PT2222291E - Compostos para o tratamento seletivo do componente intestinal imuno-inflamatório da doença celíaca - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

COMPOSTOS PARA O TRATAMENTO SELETIVO DA COMPONENTE INTESTINAL IMUNO-INFLAMATÓRIA DA DOENÇA CELÍACA

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a compostos para o tratamento seletivo da componente intestinal imuno- inflamatória da doença celiaca. A presente invenção tem origem a partir do campo dos medicamentos para o tratamento de doenças com uma componente inflamatória e localizada ao nivel da mucosa do primeiro trato do intestino delgado, tais como a doença celiaca.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Em particular, a presente invenção refere-se a um grupo de moléculas adequadas para reduzir seletivamente a inflamação que se desenvolve ao nivel do duodeno e do jejuno proximal em indivíduos que sofrem da doença celíaca. A doença celíaca, é uma doença autoimune muito comum que tem componentes genéticos, imunológicos e ambientais.

Na base da doença celíaca está uma intolerância permanente à gliadina, uma fracção de proteína do glúten contido no trigo, ou fracções semelhantes de proteína solúveis em 1 álcool (prolaminas), contida na cevada, centeio, espelta, kamut e em outros cereais menores.

Na doença celíaca, a mucosa do intestino delgado fica danificada subsequentemente à exposição ao antigénio (gliadina). Na doença, as vilosidades intestinais tendem a tornar-se achatadas e as criptas hiper-proliferam para compensação, os enterócitos ficam cúbicos, em vez do formato cilíndrico e o número de linfócitos no lúmen intestinal aumenta. A sintomatologia que acompanha a doença é muito complexa e não se limitando à área gastroentérica. Na verdade, os sintomas típicos a nível local que normalmente compreendem diarreia, dor abdominal com possível sangramento, intolerância à lactose, são acompanhados por uma sintomatologia extra-intestinal, que pode compreender estomatite aftosa, dor óssea, perda de peso progressiva com enfraquecimento. Além disso, nos casos de doença celíaca não tratada ou refractária, existem riscos de desenvolver linfoma gastrointestinal ou também carcinoma. Não raramente, além disso, o sujeito com doença celíaca pode apresentar um défice de ferro ou ferritina, juntamente com deficiência possível de vitaminas A, B12, D, E, K e ácido fólico, causada pela má absorção intestinal. Além disso, a perda contínua de gorduras através da defecação pode causar uma deficiência de cálcio e desenvolver duas complicações possíveis, uma a nível renal, com formação de cálculos de oxalato de cálcio e a outro a nível ósseo, com 2 o desenvolvimento de osteomalacia, uma patologia que causa o enfraquecimento ósseo.

Numa percentagem de indivíduos, a doença pode mesmo ser totalmente ou parcialmente assintomática, isto é, não apresentar sintomas claros ou estar numa forma latente, pronta para surgir na sequência de eventos específicos.

Uma vez que o antigénio que desencadeia a doença é conhecido, é possível obter uma remissão completa dos sintomas correlacionados por simplesmente evitar a ingestão de alimentos contendo glúten.

Uma vez que o controlo da doença se baseia na adesão a uma dieta restrita, não é suficiente evitar a ingestão de alimentos que como se sabe contém glúten, tais como massas, pão, cevada, espelta, mas também é essencial evitar a toma de alimentos que podem contê-lo em pequenas quantidades, por exemplo, como um agente espessante ou de estruturação, ou como vestígios perdidos no processamento.

Por exemplo, o paciente tendo doença celíaca deve evitar tomar café expresso no bar (isto pode estar contaminado com cevada), especiarias, açúcar de confeiteiro, algumas preparações farmacêuticas e prestar atenção também à cola encontrada, por exemplo, em selos e envelopes postais. 3 A dieta dos pacientes com doença celiaca pode, em qualquer caso, ser suficientemente variada e bem balanceada comendo apenas alimentos como arroz, milho, trigo sarraceno, painço, amaranto, carne, peixe, vegetais, frutas, queijo e legumes.

De acordo com alguns estudos recentes existe um limite critico de 20 ppm de glúten por alimentos, para além do qual o conteúdo dos alimentos torna-se tóxico para o sujeito com doença celiaca. O Codex Alimentarius prevê dois tipos de limiares para a rotulagem de alimentos como livres de glúten. Um primeiro é fixado em 100 ppm e refere-se a alimentos "destoxifiçados" que, entre os materiais de partida também contém os derivados de cereais tóxicos, tais como, por exemplo amido de trigo, e um limiar de 20 ppm para os alimentos livres de ingredientes derivados de cereais tóxicos. A observância estrita da dieta e de algumas regras básicas de comportamento previne o aparecimento de novos sintomas e, geralmente, faz, de uma forma mais ou menos acentuada de acordo com a resposta individual, a remissão dos sintomas desenvolvidos. A dieta, no entanto, deve ser observada durante toda a vida, apesar da falta de sintomas ou mesmo a ausência de anticorpos no soro.

Além da dieta, no entanto, nenhuma forma de tratamento está atualmente disponível para indivíduos com doença celíaca, em particular, não existem produtos que possam conter os 4 sintomas inflamatórios que acompanham a ingestão, mesmo acidental, de alimentos contendo glúten.

Os poucos métodos de intervenção terapêutica tentados até agora não levaram à obtenção de resultados significativos.

Uma vez que a doença é estritamente correlacionada com alguns genes que codificam os antigénios de leucócitos humanos (HLA) DQ2/DQ8, algumas formas de tratamentos destinada a ligação da inibição dos péptidos de glúten em HLA DQ2/DQ8. Em particular, foram testados alguns compostos de bloqueio HLA-DQ2, mas sem se alcançar resultados significativos. A utilização de antagonistas de zonulina, uma proteína envolvida na regulação das junções intercelulares do intestino delgado, a expressão da qual aumenta durante a fase aguda da doença, tem sido descrita na literatura para o tratamento da síndrome celíaca. No entanto, nenhum fármaco baseado nesta proteína está atualmente disponível no mercado.

Além disso, os fármacos anti-inflamatórios para utilização tópica na mucosa não encontraram aplicação até à data além do tratamento de formas crónicas intestinais inflamatórias, localizadas ao nível do cólon, o trato distai do intestino. Por esta razão, as preparações disponíveis no mercado para o tratamento da doença de Crohn e da colite ulcerativa são vendidos como supositórios ou soluções para utilização 5 rectal. Pelo contrário, quando estas preparações são destinadas a administração oral, são formuladas para a libertação retardada do principio ativo de modo a passar intacto ao longo do tubo digestivo e permitir a libertação do principio ativo ao nivel apenas do cólon.

