PT2212673E - Dispositivo para a deteção magnética de partículas individuais num canal microfluídico - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "DISPOSITIVO PARA A DETEÇÃO MAGNÉTICA DE PARTÍCULAS INDIVIDUAIS NUM CANAL MICROFLUÍDICO" A invenção refere-se a um dispositivo para a deteção de particulas de um fluido, principalmente para a deteção dinâmica de particulas.

Por meio de imunof luorescência podem com um sistema FACS (FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting/citometria de fluxo) ser analisadas e separadas partículas marcadas, principalmente também populações de células (D. Huh et al., Physiol. Meas. 2005, 26, R73-R98). Para este efeito uma população de células é bombeada por um tubo capilar, onde células individuais em sequência são por intermédio de uma ótica externa examinadas quanto às suas propriedades fluorescentes. As células são, diretamente após a sua deteção de fluorescência num difusor, individualmente atomizadas em goticulas e as goticulas eletricamente carregadas com células marcadas. Por intermédio de um desvio das goticulas carregadas num campo elétrico, as células marcadas podem ser separadas de uma grande população de células. Os aparelhos FACS operam neste caso com múltiplos marcadores e a velocidades de ~105 células/min. Este método representa o Standard industrial. A desvantagem de FACS está nos elevados custos de aquisição e de manutenção, bem como na complexidade do sistema, o qual requer pessoal treinado para a função.

Além da separação FACS são na bibliografia descritos sistemas os quais se baseiam em princípios imunomagnéticos, em que neste caso está salientada principalmente a deteção de células marcadas e menos salientada a sua separação. São utilizados separadores dipolares e quadripolares macroscópicos, bem como SQUIDS1 (Superconducting Quantum Interference Devlce). A 2 desvantagem destas abordagens magnéticas é a falta de praticabilidade (não é possivel uma miniaturização) e os custos elevados. Os sistemas dipolares e quadripolares são analogicamente aos FACS instrumentos complicados e dispendiosos, os quais devido à sua dimensão só apresentam uma reduzida taxa de reencontro de células marcadas. SQUIDs devem ser refrigerados a menos de 100 K, para serem funcionais. Além disso, devido à refrigeração, torna-se necessária uma construção mais complexa do detetor, o que contraria a elevada sensibilidade dos SQUIDs.

Em sistemas modernos de separação de células é utilizado MACS (Magnetic Activated Cell Sorting) . Neste caso as nanoparticulas paramagnéticas, as quais estão revestidas com anticorpos monoclonais, são misturadas com uma suspensão celular. Os anticorpos ligam ao antigénio especifico na superfície da célula. Quando a suspensão celular passar por um forte campo magnético numa coluna, os complexos de nanoparticulas celulares permanecem na coluna, enquanto que as células livres passam de imediato (seleção negativa). Quando a coluna for retirada do campo magnético, os complexos de nanoparticulas celulares podem ser recuperados (seleção positiva). Células que aderem em esférulas são viáveis e o complexo de esférulas de anticorpos pode ser retirado da superfície da célula. MACS é completamente compatível com FACS. Após a separação magnética (100 vezes de enriquecimento de até 109 células em 15 min.) pode de imediato ser efetuada uma análise por citometria de fluxo com marcação de fluorescência. A desvantagem deste processo reside na necessidade de uma marcação dupla (magnética e fluorescente), para realizar uma análise de separação das células de custos mais favoráveis e de uma separação mais apurada. 3 0 documento US2006/081954 AI descreve um sistema para a deteção dinâmica e a seleção de células assinaladas de forma superparamagnética, um canal de microfluídicos e uma ligação em ponte tipo Wheatstone com elementos magnetorresistivos, em gue o canal de microf luídicos está de tal modo disposto na ligação em ponte, que as células assinaladas magneticamente que passam pelo canal microfluídico influenciam de forma mensurável o alinhamento da ligação em ponte. Além disso dois elementos de ponte fora da zona de deteção do canal microfluídico são elementos diagonais opostos da geometria de Wheatstone, tendo os elementos da ponte uma distância geométrica de pelo menos um tamanho de célula. 0 objetivo da presente invenção é portanto a supressão das desvantagens do estado da técnica e criar um dispositivo exato de baixos custos e um método para a deteção de partículas magneticamente marcadas, principalmente de células. 0 objetivo atingido e portanto o objeto da invenção é um dispositivo para a deteção dinâmica e a seleção superparamagnética de células marcadas, de acordo com a reivindicação 1, um canal microfluídico e uma ligação em ponte tipo Wheatstone disposta na mesma compreendendo pelo menos um elemento magnetorresistivo, em que o canal microfluídico está disposto na ligação em ponte, de modo que as partículas marcadas magneticamente que passam pelo canal microfluídico influenciam de forma mensurável o alinhamento da ligação em ponte. 0 sensor magnetorresistivo é portanto realizado pela disposição de pelo menos um elemento magnetorresistivo sob forma de um contador de Wheatstone em ponte. Para a prova dinâmica de partículas magnéticas os elementos da ponte estão 4 a uma distância geométrica de pelo menos do tamanho da partícula respetivamente da célula.

