PT2061313E

PT2061313E - Produtos e métodos que usam péptidos de soja para reduzir os níveis de colesterol total e de colesterol ldl

Info

Publication number: PT2061313E
Application number: PT78425675T
Authority: PT
Inventors: Alfredo Flores Galvez
Original assignee: Soy Labs Llc
Priority date: 2006-09-16
Filing date: 2007-09-15
Publication date: 2013-09-23
Also published as: CA2960817A1; CN101522022A; EP2641608B1; AU2007296186A1; US20140057846A1; EP2061313A2; ES2427856T3; IL197612A0; US10702579B2; CN101522022B; US9133255B2; EP2641608A3; US20180064783A1; US20150374783A1; CA2664066A1; JP2010503704A; CA2664066C; US20100197594A1; EP2061313B1; AU2007296186B2

Description

ΕΡ 2 061 313/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Produtos e métodos que usam péptidos de soja para reduzir os níveis de colesterol total e de colesterol LDL"

CAMPO DO INVENTO

Este invento refere-se geralmente a composições para uso no tratamento de doenças relacionadas com colesterol em indivíduos. Mais especificamente, este invento refere-se a uma classe de péptidos que proporciona aos indivíduos vários benefícios relacionados com a saúde e composições que os compreendem. Mais especificamente, o presente invento refere-se a novas composições compreendendo péptidos de soja, métodos de usar essas composições para reduzir os níveis de colesterol total e de colesterol LDL em indivíduos e métodos de preparar composições que as compreendem.

ANTECEDENTES DO INVENTO A doença coronária (CHD) é um importante problema de saúde nos EUA com taxas de mortalidade superiores a um milhão de casos anuais. Os factores de risco incluem fumar cigarros e hipertensão, mas o colesterol plasmático elevado tem sido implicado como o factor de risco primário de CHD. Os níveis elevados de colesterol total e de colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL) contribuem para a formação de placas ateroscleróticas e eventualmente levam a trombose ou enfarte do miocárdio. Assim, a gestão dos níveis de colesterol é um factor essencial para estratégias de prevenção e tratamento para reduzir a incidência, mortalidade e morbilidade da doença coronária.

Existem evidências epidemiológicas substanciais de que factores dietéticos como o consumo de determinadas proteínas de soja podem ajudar a gerir os níveis de colesterol e reduzem o risco de CHD em determinados indivíduos. Alguns estudos epidemiológicos mostraram que o consumo de alimentos de soja está ligado à diminuição do risco de doença cardiovascular em algumas populações asiáticas (1). Mais recentemente, um estudo de coorte em larga escala durante 3 anos de 75 000 mulheres chinesas mostrou uma relação de dose- 2 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ resposta entre a ingestão de alimentos de soja e a redução do risco de doença coronária, especialmente de enfarte do miocárdio não fatal (2) . Os resultados da meta-análise de 38 estudos clínicos incluindo 730 voluntários de investigação, mostrou que a ingestão de proteína de soja estava associada a uma redução de 9,3% do colesterol sérico, uma redução de 12,9% do colesterol LDL sérico, uma redução de 10,5% dos triglicéridos séricos e um aumento não significativo dos níveis de lipoproteína de densidade elevada (HDL) (3). Os resultados clínicos das experiências envolvendo proteína de soja incentivaram a Food and Drug Administration (FDA) a permitir uma reivindicação de saúde nas etiquetas dos alimentos mencionando que 25 gramas de proteína de soja como parte de uma dieta diária com teores reduzidos de gorduras saturadas e colesterol podem reduzir o risco de doença cardíaca.

Os componentes candidatos da soja que poderiam contribuir para o seu efeito hipocolesterolémico incluem proteínas de soja e os seus componentes não proteicos, saponinas e isoflavonas, genisteína e daidzeína. Infelizmente, o conjunto de dados experimentais indica que ainda não é claro qual destes componentes proporciona efeitos hipocolesterolémicos. Tem-se frequentemente avançado a hipótese que as isoflavonas de soja são responsáveis pela redução do colesterol em animais. De facto, numerosos estudos têm-se focado no papel das isoflavonas de soja na redução dos níveis de colesterol em animais (4-6) e humanos (7, 8). Curiosamente, estes e outros estudos mostram que as isoflavonas de soja não proporcionam quaisquer efeitos de redução do colesterol. Por exemplo, num estudo, quando se alimentaram macacos cinomólogos com extracto de soja rico em isoflavonas na ausência de proteína de soja, não se produziram quaisquer efeitos de redução de colesterol (9).

Em alguns estudos, quando se adicionou simplesmente proteína de soja à dieta do animal, observaram-se reduções significativas do colesterol (10) . As preocupações sobre um mecanismo de acção cardioprotector viável atribuível a isoflavonas (11-13) também moderaram o entusiasmo sobre o papel das isoflavonas na redução do risco de CHD. Também se propuseram as saponinas, um grupo estruturalmente diverso de 3 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ triterpenos ou glicósidos esteróides, como o possível componente da soja responsável pela sua actividade hipocolesterolémica (14) . Contudo, não existem estudos convincentes em animais ou humanos assim como um mecanismo de acção viável que indiquem que as saponinas são responsáveis pela actividade hipocolesterolémica da soja. 0 mesmo é verdade para as globulinas 7S, uma importante proteína de armazenamento de soja, que se descobriu inibir aterosclerose em ratinhos mas que não apresentou efeitos hipocolesterolémicos (15).

Em Fevereiro de 2006, a American Heart Association publicou um parecer científico sobre a proteína de soja, isoflavonas e saúde cardiovascular por análise de dados clínicos recentes publicados desde a reivindicação de saúde aprovada pela FDA (16). De entre 19 estudos de isoflavonas de soja, a American Heart Association verificou que as isoflavonas, em média, não têm efeito sobre o colesterol de lipoproteína de baixa densidade ("colesterol LDL") ou outros factores de risco lipídicos. 0 relatório conclui que "uma grande quantidade de proteína de soja, mais de metade da ingestão diária de proteína, pode reduzir o colesterol LDL em poucos pontos percentuais quando substitui proteína de lacticínios de uma mistura de proteínas animais. A evidência favorece a proteína de soja relativamente a isoflavonas de soja como o nutriente responsável. Contudo, presentemente, não se pode descartar a possibilidade de outro componente da soja poder ser o factor activo. Assim ainda não é claro qual ou quais o(s) componente(es) da proteína de soja proporcionam efeitos benéficos de redução de colesterol que reduzem o risco de CHD. Em resultado, os métodos presentes de reduzir o colesterol usando proteína de soja têm proporcionado resultados variáveis que nem são direccionados nem altamente eficazes.

Um problema adicional para a utilização de produtos de soja descrito nos ensaios clínicos anteriormente descritos e apoiados pela FDA é a grande quantidade (25 mg/dia) de produto de soja necessária para obter um resultado benéfico. Seria desejável ter uma composição mais concentrada, facilitando a obtenção de níveis suficientes da parte 4 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ pretendida de produto de soja e possibilitando a preparaçao e empacotamento de tais produtos de soja.

Enquanto US 2003/0027765A1, US 6391848A, US 6544956A e US 6107287A divulgam composições farmacêuticas compreendendo lunasina, em particular para o tratamento de cancro, há uma necessidade de composições e métodos relacionados melhorados para reduzir eficazmente o colesterol total e o colesterol LDL em indivíduos. O presente invento proporciona estes e outros benefícios relacionados.

DEFINIÇÕES

Para facilitar a compreensão do invento definem-se seguidamente várias expressões e frases. Salvo definição em contrário pretende-se que todas as expressões, notações e outra terminologia cientifica da especialidade aqui utilizadas tenham os significados habitualmente atribuídos pelos peritos na especialidade à qual se refere este invento. Em alguns casos, as expressões com significados de compreensão geral são aqui definidas por questões de clareza e/ou para referência rápida e a inclusão de tais definições aqui não deve considerar-se necessariamente como representando uma diferença substancial relativamente ao que é geralmente compreendido na especialidade. As técnicas e procedimentos gerais aqui descritos ou referenciados são geralmente bem compreendidos e habitualmente utilizados usando metodologia convencional pelos peritos na especialidade. Tal como apropriado, os procedimentos envolvendo a utilização de kits e reagentes disponíveis comercialmente são geralmente efectuados de acordo com protocolos e/ou parâmetros definidos pelo fabricante salvo indicação em contrário.

Tal como aqui utilizada, a forma singular "a/o" e "um(a)" inclui as referências no plural salvo indicação em contrário. Por exemplo, "um" inibidor de enzima protéase inclui um ou mais inibidores de enzima protéase.

Tal como aqui utilizado "ug" é uma abreviatura para micrograma e "uM" é uma abreviatura para micromole. 5 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ

Tal como aqui utilizado, "actividade biológica" e "bioactividade" referem-se às actividades in vivo de um composto ou resposta fisiológicas que resultam da administração in vivo de um composto, composição ou outra mistura. Assim, a actividade biológica abrange os efeitos terapêuticos e a actividade farmacêutica de tais compostos, composições e misturas. As actividades biológicas podem ser observadas e medidas em sistemas in vitro concebidos para ensaiar ou usar também tais actividades.

Tal como aqui utilizada, a expressão "biologicamente activa" refere-se a uma molécula com funções estruturais, regulatórias e ou bioquímicas de uma molécula de lunasina de ocorrência natural.

Tal como aqui utilizada, uma "combinação" refere-se a qualquer associação entre dois ou mais elementos.

Tal como aqui utilizada, a expressão "padecendo de uma doença" refere-se a um indivíduo (e.g., um humano) que está a sofrer de uma doença específica. Não se pretende que o presente invento seja limitado por quaisquer sinais ou sintomas específicos, nem pela doença. Assim, pretende-se que o presente invento abranja indivíduos que sofrem de uma doença em qualquer grau (e.g., desde a manifestação subclínica até à doença completamente desenvolvida) em que o indivíduo apresenta pelo menos alguns dos indícios (e.g., sinais e sintomas) associados à doença específica.

Tal como aqui utilizadas, as expressões "doença" e "condição patológica" são utilizadas indiferentemente para descrever um estado, sinais e/ou sintomas que estão associados com qualquer disfunção do estado normal de um animal vivo ou de quaisquer dos seus órgãos ou tecidos que interrompe ou modifica o desempenho das funções normais e pode ser uma resposta a factores ambientais (tal como malnutrição, perigos industriais ou clima), a agentes infecciosos específicos (tal como vermes, bactérias ou vírus), a defeitos inerentes ao organismo (tal como várias anomalias genéticas ou a combinações destes e de outros factores. 6 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ

Tal como aqui utilizada, a expressão "quantidade eficaz" refere-se à quantidade de uma composição (e.g., compreendendo lunasina) suficiente para efectuar os resultados benéficos ou pretendidos. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens e não se pretende que seja limitada por uma formulação ou via de administração especifica.

Tal como aqui utilizadas, as expressões "administração" e "administrar" referem-se ao acto de dar um fármaco, pró-fármaco ou outro agente ou tratamento terapêutico (e.g., composições do presente invento) a um indivíduo (e.g., um indivíduo ou células, tecidos e órgãos in vivo, in vitro ou ex vivo) e/ou para dirigir, instruir ou aconselhar o uso da composição para qualquer objectivo (preferentemente, para um objectivo aqui descrito) . Quando a administração de uma ou mais das presentes composições é dirigida, instruída ou aconselhada, tais indicações podem ser de modo a instruir e/ou informar o utilizador que a utilização da composição pode proporcionar e/ou proporcionará um ou mais dos benefícios aqui descritos.

Os exemplos das vias de administração ao corpo humano podem ser através dos olhos (oftálmica) , boca (oral) , pele (tópica ou transdérmica), nariz (nasal), pulmões (inalação), mucosa oral (bucal), ouvido, rectal, vaginal, por injecção (e.g., intravenosa, subcutânea, intratumoral, intraperitoneal, etc.) e semelhantes. A administração que é dirigida pode compreender, por exemplo, indicações orais (e.g., através de indicações orais de, por exemplo, um médico, profissional de saúde, profissional ou organização de vendas e/ou por meio da rádio ou da televisão (i.e., anúncios) ou indicações escritas (e.g., através de indicações escritas de, por exemplo, um médico ou outro profissional de saúde (e.g., receitas), profissional ou organização de vendas (e.g., através, por exemplo, de brochuras ou panfletos publicitários ou outros instrumentos de instrução), meios escritos (e.g., internet, correio electrónico ou outros meios relacionados com computador) e/ou material de embalagem associado à composição (e.g., uma etiqueta presente numa embalagem contendo a 7 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ composição). Tal como aqui utilizado, "escrito" inclui através de palavras, esquemas, simbolos e/ou outros descritores visíveis. Tal indicação não precisa de utilizar as mesmas palavras aqui usadas, abrangendo-se no âmbito deste invento a utilização de palavras, esquemas, símbolos e semelhantes que transmitam o mesmo significado ou um significado semelhante.

Tal como aqui utilizadas, as expressões "co-administração" e "co-administrar" referem-se à administração de pelo menos dois agentes (e.g., composição compreendendo lunasina e um ou mais outros agentes—e.g., um inibidor de enzima protéase) ou terapias a um indivíduo. Em algumas concretizações, a co-administração de dois ou mais agentes ou terapias é simultânea. Em outras concretizações administra-se um primeiro agente/terapia antes de um segundo agente/terapia. Os peritos na especialidade compreendem que as formulações e/ou vias de administração dos diferentes agentes ou terapias utilizados podem variar. A dosagem adequada para co-administração pode ser facilmente determinada pelo perito na especialidade. Em algumas concretizações, quando os agentes ou terapias são co-administrados, os respectivos agentes ou terapias são administrados a dosagens inferiores às adequadas para a sua administração sozinha. Assim, a co-administração é especialmente pretendida em concretizações nas quais a co-administração dos agentes ou terapias reduz a dosagem requerida de um ou mais agente(s) potencialmente perigoso(s) (e.g., tóxicos) e/ou quando a co-administração de dois ou mais agentes resulta na sensibilização de um indivíduo para os efeitos benéficos de um dos agentes através da co-administração do outro agente.

Tal como aqui utilizada, a expressão "tratamento" ou seus equivalentes gramaticais abrangem a melhoria e/ou desaparecimento dos sintomas de doença (e.g., doença coronária). Uma composição que causa uma melhoria em qualquer parâmetro associado a doença quando utilizada nos métodos de rastreio do presente invento pode ser desse modo identificada como uma composição terapêutica. A expressão "tratamento" refere-se tanto a tratamento terapêutico como a medidas profilácticas ou preventivas. Por exemplo, aqueles que podem 8 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ beneficiar de tratamento com composições e métodos do presente invento incluem aqueles que já apresentam uma doença (e.g., níveis elevados de colesterol) assim como aqueles nos quais se pretende evitar uma doença (e.g., usando um tratamento profiláctico do presente invento).

Tal como aqui utilizada, a expressão "em risco de doença" refere-se a um indivíduo (e.g., um humano) que tem predisposição para apresentar determinada doença. Esta predisposição pode ser genética (e.g., uma tendência genética específica para apresentar a doença, tal como doenças hereditárias) ou devido a outros factores (e.g., idade, peso, condições ambientais, exposições a compostos nocivos presentes no ambiente, etc.). Assim, não se pretende que o presente invento seja limitado a um qualquer risco específico, nem se pretende que o presente invento seja limitado a uma qualquer doença em particular.

Tal como aqui utilizadas, as expressões "indivíduo", "hospedeiro" e "doente" referem-se a qualquer animal, incluindo animais humanos e não humanos, não se lhes limitando (por exemplo, primatas, cães, gatos, vacas, cavalos, ovelhas, roedores, aves de capoeira, peixes, crustáceos, etc., não se lhes limitando) que é estudado, analisado, testado, diagnosticado ou tratado. Tal como aqui utilizadas, as expressões "indivíduo", "hospedeiro" e "doente" usam-se indiferentemente, salvo indicação em contrário.

Tal como aqui utilizada, a expressão "anticorpo" (ou "anticorpos") refere-se a qualquer imunoglobulina que se liga especificamente a um determinante antigénico e que se liga especificamente a proteínas idênticas ou estruturalmente relacionadas com o determinante antigénico que estimulou a sua produção. Assim, os anticorpos podem ser úteis em ensaios para detectar o antigénio que estimulou a sua produção. Os anticorpos monoclonais são derivados de um único clone de linfócitos B (i.e., células B) e apresentam geralmente homogeneidade em estrutura e especificidade antigénica. Os anticorpos policlonais são originários de muitos clones diferentes de células produtoras de anticorpos e apresentam assim heterogeneidade estrutural e de especificidade de 9 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ epítopo, mas todos reconhecem o mesmo antigénio. Igualmente pretende-se que a expressão "anticorpo" abranja qualquer imunoglobulina (e.g., IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, etc.) obtida de qualquer fonte (e.g., humanos, roedores, primatas não humanos, lagomoros, caprinos, bovinos, equinos, ovinos, etc.).

