PT1951395E - Método para a determinação quantitativa de poloxâmeros - Google Patents

Description

1

DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DE POLOXÂMEROS"

Domínio da Invenção A invenção refere-se ao domínio da determinação analítica de um surfactante pertencente à classe de poloxâmeros numa amostra de proteína líquida.

Antecedentes da invenção

Poloxâmeros são copolímeros de bloco não iónicos de óxido de etileno (EO) e óxido de propileno (PO) . São utilizados em formulações farmacêuticas como surfactantes, agentes emulsionantes, agentes de solubilização e agentes de dispersão.

Uma abordagem analítica bem conhecida para caraterizar um poloxâmero é um método calorimétrico no qual é analisada a absorvância UV aos 32 0 e 62 0 nm resultante da formação complexa do poloxâmero com tiocianato de cobalto (II).

Yun Mao et al. (Journal of Pharmaceutical and Biomedical

Analysis, 35 (2004) 1127) descrevem, para a determinação de poloxâmeros, a utilização de cromatografia de exclusão por tamanhos (SEC) utilizando uma coluna com THF como fase móvel e deteção do índice de refração (IR) . O método foi aplicado às formulações farmacêuticas Avapro, Neurontin e Sudafed, nas quais o princípio ativo é uma "molécula pequena". Moléculas pequenas são convenientemente separáveis por SEC dos poloxâmeros de elevada massa molecular. 2 A cromatografia de exclusão por tamanhos (SEC), também denominada cromatografia de permeação em gel (GPC), emprega partículas porosas para separar moléculas de diferentes dimensões. É geralmente utilizada para separar moléculas poliméricas e para determinar pesos moleculares e distribuições de pesos moleculares de polímeros. As moléculas que são mais pequenas do que a dimensão dos poros podem entrar nas partículas e, em consequência, têm um percurso mais longo e maior tempo de trânsito do que moléculas maiores que não conseguem entrar nas partículas. Todas as moléculas maiores do que a dimensão dos poros não ficam retidas e eluem em conjunto. As moléculas que conseguem entrar nos poros terão um tempo de permanência médio nas partículas que depende da dimensão e forma das moléculas. Assim, diferentes moléculas têm diferentes tempos de trânsito total ao longo da coluna.

Até à data não foi proporcionado nenhum método que permita a determinação quantitativa de poloxâmeros em amostras de proteína, em que a proteína tem uma massa molecular que é comparável à dos poloxâmeros. É particularmente necessária a determinação quantitativa de poloxâmeros em amostras de proteína, em que a proteína tem uma massa molecular entre 5 e 70 kDa, preferivelmente entre 20 e 70 kDa.

Resumo da invenção A presente invenção refere-se a um método que permite a determinação quantitativa de um poloxâmero numa amostra de proteína, em particular uma amostra de proteína líquida, por exemplo, numa formulação farmacêutica líquida. Em particular, a invenção proporciona um método para a medição 3 quantitativa da concentração do poloxâmero numa amostra de proteína. Assim, em qualquer altura durante o tempo de vida de armazenamento de cerca de 2 anos de uma formulação proteica, a quantidade de poloxâmero na formulação pode ser determinada. A presente invenção refere-se a um método para a determinação quantitativa de um poloxâmero numa amostra de proteína líquida, que compreende os passos de sujeitar a referida amostra a: (a) um passo de separação utilizando uma coluna de cromatografia de exclusão por tamanhos; (b) um passo de eluição com uma fase móvel; e (c) opcionalmente um passo de deteção para o poloxâmero, em que a proteína tem uma massa molecular entre 5-7 0 kDa, preferivelmente entre 20-70 kDa, e em que o pH da fase móvel utilizada para o passo de eluição é ajustado para um valor inferior a 3.

Assim, a cromatografia de exclusão por tamanhos combinada com um passo de eluição com uma fase móvel como definida acima permite separar o poloxâmero dos restantes ingredientes. 0 poloxâmero é detetado no contexto de um passo adicional por análise da fase eluída, por exemplo, utilizando um sistema de deteção do IR (índice de refração).