Neste caso dois elementos diagonais estão dispostos no interior e dois elementos diagonais no exterior da zona de deteção do canal microfluídico, pelo que a resolução local é duplicada, ou 3 elementos de ponte estão dispostos no exterior do canal microfluídico e um elemento de ponte no interior da zona de deteção do canal microfluídico, pelo que a resolução local é quadruplicada.

Objeto da invenção é além disso um método para a deteção dinâmica e a seleção de células marcadas de forma superparamagnética, de acordo com a reivindicação 3, em que através de um canal microfluídico flúem partículas marcadas magneticamente, as quais devido ao campo magnético de dispersão gerado pelas mesmas influenciam pelo menos uma resistência magnetorresistiva da ligação em ponte de Wheatstone disposta à volta do canal microfluídico de tal modo que resulta um desvio mensurável da ponte. A solução proposta baseia-se na aplicação de elementos magnetorresistivos, os quais são integrados nos canais microfluídicos. A deteção de células efetua-se - de forma diferente do que em todas as abordagens imunomagnéticas até à data - de forma dinâmica durante o fluxo das células através de um canal microfluídico.

Neste caso são por intermédio da determinação dos diferentes tempos de relaxação da magnetização pelas medições resolvidas temporariamente com sensores magnetorresistivos, obtidas no processo informações úteis adicionais sobre as células marcadas de forma superparamagnética ou os tipos de células e 5 o dispositivo compreende meios adequados para a obtenção destas informações.

De forma favorável são aplicados pelo menos dois tipos de partículas magneticamente marcadas, por um lado partículas permanentemente magnetizadas, cujo momento dipolar continua a permanecer também após a supressão de um campo magnético exterior necessário para a magnetização e por outro lado partículas marcadas temporariamente de forma magnética, as assim denominadas partículas superparamagnéticas, principalmente também nanopartículas. Por intermédio de um campo magnético exterior ligado a montante estas partículas são temporariamente magnetizadas, e a magnetização diminui em dependência da partícula superparamagnética com um tempo de decaimento característico. A diferença do tempo de decaimento permite a realização da deteção dinâmica e seleção aqui descrita.

As últimas mencionadas partículas marcadas de forma superparamagnética são utilizadas na deteção dinâmica e na seleção aqui descrita.

Por outro lado as partículas ferromagnéticas não têm preferência, existe o risco que estas formem aglomerações, podendo nesta deposição prejudicar o sensor respetivamente bloquear o canal microfluidico.

Campo magnético de dispersão significa que o campo gerado devido às partículas magneticamente marcadas foi induzido por intermédio de um campo externo.

As partículas superparamagnéticas são geradas pelo facto de que estas são polarizadas. Quando o campo externo desaparecer 6 não resta após um determinado tempo de decaimento nenhum dipolo. A medição dinâmica efetua-se por meio de um canal microfluidico. 0 canal microfluidico está ajustado à dimensão das células analisadas, de modo a permitir uma deteção individual com elevada taxa de recuperação. 0 canal microfluidico é de acordo com uma forma de realização preferencial moldado com meios micro-mecânicos, por exemplo por meio de causticação de um disco de silicio. A adaptação do canal microf luidico efetua-se de tal modo que cada partícula ou cada célula flúi individualmente pelo canal microfluidico, não tendo portanto no canal várias partículas espaço umas ao lado das outras. 0 canal microfluidico pode, por exemplo, também ser produzido por intermédio de uma técnica de moldagem, de modo que este, por exemplo, seja produzido por meio de fundição de um silicone sobre uma matriz de silício. 0 canal microfluidico é de preferência de um material transparente.