Tal como aqui utilizada, usa-se a expressão "antigénio" em referência a qualquer substância que é capaz de ser reconhecida por um anticorpo.

Tal como aqui utilizadas, as expressões "transferência "Western"", "imunotransferência "Western"", "imunotransferência" e "Western" referem-se à análise imunológica de uma ou mais proteína(s), polipéptidos ou péptidos que foram imobilizados num suporte de membrana. As proteínas são primeiramente resolvidas por electroforese em gel de poliacrilamida (i.e., SDS-PAGE) para separar as proteínas, seguido de transferência da proteína do gel para um suporte sólido tal como uma membrana de nitrocelulose ou de nylon. Expõem-se então as proteínas imobilizadas a um anticorpo apresentando reactividade contra um antigénio de interesse. A ligação do anticorpo (i.e., o anticorpo primário) é detectada por utilização de um anticorpo secundário que se liga especificamente ao anticorpo primário. O anticorpo secundário está tipicamente conjugado com uma enzima que permite visualização do complexo antigénio-anticorpo pela produção de um produto reaccional colorido ou que catalisa uma reacção enzimática luminescente (e.g., o reagente ECL, Amersham). A expressão "composto" refere-se a qualquer entidade química, produto farmacêutico, fármaco e semelhante que possa ser utilizado para tratar ou evitar uma doença ou alteração da função corporal. Os compostos compreendem compostos terapêuticos tanto conhecidos como potenciais. Os compostos compreendem polipéptidos tal como aqueles aqui descritos.

Tal como aqui utilizada, a expressão "tóxico" refere-se a quaisquer efeitos prejudiciais ou nocivos sobre um indivíduo, uma célula ou um tecido comparativamente com a mesma célula ou tecido antes da administração do produto tóxico. 10 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ

Tal como aqui utilizada, a expressão "composição farmacêutica" refere-se à combinação de um agente activo (e.g., lunasina) com um transportador, inerte ou activo, tornando a composição especialmente adequada para uso diagnóstico ou terapêutico in vitro, in vivo ou ex vivo.

As expressões "farmaceuticamente aceitável" ou "farmacologicamente aceitável" tal como aqui utilizadas referem-se a composições que não produzem substancialmente reacções adversas, e.g., reacções tóxicas, alérgicas ou imunológicas, quando administradas a um indivíduo.

Tal como aqui utilizada, a expressão "topicamente" refere-se à aplicação das composições do presente invento à superfície da pele e células e tecidos da mucosa (e.g., mucosa alveolar, bucal, lingual, mastigatória ou nasal e outros tecidos e células que revestem órgãos ocos ou cavidades corporais).

Tal como aqui utilizada, a expressão "transportador farmaceuticamente aceitável" refere-se a qualquer dos transportadores farmacêuticos padrão incluindo, solução salina tamponada de fosfato, água, emulsões (e.g., tal como emulsões óleo/água ou água/óleo) e vários tipos de agentes de molhagem, quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, laurilsulfato de sódio, agentes isotónicos e retardantes de absorção, desintegrantes (e.g., amido de batata ou glicolato de amido de sódio) e semelhantes, não se lhes limitando. As composições podem também incluir estabilizantes e conservantes. Para exemplos de transportadores, estabilizantes e adjuvantes. (consultar e.g., Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a Ed., Mack Publ. Co., Easton, Pa. (1975). A expressão "gene" refere-se a uma sequência de ácido nucleico (e.g., ADN) que compreende sequências de codificação necessárias para a produção de um polipéptido, precursor ou ARN (e.g., ARNr, ARNt). O polipéptido pode ser codificado por uma sequência de codificação completa ou por qualquer parte de uma sequência de codificação desde que se mantenham a actividade pretendida ou as propriedades funcionais (e.g., 11 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ actividade enzimática, ligação de ligandos, transdução de sinal, imunogenicidade, etc.) da sequência completa ou do fragmento. A expressão também abrange a região de codificação de um gene estrutural e as sequências com localização adjacente à região de codificação em ambas as extremidades 5' e 3' ao longo de uma distância de cerca de 1 kb ou mais em qualquer das extremidades de modo a que o gene corresponda ao comprimento do ARNm completo. As sequências localizadas a 5' da região de codificação e presentes no ARNm são referidas como sequências não traduzidas a 5' . As sequências localizadas a 3' ou a jusante da região de codificação e presentes no ARNm são referidas como sequências não traduzidas a 3'. A expressão "gene" abrange tanto ADNc como formas genómicas de um gene. Uma forma genómica ou clone de um gene contém a região de codificação interrompida com sequências não codificantes denominadas "intrões" ou "regiões intrónicas" ou "sequências intrónicas". Os intrões são segmentos de um gene que são transcritos para ARN nuclear (ARNhn); os intrões podem conter elementos de regulação tal como facilitadores. Os intrões são removidos ou sujeitos a "splicing" do produto de transcrição nuclear ou primário; os intrões estão portanto ausentes do produto de transcrição do ARN mensageiro (ARNm). O ARNm funciona durante a tradução para especificar a sequência ou ordem dos aminoácidos num polipéptido nascente.

Tal como aqui utilizadas, as expressões "expressão génica" e "expressão" referem-se ao processo de converter informação genética codificada num gene para ARN (e.g., ARNm, ARNr, ARNt ou ARNsn) através de "transcrição" do gene (i.e., através da acção enzimática de uma ARN polimerase) e para genes que codificam proteínas, em proteínas através de "tradução" de ARNm. A expressão génica pode ser regulada em muitas das etapas do processo. A "regulação positiva" ou "activação" refere-se a regulação que aumenta e/ou melhora a produção dos produtos de expressão génica (e.g., ARN ou proteína), enquanto "regulação negativa" ou "repressão" refere-se a regulação que diminui a produção. As moléculas (e.g., factores de transcrição) que estão envolvidas em regulação positiva ou negativa são muitas vezes denominadas "activadores" e "repressores", respectivamente. 12 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ

Tal como aqui utilizada, a expressão "sequência promotora/de regulação" significa uma sequência de ácido nucleico que é necessária para expressão de um produto génico ligado operacionalmente à sequência promotora/de regulação. Em alguns casos, esta sequência pode ser a sequência de promotor nuclear e noutros casos esta sequência pode também incluir uma sequência facilitadora e outros elementos de regulação que são necessários para expressão do produto génico. A sequência promotora/de regulação pode, por exemplo, ser tal que expresse o produto génico de uma forma específica do tecido.

Tal como aqui utilizada, a expressão "cultura de células" refere-se a qualquer cultura de células in vitro. Incluem-se nesta expressão linhas celulares contínuas (e.g., com um fenótipo imortal), cultura de células primárias, linhas celulares transformadas, linhas celulares finitas (e.g., células não transformadas) e qualquer outra população celular mantida in vitro.

Tal como aqui utilizada, a expressão "in vitro" refere-se a um ambiente artificial e a processos ou reacções que ocorrem no interior de um ambiente artificial. Os ambientes in vitro podem consistir de tubos de ensaio e cultura de células, não se lhes limitando. A expressão "in vivo" refere-se ao ambiente natural (e.g., um animal ou uma célula) e a processos ou reacções que ocorrem no interior do ambiente natural.

Tal como aqui utilizado "aminoácido" refere-se a qualquer dos aminoácidos de ocorrência natural com as designações padrão listadas na tabela 1, seguidamente apresentada. Refere-se também aos aminoácidos sintéticos conhecidos. Salvo indicação em contrário, todas as sequências de aminoácidos listadas nesta divulgação estão listadas na ordem do amino terminal para o carboxilo terminal. Tal como aqui utilizadas, as abreviaturas para quaisquer grupos protectores, aminoácidos e outros compostos, estão de acordo com a sua utilização comum, abreviaturas reconhecidas ou a nomenclatura da Comissão IUPAC-IUB sobre nomenclatura de bioquímica, salvo indicação em contrário (consultar Biochemistry 11: 1726 (1972)). Tal como aqui utilizado, os resíduos de aminoácidos 13 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ representam-se pelo seu nome completo, pelo código de três letras que lhes corresponde ou pelo código de uma letra que lhes corresponde, tal como indicado na seguinte tabela: TABELA 1

Nome completo Código de três letras Código de uma letra Ácido aspártico Asp D Ácido glutâmico Glu E Lisina Lys K Arginina Arg R Histidina His H Tirosina Tyr Y Cisteína Cys C Asparagina Asn N Glutamina Gin Q Serina Ser S Treonina Thr T Glicina Gly G Alanina Ala A Valina Vai V Leucina Leu L Isoleucina Ile I Metionina Met M Prolina Pro P Fenilalanina Phe F Triptofano Trp W

Tal como aqui utilizadas, as expressões "péptido", "polipéptido" e "proteína" referem-se todas a uma sequência primária de aminoácidos que estão ligados por "ligações peptídicas" covalentes. Em geral, um péptido consiste de alguns aminoácidos tipicamente de 2-50 aminoácidos. A expressão "polipéptido" abrange péptidos e proteínas, em que 14 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ a expressão "proteína" refere-se tipicamente a polipéptidos grandes e a expressão "péptido" refere-se tipicamente a polipéptidos curtos. Em algumas concretizações, o péptido, polipéptido ou proteína é sintético, enquanto em outras concretizações, o péptido, polipéptido ou proteína é recombinante ou de ocorrência natural. Um péptido "sintético" é um péptido que é produzido por meios artificiais in vitro (i.e., não foi produzido in vivo). A expressão "péptido" inclui adicionalmente aminoácidos modificados (quer de ocorrência natural quer de ocorrência não natural), tais modificações incluem, fosforilação, glicosilação, pegilação, lipidização e metilação, não se lhes limitando.

Um "péptido isolado" é um péptido que foi substancialmente separado de componentes (e.g., ADN, ARN, outras proteínas e péptidos, hidratos de carbono e lípidos) que o acompanham naturalmente numa célula.

Tal como aplicado a polipéptidos, a expressão "identidade substancial" significa que duas sequências de péptido, quando alinhadas de forma óptima, tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de falha por omissão, partilham pelo menos 80% de identidade de sequência, de preferência pelo menos 90% de identidade de sequência, com mais preferência pelo menos 95% de identidade de sequência ou mais (e.g., 99% de identidade de sequência). Preferentemente, as posições de resíduos que não são idênticas diferem por substituições de aminoácidos conservativas. A frase "funcionalmente equivalente" significa que a variante, análogo ou fragmento de um polipéptido retém uma actividade biológica pretendida em comum com o polipéptido lunasina. Em pelo menos uma concretização do presente invento, a actividade biológica pretendida em comum com lunasina é a actividade biológica relacionada com o controlo, estabilização ou redução na produção ou níveis existentes de colesterol, colesterol LDL, colesterol total ou lípidos. Preferentemente, determinada quantidade de um análogo, variante ou fragmento é de pelo menos 10%, de preferência pelo menos 30%, com maior preferência pelo menos 50, 60, 80, 90, 95 ou 99% tão eficaz como uma quantidade equivalente da lunasina de ocorrência natural da qual deriva o análogo, 15 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ variante ou fragmento. A determinação da eficácia relativa do análogo, variante ou fragmento pode ser facilmente efectuada por utilização de uma quantidade prescrita do análogo, variante ou fragmento em um ou mais dos métodos de ensaio do invento e seguidamente comparando a capacidade do análogo, variante ou fragmento com a lunasina de ocorrência natural em ensaios que medem a capacidade da amostra inibir a acetilação da histona H3 ou para efectuar a expressão de HMG Co-A reductase, Spl ou receptor de LDL. A expressão "análogo" tal como aqui utilizada em referência a um polipéptido significa um polipéptido que é um derivado do polipéptido do invento, em que o derivado compreende adição, deleção e/ou substituição de um ou mais aminoácidos, de modo a que o polipéptido retenha substancialmente a mesma função do que o polipéptido lunasina seguidamente identificado. A expressão "fragmento" refere-se a uma molécula de polipéptido que é uma constituinte do polipéptido lunasina completo e apresenta actividade biológica qualitativa em comum com o polipéptido lunasina completo. O fragmento pode ser derivado do polipéptido lunasina completo ou alternativamente pode ser sintetizado por alguns outros meios, por exemplo síntese química. Em referência a "fragmentos" pretende-se abranger fragmentos de uma proteína com um comprimento de pelo menos 5, de preferência pelo menos 10, com maior preferência pelo menos 20 e com a maior preferência pelo menos 30, 40 ou 50 aminoácidos de comprimento e que são funcionalmente equivalentes à proteína da qual são um fragmento. A expressão "variante" tal como aqui usada refere-se a um polipéptido que é produzido a partir de um ácido nucleico que codifica lunasina, mas é diferente da lunasina de tipo selvagem na medida em que é processado diferentemente de modo a apresentar uma sequência de aminoácidos alterada. Por exemplo pode produzir-se uma variante através de um padrão de splicing alternativo do produto de transcrição de ARN primário relativamente à que produz lunasina do tipo selvagem. 16 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ

Pretende-se que os análogos e variantes abranjam proteínas com sequências de aminoácidos diferentes da proteína a partir da qual são derivados em virtude da adição, deleção ou substituição de um ou mais aminoácidos para resultar numa sequência de aminoácidos que é de preferência pelo menos 60%, com maior preferência pelo menos 80%, com especial preferência pelo menos 85, 90, 95, 98, 99 ou 99,9% idêntica à sequência de aminoácidos da proteína original. Os análogos ou variantes incluem especificamente variantes polimórficas e análogos inter-espécies. Os análogos e variantes do presente invento podem apresentar adicionalmente alterações "conservativas", em que um aminoácido substituído tem propriedades estruturais ou químicas semelhantes. Um tipo de substituição de aminoácidos conservativa refere-se à possibilidade de troca de resíduos com cadeias laterais semelhantes. Por exemplo, um grupo de aminoácidos com cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais alifáticas-hidroxilo é serina e treonina; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais contendo amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos com cadeias laterais básicas é lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos com cadeias laterais contendo enxofre é cisteina e metionina. Os grupos preferidos para substituições conservativas de aminoácidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e asparagina-glutamina. Mais raramente, uma variante pode ter alterações "não conservativas" (e.g., substituição de uma glicina por um triptofano). As pequenas variações semelhantes podem também incluir deleções ou inserções (i.e., adições) de aminoácidos ou ambas. Pode encontrar-se orientação para determinar qual e como muitos dos resíduos de aminoácidos podem ser substituídos, inseridos ou deletados sem abolir a actividade biológica usando programas de computador bem conhecidos na especialidade, por exemplo, o utilitário DNAStar. Podem testar-se variantes em ensaios funcionais tal como os descritos na secção de exemplos que se segue. A expressão "substituição de aminoácidos conservativa" tal como aqui utilizada refere-se a uma substituição de um 17 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ aminoácido por outro aminoácido com propriedades semelhantes no interior de uma cadeia polipeptídica (sequência primária de uma proteína). Por exemplo, a substituição do aminoácido carregado ácido glutâmico (Glu) pelo aminoácido igualmente carregado ácido aspártico (Asp) seria uma substituição de aminoácidos conservativa.

Tal como aqui utilizado "lunasina" refere-se ao polipéptido de soja lunasina obtido de forma natural, sintética ou recombinante estabelecida em (SEQ. ID. 1). A descrição adicional do péptido lunasina e uma avaliação de vários fragmentos e análogos funcionalmente equivalentes aparece na patente US 6 107 287, patente US 6 544 956, pedido de patente US 2003/0229038, apresentado a 22 de Novembro de 2002, patente US 6 391 848, pedido de patente U.S. N° 10/252 256, apresentado a 23 de Setembro de 2002 e pedido de patente U.S. N° 10/302 633, apresentado a 22 de Novembro de 2002. Estas divulgações guiarão o perito na especialidade na identificação de fragmentos, variantes e análogos de lunasina funcionalmente equivalentes e biologicamente activos.

Tal como aqui utilizado "enriquecido em lunasina" refere-se a composições contendo níveis biologicamente activos de lunasina de ocorrência natural ou um análogo de lunasina de ocorrência natural, que está a uma concentração superior à qual a lunasina se encontra no material utilizado como fonte da lunasina ou análogo. Tal como aqui utilizado "extracto de semente enriquecido em lunasina" refere-se a composições contendo níveis biologicamente activos de lunasina de ocorrência natural ou um análogo de lunasina de ocorrência natural, que está a uma concentração de pelo menos duas vezes a da lunasina encontrada naturalmente na fonte de semente. Sem limitar o invento a qualquer fonte específica das composições do presente invento, podem obter-se composições enriquecidas em lunasina a partir de feijões de soja, trigo, cevada, isolados de soja, concentrados de soja ou outros produtos derivados de soja, obtidos comercialmente ou não.

