PT2069531E - Ltqs para resistência à mastite em gado - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "LTQS PARA RESISTÊNCIA À MASTITE EM GADO" Área da invenção A presente invenção relaciona-se com um método para determinação da resistência à mastite num sujeito bovino compreendendo a deteção de pelo menos um marcador genético localizado no cromossoma bovino BTA9. Além disso, a presente invenção relaciona-se com o uso de um conjunto de diagnóstico para deteção da presença ou ausência de pelo menos um marcador genético associado à resistência à mastite.

Antecedentes da invenção A mastite é a inflamação da glândula mamária ou úbere da vaca resultando de infeção ou trauma e acredita-se que a mastite é a doença mais economicamente importante no gado. A doença pode ser causada por uma variedade de agentes. A causa primária da mastite é a invasão da glândula mamária através da extremidade da teta por microrganismos. A mastite pode ser clínica ou subclinica, com a infeção subclinica precedendo manifestações clinicas. A mastite clinica (MC) pode ser detetada visualmente através da observação de glândulas mamárias vermelhas e inchadas i.e. úbere vermelho e inchado, e através da produção de leite coagulado. Uma vez detetado, o leite das vacas mastiticas é mantido separado da cuba de modo que não irá afetar a qualidade global do leite. A mastite subclinica é um tipo de mastite caracterizada por elevadas contagens de células somáticas (CCS), uma temperatura corporal normal ou elevada, e amostras de leite 2 que devem testar positivo em cultura. Assim sendo, a mastite subclinica não pode ser detetada visualmente por inchação do úbere ou por observação da glândula ou do leite produzido. Devido a isto, os agricultores não têm a opção de desviar o leite das vacas mastíticas subclinicas. No entanto, este leite é de qualidade mais fraca do que aquele de vacas não infetadas e pode assim contaminar o resto do leite na cuba. A mastite pode ser detetada pelo uso de contagens de células somáticas (CCS) nas quais uma amostra de leite de uma vaca é analisada quanto à presença de células somáticas (glóbulos brancos). As células somáticas são parte do mecanismo de defesa natural das vacas e as contagens de células aumentam quando o úbere se torna infetado. 0 número de células somáticas numa amostra de leite pode ser estimado indiretamente por viscómetro de queda de bola e por contador de Coulter.

Como a mastite resulta em quantidade e qualidade reduzidas do leite e dos produtos do leite, a mastite resulta em perdas económicas para o agricultor e para a indústria dos lacticinios. Portanto, a capacidade de determinar a base genética da resistência à mastite num bovino é de enorme significância económica para a indústria dos lacticinios em termos quer da produção diária de leite, quer da gestão do melhoramento, selecionando sujeitos bovinos com resistência à mastite. Um método de seleção genética de sujeitos bovinos com resistência melhorada que originará vacas menos propensas à mastite seria desejável.

Uma abordagem para identificar determinantes genéticos para traços genéticos é o uso do mapeamento de desequilíbrio de ligação (DL) o qual pretende explorar recombinantes históricos e tem mostrado em algumas populações de gado, 3 incluindo gado leiteiro, que se estende ao longo de segmentos de cromossoma muito longos quando comparado com populações humanas (Famir et al., 2000). Uma vez mapeado, um Lócus de Traço Quantitativo (LTQ) pode ser utilmente aplicado na seleção assistida por marcadores.

Desequilíbrio de ligação O desequilíbrio de ligação reflete eventos de recombinação remontando na história e o uso do mapeamento do DL no seio de familias aumenta a resolução do mapeamento. O DL existe quando haplotipos observados numa população não coincidem com as frequências de haplotipo previstas pela multiplicação da frequência de marcadores genéticos individuais em cada haplotipo. A este respeito, o termo haplotipo significa um conjunto de marcadores genéticos intimamente ligados presentes num cromossoma que tendem a ser herdados em conjunto. De modo a que o mapeamento do DL seja eficaz, a densidade dos marcadores genéticos necessita de ser compatível com a distância ao longo da qual o DL se estende na dada população. Num estudo do DL numa população de gado leiteiro usando um alto número de marcadores genéticos (284 marcadores de microssatélite autossomais), foi demonstrado que o DL se estende ao longo de várias dezenas de centimorgans para marcadores intracromossomais (Farnir et al. 2000). Similarmente, Georges, M (2000) relatou que a localização de um marcador genético que está ligado a um fenótipo particular no gado tem tipicamente um intervalo de confiança de 20-30 cM (correspondendo a talvez 500-1000 genes) (Georges, M., 2000). A existência do desequilibrio de ligação é tida em conta de modo a se usarem mapas de regiões particulares de interesse com alta confiança. 4

Na presente invenção, loci de traço quantitativo associados à mastite clinica e/ou à CCS foram identificados no cromossoma bovino BTA9 o que permite um método para determinação se um sujeito bovino será resistente à mastite.

Sumário da invenção É de interesse económico significativo no seio da indústria do gado ser-se capaz de selecionar sujeitos bovinos com resistência aumentada à mastite e desse modo evitar perdas económicas em conexão com animais sofrendo de mastite. A predisposição genética para a resistência à mastite pode ser detetada pela presente invenção. A presente invenção oferece um método para determinação da resistência à mastite num sujeito bovino baseado em marcadores genéticos que estão associados e/ou ligados à resistência à mastite.

Assim sendo, um aspeto da presente invenção relaciona-se com um método para determinação da resistência à mastite num sujeito bovino, compreendendo a deteção numa amostra do referido sujeito bovino da presença ou ausência de pelo menos um marcador genético que esteja ligado a pelo menos um traço indicativo da resistência à mastite, em que o referido pelo menos um marcador genético está localizado no cromossoma bovino BTA9 na região flanqueada pelos e incluindo os marcadores de microssatélite polimórficos C6orf93 e inra084, em que a presença ou ausência do referido pelo menos um marcador genético é indicativa da resistência à mastite do referido sujeito bovino ou da sua descendência.

Um segundo aspeto da presente invenção relaciona-se com o uso de um conjunto de diagnóstico na deteção da presença ou ausência num sujeito bovino de pelo menos um marcador genético associado à resistência à mastite, compreendendo 5 pelo menos uma sequência de oligonucleótidos e suas combinações, em que as sequências de nucleótidos são selecionadas de qualquer uma da SEQ ID NO.: 75 à SEQ ID NO.: 98.

Descrição dos Desenhos

Figura 1: Scan do genoma de BTA9 em relação à resistência à mastite caracteristica de famílias Vermelho Dinamarquês. Os números referem-se ao "número de livro genealógico". 0 eixo dos X representa a distância do cromossoma expressa em Morgan de acordo com as posições empregues nesta análise. 0 eixo dos Y representa a estatística teste da análise do LTQ expressa no valor F.

Figura 2: Scan do genoma de BTA9 em relação à contagem de células somáticas caracteristica de famílias Vermelho Dinamarquês. Os números referem-se ao "número de livro genealógico". 0 eixo dos X representa a distância do cromossoma expressa em Morgan de acordo com as posições empregues nesta análise. 0 eixo dos Y representa a estatística teste da análise do LTQ expressa no valor F.

Figura 3: Scan do genoma de BTA9 em relação à resistência à mastite caracteristica de famílias Ayrshire Finlandês. Os números referem-se ao "número de livro genealógico". 0 eixo dos X representa a distância do cromossoma expressa em Morgan de acordo com as posições empregues nesta análise. 0 eixo dos Y representa a estatística teste da análise do LTQ expressa no valor F.

Figura 4: Scan do genoma de BTA9 em relação à contagem de células somáticas caracteristica de famílias Ayrshire Finlandês. Os números referem-se ao "número de livro genealógico". 0 eixo dos X representa a distância do 6 cromossoma expressa em Morgan de acordo com as posições empregues nesta análise. 0 eixo dos Y representa a estatística teste da análise do LTQ expressa no valor F.

Figuras 5a e 5b: Scan do genoma de BTA9 em relação à resistência à mastite característica de famílias Vermelho e Branco Sueco. Os números referem-se ao "número de livro genealógico". 0 eixo dos X representa a distância do cromossoma expressa em Morgan de acordo com as posições empregues nesta análise. 0 eixo dos Y representa a estatística teste da análise do LTQ expressa no valor F.

Figuras 6a e 6b: Scan do genoma de BTA9 em relação à contagem de células somáticas característica de famílias Vermelho e Branco Sueco. Os números referem-se ao "número de livro genealógico". 0 eixo dos X representa a distância do cromossoma expressa em Morgan de acordo com as posições empregues nesta análise. 0 eixo dos Y representa a estatística teste da análise do LTQ expressa no valor F.

Figura 7: Scan do genoma de BTA9 em relação à resistência à mastite característica de famílias Holstein Dinamarquês. Os números referem-se ao "número de livro genealógico". 0 eixo dos X representa a distância do cromossoma expressa em Morgan de acordo com as posições empregues nesta análise. 0 eixo dos Y representa a estatística teste da análise do LTQ expressa no valor F.

Figura 8: Scan do genoma de BTA9 em relação à contagem de células somáticas característica de famílias Holstein Dinamarquês. Os números referem-se ao "número de livro genealógico". 0 eixo dos X representa a distância do cromossoma expressa em Morgan de acordo com as posições 7 empregues nesta análise. 0 eixo dos Y representa a estatística teste da análise de LTQ expressa no valor F.

Figura 9: Perfil do LTQ para o traço da resistência à mastite mostrando um pico de DLAL/DL entre os marcadores BMS2819 e INRA144 a 74,08 cM em gado Vermelho Dinamarquês. O eixo dos X representa a distância do cromossoma expressa em Morgan de acordo com as posições empregues nesta análise. O eixo dos Y representa a razão de probabilidade da estatística teste da análise do LTQ.

Figura 10: Perfil do LTQ para o traço da Contagem de Células Somáticas mostrando um pico de DLAL entre os marcadores BMS2819 e INRA144 a 74,075 cM em gado Vermelho Dinamarquês. O eixo dos X representa a distância do cromossoma expressa em Morgan de acordo com as posições empregues nesta análise. O eixo dos Y representa a razão de probabilidade da estatística teste da análise do LTQ.

Figura 11: Perfil do LTQ para o traço da resistência à mastite mostrando um pico de DLAL/DL entre os marcadores BM4208 e INRA144 na raça Ayrshire Finlandês. 0 eixo dos X representa a distância do cromossoma expressa em Morgan de acordo com as posições empregues nesta análise. O eixo dos Y representa a razão de probabilidade da estatística teste da análise do LTQ.

Figura 12: Perfil do LTQ para o traço da resistência à mastite mostrando um pico de DLAL/DL entre os marcadores BMS2819 e INRA144 em gado combinado Ayrshire Finlandês e Vermelho Dinamarquês. 0 eixo dos X representa a distância do cromossoma expressa em Morgan de acordo com as posições empregues nesta análise. O eixo dos Y representa a razão de probabilidade da estatística teste da análise do LTQ.

Figura 13: Perfil do LTQ para o traço da resistência à mastite mostrando um pico de AL a 60-80 cM entre os marcadores BMS2819 e INRA144 em gado Vermelho e Branco Sueco. O eixo dos X representa a distância do cromossoma expressa em Morgan de acordo com as posições empregues nesta análise. O eixo dos Y representa a razão de probabilidade da estatística teste da análise do LTQ.

Figura 14: Perfil do LTQ para a PCS em gado Vermelho e Branco Sueco com evidência de DLAL entre os marcadores BMS2819 e INRA084. O eixo dos X representa a distância do cromossoma expressa em Morgan de acordo com as posições empregues nesta análise. O eixo dos Y representa a razão de probabilidade da estatística teste da análise do LTQ.

