PT2092081E - Métodos e utilizações envolvendo anomalias genéticas no cromossoma 12 - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Métodos e utilizações envolvendo anomalias genéticas no cromossoma 12"

Campo da invenção A presente invenção refere-se aos campos da genética e da oncologia e proporciona métodos para a previsão e identificação de tumores de origem epitelial. Especificamente, a presente invenção refere-se a um novo método de previsão da iniciação de tumores, progressão de tumores e/ou carcinomas, o método compreendendo a detecção de uma anomalia genética associada a tumores de origem epitelial. A presente invenção refere-se adicionalmente a um novo método de identificação de um indivíduo com potencial para o desenvolvimento de carcinoma, o método compreendendo a detecção de anomalias genéticas. A presente invenção também se refere a um método de previsão da progressão de carcinomas e da sua transformação numa variante agressiva, o método compreendendo a detecção de anomalias genéticas, que indicam a probabilidade de desenvolvimento de carcinoma. A presente invenção também se refere à utilização de uma região cromossómica, um gene ou um seu fragmento, específicos, e/ou de marcadores genéticos para a previsão da iniciação de tumores, progressão de tumores e/ou carcinoma. A presente invenção também se refere à utilização de uma região cromossómica ou de um gene ou um seu fragmento específicos em terapia, para o desenvolvimento de terapia e para a preparação de um medicamento para tratamento de tumores de origem epitelial.

Anterioridade da invenção O cancro é uma doença complexa em que se acumularam várias anomalias genéticas e epigenéticas. São necessárias um número variável de alterações genéticas antes da ocorrência de um tumor somaticamente desenvolvido. Os dados disponíveis indicam que o desenvolvimento de tumores sólidos depende da combinação de deleções e amplificações de múltiplos segmentos cromossómicos (Mertens et al. Câncer Res 57: 2765-2780, 1997;

Mitelman et al. Nature Genet, 15: 417-474, 1997). Mais de 90% de todas as neoplasias humanas derivam de epitélios. Assim, as células epiteliais desempenham um importante papel nas condições fisiológicas e patofisiológicas. Os carcinomas são tumores malignos derivados de células epiteliais. Os 2 ΕΡ 2 092 081/PT carcinomas mais comuns incluem as formas comuns de cancro da mama, da próstata, do pulmão e colorrectal. O cancro colorrectal é o terceiro cancro mais comum mundialmente com uma estimativa de um milhão de novos casos anualmente (Parkin et al. CA Câncer J Clin 55: 74-108, 2005). O risco médio ao longo da vida em paises industrializados é de aproximadamente 5%, e quase metade dos que são afectados morrerão da sua doença (Burt, Gastroenterology 119: 837-853, 2000). O cancro colorrectal desenvolve-se por via de uma lesão precursora benigna, o pólipo, e pode ser prevenido através de polipectomia. Estima-se que 30% da população tem pólipos colónicos, e a incidência de pólipos aumenta com a idade. Assim, colonoscopias de rastreio em indivíduos assintomáticos revelaram pólipos neoplásicos (adenomatosos) em 12% dos indivíduos de 40-49 anos de idade (Imperiale TF et al. NEJM 346: 1781-1785, 2002), e em 58% entre os indivíduos de 50-59 anos de idade (Mehran A et al. Surg Endosc 17: 1974-1977, 2003). Determinadas desordens hereditárias, que montam em cerca de 5-10% da carga total de cancro colorrectal, estão associadas a um número aumentado de pólipos (polipose adenomatosa familiar, PAF) ou a uma elevada tendência para progressão maligna (cancro colorrectal hereditário não polipóide, CCRHNP) (Lynch e de la Chapelle, N Engl J Med 348: 919-932, 2003). A sobrevivência está estreitamente relacionada com o estádio aquando do diagnóstico, mesmo em pacientes que já desenvolveram doença maligna: mais de 90% dos pacientes com cancro local estão vivos após 5 anos em oposição a menos de 10% dos que têm doença metastática (Burt, Gastroenterology 119: 837-853, 2000). Os carcinomas colorrectais são notoriamente resistentes tanto a quimioterapia como a radioterapia e a maioria dos pacientes para quem a cirurgia apenas não é curativa estão condenados a morrer da sua doença (Globcan, International Agency for Research on Câncer. Disponível em http:/www-dep.iarc.fr/, 2002). É portanto vital ser possivel identificar indivíduos com um risco acrescido tão precocemente quanto possível para permitir uma eficiente prevenção ou tratamento curativo do cancro. 3 ΕΡ 2 092 081/ΡΤ Ο desenvolvimento de cancro colorrectal por via de precursores benignos conjuntamente com a acumulação de alterações genéticas constituem um dos mais bem conhecidos exemplos de carcinogénese em múltiplas etapas (Chung DC, Gastroenterology 119: 854-865, 2000, e adiante). Esta natureza evolucionária em múltiplas etapas do cancro colorrectal proporciona excelentes oportunidades para uma precoce detecção e prevenção do cancro. Os cancros colorrectais surgem em resultado da acumulação em etapas de mutações ao nivel dos nucleótidos e/ou ao nivel cromossómico. A esmagadora maioria dos cancros colorrectais exibem um dos dois principais fenótipos de instabilidade genómica, instabilidade de microssatélites (MSI) ou instabilidade cromossómica (CIN) (Abdel-Rahman et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98: 2538-2543, 2001) . A literatura presente inclui uma multiplicidade de biomarcadores com potencial utilidade na avaliação do risco de cancro colorrectal ou na detecção precoce deste cancro; contudo, carece amplamente a validação clinica (Umar e Srivastava, Dis Markers 20: 87-96, 2004).

Presentemente, a histologia serve como principal previsor, com multiplicidade de adenomas, displasia de alto grau, caracteristicas vilosas e grande dimensão (mais de 1 cm), do risco acrescido de cancro (Winawer et al. Gastroenterology 130: 1872-1885, 2006). Portanto, seriam úteis previsores de patologia avançada, tanto para adenomas como para o cancro, para ser possível atribuir uma categoria de risco apropriada a cada paciente. Biomarcadores que pudessem servir como previsores de uma tendência para a progressão de cancro seriam altamente bem-vindos. O cancro do pulmão é uma das principais causas das mortes relacionadas com o cancro a nível mundial, com aproximadamente 1,2 milhões de mortes anualmente (Ferlay et al. 2001, GLOBOCAN2000: Câncer Incidence, Mortality and Prevalence

Worldwide, Version 1.0 IARC CancerBase No. 5. Lyon, IARCPress). Até 95 porcento dos cancros do pulmão estão relacionados com o hábito de fumar e portanto, os aductos de ADN têm um papel chave na carcinogénese.

Os pacientes que sofrem de cancro do pulmão têm frequentemente um fraco prognóstico, variando as taxas de 4 ΕΡ 2 092 081/ΡΤ sobrevivência durante cinco anos de aproximadamente 50% a 10% (Hasleton PS, Respiratory system 1.0 em Câncer Handbook. http:www.cancerhandbook.net, London: Nature Publishing Group, 2001) . Contudo, quando o cancro do pulmão é detectado num estádio precoce e é possivel a cirurgia, as taxas de sobrevivência durante cinco anos podem atingir 85%. Assim, previsores de iniciação e/ou de progressão de tumores seriam valiosos para possibilitar uma eficaz prevenção ou terapia do cancro.

As malignidades do pulmão podem ser divididas com base nas caracteristicas histológicas em cancros do pulmão de células pequenas (CPCP) e de células não pequenas (CPCNP), consistindo estes últimos principalmente em carcinoma epidermóide e adenocarcinoma. Estudos recentes mostraram que a base genética é diferente entre estes tipos de cancro (Kaminski et al. Chest 125 (5 Suppl): 111 S-5S, 2004, Fong et al. Thorax 58: 892-900, 2003). Contudo, assume-se que são necessárias mais de 20 anomalias genéticas ou epigenéticas antes de ser clinicamente evidente um cancro do pulmão. Tipicamente, nos carcinomas do pulmão, podem ser observadas múltiplas aberrações cromossómicas indicando uma instabilidade genómica. Novos marcadores tumorais explicariam a patogénese do cancro e portanto, melhorariam o efeito das terapias e a sobrevivência nos cancros do pulmão. O campo do diagnóstico anseia por marcadores individuais ou um painel de marcadores para o rastreio geral de cancros. Por exemplo, o antigénio especifico da próstata (PSA) é segregado pelas células da glândula da próstata e niveis elevados de PSA são utilizados como um marcador para tumores da próstata.

Estão disponíveis vários outros marcadores para tumores epiteliais mas a sua utilização é dificultada pela sua ausência de especificidade: Estes marcadores estão frequentemente elevados também em outras condições para além da malignidade, tais como lesões inflamatórias. Os marcadores que têm sido utilizados clinicamente mas não cumprem o requisito de especificidade e/ou sensibilidade são, por exemplo, os seguintes: antigénio específico do cólon derivado de tumores (tCSA), antigénio carcinoembrionário (CEA), alfa- 5 ΕΡ 2 092 081/ΡΤ fetoproteína (AFP), beta-glicoproteína 1 específica da gravidez (SP1), lactogénio placentário humano (HPL), gonadotropina coriónica beta humana (beta-HCG), transferrina (TF) e ferritina (FE). É da maior importância desenvolver novos métodos, que permitam a identificação precoce de pacientes com um risco acrescido de desenvolvimento de carcinoma agressivo para permitir uma eficiente prevenção do cancro. Existe também necessidade de um método clinicamente útil que possa servir como previsor de uma tendência para progressão de carcinoma. Também, são grandemente necessários meios adicionais para o desenvolvimento de novas orientações para a iniciação e seguimento da terapia do cancro.

Schneider, B.G. et al., J. Clin. Pathol: Mol Pathol 2003; 56: 141-149, descrevem regiões de desequilíbrio alélico na porção distai do cromossoma 12q e sugerem que estas regiões podem conter genes supressores tumorais importantes no desenvolvimento de cancro gástrico. Especificamente, através do mapeamento de regiões alongadas de homozigocidade (EHR) em linhas celulares de cancro gástrico e locais de desequilíbrio alélico (AI) em adenocarcinomas gástricos primários, os autores identificaram três regiões que contêm genes supressores putativos no cromossoma 12 entre os marcadores de microssatélite D12S1667 e D12S88 (região A) , D121607 e D12S78 (região B) e D12S342 e D12S324 (região C). Não são mencionados genes supressores para a região A, que se localiza próximo da região cromossómica 12q21.2 identificada no presente pedido de patente como contendo aberrações genéticas que são específicas de tumores de origem epitelial. A publicação do pedido internacional de patente WO2005/118869 divulga um método para determinar se um paciente está afectado com cancro ou está em risco de desenvolver cancro. No método, o número de cópias de uma região comum mínima (MCR) numa amostra de um indivíduo é comparado com o número de cópias normal da MCR, em que a referida MCR é seleccionada do grupo de 54 MCR enumeradas na tabela 1. Estas MCR têm uma dimensão da ordem de megabases e não estão definidas nem estruturalmente nem funcionalmente. Uma das regiões é 12q21-q24.33, em que DUSP6 é indicado como um gene 6 ΕΡ 2 092 081/PT candidato codificando uma proteína da subfamília de fosfatases de proteínas de dupla especificidade. A região cromossómica específica 12q21.2 não é mencionada, nem o é o gene NAV3. A Tabela 4 de WO2005/118869 enumera um grande número de marcadores génicos presentes nas MCR que contêm uma deleção, incluindo no cromossoma 12, mas não menciona NAV3. Similarmente, na Tabela 5 os marcadores génicos presentes nas MCR, contendo uma amplificação, não incluem NAV3.