Tal como aqui utilizado "farinha de soja que protege lunasina" refere-se a composições de farinha de soja compreendendo farinha de soja e uma quantidade de um inibidor de protéase suficiente para proteger a lunasina ou um seu 18 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ análogo, variante ou fragmento, da digestão completa, em que as composições não têm níveis de elementos anti-nutricionais que causariam um efeito adverso num indivíduo que as ingira.

Tal como aqui utilizado "digerido" refere-se ao tratamento de um polipéptido com um material digestivo que o quebra nos seus aminoácidos componentes. Os exemplos de materiais digestivos que podem ser usados são bem conhecidos na especialidade e incluem pancreatina e outras protéases tais como tripsina, quimiotripsina, pepsina, Proteinase K, termolisina, trombina, proteinase Arg-C, endopeptidase Asp-N, endopeptidase AspN + Glu N-terminal, BNPS-Skatole, CNBr, clostripaína, ácido fórmico, glutamilo endopeptidase, ácido iodosobenzóico, LysC, LysN, NTCB (ácido 2-nitro-5-tiocianobenzóico) e peptidase de Staphylococcus, não se lhes limitando.

Tal como aqui utilizado "biologicamente activo parcialmente digerido" relativamente a um polipéptido refere-se ao tratamento de um polipéptido com um material digestivo sob condições que aumentam a actividade biológica do polipéptido. A frase "terapia de combinação" abrange a administração de uma composição do presente invento em conjunção com outro agente farmacêutico que é indicado para tratar ou evitar uma doença, como parte de um regímen de tratamento específico que se pretende que proporcione um efeito benéfico a partir da acção concertada desses agentes terapêuticos.

Referenciam-se aqui nomes comerciais para componentes incluindo vários ingredientes utilizados no presente invento. Os inventores aqui não pretendem ser limitados por materiais com determinado nome comercial. Os materiais referenciados por nomes comerciais podem substituir-se por materiais equivalentes (e.g., aqueles que se obtêm a partir de uma fonte diferente com um nome ou número de referência diferentes) e utilizados nas descrições aqui.

As composições aqui podem compreender, consistir essencialmente ou consistir de quaisquer dos elementos tal como aqui descrito. 19 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ A prática do presente invento utilizará, salvo indicação em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes) , microbiologia, biologia celular, bioquímica, imunologia e cinética proteica, que estão no âmbito da especialidade. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura, tal como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather e P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths e D. G. Newell, ed., 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir e C. C. Blackwell, ed.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller e M. P. Calos, ed., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., ed., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., ed., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., ed., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley e Sons, 1999); e Mass isotopomer distribution analysis at eight years: theoretical, analytic and experimental considerations por Hellerstein e Neese (Am J Physiol 276 (Endocrinol Metab. 39) E1146-E1162, 1999). Além disso, serão tipicamente usados procedimentos que utilizam kits de ensaio e reagentes disponíveis comercialmente de acordo com protocolos definidos pelo fabricante, salvo indicação em contrário.

SUMÁRIO DO INVENTO A presente divulgação refere-se geralmente a produtos e métodos relacionados usando péptidos relacionados com soja para reduzir os níveis de colesterol total e colesterol LDL em indivíduos. O invento define-se na reivindicação 1.

Numa concretização, o presente invento proporciona composições para uso em métodos para reduzir os níveis de colesterol num indivíduo, compreendendo um composto 20 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ seleccionado do grupo que consiste do péptido de SEQ ID NO 2 e uma variante, fragmento ou análogo funcionalmente equivalente do referido péptido. Em determinadas concretizações obtém-se o composto a partir de feijão de soja, trigo ou cevada ou pela produção, extracção e purificação do referido composto usando técnicas de ADN recombinante ou por produção de polipéptido sintético. Em determinadas concretizações o indivíduo é um humano. Em determinadas concretizações a composição é para ingestão oral e em determinadas concretizações a composição está na forma de uma cápsula, comprimido, pó, formulação semi-sólida, liquida, gel, suspensão ou aerossol. Em determinadas concretizações a composição compreende adicionalmente farinha de soja. Em determinadas concretizações a farinha de soja é uma farinha de soja protectora de lunasina. Em determinadas concretizações preferidas a composição compreende adicionalmente um inibidor de quimiotripsina. Em determinadas concretizações o composto é para administração ao referido indivíduo entre 0,05 mg/kg e 50 mg/kg diariamente. Em determinadas concretizações o indivíduo está em risco de aterosclerose, esclerose arterial, enfarte de miocárdio, ataque cardíaco, diabetes, doença coronária, angina de peito ou angina instável.

Noutra concretização, este invento proporciona composições para uso em métodos para tratar ou evitar doença cardiovascular compreendendo um composto seleccionado do grupo que consiste do péptido de SEQ ID NO 2 e uma variante, fragmento ou análogo funcionalmente equivalente do referido péptido. Em determinadas concretizações obtém-se o composto a partir de feijão de soja, trigo ou cevada ou pela produção, extracção e purificação do referido composto usando técnicas de ADN recombinante ou por produção de polipéptido sintético ou em que o referido indivíduo é um humano. Em determinadas concretizações a composição é para ingestão oral e em determinadas concretizações a composição está na forma de uma cápsula, comprimido, pó, formulação semi-sólida, líquida, gel, suspensão ou aerossol. Em determinadas concretizações a composição compreende adicionalmente farinha de soja. Em determinadas concretizações preferidas a composição compreende adicionalmente inibidor de quimiotripsina. Em determinadas concretizações o composto é para administração 21 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ ao referido indivíduo entre 0,05 mg/kg e 50 mg/kg diariamente. Em determinadas concretizações o indivíduo está em risco de aterosclerose, esclerose arterial, enfarte de miocárdio, ataque cardíaco, diabetes, doença coronária, angina de peito ou angina instável.

Os aspectos não inventivos referem-se a composições compreendendo um péptido activo de SEQ ID NO 1 parcialmente digerido biologicamente. Por exemplo a composição também compreende um inibidor de quimiotripsina. Por exemplo a composição compreende adicionalmente farinha de soja.

Os aspectos não inventivos referem-se a composições compreendendo extracto de semente enriquecido em lunasina e farinha de soja. Por exemplo, a razão em peso de extracto de semente enriquecido em lunasina e farinha de soja é entre a) 90% de extracto de semente enriquecido em lunasina para 10% de farinha de soja e b) 60% de extracto de semente enriquecido em lunasina para 40% de farinha de soja, preferentemente aproximadamente 70% de extracto de semente enriquecido em lunasina para 30% de farinha de soja. Por exemplo farinha de soja compreende um inibidor de quimiotripsina. Por exemplo a lunasina está presente nas composições numa concentração entre cerca de 0,5% e 5% em peso da composição.

Os aspectos não inventivos referem-se a métodos de melhorar a actividade biológica da lunasina compreendendo: a) proporcionar lunasina e b) digerir parcialmente a referida lunasina. Em determinadas concretizações está presente farinha de soja enquanto a lunasina está a ser digerida.

Os aspectos não inventivos referem-se a métodos para diminuir ou reduzir os níveis de colesterol num indivíduo, compreendendo: proporcionar um produto contendo um péptido seleccionado de um grupo que consiste do péptido de SEQ ID NO 2 e um fragmento, variante ou análogo de SEQ ID NO 2 funcionalmente equivalente; e reivindicar que o produto reduz ou mantém os níveis de colesterol, colesterol total, colesterol LDL ou lípido num indivíduo que consome a composição. Por exemplo obtém-se o péptido a partir de feijão de soja, trigo ou cevada ou pela produção, extracção e 22 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ purificação do referido composto usando técnicas de ADN recombinante ou por produção de polipéptido sintético. Por exemplo o indivíduo é um humano. Por exemplo a administração compreende ingestão oral da composição e a composição está na forma de uma cápsula, comprimido, pó, formulação semi-sólida, líquida, gel, suspensão ou aerossol. Por exemplo a composição compreende adicionalmente farinha de soja. Por exemplo a composição compreende adicionalmente inibidor de quimiotripsina. Em determinadas concretizações a composição é administrada ao referido indivíduo entre 25 mg/kg e 100 mg/kg diariamente. Por exemplo o indivíduo está em risco de aterosclerose, esclerose arterial, enfarte de miocárdio, ataque cardíaco, diabetes, doença coronária, angina de peito ou angina instável.

Os aspectos não inventivos referem-se a um método para reduzir ou manter níveis de colesterol, compreendendo: proporcionar a um humano que dela necessite uma quantidade biologicamente activa do péptido de SEQ ID NO 2.

Os aspectos não inventivos referem-se a proporcionar um produto contendo uma quantidade eficaz de péptidos lunasina que reduzem os níveis de colesterol num indivíduo que consome o produto.

Os aspectos não inventivos referem-se a proporcionar uma composição contendo uma quantidade eficaz de péptidos lunasina ou derivados de péptido lunasina e um ou mais inibidores enzimáticos que funcionam conjuntamente para reduzir os níveis de colesterol num indivíduo que consome a composição.

Ainda noutro aspecto não inventivo proporciona-se um método para diminuir ou reduzir os níveis de colesterol num indivíduo. O método inclui proporcionar um produto contendo uma quantidade eficaz de péptidos lunasina a um indivíduo e reivindicar que o produto diminui, reduz ou mantém níveis de colesterol, colesterol total, colesterol LDL ou lípido num indivíduo que consome a composição.

Num aspecto de pelo menos uma concretização do presente invento, a quantidade eficaz de péptidos lunasina e/ou 23 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ péptidos derivados de lunasina que reduz os níveis de colesterol num indivíduo é 25 mg a 100 mg diariamente, assumindo que uma proteína de soja média contém 0,1 % de lunasina e que pelo menos 25 g de proteína de soja diárias estão clinicamente provados como reduzindo o colesterol LDL em humanos.

Noutro aspecto de pelo menos uma concretização do presente invento, os níveis de colesterol que diminuíram no indivíduo são os níveis de colesterol total e de colesterol LDL .

Ainda noutro aspecto de pelo menos uma concretização do presente invento, os péptidos lunasina incluem péptidos lunasina ou derivados de péptidos lunasina.

Ainda noutro aspecto de pelo menos uma concretização do presente invento, os péptidos lunasina obtém-se de soja.

Ainda noutro aspecto de pelo menos uma concretização do presente invento, obtém-se os péptidos lunasina a partir de soja e outras plantas apresentando sementes.

Ainda noutro aspecto de pelo menos uma concretização do presente invento, obtém-se os péptidos lunasina ou derivados de péptido lunasina por produção, extracção e purificação de péptidos lunasina ou derivados de péptido lunasina usando técnicas de ADN recombinante.

Ainda noutro aspecto de pelo menos uma concretização do presente invento, obtém-se os péptidos lunasina ou derivados de péptidos lunasina por sequenciação sintética.

Ainda noutro aspecto de pelo menos uma concretização do presente invento, o inibidor ou os inibidores enzimáticos incluem um ou mais inibidores de tripsina.

Ainda noutro aspecto de pelo menos uma concretização do presente invento, os ensaios descritos nos exemplos seguintes podem ser utilizados para rastrear isolados, concentrados, extractos, análogos, fragmentos e variantes de lunasina para confirmar a actividade pretendida antes de os utilizar em 24 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ métodos do presente invento. 0 presente invento abrange métodos de rastrear isolados, concentrados e extractos de soja assim como variantes, fragmentos e análogos de lunasina para medir actividade de modo a identificar aqueles com actividade preferida para usar em composições e métodos do presente invento, segundo os quais se efectua uma experiência semelhante aquela aqui descrita usando análogos, fragmentos ou variantes de lunasina em vez de lunasina, ensinando assim ao perito na especialidade métodos simples para rastrear os níveis de actividade de análogos, variantes e fragmentos de lunasina para uso no presente invento.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As características e objectos da presente divulgação anteriormente referidos tornar-se-ão mais evidentes em referência à seguinte descrição tomada conjuntamente com os esquema anexos em que os números das referências denotam as mesmas e em que: A figura 1 apresenta a proteína albumina 2S codificada pelo ADNc Gm2S 1 (SEQ ID NO 2) . As setas indicam locais de endoproteolíticos que dão origem a uma subunidade pequena (lunasina) (SEQ ID NO 2) e uma subunidade grande (proteína rica em metionina). Indicam-se regiões importantes em ambas as subunidades. A figura 2 é uma fotografia de uma análise de transferência "Western" (cima) e uma tabela (baixo) apresentando valores de densitómetro indicando os níveis relativos de expressão de HMG-CoA reductase em células HepG2 tratadas (CFM+LS (24)) ou não tratadas (CFM) com lunasina durante 24 horas antes da incubação em meio isento de colesterol (CFM) durante 24 horas para activar proteínas de ligação ao elemento de regulação de esterol (SREBP). Após as incubações, extraiu-se a proteína total e carregou-se 10 ug de proteína em géis Tris-glicina a 10%, electro-transferiu-se para membrana de nitrocelulose e efectuou-se imuno-coloração com anticorpos primários desenvolvidos contra HMG-CoA reductase e actina (para verificar carga equivalente de proteínas). Os valores de densitometria das manchas 25 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ representam médias e desvio padrao dos dados de três experiências independentes. A figura 3 é uma fotografia de uma análise de transferência "Western" (cima) e uma tabela (baixo) apresentando valores de densitómetro indicando os níveis relativos de expressão do receptor de LDL em células HepG2 tratadas (CFM +LS(24)) ou não tratadas (CFM) com lunasina durante 24 horas antes da incubação em meio isento de colesterol (CFM) durante 24 horas para activar SREBP. Após as incubações, extraiu-se a proteína total e carregou-se 10 ug de proteína em géis Tris-glicina a 10%, electro-transferiu-se para membrana de nitrocelulose e efectuou-se imuno-coloração com anticorpos primários desenvolvidos contra receptor de LDL e actina (para verificar carga equivalente de proteínas). Os valores de densitometria das manchas representam médias e desvio padrão dos dados de três experiências independentes. A figura 4 é uma fotografia de uma análise de transferência "Western" (cima) e uma tabela (baixo) apresentando valores de densitómetro indicando os níveis relativos de expressão de Spl em células HepG2 cultivadas a partir da confluência em meio de crescimento durante 24 horas antes da substituição do meio de crescimento com meio de crescimento fresco (meio), meio com lunasina (meio + LS) ou meio isento de colesterol com lunasina (CFM + LS) ou sem lunasina (CFM). Incubaram-se então as amostras durante 24 ou 48 horas tal como indicado. Após as incubações extraiu-se a proteína total e carregou-se 10 ug de proteína em géis de Tris-glicina a 10%, electro-transferiu-se para membrana de nitrocelulose e efectuou-se imuno-coloração com anticorpos primários desenvolvidos contra Spl e actina (para verificar carga equivalente de proteínas). Os valores de densitometria das manchas representam dados de uma experiência. A figura 5 é uma imagem digital de um gel de SDS-PAGE corado com azul de Coomasie (I) e uma fotografia de uma análise de transferência "Western" (II) apresentando amostras com 20 ug de proteína de soja extraída de cinco fontes comercias diferentes de proteína de soja (A-E) e amostras de 0,25 ug, 0,5 ug e 1,0 ug de lunasina sintética. Cada banda de lunasina de 5 kDa está indicada por uma seta. 26 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ A figura 6 é uma fotografia de uma análise de transferência "Western" do conteúdo em proteína e com especial interesse, do teor em lunasina, de um extracto de sementes enriquecido em lunasina, especificamente formulações de concentrado de soja enriquecido em lunasina (LeSC) farinha de soja (SF) e LeSC suplementada com farinha de soja (LeSC + SF) (consultar exemplo 4, seguidamente, para formulação e desenvolvimento de LeSC e LeSC + SF) comparativamente com amostras de lunasina sintética de 0,5 ug, 1,0 ug e 1,5 ug. A figura 7 é uma fotografia de uma análise de transferência "Western" apresentando o efeito da digestão com pancreatina sobre a actividade biológica de diferentes extractos, concentrados e isolados de proteína de soja. Utilizou-se um ensaio de histona acetiltransferase (HAT) para determinar a actividade biológica. As pistas representam: LeSC (A), LeSC + SF (B), LeSC + SF digeridos (C) , LeSC digerido (D) , isolado de proteína de soja digerido (E) e concentrado de soja digerido (F). Utiliza-se histona nuclear de eritrócito de galinha como pista de controlo negativo e a histona molde (Temp-) para o ensaio HAT. A pista de controlo positivo corresponde a histonas nucleares não tratadas (Untrt) num ensaio HAT que resulta na máxima acetilação de histona. Um sinal reduzido indica que a amostra foi bioactiva porque evitou a acetilação da histona H3. Um sinal intenso indica que a amostra foi inactiva, não tendo assim influência nos níveis de acetilação de histona H3.