Descrição breve da figura 4

Figura 1 mostra um cromatograma para a determinação quantitativa do Poloxâmero 188 numa formulação de hCG. Neste exemplo, a área do pico do Poloxâmero 188 situa-se a um tempo de eluição de cerca de 14-16 minutos (o tempo de retenção pode variar em função da taxa de fluxo) . A área debaixo da curva permite a quantificação do Poloxâmero 188 na amostra de hCG.

Abreviaturas

As seguintes abreviaturas são usadas na descrição da invenção: FSH: hormona estimulante do foliculo; r-FSH; r-LH; r-hCG; r-GH; r-IFN beta; r-TSH: FSH, LH, hCG, GH, IFN beta, TSH recombinantes; hFSH: FSH humana; r-hFSH: FSH humana recombinante IR: índice de Refração KD ou Kd ou kDa: quiloDalton SEC: Cromatografia de Exclusão por Tamanhos TA: Temperatura Ambiente API: água para injeção

Poloxâmero 188: sinónimo de Pluronic F68 da BASF Inc. Descrição pormenorizada da invenção A presente invenção refere-se a um método conveniente que permite a determinação quantitativa de um poloxâmero - que é um surfactante - numa amostra de proteína. A amostra de proteína é uma amostra de proteína líquida. A amostra de proteína líquida pode estar na forma de qualquer formulação líquida, preferivelmente é uma formulação farmacêutica líquida como descrito em baixo. Numa forma de realização, a referida amostra de proteína farmacêutica líquida está 5 contida num frasco, para administração de uma única ou de múltiplas doses.

Noutra forma de realização, a amostra de proteína a ser analisada é liofilizada e destina-se a ser solubilizada num solvente aquoso adequado antes de ser analisada. A invenção proporciona um método para a determinação quantitativa de um poloxâmero numa amostra de proteína líquida, que compreende os passos de sujeitar a referida amostra a: (a) um passo de separação utilizando uma coluna de cromatografia de exclusão por tamanhos; (b) um passo de eluição com uma fase móvel; e (c) opcionalmente um passo de deteção para o poloxâmero, em que a proteína tem uma massa molecular entre 5-7 0 kDa, preferivelmente entre 20-70 kDa, e em que o pH da fase móvel utilizada para o passo de eluição é ajustado para um valor inferior a 3.

Tipicamente, a coluna de exclusão por tamanhos será uma coluna de SE-HPLC.

Numa forma de realização, o poloxâmero é Poloxâmero 188. A razão entre a massa da proteína e a massa do poloxâmero respetivo pode situar-se preferivelmente entre 1:3 e 10:1, preferivelmente entre 1:2 e 7:1. 6