Figura 15: Perfil do LTQ para o traço da resistência à mastite mostrando um pico de DLAL/AL entre os marcadores BM4208 e INRA144 em análises combinadas de Ayrshire Finlandês, gado Vermelho Dinamarquês e gado Vermelho e Branco Sueco. O eixo dos X representa a distância do cromossoma expressa em Morgan de acordo com as posições empregues nesta análise. O eixo dos Y representa a razão de probabilidade da estatística teste da análise do LTQ.

Figura 16: Perfil do LTQ para o traço da resistência à mastite em gado Holstein Dinamarquês. O eixo dos X representa a distância do cromossoma expressa em Morgan de acordo com as posições empregues nesta análise. O eixo dos Y representa a razão de probabilidade da estatística teste da análise do LTQ.

Figura 17: O efeito dos haplotipos na resistência à mastite a 74,08 cM em Vermelho Dinamarquês. Os efeitos dos haplotipos estão no eixo dos y e o número de haplotipos está no eixo dos x. No início existem grandes 9 aglomerados de haplotipos do progenitor feminino seguidos pelos haplotipos do progenitor masculino.

Figura 18: 0 efeito dos haplotipos na resistência à mastite a 74,08 cM em Ayrshire Finlandês. Os efeitos dos haplotipos estão no eixo dos y e o número de haplotipos está no eixo dos x. No inicio existem grandes aglomerados de haplotipos do progenitor feminino seguidos pelos haplotipos do progenitor masculino.

Figura 19: O efeito dos haplotipos na resistência à mastite a 74,08 cM em Vermelho Dinamarquês e Ayrshire Finlandês combinados. Os efeitos dos haplotipos estão no eixo dos y e o número de haplotipos está no eixo dos x. No inicio existem grandes aglomerados de haplotipos do progenitor feminino seguidos pelos haplotipos do progenitor masculino.

Figura 20: O efeito dos haplotipos na resistência à mastite a 74,08 cM em Vermelho Dinamarquês, Ayrshire Finlandês e Vermelho e Branco Sueco combinados. Os efeitos dos haplotipos estão no eixo dos y e o número de haplotipos está no eixo dos x. No inicio existem grandes aglomerados de haplotipos do progenitor feminino seguidos pelos haplotipos do progenitor masculino.

Descrição detalhada da invenção A presente invenção relaciona-se com determinantes

genéticos da resistência à mastite em gado leiteiro. A ocorrência da mastite, mastite quer clinica, quer subclinica, envolve perda económica substancial para a indústria dos lacticinios. Portanto, é de interesse económico identificar aqueles sujeitos bovinos que tenham uma predisposição genética para a resistência à mastite. Os sujeitos bovinos com tal predisposição genética são 10 transportadores de traços desejados, os quais podem ser passados à sua descendência. O termo "sujeito bovino" refere-se a gado de qualquer raça e destina-se a incluem quer vacas, quer touros, sejam animais adultos ou recém-nascidos. Nenhuma idade particular doa animais é denotada por este termo. Um exemplo de um sujeito bovino é um membro da raça Holstein. Numa forma de realização preferencial, o sujeito bovino é um membro da população de gado Holstein-Friesian. Noutra forma de realização, o sujeito bovino é um membro da população de gado Holstein Swartbont. Noutra forma de realização, o sujeito bovino é um membro da população de gado Holstein Schwarzbunt Alemão. Noutra forma de realização, o sujeito bovino é um membro da população Holstein dos EUA. Numa forma de realização, o sujeito bovino é um membro da raça Vermelho e Branco de Holstein. Noutra forma de realização, o sujeito bovino é um membro da população de gado Holstein Schwarzbunt Alemão. Numa forma de realização, o sujeito bovino é um membro de qualquer familia, o que inclui membros da raça Holstein. Numa forma de realização preferencial, o sujeito bovino é um membro da população Vermelho Dinamarquês. Noutra forma de realização preferencial, o sujeito bovino é um membro da população Ayrshire Finlandês. Ainda noutra forma de realização, o sujeito bovino é um membro da população Vermelho e Branco Sueco. Numa forma de realização adicional, o sujeito bovino é um membro da população Holstein Dinamarquês. Noutra forma de realização, o sujeito bovino é um membro da população Vermelho e Branco Sueco. Ainda noutra forma de realização, o sujeito bovino é um membro da população Vermelho Nórdico.

Numa forma de realização da presente invenção, o sujeito bovino é selecionado do grupo consistindo em Vermelho e Branco Sueco, Vermelho Dinamarquês, Ayrshire Finlandês, 11

Holstein-Friesian, Holstein Dinamarquês e Vermelho Nórdico. Noutra forma de realização da presente invenção, o sujeito bovino é selecionado do grupo consistindo em gado Ayrshire Finlandês e Vermelho e Branco Sueco. Noutra forma de realização da presente invenção, o sujeito bovino é selecionado do grupo consistindo em gado Ayrshire Finlandês e Vermelho e Branco Sueco. 0 termo "marcador genético" refere-se a uma sequência de nucleótidos variável (polimorfismo) do ADN no cromossoma bovino e distingue um alelo de outro. A sequência de nucleótidos variável pode ser identificada por métodos conhecidos de uma pessoa perita na técnica por exemplo pelo uso de oligonucleótidos específicos por exemplo em métodos de amplificação e/ou observação de uma diferença de tamanhos. No entanto, a sequência de nucleótidos variável pode ser também detetada por sequenciação ou por exemplo análise de polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição. A sequência de nucleótidos variável pode ser representada por uma deleção, uma inserção, repetições, e/ou uma mutação pontual.

Um tipo de marcador genético é um marcador de microssatélite que esteja ligado a um lócus de traço quantitativo. Marcadores de microssatélite referem-se a pequenas sequências repetidas uma após a outra. Em pequenas sequências estão por exemplo um nucleótido, tal como dois nucleótidos, por exemplo três nucleótidos, tal como quatro nucleótidos, por exemplo cinco nucleótidos, tal como seis nucleótidos, por exemplo sete nucleótidos, tal como oito nucleótidos, por exemplo nove nucleótidos, tal como dez nucleótidos. No entanto, ocorrem por vezes mudanças e o

número de repetições pode aumentar ou diminuir. A definição especifica e o lócus dos marcadores de microssatélite polimórficos podem ser encontrados no mapa genético do DA 12 dos EUA (Kappes et al. 1997; ou seguindo a ligação do Centro de Pesquisa em Carne Animal dos E.U.A. http://www.marc.usda.gov/). É além disso apreciado que as sequências de nucleótidos dos marcadores genéticos da presente invenção estejam geneticamente ligadas a traços para a resistência à mastite num sujeito bovino. Consequentemente, é também entendido que pode ser gerado um número de marcadores genéticos a partir da sequência de nucleótidos da(s) região(ões) de ADN flanqueada(s) pelos e incluindo os marcadores genéticos de acordo com o método da presente invenção. 0 termo "Lócus de traço quantitativo (LTQ) " é uma região de ADN que está associada a um traço particular (e.g., altura da planta). Embora não necessariamente genes eles mesmos, os LTQs são extensões de ADN que estão intimamente ligadas aos genes que subjazem o traço em questão. 0 termo "mastite" é usado na presente aplicação para descrever quer a mastite subclinica caracterizada por exemplo por elevada pontuação de células somáticas (PCS), quer a mastite clinica.

Os termos "resistência contra a mastite" e "resistência à mastite" são usados indistintamente e relacionam-se com o facto de que alguns sujeitos bovinos não serem tão propensos como o são outros sujeitos bovinos. Quando se realizam análises de um número de sujeitos bovinos como na presente invenção de modo a se determinarem marcadores genéticos que estejam associados à resistência à mastite, os traços implicando resistência à mastite podem ser observados pela presença ou ausência de marcadores genéticos ligados à mastite clinica e/ou mastite subclinica nos sujeitos bovinos analisados. É entendido que a 13 resistência à mastite compreende resistência a traços, o que afeta a saúde do úbere no sujeito bovino ou na sua descendência. Assim sendo, a resistência à mastite de um touro é fisicamente manifestada pela sua descendência feminina.

Pontuação para a resistência à mastite

As filhas de touros foram pontuadas quanto à resistência à mastite e à PCS. A pontuação de células somáticas (PCS) foi definida como a média dos valores log10 de contagens de células somáticas transformadas (em 10.000/mL) obtidos a partir do esquema de registo do leite. A média foi tomada ao longo do período 10 a 180 após o parto. Os valores de melhoramento estimados (VME) para traços de filhos foram calculados usando um modelo animal de Melhor Previsão Imparcial Linear (MPIL) de traço único ignorando a estrutura da família. Estes VMEs foram usados na análise do LTQ. Os registos das filhas usados nos traços individuais foram:

Mastite clínica na Dinamarca: Casos tratados de mastite clínica no período de -5 a 10 dias após o Io parto. Mastite clínica na Suécia e na Finlândia: Casos tratados de mastite clínica no período de -7 a 150 dias após o Io parto. PCS na Dinamarca: PCS média no período de 10-180 dias após o Io parto. PCS na Suécia: PCS média no período de 10-150 dias após o Io parto. PCS na Finlândia: PCS média no período de 10-305 dias após o Io parto.

Numa forma de realização da presente invenção, o método e o conjunto descritos aqui relacionam-se com a resistência à mastite. Noutra forma de realização da presente invenção, o 14 método e o conjunto descritos aqui relacionam-se com a resistência à mastite clinica. Noutra forma de realização, o método e o conjunto da presente invenção pertencem à resistência à mastite subclinica, tal como detetada por contagens de células somáticas. Ainda noutra forma de realização, o método e o conjunto da presente invenção relacionam-se primariamente com a resistência à mastite clinica em combinação com a resistência à mastite subclinica tal como detetada por contagens de células somáticas.

Amostra 0 método de acordo com a presente invenção inclui a análise de uma amostra de um sujeito bovino, em que a referida amostra pode ser qualquer amostra adequada capaz de proporcionar o material genético bovino para uso no método. 0 material genético bovino pode ser por exemplo extraído, isolado e purificado se necessário a partir de uma amostra de sangue, uma amostra de tecido (por exemplo baço, esfregaços bucais), tosquia de uma superfície corporal (pelos ou unhas), leite e/ou sémen. As amostras podem ser frescas ou congeladas.

Os polimorfismos de sequência da invenção compreendem pelo menos uma diferença de nucleótidos, tal como pelo menos duas diferenças de nucleótidos, por exemplo pelo menos três diferenças de nucleótidos, tal como pelo menos quatro diferenças de nucleótidos, por exemplo pelo menos cinco diferenças de nucleótidos, tal como pelo menos seis diferenças de nucleótidos, por exemplo pelo menos sete diferenças de nucleótidos, tal como pelo menos oito diferenças de nucleótidos, por exemplo pelo menos nove diferenças de nucleótidos, tal como 10 diferenças de nucleótidos As diferenças de nucleótidos compreendem 15 diferenças, deleção e/ou inserção de nucleótidos ou qualquer sua combinação.

Desenho da neta 0 desenho da neta inclui a análise de dados de marcadores baseados em ADN para avôs que têm sido extensivamente usados no melhoramento e para filhos de avôs onde os filhos produziram descendência. Os dados fenotipicos que são para ser usados em conjunto com os dados do marcador de ADN são derivados das filhas dos filhos. Tais dados fenotipicos poderiam ser por exemplo caracteristicas da produção do leite, caracteristicas relativas ao parto, qualidade da carne, ou doença. Um grupo de filhas herdou um alelo do seu progenitor masculino ao passo que um segundo grupo de filhas herdou o outro alelo do seu progenitor masculino. Pela comparação dos dados dos dois grupos, pode ser adquirida informação sobre se um fragmento de um cromossoma particular está a abrigar um ou mais genes que afetem o traço em questão. Pode ser concluído se um LTQ está presente no seio deste fragmento do cromossoma.