A figura 8 é uma fotografia de uma análise de transferência "Western" apresentando os efeitos da digestão com pancreatina na actividade biológica do concentrado de soja enriquecido em lunasina na presença ou ausência de farinha de soja. Efectuou-se o ensaio de bioactividade HAT utilizando histonas nucleares extraídas de células HeLa em condições ácidas como um molde/controlo negativo (temp (-) ) para a reacção HAT catalisada por PCAF. Utilizaram-se histonas nucleares de células HeLa tratadas com butirato de sódio (NaB) como um controlo positivo. Utilizou-se o efeito de inibição da lunasina sintética (+synL) sobre a acetilação da histona H3 por PCAF para comparar o efeito de LeSC (A) , LeSC digerido (A dig), LeSC + SF (B) e LeSC + SF digeridos (B 27 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ dig) . Os números por baixo da legenda indicam leituras de densitómetro relativas normalizadas usando o sinal imunitário do molde de histonas nucleares HeLa (temp (-)) . Números reduzidos indicam actividade biológica. A figura 9 é uma fotografia de uma análise de transferência "Western" apresentando os efeitos da digestão com pancreatina em concentrado de soja enriquecido em lunasina na presença e ausência de inibidores de tripsina e/ou de quimiotripsina. Digeriram-se amostras de concentrado de soja enriquecido em lunasina com inibidores de tripsina (LeSC + Try) e LeSC com inibidores de tripsina e de quimiotripsina (LeSC + Try + Chy) com pancreatina seguido de imuno-coloração com anticorpo lunasina. Incluíram-se como controlos lunasina sintética (0,8 ug, 0,4 ug, 0,2 ug) e LeSC não digerido. A figura 10 é uma fotografia de uma análise de transferência "Western" apresentando os resultados de um ensaio de bioactividade HAT efectuado utilizando histonas nucleares de células de eritrócitos de galinha como um molde para a reacção HAT catalisada por PCAF (figura 6) . O efeito de inibição da lunasina sintética (+synL) comparativamente com a acetilação de histonas máxima e a acetilação num controlo negativo não tratado (-synL) sobre a acetilação da histona H3 por PCAF foi utilizado como controlo para comparar o efeito da digestão sobre: concentrado de soja enriquecido em lunasina (LeSC) (A) , LeSC com inibidores de tripsina e de quimiotripsina (B) , LeSC com inibidores de tripsina (C) . Também se incluem LeSC não digerido (D) e LeSC não digerido mais farinha de soja (E) . Os números por baixo da legenda indicam leituras de densitómetro relativas normalizadas usando o sinal imunitário de LeSC não digerido (D) . Números reduzidos indicam a presença de actividade biológica na amostra.

DESCRIÇÃO GERAL DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS

Este invento refere-se na generalidade a composições e métodos para tratamento de doenças relacionadas com colesterol em indivíduos. Mais especificamente, este invento refere-se a uma classe de péptidos que proporciona aos 28 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ indivíduos vários benefícios relacionados com saúde e composições que os compreendem. Mais especificamente, o presente invento refere-se a novas composições compreendendo péptidos de soja, métodos de usar essas composições para reduzir níveis de colesterol total e colesterol LDL em indivíduos e métodos de produzir composições que os compreendem.

Lunasina A lunasina é um componente bioactivo recentemente descoberto no feijão de soja (Glycine max) com uma nova propriedade de ligação a cromatina e efeitos epigenéticos na expressão génica (17, 18). A lunasina é o péptido subunidade pequena de uma albumina 2S específica dos cotilédones. A figura 1 apresenta a proteína albumina 2S (SEQ. ID. NO. 1) e a subunidade pequena lunasina (SEQ. ID. NO. 2). 0 péptido de soja lunasina é estável ao calor, solúvel em água e encontra-se em quantidades significativas em preparações de proteína de soja seleccionadas e na literatura proporcionam-se orientações significativas para a selecção das fontes de soja e de produtos de soja para isolamento ou concentração de lunasina (19) · A lunasina é aqui identificada como um componente activo da soja apresentando efeitos hipocolesterolémicos. Também se descrevem composições e métodos para produzir e utilizar lunasina para, entre outros, reduzir o colesterol.

Esta revelação resolve vários problemas que tinham até agora dificultado a utilização de produtos de soja para redução do colesterol. Devido ao componente activo da soja na redução do colesterol não ter sido anteriormente identificado, este não podia ser seleccionado em produtos de soja. Assim, anteriormente, uma pessoa teria que ingerir grandes quantidades de soja diariamente para poder observar uma pequena redução do colesterol. Proporcionam-se agora composições de soja com concentração aumentada de lunasina, permitindo doses menores, melhoria de eficácia e resultados de tratamento mais consistentes. 29 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ

Além disso, analisam-se os problemas de processamento e empacotamento relacionados com proporcionar grandes quantidades de soja a indivíduos e está agora disponível uma variedade de formulações.

Os estudos mostram que a lunasina pode entrar nas células epiteliais de mamífero através do seu motivo de adesão celular RGD, ligando-se preferentemente a histonas diacetiladas e inibindo a acetilação das histonas H3 e H4 (20) . Têm sido acumuladas evidências que a transformação celular, as respostas a hormonas e os efeitos da dieta e do ambiente envolvem alterações epigenéticas na expressão génica, que são moduladas pelos processos reversíveis de metilação-desmetilação de ADN e acetilação-desacetilação de histonas (21, 22). A lunasina é a primeira substância natural a ser identificada como um inibidor da histona acetilase, apesar de não afectar directamente a enzima histona acetilase. Ela inibe acetilação H3 e H4 por ligação a resíduos de lisina desacetilados específicos na cauda N-terminal das histonas H3 e H4, tornando-as indisponíveis como substratos para a acetilação de histonas (20) . A elucidação do mecanismo de acção faz da lunasina uma molécula importante para estudos de investigação para compreender o papel emergente da epigenética e das modificações da cromatina em processos biológicos importantes. 0 estudo do efeito da lunasina na carcinogénese da próstata na University of Califórnia em Davis revelou os efeitos da lunasina nas modificações da histona H4 e na regulação positiva de genes de prevenção quimica (23). Contudo, o efeito específico da ligação da lunasina na cauda N-terminal de H3 desacetilada e na inibição da acetilação da histona H3 em sistemas biológicos ainda não foi investigada. A maioria do colesterol em circulação no sangue é sintetizado internamente e assim a produção interna de colesterol tal como catalisada pela enzima HMG-CoA reductase (a enzima limitante da velocidade de biossíntese do colesterol) e a quantidade de receptores de LDL nas membranas 30 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ das células do fígado sao factores importantes na modulaçao dos níveis de colesterol LDL (33) .

Para determinar o efeito biológico especifico da ligação da lunasina a histona H3 desacetilada e a inibição da acetilação, usou-se como modelo biológico a indução de genes envolvidos na biossíntese do colesterol pelas proteínas de ligação ao elemento de regulação de esterol (SREBP). Escolheu-este modelo biológico porque a activação das SREBP pela falta de esterol resulta no aumento da acetilação da histona H3, mas não da histona H4, pela enzima histona acetilase P300/factor associado a CBP (PCAF), na cromatina proximal às sequências de promotor/de regulação de HMG-CoA reductase (a enzima limitante da velocidade de biossíntese do colesterol) e os genes do receptor de LDL (24). Além disso, a activação de SREBP resulta no aumento do recrutamento dos factores de co-regulação, ligação do elemento de resposta de adenosina cíclica monofosfato (CREB) à sequência de promotor/de regulação do gene de HMG-CoA reductase e Spl à sequência de promotor/de regulação do gene de receptor de LDL (24) .

Os nossos estudos em ensaios in vitro de histona acetiltransferase (HAT) (descritos seguidamente no EXEMPLO 8), mostram que a lunasina inibe significativamente a acetilação de histona H3 pela enzima histona acetilase, PCAF. As experiências de cultura de células usando células de fígado HepG2 mostram que a lunasina sintética pode reduzir significativamente a expressão de HMG-CoA reductase e aumentar a expressão do gene de receptor de LDL em meio isento de colesterol (exemplo 1, seguidamente), de forma semelhante aos efeitos dos fármacos de redução de colesterol do tipo das estatinas. Os nossos estudos também mostraram que o aumento da expressão de receptor de LDL coincide com o aumento da expressão de Spl em meio isento de colesterol (exemplo 2, seguidamente).

Sem pretender limitar o presente invento a qualquer mecanismo ou modo de acção em particular, propõe-se um mecanismo molecular de acção com base nas experiências descritas, no qual a lunasina reduz a acetilação de histona H3 pela enzima histona acetilase, PCAF, necessária para 31 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ activar expressão de HMG-CoA reductase e aumenta a expressão de receptor LDL. Assim, a lunasina pode reduzir os níveis de colesterol total e colesterol LDL 1) inibindo expressão génica de HMG-CoA reductase, cuja actividade enzimática é reduzida pelos fármacos de redução de colesterol estatinas e 2) aumentando a expressão do receptor LDL, o que aumenta a depuração de colesterol LDL no sangue.

Além disso, a actividade biológica da lunasina, tal como apresentado nos exemplos, é apoiada adicionalmente por dados epidemiológicos e clínicos em larga escala ligando o consumo de proteína de soja com a redução do colesterol LDL e menor risco de doença cardiovascular (3). A identificação da lunasina como o principal componente em proteína de soja que lhe confere a propriedade de redução do colesterol, prepara o caminho para a optimização dos ingredientes de proteína de soja para maximizar os seus benefícios saudáveis para o coração.

Os dados anteriormente publicados demonstram que o conteúdo em lunasina em diferentes variedades de soja, concentrados de proteína de soja e isolados de proteína de soja variam significativamente de uma preparação para outra. (19). Sem pretender limitar o presente invento a qualquer mecanismo ou modo de acção em particular, parece com base nos dados que a lunasina é o único agente bioactivo de soja com um mecanismo de acção molecular viável que possa explicar a propriedade de redução de colesterol da proteína de soja (descrito seguidamente nos EXEMPLOS 1 e 2). Os dados também ajudam a elucidar os resultados clínicos altamente divergentes citados no relatório científico da American Heart Association (16). Devido a sabermos que a lunasina está presente em quantidades variáveis em várias preparações de proteína de soja (19), parece que os resultados imprevisíveis relativos aos efeitos de redução de colesterol e a ausência de efeitos dependentes da dose em estudos anteriores utilizando isolados de proteína de soja, mesmo aqueles que ensaiaram concentrações mais elevadas de proteína de soja, são provavelmente devidos a variação nas quantidades de lunasina ou à ausência de inibidores de quimiotripsina para proteger a lunasina durante a digestão ou a uma combinação dos dois factores. 32 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ A nossa revelação surpreendente que a lunasina reduz o colesterol em indivíduos e é o componente da soja responsável por reduzir o colesterol LDL é adicionalmente apoiada por experiências que demonstram que a taxa mais elevada de redução de colesterol LDL em ensaios clínicos (20-30% de redução) foi relatada quando se misturou 50% de farinha de soja com 50% de concentrado de proteína de soja (26, 27) . Apesar da concentração e actividade biológica da lunasina variar entre as diferentes fontes disponíveis comercialmente, entre as diferentes fontes de lunasina, os concentrados de proteína de soja demonstraram um rendimento mais elevado de lunasina bioactiva em algumas experiências (consultar o exemplo 4 e a referência (19). Numa concretização preferida do presente invento, o concentrado de proteína de soja é uma fonte de lunasina para uso em composições e métodos do presente invento.

Prova-se aqui que a presença de farinha de soja numa mistura de proteína de soja tal como a que é usada nos ensaios clínicos anteriormente referidos proporciona protecção da lunasina contra digestão e degradação quando ingerida (consultar o exemplo 5). Também se demonstrou que a digestão parcial de extracto de semente enriquecido em lunasina misturado com farinha de soja aumenta a bioactividade da lunasina (exemplo 6).

Prova-se seguidamente que a farinha de soja protege a actividade biológica de composições contendo lunasina contra a redução de actividade biológica por efeito da digestão. Verificamos igualmente que os inibidores de tripsina e em particular os inibidores de quimiotripsina presentes em farinha de soja (34) protegem a actividade biológica de composições contendo lunasina contra efeitos adversos da digestão. Sem pretender limitar o invento a qualquer mecanismo ou modo de acção pensa-se que, nos estudos clínicos anteriormente mencionados, a presença de inibidores de quimiotripsina endógenos em farinha de soja pode ter funcionado como protectora da lunasina contra digestão e ter tornado o péptido lunasina mais biodisponível no fígado e no sangue dos indivíduos que participaram no estudo, 33 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ proporcionando assim a taxa mais elevada de redução de colesterol LDL. 0 efeito de redução de colesterol da proteina de soja pode ser aumentado adicionalmente pelo desenvolvimento de formulações que optimizam a adsorção e entrega adequadas de lunasina ao fígado, que são necessárias para que os indivíduos apresentem níveis significativamente inferiores de colesterol LDL no plasma. As concretizações preferidas do invento abrangem composições compreendendo lunasina em combinação com farinha de soja ou quimiotripsina ou uma combinação de ambos, métodos de utilizar e produzir tais composições. A lunasina é o péptido subunidade pequena de uma albumina 2S específica de cotilédones. A figura 1 apresenta a proteína albumina 2S (SEQ. ID. NO. 1) e a subunidade de lunasina pequena (SEQ. ID. NO. 2). Demonstrou-se que a expressão constitutiva do gene de lunasina em células de mamífero perturba a formação do cinetócoro e interrompe a mitose, levando a morte celular (18) . Quando aplicado exogenamente em cultura de células de mamífero, o péptido lunasina suprime a transformação de células normais em focos cancerígenos que são induzidos por carcinogéneos químicos e oncogenes. Para elucidar o seu mecanismo de acção de prevenção química, demonstramos que a lunasina (a) é internalizada através do seu motivo de adesão celular RGD, <b) co-localiza com cromatina hipoacetilada em telómeros na prometafase, (c) liga-se preferentemente a histona H4 desacetilada, o que é facilitado pela presença de um motivo helicoidal estruturalmente conservado, presente noutras proteínas de ligação de cromatina, (d) inibe a acetilação das histonas H3 e H4 e (e) induz apoptose em células transfectadas com EIA (20). Com base nestes resultados, propõe-se aqui um novo mecanismo de prevenção química no qual a lunasina entra dentro do núcleo, liga-se a histonas desacetiladas, evita a sua acetilação e inibe a expressão génica tal como as controladas pelo supressor de tumor Rb e o oncogene h-ras.

As experiências de micromatriz demonstram alterações genéticas negativas mínimas ou nulas utilizando lunasina. Para determinar as alterações genéticas associadas ao 34 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ tratamento com lunasina, avaliaram-se os perfis de expressão génica de células de próstata não tumorigénicas (RWPE-1) e tumorigénicas (RWPE-2) tratadas com lunasina sintética utilizando análise de micromatriz. Os resultados demonstram que dos 14 500 genes interrogados, 123 genes tiveram uma alteração de expressão superior a duas vezes nas células expostas a lunasina 2 uM durante 24 horas (23). Destes genes, 121 genes foram regulados positivamente em células RWPE-1 e apenas dois genes foram regulados positivamente em células RWPE-2. Não ocorreu regulação negativa de quaisquer genes em células epiteliais não tumorigénicas ou tumorigénicas tratadas com lunasina 2 uM. Os genes que foram regulados positivamente em células RWPE-1 incluem os genes envolvidos na prevenção da formação de cancro tal como supressão de tumor, pro-apoptose, pontos de verificação mitótica e controlo da divisão celular (23) .

Os resultados de micromatriz das nossas experiências também sugerem que a lunasina pode actuar como um activador de transcrição de genes que protegem as células normais da transformação. Estas revelações estão em contraste com os modelos mecanísticos anteriores que sugerem que a lunasina evita a transformação das células normais em tumores por inibição da acetilação de histonas H4 desacetiladas (20) . Pensa-se que o bloqueio da acetilação destas histonas resulta em condensação de cromatina e silenciamento de transcrição de oncogenes mesmo na ausência ou inactivação de supressores de tumor tal como Rb (proteína retinoblastoma). Num estudo recente contudo, células 3T3 de fibroblastos de ratinho tratadas com lunasina obtidas de National Institutes of Health (células 3T3 de NIH) (pré-tratadas durante 24 horas) transfectadas com o oncogene EIA apresentaram um aumento de cinco vezes nos níveis de proteína p21/WAFl/Cipi, oito dias após transfecção com EIA (28). A proteína p21/WAFl/Cipi é um inibidor potente e universal de cinases dependentes de ciclina, que são os principais pontos de controlo da progressão do ciclo celular (29). Os resultados de micromatriz não mostraram regulação positiva de p21/WAFl/Cipi no intervalo de 24 horas; contudo o gene SP3, um activador de transcrição de p21/WAFl/Cip (30), foi regulado positivamente por lunasina às 24 horas, o que pode explicar o aumento 35 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ posterior da expressão de p21/WAFl/Cipi em células 3T3 de NIH.