Estes fármacos, por conseguinte, não têm efeito sobre a porção duodenal do intestino, onde o foco inflamatório na doença celiaca está localizado. A W02007/010516 divulga o composto da seguinte fórmula

CH

em que RI e R2 podem ser idênticos ou diferentes e são selecionados de entre o grupo que compreende H ou linear ou grupo alquilo ramificado tendo de 1 a 6 átomos de carbono ou em conjunto formam um anel aromático ou alifático, Y e Z, que podem ser iguais ou diferentes, são selecionados de entre o grupo que compreende H,-OH,-COOH,-0R3,-CH(0R3) COOH, em que R3 é selecionado de H, fenilo, benzilo, -CF3, ou -CF2CF3, vinilo, alilo e um grupo alquilo linear ou ramificado tendo de 1 a 6 átomos de carbono. Tais compostos têm sido divulgados para a utilização na prevenção e no tratamento de tumores que expressam os receptores PPARy e os receptores EGF e para o tratamento de 6 doenças inflamatórias crónicas. Nenhuma referência é feita à doença celíaca. A W02005/072113 revela composições para as doenças inflamatórias do intestino ou outras doenças inflamatórias compreendendo ácido 5-aminossalicílico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ou éster; pelo menos um anti-oxidante; e um veículo farmaceuticamente aceitável. 0 objecto de tal pedido de patente difere da presente em que a estrutura de base fenilo é substituída por -CH(Y) (Z) e não por -COOH. A US2006/270635 descreve derivados de 4 - ou 5-ácido aminossalicílico e uma composição farmacêutica contendo estes derivados de 4 - ou 5-ácido aminossalicílico como ingredientes ativos, úteis para o tratamento de doenças intestinais como a doença inflamatória do intestino (IBD) e a doença do intestino irritável (IBS) e para a prevenção/tratamento do cancro do cólon. A referência à doença celíaca é feita apenas como uma doença possível entre várias outras.

Portanto, é sentida atualmente a necessidade clínica de ter substâncias fornecidas com atividade farmacológica que deverão permitir conter os sintomas de base imuno-inflamatória que se desenvolvem ao nível da mucosa duodenal do intestino delgado na doença celíaca. 7

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um objecto geral da presente invenção consiste em proporcionar novas indicações adequadas sobre a utilização de compostos proporcionados com uma atividade farmacológica.

Um dos principais objetos da presente invenção, portanto, é proporcionar compostos que proporcionam uma ação seletiva sobre o componente imuno-inflamatório local da doença celiaca.

Num aspecto, a Requerente verificou que os compostos de fórmula (I) descritos abaixo, têm uma afinidade especifica e por exemplo, são agonistas para os receptores PPARgama (PPARy) e fornecem ativação dos mesmos. Em particular, a presença de tais receptores tem sido detectada ao nivel das células epiteliais duodenais em pacientes afectados pela doença celiaca, onde o efeito anti-inflamatório dos compostos da fórmula I, foi demonstrado por uma redução da produção de citocinas inflamatórias.

Tipicamente, os compostos de fórmula (I) têm uma estrutura semelhante ao aminofenilpropiónico, e atuam bloqueando as citocinas na doença celiaca.

Numa forma de realização, os compostos de fórmula (I) são especificamente úteis no tratamento da doença celiaca 8 refractária à dieta, em erros de dieta e no tempo de remissão da doença celíaca.

De acordo com um aspecto da presente invenção, é proporcionada a utilização de um composto de fórmula (I)

em que RI e R2, iguais ou diferentes um do outro, e são selecionados de entre o grupo compreendendo -H ou um grupo alquilo linear ou ramificado tendo 1 a 6 carbonos, Y e Z, igual ou diferente um do outro, são selecionados de entre o grupo compreendendo -H,-OH,-COOH,-0R3,-CH(0R3) COOH, em que R3 é selecionado de H, um grupo alquilo linear ou ramificado tendo 1 a 6 carbonos, e sais farmaceuticamente aceitáveis ou ésteres do mesmo, para a utilização no tratamento da componente imuno-inflamatória da doença celíaca. 9

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Num aspecto, outros exemplos dos compostos de fórmula (I) adaptados para a utilização na invenção, são descritos no pedido WO 2007/010516. A Requerente observou que os compostos de fórmula I têm uma atividade especifica sobre o componente imuno-inflamatório observado ao nivel da mucosa intestinal, em particular ao nivel da segunda porção do duodeno, do sujeito com a doença celíaca. A Requerente observou ainda que a atividade anti-inflamatória local exercida pelos compostos de fórmula (I) é referida a uma atividade inibidora sobre a libertação de citocinas, substâncias que têm um papel importante nos processos flogísticos e/ou em tornarem-se crónicos.

Em particular, tem sido verificado surpreendentemente que os compostos de fórmula I bloqueam de forma substancial, ou em qualquer caso, de forma substancial e significativamente inibem as citocinas, em indivíduos com doença celíaca apenas, enquanto não têm uma atividade significativa em indivíduos que sofrem de doenças inflamatórias afectando um trato gastrointestinal específico, com exceção da doença celíaca.

Em particular, os compostos de fórmula I são adequados para bloquear as chamadas citocinas proflogogene Thl (célula T 10 auxiliar do tipo 1), uma vez que favorecem o recrutamento de células imunitárias e inflamatórias no local da lesão.

Esta atividade especifica pode ser atribuida ao facto de, na doença celiaca a persistência de uma flogose tipo Thl refletir a ativação do sistema imunitário contra o antigénio (fracção gliadina de glúten) que não podem ser eliminados e para a qual o sistema não é capaz de desenvolver tolerância.

As citocinas proflogogene tipicas (Thl) envolvidas na imunopatogénese da doença celiaca compreendem (L-l, IL-2, IL-6 (interleucinas 1, 2, 6), IFN (interferão) . Além disso, as citocinas associados a Th2 (célula T auxiliar do tipo 2), bem como as citocinas derivadas de macrófagos tais como TNF-oí (factor de necrose tumoral) também estão envolvidas na doença celiaca. Em particular, o TNF-oí tem um papel importante no desenvolvimento de doenças inflamatórias crónicas devido à sua capacidade para potenciar a produção de citocinas proflogogene, algumas das quais são fornecidas com considerável toxicidade.

Em particular, foi verificado o efeito dos compostos de fórmula (I) sobre a produção e libertação de citoquinas a partir de amostras da mucosa intestinal que sofrem da doença celiaca utilizando um sistema de cultura orgânica. Em particular, tem sido notada uma redução eficaz da flogose, como realçado pela redução significativa dos valores de IFN-y, IL-2, TNF-α usando um ou mais dos 11 compostos de fórmula (I) em biopsias da mucosa intestinal sujeita à cultura.

De acordo com outro aspecto da invenção, é proporcionado o uso de um composto de fórmula I, tal como descrito antes, para o fabrico de um medicamento para o tratamento da inflamação em indivíduos com doença celiaca refractária.