Um pré-requisito para a realização de um desenho da neta é a disponibilidade de dados fenotipicos detalhados. Na presente invenção, tais dados estavam disponíveis (http://lr.dk/kvaeg/diverse/principies.pdf). LTQ é uma forma diminutiva de lócus de traço quantitativo. Os genes conferindo traços quantitativos a um indivíduo podem ser encontrados de uma maneira indireta pela observação de pedaços de cromossomas que atuam como se um ou mais gene(s) estivesse(m) localizado(s) no seio desse pedaço do cromossoma.

Em contraste, podem ser usados marcadores de ADN para proporcionar informação dos traços passados dos parentes a 16 um ou mais da sua descendência quando um número de marcadores de ADN num cromossoma tenha sido determinado para um ou ambos os parentes e sua descendência. Os marcadores podem ser usados para calcular a história genética do cromossoma ligado aos marcadores de ADN.

Regiões e marcadores cromossomais BTA é diminutivo para autossoma Bos taurus.

Um aspeto da presente invenção relaciona-se com um método para determinação da resistência à mastite num sujeito bovino, compreendendo a deteção numa amostra do referido sujeito bovino da presença ou ausência de pelo menos um marcador genético que esteja ligado a pelo menos um traço indicativo da resistência à mastite, em que o referido pelo menos um marcador genético está localizado no cromossoma bovino BTA9 na região flanqueada pelos e incluindo os marcadores de microssatélite polimórficos C6orf93 e inra084, em que a presença ou ausência do referido pelo menos um marcador genético é indicativa da resistência à mastite do referido sujeito bovino ou da sua descendência.

Devido ao conceito de desequilíbrio de ligação como descrito aqui, a presente invenção também se relaciona com a determinação da resistência à mastite num sujeito bovino, em que o pelo menos um marcador genético está ligado a um traço bovino para a resistência à mastite.

De modo a se determinar a resistência à mastite num sujeito bovino, é apreciado que mais do que um marcador genético podem ser empregues na presente invenção. Por exemplo, o pelo menos um marcador genético pode ser uma combinação de pelo menos dois ou mais marcadores genéticos tal que a precisão possa ser aumentada, tal como pelo menos três marcadores genéticos, por exemplo quatro marcadores 17 genéticos, tal como pelo menos cinco marcadores genéticos, por exemplo seis marcadores genéticos, tal como pelo menos sete marcadores genéticos, por exemplo oito marcadores genéticos, tal como pelo menos nove marcadores genéticos, por exemplo dez marcadores genéticos. 0 pelo menos um marcador genético pode estar localizado no pelo menos um cromossoma bovino tal como dois cromossomas, por exemplo três cromossomas, tal como quatro cromossomas, por exemplo cinco cromossomas, e/ou tal como seis cromossomas. O pelo menos um marcador genético pode estar localizado no cromossoma bovino 9. No entanto, o pelo menos um marcador genético pode ser uma combinação de marcadores localizados em diferentes cromossomas. 0 pelo menos um marcador genético é selecionado de qualquer um dos marcadores individuais das tabelas mostradas aqui.

De acordo com a invenção, o pelo menos um marcador genético está localizado no cromossoma bovino BTA9 na região flanqueada pelos e incluindo os marcadores c6orf93 e inra084. Numa forma de realização da presente invenção, o pelo menos um marcador genético está localizado na região de cerca de 69,35 cM a cerca de 79,8 cM (de acordo com as posições empregues nesta análise) no cromossoma bovino BTA9. 0 pelo menos um marcador genético é selecionado do grupo de marcadores mostrado na Tabela 1.

Tabela 1

Marcador no BTA9 Posição empregue na análise (cM) Posição relativa (cM) http://www.marc.usda.gov/ C6orf93* 69,35 - DIK 4986 69,4 84,258 Mml2e6* 69,45 84,258 PEX3* 69,5 - 18 DEAD21 69, 55 - BMS2251 71,3 86, 58 EPM2A* 72,1 BM7234 72,3 88,136 BM42U8 73, 9 90,69 BMS2819 73, 95 90,98 INRA144 74,2 90,98 INRA084 74,5 90,98 * denota marcadores que não estão listados no mapa dos marcadores do CPCA no BTA9.

Noutra forma de realização da invenção, o pelo menos um marcador genético está localizado no cromossoma bovino BTA9 na região flanqueada pelos e incluindo os marcadores c6orf93 e inra084. Numa forma de realização da presente invenção, o pelo menos um marcador genético está localizado na região de cerca de 69, 35 cM a cerca de 74,5 cM (de acordo com as posições empregues nesta análise) no cromossoma bovino BTA9. De acordo com o mapa de marcadores do CPCA, a posição do marcador genético inra084 é de 90,98. O pelo menos um marcador genético é selecionado do grupo de marcadores mostrado na Tabela 2.

Tabela 2

Marcador no BTA9 Posição empregue na análise (cM) Posição relativa (cM) http://www.marc.usda.gov/ C6orf93* 69,35 - DIK 4986 69, 4 84,258 Mml2e6* 69, 45 84,258 PEX3* 69, 5 - DEAD21 69, 55 - BMS2251 71,3 86,58 EPM2A* 72,1 BM7234 72,3 88,136 BM4208 73, 9 90,69 BMS2819 73, 95 90,98 INRA144 74,2 90,98 INRA084 74,5 90,98 19

Marcador no BTA9 Posição empregue na análise (cM) Posição relativa (cM) http://www.marc.usda.gov/ * denota marcadores que não estão listados no mapa de marcadores do CPCA no BTA9.

Numa forma de realização adicional, o pelo menos um marcador genético está localizado no cromossoma bovino BTA9 na região flanqueada pelos e incluindo os marcadores bms2251 e inra 084. Numa forma de realização da presente invenção, o pelo menos um marcador genético está localizado na região de cerca de 71,3 cM a cerca de 74,5 cM no cromossoma bovino BTA9 (de acordo com as posições empregues nesta análise) e de cerca de 86,58 cM a cerca de 90,98 cM de acordo com o mapa de marcadores do CPCA. O pelo menos um marcador genético é selecionado do grupo de marcadores mostrado na Tabela 3.

Tabela 3

Marcador no BTA9 Posição empregue na análise (cM) Posição relativa (cM) http://www.marc.usda.gov/ BMS2251 71,3 86, 58 EPM2A* 72,1 BM7234 72,3 88,136 BM4208 73, 9 90,69 BMS2819 73, 95 90,98 INRA144 74,2 90,98 INRA084 74,5 90,98 * denota marcadores que não estão listados no mapa de marcadores do CPCA no BTA9.

Noutra forma de realização, o pelo menos um marcador genético está localizado no cromossoma bovino BTA9 na região flanqueada pelos e incluindo os marcadores bms2251 e inral44. Numa forma de realização da presente invenção, o pelo menos um marcador genético está localizado na região de cerca de 71,3 cM a cerca de 74,2 cM no cromossoma bovino BTA9 (de acordo com as posições empregues nesta análise) e 20 de cerca de 86, 58 cM a cerca de 90, 98 cM de acordo com o mapa de marcadores do CPCA. O pelo menos um marcador genético é selecionado do grupo de marcadores mostrado na Tabela 4.

Tabela 4

Marcador no BTA9 Posição empregue na análise (cM) Posição relativa (cM) http://www.marc.usda.gov/ BMS2251 71,3 86, 58 EPM2A* 72,1 BM7234 72,3 88,136 BM4208 73, 9 90,69 BMS2819 73, 95 90,98 INRA144 74,2 90,98 * denota marcadores que não estão listados no mapa de marcadores do CPCA no BTA9.

Ainda noutra forma de realização, o pelo menos um marcador genético está localizado no cromossoma bovino BTA9 na região flanqueada pelos e incluindo os marcadores bm7234 e inra084. Numa forma de realização da presente invenção, o pelo menos um marcador genético está localizado na região de cerca de 72,3 cM a cerca de 74,5 cM no cromossoma bovino BTA9 (de acordo com as posições empregues nesta análise) e de cerca de 88,136 cM a cerca de 90, 98 cM de acordo com o mapa de marcadores do CPCA. O pelo menos um marcador genético é selecionado do grupo de marcadores mostrado na Tabela 5.

Tabela 5

Marcador no BTA9 Posição empregue na análise (cM) Posição relativa (cM) http://www.marc.usda.gov/ BM7234 72,3 88,136 BM4208 73, 9 90,69 BMS2819 73, 95 90,98 INRA144 74,2 90,98 INRA084 74,5 90,98 21

Marcador no BTA9 Posição empregue na análise (cM) Posição relativa (cM) http://www.marc.usda.gov/ * denota marcadores que não estão listados no mapa de marcadores do CPCA no BTA9.

Numa forma de realização adicional, o pelo menos um marcador genético está localizado no cromossoma bovino BTA9 na região flanqueada pelos e incluindo os marcadores bm7234 e inral44. Numa forma de realização da presente invenção, o pelo menos um marcador genético está localizado na região de cerca de 72,3 cM a cerca de 74,2 cM no cromossoma bovino BTA9 (de acordo com as posições empregues nesta análise) e de cerca de 88,136 cM a cerca de 90,98 cM de acordo com o mapa de marcadores do CPCA. O pelo menos um marcador genético é selecionado do grupo de marcadores mostrado na Tabela 6.

Tabela 6

Marcador no BTA9 Posição empregue na análise (cM) Posição relativa (cM) http://www.marc.usda.gov/ BM7234 72,3 88,136 BM4208 73, 9 90,69 BMS2819 73, 95 90,98 INRA144 74,2 90,98 * denota marcadores que não estão listados no mapa de marcadores do CPCA no BTA9.

Ainda numa forma de realização adicional, o pelo menos um marcador genético está localizado no cromossoma bovino BTA9 na região flanqueada pelos e incluindo os marcadores bm7234 e bms2819. Numa forma de realização da presente invenção, o pelo menos um marcador genético está localizado na região de cerca de 72,3 cM a cerca de 73, 95 cM no cromossoma bovino BTA9 (de acordo com as posições empregues nesta análise) e de cerca de 88,136 cM a cerca de 90, 98 cM de acordo com o mapa de marcadores do CPCA. O pelo menos um 22 marcador genético é selecionado do grupo de marcadores mostrado na Tabela 7.

Tabela 7

Marcador no BTA9 Posição empregue na análise (cM) Posição relativa (cM) http://www.marc.usda.gov/ BM7234 72,3 88,136 BM4208 73, 9 90,69 BMS2819 73, 95 90,98 * denota marcadores que não estão listados no mapa de marcadores do CPCA no BTA9.

Noutra forma de realização, o pelo menos um marcador genético está localizado no cromossoma bovino BTA9 na região flanqueada pelos e incluindo os marcadores bm7234 e bm4208. Numa forma de realização da presente invenção, o pelo menos um marcador genético está localizado na região de cerca de 72,3 cM a cerca de 73,9 cM no cromossoma bovino BTA9 (de acordo com as posições empregues nesta análise) e de cerca de 88,136 cM a cerca de 90,69 cM de acordo com o mapa de marcadores do CPCA. O pelo menos um marcador genético é selecionado do grupo de marcadores mostrado na Tabela 8.

Tabela 8

Marcador no BTA9 Posição empregue na análise (cM) Posição relativa (cM) http://www.marc.usda.gov/ BM7234 72,3 88,136 BM4208 73, 9 90,69 * denota marcadores que não estão listados no mapa de marcadores do CPCA no BTA9.