Aberrações no cromossoma 12q21, especificamente aberrações no gene neuron navigator 3 (NAV3), foram identificadas em neuroblastomas e no linfoma cutâneo de células T (LCCT). Quatro dos 10 neuroblastomas primários estudados por Coy et al. apresentaram expressão reduzida ou ausente de NAV3, e três deles tinham deleções homozigóticas de ambos os alelos (Coy JF et al. Gene 290: 73-94, 2002) . No LCCT, uma deleção ou uma translocação do gene NAV3 foi associada a uma mutação pontual no alelo remanescente apenas em um de 7 pacientes estudados (Karenko L et al. Câncer Res 65: 8101-8110, 2005 e EP1476567 Al). Em carcinomas pancreáticos, foram identificadas aberrações no cromossoma 12q21 por análise de microssatélites. Foi detectada perda de heterozigocidade (LOH, do inglês "Loss of heterozygoslty") com os marcadores D12S1684 e D12S1708, que delimitam uma região cromossómica compreendendo o gene NAV3 (Kimura M et al. Câncer Res 58: 2456-60, 1998). Contudo, a região cromossómica descrita no artigo de Kimura et al. é grande e não foi observado nem que a região específica nem o gene NAV3 estivessem ligados ao carcinoma pancreático. Pelo contrário, o presente pedido de patente descreve anomalias cromossómicas que são específicas para tumores de origem epitelial, na região cromossómica específica.

Estão garantidos novos biomarcadores para proporcionar um diagnóstico mais eficaz e precoce de tumores potencialmente agressivos assim como a identificação de tumores susceptíveis a terapias direccionadas. A presente invenção proporciona uma solução para a previsão ou identificação da progressão de tumores e de carcinoma. A presente invenção também divulga uma ferramenta para a avaliação da agressividade clínica de tumores epiteliais e da sobrevivência dos pacientes. 7 ΕΡ 2 092 081/ΡΤ

Adicionalmente, a invenção proporciona um novo alvo terapêutico para a prevenção ou terapia do carcinoma.

Breve descrição da invenção O objecto da invenção é assim proporcionar novos métodos e meios para o diagnóstico, classificação de estágios e monitoração de pacientes possuindo cancro, métodos e meios esses que permitem um diagnóstico precoce da doença.

Outro objecto da invenção consiste em proporcionar novos métodos e meios para a previsão da iniciação de tumores, progressão de tumores e/ou carcinoma.

Outro objecto da invenção consiste em proporcionar novos métodos e meios para a identificação de indivíduos com um risco acrescido de desenvolvimento de carcinomas, métodos e meios esses que são específicos e fiáveis e permitem a identificação tão precocemente quanto possível.

Ainda outro objecto da invenção consiste em proporcionar novos métodos e meios para a previsão da progressão de carcinomas e da transformação numa forma agressiva, métodos e meios esses que permitem uma intervenção terapêutica atempada, que pode salvar vidas.

Ainda outro objecto da invenção consiste em proporcionar novos métodos e meios para o desenvolvimento de novas orientações para a iniciação e seguimento de intervenções terapêuticas assim como para o desenvolvimento de novas modalidades de tratamento para cancros, métodos e meios esses que prolongam o estádio de remissão da doença, e introduzem novas possibilidades para o combate à doença e para a recuperação do paciente.

Ainda outro objecto da invenção consiste em proporcionar novos biomarcadores úteis na detecção precoce do cancro assim como na avaliação do risco de cancro. A presente invenção refere-se a um novo método para previsão da iniciação de tumores, da progressão de tumores e/ou de carcinomas, caracterizado pela detecção da presença ou da ausência de anomalias genéticas em 12q21.2 num gene neuron 8 ΕΡ 2 092 081/ΡΤ navigator 3 (NAV3) ou num seu fragmento, estando a presença das referidas anomalias genéticas associada a tumores de origem epitelial, numa amostra biológica. Por outras palavras, as anomalias genéticas indicam a presença de tumores epiteliais ou de uma iniciação ou progressão de tumores de origem epitelial e/ou de carcinoma. A presente invenção refere-se adicionalmente a um novo método para a identificação de um indivíduo com potencial para desenvolver carcinoma de origem epitelial, o método compreendendo a detecção de anomalias genéticas em 12q21.2 num gene neuron navigator 3 (NAV3) ou num seu fragmento, estando as referidas anomalias genéticas associadas a tumores de origem epitelial. Ou seja, as anomalias genéticas indicam tumores de origem epitelial com potencial para desenvolvimento de carcinoma. A presente invenção refere-se adicionalmente a um novo método de previsão da progressão de carcinomas de origem epitelial e/ou da sua transformação numa variante agressiva, caracterizado pela detecção de anomalias genéticas em 12q21.2 num gene neuron navigator 3 (NAV3) ou num seu fragmento, em que anomalias indicam a probabilidade de desenvolvimento de carcinoma. A presente invenção também se refere à utilização do gene NAV3 ou de um seu fragmento para a previsão da iniciação de tumores, da progressão de tumores e/ou de carcinoma, indicando anomalias genéticas no gene NAV3 tumores de origem epitelial. A presente invenção também se refere à utilização de marcadores genéticos em 12q21.2, para a previsão da iniciação de tumores, da progressão de tumores e/ou de carcinoma, caracterizada pela detecção da presença ou ausência de anomalias genéticas, indicando as referidas anomalias genéticas em 12q21.2 no gene NAV3 ou num seu fragmento, tumores de origem epitelial. As referidas anomalias genéticas estão associadas a tumores de origem epitelial e/ou a carcinoma. A presente invenção também descreve a utilização de uma região cromossómica especifica 12q21.2, especificamente o gene 9 ΕΡ 2 092 081/ΡΤ NAV3, um seu fragmento ou um seu produto génico, em terapia, para o desenvolvimento de terapia ou para a preparação de um medicamento para tratamento de tumores de origem epitelial.

Breve descrição dos desenhos

No que se segue, a invenção será descrita com mais detalhes por meio de concretizações preferidas com referência às figuras anexas, nas quais a Figura 1 mostra uma LOH observada no microssatélite D12S1708 do cromossoma 12 tanto em adenoma (meio) como em carcinoma (fundo) em comparação com o tecido normal seu correspondente (topo). a Figura 2 mostra uma MSI observada no microssatélite D12S1708 do cromossoma 12 no carcinoma (fundo) comparado com o tecido normal seu correspondente (topo). O adenoma (meio) é um MSS. a Figura 3 mostra uma extensão do iniciador de nucleótido único (SnuPE) apresentando a LOH num carcinoma (fundo) em comparação com o seu correspondente normal (topo). a Figura 4 mostra um cariótipo das células de carcinoma do pulmão malignas verdadeiras de um paciente com LCCT e CPCP. a Figura 5a mostra o resultado de FISH especifica de NAV3 com metástases de cancro da mama. As barras a negro indicam a quantidade de poliploidia em células estudadas e as barras a cinzento indicam a quantidade de células com deleção de NAV3. Os resultados estão apresentados como percentagem da contagem de células totais. a Figura 5b mostra células típicas de metástases de cancro da mama com deleção de NAV3. Os sinais a verde indicam centrómeros e os sinais a vermelho, cópias de NAV3 . a Figura 6 mostra uma comparação de resultados de FISH de NAV3 de amostras de cólon normal e de cancro do cólon. A análise FISH de NAV3 incluiu tanto amostras de cólon normal como amostras de OCR do mesmo paciente (n=36). Estão apresentados os valores médios (%) de cólon normal (barras a cinzento) e de cancro do cólon (barras a negro). 10

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Descrição detalhada da invenção

Verificou-se que anomalias em 12q21.l-q21.31, especificamente 12q21.2, estão associadas a tumores de origem epitelial.

Verificou-se que aberrações no cromossoma 12q21.l-q21.31, especificamente aberrações em 12q21.2, mais especificamente aberrações no gene NAV3, desempenham um papel no desenvolvimento de tumores de origem epitelial. A presente invenção baseia-se num método para a detecção de anomalias genéticas em 12q21.l-q21.31, especificamente 12q21.2, associadas a tumores de origem epitelial, excluindo o carcinoma do pâncreas.

Especificamente, anomalias genéticas na posição cromossómica 12q21.l-q21.31, especificamente 12q21.2, afectam o gene NAV3 ou um seu fragmento.

Especificamente, são detectadas anomalias genéticas no gene NAV3 ou num seu fragmento.

Numa concretização preferida do método da invenção o tumor de origem epitelial é um adenoma e/ou um carcinoma.

Em outra concretização preferida do método da invenção a localização do tumor de origem epitelial é cólon, recto, pulmão, bexiga urinária, mama, células escamosas ou basais. Por outras palavras, o tumor epitelial é um tumor no cólon, um tumor no recto, um tumor no pulmão, um tumor bexiga urinária, um tumor na mama, um tumor de células escamosas ou um tumor de células basais. No intestino grosso, os tumores colorrectais podem ser adenocarcinomas ou adenomas ou pólipos pré-malignos, na bexiga urinária o tumor pode ser pólipos epiteliais transicionais com fraca diferenciação ou carcinomas transicionais declarados, os tumores na mama podem ser carcinomas ductais ou carcinomas acinares e na pele, os tumores podem ser basaliomas ou carcinomas epidermóides (também denominados carcinoma de células escamosas ou carcinoma espinocelular). No pulmão, o tumor pode ser carcinoma epidermóide ou adenocarcinomas. 11

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Numa outra concretização preferida do método da invenção as anomalias genéticas são determinadas pela perda de heterozigocidade (LOH) do gene NAV3 ou de um seu fragmento, em que a LOH de NAV3 é indicativa de progressão tumoral.

Numa outra concretização preferida do método da invenção as anomalias genéticas do gene NAV3 são determinadas em células haplóides, diplóides e/ou poliplóides.

Numa outra concretização preferida do método da invenção as células tumorais são de microssatélites estáveis (MSS) ou microssatélites instáveis (MSI).

Numa outra concretização preferida do método da invenção o tumor de origem epitelial é outro que não o carcinoma do pâncreas. A presente invenção baseia-se também na utilização da região cromossómica 12q21.l-q21.31, especificamente 12q21.2, do gene NAV3 ou um seu fragmento, e/ou de marcadores em 12q21.l-q21.31, especificamente 12q21.2, associados a tumores de origem epitelial.

Numa concretização preferida os marcadores em 12q21.1-q21.31 incluem D12S1684, D12S326, D12S1708 e/ou rsl852464.

Numa concretização preferida os marcadores em 12q21.2 incluem D12S326 e/ou rsl852464.

Como aqui se utiliza, a expressão "anomalia genética" refere-se à presença de uma translocação, deleção, amplificação, inversão ou outro defeito em 12q21.l-q21.31, especificamente em 12q21.2.

Como aqui se utiliza, a expressão "deleção" refere-se à ausência de um nucleótido ou nucleótidos e/ou de um exão ou exões na sequência do gene, ausência essa que afecta adversamente a função do gene. A expressão também se refere à ausência do fragmento génico, do gene ou do fragmento cromossómico contendo o gene. 12

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Como aqui se utiliza, a expressão "outro defeito" refere-se a qualquer alteração genética, tal como uma substituição, uma adição, um polimorfismo, uma inserção, uma inversão, etc., que está associada a tumores de origem epitelial.

Como aqui se utiliza, a expressão "perda de heterozigocidade" (LOH, do inglês "Loss Of Heterozygosity") refere-se a perda da contribuição de um único progenitor para parte do genoma da célula. A LOH pode ser considerada como um evento para desmascarar um alelo mutante de um gene que pode desempenhar um papel na supressão da formação de tumores. Assim, a LOH é um importante marcador para a iniciação ou progressão de tumores.