De acordo com outro aspecto da invenção, é proporcionado o uso de um composto de fórmula I, tal como descrito antes, para o fabrico de um medicamento para o tratamento de uma reação inflamatória num sujeito com doença celiaca em dieta, desencadeada por um erro na dieta.

De acordo com outro aspecto da invenção, é proporcionado o uso de um composto de fórmula I, para o fabrico de um medicamento, tipicamente, em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis ou adjuvantes, para o tratamento da componente imuno-inflamatória na doença celiaca para encurtar o tratamento clinico e/ou o tempo de remissão histológica.

Na preparação de medicamentos de acordo com um ou mais dos aspectos da invenção é também possível utilizar, para além de um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, também lubrificantes, humectantes, agentes de suspensão, agentes dispersantes, agentes conservantes normalmente utilizados dentro do âmbito das preparações para uso farmacêutico. 12

Numa forma de realização, os compostos de fórmula (I) podem ser administrados em várias formas tais como comprimidos, cápsulas, formulações granulares, dispersões e outras formulações típicas do campo farmacêutico.

Tipicamente, os ingredientes ativos (I) podem ser incorporados na formulação adequada para a administração numa quantidade eficaz para alcançar a resposta anti-inflamatória na doença celíaca. A título de um exemplo, o ingrediente ativo pode ser incorporado na composição farmacêutica numa quantidade variando de 50 mg a 2000 mg, de preferência na gama de 200 a 600 mg, mais preferencialmente de 250 a 500 mg.

Tem sido demonstrado que o uso de medicamentos com base em um ou mais compostos de fórmula (I) determina uma melhoria da adesão do paciente e do médico, diminuindo o tempo de remissão.

Em outra forma de realização, os compostos de fórmula (I) encontram ainda aplicação terapêutica no tratamento da doença celíaca resistente e/ou refractária.

Os exemplos seguintes são dados apenas como uma ilustração da presente invenção, e não são para ser concebidos como 13 limitando o âmbito de proteção tal como aparece a partir das reivindicações em anexo.

Exemplo de Referência 1

Foi avaliado o efeito de mesalazina na componente inflamatória observada na doença celiaca.

Para este fim, foram selecionados 16 indivíduos na fase ativa da doença e 6 pacientes em fase de remissão clinica numa dieta livre de glúten.

Foram feitos 5 fragmentos de biópsia por cada sujeito do estudo por exame EGDS.

Cada fragmento de mucosa intestinal foi colocado em cultura num meio adequado, ambos com e sem mesalazina (5ASA). A seguir foi então observado em liquidos de cultura: o nivel de citocinas libertadas nos diferentes meios de cultura a quantidade das mesmas citocinas presentes na biópsia da mucosa adequadamente homogeneizada. 14 MATERIAIS E MÉTODOS Método

Foram avaliados 3 grupos de indivíduos. 0 primeiro grupo (atrófico) incluía 29 indivíduos com testes sorológicos positivos para anticorpos antiendomísio e anticorpos anti-transglutaminase, com neo-diagnóstico de doença celíaca e dieta contendo glúten. 0 segundo grupo (remissão) incluiu 17 indivíduos com doença celíaca em remissão clínica e dieta isenta de glúten por pelo menos 6 meses. 0 terceiro grupo (saudável) incluiu indivíduos que não sofrem da doença celíaca, mas que sofrem de inflamação do trato gastro-intestinal.

Dosagem de citocinas em líquidos de cultura Culturas de órgãos:

Os pacientes incluídos no estudo foram sujeitos a 5 biópsias da mucosa duodenal por exame EGDS: uma para o ensaio histológico e as outras quatro (cada dividida em duas partes) sujeitas a cultura, respectivamente, com apenas um meio de cultura (Meio C) e com péptido de gliadina, e com meio de cultura com gliadina, na presença de mesalazina (Meio+5 ASA C). 15

As amostras foram lavadas em solução salina durante dois minutos, pelo menos, três vezes. As biópsias foram colocadas em meio de cultura com um volume igual a 1 ml: MEIO (RPM11860 + soro fetal de vitelo +

Penicilina/estreptomicina) MEIO + digestão péptica-triptica de gliadina ou 31-43 ou outros cereais MEIO + mesalazina (5-ASA) MEIO + digestão péptica-triptica de gliadina +5- ASA (1,5-8,0 mg por ml de meio)

As biópsias são incubadas num 02 (95%) e atmosfera de C02 (5%) a uma temperatura de 37°C durante um período que varia de 4h a 72h. São partilhadas três diferentes quantidades de meio para o ensaio ELISA de citocinas Thl e Th2 libertadas em meios de cultura.

Dosagem de citocinas no homogenato

Depois de um tempo de incubação variando de 4 h para 72 h, a um T de 37°C: - O fragmento biótico é lavado três vezes em solução salina durante dois minutos - As biópsias são homogeneizadas por desintegração mecânica ou química A centrifugação é realizada, o sobrenadante é recolhido e transferido num Eppendorf de 1,5 ml. 16

As citocinas fixas no tecido da mucosa são ensaiadas pelo ensaio de ELISA.

RESULTADOS

Os dados encontrados mostram que a presença de Mesalazina nos meios de cultura bloqueia as citocinas em indivíduos apenas com doença celiaca, determinando assim seletivamente uma edução do componente inflamatório em amostras colhidas de indivíduos com doença celíaca (Tabela 1). 17

Tabela 1: Meio C/Meio+SASA.C

População Citocina Parâmetro N Meio Dev, Pad. Erro pad, Min Médio Max Wilcoxon signed Rank Test Meio C 22 0,199 0,197 0,0420 0,0450 0,119 0,916 Meio+5ASA C 22 0,136 0,165 0,0351 0,0330 0,0670 0,780 Diferença 22 0,0601 0,250 0,0533 -0,549 0,0260 0,877 Atrófico IFN p=0,08 Meio C 15 0,175 0,136 0,0351 0,0100 0,161 0,569 Meio+5ASA C 15 0,119 0,0978 0,0252 0,0130 0,0910 0,355 Diferença 15 0,0559 0,0557 0,0221 -0,060 0,0490 0,258 IL-2 p=0,03 Meio C 21 0,477 0,585 0,128 0,0550 0,174 2,077 Meio+5ASA C 21 0,472 0,651 0,142 0,0590 0,204 2,134 Diferença 21 0,0048 0,447 0,0974 -1,398 0,0150 0,972 TNF p=N.S. Meio C 15 0,240 0,154 0,0398 0,0610 0,209 0,534 Meio+5ASA C 15 0,201 0,135 0,0348 0,0390 0,208 0,429 Diferença 15 0,0383 0,123 0,0317 0,0500 0,209 Remissão IFN p=N.S. Meio C 12 0,315 0,176 0,0509 0,0420 0,284 0,732 Meio+óASA C 12 0,309 0,223 0,0644 0,0500 0,253 0,737 Diferença 12 0,0061 0,147 0,0425 0,314 5E-4 0,201 18 (Continuação)