Em complemento à deteção dinâmica e à seleção pode também ser aplicado mais outro método de deteção ótico, elétrico, magnético e/ou outro, para analisar o fluido que se encontra no micro-canal.

As possibilidades de deteção: a) Óticas:

Por meio de microscopia, medição de absorção ou fluorescência são detetadas todas as células num canal microfluidico e calculada a porção de células marcadas por meio de medição comparativa com uma componente magnetorresistiva. 7 b) Elétricas:

Por meio de espectroscopia de impedância, métodos de medição capacitivos, resistivos ou dielectroforéticos é de forma análoga à determinação ótica contada a passagem de células individuais no canal microfluidico e novamente por meio de medição com um detetor magnetorresistivo calculada a porção de células marcadas por meio de medição de diferenças com o número registado de células marcadas. c) Magnéticas (1 tipo de nanopartícuias magnéticas):

Cada célula que passa pelo canal microfluidico adaptado à dimensão da célula - é na zona do sensor magnetorresistivo devido ao volume celular deslocada a solução aquosa, existindo assim menos nanopartículas magnéticas livres. Este empobrecimento temporário de nanopartículas leva a um sinal de medição mais reduzido e permite a deteção de células não marcadas. No caso de uma célula marcada será detetado um grande sinal de medição, dado que as nanopartículas magnéticas na superfície da célula ou no interior da mesma estão enriquecidas. d) Magnetorelaxometria: 0 comportamento de decaimento do momento magnético de nanopartículas é determinado pela dimensão da própria partícula e pela ligação a outras partículas ou substratos. Dado à determinação dos diferentes tempos de relaxação devido às medições resolvidas temporariamente com o sensor magnetorresistivo, podem ser obtidas úteis informações complementares. Por exemplo células ligadas podem ser diferenciadas de células livres. É admissível equipar diferentes tipos de células ou células com diferentes ligações de 8 antígenes e ligar respetivamente nanopartículas de diferentes dimensionamentos. Também células de diferentes dimensões como ligantes na mesma espécie de nanopartículas podem deste modo ser diferenciadas. A estrutura esquemática é mostrada nas figuras. Uma disposição em ponte de Wheatstone de geralmente 4 resistências magnetorresistivas é disposta de tal modo que duas resistências são conduzidas por baixo de um canal microfluídico e duas resistências permanecem fora da zona microfluídica, de modo a obter uma dessintonização máxima da ponte pelas células magneticamente marcadas. A disposição dos 4 elementos é contudo variável e conforme a disposição a sensibilidade do sinal ou a resolução local do dispositivo e do método podem ser otimizadas.

Além disso não é obrigatório que 4 elementos magnetorresistivos sejam realizados na ligação em ponte. De igual modo também podem existir 2 elementos magnetorresistivos com duas resistências convencionais em combinação na ponte. Ou qualquer outra combinação, desde que exista pelo menos um elemento magnetorresistivo na ligação em ponte.

Os elementos magnetorresistivos podem ser tanto elementos magnetorresistivos convencionas, como são por exemplo descritos na DE 102 02 287, contudo também pode tratar-se de elementos magnetorresistivos orgânicos, como por exemplo conhecidos a partir da DE 10 2006 019 482.

Por meio de medições magnetorresistivas torna-se acessível uma análise e uma separação de partículas, por exemplo de populações heterogéneas de células na base de características celulares. Para a separação destas populações heterogéneas de células recorre-se a marcadores imunomagnéticos 9 (nanopartículas ligadas a um recetor ou a um ligante) . As células marcadas são magnetizadas num campo magnético externo e produzem deste modo um campo magnético de dispersão, o qual pode ser detetado por um elemento magnetorresistivo. Por intermédio da aplicação de magnetorelaxometria (comportamento de decaimento temporal do campo de dispersão) podem ser distinguidas entre si nanopartículas magnéticas livres e ligadas de forma diferente. Não são necessárias mais outras marcações fluorescentes ou similares para a separação respetivamente a análise da população de células.