Além disso, os resultados de micromatriz ajudam a explicar a redução de 70% na formação de focos observada quando se expõem células C3H/T101/2 pré-tratadas com lunasina aos carcinogéneos químicos dimetilbenzatraceno (DMBA) e MCA (20) . Uma única exposição de 24 horas destas células a quantidades tão reduzidas de lunasina como 125 nM foi suficiente para suprimir a formação de focos em ensaios de carcinogénese quimica com a duração de seis semanas (20) . Pensa-se que o pré-tratamento de 24 horas de células C3H/T101/2 com lunasina regula positivamente a expressão de genes de prevenção química que protegem as células contra transformação induzida por DMBA e MCA. A análise bioinformática dos 121 genes regulados positivamente pela lunasina em células de próstata normais mostra que mais de 25% dos genes se localizam desde 0 a 2000 pb (a 10 nucleossomas de distância) de uma ilha CpG que é altamente significativa relativamente a uma distribuição apenas aleatória dos genes no genoma. É possível que a perda de regulação positiva destes genes de prevenção química na linha celular de próstata tumorigénica (RWPE-2) pela lunasina seja devida ao aumento da metilação das citosinas e a hipoacetilação de cromatina das ilhas CpG, que são características de carcinogénese.

Ensaio de rastreio (não é parte do invento) O invento proporciona adicionalmente um ensaio in vitro que pode ser usado para rastrear fontes potenciais de lunasina ou análogos, fragmentos ou variantes de lunasina para material activo biologicamente útil nos métodos do presente invento. Numa concretização do presente invento, utilizam-se histonas nucleares purificadas a partir de proteínas extraídas de células HeLa e de células de eritrócitos de galinha em condições ácidas assim como histona H3 recombinante (disponível comercialmente de Upstate/Millipore) como moldes em reacções de histona acetilase (HAT) utilizando enzima histona acetilase PCAF na presença ou ausência de lunasina. Numa concretização 36 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ preferida do presente invento, rastreiam-se potenciais fontes de lunasina ou análogos, fragmentos ou variantes de lunasina como se segue: incubam-se o molde de histona nuclear e a amostra de lunasina (10:1 p/p) em gelo durante 5 min e a 25 °C durante 10 min antes de se adicionar a solução a uma mistura reaccional IX HAT, acetilCoA 1 uM e 5 uL de PCAF (com base na concentração recomendada de Upstate/Millipore). Incuba-se a mistura a 30 °C enquanto se agita a 250 rpm durante 1 hora. Pára-se a reacção por adição de tampão de paragem Laemmli (1:1 v/v) com betamercaptoetanol, ferver durante 5 min. e parar a reacção em gelo durante 15 min. Correm-se os produtos da reacção HAT PCAF em SDS-PAGE a 16%, transferem-se para uma membrana de nitrocelulose e coram-se imunitariamente com anticorpos primários desenvolvidos contra histona H3 diacetilada (Ac-Lys 13 + Ac-Lysl4 H3) e/ou histona H3 Ac-Lysl4, seguido de anticorpo secundário conjugado com HRP. Os sinais de quimioluminescência dos complexos de anticorpo podem ser visualizados usando reagentes padrão de quimioluminescência e expondo-se a película Kodak BioMAX, revelação e medição das manchas por densitometria usando um digitalizador e o programa utilitário UN-SCAN-IT de Silk Scientific (Orem, Utah).

Este ensaio HAT in vitro pode ser usado para determinar a actividade biológica de lunasina (consultar o exemplo 5 e 6) derivada de diferentes fontes sem recorrer a experiências de cultura celular e/ou com animais, que são demoradas e dispendiosas. A activação da expressão do gene de HMG-CoA reductase pelo activador de transcrição SREBP necessita da acetilação da histona H3 (24) e a capacidade da lunasina inibir a acetilação da histona H3 leva a expressão reduzida de HMG-CoA reductase e consequentemente à biossíntese de colesterol reduzida no fígado.

Fontes de lunasina.

Pode encontrar-se lunasina de ocorrência natural em quantidades significativas em sementes de soja e de fontes de proteína de soja disponíveis comercialmente (19) e os seus análogos de outras fontes de sementes, tais como cevada (35) e trigo (36). Dado o papel biológico da lunasina na etapa de endo-reduplicação de ADN no desenvolvimento da semente (18) é 37 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ de esperar encontrar lunasina e os seus análogos também no endosperma e cotilédones de outras plantas contendo sementes (angiospermas).

Os polipéptidos do presente invento podem ser obtidos de várias formas bem conhecidas na especialidade. Por exemplo, sem pretender limitar o âmbito do invento a qualquer método especifico de obter polipéptidos do presente invento, a lunasina e seus análogos, variantes e fragmentos podem ser sintetizados quimicamente utilizando procedimentos automatizados comerciais, incluindo química f-Moc ou t-Boc de fase sólida de Merrifield convencional, não se lhe limitando. Os métodos para purificação de polipéptidos são também bem conhecidos na especialidade, incluindo cromatografia de permuta catiónica e aniónica, cromatografia de imunoafinidade e cromatografia de exclusão de tamanho, não se lhes limitando. Para alguns objectivos, é preferível produzir o polipéptido num sistema recombinante.

Podem produzir-se fragmentos de uma proteína de várias formas, e.g. por meios recombinantes, por digestão proteolítica ou por síntese química. Podem gerar-se fragmentos internos ou terminais de um polipéptido por remoção de um ou mais nucleótidos de uma extremidade (para um fragmento terminal) ou ambas as extremidades (para um fragmento interno) de um ácido nucleico que codifica o polipéptido. A expressão do ADN mutagenizado produz fragmentos de polipéptido. A digestão com endonucleases de digestão de terminal pode assim gerar ADN que codificam uma matriz de fragmentos. Os ADN que codificam fragmentos de uma proteína podem também ser gerados por corte aleatório, digestão de restrição ou uma combinação dos métodos discutidos anteriormente.

Podem também sintetizar-se quimicamente fragmentos utilizando técnicas conhecidas na especialidade tal como química f-Moc ou t-Boc de fase sólida de Merrifield convencional. Por exemplo, os péptidos do presente invento podem ser divididos arbitrariamente em fragmentos do comprimento pretendido sem qualquer sobreposição dos fragmentos ou divididos em fragmentos com sobreposição de um tamanho pretendido. 38 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ

Podem preparar-se variantes de sequência de aminoácidos de uma proteina por mutagénese aleatória de ADN que codifica uma proteina ou um domínio específico ou região de uma proteína. Os métodos úteis incluem mutagénese de PCR e mutagénese de saturação. Pode gerar-se uma biblioteca de variantes aleatórias de sequência de aminoácidos pela síntese de um conjunto de sequências de oligonucleótidos degenerados. (Os métodos para rastreio de proteínas numa biblioteca de variantes encontram-se aqui noutro local).

Rastreio para análogos, fragmentos e variantes de péptido lunasina: A presença e quantidade de péptido lunasina, seus análogos, fragmentos e variantes podem ser determinadas por transferências "Western" de imuno-coloração com o anticorpo de lunasina desenvolvido contra o terminal carboxilo bioactivo do péptido lunasina (consultar exemplo 3). A bioactividade do péptido lunasina, seus análogos, fragmentos e variantes pode ser determinada e analisada quantitativamente efectuando o ensaio HAT in vitro tal como descrito no exemplo 4 e exemplo 8.

Fontes naturais de lunasina. A lunasina encontra-se na natureza e pode ser obtida de sementes de soja e de fontes de proteína de soja disponíveis comercialmente (19) e os seus análogos de outros fontes de sementes tais como cevada (35) e trigo (36) . Por exemplo, sem nos pretendermos limitar a qualquer método de obtenção de lunasina, a lunasina pode ser extraída das seguintes fontes de soja: farinha de soja em forma de flocos ou pó, concentrados de proteína de soja e isolados de proteína de soja (consultar exemplo 3).

Os flocos de soja são geralmente produzidos por descasque, desengorduramento e moagem do feijão de soja e tipicamente contêm menos de cerca de 65% (em peso) de proteína de soja numa base isenta de humidade. Os flocos de soja também contêm hidratos de carbono solúveis, hidratos de carbono insolúveis, tal como fibra de soja, e gordura inerente à soja. Os flocos de soja podem ser desengordurados, por exemplo, por extracção com hexano. As farinhas de soja, 39 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ sêmolas de soja e refeições de soja são produzidas a partir de flocos de soja através de fragmentação dos flocos em equipamento de trituração e moagem, tal como um moinho de martelos ou um moinho com jacto de ar, até um tamanho de partícula pretendido. Os materiais fragmentados são tipicamente aquecidos com calor seco ou vaporizados com calor húmido para "tostar" os flocos moídos e inactivar os elementos anti-nutricionais presentes na soja, incluindo inibidores de tripsina de Bowman-Birk e Kunitz e outros inibidores de protéase.

Numa concretização do presente invento não se efectua tostagem em condições para destruir a actividade de inibidores de protéase. Numa concretização preferida do presente invento não se efectua tostagem durante um período ou com um calor suficiente para destruir a actividade dos inibidores de quimiotripsina. Evita-se o tratamento térmico dos flocos triturados na presença de quantidades significativas de água para evitar desnaturação da proteína de soja no material e para evitar custos envolvidos na adição e remoção de água do material de soja. O produto de moagem tratado termicamente resultante é uma farinha de soja, sêmola de soja ou uma refeição de soja, dependendo do tamanho de partícula médio do material. A farinha de soja tem geralmente um tamanho de partícula inferior a cerca de 150 .miu.m. As sêmolas de soja tem um tamanho de partícula inferior a cerca de 150 a cerca de 1000 .miu.m. A refeição de soja tem um tamanho de partícula superior a cerca de 1000 .miu.m.

Os concentrados de proteína de soja contêm tipicamente de cerca de 65% (em peso) a menos de cerca de 90% (em peso) de proteína de soja numa base isenta de humidade, sendo a fibra o principal componente não proteico. Os concentrados de proteína de soja são formados tipicamente a partir de flocos de soja desengordurados por lavagem dos flocos com uma solução aquosa de álcool ou com uma solução aquosa ácida para remover os hidratos de carbono solúveis da proteína e fibra.

Os isolados de proteína de soja, também denominados proteínas de soja isoladas, são materiais de proteína de soja mais altamente refinados, são processados para conter pelo menos cerca de 90% (em peso) de proteína de soja numa base 40 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ isenta de humidade e poucos ou nenhuns hidratos de carbono ou fibra solúveis. As proteínas de soja isoladas são tipicamente formadas por extracção de proteína de soja e hidratos de carbono solúveis em água de flocos de soja ou farinha de soja desengordurados com uma extracção com solução aquosa alcalina. O extracto aquoso, conjuntamente com a proteína solúvel e hidratos de carbono solúveis, é separado dos materiais que são insolúveis no extracto, principalmente fibra. O extracto é então tipicamente tratado com um ácido para ajustar o pH do extracto ao ponto isoeléctrico da proteína para precipitar a proteína do extracto. A proteína precipitada é separada do extracto, que mantém os hidratos de carbono solúveis, e é seca após uma etapa de ajuste de pH opcional.

Extracção de lunasina e fontes de composições enriquecidas em lunasina.

Pode obter-se lunasina e composições enriquecidas em lunasina a partir da fracção de albumina de baixo peso molecular de proteína de soja conjuntamente com inibidores de protéase naturais encontrados na soja (37, 38.) Podem também utilizar-se procedimentos de extracção de inibidores de protéase de soja para extrair lunasina e obter composições enriquecidas em lunasina.

Existem métodos conhecidos na especialidade para extrair inibidores de protéase de soja. Por exemplo, consultar Konwinski et. al., patente U.S. N° 7 235 269, Kennedy et. al., patentes U.S. N° 4793996, 5 217 717, 5 505 946, Konwinski, et. al., pedido de patente U.S. N° 2003/0064 121, apresentado a 3 de Abril de 2003, Singe, patente U.S. N° 7 235 269, todos aqui incorporados por referência na sua globalidade. No entanto, os métodos anteriores para extrair inibidores de protéase de soja não se focaram na optimização do rendimento de lunasina. Pode obter-se uma actividade biológica melhorada das composições do presente invento por rastreio prévio da fonte do material de partida para a extracção de lunasina para concentração de lunasina antes de efectuar uma extracção. Num método preferido do presente invento, rastrear-se-ão fontes potenciais de lunasina para 41 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ determinar a concentração de lunasina antes de se utilizarem para métodos do presente invento.

Os seguintes exemplos adicionais de métodos de obter composições enriquecidas em lunasina não pretendem limitar o presente invento a qualquer método especifico de extracção de lunasina. Pode extrair-se farinha de soja desengordurada com etanol a 60%, precipitar-se com acetona fria, seguida por uma cromatografia em coluna em multi-etapas. Os inibidores de protéase são solúveis em etanol a 60% (conjuntamente com outras proteínas). Os inibidores de protéase são então precipitados com acetona fria, centrifugados e redissolvidos em água para preparar um extracto impuro para purificação adicional. (37). Utilizou-se uma modificação deste procedimento em Odani et al. (38) para isolar um extracto de soja que foi usado como material de partida para purificação adicional em cromatografia em CM-celulose e DEAE-celulose. Neste procedimento, extraiu-se farinha de soja desengordurada em etanol a 60% (4:1) à temperatura ambiente antes de adicionar 2 volumes de acetona fria, redissolve-se o precipitado em água, dialisa-se com água destilada, ajusta-se o pH a 4,0 antes de diálise adicional com NaAcetato 5 mM pH 4,0.

Outro modo de obter enriquecimento em lunasina é por extracção da fracção de baixo peso molecular de proteína de soja (39, 40). Neste procedimento, extraem-se todas as proteínas de farinha de soja utilizando um solvente tamponado de elevada força iónica (tampão NaFosfato 0,1 M, pH 7,5, NaCl 0,5 M, PMSF 1 mM, DTT 5 mM) . Por diálise contra água destilada, as albuminas de soja permanecem em solução porque são solúveis em água, enquanto as globulinas que são insolúveis em água precipitam. Liofiliza-se a solução de albumina e redissolve-se no menor volume para obter concentrado de albumina, que deverá conter quantidades significativas do péptido lunasina. A purificação adicional de lunasina de albuminas de baixo peso molecular e de extractos de soja enriquecidos em inibidor de protéase pode ser conseguida por cromatografia de permuta iónica ou de exclusão molecular e cromatografia de imuno-afinidade. Exemplos de resinas de permuta aniónica: 42 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ DEAE-sephadex, QAE-sephadex, DEAE-sepharose, QAE-sepharose, DEAE-sephacel, DEAE-cellulose e QAE-cellulose. Exemplos de resina de exclusão molecular: Sephadex G-25 (separa péptidos de 1-5 kDa, Sephadex G-50 (separa proteínas de 1,5-30 kDa) . Podem preparar-se colunas de imuno-afinidade utilizando anticorpo de lunasina para capturar péptido lunasina de fracções de proteína de soja.

Para os seguintes exemplos 3 e 4, obteve-se um extracto de sementes enriquecido em lunasina da seguinte forma: utilizou-se como material de partida concentrado de proteína de soja, que se verificou através de outra experiência aqui descrita que continha lunasina activa biologicamente, numa extracção de uma etapa com tampão utilizando 0,1X PBS seguido por centrifugação para separar o sobrenadante. Adicionou-se cerca de 2 volumes de acetona ao sobrenadante e separou-se o precipitado por centrifugação com sacos de filtro antes de liofilização para obter um extracto de sementes enriquecido em lunasina. Em determinadas concretizações do presente invento, em vez de precipitação de acetona, uma variação deste procedimento é concentrar o sobrenadante após extracção com tampão, aquecendo a 75 °C com vácuo até 1/1 do volume original, seguido por liofilização para obter uma forma em pó de extracto de semente enriquecido em lunasina.

Administração

As composições podem ser administradas utilizando muitas vias diferentes incluindo administração oral, administração tópica, administração transdérmica ou injecção directamente no corpo. A administração de composições para utilização na prática do presente invento pode ser sistémica (i.e., administrada ao indivíduo como um todo através de qualquer uma das vias anteriores) ou localizada (i.e., administrada ao local específico da doença ou condição patológica específica do indivíduo através de qualquer uma das vias anteriores).