Exemplos de proteínas de acordo com a presente invenção incluem proteínas de mamífero, tais como, por exemplo, hormona de crescimento, incluindo hormona de crescimento humano e hormona de crescimento bovino; fator de libertação da hormona de crescimento; hormona da paratiroide; hormona estimulante da tiroide; lipoproteínas; a-I-antitripsina; cadeia de insulina A; cadeia de insulina B; proinsulina; hormona estimulante do folículo; coriogonadotropina; calcitonina; hormona luteinizante; glucagon; fatores de coagulação, como fator VIIIC, fator IX, fator tecidual, e fator de von Willebrand; fatores anticoagulantes, como Proteína C; fator natriurético atrial; surfactante pulmonar; um ativador do plasminogénio, como uroquinase ou ativador do plasminogénio do tipo tecido (t-PA); bombazina; trombina; fator de necrose tumoral alfa e beta; encefalinase; RANTES (regulada na ativação, normalmente expressa e segregada pelas células T); proteína inflamatória de macrófagos humanos (MIP-I-alfa); albumina do soro, como albumina do soro humano; substância inibidora mulleriana; cadeia da relaxina A; cadeia da relaxina B; pró-relaxina; péptido associado a gonadotropina de ratinho; Dnase; inibina; activina; fator de crescimento vascular endotelial (VEGF); recetores de hormonas ou fatores de crescimento; uma integrina; proteína A ou D; fatores reumatoides; um fator neurotrófico, como fator neurotrófico derivado do osso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5, ou -6 (NT-3, NT-4, NT-5, ou NT-6), ou um fator de crescimento dos nervos, como NGF-P; fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF); fator de crescimento de fibroblastos, como aFGF e bFGF, em particular FGF-18; fator de crescimento epidérmico (EGF); fator de transformação do crescimento (TGF) , como TGF-alfa e TGF-beta, incluindo TGF-betal, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4, ou TGF-beta5; fator 7 de crescimento do tipo insulina I e II (IGF-I e IGF-II); des (1-3)-IGF-1 (IGF-I do cérebro); proteínas de ligação do fator de crescimento do tipo insulina; proteínas CD, como CD3, CD4, CD8, CD19 e CD20; eritropoietina (EPO) ; trombopoietina (TPO); fatores osteoindutores; osteopontina; imunotoxinas; uma proteína morfogenética do osso (BMP); um interferão, como interferão alfa, beta, e gama; fatores estimuladores de colónias (CSFs), por exemplo, M-CSF, GM-CSF, e G-CSF; interleuquinas (ILs), por exemplo, IL-1 até IL-10; superóxido dismutase; recetores de células T; proteínas membranares de superfície; fator de aceleração do decaimento (DAF); um antigénio virai, tal como, por exemplo, uma porção do envelope de SIDA; proteínas de transporte; recetores de endereçamento; adressinas; proteínas reguladoras; imunoadesinas; anticorpos; e fragmentos ou variantes biologicamente ativas de quaisquer dos polipéptidos acima listados.

Preferivelmente, a proteína de acordo com a presente invenção é selecionada de hormona estimulante do folículo (FSH), coriogonadotropina (CG), hormona luteinizante (LH), Interferão beta (IFN-beta), Interferão beta peguilado (PEG-IFN-beta), hormona de crescimento (GH), hormona estimulante da tiroide (TSH), fator de crescimento de fibroblastos 18 (FGF-18) ou osteopontina. A FSH, CG, LH e TSH são glicoproteínas que caiem na classe das gonadotrofinas. As gonadotrofinas são utilizadas no tratamento de infertilidade. 0 IFN-beta é uma glicoproteína que cai na classe das interleuquinas. 0 IFN-beta é utilizado no tratamento de esclerose múltipla. 8 0 PEG-IFN-beta é um IFN-beta derivatizado por uma cadeia de polietilenoglicol, que confere estabilidade melhorada. A hormona de crescimento é uma proteína não glicosilada. É utilizada para tratar deficiências de hormona de crescimento em crianças ou adultos. 0 FGF-18 é utilizado no tratamento de osteoartrite. A osteopontina é um polipéptido de cadeia simples glicosilado.

Numa forma de realização preferida, a referida proteína é um heterodímero, como as gonadotropinas (FSH, LH, CG, TSH, bem como variantes). Noutra forma de realização, a proteína é Hormona de Crescimento (GH) ou interferão beta (IFN-beta ou variantes, por exemplo, variantes peguiladas). Ainda noutra forma de realização, a proteína é FGF-18 ou osteopontina.