Numa forma de realização adicional, o pelo menos um marcador genético está localizado no cromossoma bovino BTA9 na região flanqueada pelos e incluindo os marcadores bms2819 e inral44. Numa forma de realização da presente invenção, o pelo menos um marcador genético está localizado 23 na região de cerca de 73, 95 cM a cerca de 74,2 cM no cromossoma bovino BTA9 (de acordo com as posições empregues nesta análise) e de cerca de 90, 98 cM a cerca de 90,98 cM de acordo com o mapa de marcadores do CPCA. O pelo menos um marcador genético é selecionado do grupo de marcadores mostrado na Tabela 9.

Tabela 9

Marcador no BTA9 Posição empregue na análise (cM) Posição relativa (cM) http://www.marc.usda.gov/ BMS2819 73, 95 90,98 INRA144 74,2 90,98 * denota marcadores que não estão listados no mapa de marcadores do CPCA no BTA9.

Noutra forma de realização da presente invenção, o pelo menos um marcador genético está localizado no cromossoma bovino BTA9 na região flanqueada pelos e incluindo os marcadores bms2819 e inra084. Numa forma de realização da presente invenção, o pelo menos um marcador genético está localizado na região de cerca de 73, 95 cM a cerca de 74,5 cM no cromossoma bovino BTA9 (de acordo com as posições empregues nesta análise) e de cerca de 90,98 cM a cerca de 90,98 cM de acordo com o mapa de marcadores do CPCA. O pelo menos um marcador genético é selecionado do grupo de marcadores mostrado na Tabela 10.

Tabela 10

Marcador no BTA9 Posição empregue na análise (cM) Posição relativa (cM) http://www.marc.usda.gov/ BMS2819 73, 95 90,98 INRA144 74,2 90,98 INRA084 74,5 90,98 * denota marcadores que não estão listados no mapa de marcadores do CPCA no BTA9.

Noutra forma de realização da presente invenção, o pelo menos um marcador genético está localizado no cromossoma bovino BTA9 na região flanqueada pelos e incluindo os marcadores bm4208 e inral44. Numa forma de realização da presente invenção, o pelo menos um marcador genético está localizado na região de cerca de 73,9 cM a cerca de 74,2 cM no cromossoma bovino BTA9 (de acordo com as posições empregues nesta análise) e de cerca de 90,69 cM a cerca de 90,98 cM de acordo com o mapa de marcadores do CPCA. O pelo menos um marcador genético é selecionado do grupo de marcadores mostrado na Tabela 11.

Tabela 11

Marcador no BTA9 Posição empregue na análise (cM) Posição relativa (cM) http://www.marc.usda.gov/ BM4208 73, 9 90,69 BMS2819 73, 95 90,98 INRA144 74,2 90,98 INRA084 74,5 90,98 * denota marcadores que não estão listados CPCA no BTA9. no mapa de marcadores do

Ainda noutra forma de realização da presente invenção, o pelo menos um marcador genético está localizado no cromossoma bovino BTA9 na região flanqueada pelos e incluindo os marcadores inral44 e inra084. Numa forma de realização da presente invenção, o pelo menos um marcador genético está localizado na região de cerca de 74,2 cM a cerca de 74,5 cM no cromossoma bovino BTA9 (de acordo com as posições empregues nesta análise) e de cerca de 90,98 cM a cerca de 90,98 cM de acordo com o mapa de marcadores do CPCA. O pelo menos um marcador genético é selecionado do grupo de marcadores mostrado na Tabela 12. 25

Tabela 12

Marcador no BTA9 Posição empregue na análise (cM) Posição relativa (cM) http://www.marc.usda.gov/ INRA144 74,2 90,98 INRA084 74,5 90,98 * denota marcadores que não estão listados no mapa de marcadores do CPCA no BTA9.

Numa forma de realização adicional, o pelo menos um marcador genético está localizado no cromossoma bovino BTA9 na região flanqueada pelos e incluindo os marcadores bms2251 e bm7234. Numa forma de realização da presente invenção, o pelo menos um marcador genético está localizado na região de cerca de 71,3 cM a cerca de 72,3 cM no cromossoma bovino BTA9 (de acordo com as posições empregues nesta análise) e de cerca de 86,58 cM a cerca de 88,136 cM de acordo com o mapa de marcadores do CPCA. 0 pelo menos um marcador genético é selecionado do grupo de marcadores mostrado na Tabela 13.

Tabela 13

Marcador no BTA9 Posição empregue na análise (cM) Posição relativa (cM) http://www.marc.usda.gov/ BMS2251 71,3 86,58 EPM2A* 72,1 BM7234 72,3 88,136 * denota marcadores que não estão listados no mapa de marcadores do CPCA no BTA9.

Ainda numa forma de realização adicional, o pelo menos um marcador genético está localizado no cromossoma bovino BTA9 na região flanqueada pelos e incluindo os marcadores EPM2A e bm7234. Numa forma de realização da presente invenção, o pelo menos um marcador genético está localizado na região de cerca de 72,1 cM a cerca de 72,3 cM no cromossoma bovino BTA9 (de acordo com as posições empregues nesta análise) e para bm7234 cerca de 88,136 cM de acordo com o mapa de 26 marcadores do CPCA. 0 pelo menos um marcador genético é selecionado do grupo de marcadores mostrado na Tabela 14.

Tabela 14

Marcador no BTA9 Posição empregue na análise (cM) Posição relativa (cM) http://www.marc.usda.gov/ EPM2A* 72,1 BM7234 72,3 88,136 * denota marcadores que não estão listados no mapa de marcadores do CPCA no BTA9.

Numa forma de realização da invenção, o pelo menos um marcador genético está localizado no cromossoma bovino BTA9. Numa forma de realização, o pelo menos um marcador genético está localizado no cromossoma bovino BTA9 na região flanqueada pelos e incluindo os marcadores inral44 e rgsl7. Numa forma de realização da presente invenção, o pelo menos um marcador genético está localizado na região de cerca de 7 4,2 cM a cerca de 7 9,8 cM (de acordo com as posições empregues nesta análise) no cromossoma bovino BTA9 onde a posição de inral44 de acordo com o mapa de marcadores do CPCA é de 90,98 cM. O pelo menos um marcador genético é selecionado do grupo de marcadores mostrado na Tabela 15.

Tabela 15

Marcador no BTA9 Posição empregue na análise (cM) Posição relativa (cM) http://www.marc.usda.gov/ INRA144 74,2 90,98 INRA084 74,5 90,98 rgsl7* 79, 8 * denota marcadores que não estão listados no mapa de marcadores do CPCA no BTA9.

Noutra forma de realização da invenção, o pelo menos um marcador genético está localizado no cromossoma bovino BTA9. Numa forma de realização, o pelo menos um marcador 27 genético está localizado no cromossoma bovino BTA9 na região flanqueada pelos e incluindo os marcadores inra084 e rgsl7. Numa forma de realização da presente invenção, o pelo menos um marcador genético está localizado na região de cerca de 74,5 cM a cerca de 79,8 cM (de acordo com as posições empregues nesta análise) no cromossoma bovino BTA9 e onde a posição de inra084 de acordo com o mapa de marcadores do CPCA é de 90,68 cM. O pelo menos um marcador genético é selecionado do grupo de marcadores mostrado na Tabela 16.

Tabela 16

Marcador no BTA9 Posição empregue na análise (cM) Posição relativa (cM) http://www.marc.usda.gov/ INRAO 8 4 74,5 90,98 rgsl7* 79, 8 - * denota marcadores que não estão listados no mapa de marcadores do CPCA no BTA9.

Iniciadores

Os iniciadores que podem ser usados de acordo com a presente invenção são mostrados na Tabela 17. Os pares de iniciadores especificados na Tabela 17 podem ser usados individualmente ou em combinação com um ou mais pares de iniciadores da Tabela 17. O desenho de tais iniciadores ou sondas será aparente ao biólogo molecular de perícia ordinária. Tais iniciadores têm qualquer comprimento conveniente tal como até 50 bases, até 40 bases, mais convenientemente até 30 bases de comprimento, tal como por exemplo 8-25 ou 8-15 bases de comprimento. Em geral, tais iniciadores compreenderão sequências de bases inteiramente complementares do correspondente lócus de tipo selvagem ou variante na região. No entanto, se requerido, podem ser introduzidas 28 uma ou mais incompatibilidades, contanto que o poder discriminatório da sonda de oligonucleótidos não seja indevidamente afetado. Os iniciadores/sondas da invenção podem transportar um ou mais marcadores para facilitar a deteção.

Numa forma de realização, os iniciadores e/ou sondas são capazes de hibridar com e/ou amplificar uma hibridação subsequente a um polimorfismo de nucleótido único contendo a sequência delineada pelos marcadores como mostrado aqui.

As sequências de nucleótidos iniciadoras da invenção incluem adicionalmente: (a) qualquer sequência de nucleótidos que hibride com uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de marcador genético ou a sua sequência complementar ou produtos de ARN sob condições estringentes, e.g., hibridação com ADN ligado ao filtro em 6x cloreto de sódio/citrato de sódio (SCS) a cerca de 45°C seguindo-se uma ou mais lavagens em 0,2x SCS/Dodecilo Sulfato de Sódio (DSS) a 0,1% a cerca de 50-65°C, ou (b) sob condições altamente estringentes, e.g., hibridação com ácido nucleico ligado ao filtro em 6x SCS a cerca de 45°C seguindo-se uma ou mais lavagens em 0,lx SCS/DSS a 0,2% a cerca de 68°C, ou sob outras condições de hibridação que sejam aparentes àqueles peritos na técnica (ver, por exemplo, Ausubel F.M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., e John Wiley & sons, Inc., Nova Iorque, nas pp. 6.3.1-6.3.6 e 2.10.3). Preferencialmente, a molécula de ácido nucleico que híbrida com a sequência de nucleótidos de (a) e (b) , acima, é uma que compreenda o complemento de uma molécula de ácido nucleico do ADN genómico compreendendo a sequência de marcador genético ou uma sequência complementar ou seu produto de ARN. 29

De entre as moléculas de ácido nucleico da invenção estão deoxioligonucleótidos ("oligos") que hibridam sob condições altamente estringentes ou estringentes às moléculas de ácido nucleico descritas acima. Em geral, para sondas entre 14 e 70 nucleótidos de comprimento, a temperatura de fusão (TF) é calculada usando a fórmula:

Tf (°C) = 81,5 + 16,6(log[catiões monovalentes (molar)]) + 0,41(%G+C) - (500/N) onde N é o comprimento da sonda. Se a hibridação for levada a cabo numa solução contendo formamida, a temperatura de fusão é calculada usando a equação Tf (°C) = 81,5 + 16, 6(log[catiões monovalentes (molar)]) + 0,41(%G+C) - (0,61%formamida) - (500/N) onde N é o comprimento da sonda. EM geral, a hibridação é levada a cabo a cerca de 20-25 graus abaixo da Tf (para hibridos ADN-ADN) ou a 10-15 graus abaixo da Tf (para híbridos ARN-ADN).

Condições altamente estringentes exemplares podem-se referir, e.g., à lavagem em 6x SCS/pirofosfato de sódio a 0,05% a 37°C (para oligos com cerca de 14 bases), 48°C (para oligos com cerca de 17 bases), 55°C (para oligos com cerca de 20 bases) , e 60°C (para oligos com cerca de 23 bases).