Os presentes métodos, kits e composições podem também ser utilizados em "terapia de combinação" com outra composição ou tratamento indicado para o tratamento ou prevenção de uma doença relacionada ou proveniente de colesterol ou níveis de lípidos elevados tal como, por exemplo, uma estatina (e.g., 43 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ lovastatina) um inibidor de enzima de conversão de angiotensina, um antagonista de receptor de angiotensina II, um anti-arritmico, um anti-coleresterémico, um diurético, um agonista de receptor de dopamina, um antagonista de receptor de dopamina ou um vasodilatador, que são usualmente administrados para tratar, evitar ou minimizar os sintomas e complicações relacionados com esta doença. Estes fármacos têm determinadas desvantagens associadas ao seu uso, algumas das quais são melhoradas por uma dosagem diminuída necessária para conseguir um efeito terapêutico quando administrados em combinação com composições do presente invento.

Dosagem

Num exemplo de concretização do presente invento, proporciona-se um produto contendo uma quantidade eficaz de péptidos lunasina que baixam os níveis de colesterol num indivíduo que consome o produto. Deve considerar-se que a quantidade eficaz de lunasina dependerá, pelo menos em parte, do tamanho, peso, saúde e objectivos pretendidos para os indivíduos que consomem as composições. Assim, pensa-se que pelo menos numa concretização, a quantidade eficaz de lunasina proporcionada ao indivíduo é de 25 mg/kg a 100 mg/kg diariamente.

Dependendo das necessidades específicas do indivíduo em particular envolvido, as composições do presente invento podem ser administradas em várias doses para proporcionar concentrações de tratamento eficazes com base nos ensinamentos do presente invento. Os factores tais como a actividade das composições seleccionadas, as características fisiológicas do indivíduo, a extensão ou natureza da doença ou condição patológica do indivíduo e o método de administração determinarão o que constitui uma quantidade eficaz das composições seleccionadas. Em geral, as doses iniciais serão modificadas para determinar a dosagem óptima para tratamento do indivíduo em particular. As dosagens adequadas podem ser seleccionadas tendo em consideração qualquer ou todos os factores tais como o tamanho, peso, saúde, idade e sexo do humano ou indivíduo, os objectivos pretendidos pelo doente, a gravidade da condição patológica para a qual se está a administrar a composição, a resposta ao 44 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ tratamento, ο tipo e quantidade de outras medicações administradas ao doente que podem interactuar com a composição, quer potenciando-a, quer inibindo-a, e outras considerações farmacocinéticas, tais como função hepática e renal. Estas considerações são bem conhecidas na especialidade e são descritas em livros padrão.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer concretização do presente invento é determinada utilizando métodos conhecidos dos farmacologistas e clínicos que são peritos normais na especialidade. Por exemplo, pode determinar-se subjectivamente uma quantidade eficaz por administração de quantidades crescentes das composições do presente invento até que o doente a ser tratado apresente redução do colesterol, colesterol total, colesterol LDL ou níveis de lípidos. Os níveis sanguíneos da composição, níveis de colesterol e lípidos podem ser determinados utilizando ensaios químicos e biológicos de rotina e esses níveis sanguíneos podem ser relacionados com a via de administração. 0 nível sanguíneo e a via de administração que proporcionem o nível mais desejado de redução de colesterol podem então ser utilizados para estabelecer uma "quantidade eficaz" da composição farmacêutica para tratamento.

Este mesmo método de titulação de uma composição paralelamente à via de administração pode ser utilizado para determinar uma quantidade terapeuticamente eficaz das composições do presente invento para tratar qualquer e todas as doenças aqui descritas. Adicionalmente podem utilizar-se modelos animais tal como descrito seguidamente para determinar dosagens aplicáveis para uma doença ou condição patológica em particular. Tipicamente, as relações dosagem-efeito de ensaios in vitro ou in vivo podem proporcionar inicialmente orientações úteis sobre as doses adequadas para administração ao indivíduo.

Numa concretização do presente invento relacionada com a redução ou controlo de colesterol, colesterol LDL ou níveis de lípidos ou a síntese de colesterol ou colesterol LDL, os métodos e composições do invento abrangem uma dose de uma composição compreendendo lunasina, ou uma sua variante, análogo ou fragmento de lunasina funcionalmente equivalente 45 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ de cerca de 5 ng a cerca de 1000 g, ou cerca de 100 ng a cerca de 600 mg, ou cerca de 1 mg a cerca de 500 mg, ou cerca de 20 mg a cerca de 400 mg. Ilustrativamente, uma dosagem unitária de uma composição do presente invento pode conter tipicamente, por exemplo, cerca de 5 ng, 50 ng, 100 ng, 500 ng, 1 mg, 10 mg, 20 mg, 40 mg, 80 mg, 100 mg, 125 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 700 mg, 800 mg, 900 mg, 1 g, 5 g, 10 g, 20 g, 30 g ou 40 g de uma composição do presente invento, não se lhes limitando. Em determinadas concretizações preferidas do presente invento, as composições do presente invento contêm cerca de 2,5 a 100 mg, de preferência 5 a 50 mg, com maior preferência aproximadamente 25 mg de lunasina ou fragmentos, variantes e análogos de lunasina.

Os exemplos de dosagens para lunasina ou seus fragmentos, variantes e análogos, de acordo com os ensinamentos do presente invento, estão na gama de 0,0001 mg a 200 mg, de preferência 2,5 mg a 100 mg, com maior preferência 25 mg a 50 mg para humanos e outros indivíduos com um peso médio de 60 kg, embora se considere que as dosagens alternativas estão abrangidas pelo âmbito do presente invento. Em determinadas concretizações preferidas do presente invento para composições e métodos para administração tópica, a lunasina ou seus fragmentos, variantes e análogos estão presentes a um nível entre 25 ug/ml e 25 mg/ml, com maior preferência entre 50 ug/ml e 1 mg/ml, com maior preferência entre 100 ug/ml e 500 ug/ml, ainda com maior preferência aproximadamente 250 ug/ml. Em determinadas concretizações preferidas do presente invento para composições e métodos para administração oral proporciona-se lunasina ou seus fragmentos, variantes e análogos a um indivíduo a um nível entre 0,01 mg/Kg e 100 mg/Kg de peso corporal de um indivíduo, de preferência 0,05 mg/Kg e 50 mg/Kg, com maior preferência entre 0,5 mg/Kg e 2,5 mg/Kg e ainda com maior preferência entre 0,2 mg/Kg e 1,5 mg/Kg.

Pode administrar-se uma dose numa a cerca de quatro doses por dia ou em tantas doses por dia quanto necessário para provocar um efeito terapêutico. A forma de dosagem pode ser seleccionada para se adequar à frequência de administração 46 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ pretendida para atingir a dosagem especificada, bem como a via de entrega. A quantidade de agente terapêutico necessária para provocar um efeito terapêutico pode ser determinada experimentalmente com base, por exemplo, na taxa de absorção do agente para o soro sanguíneo, na biodisponibilidade do agente e na potência para modular a expressão ou acção de HMG-CoA reductase e/ou do receptor de LDL e por monitorização da redução do colesterol total e LDL. A determinação destes parâmetros é conhecida na especialidade.

Formulações. O invento também se refere a formulações contendo as composições do presente invento. Os produtos e composições do presente invento podem ser utilizados sozinhos ou em alimentos, pós, barras, cápsulas, batidos e outros produtos bem conhecidos consumidos por indivíduos.

Numa concretização preferida, as composições do presente invento encontram-se conjuntamente com um excipiente, diluente, transportador adequado dieteticamente ou com um alimento. Numa concretização preferida do presente invento, a formulação está sob a forma de uma pílula, comprimido, cápsula, pó, barra alimentar ou forma de dosagem semelhante.

As formulações podem estar numa variedade de tipos, tais como suplementos nutritivos, preparações farmacêuticas, suplementos vitamínicos, aditivos alimentares ou alimentos suplementados com as composições especificadas do invento, preparações líquidas ou sólidas, incluindo bebidas, soluções injectáveis estéreis, comprimidos, comprimidos revestidos, cápsulas, pós, rebuçados, suspensões ou xaropes, pomadas, loções, pastas em creme, géis ou semelhantes.

As formulações podem ser embaladas em formas de dosagem convenientes e podem também incluir outros ingredientes activos e/ou podem conter excipientes convencionais, transportadores e diluentes farmaceuticamente aceitáveis. A inclusão das composições do presente invento em remédios e 47 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ tratamentos à base de plantas é também uma parte preferida do invento.

As formulações preferidas para aplicações tópicas das composições do presente invento tanto para uso farmacêutico, como cosmético utilizarão excipientes adequados para aplicação tópica. As formulações tópicas são tipicamente géis, bálsamos, pós ou líquidos, embora também sejam desejáveis formulações controladas que libertam quantidades definidas do ingrediente activo na superfície pretendida. As formulações podem conter materiais que melhoram a permeabilidade das partes activas através da epiderme. Tais agentes penetrantes incluem, por exemplo, DMSO, vários sais biliares, tensioactivos não tóxicos e semelhantes. Os ingredientes padrão para composições cosméticas/farmacêuticas são bem conhecidos na especialidade; as formulações para aplicação tópica de fármacos encontram-se em Remington's Pharmaceutical Sciences, última edição, Mack Publishing Co., Easton, Pa., aqui incorporado por referência. As formulações cosméticas são largamente variadas e bem conhecidas dos praticantes da especialidade.

Numa concretização preferida do presente invento, consideram-se composições para uso tópico dos ingredientes activos, quer para objectivos puramente cosméticos, quer farmacêuticos/cosméticos. seus ou

Algumas concretizações do presente invento abrangem métodos para tratar uma ou mais das seguintes doenças ou condições: níveis elevados de colesterol, colesterol total, colesterol LDL ou lípidos, um tumor cancerígeno, qualquer doença associada a hiperlipidemia, incluindo aterosclerose, hipertensão, obesidade, diabetes e doenças renais, não se lhes limitando, compreendendo tratar um doente que sofre de uma destas doenças ou condições com composições contendo níveis biologicamente activos de lunasina ou seus fragmentos, variantes ou análogos funcionalmente equivalentes de acordo com os métodos do presente invento. Outra concretização do presente invento abrange métodos compreendendo tratar indivíduos que pretendem manter um determinado nível de colesterol, colesterol total, colesterol LDL ou lípidos com níveis biologicamente activos de lunasina, 48 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ fragmentos, variantes ou análogos funcionalmente equivalentes de acordo com os métodos do presente invento.

Embora se pretenda que a principal utilização dos materiais do invento seja em humanos, podem existir circunstâncias em que se pretende o tratamento em animais domésticos ou animais de criação ou em animais experimentais. De facto, um aspecto do invento é o uso de animais experimentais para confirmar a segurança e eficácia das composições do invento. Assim, podem aplicar-se produtos para uso em humanos a animais de laboratório tais como ratos, ratinhos ou coelhos para confirmar a capacidade da preparação especifica para reduzir ou controlar os níveis de colesterol e para assegurar que uma preparação específica não é tóxica. 0 uso dos materiais do invento no contexto de controlo de qualidade, tal como agora descrito, é parte do invento. Métodos de preservar ou melhorar a actividade biológica de lunasina.

Noutro exemplo de concretização do presente invento, proporciona-se uma composição contendo uma quantidade eficaz de péptidos lunasina ou derivados de péptido lunasina e uma composição compreendendo um ou mais inibidores de enzima protéase que conjuntamente diminuem os níveis de colesterol num indivíduo que consome a composição.

Os inibidores de enzima protéase actuam protegendo a lunasina de digestão, facilitando assim a absorção e entrega às áreas alvo adequadas. Os exemplos de inibidores de enzima protéase adequados incluem inibidores de pancreatina, tripsina e quimiotripsina, não se lhes limitando. Deve considerar-se que o âmbito do presente invento inclui o uso da lunasina e fragmentos, análogos e variantes de lunasina com qualquer outra composição ou produto que se sabe ou pensa que facilita a absorção ou entrega de lunasina a um indivíduo.

Ainda noutro exemplo de concretização do presente invento proporciona-se um método para baixar ou diminuir os níveis de colesterol num indivíduo. 0 método inclui proporcionar um produto contendo uma quantidade eficaz de péptidos lunasina a 49 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ um indivíduo e reivindicar que o produto baixa, reduz ou mantém os níveis de colesterol, colesterol total, colesterol LDL ou lípidos num indivíduo que consome a composição. Deve considerar-se que o presente invento inclui a reivindicação que o produto baixa, reduz ou mantém os níveis de colesterol, colesterol total, colesterol LDL ou lípidos num indivíduo que consome a composição numa variedade de formas, incluindo através de sugestão ou afirmando explicitamente através de meios escritos, verbais ou electrónicos, não se lhes limitando.

Num aspecto de pelo menos uma concretização do presente invento, os péptidos lunasina são obtidos de soja. Noutro aspecto de pelo menos uma concretização do presente invento, os péptidos lunasina são obtidos de outras plantas com sementes ou de uma combinação de soja e de outras plantas com sementes. São bem conhecidas na especialidade plantas com sementes contendo quantidades suficientes de lunasina.

Ainda noutro aspecto de pelo menos uma concretização do presente invento, os péptidos lunasina ou derivados de péptido lunasina são obtidos por produção, extracção e purificação de péptidos lunasina ou derivados de péptido lunasina utilizando técnicas de ADN recombinante ou obtendo de outra forma péptidos lunasina isolados. Ainda noutro aspecto de pelo menos uma concretização do presente invento, os péptidos lunasina ou derivados de péptido lunasina são obtidos por produção sintética de polipéptido. Estes métodos de obter lunasina são bem conhecidos na especialidade.

Digestão parcial de lunasina.

Uma descoberta surpreendente do presente invento é que em vez de reduzir ou destruir a actividade biológica de lunasina, a digestão parcial de lunasina pode de facto melhorar ou aumentar a actividade biológica de lunasina. (Consultar figura 8 e exemplo 6, seguidamente.) Assim, uma concretização preferida do presente invento abrange péptidos lunasina parcialmente digeridos activos biologicamente. A digestão parcial de proteína de soja enriquecida em lunasina misturada com farinha de soja (LeSC + SF) pela 50 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ enzima digestiva pancreatina aumenta a bioactividade do péptido lunasina (figura 8) . Tal tem aplicação prática na preparação de extracto de sementes enriquecido em lunasina para aplicações tópicas.

Demonstrou-se que a lunasina sintética reduz a formação de tumores de pele em ratinhos quando aplicada topicamente utilizando etanol como sistema de entrega (20). Por utilização de lunasina parcialmente digerida biologicamente activa numa formulação tópica com um excipiente adequado é possível aumentar a eficácia de lunasina em aplicações tais como redução de tumor de pele e formação de cancro, ceratose actínica, rosácea, manchas de idade e de exposição solar e outras doenças de pele associadas com divisão e proliferação celular anómala. Tal formulação pode também ser utilizada para entrega tópica de lunasina para diminuir os níveis de colesterol e para tratar outras doenças relacionadas com colesterol, tais como aterosclerose, hipertensão, obesidade e diabetes, não se lhes limitando.

Demonstrou-se que a presença de farinha de soja protege a actividade biológica da lunasina durante a digestão. (Consultar exemplo 5) . Sem pretender limitar o presente invento a qualquer mecanismo ou modo de acção específico, pensa-se que a presença de farinha de soja durante a digestão protege a lunasina de digestão total, mas permite digestão parcial que aumenta a actividade biológica da lunasina.

Uma concretização do presente invento é um péptido lunasina parcialmente digerido, seu fragmento, variante ou análogo. Uma concretização preferida do presente invento é um péptido lunasina parcialmente digerido, seu fragmento, variante ou análogo em combinação com farinha de soja. Outra concretização preferida do presente invento é um péptido lunasina parcialmente digerido, seu fragmento, variante ou análogo numa formulação adequada para aplicação tópica. Outra concretização preferida do presente invento é um método de tratar doenças da pele compreendendo aplicar topicamente um péptido lunasina parcialmente digerido, seu fragmento, variante ou análogo a um doente que necessita de tal tratamento. 51 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ

Deve entender-se que a seguinte discussão, concretizações e exemplos apresentam meramente uma descrição detalhada de determinadas concretizações preferidas. Será evidente para os peritos na especialidade que se podem fazer várias modificações e equivalentes sem nos afastarmos do espirito e âmbito do invento.

Os seguintes exemplos não limitativos são apresentados para melhor ilustrar o presente invento. Os exemplos não pretendem limitar o âmbito do presente invento e não devem ser interpretados como tal. Serão evidentes outros procedimentos e adaptações aos peritos na especialidade por inspecção destes esquemas reaccionais e das estruturas das composições de acordo com o invento. Considera-se que tais procedimentos estão no âmbito do presente invento. As quantidades apresentam-se em partes por peso ou percentagens em peso, salvo indicação em contrário.