Numa forma de realização preferida, a amostra de proteína líquida inclui uma ou mais proteínas terapêuticas. Preferivelmente, essa amostra não inclui um agente terapêutico não proteico, como um composto químico de pequeno peso molecular. A hormona estimulante do folículo, ou FSH, como usado aqui, refere-se à FSH produzida como uma proteína madura completa que inclui, mas não está limitada à FSH humana ou "hFSH", seja produzida de modo recombinante ou isolada de fontes humanas, como a urina de mulheres na pós-menopausa. 9 0 método é aplicável a proteínas naturais e recombinantes. Numa forma de realização, a formulação de proteína consiste em FSH, LH, CG, TSH, GH ou IFN-beta recombinante. A hormona estimulante do folículo (FSH) é uma glicoproteína que cai na classe das gonadotrofinas. A FSH é utilizada no tratamento de infertilidade e perturbações reprodutoras em pacientes femininos e masculinos, por exemplo, para induzir espermatogénese em homens que sofrem de oligospermia. A Hormona Luteinizante (LH) é uma gonadotropina segregada pelo lobo anterior da pituitária. A LH é utilizada em pacientes femininos em combinação com a FSH na 01 (indução da ovulação) e na COH (hiperestimulação ovariana controlada), particularmente naqueles pacientes com níveis muito baixos de LH endógena ou resistência à LH, como mulheres que sofrem de hipogonadismo hipogonadotrófico (HH, grupo I da OMS) ou pacientes mais velhos (isto é, com 35 anos ou mais), e pacientes nos quais a implantação de embriões ou parto prematuro é um problema. A Gonadotropina coriónica (CG) é uma gonadotropina produzida pela placenta e obtida da urina de mulheres grávidas. A CG atua no mesmo recetor da LH e induz as mesmas respostas. A CG tem um tempo de semivida em circulação mais longo do que a LH e, assim, é habitualmente utilizada como fonte de atuação prolongada de atividade de LH. A CG é utilizada em regimes de 01 e COH para imitar o pico natural da LH e desencadear ovulação. Uma injeção de gonadotrofina coriónica humana (hCG) é utilizada para desencadear ovulação no final da estimulação com FSH ou uma mistura de FSH e LH. A CG também pode ser utilizada conjuntamente com a FSH durante a estimulação para 01 e 10 COH, para proporcionar atividade de LH durante a estimulação em pacientes nos quais é desejável atividade de LH, como os mencionados acima. A FSH, LH e CG são membros da família de hormonas glicoproteicas heterodiméricas que também inclui a hormona estimulante da tiroide (TSH). Os membros desta família são heterodímeros, compreendendo uma subunidade a e uma β. As subunidades são mantidas em conjunto por interações não covalentes. O heterodímero da FSH humana (hFSH) consiste (i) numa subunidade alfa glicoproteica madura de 92 aminoácidos, que também é comum aos outros membros da família humana (isto é, gonadotrofina coriónica ("CG")/ hormona luteinizante ("LH") e hormona estimulante da tiroide ("TSH")); e (ii) numa subunidade beta madura de 111 aminoácidos que é única da FSH. O heterodímero da LH humana consiste (i) na subunidade alfa glicoproteica madura de 92 aminoácidos; e (ii) numa subunidade beta madura 112 que é única da LH. As subunidades alfa e beta das glicoproteínas podem ser propensas a sofrer dissociação em formulações, devido à interação com um conservante, surfactante e outros excipientes. A dissociação das subunidades conduz a perda de potência biológica. A FSH é formulada para injeção intramuscular (IM) ou subcutânea (SC) . Numa forma de realização, a FSH é fornecida em forma liofilizada (sólida) em frascos ou ampolas de 75 IU/frasco e 150 IU/frasco, com um tempo de vida de armazenamento de um ano e meio até dois anos quando armazenada a 2-25°C. Forma-se uma solução para injeção por reconstituição do produto liofilizado com água para injeção (API) . Adicionalmente, está disponível uma formulação de FSH líquida (Gonal-F pen) contendo 22 pg/0,5 mL, 33 pg/0,75 11 mL ou 66 μg/l,5 mL de FSH, bem como Poloxâmero 188, sacarose, tampão, metionina e m-cresol.