As células marcadas são detetadas por uma componente magnetorresistiva, ao passo que as células não marcadas podem ser detetadas de forma ótica, elétrica ou magnetorresistiva. 0 dispositivo e o método de acordo com a invenção têm o potencial de substituir a medição fluorescente aquando da análise FACS convencional. Aquando do tipo inicialmente mencionado de deteção de células com fluorescência, as células são introduzidas num pequeno capilar. A deteção de fluorescência efetua-se de forma discreta em células individuais. As células individuais são atomizadas em pequenas goticulas e dependentes de uma deteção fluorescente carregadas eletricamente. As goticulas carregadas são desviadas para um coletor e reunidas num recipiente. 0 sensor GMR é neste caso aplicado antes do atomizador. Com esta estruturação podem ser atingidas medições até ao âmbito de MHz. A vantagem desta estruturação consiste na miniaturização maciça e na possibilidade de paralelização. Além da separação com o auxílio de um atomizador pode além disso ser realizada uma análise da população de células. 10

Nas aplicações da técnica sensorial GMR até à data conhecidas na biologia e na medicina (sensor DNA) é detetado material imobilizado, marcado magneticamente. Utiliza-se neste caso um processo de seleção estática. Para a medição dinâmica de analitos individuais exposta nesta invenção, é favorável uma consulta de alta-frequência do estado do sensor. Isto por exemplo é realizado pelo sensor por intermédio de um varrimento de campo na zona relevante da caracteristica, de forma tipica com frequências essencialmente maiores de 1 KHz, Uma divergência na amplitude sensorial ou uma descontinuidade na sensibilidade do sensor (sinal diferenciado) são por exemplo caracteristicas para uma deteção de incidentes.

Este método de seleção permite além disso a utilização de uma filtragem Lock-in eletrónica para a preparação do sinal útil. Deste modo a sensibilidade da prova de incidente pode ser nitidamente aumentada.

Para uma prova dinâmica de partículas magnéticas, os elementos de ponte estão portanto a uma distância geométrica de pelo menos uma dimensão de partícula. A ponte tem então uma extensão efetiva de quatro diâmetros de partículas. A deteção de partículas que se seguem estreitamente umas às outras torna-se então um problema. Sob a condição prévia de que o canal fluídico possa ser fabricado com precisão micro-tecnológica e ser posicionado com elevada exatidão sobre um chip de suporte, a geometria da ligação em ponte pode ser modificada de tal modo que respetivamente dois elementos diagonais da geometria de Wheatstone estejam situados no interior e os outros dois elementos diagonais no exterior da célula microfluídica. Deste modo a resolução espacial para a deteção de partículas é duplicada. 11

Num outro exemplo de realização três elementos de ponte são posicionados no exterior da zona de deteção. Deste modo a sensibilidade do sinal do sensor é dividida pela metade. A resolução espacial é no entanto quadruplicada. A seguir a invenção é ainda na base de figuras explicada em pormenor:

Figura 1 Figura 2 Figuras 3 e 4 Figura 5 mostra um diagrama de uma forma de realização da invenção, mostra a relaxação magnética de nanopartículas magnéticas, mostram um exemplo para uma consulta de alta-frequência do estado do sensor da medição, um diagrama da sensibilidade sensorial ou sensividade.

Na fig. 1 pode ser vista uma estrutura exemplificativa para uma disposição geométrica da ponte, na qual 2 elementos de ponte, portanto por exemplo duas resistências magnetorresistivas RI e R3, estão dispostos no exterior do canal microfluidico 1, e 2 elementos de ponte, por sua vez ou resistências elétricas ou magnetorresistivas R2 e R4, estão dispostos por baixo do canal microfluidico portanto no interior da assim denominada zona de deteção do canal microfluidico. Pelo menos uma resistência é uma resistência magnetorresistiva. No canal microfluidico 1 podem ser vistas células individuais 2. As setas indicam a direção na qual corre o fluido. A fig. 2 mostra uma disposição modificada da ponte de Wheatstone. Pode ver-se novamente o canal fluidico 1 e novamente 4 resistências, RI até R4, as quais estão dispostas numa ligação em ponte tipo Wheatstone. 12

Na fig. 3 é mostrado de forma exemplificativa como é medida a relaxação magnética de nanopartículas magnéticas. Esta figura mostra o tempo de relaxação como função do diâmetro (hidrodinâmico) da partícula, em que esta última é, por exemplo, mencionada na página 693, coluna da direita, linhas 13 - 18, da publicação de F. Ludwig, E. Heim, S. Mauselein, D. Eberbeck and M. Schilling; "Magnetorelaxometry of magnetic nanoparticles with fluxgate magnetometers for the analysis of biological targets" J Magnet Magn. Mat. 2005; 293 (1):690-695. A fig. 4 mostra um diagrama da amplitude do sinal e a fig. 5 um diagrama da sensibilidade do sensor ou da sensitividade.