População Citocina Parâmetro N Meio Dev. Pad. Erro pad. Min Médio Max Wilcoxon signed Rank Test IL-2 p=N.S. Meio C 15 0,948 0,796 0,206 0,0830 0,578 2,477 Meio+5ASA C 15 0,894 co 0,178 0,249 0,571 2,301 Diferença 15 0.0541 0,297 0,0767 0,460 0,0790 0,728 TNF p=N.S. Meio C 7 0,145 0,0643 0,0243 0,102 0,112 0,281 Meio+5ASA C 1 0,149 0,0480 0,0182 0,111 0,140 0,252 Diferença 1 0,004 0,0398 0,0150 0,047 0,029 0,0510 Controlo IFN p=N.S. Positivo Meio C 1 0,532 0,171 0,0659 0,223 0,535 0,730 Meio+5ASA C 1 0,356 0,140 0,0530 0,169 0,379 0,529 Diferença 1 0,116 0,169 0,0638 0,247 0,351 IL-2 -0,028 p=0,07 Meio C 1 0,253 0,129 0,0486 0,105 0,220 0,489 Meio+5ASA C 1 0,259 0,105 0,0397 0,127 0,229 0,434 Diferença 1 0,005 0,201 0,0761 0,260 0,0040 0,362 TNF p=N.S. 19

Tabela 2: PT C I PT+5ASA C

População Citocina Parâmetro N Meio Dev, Pad. Erro pad, Min Médio Max Wilcoxon signed Rank Test PT C 22 0,211 0,213 0,0454 0,0400 0,126 0,849 PT+5ASA C 22 0,145 0,195 0,0416 0,0270 0,0545 0,816 Diferença 22 0,0657 0,178 0,0379 -0,244 0,0505 0,563 Atrófico IFN p=0,05 PT C 15 0,151 0,124 0,0320 0,0100 0,124 0,507 PT+5ASA C 15 0,124 0,137 0,0355 0,0070 0,0770 0,440 Diferença 15 0,0270 0,0749 0,0193 -0,217 0,0410 0,0900 IL-2 p=0,012 PT C 21 0,600 0,788 0,172 0,0550 0,200 2,725 PT+5ASA C 21 0,414 0,584 0,127 0,0700 0,120 2,163 Diferença 21 0,187 0,272 0,0593 -0,052 0,0580 co TNF p=<0,0001 PT C 15 0,254 0,210 0,0543 0,0560 0,185 0,870 PT+5ASA C 15 0,153 0,120 0,0309 0,0370 0,0960 0,387 Diferença 15 0,101 0,210 0,0541 -0,060 0,0210 0,791 Remissão IFN P=0,022 PT C 12 0,271 0,218 0,0630 0,0360 0,204 0,815 PT+5ASA C 12 0,234 0,126 0,0363 0,0650 0,194 0,473 Diferença 12 0,0365 0,141 0,0425 -0,817 0,0260 0,342 20 (continuação)

População Citocina Parâmetro N Meio Dev, Pad. Erro pad, Min Médio Max Wilcoxon signed Rank Test IL-2 p=N.S. PT C 15 0,996 0,832 0,215 0,216 0,673 2,951 PT+5ASA C 15 0,305 0,708 0,183 0,151 0,545 2,294 Diferença is 0,191 0,221 0,0659 -0,188 0,221 0,657 TNF p=0,005 PT C 7 0,141 0,0766 0,0289 0,0700 0,124 0,295 PT+5ASA C 1 0,116 0,0628 0,0237 0,0540 0,121 0,210 Diferença 1 0,0247 0,0505 0,0191 -0,030 0,0090 0,105 Controlo IFN P=N.S. Positivo PT C 1 0,501 0,243 0,0920 0,284 0,469 0,996 PT+5ASA C 1 0,521 0,259 0,0979 0,191 0,468 0,951 Diferença 1 -0,020 0,123 0,0465 -0,184 0,0210 0,144 IL-2 p=N.S. PT C 1 0,313 0,133 0,0504 0,183 0,280 0,511 PT+5ASA C 1 0,291 0,127 0,0479 0,159 0,274 0,470 Diferença 1 0,0226 0,102 0,0385 -0,190 0,0250 TNF 0,110 p=N.S 21

Tabela 3: Meio 0/Meio+5ASA 0

População Citocina Parâmetro N Meio Dev, Pad. Erro pad, Min Médio Max Wilcoxon signed Rank Test Meio 0 9 0,277 0,0561 0,0187 0,212 0,274 0,361 Meio+5ASA 9 0,202 0,0585 0,0195 0,125 0,193 0,311 Diferença 9 0,0951 0,0594 0,0198 0,0270 0,0560 0,227 Atrófico IFN p=0,003 Meio 0 0 Meio+5ASA 0 Diferença 0 IL-2 Meio 0 11 0,138 0,0546 0,0165 0,0710 0,115 0,233 Meio+5ASA 11 0,123 0,0395 0,0119 0,0660 0,106 0,174 Diferença 11 0,0154 0,0297 0,0089 -0,035 0,0100 0,0640 TNF p=N.S. Meio 0 4 0,252 0,0748 0,0374 0,183 0,251 0,324 Meio+5ASA 4 0,133 0,0577 0,0289 0,0490 0,151 0,174 Diferença 4 0,120 0,0505 0,0252 0,0440 0,142 0,150 Remissão IFN P=N.S Meio 0 0 Meio+óASA 0 Diferença 0 21 (continuação)

Dev, Pad. Erro pad, Wilcoxon signed Rank Test

População Citocina Parâmetro N Meio Min Médio Max UÃ

Meio 0 5 0,122 0,0331 0,0118 0,0800 0,133 0,159 Meio+5ASA 5 0,122 0,0230 0,0103 0,0960 0,114 0,154 Diferença 5 -0,00 0,0371 0,0169 -0,057 0,0050 0,0370 TNF p=N.S.