Conformemente, a invenção proporciona adicionalmente iniciadores ou sondas de nucleótidos que detetam os polimorfismos da invenção. A avaliação pode ser conduzida por meio de pelo menos um iniciador ou sonda de ácido nucleico, tal como um iniciador ou sonda de ADN, ARN ou um análogo de ácido nucleico tal como ácido nucleico de péptido (ANP) ou ácido nucleico bloqueado (ANB). 30

De acordo com um aspeto da presente invenção, é proporcionado uma sonda de oligonucleótidos especifica quanto ao alelo capaz de detetar um polimorfismo numa ou mais posições nas regiões delineadas. A sonda de oligonucleótidos especifica quanto ao alelo tem preferencialmente 5-50 nucleótidos, mais preferencialmente cerca de 5-35 nucleótidos, mais preferencialmente cerca de 5-30 nucleótidos, mais preferencialmente pelo menos 9 nucleótidos.

Determinação da ligação

De modo a se detetar se o marcador genético está presente no material genético, podem ser aplicados métodos padrão bem conhecidos de pessoas peritas na técnica, e.g. pelo uso de amplificação de ácido nucleico. De modo a se determinar se o marcador genético está geneticamente ligado a traços de resistência à mastite, pode ser aplicado um teste de permutação (Doerge e Churchill, 1996), ou pode ser aplicado o método de Piepho (Piepho, 2001) . O princípio do teste de permutação está bem descrito por Doerge e Churchill (1996) , ao passo que o método de Piepho está bem descrito por Piepho (2001). Ligação significativa na análise no seio da família usando o método de regressão, foram feitas 1000 permutações usando o teste de permutação (Doerge e Churchill, 1996). Um limite no nivel amplo de cromossoma a 5% foi considerado como sendo evidência significativa da ligação entre o marcador genético e os traços da resistência à mastite e da contagem de células somáticas. Adicionalmente, o LTQ foi confirmado em diferentes famílias de progenitores masculinos. Para a análise ao longo das famílias e análise multitraços com o método do componente de variância, foi usado o método de Piepho para determinar o nível de significância (Piepho, 2001) . Um limite no nível amplo de cromossoma a 5% foi considerado como sendo 31 evidência significativa da ligação entre o marcador genético e os traços da resistência à mastite e da contagem de células somáticas.

Conjunto

Outro aspeto da presente invenção relaciona-se com o uso de um conjunto de diagnóstico para deteção da presença ou ausência num sujeito bovino de pelo menos um marcador genético associado à resistência à mastite, compreendendo pelo menos uma seguência de nucleótidos e suas combinações, em gue as seguências de nucleótidos são selecionadas de gualguer uma da SEQ ID NO.: 75 à SEQ ID NO.: 98. A genotipagem de um sujeito bovino de modo a estabelecer os determinantes genéticos de resistência à mastite para esse sujeito de acordo com a presente invenção pode ser baseada na análise de ADN e/ou ARN. Um exemplo é ADN genómico o qual pode ser proporcionado usando métodos de extração de ADN padrão como descrito aqui. 0 ADN genómico pode ser isolado e amplificado usando técnicas padrão tais como a reação em cadeia da polimerase usando iniciadores de oligonucleótidos correspondendo (complementares) às regiões marcadoras polimórficas. Podem ser incluídos passos adicionais de purificação do ADN antes da reação de amplificação. Assim sendo, um conjunto de diagnóstico para estabelecimento de características da resistência à mastite e das contagens de células somáticas compreende, num pacote separado, pelo menos uma sequência de oligonucleótidos selecionada do grupo de sequências mostrado na tabela 17 e quaisquer suas combinações. 32

Exemplos - BTA9 Animais 0 material animal consiste num desenho de neta com 39 familias de progenitores masculinos paternos com um número total de filhos da descendência testados de 1513 de quatro raças de gado leiteiro nomeadamente Holstein Dinamarquês (HD) e Vermelho Dinamarquês (VD), Ayrshire Finlandês (AF) e Vermelho e Branco Sueco (VBS). Estas 39 familias consistem em 5 familias de avôs de HD, 11 de AF e 14 de VBS. 0 número de filhos por avô variou de 16 a 161, com um tamanho de familia médio de 38,8.

Purificação de ADN genómico 0 ADN genómico foi purificado de sémen de acordo com o seguinte protocolo:

Após descongelamento da palhinha de sémen, ambas as extremidades da palhinha foram cortadas com uma tesoura e o conteúdo do sémen transferido para um tubo eppendorf de 1,5 mL. 1 mL de NaCl a 0,9% foi usado para inserir a palhinha no tubo. O tubo foi depois centrifugado durante 5 minutos a 2000 rpm, seguindo-se a remoção do sobrenadante. Este passo de lavagem foi repetido duas vezes.

Depois, 300 yL de tampão S (Tris HC1 pH 8 a 10 mM, NaCl a 100 mM, AEDT pH 8 a 10 mM; DSS a 0,5%), 20 yL de DTT a 1 M e 20 yL de pronase (20 mg/mL) (Boehringer) são adicionados ao tubo. Após mistura, os tubos são incubados durante a noite com rotação lenta onde após o que 180 yL de NaCl saturado são adicionados seguindo-se agitação vigorosa durante 15 segundos. O tubo é centrifugado durante 15 minutos a 11000 rpm. 0,4 mL do sobrenadante 33 são transferidos para um tubo de 2 mL e é adicionado 1 mL de etanol a 96%, a mistura é alcançada por rotação lenta do tubo. 0 tubo é depois centrifugado durante 10 minutos a 11000 rpm. Remova o sobrenadante vertendo o liquido para fora, lave a pastilha com etanol a 70% (0,2 mL) e centrifugue novamente durante 10 minutos a 11000 rpm. Verta o etanol para fora, seque a pastilha e ressuspenda em 0,5 mL de tampão TA durante 30 minutos a 55°C.

Procedimentos de amplificação

As reações de RCP foram executadas num volume de 8 pL usando polimerase TEMPase (GeneChoice) e tampão de reação I como proporcionado pelo fornecedor (GeneChoice). Usualmente, 5 marcadores diferentes estão incluídos em cada RCP multiplex. 1 pL de ADN, 0,1 pL de enzima TEMPase, dNTPs a 0,2 mM, MgCl2 a 1,2 mM, cada iniciador a 0,3 pM.

As misturas de RCP foram sujeitas a desnaturação inicial a 94°C durante 14 minutos (para a TEMPase). Subsequentemente, as amostras foram sujeitas a ciclo durante 10 ciclos com decréscimo, i.e. a temperatura é baixada 1°C em cada ciclo (desnaturação a 94°C 30°, emparelhamento a 67°C 45"", elongação 72°C 30""), após o que as amostras foram sujeitas a ciclo durante 20 ciclos com condições de RCP normais (desnaturação a 94°C 30°, emparelhamento a 58°C 45"", elongação 72°C 30) . O ciclo de RCP foi terminado por 1 ciclo a 72°C 30" e a máquina de RCP foi programada para arrefecer as amostras a 4°C para "sempre". A sequência de nucleótidos dos iniciadores usados para deteção dos marcadores é mostrada na Tabela 17. A sequência de nucleótidos está listada a partir da extremidade 5".

Tabela 17 34 34 Nome do marcador Iniciador Dianteiro D SEQ ID NO.: Iniciador Inverso I BTA9: C6orf93 d CTCGGTGATGTTTTTGCTGA i CG CCC CÂG CTCTTTCTÂGTT SEQ ID NO.: 75 SEQ ID NO.: 76 DIK 4986 d G G GATGAA.CATTGAGG GTTG i CATGATCAAGATGGGGGAAG SEQ ID NO.: 77 SEQ ID NO.: 78 Mml2e6 d GAAGACAGGTGTTTCAATCT 1 ATCGACTCTGGGGGATGATGT SEQ ID NO.: 79 SEQ ID NO.: 80 PEX3 D TTTTGCGAGTCCAGTTAAAGA i GGAAAAGCCAGAGCAAAATG SEQ ID NO.: 81 SEQ ID NO.: 82 DEADC1 d TTGCTAGGGCTGTGGTGATT i TGGAGCAGGCATAAGGATTT SEQ ID NO.: 83 SEQ ID NO.: 84 BMS2251 d AACG G CTTTCACTTTCTTGC 1 CTGGGTGAACAAATGGGC SEQ ID NO.: 85 SEQ ID NO.: 86 EPM2A d GCGGCC GCGTTGAGAG i TTCCAC TTT ATG ÂTG AGG AGG TTC SEQ ID NO.: 87 SEQ ID NO.: 88 BM7234 d TTCACTGATTGTCATTCCCTAGA i TAAGCAAATAAATGGTGCTAGTCA SEQ ID NO.: 89 SEQ ID NO.: 90 BM4208 d TCAGTACACTGG GCACCATG i CACTGCATGCTTTTCCAAAC SEQ ID NO.: 91 SEQ ID NO.: 92 BMS2819 d GCTCACAGGTTGTGAGGACTC i AÃCTTGAAG AAGGAATG GTGAG SEQ ID NO.: 93 SEQ ID NO.: 94 INRA144 D TCG GTGTGG GAG GTG AGTAGÂT 1 ΪG CTG GTG G G CT CCGT CACC SEQ ID NO.: 95 SEQ ID NO.: 96 INRA084 D C TAAAG CTTTCCTCC ATCT C i CCTGGTGATGTTTGGATGTC SEQ ID NO.: 97 SEQ ID NO.: 98

Marcadores e mapa

Para ο BTA9 no presente estudo, foram escolhidos 45 marcadores de microssatélite a partir do website do Centro de Pesquisa em Carne Animal

Como ο BTA9 é [www.marc.usda.gov/genome/genome.html). 35 ortólogo em relação a HSA6q, foram escolhidos 28 genes e MSEs publicados ao longo de HSA6q (Ctgf, Vip, Vil2, Rgsl7, ROsl, Slcl6al0, Oprm, igf2r, Esrl, Deadcl, Pex3, C6orf93, Ifngrl, Shprh, Epm2a, AK094944, AK094379, Utm, Tnf, plg, aridlb, lama4, hivep2, C6orff055, CITED2, RP1-172K10, AIGl, GRM) para rastreio de PNUs e de microssatélites. Oito dos novos marcadores de microssatélite identificados no presente estudo e 29 PNUs foram igualmente genotipados ao longo da linhagem de modo a se criar um mapa denso do BTA9 por análise de ligação.

Informação do painel de hibrido de radiação (HR)

Pares de iniciadores específicos foram desenhados a partir das sequências bovinas para mapear os genes e microssatélites incluindo microssatélites do CPCA. Ao longo do cromossoma 9, um total de mais do que 120 marcadores foi usado no painel de HR do gado. 65 genes e 34 microssatélites mostraram uma amplificação bem-sucedida, bandas com o tamanho apropriado no ADN bovino e nenhuma amplificação em ADN de hamster. Eles foram tipados no painel de HR bovino de Rostin/Cambridge de 3000-rad (Williams et al. 2002).

As amplificações de RCP foram realizadas num volume total de 20 pL contendo 25 ng de ADN da linha celular HR, 0,5 μΜ de cada iniciador, dNTPs a 200 μΜ, MgC12 a 3 mM, 0,5 de Taq polimerase (BIOLine). As condições reacionais foram um decréscimo começando com 94°C durante 3 min seguindo-se 40 ciclos de 93°C durante 30 s, 65-45°C repouso durante 30 s, diminuindo 0,5°C por ciclo, e 72°C durante 1 min, com um passo de extensão final de 72°C durante 5 min. As reações de RCP sofreram eletroforese: 10 pL do produto de RCP foram carregados em minigéis corados com brometo de etídio 36 (agarose a 2,5%) e a presença ou ausência de amplicões foi pontuada por dois observadores independentes. Onde existiram várias discrepâncias entre os padrões dos duplicados ou entre as pontuações de diferentes observadores, as reações de RCP e os géis foram repetidos. Os marcadores foram descartados quando os resultados para vários hibridos permaneceram ambíguos.