EXEMPLOS

Apresentam-se os seguintes exemplos para demonstrar e ilustrar adicionalmente determinadas concretizações e aspectos preferidos do presente invento e não devem ser interpretados como limitando o seu âmbito. EXEMPLO 1

Experiências que demonstram que a lunasina diminui os niveis de colesterol LDL e colesterol total. A diminuição do colesterol no soro por fármacos de estatina é conseguida por inibição competitiva de HMG-CoA reductase, a enzima limitante de velocidade na via metabólica da sintese de colesterol. Por redução da síntese de colesterol endógeno, as estatinas também causam a regulação positiva da expressão do receptor de LDL pelas células hepáticas, levando a uma depuração aumentada da lipoproteína de baixa densidade (LDL) do fluxo sanguíneo (25) . Em 1985, Michael Brown e Joseph Goldstein receberam o prémio Nobel da medicina pelo seu trabalho na elucidação deste mecanismo de diminuição de LDL. 52 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ A regulação da transcrição de HMG-CoA reductase e receptor de LDL é controlada pela proteína 1 e proteína 2 de ligação de elemento de regulação de esterol (SREBP). Esta proteína liga-se ao elemento de regulação de esterol (SRE) localizado na extremidade 5' dos genes da reductase e do receptor de LDL. Quando SREBP está inactivo, liga-se ao retículo endoplasmático ou à membrana nuclear. Quando os níveis de colesterol diminuem, liberta-se SREBP da membrana por proteólise e migra para o núcleo, onde se liga ao SRE para regular positivamente a transcrição de HMG-CoA reductase e receptor de LDL (24, 25).

Em cultura celular de células hepáticas HepG2, é possível activar SREBP e aumentar a expressão de HMG-CoA reductase e receptor de LDL por remoção de colesterol no meio de crescimento. Tal pode conseguir-se por exposição das células a meio isento de soro durante 24 horas (31, 32) .

Efectuaram—se as seguintes experiências relacionadas para avaliar o efeito de lunasina na expressão de HMG-CoA e expressão de receptor de LDL.

Na primeira experiência trataram-se células HepG2 (1 x 106) com ou sem lunasina sintética 10 uM em DMEM com FBS a 10% durante 24 antes de se substituir o meio de crescimento por meio isento de colesterol para activar SREBP. Após 24 horas, extraiu-se proteína total e carregou-se 10 ug de proteína em géis de Tris-glicina a 10%, electro-transferiram-se para membrana de nitrocelulose e imunocoraram-se com anticorpos primários desenvolvidos contra HMG-CoA reductase e actina (para mostrar carregamento igual de proteínas). Os valores de densitometria de mancha foram obtidos por digitalização e com o utilitário Un-Scan It e representam a média e o desvio padrão dos dados de três experiências independentes. Os resultados apresentam-se na figura 2.

Na segunda experiência trataram-se células HepG2 (1 x 106) com ou sem lumasina sintética 10 uM em DMEM com FBS a 10% durante 24 horas antes de se substituir o meio de crescimento por meio isento de colesterol para activar SREBP. Após 24 horas, extraiu-se a proteína total e carregou-se 10 ug de proteína em géis de Tris-glicina a 10%, electro- 53 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ transferiram-se para membrana de nitrocelulose e imunocoraram-se com anticorpos primários desenvolvidos contra receptor de LDL e actina (para mostrar carregamento igual de proteínas). Os valores de densitometria de mancha foram obtidos por digitalização e com o utilitário Un-Scan It e representam a média e o desvio padrão dos dados de três experiências independentes. Os resultados apresentam-se na figura 3.

As figuras 2 e 3 mostram a regulação positiva de HMG-CoA reductase (98% de aumento) e de receptor de LDL (34% de aumento) quando se cultivam as células HepG2 em meio isento de colesterol durante 24 horas. No entanto, quando se adiciona lunasina ao meio isento de colesterol, a expressão da HMG-CoA reductase é reduzida mais de 50% (figura 2), enquanto a expressão de receptor de LDL aumentou mais de 60% (figura 3).

Este efeito de lunasina é semelhante aos fármacos estatina que reduzem a síntese de colesterol endógeno por inibição da actividade de HMG-CoA reductase, que leva a aumento da expressão de receptor de LDL. No entanto, embora não se pretenda que o presente invento se limite a qualquer mecanismo ou modo de acção específicos, pensa-se que o modo de acção da lunasina difira do de fármacos estatina já que parece inibir a expressão de HMG-CoA reductase ao nível da transcrição e não na inibição da sua actividade enzimática. Tal como os fármacos estatina, a lunasina regula positivamente a expressão do gene de receptor de LDL. Uma vez mais, embora não se pretenda que o presente invento se limite a qualquer mecanismo ou modo de acção específicos, o efeito contrastante da lunasina nestes dois genes controlados por SREBP pode ser explicado pelo recrutamento selectivo de diferentes factores de transcrição de co-regulação para duas sequências promotoras/de regulação reguladas por colesterol independentes. 54 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ EXEMPLO 2

Efeito de lunasina na expressão de co-activador Spl

Contrariamente a HMG-CoA reductase, a activação do receptor de LDL por SREBP por depleção de esterol requer recrutamento aumentado de co-activador Spl para um local adjacente a SREBP na sequência promotora/de requlação do qene de receptor de LDL (25). Tal como apresentado na figura 3, a regulação positiva de receptor de LDL por lunasina (LS) em meio isento de colesterol pode ser devida a aumento da biodisponibilidade e recrutamento do co-activador Spl para a sequência promotora/de regulação do receptor de LDL. Para ensaiar esta hipótese, determinou-se o nivel de Spl em meio de crescimento tratado com lunasina e meio isento de colesterol por análise Western utilizando anticorpo Spl, da seguinte forma: cultivaram-se células HepG2 (1 x 106) desde confluência em DMEM com FBS a 10% durante 24 horas antes de substituir o meio de crescimento por meio de crescimento fresco ou meio de isento de colesterol (para activar SREBP) e tratou-se com ou sem lunasina sintética 10 uM. Após 24 horas, extraiu-se a proteína total de cada tratamento e carregou-se 10 ug de proteína para géis de Tris-glicina a 10%, electro-transferiram-se para membrana de nitrocelulose e imuno-coraram-se com anticorpos primários desenvolvidos contra Spl e actina (para mostrar igual carga de proteínas). Os valores de densitometria de mancha foram obtidos por digitalização e com o utilitário Un-Scan It e representam os dados de uma experiência. Os resultados apresentam-se na figura 4. A figura 4 mostra que os níveis de Spl em meios de crescimento de controlo e tratados com lunasina não são significativamente diferentes. No entanto, os níveis de Spl aumentaram 23% em meio isento de colesterol comparativamente ao meio de crescimento. A adição de lunasina no meio isento de colesterol aumentou adicionalmente quase 60% os níveis de Spl, o que reflecte quase perfeitamente o aumento dos níveis de receptor de LDL em meio isento de colesterol tratado com lunasina.

Os dados destas experiências indicam que o aumento da expressão de receptor de LDL por lunasina em meio sem esterol 55 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ pode ser atribuído ao aumento da biodisponibilidade do co-activador de transcrição de Spl. Igualmente, a inibição da expressão de HMG-CoA reductase por lunasina diminui os níveis de colesterol intracelular que mantêm SREBP activada, resultando na regulação positiva da expressão de receptor de LDL. Assim, os dados mostram que a lunasina inibe a expressão de HMG-CoA reductase, a enzima limitante de velocidade na via metabólica corporal para síntese de colesterol e, ao mesmo tempo, aumenta a expressão do receptor de LDL, levando a um aumento da depuração da lipoproteína de baixa densidade (LDL) do fluxo sanguíneo, que diminui o colesterol total e o colesterol LDL num indivíduo. A maioria do colesterol em circulação em indivíduos é sintetizado internamente, numa média de 1000 mg/dia comparativamente a 200-300 mg/dia de absorção intestinal numa dieta humana. Assim, a produção interna de colesterol, tal como catalisada por HMG-CoA reductase e a quantidade de receptores de LDL nas membranas das células hepáticas é o factor mais importante na modulação dos níveis de colesterol em indivíduos. Assim, estas experiências demonstram que uma quantidade eficaz de lunasina reduz ambos os níveis de colesterol total e colesterol LDL num indivíduo. EXEMPLO 3 Ά lunasina pode ser extraída de fontes comerciais de proteína de soja.

Encontrou-se lunasina em quantidades significativas em fontes comerciais de proteína de soja (19) e seus análogos de outras fontes de sementes tais como cevada (4) e trigo (5). Para identificar as fontes preferidas para matéria-prima de partida que podem ser utilizados para obter extracto de sementes enriquecido em lunasina, rastrearam-se vários produtos de proteína de soja disponíveis comercialmente para a presença de lunasina. 0 procedimento utilizado foi o seguinte: dissolveu-se aproximadamente 500 mg de amostras de proteína de soja (A-E) obtidas de diferentes fontes comerciais (Solae, St. Louis, MO) em 50 mL de tampão fosfato aquoso (pH 7,2) por agitação 56 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ durante 1 hora à temperatura ambiente. Centrifugaram-se as amostras a 2500 rpm durante 30 minutos e separou-se a fracção aquosa e colocou-se em tubos separados. Mediram-se as concentrações de proteína por ensaio de Bradford e carregou-se cerca de 20 ug de proteína total em dois géis de Tris-tricina a 16% da Bio-Rad Laboratories (Hercules, Califórnia). Corou-se um dos géis de SDS-PAGE (I) com azul de Coomasie e descorou-se antes de digitalização. A banda de lunasina de 5 kDa indica-se por uma seta. O outro (II) foi electro-transferido para membrana de nitrocelulose e incubou-se com anticorpo policlonal de lunasina purificado por afinidade (Pacific Immunology, (Ramona, Califórnia) seguido por anticorpo secundário de burro anti-coelho conjugado a HRP (Amersham Biosciences, Piscataway, New Jersey). Detectaram-se os imuno-sinais de lunasina (indicados por seta) utilizando o kit de transferência "Western" ECL de Amersham.

Os resultados apresentam-se na figura 5. É evidente da fotografia que a concentração de lunasina varia drasticamente de fonte para fonte. Este ensaio é uma ferramenta útil para identificar fontes de lunasina natural para utilização nas composições e métodos do presente invento. Utilizou-se o concentrado de soja (amostra A na figura 5) que continha mais lunasina como material de partida num procedimento de extracção com tampão para produzir um extracto de sementes enriquecido em lunasina que se denomina "concentrado de soja enriquecido em lunasina" ou "LeSC" nos seguintes exemplos e nas figuras aí mencionadas. EXEMPLO 4 O concentrado de soja enriquecido em lunasina (LeSC) e LeSC suplementado com farinha de soja (SF) formulados contêm quantidades significativas de lunasina.

Esta experiência avaliou a quantidade de lunasina em concentrado de soja enriquecido em lunasina (LeSC) e LeSC suplementado com farinha de soja. Note-se que em determinadas concretizações do presente invento, o extracto de sementes enriquecido em lunasina é obtido de isolado de soja ou de outros produtos de soja que não concentrado de soja. 57 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ Ο concentrado de soja enriquecido em lunasina foi produzido primeiramente por identificação de preparações de proteína de soja disponíveis comercialmente que contêm quantidades significativas de lunasina por análise de transferência "Western" utilizando anticorpo policlonal de lunasina, tal como descrito no exemplo 3. 0 concentrado de proteína de soja identificado como contendo mais lunasina foi utilizado como material de partida num procedimento de extracção com tampão numa etapa (0,1X PBS pH 7,2) seguido por centrifugação para separar o sobrenadante. Adicionaram-se dois volumes de acetona ao sobrenadante e separou-se o precipitado por centrifugação com sacos de filtro antes de secar sob vácuo para obter o concentrado de soja enriquecido em lunasina.

Os esforços para tornar a lunasina mais resistente a digestão excessiva indesejável, aumentar a sua biodisponibilidade e manter a sua bioactividade quando ingerida, resultaram na descoberta de pelo menos uma das concretizações preferidas do presente invento, uma composição compreendendo extracto de semente enriquecido em lunasina e farinha de soja.

Em pelo menos uma concretização do presente invento, as composições do presente invento compreendendo lunasina derivada naturalmente podem ser optimizadas para utilização em métodos específicos do presente invento por variação da quantidade de proteína total e de teor de lunasina, que podem ser controlados pela quantidade de concentrado de soja utilizado e variando a quantidade de protecção de lunasina a digestão, que pode ser controlada pela quantidade de farinha de soja utilizada.

Para itens baseados em alimentos é por vezes desejável limitar a quantidade de inibidores de protéase num produto. Por exemplo, o pedido de patente U.S. N° 20070092633, apresentado a 26 de Abril de 2007, aqui incorporado por referência, ensina que parte do processamento padrão de alguns produtos de soja incluem tratamento térmico para inactivar elementos anti-nutricionais, tais como inibidores de Bowman-Birk e Kuntz. Assim, numa concretização preferida do presente invento, optimiza-se uma composição compreendendo 58 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ lunasina e farinha de soja através de métodos de preparação aqui descritos ou conhecidos dos peritos na especialidade para terem um nível de inibidores de protéase suficiente para proteger a actividade biológica da lunasina durante a digestão, mas não suficiente para ter níveis de elementos anti-nutricionais que são indesejáveis para uso oral.

Os ensaios clínicos numa mistura 50:50 de concentrado de soja e farinha de soja levou a uma redução de 20-30% do colesterol LDL (26, 27.) Estes ensaios clínicos foram efectuados sem o conhecimento que a lunasina é um elemento activo no concentrado de soja na redução do colesterol LDL e assim não controlaram o nível de lunasina presente na mistura. O presente invento ensina métodos melhorados de determinar a concentração de lunasina em materiais de partida e produtos finais do presente invento, de modo a maximizar a concentração de lunasina e assim a actividade de composições de tratamento em aplicações relacionadas com colesterol. Em pelo menos uma concretização preferida do presente invento, a razão de farinha de soja para extracto de semente enriquecido em lunasina está entre 10:90 e 50:50, com maior preferência entre 20:80 e 40:60, com maior preferência aproximadamente 30:70 de farinha de soja:concentrado de soja. Numa concretização preferida do presente invento, a razão entre farinha de soja e extracto de semente enriquecido em lunasina é a que proporciona uma concentração de lunasina activa biologicamente, assim como protecção suficiente à digestão por farinha de soja.

Nas seguintes várias experiências, adicionou-se farinha de soja (SF) ao concentrado de soja de partida (numa mistura 30:70 p/p) antes de extracção com tampão com 0,1 x PBS pH 7,2 e precipitação com acetona para produzir concentrado de soja enriquecido em lunasina mais farinha de soja (LeSC + SF). O procedimento de análise de transferência "Western" utilizado nesta experiência foi o seguinte: sujeitou-se aproximadamente 20 ug de proteína total de LeSC, SF e LeSC+SF a electroforese em géis de Tris-tricina a 16% e electro-transferiram-se para membrana de nitrocelulose. Incubaram-se as transferências com anticorpo policlonal de lunasina seguido por anticorpo secundário anti-coelho conjugado com 59 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ HRP antes de se detectarem os imuno-sinais de lunasina com o kit ECL. Tanto LeSC, como LeSC + SF continham quantidades significativas de lunasina, tal como apresentado na figura 6. EXEMPLO 5 O extracto de sementes enriquecido em lunasina combinado com farinha de soja mantém a bioactividade mesmo quando digerido com enzimas digestivas.

Mediu-se a actividade biológica de LeSC (A) , LeSC + SF (B) , LeSC + SF digeridos (C) , LeSC digerido (D) , isolado de proteína de soja digerido (E) e concentrado de soja digerido (F) utilizando o ensaio de H3 histona acetiltransferase (HAT) (consultar exemplo 8). Digeriu-se cerca de 100 mg de proteína total de LeSC, LeSC + SF, isolado de proteína de soja e concentrado de soja por mistura com pancreatina (Sigma Life Sciences, Saint Louis, Missouri) a 1:1 (p/p) e incubação durante 30 min. a 40 °C. Para confirmar se o ensaio HAT estava a funcionar, incluiu-se o tratamento com lunasina sintética (+synL). A lunasina sintética diminuiu a acetilação de histona H3 pela enzima histona acetilase, PCAF, utilizando histonas nucleares isoladas de eritrócitos de galinha (Upstate/Millipore, Billerica, MA) como molde para o ensaio HAT. Incubou-se cerca de 10 ug de amostra de proteína com 1 ug de histonas nucleares antes de efectuar a reacção HAT com enzima PCAF e substrato acetil CoA. Correram-se os produtos da reacção em géis de Tris-Tricina a 16% e electro-transferiram-se para membranas de nitrocelulose. Incubaram-se as transferências com anticorpo primário desenvolvido contra H3 acetilada (diacetilada em histona 14 e histona 10) e anticorpo secundário anti-coelho conjugado com HRP antes de detectar os sinais utilizando o kit ECL. Sinais fracos indicaram que o péptido lunasina era bioactivo porque evitou a acetilação de histona H3. Os sinais fortes indicaram que o péptido lunasina foi digerido e tornado inactivo, não afectando assim os níveis de acetilação de histona H3. Os resultados apresentam-se na figura 7.