Como aqui se utiliza, a expressão "BLOH" refere-se à LOH limítrofe (do inglês, "Borderline LOH", significando que um dos alelos na amostra de tumor possui 25%-39% de redução de sinal em comparação com o seu correspondente normal.

Como aqui se utiliza, a expressão "translocação" refere-se à transferência de regiões cromossómicas entre cromossomas não homólogos.

Como aqui se utiliza, a expressão "amplificação" refere-se ao ganho de material genético tal como um fragmento génico, um gene ou o fragmento cromossómico contendo o gene.

Como aqui se utiliza, a expressão "tumor" refere-se a uma massa anormal de tecido devido a um excesso anormal de divisões celulares ou ausência de morte celular normal. Os tumores podem ser benignos ou malignos, por outras palavras, não cancerosos ou cancerosos. Os tumores incluem adenomas, carcinomas ou pólipos.

Como aqui se utiliza, a expressão "adenoma" refere-se a um tumor não canceroso.

Como aqui se utiliza, a expressão "carcinoma" refere-se a um cancro de origem epitelial. 13

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Como aqui se utiliza, a expressão "epitelial" refere-se às células que revestem as superfícies internas e externas do corpo.

Como aqui se utiliza, a expressão "tumores de origem epitelial" refere-se a tumores, que surgem a partir de células epiteliais. Os tumores de origem epitelial incluem tumores como da mama, colorrectal, do pulmão, da bexiga urinária, da mama, de células escamosas, de células basais, da próstata, gástrico, do esófago e da boca/língua.

Os tumores epiteliais surgem a partir do epitélio, o conjunto especificado de células que cobrem órgãos e superfícies do corpo. O epitélio pode ser simples, tal como o epitélio de uma camada celular que cobre parte do tracto respiratório, duetos e dúctulos da glândula mamária ou intestino, ou pode ser estratificado, composto por várias camadas de células, tal como se encontra na camada superior da pele ou na bexiga urinária. O epitélio da pele é queratinizante, significando que enquanto as células basais da epiderme, que cobrem a pele, são redondas e proliferam, as células mais superiores são achatadas, não se dividem e o seu citoplasma está cheio com fibras de queratina. O epitélio urinário, por outro lado, não é queratinizante mas mesmo aqui, as células localizadas basalmente são redondas enquanto as células localizadas mais próximo da superfície são achatadas e por isso, este tipo de epitélio é denominado transicional.

Como aqui se utiliza, a expressão "indicando tumores de origem epitelial" refere-se ao facto da presença ou elevada probabilidade ou possibilidade de tumores epiteliais ser demonstrada ou descrita ou provada ou evidenciada.

Como aqui se utiliza, a expressão "variante agressiva" refere-se a um cancro, que cresce rapidamente e possivelmente metastatiza.

Como aqui se utilizam, as expressões "fragmento" ou "fragmento funcional" referem-se a uma parte do gene NAV3, que é detectável nos métodos da invenção tais como análise de LOH ou métodos de FISH. 14 ΕΡ 2 092 081/ΡΤ

Como aqui se utiliza, a expressão "produto génico" refere-se a um ARNm, uma proteina ou a qualquer produto originado directa ou indirectamente a partir do gene. O gene neuron navigator 3 (NAV3 ou POMFIL1) é um membro de uma familia de genes humanos recentemente identificada, que apresenta homologia com o gene unc-53, um gene guia de axónios de Caenorhabditis elegans (Maes et al. Genomics 80: 21-30, 2002). Partilha também sequências homólogas com RAINB1 humano (indutivel por ácido retinóico em células de neuroblastoma) um homólogo de mamífero de unc-53 (Merrill et al. PNAS 99: 3422-3427, 2002). Por previsão da estrutura o NAV3 possui domínios semelhantes a calponina e locais de ligação a SH3 sugestivos de um papel na sinalização celular (Coy JF et al. Gene 290: 73-94, 2002 e Maes et al. Genomics 80: 21-30, 2002) O NAV3 consiste em 39 exões e a sua expressão, baseada na detecção de ARNm, está largamente restrita ao tecido cerebral (Maes et al. Genomics 80: 21-30, 2002). Mostrou-se que o NAV3 produz transcritos que codificam proteínas de diferentes comprimentos e pode estar sujeito a splicing alternativo específico dos tecidos. A NAV3 é estruturalmente uma helicase e uma exonuclease, assemelhando-se às proteínas da síndrome de Wemer e Bloom com o papel na manutenção da estabilidade de cromossomas (Coy JF et al. Gene 290: 73-94, 2002, Maes et al. Genomics 80: 21-30, 2002). Subcelularmente, foi relatado que a NAV3 está localizada em pré-complexos nucleares (Coy JF et al. Gene 290: 73-94, 2002) e pode ter um papel no transporte nuclear, na formação de cinetócoros e controlo do ciclo celular (Fahrenkrog B e Aebi U, Nat Rev Mol Cell Biol 4: 757-66, 2003). Assim, a NAV3 pode ser um supressor tumoral haplo-insuficiente não clássico (Sherr CJ, Cell 116: 235-46, 2004).

Na presente invenção, foram estudadas anomalias genéticas em 12q21.l-q21.31, especificamente em 12q21.2, por análise de LOH para adenomas colorrectais, cancros de carcinomas do pulmão e cancro da bexiga urinária. Foi também utilizada hibridação in situ com fluorescência (FISH, do inglês "Fluorescence In Situ Hybridization") para tumores no cólon, cancro da mama, carcinoma de células basais (CCB) e carcinoma de células escamosas (CCE), e hibridação genómica comparativa (CGH) para cancros do pulmão, para escrutinar a posição cromossómica 12q21.l-q21.31, especificamente 12q21.2. 15

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Todos os marcadores de microssatélite (D12S1684, D12S326, D12S1708) assim como o marcador SNP (o rsl852464 intragénico de NAV3) apresentaram uma LOH em 12q21.l-q21.31 em adenomas e carcinomas colorrectais. Em amostras de cancro da bexiga urinária, foi detectada pelo menos LOH limitrofe com os referidos quatro marcadores. Os marcadores de microssatélite também apresentaram LOH em cancros do pulmão. Adicionalmente, a FISH revelou perda de 12q21 em tumores no cólon e tanto perda como ganho de 12q21 nos cancros da mama, carcinoma de células basais e carcinoma de células escamosas. A CGH revelou perda de 12q21 num cancro do pulmão. Assim, a perda ou o ganho de NAV3 surgem como um marcador de tumores originários dos epitélios.

Em adição, os adenomas e carcinomas colorrectais que surgem no mesmo paciente apresentaram LOH de NAV3 sugerindo que os pacientes de adenoma irão desenvolver carcinomas através de LOH de NAV3. Foi observada fraca diferenciação num adenoma com LOH de NAV3 e a dimensão da LOH de NAV3 em adenomas tendia a ser maior do que sem LOH.

Observámos agora que as anomalias cromossómicas encontradas em tumores epiteliais, de facto, ocorrem em tumores que surgem em todos os diferentes tipos de epitélio. Assim, os basaliomas (também denominados carcinomas basocelulares ou carcinomas de células basais) são formados a partir de células normalmente localizadas na parte mais basal da epiderme. Por outro lado, os carcinomas de células escamosas (também denominado carcinoma esquamosocelular ou carcinoma espinocelular), são formados a partir das células localizadas mais distalmente e este tumor apresenta frequentemente queratinização, um aspecto caracteristico de células queratinizantes. Os carcinomas da mama e os carcinomas colorrectais são exemplos de tumores malignos que surgem de um epitélio simples, possuindo apenas uma camada de células normalmente, mas mesmo aqui, o epitélio benigno original contém tipos de células diferenciadas, tais como células exócrinas da glândula mamária, que segregam leite ou muco, ou células Goblet que segregam muco no epitélio intestinal. 16

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Os tumores epiteliais podem ser benignos, pré-malignos ou declaradamente malignos. Observámos a anomalia cromossómica descrita com mais detalhes no presente pedido de patente na sua maioria em tumores malignos, carcinomas, mas também em algumas das condições pré-malignas, tais como grandes adenomas do cólon ou do recto.

Como as anomalias genéticas estavam associadas a tumores de origem epitelial, a presença dessas anomalias indica a iniciação, progressão e/ou presença de tumores de origem epitelial ou o desenvolvimento, progressão e/ou presença de carcinomas. Portanto, é possivel diagnosticar ou identificar os pacientes que têm o tumor de origem epitelial ou o carcinoma através da detecção da presença das referidas aberrações numa amostra biológica. É também possivel diagnosticar ou identificar os pacientes cujos tumores têm probabilidade de progredir ou desenvolver-se ou transformar-se numa variante agressiva através da detecção da presença das referidas aberrações. As amostras biológicas dos pacientes ou pacientes suspeitos podem ser rastreadas quanto à presença das referidas anomalias genéticas.

De acordo com o método da presente invenção, a presença ou a ausência de anomalias genéticas pode ser detectada a partir de uma amostra biológica através de qualquer método de detecção conhecido adequado para a detecção de translocações, deleções, inserções, etc. Estes métodos são facilmente reconhecidos pelos peritos na especialidade e incluem hibridações in situ com fluorescência, tais como hibridações in situ com fluorescência multicolorida, hibridação in situ multi-flúor (MFISH), cariotipagem espectral (SKY), marcação da razão de binário combinada (COBRA), cariotipagem por mudança de cor (CCK). Na hibridação genómica comparativa (CGH) as alterações genéticas são classificadas como ganhos e perdas de ADN. A CGH revela um padrão caracteristico que inclui aberrações aos niveis cromossómico e sub-cromossómico. As técnicas convencionais de coloração G-banding podem também ser utilizadas em casos em que é considerada suficiente a detecção pouco precisa de ganhos, perdas ou translocações. Os métodos preferíveis são os que são adequados para utilização em laboratórios clínicos. 17 ΕΡ 2 092 081/ΡΤ

De acordo com uma concretização preferida da presente invenção, que toma partido da identificação do gene NAV3 em tumores de origem epitelial, a presença ou ausência do gene NAV3, ou de um seu equivalente ou fragmento pode ser detectada a partir de uma amostra biológica por qualquer método de detecção conhecido adequado para a detecção de expressão de um gene (ou número de cópias), i.e. métodos baseados na detecção do número de cópias do gene (ou ADN) e/ou os que são baseados na detecção de produtos de expressão de genes (ARNm ou proteína). Estes métodos são facilmente reconhecidos pelos peritos na especialidade e incluem métodos convencionais de reacção em cadeia pela polimerase (PCR), RT-PCR, hibridações in situ, tais como FISH, hibridação in situ de ARNm, análise de Northern, análises de Southern e de Western, imuno-histoquímica, e outros imunoensaios, tais como ELISA. Os métodos preferíveis são os que são adequados para utilização em laboratórios clínicos de rotina.

De acordo com outra concretização preferida da presente invenção, que toma partido da análise da LOH para a detecção de anomalias do gene NAV3, podem ser detectadas a deleção, a conversão génica, a recombinação mitótica e a perda cromossómica. A LOH em cancros pode ser identificada pela presença de heterozigocidade num locus genético em ADN da linha germinal e pela ausência de heterozigocidade no mesmo locus nas células tumorais.