Os marcadores foram atribuídos ao cromossoma bovino levando a cabo análise de ligação com 2 pontos usando RHMAPPER (Soderlund et al., 1998) contra marcadores com atribuições conhecidas que foram previamente tipados no painel HRGT bovino (Williams et al., 2002) . O mapa dos HR foi então construído usando o software Carthegene (Schiex, 2002) como descrito por Williams et al. (2002). No cromossoma bovino 9, temos informação de um mapa de híbridos de radiação com 150 marcadores. O ordenamento dos marcadores e as distâncias no mapa foram estimados usando software CRIMAP 2.4 (Green et al. 1990). Para construir o nosso mapa de ligação, começámos por colocar os marcadores de microssatélite seguindo o ordenamento do mapa do CPCA. De seguida, foi executada uma opção BUILD do CRIMAP para colocar os restantes marcadores, os novos marcadores de microssatélite e de PNU foram inseridos na posição com a probabilidade mais alta. A informação do CPCA (www.marc.usda.gov/genome/genome.html), do EnsembL (http://www.ensembl.org/Bos_taurus/index.html) e dos híbridos de radiação (HR) foram tidos em conta para reconsiderar aquela colocação dos marcadores. 0 mapa de ligação final usado no mapeamento dos LTQ do BTA9 de acordo com a presente invenção inclui 59 marcadores como listados na tabela 18. 37 A tabela seguinte mostra os marcadores usados para o LTQ relevante. Qualquer informação adicional nos marcadores pode ser encontrada em "www.marc.usda.gov/", em http://www.ensembl.org/Bos_taurus/index.html e em "http://www.ncbi.nih.gov/".

Tabela 18

Marcador no BTA9 Posição empregue na análise (cM) Posição relativa (cM) http://www.marc.usda.gov/ BMS2151 0 4,892 ETH225 7,4 12,754 BM2504 25,3 30,92 DIK2892 25,35 30,92 DIK 3002 32,7 36,542 DIK 3003 32,75 36,542 RM216 32,8 37,087 BMS817 36, 6 42,489 BMS555 37,4 43,818 lama4 * 37,6 - DIK 5142 37,75 43,818 slcl6al0* 37,78 - DIK 4268 37,81 45,152 DIK 4950 37,84 45,152 CSSM025 37,87 45,739 DIK 2810 37,9 45,739 DIK 5364 38,2 45,739 DIK 2741 39, 75 49,659 TGLA261 39, 8 49,659 ILSTS013* 39, 85 - UWCA9 39, 9 49,996 BMS1148 39, 95 50,923 DIK 4912 42,45 51,855 DIK 5130 42,5 52,296 DIK 2303 42,55 52,352 DIK 4720 43,3 53,966 BM4204 45, 1 55,414 DIK 4926 47,6 57,088 BMS1909 49, 8 59,516 BMS1290 53, 8 64,935 38 TGLA73 63,3 77,554 BMS2753 65,4 79,249 TNF* 65,45 - BMS1724 67,15 80,265 DIK 2145 67,2 80,265 BM7209 67,6 81,569 SLU2 68,8 - C6orf93* 69,35 - DIK 4986 69,4 84,258 mml2e6* 69,45 84,258 PEX3* 69,5 - DEADC1 69,55 - BMS2251 71,3 86, 58 EPM2A* 72,1 BM7234 72,3 88,136 BM4208 73, 9 90,69 BMS2819 73, 95 90,98 INRA144 74,2 90,98 INRA084 74,5 90,98 rgsl7* 79, 8 - ESR1 * 79, 85 - BMS2295 82,2 98,646 BM3215 83,2 101,647 bvil203* 86,5 - Aridlb* 86, 6 - Plg* 89,4 - igfsnpl23* 89,45 - BMS1943 92,5 103,708 BMS1967 97,7 109,287 * estes marcadores não estão listados no mapa de marcadores do CPCA no BTA9 .

Dados fenotípicos

As filhas de touros foram pontuadas quanto à resistência à mastite e à PCS. Os valores de melhoramento estimados (VME) para traços de filhos foram calculados usando um modelo animal de Melhor Previsão Imparcial Linear (MPIL) de traço único ignorando a estrutura da família. Estes VMEs foram 39 usados na análise do LTQ. Os registos das filhas usados nos traços individuais foram:

Mastite clinica na clinica no período Mastite clínica na de mastite clínica parto. PCS na Dinamarca: após o Io parto. PCS na Suécia: PCS Io parto. PCS na Finlândia: após o Io parto.

Dinamarca: Casos tratados de mastite de -5 a 10 dias após o Io parto.

Suécia e na Finlândia: Casos tratados no período de -7 a 150 dias após o Io PCS média no período de 10-180 dias média no período de 10-150 dias após o PCS média no período de 10-305 dias

Análise estatística

Um número de métodos estatísticos como descrito abaixo foi usado na determinação de marcadores genéticos associados ou ligados à mastite e assim à resistência à mastite.

Análise do LTQ A análise de ligação (AL) é usada para identificar o LTQ pela tipagem de marcadores genéticos em famílias em regiões do cromossoma que estejam associadas a doença ou de valores de traço no seio de linhagens mais frequentemente do que sejam expetáveis por acaso. Tais regiões ligadas são mais prováveis de conter uma variante genética causal. Os dados foram analisados com uma série de modelos. Inicialmente, um modelo de traço único usando uma abordagem de regressão de multipontos para todos os traços foi analisado no seio da família. Os cromossomas com efeitos significativos no seio das famílias foram analisados com o método do componente de 40 variância para validar o LTQ encontrado ao longo das familias e para caracterização do LTQ.

Análise de regressão

As frequências do alelo nos marcadores na população foram estimadas usando um algoritmo EM. As frequências do alelo foram subsequentemente assumidas como conhecidas sem erro. A fase nos progenitores masculinos foi determinada com base nos tipos de marcadores da descendência. Subsequentemente, esta fase foi assumida como conhecida sem erro. As probabilidades de segregação em cada posição do mapa foram calculadas usando informação de todos os marcadores no cromossoma simultaneamente usando a função de mapeamento de Haldane (Haldane, 1919). Os fenótipos foram regredidos nas probabilidades de segregação. Os limites de significância foram calculados usando testes de permutação (Churchill e Doerge, 1994). Método do componente de variância A análise de ligação ao longo da familia foi levada a cabo usando um método baseado no componente de variância (CV) (S0rensen et al., 2003). Na AL com CV, as probabilidades de Identidade por descendência (IPD) entre os alelos do LTQ de quaisquer dois haplotipos fundadores (Hs e Hm) são assumidas como sendo zero, i.e. os haplotipos fundadores não estavam relacionados (Meuwissen et al. 2002). Os haplotipos dos progenitores masculinos e os haplotipos paternalmente herdados dos filhos são usados para computar a probabilidade de herança do alelo do LTQ paterno ou materno do progenitor masculino (Freyer et al. 2004) e computaram a matriz da IPD usando um algoritmo recursivo (Wang et al., 1995) . As matrizes da IPD foram computadas no 41 ponto médio de cada suporte de marcadores ao longo do cromossoma e usadas no subsequente procedimento de estimativa do componente de variância. A fração da variância genética aditiva total explicada pelo LTQ foi estimada como 2o2h/ (2σ\ + 2o2u) onde 2o\ e 2o2u correspondem respetivamente ao componente de variância associado ao efeito dos haplotipos e ao efeito poligénico aditivo.

Análise do componente de variância. Análise do LTQ de traço único.

Cada traço foi analisado separadamente usando análise de ligação. 0 modelo completo pode ser expresso por y - Χβ + Zu + Wq + e, (1) onde y é um vetor de n VMEs, X é uma matriz de desenho conhecido, β é um vetor de efeitos fixos desconhecidos, o qual neste caso é somente a média, Z é uma matriz relativa aos indivíduos, u é um vetor dos efeitos poligénicos aditivos, W é uma matriz conhecida relacionando cada registo individual ao seu efeito do LTQ aditivo desconhecido, q é um vetor de efeitos do LTQ aditivos desconhecidos dos indivíduos e e é um vetor dos resíduos. As variáveis aleatórias u, q e e são assumidas como sendo multivariáveis normalmente distribuídas e mutuamente independentes (Lund et ai., 2003).

Análise multi-LTQ multitraços

Foi realizada análise multitraços. O Modelo (1) pode ser estendido a um modelo multi-LTQ multitraços como descrito no Modelo (2) segundo Lund et ai., 2003. 42

Os traços são modelados usando o seguinte modelo misto linear com nq LTQ:

y * μ + Za + jr Wfy + et onde y é um vetor de observações para n filhos registadas em t traços, μ é um vetor de meios de traços globais, Z e W são matrizes conhecidas associando as observações de cada filho aos seus efeitos poligénicos e de LTQ, a é um vetor dos efeitos poligénicos dos progenitores masculinos e dos seus filhos, h± é um vetor dos efeitos dos haplotipos do LTQ dos progenitores masculinos e dos filhos para o i° LTQ e e é um vetor dos residuos. As variáveis aleatórias a, hi e e são assumidas como sendo multivariáveis normalmente distribuídas (MND) e mutuamente não correlacionados.

Especificamente, a é MND (0, G®*A) , h± é MND (0, Ki®*IPDi) e

e é MND (0, E^-I) . As matrizes G, K e E incluem variâncias e covariâncias de entre os traços devido aos efeitos poligénicos, aos efeitos do LTQ e aos efeitos residuais. O símbolo representa o produto de Kronecker. A é a matriz de relação aditiva que descreve a estrutura de covariância de entre os efeitos poligénicos, IPDi é a matriz de identidade por descendência (IPD) que descreve a estrutura de covariância de entre os efeitos para o i° LTQ, e I é a matriz identidade.

Análise combinada de ligação e de desequilíbrio de ligação

Na análise combinada de ligação e de desequilíbrio de ligação, as probabilidades da IPD entre os alelos do LTQ de quaisquer dois haplotipos fundadores foram computadas usando o método descrito por Meuwissen e Goddard (2001). 43

Este método aproxima a probabilidade que os dois haplotipos sejam IPD a um LTQ putativo condicionada ao estado identidade-por-estado (IPE) dos marcadores flanqueantes, na base da teoria de coalescência (Hudson, 1985). Brevemente, a probabilidade da IPD no LTQ é baseada na similaridade dos haplotipos do marcador rodeando os alelos que rodeiam a posição: i.e. muitos alelos de marcadores (não) idênticos próximos da posição implicam alta (baixa) probabilidade na posição do mapa. 0 nivel real das probabilidades do LTQ é afetado pelo tamanho efetivo da população, Ne. A probabilidade de coalescência entre a geração corrente e uma geração de base arbitrária, às Tg gerações, é calculada dados os alelos de marcador que ambos os haplotipos têm em comum (Hudson, 1985). Não é fácil estimar Tg e Ne a partir dos dados observados. Estudos de simulação mostram que a estimativa da posição do LTQ é relativamente insensível à escolha de Ne e de Tg (Meuwissen e Goddard, 2000). Portanto, usámos os valores de Tg = 100 e Ne = 100. Janelas de 10 marcadores foram consideradas como computando as probabilidades da IPD. Usámos também uma janela de 4 marcadores para computar as probabilidades da IPD na área do pico de DLAL para examinar se 4 marcadores eram suficientes para reproduzir o pico já identificado pelos haplotipos de 10 marcadores. Os haplotipos fundadores foram agrupados em aglomerados funcionalmente distintos. Usámos (1-IPDij) como uma medida da distância e aplicámos a ligação média do algoritmo de aglomeração hierárquica para gerar um dendograma com raízes representando a relação genética entre todos os haplotipos fundadores. A árvore é rastreada de cima para baixo a partir da raiz e os ramos são cortados até os nódulos serem atingidos tal que todos os haplotipos coalescentes tenham uma medida da distância (1-IPDij) < Tc. Um aglomerado é definido como um grupo de haplotipos que coalescem num nódulo comum. Os haplotipos no seio de um aglomerado são assumidos como carregando um 44 alelo de LTQ idêntico (probabilidade da IPD = 1,0) enquanto os haplotipos dos diferentes aglomerados carregam alelos de LTQ distintos e são portanto considerados como sendo independentes (probabilidade da IPD = 0). Portanto, a parte superior da matriz da IPD correspondendo à informação do desequilíbrio de ligação é uma matriz identidade correspondendo aos haplotipos fundadores distintos. A parte inferior da matriz da IPD correspondendo à informação da ligação nos haplotipos paternos dos filhos é construída usando um algoritmo recursivo (Wang et al., 1995) . As matrizes da IPD foram computadas nos pontos médios de cada intervalo do marcador e usadas no subsequente procedimento de estimativa do componente de variância.