Ocorreu uma redução significativa da acetilação H3 na presença de lunasina sintética comparativamente a controlo não tratado. Tanto LeSC (A na figura 7) e LeSC + SF (B na 60 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ figura 7) foram capazes de diminuir significativamente a acetilação H3 por PCAF, indicando que a lunasina presente em ambos os extractos de proteína de soja é activa biologicamente. A digestão de LeSC + SF com pancreatina (C na figura 7) diminuiu a actividade biológica mas não na extensão verificada quando se digere apenas LeSC (D na figura 7). Tal como LeSC, o isolado de proteína de soja e concentrado de soja, que contêm quantidades significativas de lunasina, não apresentaram actividade biológica de lunasina após digestão com pancreatina (E e F na figura 7). Estes resultados indicam que a formulação LeSC + SF protege parcialmente a lunasina de digestão com pancreatina e permite que a lunasina mantenha a sua actividade biológica. EXEMPLO 6 A digestão parcial de formulação LeSC + SF aumenta a actividade biológica de lunasina.

Efectuou-se uma experiência de confirmação para determinar a actividade biológica de LeSC e LeSC + SF digerido e não digerido utilizando um molde diferente de histona nuclear. Desta vez utilizámos as histonas nucleares extraídas de células de tumor HeLa. Contrariamente às células de eritrócitos de galinha, as histonas nucleares de células HeLa tratadas com butirato de sódio encontram-se disponíveis comercialmente (Upstate/Millipore, Piscataway, NJ) e podem ser utilizadas como um controlo positivo para acetilação de histona. As histonas nucleares isoladas de células HeLa não tratadas foram utilizadas como um controlo negativo (baixos níveis de acetilação de histona) e como molde para o ensaio HAT. O ensaio de bioactividade HAT foi efectuado utilizando histonas nucleares extraídas com ácido de células HeLa (Upstate/Millipore) como um molde (controlo temp (-) ) para a reacção HAT catalisada por PCAF. Utilizaram-se histonas nucleares de células HeLa tratadas com butirato de sódio (NaB) como um controlo positivo dado que NaB é um inibidor de histona desacetilase que se sabe qua aumenta a acetilação de histona. Utilizou-se o efeito de inibição de lunasina sintética (+synL) na acetilação de histona H3 por PCAF para 61 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ comparar ο efeito de concentrado de soja enriquecido em lunasina (A) , LeSC digerido (A dig) , LeSC + SF (B) e LeSC + SF digerido (B dig) . LeSC e LeSC + SF foram digeridos parcialmente por adição de pancreatina a 1:0,5 (p/p) e incubando a 38 °C durante 15 min. Os números por baixo da legenda indicam as leituras de densitometria relativa normalizadas utilizando o imuno-sinal do molde (temp). Números baixos indicam a presença de actividade biológica de lunasina.

Os resultados apresentam-se na figura 8. Verificou-se uma redução significativa da acetilação H3 na presença de lunasina sintética. LeSC (A) e LeSC + SF (B) não digeridos apresentaram niveis reduzidos de acetilação H3, indicando que a lunasina natural presente nestes extractos de soja era activa biologicamente. A digestão parcial de LeSC (A Dig) levou à perda de actividade biológica.

Surpreendentemente, a digestão parcial de LeSC +SF resultou num aumento da actividade biológica e não numa diminuição. Embora não se pretenda limitar o presente invento a qualquer mecanismo especifico, pensa-se que a lunasina está ligada covalentemente a complexos de proteína de elevado peso molecular e que, com a protecção da farinha de soja, a digestão parcial apenas quebra estas ligações e liberta, mas não destrói, a lunasina bioactiva para a solução. Numa concretização preferida do presente invento, a lunasina é parcialmente digerida antes de utilização. Noutra concretização preferida do presente invento, está presente farinha de soja quando a lunasina é parcialmente digerida.

Digeriu-se parcialmente LeSC + SF por sua mistura com solução de pancreatina preparada recentemente (10 ug/mL de água destilada) numa razão 1:0,5 (p/p). Incubou-se a mistura a 38 °C durante 15 min. antes de se inactivarem as protéases e enzimas digestivas por ebulição durante 5 min e seguidamente parando a reacção em gelo. Nestas condições de digestão, a lunasina no extracto de soja LeSC foi digerida e inactivada (figura 8, pista Adig) enquanto a de LeSC + SF foram mais activas biologicamente (figura 8, pista B dig). No entanto, as condições para a digestão parcial de LeSC + SF têm de ser determinadas empiricamente por análise dos 62 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ produtos de digestão para teor de lunasina (figura 6) e actividade biológica utilizando o ensaio HAT (figura 8).

As variações nas fontes de pancreatina e enzimas protéases, a idade da enzima protéase ou condições de incubação podem levar a variabilidade nas condições de digestão. Por exemplo, a utilização de preparações de pancreatina com um mês de idade para digestão parcial levou a degradação e perda de actividade de lunasina em condições semelhantes às descritas anteriormente. Assim, numa concretização preferida do presente invento, as gamas aceitáveis para concentração e tempo de incubação com as enzimas protéase são determinadas utilizando um ensaio tal como o ensaio HAT utilizado anteriormente para avaliar a actividade biológica das composições tratadas. Numa concretização preferida do presente invento incuba-se enzimas pancreatina frescas a 38 °C durante 10 minutos. Por cada ug de extracto de lunasina utilizar 0,5 ug de pancreatina. EXEMPLO 7

Os inibidores de quimiotripsina (Chy) protegera a bioactividade de lunasina.

Para determinar quais os inibidores de protéase encontrados em soja que protegem a lunasina de digestão, obteve-se inibidor de tripsina de soja e inibidores tripsina + quimiotripsina de Sigma e misturaram-se com LeSC numa razão 1:1 p/p. Digeriram-se as misturas com pancreatina e imuno-coraram-se os produtos de digestão com anticorpo de lunasina.

Os detalhes da experiência são os seguintes. Digeriram-se LeSC + inibidores de tripsina de soja (1:1 p/p) (Sigma) e LeSC + inibidores de tripsina e quiimotripsina (1:1 p/p) (Sigma) com pancreatina (1:1 p/p) por incubação a 38 °C durante 15 min. Analisaram-se os produtos de digestão e LeSC por análise de transferência "Western" (figura 9) utilizando anticorpo primário de lunasina e lunasina sintética como padrões de controlo.

Efectuou-se o ensaio de bioactividade HAT utilizando histonas nucleares de células de eritrócito de galinha 63 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ (Upstate/Millipore) como um molde para a reacção HAT catalisada por PCAF (figura 10) . O efeito de inibição da lunasina sintética (+syriL) na acetilação de histona H3 por PCAF comparativamente ao controlo negativo não tratado (-synL) foi usado para comparar o efeito de LeSC digerido (A), LeSC +try + chy digerido (B) , LeSC + try (digerido C) , LeSC não digerido (D) e LeSC +SF não digerido (E) . Os números em baixo da legenda indicam leituras de densitometria relativas normalizadas utilizando o imuno-sinal de LeSC não digerido (D) . Os números baixos indicam a presença de actividade biológica de lunasina.

Os resultados nas figuras 9 e 10 demonstram que na amostra de LeSC + inibidores tripsina + quimiotripsina, a lunasina foi mais protegida de digestão do que na amostra de LeSC + inibidor de tripsina. De igual forma, nos ensaios HAT para determinar a actividade biológica de lunasina, a digestão de LeSC + inibidores tripsina + quimiotripsina foi significativamente mais bioactiva do que LeSC + inibidor tripsina (figura 10). A digestão com pancreatina de LeSC levou à perda da actividade biológica. Estes resultados indicam que a presença de inibidores de quimiotripsina em extracto de semente enriquecido em lunasina ajuda a proteger a actividade biológica da lunasina e ajuda a proteger a lunasina de digestão excessiva. EXEMPLO 8

Ensaio de rastreio para determinar a actividade biológica de lunasina.

Utilizaram-se histonas nucleares purificadas de células de eritrócito de galinha como moldes nas reacções de histona acetilase (HAT) utilizando a enzima histona acetilase PCAF, na presença ou ausência de lunasina cerca de 2-10 uM. Misturaram-se o molde de histona nuclear e os concentrados de soja enriquecidos em lunasina (LeSC e LeSC + SF) (10:1 p/p) e incubaram-se em gelo durante 5 min e 25 °C durante 10 min antes de adicionar a mistura a uma mistura reaccional de IX HAT, acetil-CoA 1 uM e PCAF 5 uL (com base na concentração recomendada por Upstate/Millipore). Incubou-se a mistura reaccional a 30 °C com agitação a 250 rpm durante 1 h. Parou- 64 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ se a reacção por adição de tampão de paragem de Laemmli (1:1 v/v) com beta-mercaptoetanol e ebulição durante 5 min. antes de parar a reacção em gelo durante 15 min. Correram-se os produtos de reacção PCAF HAT num gel de SDS-PAGE a 16%, transferiram-se para membrana de nitrocelulose e imuno-coraram-se com anticorpos primários desenvolvidos contra histona H3 diacetilada (Ac-Lys 13 + Ac-Lysl4 H3) seguindo por anticorpo secundário anti-coelho conjugado com HRP. Visualizaram-se os sinais quimioluminescentes dos complexos de anticorpo utilizando reagentes quimioluminescentes padrão e expuseram-se a película Kodak BioMAX, revelaram-se e mediu-se a densitometria da mancha por utilização de um digitalizador e utilitário UN-SCAN-IT de Silk Scientific (Orem, Utah). A figura 7, pistas A e B apresenta a redução de acetilação H3 nas misturas reaccionais tratadas com LeSc e LeSC + SF comparativamente a controlos não tratados, indicando que este procedimento de rastreio pode determinar a actividade biológica de extractos de semente enriquecidos em lunasina e outras composições compreendendo lunasina ou fragmentos, análogos ou variantes de lunasina. Na mesma figura 7, também se determina que a digestão de LeSC (pista D) elimina a actividade biológica mas não a de LeSC + SF (pista C) que apresenta apenas uma redução parcial de actividade biológica. EXEMPLO 9 A actividade in vivo das composições aqui descritas, bem como a utilização em tratamento de kits e métodos de tratamento podem ser determinados opcionalmente por qualquer dos seguintes procedimentos.

Alimentaram-se cães macho (beagles, na gama de cerca de 9 a cerca de 14 quilogramas, 1 a 4 anos de idade) com um alimento para cão padrão suplementado com banha a 5,5% e colesterol a 1%. Obtiveram-se amostras de sangue de linha de base de cães em jejum antes de iniciar o estudo para obter valores de referência para colesterol plasmático. Os cães foram então distribuídos aleatoriamente em grupos de cinco animais com níveis de colesterol plasmático semelhantes. Os animais foram doseados de acordo com um método de tratamento aqui descrito imediatamente antes de apresentação da dieta durante sete dias. Obtiveram-se amostras de sangue 24 horas após a última dose para determinações de colesterol 65 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ plasmático. Determinaram-se os níveis de colesterol plasmáticos por uma modificação do método de colesterol oxidase utilizando um kit disponível comercialmente.

Num procedimento alternativo opcional, separaram-se hamsters em grupos de seis e proporcionou-se uma dieta de colesterol controlado contendo colesterol a 0,5% durante sete dias. Monitorizou-se o consumo da dieta para determinar a exposição a colesterol na dieta. Dosearam-se os animais de acordo com um método de tratamento aqui descrito uma vez por dia começando no inicio da dieta. A dosagem é por gavagem oral. Todos os animais moribundos ou em condições físicas precárias são eutanizados. Após setes dias, os animais são anestesiados por injecção intramuscular (IM) de cetamina e sacrificados por decapitação. Recolhe-se sangue em tubos vacutainer contendo EDTA para análise de lípidos no plasma e o fígado é excisado para análise de lípidos em tecidos. A análise de lípidos é efectuada por procedimentos publicados (e.g., Schnitzer-Polokoff et al., Comp. Biochem. Physiol., 99A, 4 (1991), p. 665-670 e registaram-se os dados como redução percentual de lípido relativamente ao controlo. O fascículo, exemplos e dados anteriores proporcionam uma descrição completa do fabrico e utilização das composições do invento. Embora os produtos, composições e métodos relacionados tenham sido descritos em termos do que actualmente se considera ser as concretizações mais práticas e preferidas, pretende-se abranger várias modificações e arranjos similares incluídos no âmbito das reivindicações. O presente fascículo inclui todas e quaisquer concretizações das seguintes reivindicações. 66 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ

Referências

As referências numéricas incorporadas anteriormente correspondem à seguinte lista de artigos e resumos publicados. 1. Adlercruz H e Mazur W. Phyto-oestrogens and Western diseases. Ann. Med. 29: 95-1 20 (1997). 2. Zhang X., Shu XO, Gao YT, Yang G., Li O, Li H, Jin F e

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

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<130> 9 SoyL.8 PCT <140> PCT/US07/78584 <141> 2007-09-15 <160> 2 71 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ <170> Patentln versão 3.4 <210> 1 <211> 157

<212> PRT <213> Glycine max <400> 1

Met Thr Lys Phe Thr ile Leu Leu ile ser Leu Leu Phe cys Ile Ala 1 5 10 15 His Thr Cys Ser Ala Ser Lys Trp Gin His Gin Gin Asp Ser cys Arg 20 25 30 Lys Gin Leu Gin Gly vai Asn Leu Thr Pro Cys Glu Lys His Ile Met 35 40 45 Glu Lys Ile Gin Gly Arg Gly Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp 50 55 60 Asn His lie Leu Arg Thr Met Gly Gly Arg il e Asn Tyr Ile Arg Arg 65 70 75 80 Asn Glu Gly Lys Asp Glu Asp Glu Glu Glu Gly His Met Gin Lys cys 85 90 95 cys Thr Glu Met ser Glu Leu Arg Ser pro Lys Cys Gin cys Lys Ala 100 105 110 Leu Gin Lys Ile Met Glu Asn Gin Ser Glu Gl U Leu Glu Glu Lys Gin 115 120 125 Lys Lys Lys Met Glu Lys Glu Leu Ile Asn Leu Ala Thr Met Cys Arg 130 135 140 Phe Gly Pro Met ile Gin Cys Asp Leu ser ser Asp Asp 145 150 155 <210> 2 <211> 43

<212> PRT <213> Glycine max 72 ΕΡ 2 061 313/ΡΤ <400> 2

Ser Lys Trp Gin His Gin Gin Asp Ser Cys Arg Lys Gin Leu Gin Gly 1 5 10 15

Vai Asn Leu Thr Pro Cys Glu Lys His lie Met Glu Lys lie Gin Gly 20 25 30

Arg Gly Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp 35 40

Lisboa, 2013-09-17

Claims

ΕΡ 2 061 313/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Composição compreendendo um composto seleccionado do grupo que consiste do péptido de SEQ ID NO 2 e uma variante, fragmento ou análogo funcionalmente equivalente do referido péptido para utilização no tratamento de níveis de colesterol elevados num indivíduo.
2. Composição para o uso de acordo com a reivindicação 1 para utilização no tratamento de doença cardiovascular num indivíduo que sofre de doença cardiovascular ou que está em risco de desenvolver doença cardiovascular.
3. Composição para o uso da reivindicação 1 ou 2, em que o referido composto é obtido de soja, trigo ou cevada.
4. Composição para o uso da reivindicação 1 ou 2, em que o referido composto é obtido por produção, extracção e purificação do referido composto utilizando técnicas de ADN recombinante ou em que o referido composto é obtido por produção de polipéptido sintético.
5. Composição para o uso da reivindicação 1 ou 2, em que o referido indivíduo é um humano e especialmente em que a composição é proporcionada para ingestão oral.
6. Composição para o uso da reivindicação 1 ou 2, em que a composição está sob a forma de uma cápsula, comprimido, pó, formulação semi-sólida, líquido, gel, suspensão ou vaporização em aerossol.
7. Composição da reivindicação 1 ou 2, em que a referida composição compreende adicionalmente inibidor de quimiotripsina e/ou farinha de soja.
8. Composição da reivindicação 1 ou 2, em que o referido composto é proporcionado para administração entre 0,05 mg/kg e 50 mg/kg diariamente.
9. Composição da reivindicação 1 ou 2, em que o referido indivíduo está em risco de aterosclerose, esclerose ΕΡ 2 061 313/ΡΤ 2/2 arterial, enfarte do miocárdio, ataque cardíaco, diabetes, doença coronária, angina do peito ou angina instável. Lisboa, 2013-09-17