De acordo com outra concretização preferida da presente invenção, que toma partido dos marcadores adequados para detecção de anomalias do gene NAV3, os marcadores incluem quaisquer marcadores biológicos tais como marcadores de microssatélite, marcadores de SNP, quaisquer sondas, iniciadores ou anticorpos associados ao gene NAV3. São adequados numerosos métodos para a análise de ácidos nucleicos quanto à presença de variações da sequência específicas tais como polimorfismos, SNP, inserções ou deleções. As variantes alélicas podem ser discriminadas por exemplo por métodos enzimáticos, métodos electroforéticos e métodos físicos. Estes métodos incluem por exemplo polimorfismo de conformação de cadeia simples (SSCP) , análise de heterodúplices, análise de fragmentos, sequenciação de ADN, mini-sequenciação, métodos de extensão de iniciadores, microarrays, espectrometria de massa 18 ΕΡ 2 092 081/ΡΤ e cromatografia líquida de alta resolução desnaturante (DHPLC). As PCR são frequentemente utilizadas na análise de variações de sequência específicas ou exploradas em combinação com os métodos supramencionados.

No método da invenção, a amostra biológica pode ser qualquer amostra de tecido adequada, tal como uma biópsia do tecido epitelial ou do nódulo linfático ou de uma lesão tumoral metastática em qualquer órgão do corpo ou sangue completo. A amostra biológica pode ser, se necessário, pré-tratada de uma maneira adequada conhecida dos peritos na especialidade.

Em terapia, pode-se utilizar o restabelecimento da função normal do gene NAV3. Isto pode ser conseguido aumentando a expressão de genes funcionalmente homólogos, introduzindo um gene NAV3 intacto ou utilizando uma forma alterada do gene NAV3 ou um oligonucleótido anti-sentido contra o NAV3 em qualquer técnica presentemente disponível para terapia génica para prevenir a progressão de uma doença proliferante. Em particular, o crescimento de células tumorais pode ser retardado ou mesmo parado por esta terapia. Estas técnicas incluem os métodos de terapia ex vivo e in situ, o primeiro compreendendo a transdução ou transfecção de um gene NAV3 intacto ou alterado (ou seus domínios funcionais) numa forma recombinante ou peptídica ou na forma de oligonucleótidos anti-sentido ou num vector para o paciente, e o segundo compreendendo a inserção do gene ou oligonucleótido alterados num transportador, que é depois introduzido no paciente. Dependendo da doença a tratar, pode ser conseguida uma cura transitória ou uma cura permanente. Alternativamente, anticorpos monoclonais ou humanizados ou péptidos que se ligam à proteína NAV3 ou ao gene de fusão gerado em resultado da translocação, podem ser utilizados para suprimir a função da proteína NAV3 alterada e assim pode ser retardado ou mesmo parado o crescimento de células tumorais. Os anticorpos contra NAV3 podem também ser utilizados para transportar outros agentes, tais como substâncias citotóxicas, para as células de cancro que sobre-expressam o gene NAV3. Estes agentes podem então ser utilizados para matar especificamente as células cancerosas. 19

ΕΡ 2 092 081/PT Ο entendimento das aberrações genéticas ou das alterações cromossómicas, especialmente as associadas à iniciação de tumores, irá contribuir para o diagnóstico precoce de cancro e tratamento de pacientes. A presente invenção divulga pela primeira vez o papel da LOH de NAV3 em tumores epiteliais. A presente invenção também divulga gue quando a LOH de NAV3 é observada em adenomas colorrectais é provável que esse paciente vá desenvolver carcinomas também através da LOH de NAV3. A detecção de deleções ou outros defeitos do gene NAV3 como descrito na presente invenção, permite assim a identificação precoce de pacientes com um risco acrescido de desenvolvimento de cancro agressivo e permite a eficiente prevenção do cancro e o desenvolvimento de novos diagnósticos e seguimento de carcinomas, tais como cancro colorrectal ou cancro do pulmão. A descoberta de anomalias genéticas de NAV3 em tumores epiteliais também abre novas possibilidades no avanço das suas terapias.

Os exemplos que se seguem são dados para ilustração adicional da invenção.

Será óbvio para um perito na especialidade que, à medida que a tecnologia avança, o conceito inventivo pode ser implementado de várias maneiras. A invenção e as suas concretizações não estão limitadas aos exemplos descritos adiante mas podem variar dentro do âmbito das reivindicações.

Exemplo 1 a) Análise da perda de heterozigocidade (LOH) de NAV3 utilizando marcadores de microssatélite A histologia das amostras de tecido embebidas em parafina e fixadas em formalina foi verificada por um histopatologista. Os tumores, os adenomas ou áreas normais, foram dissectados para obter tecido puramente normal ou com pelo menos 50% de razão entre tecido de carcinoma ou adenoma para a preparação de ADN de acordo com um protocolo padrão. As secções embebidas em parafina foram cortadas com uma espessura de 10 ym e o ADN foi purificado a partir dos seguintes protocolos padrão (Isola et al. Am J Pathol 145: 1301-1308, 1994). 20

ΕΡ 2 092 081/PT A análise da LOH foi realizada para o gene NAV3. Foram escolhidos três marcadores de microssatélite que se estendem no locus do gene NAV3 em 12q21.l-q21.31 e circundam o gene em ambos os sentidos (as distâncias físicas entre os loci em mega-bases de acordo com http://www.ensembl.org são dadas entre parêntesis): pter D12S1684 -(0,8 Mb)- D12S326 -(0,2 Mb)- NAV3 -(3,8 Mb)- D12S1708 qter. As amostras de ADN foram amplificadas por reacção em cadeia pela polimerase (PCR) utilizando os iniciadores

seguintes: D12S1684F 5'cctgcatgcctcagttatga3', D12S1684R 5'aacaagccataccagtcagg3', D12S326F 5'accaggctcccctaaaagtg3', D12S326R 5'agaatgaccagacccacagg3', D12S1708F 5'gggaacttatgtcaa ggctagga3', D12S1708R 5'gatctagtgctcaagaggttttcaa3'. As reacções PCR foram realizadas num volume reaccional de 25 μΐ contendo 75-150 ng de ADN molde, tampão de PCR GeneAmp lOx (Applied Biosystems), 0,2 mM de mistura de dNTP (GE Healthcare Biosciences Ab), 0,8 umol de cada iniciador, e 1,5 U de polimerase AmpliTaq (AB). Utilizaram-se os seguintes ciclos de PCR para a amplificação: 94°C durante 3 minutos, 35 ciclos de desnaturação a 94°C durante 30 segundos, temperatura de hibridação de 60°C durante 30 segundos, e extensão a 72°C durante 45 segundos. A extensão final foi a 72°C durante 5 minutos. Os iniciadores directos foram marcados com fluorescência com FAM e os fragmentos de PCR foram corridos no sequenciador/genotificador ABI3730 e os resultados foram analisados utilizando o software GeneMapper v3 (Applied Biosystems). b) Análise da perda de heterozigocidade (LOH) de NAV3 utilizando extensão do iniciadores de nucleótido único (SnuPE, do inglês "Single nucleotide Primer Extension") O ADN foi preparado como acima.

Foi utilizado um método não radioactivo para quantificar a expressão relativa dos dois alelos de NAV3 em pacientes heterozigotas para o polimorfismo A/G de codificação (rsl852464) no interior do exão 19 do gene NAV3. A heterozigocidade para rsl852464 é de até 0,493 nos Caucasianos/Europeus, o que o torna um marcador altamente útil. A reacção de extensão de SNuPE é baseada na incorporação de um único ddNTP que é selecionado para permitir a extensão diferencial de um iniciador marcado hibridado próximo do local polimórfico. 21 ΕΡ 2 092 081/ΡΤ

Amostras de ADN genómico tumoral e normal correspondentes, dos mesmos indivíduos, foram primeiro amplificadas por PCR utilizando os iniciadores rsl852464F 5' CCTGCTATTTTCATCTTTCAAGC 3' e rsl852464R 5' GGCTGGGATGCTGTTTGAG 3' para obter um fragmento de PCR de 130 pb contendo o polimorfismo A/G. As reacções PCR foram realizadas num volume reaccional de 25 μΐ contendo 60-100 ng de ADN molde, tampão de PCR lOx GeneAmp (Applied Biosystems) , 0,2 mM de mistura de dNTP (GE Healthcare Biosciences Ab), 0,4 μΜ de cada iniciador, e 1,5 U de polimerase AmpliTaq (AB). Utilizaram-se os seguintes ciclos de PCR para a amplificação: 94 °C durante 3 minutos, 35 ciclos de desnaturação a 94°C durante 30 segundos, temperatura de hibridação de 56°C durante 30 segundos, e extensão a 72°C durante 45 segundos. A extensão final foi a 72°C durante 5 minutos. O produto da PCR foi subsequentemente purificado por Exonuclease I (10 U/μΙ) e SAP (fosfatase alcalina de camarão, 2 U/μΙ) (ExoSAP-IT, Amersham Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante. A extensão por PCR foi realizada utilizando um iniciador de extensão marcado com fluorescência 5' GATGCTGTTTGAGCGCATCAT GCTGGGCCC 3' e uma mistura de nucleótidos contendo o nucleótido de paragem ddCTP no lugar da citosina normal. As extensões por PCR foram realizadas num volume reaccional de 20 μΐ contendo 2 μΐ de produto da PCR purificado, Tampão de Reacção Thermo Sequenase (GE Healthcare Biosciences Ab), 50 μΜ de cada dATP, dGTP, dTTP e ddCTP (GE Healthcare Biosciences Ab) , 0,2 μΜ de iniciador SNuPE, e 6,4 U de ADN-polimerase Thermo Sequenase (GE Healthcare Biosciences Ab). Utilizaram-se os seguintes ciclos de PCR para as reacções de extensão: 95°C durante 2 minutos, 25 ciclos de desnaturação a 95°C durante 20 segundos, temperatura de hibridação de 56°C durante 20 segundos, e extensão a 70°C durante 40 segundos. A extensão final foi a 70°C durante 10 minutos. Isto originou produtos de extensão de: 43 pb e 49 pb dependendo se está presente G ou A no molde. Os produtos da reacção de extensão de iniciadores foram corridos no sequenciador/genotipificador ABI3730 e os resultados foram analisados utilizando o software GeneMapper v3 (Applied Biosystems). 22 ΕΡ 2 092 081/ΡΤ

c) Interpretação dos resultados da LOH

Uma amostra era classificada como apresentando LOH se um dos alelos na amostra tumoral tivesse 40% ou mais diminuição do sinal em comparação com o seu correspondente normal. Existe um grande consenso na literatura quanto à utilização deste nivel de limite de exclusão pois é especifico e suficientemente sensível se as percentagens de tumor foram superiores a 50%, o que foi de facto o mínimo neste estudo. Foi observada uma redução do sinal até 23% em tecidos normais (e.g. Cleton-Jansen et al., Câncer Res 61:1171, 2001) deixando uma zona cinzenta entre 25%-39% de redução de sinal. Estas foram aqui consideradas como a LOH limítrofe, "BLOH", de acordo com a literatura publicada (Cleton-Jansen et al., Câncer Res 61:1171, 2001, Vauhkonen et al. Gastrlc Câncer 8: 238-244, 2005 e Kim et al. Virchows Arch 443: 491-500, 2003) (Figuras 1-3).