Os fluoróforos podem aquando de análises de longa duração ser metabolizados ou desvanecem. Nanopartículas magnéticas são bioquimicamente resistentes e opticamente indiferentes. Com isto pode, por exemplo, num sistema miniaturizado ser observada continuamente a cinética de reação. 0 dispositivo e o método de acordo com a invenção são entre outros adequados para estudos a longo prazo. As nanopartículas quimicamente estáveis podem ser durante prolongados períodos temporais adicionadas a uma experiência celular.

Pode por exemplo com isto ser estudada continuamente a expressão gênica de proteínas de superfície. Outras aplicações podem ser os testes de adesão celular, testes de toxicidade e outros.

Com a invenção é apresentado pela primeira vez um método dinâmico, e o qual pode ser bem miniaturizado, para a deteção e seleção de células magnetizadas.

Lisboa, 25 de Junho de 2012

Claims (6)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Dispositivo para a deteção individual dinâmica e para a seleção de células marcadas de forma superparamagnética, compreendendo um canal microfluidico adaptado à dimensão das células analisadas e de uma ligação em ponte tipo Wheatstone com pelo menos um elemento magnetorresistivo disposto no mesmo, em que o canal microf luidico está disposto de tal modo na ligação em ponte, que as células marcadas magneticamente que flúem pelo canal microfluidico influenciam de forma mensurável o alinhamento da ligação em ponte, em que 3 elementos de ponte estão dispostos no exterior do canal microf luidico e um elemento de ponte no interior da zona de deteção do canal microfluidico, ou dois elementos de ponte no interior e dois elementos de ponte no exterior da zona de deteção do canal microfluidico, em que dois elementos de ponte fora da zona de deteção do canal microfluidico são elementos diagonais da geometria de Wheatstone situados opostos, e em que os elementos da ponte se situam a uma distância geométrica de pelo menos um tamanho da célula, e em que este dispositivo é além disso caracterizado por compreender os meios para a obtenção de informações úteis complementares sobre as células marcadas de forma superparamagnética ou tipos de células, por intermédio da determinação de diferentes tempos de relaxação da magnetização por meio de medições resolvidas temporariamente com o sensor magnetorresistivo.

2. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, em que o canal microf luidico está de tal modo adaptado ao tamanho das partículas, que as partículas passam individualmente pelo canal.

3. Método para a deteção individual dinâmica e seleção de células marcadas superparamagneticamente, em que por um canal 2 microfluídico adaptado ao tamanho das células analisadas flúem células marcadas superparamagneticamente, as quais pelo campo magnético de dispersão gerado por elas influenciam pelo menos uma resistência magnetorresistiva da ligação em ponte tipo Wheatstone disposta à volta do canal microfluídico de tal modo que resulta um alinhamento mensurável da ponte, em que a deteção das células se efetua de forma dinâmica durante o fluxo de células por um canal microf luídico e em que as células são magnetizadas temporariamente por um campo magnético exterior disposto a montante e a magnetização diminuir em dependência das células marcadas superparamagneticamente, e em que este método é caracterizado que pela determinação dos diferentes tempos de relaxação por medições resolvidas temporariamente com o sensor magnetorresistivo serem obtidas informações úteis complementares sobre as células ou tipos de células marcadas superparamagneticamente.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, o qual está acoplado com mais outro método para a deteção, tal como um método ótico, elétrico ou magnético para a deteção e/ou seleção.

5. Método de acordo com uma das reivindicações 3 ou 4, o qual é aplicado na análise FACS convencional "Flourescence Activated Cell Sorting".

6. Utilização de um dispositivo de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2 ou do método de acordo com uma das reivindicações 3 até 5 em testes de adesão celular e/ou testes de toxicidade. Lisboa, 25 de Junho de 2012