Meio 0 0

Meio+5ASA 0

Diferença 0

Controlo IFN Positivo

Meio 0 0

Meio+5ASA 0

Diferença 0 IL-2

Meio 0 0

Meio+5ASA 0

Diferença 0

TNF 23

Tabela 4: PT O/PT+SASA 0

População Citocina Parâmetro N Meio Dev, Pad. Erro pad, Min Médio Max Wilcoxon signed Rank Test PT 0 9 0,223 0,0496 0,0165 0,151 0,223 0,287 PT+5ASA0 9 0,179 0,0589 0,0196 0,100 0,193 0,243 Diferença 9 0,0437 0,0409 0,0136 -0,009 0,0380 0,0980 Atrófico IFN p=0,019 PT 0 0 PT+5ASA0 0 Diferença 0 IL-2 PT 0 11 0,156 0,0627 0,0189 0,0680 0,134 0,254 PT+5ASA0 11 0,101 0,0463 0,0140 0 0,0980 0,160 Diferença 11 0,0554 0,0735 0,0222 0,004 0,0270 0,254 TNF p=0,002 PT 0 0 4 0,200 0,0931 0,0466 0,120 0,172 0,334 PT+5ASA0 4 0,177 0,0692 0,0346 0,120 0,161 0,264 Diferença 4 0,0230 0,0411 0,206 -0,021 0,0215 0,0700 Remissão IFN P=N.S PT 0 0 0 PT+5ASA0 0 Diferença 0 24 (continuação)

Dev, Pad. Erro pad,

Wilcoxon signed Rank Test

População Citocina Parâmetro UÃ PT 0 PT+5ASA0

Diferença

TNF PT 0 PT+5ASA0

Diferença

Controlo IFN Positivo PT 0 PT+5ASA0

Diferença IL-2 PT 0 PT+5ASA0

Diferença N Meio 5 0,126 0,0276 5 0,107 0,0310 5 0,0194 0,0089 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Min Médio Max 0,0123 0,0640 0,127 0,158 0,0139 0,0630 0,110 1,480 0,00040 0,0100 0,0210 0,310 25 A redução da componente inflamatória alcançada permite o uso de mesalazina isolada ou como um suporte terapêutico em todos os casos de resolução clinica lenta ou dificil.

Exemplo de Referência 2 A expressão genética de citocinas

Os fragmentos bióticos duodenais retirados do paciente durante o procedimento de gastroscopia, foram colocados em cultura a 37°C durante 48h, na ausência e na presença do fármaco 5-ASA. Após a cultura, os fragmentos foram homogeneizados numa solução de fase única composta de fenol e de guanidinio (Reagente de Lise Isol-RNA).

Tem sido utilizado um homogeneizador IKA TIO-Ultra Turrax para a homogeneização.

Todo o material insolúvel foi separado da solução por centrifugação e o sobrenadante foi transferido para um tubo de teste limpo, ao qual foi adicionado 200 μΐ de clorofórmio por ml de lise.

Depois de uma agitação mecânica rápida, as amostras foram deixadas a repousar durante alguns minutos à temperatura ambiente e depois centrifugadas a 12000 rpm durante 15 minutos a 4°C. O passo inorgânico contendo RNA foi transferido para um tubo de ensaio limpo. 26 0 RNA foi feito precipitar pela adição de 500 μΐ de álcool isopropilico por ml de lise. As amostras foram incubadas à temperatura ambiente durante 10 minutos e depois centrifugadas a 12000 rpm durante 15 minutos a 4°C.

Depois de ter sido removido o sobrenadante, os sedimentos de RNA foram lavados com 1000 μΐ de etanol a 75% por ml de lise, agitados mecanicamente e centrifugados a 7500 rpm durante 5 minutos a 4°C. Finalmente, o etanol foi removido e o sedimento de ARN foi seco ao ar sob capa química. O RNA foi re-suspenso numa quantidade adequada de RNasi livre de água. A concentração de RNA foi determinada medindo a absorção a 260 nm no espectrofotómetro; também a razão de A260/A280 para diferentes modelos de RNA foi valorizada.

RT-PCR O cADN foi sintetizado a partir de diferentes quantidades de RNA iniciais extraídas e diluídas em volumes adequados de RNasi livre de água. O cDNA dos genes em causa (citocinas) foi amplificado por PCR com o uso de iniciadores específicos. O sistema Masterscript - RT-PCR (5 PRIME) tem sido utilizado para o RT-PCR. 27 A fim de verificar a presença e a quantidade de mRNA que codifica para as citocinas nas amostras bióticas, foi executada uma electroforese em gel de agarose a 1% em IX TBE.

Os resultados obtidos são mostrados no diagrama de referência da Fig. 1. EXEMPLO DE REFERÊNCIA 3

Presença do receptor PPARgama em células epiteliais duodenais de pacientes com doença celíaca 0 receptor peroxisome proliferador ativado gama pertence à superfamilia de receptores nucleares, que inclui os receptores para os estrogénios, glucocorticóides, hormonas da tiróide, vitamina D3 e ácido retinóico, bem como receptores capazes de ligação com diferentes produtos do metabolismo lipidico, tais como o PPAR e o receptor LXR.

Especificamente, a familia PPAR 3 inclui subtipos (PPAR alfa, beta ou delta e gama) com distribuição de tecido diferente e diferente especificidade de ligandos.

Ambos PPAR gama e alfa têm sido expressos em macrófagos humanos diferenciados, onde regulam os genes implicados na resposta inflamatória e modulam a diferenciação macrofágica. 28

Agonistas diferentes PPARgama inibem a produção de citocinas inflamatórias em monócitos humanos e reduzem a expressão de genes para o TNF-alfa, IL-6, IL-lb, iNOS, B gelatinoso, receptor de varrimento A e COX-2 em macrófagos ativados, confirmando o papel anti-inflamatório do PPARgama.

Um dos principais objetos foi detectar a presença de tal receptor em células epiteliais duodenais de pacientes com doença celiaca, onde o efeito anti-inflamatório dos compostos da fórmula I, e, especificamente de 5-ASA revelados por uma redução da produção de citocinas inflamatórias foi previamente confirmada.

Imunofluorescência

Foi tomado um fragmento biótico duodenal por procedimento EGDS, tanto de pacientes com doença celiaca em dieta contendo glúten e de indivíduos não afetados pela doença celiaca (grupo de controlo) . Os fragmentos bióticos foram lavados, orientados em OCT e armazenados a -80 °C. Foram obtidas algumas seções de 5 ym a partir de cada pedaço biótico congelado (tomados na etapa EGDS tanto de pacientes com doença celiaca e de indivíduos não afectados pela doença) , essas seções foram expostas ao anticorpo PPARgama primário durante a noite (após a fixação adequada e tratamentos de eliminação específicos). PBS, as amostras foram hora com o anticorpo No caso de ligação do PPARgama, se presente, é

Depois de terem sido lavadas em incubadas durante cerca de uma secundário fluorescente ALEXA 488. anticorpo primário para o receptor 29 formado um complexo anticorpo primário/secundário, revelável como fluorescência na secção, observável por microscópio. A presença do receptor PPARgama, revelada por um microscópio de fluorescência, é evidente a partir das Figs. 2 e 3 (fotos de diagnóstico).

Em particular, nas imagens das Figs. 2 e 3 a presença do receptor é revelado pelo sinal de fluorescência detectável na porção de secção periférica. A fluorescência demonstra a presença do PPARgama ao nivel dos enterócitos, células epiteliais intestinais na superficie voltada para o lúmen intestinal.