Exemplo 2 a) Análise da LOH de NAV3 de séries de tumores colorrectais

Examinaram-se três séries (designadas aqui A, B e C): Série A: Série consecutiva de 56 carcinomas colorrectais e 21 adenomas (total = 77) de 59 pacientes. Adenomas e carcinomas provenientes dos mesmos pacientes estavam disponíveis em 10 dos 59 casos. A julgar apenas pela instabilidade nos três loci de microssatélite do cromossoma 12 examinados, todos os adenomas eram MSS enquanto 14 dos 56 carcinomas apresentaram MSI em um ou mais marcadores (25%). Série B: Série bem caracterizada de tumores colorrectais familiares que testaram negativo quanto a mutações da linha germinal do gene de reparação de erros de emparelhamento. Esta consistia em 18 carcinomas MSS, 1 carcinoma MSI e 4 adenomas MSS (número total = 23 tumores). Esta série tinha sido anteriormente caracterizada quanto a alterações moleculares comuns na carcinogénese colorrectal. Série C: Série bem caracterizada de cancros colorrectais MSI que surgem em famílias de CCRHNP com mutações da linha germinal do gene de MMR comprovadas (número total = 24 tumores). 23 ΕΡ 2 092 081/ΡΤ

As amostras normais correspondentes foram principalmente de blocos de mucosas normais ou, quando estes não estavam disponíveis, de outros tecidos corporais normais disponíveis dos pacientes (e.g. nódulos linfáticos, apêndice ou sangue). A instabilidade de microssatélites, MSI (do inglês "MicroSatellite Instability") , refere-se à variação do comprimento, na amplitude do genoma, de microssatélites, que são troços curtos de nucleótidos em tandem no interior do ADN, em resultado de uma falha na reparação de erros de emparelhamento de ADN, enquanto uma estabilidade de microssatélites, MSS (do inglês "MicroSatellite Stable"), refere-se a um comprimento constante de microssatélites, por outras palavras ausência de variação de comprimento de microssatélites causada por uma falha na reparação de erros de emparelhamento do ADN. A análise da LOH foi realizada como descrito no Exemplo 1.

Os resultados obtidos em todas as séries examinadas estão resumidos na Tabela 1. A Tabela 2 apresenta os resultados para cada marcador testado separadamente. É de especial nota que, utilizando o SNP de NAV3 intragénico rsl852464 como marcador estritamente específico para LOH no exão 19 de NAV3, os resultados disponíveis até ao momento mostram uma frequência de 7/20 (35%) para a perda de NAV3 neste local em tumores MSS. Estes 7 tumores incluíam 6 já implicados pelos marcadores de microssatélite enquanto em apenas um caso se observou BLOH no SNP rsl852464 mas não nos loci de microssatélites flanqueadores. Dos 31 tumores que apresentaram LOH/BLOH pelos marcadores de microssatélite na série A, 23 não eram informativos ou estão ainda pendentes, deixando 8 casos para comparação com SNuPE. Destes 8 cases, 6 apresentaram perda de NAV3 concordante no SNP rsl852464. 24

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Tabela 1. Resultados de LOH e BLOH de NAV3 em diferentes séries carcinoma MSS carcinoma MSI adenoma MSS Série A (n=77)* 22/42 (52%) 1/8 (13%)* 8/21 (38%) Série B (n=23) 12/18 (67%) 0/1 (0%) 3/4 (75%) Série C (n=24) 5/24 (21%) Total 34/60 (57%) 6/33 (18%) 11/25 (44%) * 0 carcinoma MSI na Série A consistia em 14 cancros dos quais 6 não foram informativos

Tabela 2. Resultados de LOH e BLOH de NAV3 para cada marcador D12S1684 D12S326 D12S1708 SnuPE 0rsl852464 A-carcinoma MSS 14/37 13/33 7/29 9/23* A-carcinoma MSI 0/3 0/2 1/4 0/7* A-adenoma MSS 4/21 6/19 3/16 0/8* B-carcinoma MSS 6/13 6/12 2/10 4/8 B-carcinoma MSI 0/1 0/1 0/1 1/1 B-adenoma MSS 1/4 1/2 1/3 0/1 C-carcinoma MSI 3/5 0/6 2/11 0/15 Totais: Todos carcinomas MSS 20/50 (40%) 19/45 (42%) 9/39 (23%) 13/31 (42%) Todos carcinomas MSI 3/9 (33%) 0/9 (0%) 3/16 (19%) 1/23 (4%) Todos adenomas MSS 5/25 (20%) 7/21 (33%) 4/19 (21%) 0/9 (0%) Total de todos os tumores 28/84 (33%) 26/75 (35%) 16/74 (22%) 14/63 (22%) * NOTA: Como usualmente, as frequências de LOH foram calculadas apenas para casos informativos. O teste de SNuPE não foi informativo devido a homozigocidade constitucional em 9 carcinomas (8 MSS, 1 MSI) e em todos os 6 adenomas que apresentaram LOH pelos microssatélites do cromossoma 12 examinados. Esta probabilidade de ocorrência de homozigocidade no rsl852464 tornará arriscado comparar os dados disponíveis por microssatélites versus SNuPE. 2b) Análise da LOH de adenomas e carcinomas colorrectais que surgem no mesmo paciente

Adenomas e carcinomas que surgem nos mesmos pacientes estavam disponiveis em 10 dos 59 casos na série A. A análise foi realizada como descrito no Exemplo 1. 25 ΕΡ 2 092 081/ΡΤ

Em 4 destes 10 pacientes os adenomas apresentaram LOH ou BLOH e em 3 destes 4 casos os carcinomas correspondentes foram informativos e têm na sua maioria um padrão similar de LOH/BLOH (Tabela 3). Isto sugere que quando é observada LOH de NAV3 em adenomas é provável que este paciente vá desenvolver também carcinomas através da LOH de NAV3.

Tabela 3. Resultados da LOH de adenomas e carcinomas que surgem no mesmo paciente

Caso n.° Tumor D12S1684 D12S326 D12S1708 SnuPE @rsl852464 1 Ca BLOH (0,73) não Não Ad BLOH (0,67) Não não Ad ND BLOH (0,74) LOH 2 Ca Não LOH não Ad não BLOH (0,68) Não Ad não LOH não 3 Ca não não não Ad não não não Ad não não não 4 Ca BLOH (0,75) Homozigota não Ad não homozigota não 5 Ca MSI MSI MSI homozigota Ad não não não 6 Ca não não BLOH (0,66) Ca não não BLOH (0,66) Ad não não não 7 Ca não não homozigota Ad não não homozigota 8 Ca não homozigota homozigota Ad não homozigota homozigota 9 Ca MSI MSI ?MSI homozigota Ad BLOH (0,73) não homozigota 10 Ca LOH LOH LOH Ad LOH LOH LOH 26 ΕΡ 2 092 081/ΡΤ 2c) Caracteristicas morfológicas e histológicas de tumores colorrectais portadores de LOH de NAV3 A ocorrência de LOH nos adenomas tendia a estar associada a casos, que pelos critérios padrão foram considerados estavam em risco de desenvolvimento de cancro. Dos cinco adenomas com LOH, o diâmetro médio era superior a 9 mm e portanto próximo do nivel critico de 1 cm, enquanto nos outros cinco casos sem LOH, o diâmetro médio era inferior a 6 mm (Tabela 4). Adicionalmente, nos adenomas com LOH, um dos cinco apresentaram pouca diferenciação enquanto o grau de diferenciação nos casos negativos para LOH era sempre elevado.

Tabela 4. Análise de LOH com os marcadores D12S1684, D12S326 e D12S1708 de dez casos com adenomas tubulares do cólon e do recto. A diferenciação foi graduada de 1 (altamente diferenciado) a 3 (fraca diferenciação). A dimensão foi dada como diâmetro em milimetros.

Caso D12S1684 D12S326 D12S1708 Diferenciação* Dimensão** 1 LOH Completa LOH LOH 1 15 2 Não BLOH Não 2 10 3 Não BLOH Não 1 8 4 BLOH Não Não 1 7 5 Não LOH Não 1 7 6 Não Não Não 1 7 7 Não Não Não 1 6 8 Não Homozigota Homozigota 1 5 9 Não Não Não 1 5 10 Não Não Não 1 5 * Grau de diferenciação 1-3 ** Dimensão em milimetros

Exemplo 3

Deleção de NAV3 em tumores colorrectais detectada por FISH Amostras

As amostras para o ensaio de FISH (hibridação in situ com fluorescência) foram preparadas a partir de 18 casos de carcinoma colorrectal seleccionados aleatoriamente da série A (descrita no Exemplo 2a) e de sete casos com amostras de pele obtidas de pacientes que sofrem de eczema crónico, uma lesão 27 ΕΡ 2 092 081/ΡΤ inflamatória não maligna, como controlo negativo. Todas as amostras de tecido tinham sido processadas por fixação com formalina de rotina e embebidas em parafina.

Preparação de núcleos de tecido embebido em parafina

Cortaram-se secções de 50 pm a partir de tecido fixado com formalina e embebido em parafina. Após desparafinização, cada secção foi digerida com protease XXIV (Sigma) a +37°C durante 30 minutos. Após digestão enzimática, os núcleos foram sedimentados por centrifugação a 2000 g durante 10 minutos e diluidos em Tris 0,1 M-HC1, NaCl 0,07 M, pH 7,2. A suspensão nuclear foi pipetada sobre lâminas de objectiva e seca ao longo da noite à temperatura ambiente. As lâminas foram fixadas com paraformaldeido a 0,01% durante 4 minutos à temperatura ambiente, seguindo-se desidratação com etanol graduado (70%, 85%, 100%). Armazenaram-se as lâminas a -70°C.

Marcação de sondas com Fluoresceína-12-dUTP e com Alexa-594-5-dUTP

Três clones de cromossoma artificial bacteriano (BAC) específicos para ADN de NAV3 (RP11-494K17, RP11-36P3 e RP11-136F16; Research Genetics Inc., Huntsville, AL, EUA) foram marcados com Alexa-594-5-dUTP (Invitrogen) e marcou-se a sonda do centrómero do cromossoma 12 (pA12H8) com Fluoresceína-12- dUTP (Roche) utilizando tradução por cortes (Hyytinen E et al. Cytometry, 16: 93-99, 1994). Para cada reacção de marcação, utilizaram-se 1-2 pg de ADN num volume reaccional total de 50 pl. Misturaram-se 4 pl de cada BAC marcado e sondas de centrómero juntamente com ADN de COT1 humano (Invitrogen) e precipitaram-se com acetato de sódio e etanol. A mistura de sondas precipitada foi diluída em tampão de hibridação (sulfato de dextrano a 15% p/v, formamida a 70% em SSC, pH 7,0) e desnaturada a +76°C durante 10 minutos. FISH com núcleos extraídos a partir de tecido embebido em parafina

As lâminas foram pré-tratadas com tiocianato de sódio 1 M a +80 °C durante 5 minutos e lavadas com SSC 2x três vezes durante 5 minutos. Após lavagem, as lâminas foram tratadas com glicerol a 50%, SSC 0,lx a +90°C durante 6 minutos, com SSC 2x durante 3 minutos e com água destilada três vezes durante 28

ΕΡ 2 092 081/PT 2 minutos. As lâminas foram desnaturadas em formamida a 70%, SSC 2x a +87°C durante 7 minutos. Após desnaturação, as lâminas foram desidratadas com etanol graduado (70%, 85%, 100%) e digeridas enzimaticamente com proteinase K (Sigma; 8 yg/ml em Tris 20 mM-HCl, pH 7,5, CaCl2 2 mM) a +37°C durante 7 minutos. Após digestão, as lâminas foram desidratadas e pipetaram-se 10 μΐ de mistura de sondas desnaturadas sobre as lâminas. Realizou-se a hibridação durante a noite a +37°C. Lavaram-se as lâminas três vezes com Ureia 1,5 M, SSC 0,lx a +45°C durante 10 minutos, uma vez com SSC 0,lx durante 10 minutos e SSC 4x durante 5 minutos, seguindo-se três lavagens com tampão PN (tampão de fosfato de sódio 0,1 M, pH 8,0, NP-40 a 0,1%). Finalmente, enxaguaram-se as lâminas com água destilada, secaram-se ao ar e montaram-se em meio de montagem Vectashield Mounting Médium com DAPI (Vector).