Assim, a FSH tem sido formulada em formatos líquidos de dose única e múltiplas doses, em frascos ou ampolas. Os formatos de dose única devem permanecer estáveis e potentes por armazenamento antes da utilização. Os formatos de múltiplas doses não só devem permanecer estáveis e potentes por armazenamento antes da utilização, mas também devem permanecer estáveis, potentes e relativamente livres de bactérias durante o período de administração do regime de utilização de múltiplas doses, depois de comprometido o selo da ampola. Por este motivo, formatos de múltiplas doses habitualmente contêm um agente bacteriostático, por exemplo, álcool benzílico ou m-cresol. A LH é formulada para injeção intramuscular (IM) ou subcutânea (SC) A LH é fornecida em forma liofilizada (sólida) em frascos ou ampolas de 75 IU/frasco, com um tempo de vida por armazenamento de um ano e meio até dois anos quando armazenada a 2-25°C. Forma-se uma solução para injeção por reconstituição do produto liofilizado com água para injeção (API) . Luveris™ contém, para além da LH, os excipientes seguintes: sacarose, tampão, Polissorbato 20, metionina. Mais recentemente, foram descritas formulações de LH contendo Poloxâmero 188 (WO 2004/087213).

Composições farmacêuticas líquidas contendo hCG também estão presentes no mercado, por exemplo, Ovitrelle™ contendo manitol, num tampão de fosfato a pH 7, metionina, Poloxâmero 188. 12

Pretende-se que a expressão "variante" abranja aquelas moléculas que diferem, na sequência de aminoácidos, padrão de glicosilação ou ligação inter-subunidades, da FSH, LH, CG, TSH, IFN-beta ou GH humanas mas que exibem a correspondente atividade biológica da FSH, LH, CG, TSH, IFN-beta ou GH. Exemplos incluem CTP-FSH, uma FSH recombinante modificada de atuação prolongada, que consiste na subunidade α de tipo selvagem e uma subunidade β híbrida na qual o péptido carboxi-terminal da hCG foi fundido ao terminal C da subunidade β da FSH, como descrito em LaPolt et ai.; Endocrinology; 1992, 131, 2514-2520; ou Klein et ai.; "Development and characterization of a long-acting r-hFSH agonist"; Human Reprod. 2003, 1_8, 50-56]. Também está incluída CTP-FSH de cadeia simples, uma molécula de cadeia simples que consiste nas sequências seguintes (do terminal N para o terminal C): 12 βΕΞΗ phCG-CTP(113-145)

cxFSH em que βΓΞΗ significa a subunidade β da FSH, βΙιΟΰ CTP (113— 145) significa o péptido carboxi-terminal da hCG e aFSH significa a subunidade α da FSH, como descrito por Klein et ai. ("Pharmacokinetics and pharmacodynamics of single-chain recombinant human follicle-stimulating hormone containing the human chorionic gonadotrophin carboxyterminal peptide in the rhesus monkey"; Fertility & Sterility; 2002, 77, 1248-1255). Outros exemplos de variantes da FSH incluem moléculas de FSH possuindo sítios de glicosilação adicionais incorporados na subunidade α e/ou β, como divulgado em WO 01/58493 (Maxygen), particularmente como divulgado nas reivindicações 10 e 11 de WO 01/58493, e moléculas de FSH com ligações S-S inter-subunidades, como divulgado em WO 98/58957. 13