Biopsias dos pacientes não afectados pela doença celiaca têm sido utilizadas como controlo negativo: o resultado foi uma ausência de sinal, e, consequentemente, a ausência do receptor nos troços analisados por microscópio. Em particular, as referências das Figs. 4 e 5 (controlos) mostram que não foi detectada nenhuma fluorescência: este é o sinal da ausência do receptor, ao nivel da mesma porção intestinal, no grupo de controlo saudável.

Da mesma forma, os compostos aqui detalhados abaixo foram testados e foram obtidos resultados similares. 30 EXEMPLO DE REFERÊNCIA 4

Foi monitorizada a expressão do gene (mRNA) das citocinas pró-inflamatórias IL-2, TFN-alfa e IFN-gama, libertadas na fase aguda da doença.

Em particular, os diagramas ilustrados nas referências das Figs. 6-8 citam os valores de densidade óptica. (IMAGE J) extrapolados a partir de diferentes bandas, obtidos por electroforese com gel de agarose lx, relacionados com Os amplificadores de citocinas objecto do estudo. A expressão genética das citocinas foi avaliada por RT-PCR do RNA extraido por biopsias duodenais dos pacientes portadores de doença celiaca. Tais biopsias foram mantidas para crescimento a 37 °C durante 48h, tanto em meio de cultura contendo uma digestão tríptica de gliadina (PT) como num meio de PT, ao qual o fármaco 5-ASA foi adicionado.

Resultados

Os três diagramas mostram que, nos fragmentos bióticos mantidos em cultura na presença de fármacos, a expressão do gene (mRNA) das citocinas pró-inflamatórias IL-2, TFN-alfa e IFN-gama, libertadas na fase aguda da doença, é bem reduzida. A redução aumenta quando o paciente é submetido a um tratamento mais duradoura e constante com o fármaco; 31 EXEMPLO DE REFERÊNCIA 5

Estudo sobre os efeitos dos compostos de referência sobre a ativação de PPARy/expressão e regulação da proliferação celular e apoptose.

MATERIAIS E MÉTODOS Compostos A - G

Foi adquirido 5-ASA da Sigma-AldrichTM (St Quentin Fallavier, França). A rosiglitazona foi adquirida em Spi BIO™ (Massy, França). Foram testados os seguintes compostos de A a G:

A 8

C

CO-NH-OH

D

E

F

G

COOH

A 32

Linhas celulares A linha celular do cólon HT-29 padrão (ATCC HTB-38) foi rotineiramente cultivada em DMEM suplementado com 10% de FCS aquecido, e antibióticos. As células foram cultivadas em monocamadas, incubadas a 37°C em C02 a 5% e 95% de humidade relativa.

Transfecção transitória com PPARy e estimulação de células

As células HT-29 padrão foram transitoriamente transfectadas utilizando o reagente de transfecção EffecteneTM (QiagenTM) de acordo com as instruções do fabricante. Para testar a ativação de PPARy, foi realizada a transfecção com 500 ng de um promotor de construção minimo contendo duas cópias do PPRE obtidas a partir do citocromo p450 4A (2XCYP). A luciferase Renilla do plasmideo (0,1 pg/poço) também foi transfectada como um controlo interno para monitorização da eficiência de transfecção e para normalizar a atividade da luciferase do pirilampo. As células transfectadas foram deixadas durante 48 horas de incubação a 37°C. As estimulações foram realizadas após a incubação das células durante 3-6-9-12-15-18-24 horas com os compostos A-G numa concentração de 30 mM e comparadas com os dois ligandos sintéticos PPARy 5-ASA 30 mM e rosiglitazona 10-5 M utilizados como controlos positivos. O pH das soluções dos fármacos foi ajustado para 7,4 com NaOH. Foram preparados extractos celulares totais utilizando o tampão de lise passiva (PromegaTM, Madison, Wisconsin). A atividade de luciferase foi ensaiada em 20 μΐ do extracto utilizando o sistema de ensaio de Luciferase Dupla PromegaTM de acordo com o protocolo do fabricante. As transfecções foram ensaiadas em triplicado em pelo menos três experiências separadas. A atividade da luciferase foi expressa como dobra da atividade obtida em células tratadas com as diferentes 33 moléculas divididas pela atividade de luciferase a partir de células não-estimuladas.

Avaliação de PPARy e β-actina por Western blot

As proteínas totais foram obtidas por homogeneização de células num tampão de extração consistindo em PBS com 2% de TritonTM, 100 mM de fluoreto de sulfonilo fenil de metilo (PMSF) e um cocktail inibidor de protease clássico. As proteínas totais foram então separadas por electroforese em gel de poliacrilamida e eletrotransferidas. As membranas de polivinilidendifluorido (PVDF) foram incubadas durante a noite com um anticorpo primário policlonal de coelho dirigido contra PPARy (diluição 1/500, TEBU, Le Perray en Yveline, França). A β-actina foi detectada utilizando um anticorpo monoclonal primário de coelho diluído a 1/10,000 (Sigma). A imunodetecção com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase (1/1000, DakoTM, Trappes, França) e quimioluminescência foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante (ECL™, Amersham Pharmacia BiotechTM, Orsay, França) . Os valores de densidade óptica de PPARy foram dados para cada condição em proporção com a quantidade de β-actina do controlo interno na mesma amostra.

Análise de proliferação celular por imunocoloração Ki-67

Após 24 horas de cultura, as células HT-29 padrão foram tratadas durante 24 horas com os compostos A, B, C, D e F, a 30 mM. Foram utilizados 5-ASA (30 mM) e rosiglitazona (10— 5M) como controlos positivos. A molécula G não foi incluída nesta experiência, devido à sua fraca solubilidade. O pH das soluções dos fármacos foi ajustado para 7,4 com NaOH. As células foram fixadas em PFA a 4%, permeabilizadas em PBS 34 contendo 0,1% de Triton X-100TM a 4°C e depois incubadas com soro de cabra normal e tampão de bloqueio (BSA a 1% em PBS) para minimizar a adsorção não especifica do anticorpo. A proliferação celular foi avaliada por uma coloração nuclear Ki-67 usando o anticorpo monoclonal primário de ratinho dirigido contra Ki-67 (diluição 1:50 durante a noite; ZYMEDTM, Clinisciences™, Montrouge, França). O anticorpo primário foi revelado com IgG anti-ratinho de burro Alexa 594 conjugado com fluorocromo de hidroacridina vermelha (diluição de 1:100, Molecular ProbesTM, InvitrogenTM, Cergy Pontoise, França). Os núcleos foram corados com solução Hoescht 33342 (0,125 mg/mL) (Sigma-AldrichTM) e visualizados sob um microscópio de fluorescência (LeicaTM, Bensheim, Alemanha). Os controlos negativos consistiram numa coloração com um soro de rato não especifico em vez do anticorpo especifico. Contagens de pelo menos 500 células por amostra, foram sistematicamente realizadas às cegas numa experiência. Os resultados foram expressos como a média ± SEM do número de células coradas.