Análise e resultados

Analisaram-se as lâminas utilizando Olympus BX 50, Tokyo, Japão, equipado com o conjunto de filtros 8300 e excitador de banda tripla 83103x (Chroma Technology Corp., Brattleboro, VT, EUA) e uma câmara CCD arrefecida (Sensi Cam, PCO, Computer Optics, Kelheim, Alemanha) combinada com um computador (Dell GX280, Limerick, Irlanda) com software Image pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, EUA) . Analisaram-se cinquenta células de cada caso e agruparam-se as células como normais se possuiam dois marcadores para centrómero do cromossoma 12 e dois para o NAV3. As células poliplóides tinham três ou mais marcadores de centrómeros. A deleção de NAV3 foi definida quando o número de marcadores de centrómeros era superior ao número de marcadores de NAV3. Algumas células tinham um marcador de centrómero e um de NAV3; isto foi tomado como um artificio técnico. Os resultados (Tabela 5) mostram claramente que as amostras dos carcinomas do cólon têm uma elevada frequência de poliploidia e que estas células apresentam frequentemente deleção de um ou mais dos alelos de NAV3. 29 ΕΡ 2 092 081/ΡΤ

Tabela 5. Número de células normais, células poliplóides e células com deleção de NAV3 em amostras de pacientes com carcinoma colorrectal e de lesões cutâneas inflamatórias. Foram calculadas cinquenta células por caso.

Amostra Número de células contadas Células normais 2/2, * Todas células poliplóides (>2 cen), células cen>nav, 1 cen lnav, Caso Cl, carcinoma do cólon 50 28 14 5 2 Caso C2, carcinoma do cólon 50 31 6 11 3 Caso C3, carcinoma do cólon 50 29 10 8 7 Caso C4, carcinoma do cólon 50 27 17 9 2 Caso C5, carcinoma do cólon 50 22 15 20 2 Caso C6, carcinoma do cólon 50 19 18 7 5 Caso C7, carcinoma do cólon 50 31 5 6 7 Caso C8, carcinoma do cólon 50 21 21 11 5 Caso C9, carcinoma do cólon 50 16 30 10 2 Caso CIO, carcinoma do cólon 50 18 16 16 7 Caso Cll, carcinoma do cólon 50 19 18 8 4 Caso C12, carcinoma do cólon 50 23 18 10 0 Caso C13, carcinoma do cólon 50 34 1 3 5 Caso C14, carcinoma do cólon 50 19 18 8 4 Caso C15, carcinoma do cólon 50 23 18 10 5 Caso C16, carcinoma do cólon 50 24 11 8 3 Caso C17, carcinoma do cólon 50 28 12 6 3 Case C18, carcinoma do cólon 50 24 14 12 3 Caso Sl, pele, eczema 50 42 1 2 3 Caso S2, pele, eczema 50 43 1 3 3 Caso S3, pele, eczema 50 47 1 0 2 Caso S4, pele, eczema 50 42 0 2 5 Caso S5, pele, eczema 50 44 1 3 2 Caso S6, pele, eczema 50 38 3 3 9 Caso S7, pele, eczema 50 41 2 2 3 = Número normal (2 e 2) de marcadores de centrómeros e de NAV3 por célula = Mais de 2 marcadores de centrómeros por célula = Número de marcadores de centrómeros maior do que o de marcadores de NAV3 por célula = um marcador de centrómero e um de NAV3 por célula 30

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Exemplo 4

Análise da LOH de NAV3 de tumores do pulmão

Examinaram-se amostras embebidas em parafina de arquivo de cinco pacientes com cancro do pulmão sem qualquer evidência de envolvimento de outros órgãos ou outro cancro concomitante. Três das amostras de cancro do pulmão eram de CPCP e duas eram de carcinomas epidermóides. Realizaram-se a microdissecção e a amplificação por PCR das amostras de células de cancro do pulmão e das amostras dos tecidos correspondentes de pulmão normal de acordo com o seguinte protocolo.

Cortaram-se secções de 5 ym a partir das amostras utilizando um micrótomo e montaram-se numa membrana de polietileno de 1,35 ym de espessura (P.A.L.M. Microlaser Technologies, Bemried, Alemanha) fixada numa lâmina de vidro. As secções de tecido foram então desparafinizadas e coradas com hematoxilina como descrito anteriormente (Stoecklein et al. Am J Pathol 161: 43-51, 2002). Para o controlo morfológico, foi realizada coloração com hematoxilina-eosina de acordo com um protocolo padrão. As áreas de células malignas que cobrem 200 000 ym2 foram microdissectadas por captura com laser utilizando o sistema P.A.L.M. Laser-Microbeam (P.A.L.M. Microlaser Technologies). Posteriormente, realizou-se a digestão com proteinase K e amplificou-se o ADN com SCOMP como descrito previamente (Klein et al. Proc Natl Acad Sei USA 96: 4494-9, 1999 e Stoecklein et al. Am J Pathol 161: 43-51, 2002). O sucesso da amplificação foi testado por PCR para os marcadores de microssatélite D5S500 e D17S1161, como previamente descrito (Klein et al. Proc Natl Acad Sei USA 96: 4494-9, 1999 e Stoecklein et al. Am J Pathol 161: 43-51, 2002).

Os cinco casos de cancro do pulmão foram analisados com sucesso quanto a LOH de acordo com o método descrito no Exemplo la. Destes cinco cancros do pulmão, um não foi informativo para todos os três marcadores que se utilizaram, mas foi encontrada perda de heterozigocidade em dois dos outros quatro casos (Tabela 6). 31

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Tabela 6. LOH de NAV3 em cancros do pulmão.

Caso D12S326 (próximo de NAV3) D12S1708 D12S1684 EC normal OK-heterozigota homozigota ? ? EC tumor Sem homozigota ? ? CPCP normal OK-heterozigota homozigota homozigota CPCP tumor LOH ? ? ? ? EC normal OK-heterozigota OK-heterozigota OK-heterozigota EC tumor Sem LOH LOH CPCP normal Homozigota homozigota homozigota CPCP tumor homozigota homozigota ? ? CPCP normal homozigota OK-heterozigota homozigota CPCP tumor homozigota Sem homozigota

?? significa um padrão não interpretável Sem = sem LOH CPCP = cancro do pulmão de células pequenas EC = carcinoma epidermóide do pulmão

Exemplo 5

Análise de CGH de tumores do pulmão

Utilizaram-se, para a CGH, amostras de cancro do pulmão de doze pacientes. Estes doze pacientes foram também diagnosticados com LCCT. A CGH foi realizada de acordo com o protocolo publicado por Klein et al. 1999 com as modificações descritas por Stoecklein et al. 2002 (Klein et al. Proc Natl Acad Sei USA 96: 4494-9, 1999 e Stoecklein et al. Am J Pathol 161: 43-51, 2002). Resumidamente, o ADN microdissectado e digerido com proteinase K foi digerido com a enzima de restrição Mse I (BioLabs) resultando fragmentos de ADN com um comprimento médio de 256 pb, foram ligados adaptadores às protuberâncias a 5', e amplificaram-se os fragmentos de ADN por reacção em cadeia pela polimerase. O ADN amplificado foi então marcado com digoxigenina-dUTP (Roche) e de forma similar processaram-se aliquotas de ADN de referência obtido de células mononucleares de sangue periférico de voluntários saudáveis com biotina-dUTP (Roche). As sondas marcadas foram hibridadas com lâminas de metáfase masculina normal durante 2- 32 ΕΡ 2 092 081/ΡΤ 3 noites. Após lavagens depois da hibridação, observaram-se as metafases num microscópio de fluorescência e captaram-se imagens digitais a três cores utilizando um microscópio de epifluorescência (Axioplan imagining 2, Cari Zeiss AG,

Oberkochen, Alemanha) equipado com uma câmara CCD utilizando limites estatísticos para razões entre verde e vermelho para determinar ganhos e perdas do número de cópias de ADN. Foram incluídas oito a doze metafases na análise para cada caso. Como controlo interno, co-hibridaram-se ADN normais masculino e feminino e apenas foram identificadas diferenças em cromossomas sexuais.

Em células tumorais de um paciente de cancro do pulmão, a perda de 12q21 foi demonstrada por CGH (Figura 4). Os cariótipos dos pacientes com CPCP e LCCT representam alterações típicas para CPCP: perdas de 3p, 5q, 8p, lOq e 13q, assim como ganhos de 5p e 19q. Algumas outras aberrações típicas de CPCP (perda de 17p e ganho de 8q) estão ausentes. As verificações características para LCCT incluem e.g. perdas de 10q/10, e 13, e ganhos de 4q, 7, 17q/17 e 18, que podem ser todos demonstrados neste caso. De forma interessante, foi também evidente perda de 12q21.

Exemplo 6

Deleções de NAV3 no cancro da bexiga urinária Amostras de tecido

Foram seleccionadas para o estudo amostras de 16 pacientes diagnosticados com um carcinoma epitelial transicional da bexiga urinária. Fixaram-se as amostras rotineiramente em formalina neutra e embeberam-se em parafina. Cortaram-se 1-3 secções de 50 mícrones de espessura e isolaram-se os núcleos como descrito no Exemplo 3, página 18, segundo parágrafo.

Marcação das sondas

Marcaram-se dois clones de cromossoma artificial bacteriano (BAC) específicos para ADN de NAV3 (RP11-36P3 e RP11-136F16; Research Genetics Inc., Huntsville, AL, EUA) com Alexa594-5-dUTP (Invitrogen) e marcou-se a sonda de centrómero do cromossoma 12 (pA12H8; American Type Cell Culture) com

Alexa488-5-dUTP (Invitrogen) utilizando tradução por cortes 33 ΕΡ 2 092 081/ΡΤ (Hyytinen et al. 1994). Misturaram-se 50-75 ng de cada BAC marcado e 30 ng de sonda de centrómero juntamente com 1 yg de ADN de COT1 humano (Invitrogen) e precipitaram-se com acetato de sódio e etanol. Diluiu-se a mistura de sondas precipitada em 10 μΐ de tampão de hibridação (sulfato de dextrano a 15% p/v, formamida a 70% em SSC 2x, pH 7,0).

Hibridação in situ com fluorescência

Pré-trataram-se lâminas de núcleos com tiocianato de sódio 1 M a +80°C durante 5 minutos e lavaram-se com SSC 2x três vezes durante 5 minutos à temperatura ambiente. Após lavagem, trataram-se as lâminas com glicerol a 50%, SSC 0,lx a + 90°C durante 6 minutos, com SSC 2x durante 3 minutos e com água destilada três vezes durante 2 minutos. Digeriram-se as lâminas enzimaticamente com proteinase K (Sigma; 8 yg/ml em Tris 20 mM-HCl, pH 7,5, CaCl2 2 mM) a +37°C durante 8 minutos. Após desidratação e secagem ao ar, pipetou-se a mistura de sondas sobre lâminas e desnaturaram-se as lâminas durante 6 min a +85°C sobre uma placa quente. A hibridação foi realizada durante 48 h a +37°C. Lavaram-se as lâminas três vezes com Ureia 1,5 M, SSC 0,lx a +47°C durante 10 minutos, uma vez com SSC 0,lx durante 10 minutos a +47°C, seguindo-se três lavagens com PBS, NP-40 a 0,1%, à temperatura ambiente. Finalmente, enxaguaram-se as lâminas com água destilada, secaram-se ao ar e montaram-se em meio de montagem Vectashield Mounting Médium com dicloridrato de 4',6-diamino-2-fenilindole (DAPI; Vector).