Estimativa dos parâmetros

Os componentes de variância foram estimados usando o algoritmo de probabilidade máxima restrita de informação média (Jensen et al., 1997). A probabilidade restrita foi maximizada no que diz respeito aos componentes de variância associados aos efeitos aleatórios no modelo. A maximização de uma sequência de probabilidades restritas ao longo de uma grelha de posições específicas origina um perfil da probabilidade restrita da posição do LTQ (S0rensen et al., 2003). Os parâmetros foram estimados no ponto médio de cada suporte de marcadores ao longo do cromossoma. Nível de significância

Os limites de significância para as análises do componente de variância foram calculados usando um método rápido para computar níveis de limite aproximados que controlam o erro do genoma de tipo I (Piepho, 2001) . Os testes de hipótese para a presença do LTQ foram baseados na distribuição assintótica da estatística do teste de razão de 45 probabilidades (TRP) , TRP 21n (LreduZida Dcompieta) , onde

Lreduzida e Lcompieta foram as probabilidades maximizadas sob o modelo reduzido e o modelo completo, respetivamente. 0 modelo reduzido excluiu sempre o efeito do LTQ para o cromossoma a ser analisado. Este método é uma alternativa aos procedimentos de permutação e é aplicável em situações complexas. Requer o TRP de cada uma das posições putativas do LTQ ao longo do cromossoma, o número de cromossomas, os graus de liberdade (gl) para o LTQ (gl = número de parâmetros de Hcompieto - número de parâmetros de Hreduzid0) , e a taxa de erros do cromossoma do tipo I. Um nivel de significância de 5% em termos de cromossoma foi considerado como sendo significativo.

Resultados BTA9

Na tabela 19, são apresentados os resultados da análise de regressão para ο BTA9. As figuras 1 a 8 apresentam os gráficos do LTQ para a análise de regressão. 0 método do componente de variância foi usado para detetar o LTQ na análise do LTQ ao longo das famílias. As figuras 9 a 26 apresentam os perfis de DL, de DLAL e de DL para o LTQ num método baseado no componente de variância. As figuras 17 a 20 apresentam os efeitos dos haplotipos.

Vermelho Dinamarquês A análise de regressão no seio da família revelou que os LTQ para MC e PCS estão a segregar em duas famílias na raça VD. O LTQ para dois traços não foi localizado no mesmo intervalo. Na análise de ligação ao longo da família usando o método CV, os efeitos do LTQ não foram significativos. Com as análises de DLAL e DL, foram observados elevados picos de LTQ a 74,08 cM entre os marcadores BMS2819 e INRA144. O pico do TRP na análise de DL (13,6) foi mais 46 elevado do que o pico do TRP (8,51) observado na análise combinada de DLAL. Este TLQ explicou 44% e 22% da variância genética aditiva e da variância fenotipica para a MC respetivamente. Implicitamente, 10 haplotipos de marcadores (cinco marcadores em cada lado da posição putativa) foram usados para estimar a probabilidade da IPD de uma localização. Usámos também 4 haplotipos de marcadores i.e. 2 marcadores em cada lado da posição putativa, e observámos um pico de DLAL/DL similar no seio destes quatro haplotipos de marcadores (BM4208-BMS2819-INRA144-INRA084). Um pico combinado de DLAL para a PCS foi também observado no seio destes 4 suportes de marcador nesta raça.

Os haplotipos do progenitor feminino com probabilidade de IPD de 0,90 ou acima foram aglomerados em conjunto. Existiram 305 haplotipos fundadores em VD antes da aglomeração que se reduziram para 54 aglomerados após aglomeração. Cinco aglomerados tiveram uma frequência mais alto do que 5% e o maior aglomerado teve uma frequência de 10% e cinco haplotipos do progenitor masculino foram também aglomerados com o aglomerado maior. Foram estimados os efeitos dos haplotipos para estes 54 haplotipos e também os haplotipos recebidos dos progenitores masculinos. Os haplotipos associados à alta ou baixa resistência à mastite foram identificados.

Ayrshire Finlandês

Descobriu-se que os LTQ afetando MC e PCS estavam a segregar quando foi realizada uma análise de regressão no seio da família em famílias de Ayrshire Finlandês. O LTQ para MC estava localizado no intervalo de 58 a 79 cM. O LTQ afetando a PCS estava localizado entre 32 a 44 cM com a estatística do pico do TRP a 37 cM. O pico de DLAL combinado para o LTQ da MC ao longo do perfil de AL foi 47 observado no seio dos marcadores BM4208-BMS2819-INRA144. 0 pico de DL foi também observado na mesma região para a MC. Um pico de DLAL para CSs ao longo do perfil de AL foi observado a 38 cM entre os marcadores DIK2810 e DIK5364. Quatro por cento da variância total na MC foram explicados pelo LTQ a 74 cM e este LTQ não mostrou nenhum efeito na PCS em AF. 0 LTQ a 38 cM explicou 18% da variância total na PCS e teve um efeito muito pequeno na MC. No pico de DLAL mais elevado na MC i.e. no intervalo médio entre os marcadores BM4208 e BMS2819, 442 haplotipos fundadores agruparam-se em 38 aglomerados quando foi aplicada a probabilidade de aglomeração de 0,90. Existiram nove aglomerados com frequência mais alta do que 5%. O maior aglomerado teve uma frequência de 14%. Os haplotipos associados à alta ou baixa resistência à mastite foram identificados.

Vermelho e Branco Sueco

Similarmente ao gado VD e AF foi também observado que os LTQ afetando MC e PCS estavam a segregar no BTA9 em gado Vermelho e Branco Sueco quando foi realizada uma análise de regressão no seio da família. Ambos os LTQ para MC e PCS estavam localizados no mesmo intervalo. O LTQ da MC foi significativo (p < 0,01) na análise de AL ao longo das famílias. O LTQ do PCS não foi significativo na análise de AL ao longo das famílias. O TRP do pico para a PCS foi de 73 cM. A estatística do teste de pico para o LTQ da MC na análise ao longo da família foi de 67,4 cM com o intervalo de LTQ entre 59 e 81 cM. Embora a estatística de TRP tenha sido altamente significativa na análise de AL ao longo da família, não foi observado nenhum pico de DLAL ao longo do perfil de AL no gado VBS. Na localização da estatística do TRP do pico na análise de AL, a variância do LTQ foi de 25% da variância total do traço da MC. Os picos de DLA para o 48 LTQ da MC das raças VD e AF estão dentro do perfil de AL observado em VBS. Embora não tenha sido observado nenhum pico de DLAL nos dados de VBS para a MC, existiu muita aglomeração em VBS nos intervalos de marcadores onde os picos em VD e AF estavam localizados. Por exemplo, no intervalo médio entre BM4208-BMS2819, onde o pico de DLAL mais elevado está localizado em AF e no intervalo da vizinhança do pico de VD (BMS2819-INRA144) , existiram 37 e 48 aglomerados respetivamente, do total de 400 haplotipos fundadores totais em VBS.

Holstein Dinamarquês A análise de regressão no seio da família revelou que os LTQ afetando MC e PCS estavam também a segregar no gado Holstein Dinamarquês. O LTQ da MC foi significativo (p < 0,01) na análise de AL ao longo das famílias com o método de CV. Embora tenham sido observados pequenos picos de DLAL ao longo do perfil de AL, não foi visto nenhum pico significativo de DL para o LTQ em HD. A mais alta

estatística de TRP para o LTQ da MC em AL foi de 42,9 cM com a estatística de TRP de 10,6 e o intervalo de LTQ foi bastante grande espalhando-se de 29 a 51 cM. Um pequeno pico de DL para o LTQ da MC coincide com os picos de DL observados na população de VD e AF a 74 cM. O LTQ da CCS teve uma estatística de teste de pico a 48,7 cM com um intervalo de 44 a 58 cM. A parte da variância total explicada pelo LTQ tomando os picos mais elevados na

respetiva AL foi de 27 e de 17% para MC e PCS respetivamente. O pico de DL mais elevado para MC foi de 73,35 cM, a região onde o pico elevado de DL foi observado. Não foi observado nenhum pico para PCS em HD. 49

Análise ao longo das raças

Análises de AL, de DLAL e de DL no seio das raças revelaram que os LTQ afetando a MC estavam a segregar à volta de 74 cM em mais do que uma população. Portanto, foram levadas a cabo análises de LTQ ao longo das raças combinando dados ao longo de diferentes raças no estudo. Os resultados das análises do LTQ ao longo das raças são apresentados nas Tabelas 21, 21 e 22. 0 pico de DLAL para o LTQ da MC em gado VD e AF estava localizado nos intervalos de marcadores da vizinhança onde as análises nc ' seio das raças foram feitas. No entanto, foi observando um pico elevado de DLAL da MC no suporte dos marcadores (BMS2 819-INRA144) onde foram analisados os dados combinados de VD e AF e coincide também com o pico de DL. A análise combinada dos dados de AF e de VBS não resultou em qualquer pico mais elevado de DLAL ao longo do perfil de AL, no entanto, o pico de DL foi observado no mesmo intervalo de marcadores a 74 cM. As análises dos dados combinados de VD, de AF e de VBS também resultaram no pico mais elevado de DLAL ao longo de AL na mesma região i.e. BM4208-BMS2819-INRA144. 0 pico de DL estava também na mesma localização que autenticou o pico mais elevado de DLAL ao longo de AL. A análise conjunta de VD e de AF mostrou um o pico elevado de DLAL a 38 cM entre os marcadores DIK2810 e DIK5364 para o LTQ da PCS. Um pico de DLAL na mesma localização foi também observado para o LTQ da PCS na análise combinada de AF e de VBS. No entanto, este pico de DLAL desapareceu quando VD, AF e VBS foram analisados em conjunto.

Análise multitraços

A PCS é um traço indicador da resistência à mastite. Era expetável que muitos dos genes responsáveis pela MC 50 tivessem igualmente efeito na PCS. Portanto, foi levada a cabo uma análise multitraços da MC e da PCS para testar se a segregação do LTQ no BTA9 tem efeito pleiotrópico em ambos os traços ou se eles se ligavam ao LTQ. Embora a análise de DLAL de traço único dos dados de VD tivesse mostrado o pico de DLAL da MC e da PCS no mesmo intervalo de marcadores i.e. entre BMS2819 e INRA144, a análise combinada dos 2 traços resultou num pico de DLAL a 69,1 cM entre os marcadores SLU2 e C6orf93. Na análise no seio da raça AF, VS não mostrou um pico de DLAL para o modelo com LTQ afetando ambas a MC e a PCS. No entanto, quando as três raças VD, AF e VBS foram combinadas e analisadas com um modelo de 2 traços, o pico de DLAL com estatística de TRP de 19,7 foi observado no intervalo dos marcadores INRA144 e INRA084.