Detecção de apoptose

Após 24 horas de cultura, as células HT-29 padrão foram tratadas durante 24 horas com os compostos A, B, C, D, F, numa concentração de 30 mM. Foram utilizados 5-ASA (30 mM) e rosiglitazona (10-5M) como controlos positivos. As moléculas E e G não foram incluídas nesta experiência, devido à sua fraca solubilidade. O pH das soluções dos fármacos foi ajustado para 7,4 com NaOH. As células submetidas a apoptose foram identificadas por meio de rotulagem enzimática de cadeias de ADN utilizando um ensaio de rotulagem final de 35 terminal de transferase (ensaio TUNEL, Roche DiagnosticsTM, Meylan, França). Contagens de pelo menos 500 células por amostra, foram sistematicamente realizadas às cegas numa experiuência. Os resultados foram expressos como a média ± SEM do número de células coradas.

Resultados

Foi observado que as moléculas C e F induzem a ativação de PPARy. O composto D também induz PPARy, mas de forma ligeiramente menor. A ativação de PPARy resulta numa cascata de reações que conduzem a uma ligação a elementos de sequência especifica de ADN denominado proliferador de peroxissoma, elementos de resposta (PPRE). Nós investigamos a atividade transcricional de PPARy por transfecções transientes de células epiteliais com os plasmideos PPRE de Renilla luciferase. As células foram estimuladas com moléculas diferentes durante 24 horas. A análise da atividade de PPARy em células HT-29 transfectadas mostraram que o composto C e F a uma concentração de 30 mM aumenta a atividade do gene repórter duas vezes exibindo assim uma atividade semelhante à do 5-ASA e rosiglitazona. Os compostos A, B e G a uma concentração de 30 mM exercem um efeito citotóxico rápido sobre as células epiteliais que limitam a investigação da ativação de PPARy após 6 horas.

Em particular, as moléculas C, D e F induzem a expressão de PPARy. Em geral, todos os compostos A-G mostram capacidade para induzir a expressão de PPARy com os niveis de proteina na linha celular HT-29. Em particular, uma média de indução 36 de 2 vezes os niveis de proteína PPARy quantificados por western blot foi observada em células tratadas durante 24 horas com as moléculas C, D e F.

Em particular, as moléculas C e F inibem a proliferação de células epiteliais. Avaliou-se na linha celular HT-29 padrão o papel das moléculas na regulação da proliferação celular. A proliferação celular foi avaliada por regulação nuclear de proliferação celular. A proliferação celular foi avaliada por coloração nuclear da proteína Ki-67 expressa em células em proliferação, a presença de Ki-67 era necessária para manter a proliferação celular. Em comparação com células não tratadas, a incubação de células HT-29 durante 24 horas com as moléculas C e F (30 mM) resultou numa inibição de 67-75% da proliferação celular.

Resultados semelhantes foram obtidos com os dois controlos positivos de rosiglitazona (10-5M) e 5-ASA (30 mM) utilizados nas suas concentrações óptimas. A demonstração do efeito anti-mitogénico potencial das moléculas A, B e D foi limitada pelos seus rápidos efeitos citotóxicos sobre as células epiteliais nesta concentração.

0 composto F também induz a apoptose das células epiteliais através PPARy. Similarmente à rosiglitazona e 5-ASA, a molécula F mostra a apoptose em 80% das células epiteliais identificadas pela rotulagem de quebras no ADN usando uma rotulagem final do terminal de transferase (TUNEL). De forma semelhante à experiência anterior, as moléculas A, B e D 37 induzem um rápido efeito citotóxico em 30 mM impedindo a análise da apoptose celular.

Conclusão

Este exemplo mostra especificamente a capacidade dos compostos C e F para estimular a expressão e ativação de PPARy e para regular a proliferação de células epiteliais e apoptose. Além disso, os efeitos citotóxicos sobre as células epiteliais dos compostos A, B e D (bem como E a G) com 30 mM podem estar relacionados com a presença na sua estrutura de um grupo de ácido hidroxâmico altamente reativo conhecido por exibir uma grande afinidade para várias enzimas. EXEMPLO DE REFERÊNCIA 6

Foram realizados estudos de modelagem molecular usando a versão 6.9.1 do software SYBYL (Tripos Associates IncTM, St Louis, MO) rodando em estações de trabalho Silicon Graphics™. O modelo tridimensional da forma de zwiteriões de 5-ASA foi construído a partir de uma biblioteca de fragmentos padrão, e sua geometria foi subsequentemente optimizada utilizando o campo de força Tripos. À medida que o pKa dos compostos ainda é desconhecido, a calculadora SPARC foi utilizada para determinar as espécies que ocorrem a um pH fisiológico (7,4). Os modelos tridimensionais de compostos ionizados foram construídos a partir de uma biblioteca de fragmentos padrão, e sua geometria foi subsequentemente optimizada utilizando o campo de força Tripos incluindo o termo electrostático calculado a partir das cargas atómicas Gasteiger e Huckel. O método de Powell disponível no procedimento Maximin2 foi utilizado para a minimização da energia até que o valor de gradiente fosse menor do que 0,001 kcal/mol.Â. A estrutura 38 do domínio de ligação ao ligando do PPARy humano foi obtido a partir da sua estrutura de cristal de raios-X complexada com o tesaglitazar (AZ 242) disponível no banco de dados de proteínas RCSB (1171) (4,5). 0 encaixe flexível dos compostos para o local do receptor ativo foi realizado usando o software GOLD. Os modelos de encaixe mais estáveis foram selecionados de acordo com a melhor conformação prevista pelo GoldScore e funções de pontuação X-Score. A energia dos complexos foi minimizada utilizando o método de Powell disponível no procedimento Maximin2 com o campo de força Tripos e uma constante dieléctrica de 4,0 até que o valor do gradiente atingisse 0,01 kcal/mol.Â. A função de recozimento foi utilizada definindo o ligante uma região quente (10 A).

Estudos de ancoragem

Os compostos A a G encaixam bem com o PPARy-LBD interagindo via ligações de hidrogénio com His-323, His-449, Tyr-473 e

Ser-289 considerados.

Os compostos A a G encaixam bem com o PPARy-LBD interagindo via ligações de hidrogénio com o His-323, His-449, Tyr-473 e Ser-289 considerados como determinantes chave necessários para o reconhecimento molecular e ativação PPARy.

Foi demonstrado que os efeitos anti-inflamatórios de compostos com estrutura amino-salicílica foram mediados através de PPARy principalmente expresso por células epiteliais. A análise de encaixe revelou que os compostos mencionados, utilizados a uma concentração de 30 mM, ativam o PPARy, induzindo a expressão por células epiteliais 39 intestinais e exercem uma ação farmacológica sobre a componente imuno-inflamatória da doença celíaca.