Os resultados da FISH foram avaliados utilizando um microscópio Olympus BX51 (Tokyo, Japão) equipado com uma objectiva de imersão em óleo de 60X e um filtro de passagem de banda triplo para detecção simultânea de Alexa488, Alexa594 e DAPI (Chroma Technology Corp., Brattleboro, VT, EUA). Analisaram-se 200 núcleos de cada caso e agruparam-se os núcleos como normais se possuíam dois marcadores para o centrómero do cromossoma 12 e dois para o NAV3. Os núcleos poliplóides tinham três ou mais marcadores de centrómeros. A deleção de NAV3 foi definida quando o número de marcadores de centrómeros era superior ao número de marcadores de NAV3 e a amplificação NAV3 foi definida quando o número de marcadores de NAV3 era superior ao dos marcadores de centrómeros. As 34 ΕΡ 2 092 081/ΡΤ análises foram realizadas com ocultação do diagnóstico ou da identidade da amostra por dois analistas independentes.

Análise da LOH de NAV3 utilizando marcadores de microssatélite

Para o ensaio da LOH (perda de heterozigocidade) , ADN proveniente tanto de tecido normal do paciente como das amostras tumorais, foi extraído a partir de secções embebidas em parafina de 10 pm de espessura seguindo métodos padrão (Isola et al. Am J Pathol 145: 1301-1308, 1994). A análise foi realizada como descrito no Exemplo la.

Resultados

Os resultados relativos à LOH (e LOH limítrofe; BLOH) assim como o estado do número de cópias de NAV3 no ensaio FISH estão apresentados na Tabela 7. 7 de 17 amostras de cancro da bexiga urinária (40%) apresentaram LOH/BLOH com pelo menos um dos marcadores utilizados no estudo. 20 de 64 (30%) alelos eram homozigotas e não puderam ser analisados utilizando o método da LOH. Na análise FISH, 3 de 15 amostras (20%) apresentaram deleção de NAV3. Foi observada duplicação do gene NAV3 (amplificação) em 20% das amostras. Uma das amostras tinha tanto deleção como amplificação de NAV3. Duas amostras não foram analisadas quanto a alterações no número de cópias de NAV3 devido à fraca qualidade da amostra. 35

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Tabela 7. Resultados da análise da LOH e FISH de NAV3 em cancro da bexiga urinária

Caso n.° D12S1684 D12S326 D12S1708 SnuPE@ rsl852464 Aberração de NAV3 (por FISH) 1 Não Não Não Não - 2 BLOH LOH Homozigota Homozigota deleção 3 Não BLOH Não Não - 4 Não BLOH Não Homozigota deleção 5 Não Não Não Não deleção e amplificação 6 BLOH BLOH Não Não - 7 Não Homozigota Não Homozigota amplificação 8 Não Homozigota Homozigota Homozigota NA 9a Não Não Não BLOH - 9b Não LOH Não Não amplificação 10 BLOH BLOH BLOH Homozigota deleção 11 Não Não Não Homozigota - 12 Não Homoziqota Homozigota Homozigota - 13 Homozigota Não Homozigota Homozigota - 14 Não Não Homozigota Não - 15 Não Homozigota Homozigota Não NA 16 Não Não Não Homozigota amplificação n.° de verificações positivas 3/17, 1 não informativa 6/17, 4 não informativas 1/17, 6 não informativas 1/17, 9 não informativas 7/15, 2 amostras não analisada (NA)

Exemplo 7

Deleção de NAV3 no cancro da mama Amostras de tecido

Estudámos a ocorrência de deleções de NAV3 no cancro da mama por selecção de nódulos linfáticos sentinela de quatro pacientes operados para o cancro da mama como material de estudo. Obtiveram-se preparações de decalques ("touch preparates") de nódulo linfáticos obtidos de fresco ou de material congelado e armazenaram-se a -70°C até serem utilizados para a análise FISH de NAV3. 36

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Marcação de sondas

Marcaram-se dois clones de cromossoma artificial bacteriano (BAC) específicos para ADN de NAV3 (RP11-36P3 e RP11-136F16; Research Genetics Inc., Huntsville, AL, EUA) com Alexa594-5-dUTP (Invitrogen) e a sonda de centrómero do cromossoma 12 (pA12H8; American Type Cell Culture) foi marcada com Alexa488-5-dUTP (Invitrogen) utilizando tradução por cortes (Hyytinen et al. 1994). Misturaram-se 50-75 ng de cada BAC marcado e 10 ng de sonda de centrómero juntamente com 1 pg de ADN de COT1 humano (Invitrogen) e precipitaram-se com acetato de sódio e etanol. Diluiu-se a mistura de sondas precipitada em 10 μΐ de tampão de hibridação (sulfato de dextrano a 15% p/v, formamida a 70% em SSC 2x, pH 7,0).

Hibridação in situ com fluorescência

Fixaram-se as lâminas com paraformaldeido a 4% em PBS durante 1 minuto em gelo. Após lavagens com PBS, digeriram-se as lâminas enzimaticamente com proteinase K (Sigma; 0,66 pg/ml em Tris 20 mM-HCl, pH 7,5, CaCl2 2 mM) a +37°C durante 6 minutos. Após desidratação e secagem ao ar pipetou-se a mistura de sondas sobre lâminas e desnaturaram-se as lâminas durante 5 min a +75°C sobre uma placa quente. A hibridação foi realizada durante 24 h a +37°C. Lavaram-se as lâminas três vezes com Ureia 1,5 M, SSC 0,lx a +47°C durante 10 minutos, uma vez com SSC 0,lx durante 10 minutos a +47°C, seguindo-se três lavagens com PBS, NP-40 a 0,1% à temperatura ambiente. Finalmente, enxaguaram-se as lâminas com água destilada, secaram-se ao ar e montaram-se em meio de montagem Vectashield Mounting Médium com dicloridrato de 4',6-diamino-2 fenilindole (DAPI; Vector).

Os resultados da FISH foram avaliados utilizando um microscópio Olympus BX51 (Tokyo, Japão) equipado com uma objectiva de imersão em óleo de 60X e um filtro de passagem de banda triplo para a detecção simultânea de Alexa488, Alexa594 e DAPI (Chroma Technology Corp., Brattleboro, VT, EUA). Todas as células cancerosas encontradas na amostra foram analisadas de cada caso e as células foram agrupadas como normais se possuíam dois marcadores para o centrómero do cromossoma 12 e dois para o NAV3. As células poliplóides tinham três ou mais marcadores de centrómeros. A deleção de NAV3 foi definida quando o número de marcadores de centrómeros era superior ao 37 ΕΡ 2 092 081/ΡΤ número de marcadores de NAV3 e a amplificação de NAV3 foi definida quando o número de marcadores de NAV3 era superior ao dos marcadores de centrómeros. As análises foram realizadas com ocultação do diagnóstico ou da identidade da amostra por dois analistas independentes.

Resultados

Os resultados estão apresentados na Tabela 8 e nas Figuras 5a e 5b. Foram analisados quatro casos e todas as células cancerosas encontradas nas amostras foram contadas de cada caso. Agruparam-se as células como normais se possuíam dois marcadores para o centrómero do cromossoma 12 e dois para o NAV3. As células poliplóide tinham três ou mais marcadores de centrómeros (>2cen). As células com deleção de NAV3 continham um número superior de marcadores de centrómeros do que de marcadores de NAV3 (cen>nav) e as células com amplificação de NAV3 tinham um número superior de marcadores de NAV3 do que de marcadores de centrómeros (cenCnav).

Todos os quatro casos apresentaram células que continham números de cópias anómalos de centrómeros e/ou de NAV3. Em adição à deleção de NAV3 (menos de duas cópias do sinal de NAV3 em FISH) , o número de células com poliploidia (mais do que duas cópias de centrómero do cromossoma 12) e amplificação de NAV3 (mais do que duas cópias do sinal de NAV3) foi analisado e registado. Num caso (caso número 2) foi observada poliploidia com deleção de NAV3 menos extensa, enquanto nos restantes três casos a poliploidia estava associada com a perda de um alelo de NAV3.

Na Figura 5a, as barras a negro indicam a quantidade de poliploidia em células estudadas e as barras a cinzento indicam a quantidade de células com deleção de NAV3. Os resultados estão apresentados como percentagem da contagem de células totais. Na Figura 5b, células cancerosas típicas apresentam deleção de NAV3. Os sinais a verde indicam centrómeros e os sinais a vermelho as cópias de NAV3 . 38

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Tabela 8. Resultados de FISH de NAV3 com amostras de cancro da mama

Caso 1 2 3 4 N.° de células cancerosas contadas 20 69 52 55 % Células normais 0 14,5 19 23, 5 % Células poliplóides 100 84 77 74,5 % Células com amplificação de NAV3 10 6 0 2 % Células com deleção de NAV3 90 6 77 71 Tipo de células primárias (cen+NAV3) 4 + 2 4 + 4 4 + 2 4 + 2 É de notar que enquanto foi difícil ou mesmo impossível encontrar as células malignas de cancro da mama nas preparações de decalques de nódulo linfático utilizando apenas microscopia óptica de rotina, esta tarefa tornou-se muito simples após os alelos de NAV3 serem marcados com a sonda fluorescente específica. Mesmo células individuais, no meio de milhares de linfócitos normais, podiam ser identificadas com claras alterações no número de cópias e em regra, estas células também apresentavam os núcleos atípicos característicos de células cancerosas. Estas células anómalas teriam sido extremamente difíceis de identificar com microscopia óptica.

Exemplo 8

Alterações no número de cópias de NAV3 no carcinoma de células basais (CCB) e no carcinoma de células escamosas (CCE)

Amostras de tecido

Foram selecionadas para o estudo amostras de 14 pacientes diagnosticados com um carcinoma de células basais e 5 pacientes com carcinoma de células escamosas. Fixaram-se as amostras rotineiramente em formalina neutra e embeberam-se em parafina. Cortaram-se 1-3 secções de 50 mícrones de espessura e isolaram-se os núcleos como descrito no Exemplo 3, página 18, segundo parágrafo. 39

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Hibridação in situ com fluorescência

Realizaram-se a marcação de sondas e a análise FISH como descrito no exemplo 6.

Resultados

Os resultados da análise FISH de NAV3 de amostras de CCB e de CCE estão apresentados na Tabela 9. 3 de 14 (21%) das amostras de CCB apresentaram deleção de NAV3 com uma gama de deleção de 6-11% da contagem de células totais. Em adição, três das amostras (21%) apresentaram duplicação do gene NAV3 (gama de amplificação de 8-11%) . Uma de cinco (20%) das amostras de CCE indicou deleção de NAV3 (12%).

Tabela 9. Resultados de FISH de NAV3 com amostras de CCB e de CCE

Caso Células normais (% da contagem de células totais) Células poliplóides (% da contagem de células totais) Células com amplificação de NAV3 (% da contagem de células totais) Células com deleção de NAV3 (% da contagem de células totais) CCB1 87 3 NA 2 CCB2 87 4 NA 4 CCB3 77 14 9 4 CCB4 85 4 5 7 CCB5 84 3 8 4 CCB6 90 2 3 4 CCB7 85 7 4 2 CCB8 75 20 5 3 CCB9 88 2 7 1 CCB10 NA 2 NA 1 CCB11 NA NA NA 1 CCB12 NA NA NA 1 CCB13 NA 17 5 11 CCB14 NA 7 11 6 CCE1 89 4 4 2 CCE2 90 6 3 2 CCE3 94 2 2 2 CCE4 81 4 NA 3 CCE5 NA 9 NA 12 40 ΕΡ 2 092 081/ΡΤ

Exemplo 9

Alterações no número de cópias de NAV3 no cancro do cólon Amostras e análise FISH de NAV3 a) Duas linhas celulares de adenocarcinoma colorrectal do tipo MSS [CCL-230 (SW403) e CCL-228 (SW480)] e duas linhas celulares de cólon normal [CRL-1539 (CCD-33Co) e CRL-1541 (CCD-112CoN)] foram encomendadas à American Type Culture Collection (LGC Promochem AB, Boras, Suécia) e foram crescidas a +37°C seguindo as instruções do fabricante. Sedimentaram-se por centrifugação 50 000-100 000 células na lâmina Super Frost Plus utilizando uma citocentrífuga. Secaram-se as lâminas ao ar, fixaram-se com acetona e armazenaram-se a -70°C até serem utilizadas para a análise FISH de NAV3. A marcação das sondas e a análise FISH foram similares às das amostras de cancro da mama no Exemplo 7. b) Para as preparações de metafases, as linhas celulares de adenocarcinoma colorrectal CCL-248, SW403, SW480, RKO, DLD, HCA7, LIM1215 e LOVO (American Type Culture Collection, LGC Promochem AB, Boras, Suécia) foram crescidas seguindo as instruções da ATCC.