Análise de haplotipos

Os resultados do mapeamento refinado do LTQ mencionados acima apontam na direção de um LTQ segregando para a MC no seio da região de 4 marcadores, BM4208-BMS2819-INRA144-INRA084. Portanto, a aglomeração dos haplotipos fundadores e dos efeitos dos haplotipos foram estudados no ponto médio entre os marcadores BMS2819 e INRA144. Isto foi feito no seio das raças e também ao longo das três raças VD, AF e VBS pois estas três raças estão relacionadas na sua origem. Os haplotipos associados à alta ou baixa resistência à mastite foram identificados. 51

Tabela 19

Análise de ligação no seio da familia usando análise de intervalos de regressão. No. de Raça e do Progenitor Masculino Resistência à mastite (MC) Contagem de Células Somáticas Posição (Morgan) Valores F Valores P Posição (Morgan) Valores F Valores P Holstein Dinamarquês 1079 0, 829 10,73 0,99 0,596 13, 19 1,00 1080 0,432 3,79 0,73 0,072 0,91 0,12 1082 0, 643 6,76 0,92 0, 654 1,18 0,21 1087 0, 474 4,22 0,76 0,919 7,58 0,95 1808 0,347 16, 61 1,00 0,596 1,97 0,33 Ao longo da familia 0,432 4,90 1,00 0,523 3,43 0,97 Vermelho Dinamarquês 1800 0,501 13,00 0,99 0,501 5, 65 0,86 1801 0,728 1,06 1,06 0,728 0,36 0,28 1802 0,699 0,07 0,07 0,961 0,23 0,21 1803 1,009 1,75 0,37 0,156 11,35 0,99 1804 0,718 0,32 0,18 0,712 3, 96 0,88 1806 0,739 0,07 0,05 0, 654 1,30 0,60 1807 0,363 0,28 0,24 0,442 0,45 0,34 4009 0,696 2,46 0,86 0,358 0,73 0,59 Ao longo da familia 0,502 1,95 0,81 0,497 1,77 0,71 Ayrshire Finlandês 34872 0, 913 0,83 0,51 0,416 1,17 0,62 35142 0,363 0,44 0,26 0,358 0,55 0,32 36386 0, 617 3, 14 0,71 1,003 1,95 0,50 36455 0, 92 0,96 0,49 0,903 1,76 0,69 364 60 0,792 8,81 0,97 0, 945 8,49 0,97 36687 0, 718 8,27 0, 95 0,564 3, 11 0,63 36733 0,728 1,67 0,74 0,728 0,66 0,49 37465 0,538 3,24 0,71 0,368 15, 85 1,00 37505 0,358 1,31 0,58 0,358 1,66 0,66 38393 0,358 0,64 0,55 0,384 1,99 0,80 52 38651 0, 808 1,33 0,56 0,998 2, 17 0,72 Ao longo da familia 0,687 2,03 0,90 0,978 1,94 0,89 Vermelho Sueco 364 60 0,792 5,22 0, 85 0, 945 9, 92 0,97 74746 0,426 5, 89 0,91 0,638 2,38 0,58 75241 0,702 0,10 0,06 0,744 9,47 0,99 76351 0, 913 4,13 0,78 0,336 5,74 0,88 76360 0, 654 1,07 0,48 0,686 1,57 0,61 83798 0, 834 0,09 0,09 0,670 1,17 0,59 85409 0, 686 2,00 0,73 0,739 1,10 0,55 85439 0,363 3, 62 0,74 0,919 1,38 0,33 85679 0, 903 10,82 0,97 0,336 0,32 0,01 85716 0,739 11,77 0,98 0, 649 2,21 0,49 86063 0,723 4,18 0,79 0,718 1,67 0,42 86097 0,432 1,68 0,53 0,760 1,51 0,50 86626 0,416 5, 19 0,84 1,009 5,72 0,87 Ao longo da familia 0,674 3,18 1,00 0,724 2,22 0,94

Tabela 20

Sumário da análise de ligação (AL) ao longo da família usando método do componente de variância

Raça Traço Posição (Morgan) Estatística do TRP do pico Intervalo do Marcador Vermelho Dinamarquês (VD) MC 0,464 4,43 BM4208 - DIK4926 PCS 0,253 4,58 BMS2504 - DIK2892 Ayrshire Finlandês (AF) MC 0,682 4,19 BM7209 - SLU2 PCS 0,370 5, 12 BMS817 - BMS555 Vermelho Sueco (VS) MC 0, 674 9, 89 DIK2145 - BM7209 PCS 0,731 6,05 BM7234 - BM4208 Holstein Dinamarquês (HD) MC 0,429 10,63 DIK2303 - DIK4720 PCS 0,487 6,72 DIK4926 - BMS1909 VD + AF MC 0,682 3,20 BM7209 - SLU2 PCS 0,370 6,57 BMS817 - BMS555 53 AF + VS MC 0,682 15, 30 BM7209 - SLU2 PCS 0,951 9, 91 BMS1943 - BMS1967 VD + AF + VS MC 0,682 13, 53 BM7209 - SLU2 PCS 0,951 8,51 BMS1943 - BMS1967

Tabela 21

Sumário do desequilíbrio de ligação e da análise de ligação (DLAL) usando método do componente de variância

Raça Traço Posição (Morgan) Estatística do TRP do pico Intervalo do Marcador Vermelho Dinamarquês (VD) MC 0,741 8,51 BM2819 - INRA144 PCS 0,398 16, 95 DIK2741 - TGLA261 Ayrshire Finlandês (AF) MC 0,739 5, 38 BM4208 - BMS2819 PCS 0,381 7,26 DIK2810 - DIK5364 Vermelho Sueco (VS) MC 0,672 5,56 BMS1724 - DIK2145 PCS 0,741 5,71 BMS2819 - INRA144 Holstein Dinamarquês (HD) MC 0,429 12,69 DIK2303 - DIK4720 PCS 0,464 7,85 BM4204 - DIK4926 VD + AF MC 0,741 9, 93 BMS2819 - INRA144 PCS 0,381 9, 61 DIK2810 - DIK5364 AF + VS MC 0,739 10,98 BM4208 - BMS2819 PCS 0,691 6,26 SLU2 - C6orf93 VD + AF + VS MC 0,739 14,90 BM4208 - BMS2819 PCS 0,741 6, 69 BMS2819 - INRA144 Tabela 22 Sumário da análise do desequilíbrio de ligação (DL) ao longo da família usando método do componente de variância Raça Traço Posição (Morgan) Estatística do TRP do pico Intervalo do Marcador Vermelho Dinamarquês (VD) MC 0,741 13, 60 BM2819 - INRA144 PCS 0,398 12,95 DIK2741 - TGLA261 Ayrshire MC 0,739 3, 64 BM4208 - BMS2819 54

Finlandês (AF) PCS < 1,0 Vermelho MC 0,327 4,26 DIK3002 - DIK3003 Sueco (VS) PCS 0,464 2,18 BM4204 - DIK4926 Holstein MC 0,744 5,45 INRA144 - INRA084 Dinamarquês (HD) PCS 0,731 1,49 BM7234 - BM4208 VD + AF MC 0,741 5,49 BMS2819 - INRA144 PCS 0,398 1,99 TGLA261 - ILSTS013 AF + VS MC 0,739 5,39 BM4208 - BMS2819 PCS 0,370 1,73 BMS817 - BMS555 VD + AF + VS MC 0,739 8,94 BM4208 - BMS2819 PCS 0,253 4,08 BMS2504 - DIK2892

Lisboa, 27 de Maio de 2013

Claims (3)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um método para determinação da resistência à mastite em quaisquer sujeitos bovinos das Raças Vermelho Dinamarquês, Ayrshire, Vermelho e Branco Sueco, e Holstein, compreendendo a deteção numa amostra do referido sujeito bovino da presença ou ausência de pelo menos um marcador genético que esteja ligado a pelo menos um traço indicativo da resistência à mastite, em que o referido pelo menos um marcador genético está localizado no cromossoma bovino BTA9 na região flanqueada pelos e incluindo os marcadores de microssatélite polimórficos C6orf93 e inra084, em que a presença ou ausência do referido pelo menos um marcador genético é indicativa da resistência à mastite do referido sujeito bovino ou da sua descendência. 2. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que o pelo menos um marcador genético está localizado na região flanqueada pelos e incluindo os marcadores genéticos bms2251 e inra084 do BTA9. 3. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que o pelo menos um marcador genético está localizado na região flanqueada pelos e incluindo os marcadores genéticos bm7234 e inral44 do BTA9. 4. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que o pelo menos um marcador genético está localizado na região flanqueada pelos e incluindo os marcadores genéticos bms2819 e inral44 do BTA9. 5. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que o pelo menos um marcador genético está localizado na região 2 flanqueada pelos e incluindo os marcadores genéticos bm4208 e inral444. 6. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que o pelo um marcador genético é o marcador de microssatélite C6orf93. 7. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que o pelo um marcador genético é o marcador de microssatélite DIK4986. 8. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que o pelo um marcador genético é o marcador de microssatélite mml2e6. 9. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que o pelo um marcador genético é o marcador de microssatélite PEX3. 10. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que o pelo um marcador genético é o marcador de microssatélite DEAD21. 11. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que o pelo um marcador genético é o marcador de microssatélite BMS 2251. 12. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que o pelo um marcador genético é o marcador de microssatélite EPM2A. 13. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que o pelo um marcador genético é o marcador de microssatélite BM7234. 3 14. 0 método de acordo com a um marcador genético é BM4208. 15. 0 método de acordo com a um marcador genético é BMS2819. 16. 0 método de acordo com a um marcador genético é INRA144. 17. 0 método de acordo com a um marcador genético é INRA084. 18. 0 método de acordo com a um marcador genético é genéticos. 19. 0 método de acordo com a de iniciadores para a microssatélite C6orf93 é 76. reivindicação 1, em que o pelo o marcador de microssatélite reivindicação 1, em que o pelo o marcador de microssatélite reivindicação 1, em que o pelo o marcador de microssatélite reivindicação 1, em que o pelo o marcador de microssatélite reivindicação 1, em que o pelo uma combinação de marcadores reivindicação 6, em que o par amplificação do marcador de SEQ ID NO.: 75 e SEQ ID No.: 20. 0 método de acordo com a reivindicação 9, em que o par de iniciadores para a amplificação do marcador de microssatélite PEX3 é SEQ ID NO.: 81 e SEQ ID No.: 82. 21. 0 método de acordo com a reivindicação 6, em que o par de iniciadores para a amplificação do marcador de microssatélite EPM2A é SEQ ID NO.: 87 e SEQ ID No.: 88. 4 22. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que o pelo um marcador genético é uma combinação de marcadores genéticos.

23. Um método para seleção de sujeitos bovinos para propósitos de melhoramento, compreendo o referido método o método na reivindicação 1 determinando resistência à mastite.

24. Uso de um conjunto de diagnóstico compreendendo pelo menos uma sequência de oligonucleótidos, em que as sequências de nucleótidos são selecionadas de qualquer uma da SEQ ID NO.: 75 à SEQ ID NO.: 98 para deteção da presença ou ausência num sujeito bovino de pelo menos um marcador genético associado à resistência à mastite de acordo com o método da reivindicação 1. Lisboa, 27 de Maio de 2013