Conclusão

Foi previamente demonstrado que os efeitos anti-inflamatórios dos compostos de fórmula II com estrutura amino-salicílica (estrutura semelhante ao 5-ASA) foram mediados através de PPARy, expresso nas células epiteliais ao nível do duodeno. 0 desenvolvimento racional dos compostos A a G baseado em análise de encaixe revelou que os referidos compostos, especificamente C, F, utilizados a uma concentração de 30 mM, ativam o PPARy e induzem a sua expressão por células epiteliais intestinais. Os compostos também inibem a proliferação de células epiteliais e induzem a apoptose, dois mecanismos importantes atribuídos à ativação de PPARy. Em particular, foi detectado, em relação às moléculas A, B, D, G, que têm efeitos citotóxicos diretos nas células epiteliais a uma concentração de 30 mM, impedindo a análise de ativação de PPARy e regulação e avaliação da proliferação celular e apoptose. EXEMPLO 7

Efeitos dos compostos H-Q de fórmula (I) na ativação de PPARy MATERIAIS E MÉTODOS Materiais O 5-ASA foi adquirido na Sigma-Aldrich™ (St Quentin Fallavier, França). A rosiglitazona foi adquirida em Spi Bio™ (Massy, França). Foram testados os compostos seguintes H-Q, que caem dentro da fórmula (I): 40

Linhas celulares A linha celular do carcinoma do cólon HT-29 padrão (ATCC HTB-38) foi rotineiramente cultivada em DMEM suplementado com 10% de FCS aquecido, e antibióticos. As células foram cultivadas 41 e 95% de em monocamadas, incubadas a 37 °C em C02 a 5% humidade relativa.

Transfecção transiente com PPARy e estimulação de células

As células HT-29 padrão foram transitoriamente transfectadas utilizando o reagente de transfecção Effectene™ (Qiagen™), de acordo com as instruções do fabricante. Para testar a ativação de PPARy, foi realizada a transfecção com 500 ng de um promotor DE construção minimo contendo duas cópias do PPRE obtidAs a partir do citocromo P450 4A (2XCYP). A luciferase do plasmideo Renilla (0,lpg/poço) também foi transfectada como um controlo interno para monitorizar a eficiência da transfecção e para normalizar a atividade da luciferase do pirilampo. As células transfectadas foram deixadas durante 24 horas de incubação a 37°C. As estimulações foram realizadas após a incubação das células durante 18 horas com os compostos H-Q numa concentração de 1 mM e comparadas com os dois ligandos sintéticos PPARy 5-ASA 30 mM e rosiglitazona (10-5 M) utilizados como controlos positivos. O pH das soluções dos fármacos foi ajustado para 7,4 com NaOH. Foram preparados extractos celulares totais utilizando o tampão de lise passiva (PromegaTM, Madison, Wisconsin). A atividade de luciferase foi ensaiada em 20 μΐ do extracto utilizando o sistema de ensaio de Luciferase Dupla PromegaTM de acordo com o protocolo do fabricante. As transfecções foram ensaiadas em triplicado em pelo menos três experiências separadas. A atividade da luciferase foi expressa como dobra da atividade obtida em células tratadas com as diferentes moléculas divididas pela atividade de luciferase a partir de células não-estimuladas. 42

RESULTADOS A ativação de PPARy resulta numa cascata de reações que conduzem a uma ligação a elementos de sequência especifica de ADN denominado proliferador de peroxissoma, elementos de resposta (PPRE). Nós investigamos a atividade transcricional de PPARy por transfecções transientes de células epiteliais com os plasmideos PPRE de Renilla luciferase. Para avaliar se os compostos H-Q têm eficácia como ou mesmo ao longo de 5-ASA para estimular a ativação de PPARy, testou-se estas moléculas a uma concentração de 1 mM. 0 efeito das novas moléculas a uma concentração de 1 mM foi comparado com o 5-ASA e rosiglitazona, utilizados como controlos positivos em concentrações óptimas de 30 mM e 10-5 M, respectivamente. As células foram estimuladas com as diferentes moléculas durante 24 horas. 5-ASA para estimular a ativação de PPARy, testou-se estas moléculas a uma concentração de 1 mM. O efeito das novas moléculas a uma concentração de 1 mM foi comparado com o 5-ASA e rosiglitazona, utilizados como controlos positivos em concentrações óptimas de 30 mM e 10-5 M, respectivamente. As células foram estimuladas com as diferentes moléculas durante 24 horas. A análise da atividade de PPARy em células HT-29 transfectadas mostraram que os referidos compostos 40 a 1 mM aumentaram a atividade do gene repórter de 4,8 ± 0,71; 2,73 ± 0:31; 2,64 ± 0,46; 3,4 ± 0,97 vezes, respectivamente, exibindo assim uma atividade semelhante ou superior ao 5-ASA em 30 mM (2,8 ± 0,7) e rosiglitazona em 10-5M (3,17 ± 0,29). 43

Existem evidências da capacidade das moléculas H-Q caindo em compostos da fórmula (I) da invenção, para aumentar a atividade de PPARy em células HT-29 transfectadas, exibindo uma atividade semelhante ou mesmo superior a 5-ASA em 30 mM e rosiglitazona em 10-5M. 44

Claims (2)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula (I) z Y CH

   NF^R, em que Rl e R2, iguais ou diferentes um do outro, são selecionados de entre o grupo compreendendo -H ou um grupo alquilo linear ou ramificado tendo 1 a 6 átomos de carbono, Y e Z, iguais ou diferentes um do outro, são selecionados de entre o grupo que compreende -H, -OH, -COOH,-0R3,-CH(0R3)COOH, em que R3 é selecionado de H, um grupo alquilo linear ou ramificado tendo 1 a 6 átomos de carbono, e sais farmaceuticamente aceitáveis ou ésteres do mesmo, para a utilização no tratamento da componente imuno-inflamatória da doença celíaca.

   2. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o referido composto é selecionado a partir do grupo que compreende: - (±) 3-(3'-aminofenil)-2-hidroxi-propiónico de fórmula 1 OH

   ácido 2-(4-aminofenil)-2-metoxiacético, ácido 2-(3-aminofenil)-2-etoxiacético, ácido 2-(4-aminofenil)-2-etoxiacético, ácido 3-(4'-aminofenil)-2-metoxipropiónico de fórmula O

   ácido 3-(4'-aminofenil)-2-etoxipropiónico de fórmula
2. 2 ácido 3-(3'-aminofenil)-2-metoxipropiónico de fórmula

   ácido 3-(3'-aminofenil)-2-etoxipropiónico de fórmula

   3