As células foram tratadas com solução hipotónica de KC1, fixadas com acetona-metanol (1:3) e a suspensão celular foi aplicada por gotas sobre lâminas de objectiva para obter preparações convencionais de cromossoma. O ADN purificado de pA12H8 (centrómero 12, plasmideo da ATTC, purificado como acima ou de acordo com Karenko L et ai. J Invest Dermatol 108: 22-29, 1997) e ADN purificado de RP11-136F16 e BAC RP11-36P3 (Karenko L et al. Câncer Res 65: 8101-8110, 2005), foram marcados com tradução por cortes com FITC-dUTP (NEN Life Science produtos, Inc, Boston, MA EUA), Alexa-594-dUTP (Invitrogen Molecular Sondas, Leiden, Holanda), biotina-dATP (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, EUA) ou digoxigenina-dUTP (Roche, Mannheim, Alemanha). Sonda de centrómero (e.g. 1-5 ng) marcada com FITC ou biotina e uma ou duas sondas de BAC, foram misturadas e precipitadas por adição de 1/10 do volume de acetato de sódio 3M e 2x o volume de etanol a 100%, e centrifugaram-se. Rejeitou-se o sobrenadante, deixou-se secar a pelete, após o que se dissolveu o ADN numa 41 ΕΡ 2 092 081/PT mistura consistindo em formamida a 50%, e sulfato de dextrano a 10%, SSC 2x, pH7 e opcionalmente ADN de Cot-1 (e.g. 125 ng; Gibco BRL, Gaithersburg, MD, EUA), denominada aqui a mistura de sonda. Desnaturaram-se metáfases alvo sobre lâminas durante 2 a 3 minutos em solução de formamida a 70% / SSC 2x (pH 7,0) de 70 a 73°C, e desidrataram-se em etanol a 70%, 85% e 100%, e trataram-se com proteinase K (1 yg/ml, Sigma Chemical Co, St Louis, MO, EUA) em tampão Tris 20 mM/CaCÍ2 2mM (pH 7,5) durante 7,5 minutos a 37°C, e desidrataram-se como acima. Desnaturou-se a mistura de sondas durante 5 minutos a 70°C, e aplicou-se em lâminas pré-tratadas sobre uma placa quente (37°C), selou-se sob uma lamela com Rubber Cement (Starkey Chemical Co, LaGrange IL EUA) e deixou-se hibridar numa câmara húmida (37°C) durante 2 a 3 dias. Lavaram-se as lâminas 3 vezes com formamida a 50% em SSC 2x, pH 7, SSC 4x, e SSC 0,lx, todos a 45°C, e com SSC 4x, SSC 2x e PBS à temperatura ambiente. Após as lavagens pós-hibridação, visualizou-se a sonda biotinilada com avidina-FITC (verde, Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA) e visualizou-se a sonda marcada com digoxigenina com anticorpo anti-digoxigenina preparado em ovelhas conjugado com rodamina (vermelho, Roche, Mannheim, Alemanha). Contrastaram-se as lâminas com DAPI e montaram-se em Vectashield (bothVector Laboratories, Burlingame, CA, EUA).

Fixaram-se as preparações secas ao ar com paraformaldeido a 0,1% e secaram-se em séries de etanol (70%, 85%, 100%).

Fotografaram-se as metafases num microscópio de UV (Axioplan imagining 2, Zeiss, Alemanha) e analisaram-se utilizando o programa de computador Isis da MetaSystems GmbH com o módulo do programa MFISH. c) Seleccionaram-se para o estudo amostras de 36 pacientes diagnosticados com um adenocarcinoma colorrectal do tipo MSS, 14 pacientes com adenoma colorrectal do tipo MSI e 19 pacientes com adenoma tubular. Em adição, incluiram-se no estudo 58 amostras de mucosa de cólon normal como material de referência. Fixaram-se as amostras rotineiramente em formalina neutra e embeberam-se em parafina. Cortaram-se 1-3 secções de 50 micrones de espessura e isolaram-se os núcleos como 42 ΕΡ 2 092 081/ΡΤ descrito no Exemplo 3. Realizou-se o ensaio FISH especifico de NAV3 como descrito no Exemplo 6.

Resultados a) Os resultados da análise FISH de células na interfase de linhas celulares de cancro do cólon (SW 403 e SW480) estão apresentados na tabela 10. Ambas as linhas celulares de cancro apresentaram o tipo de deleção 3 centrómero 2 NAV3 dominante em quase todas as células estudadas. As linhas celulares de cólon normal não apresentaram quaisquer alterações no número de cópias do gene NAV3.

Tabela 10. Resultados de FISH de NAV3 com linhas celulares de cancro do cólon

Linha celular Células normais (2cen2NAV3) (% das células estudadas) Células poliplóides (cen>2) (% das células estudadas) Células com deleção de NAV3 (cen>NAV3) (% das células estudadas) SW403 5 95 92 SW480 4 96 92 b) Os resultados da análise FISH de células na metafase de linhas celulares de cancro do cólon (CCL-248, SW 403, SW480, RKO, DLD, HCA7, LIM1215 e LOVO) estão apresentados na tabela 11. A deleção de NAV3 foi detectada na grande maioria das células em metafase em duas linhas celulares de MSS (CCL-248, SW 403) . Também a linha celular de MSI RKO apresentou bastantes deleções de NAV3. Muitas amplificações de NAV3 foram detectadas na linha celular DLD (MSI). Também a linha SW480 (MSS) apresentou mais sinais de centrómero do que sinais de NAV3. Algumas deleções de NAV3 foram detectadas na linha celular HCA7. 43

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Tabela 11. Resultados da FISH de NAV3 de células em metafase com linhas celulares de cancro do cólon

Linha celular Tipo Sonda Células com deleção de NAV3 (cen>NAV3) (% das células estudadas) Células com amplificação de NAV3 (cen<NAV3) (% das células estudadas) CCL-248 MSS 36P3 9/10 (90%) 0/10 (0%) SW 403 MSS 36P3 6/7 (86%) 0/7 (0%) SW480 MSS 36P3 2/10 (20%) 2/10 (20%) RKO MSI 136F16 12/29 (41%) 0/29 (0%) 36P3 6/14 (43%) 0/14 (0%) ambas 3/7 (43%) 0/7 (0%) DLD MSI 136F16 0/8 (0%) 8/8 100%) 36P3 0/8 (0%) 8/8 100%) ambas 0/2 (0%) 2/2 100%) HCA7 MSI 136F16 2/10 (20%) 0/10 (0%) 36P3 0/6 (0%) 0/6 (0%) ambas 0/13 (0%) 0/13 (0%) LIM1215 MSI 136F16 0/2 (0%) 0/2 (0%) 36P3 0/10 (0%) 0/10 (0%) ambas 0/15 (0%) 0/15 (0%) LOVO MSI ambas 0/1 (0%) 0/1 (0%) c) 0 ensaio FISH de NAV3 com núcleos extraídos de amostras do paciente embebidas em parafina indicou alterações no número de cópias de NAV3 em 31% das amostras de adenocarcinoma colorrectal do tipo MSS, 7% das amostras de adenocarcinoma colorrectal do tipo MSI (1 amostra de 14) e em 16% das amostras de adenoma tubular. Os resultados estão apresentados na tabela 12. A Figura 6 apresenta uma comparação dos resultados da FISH de NAV3 de amostras de cólon normal e do tipo MSS de adenocarcinoma colorrectal. As células cancerosas são diferentes das células mucosas do cólon normal em termos de poliploidia e número de cópias de NAV3. 44 ΕΡ 2 092 081/ΡΤ

Tabela 12. Resultados da análise FISH de NAV3 utilizando diferentes amostras de cólon. Em cada amostra, analisámos 200 células. As células com deleção de NAV3 contêm maior número de marcadores de centrómeros do que de marcadores de NAV3 e as células com amplificação de NAV3 maior número de marcadores de NAV3 do que de marcadores de centrómeros.

Amostra de cólon Amostras com NAV3 aberrante Gama de deleção (% das células estudadas) Gama de amplificação (% das células estudadas) CCR, MSS 11/36 5-41 8-28 CCR, MSI 1/14 7,5 - Adenoma tubular 3/19 7-11 8 Cólon normal 0/58 - -

Lisboa, 2012-05-14

Claims (12)

1. ΕΡ 2 092 081/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Método in vitro de previsão da iniciação de tumores, da progressão de tumores e/ou de carcinoma, caracterizado pela detecção da presença ou da ausência de anomalias genéticas em 12q21.2 num gene neuron navigator 3 (NAV3) ou num seu fragmento, a presença das referidas anomalias genéticas indicando uma iniciação ou progressão de tumores de origem epitelial e/ou de carcinoma numa amostra biológica.
2. 2. Método in vitro de identificação de um indivíduo com potencial para o desenvolvimento de carcinoma de origem epitelial, o método compreendendo a detecção de anomalias genéticas em 12q21.2 num gene neuron navigator 3 (NAV3) ou num seu fragmento, indicando as referidas anomalias genéticas tumores de origem epitelial.
3. 3. Método in vitro de previsão da progressão de carcinomas de origem epitelial e/ou da sua transformação numa variante agressiva, caracterizado pela detecção de anomalias genéticas em 12q21.2 num gene neuron navigator 3 (NAV3) ou num seu fragmento, em que as anomalias indicam a probabilidade de desenvolvimento de carcinoma.
4. 4. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado por o tumor de origem epitelial ser um adenoma e/ou um carcinoma.
5. 5. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado por o tumor de origem epitelial ser no cólon, no recto, no pulmão, na bexiga urinária, na mama ou em células escamosas ou basais.
6. 6. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado por as anomalias genéticas serem determinadas por hibridação in situ com fluorescência (FISH).
7. 7. Método de acordo com as reivindicações 1-6, caracterizado pela determinação da perda de heterozigocidade (LOH) do gene NAV3 ou de um seu fragmento funcional, em que a LOH de NAV3 é indicativa de progressão de tumores. ΕΡ 2 092 081/ΡΤ 2/2
8. 8. Método de acordo com as reivindicações 1-7 caracterizado por as anomalias genéticas do gene NAV3 serem determinadas em células haplóides, diplóides e/ou poliplóides.
9. 9. Método de acordo com qualquer reivindicação precedente, caracterizado por as células tumorais serem de microssatélites estáveis ou de microssatélites instáveis.
10. 10. Utilização in vitro do gene NAV3 ou de um seu fragmento para a previsão da iniciação de tumores, da progressão de tumores e/ou de carcinoma, indicando as anomalias genéticas de NAV3 tumores de origem epitelial.
11. 11. Utilização in vitro de marcadores genéticos em 12q21.2 para a previsão da iniciação de tumores, da progressão de tumores e/ou de carcinoma, caracterizada pela detecção da presença ou da ausência de anomalias genéticas de NAV3, indicando as referidas anomalias genéticas tumores de origem epitelial.
12. 12. Utilização de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por os marcadores genéticos serem D12S326 e/ou rsl852464. Lisboa, 2012-05-14