As variantes da FSH referidas aqui também incluem as deleções no carboxi-terminais da subunidade beta que são mais curtas do que a proteína FSH madura completa. Heterodímeros da FSH ou heterodímeros de variantes da FSH podem ser produzidos por qualquer método adequado, tal como por via recombinante, por isolamento ou purificação de fontes naturais, consoante o caso, ou por síntese química, ou qualquer combinação destes. "Variantes" também compreende formas peguiladas das proteínas. A utilização do termo "recombinante" refere-se a preparações de FSH, LH, CG, TSH, GH, IFN beta ou variantes que são produzidas utilizando tecnologia de DNA recombinante (ver, por exemplo, WO 85/01958). Um exemplo de um método de expressão de FSH ou LH utilizando tecnologia recombinante consiste na transfeção de células eucarióticas com as sequências de DNA que codificam uma subunidade alfa e uma beta da FSH ou LH, proporcionadas num vetor ou em dois vetores com cada subunidade tendo um promotor separado, como descrito nas patentes europeias n°s EP 0 211 894 e EP 0 487 512. Outro exemplo da utilização de tecnologia recombinante para produzir FSH ou LH consiste na utilização de recombinação homóloga para inserir um segmento regulador heterólogo em conexão operativa com sequências endógenas que codificam as subunidades da FSH ou LH, como descrito na patente europeia n° EP 0 505 500 (Applied Research Systems ARS Holding NV). A FSH ou variante da FSH utilizada de acordo com a presente invenção pode ser produzida não só por meios recombinantes, incluindo a partir de células de mamífero, mas também pode 14 ser purificada de outras fontes biológicas, como de fontes urinárias. Metodologias aceitáveis incluem as descritas em Hakola, K. Molecular and Cellular Endocrinology, 127: 59-69, 1997/ Keene, et al., J. Biol. Chem., 264: 4769-4775, 1989; Cerpa-Poljak, et al. , Endocrinology, 132: 351-356, 1993; Dias, et al., J. Biol. Chem., 269: 25289-25294, 1994; Flack, et al., J. Biol. Chem., 269: 14015-14020, 1994; e Valove, et al. , Endocrinology, 135: 2657-2661, 1994, Patente U.S. 3,119,740 e Patente US n° 5,767,067. A hormona luteinizante, ou LH, como usado aqui, refere-se à LH produzida na forma de uma proteína madura completa, que inclui mas não está limitada a LH humana, seja produzida de modo recombinante ou isolada de fontes humanas, como a urina de mulheres na pós-menopausa. A sequência proteica da subunidade alfa da glicoproteína humana está apresentada na SEQ ID NO: 1, e a sequência proteica da subunidade beta da LH humana está apresentada na SEQ ID NO: 6. Numa forma de realização preferida, a LH é recombinante.

Pretende-se que a expressão "variante da LH" abranja aquelas moléculas que diferem da LH humana na sequência de aminoácidos, padrão de glicosilação ou ligação inter-subunidades, mas que exibem atividade de LH.

Heterodímeros da LH ou heterodimeros de variantes da LH podem ser produzidos por qualquer método adequado, tal como de modo recombinante, por isolamento ou purificação de fontes naturais, consoante o caso, ou por síntese química, ou qualquer combinação destes. 15

As amostras de proteína líquida da presente invenção também compreendem misturas de FSH/LH e variantes (WO 2004/087213) bem como FSH e hCG e variantes (WO 2004/105788). O termo "diluente aquoso" refere-se a um solvente líquido que contém água. Sistemas solventes aquosos podem consistir apenas em água, ou podem consistir em água mais um ou mais solventes miscíveis, e podem conter solutos dissolvidos, como açúcares, tampões, sais ou outros excipientes. Os solventes não aquosos mais habitualmente utilizados são os álcoois orgânicos de cadeia curta, tais como metanol, etanol, propanol, cetonas de cadeia curta, como acetona, e poliálcoois, como glicerol. O termo "bacteriostático" ou "agente bacteriostático" refere-se a um composto ou composições adicionadas a uma formulação para atuarem como agente antibacteriano. Uma formulação conservada contendo FSH ou variante da FSH ou FSH e LH da presente invenção preferivelmente cumpre diretrizes estatutárias ou regulamentadoras quanto à eficácia conservante de modo a ser um produto multiusos comercialmente viável, preferivelmente em humanos. Exemplos de bacteriostáticos incluem fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo e afins), cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio, desidroacetato de sódio e timerosal. O termo "tampão" ou "tampão fisiologicamente aceitável" refere-se a soluções de compostos que é conhecido serem seguras para utilização farmacêutica ou veterinária em formulações e que têm o efeito de manter ou controlar o pH da formulação na gama de pH desejada para a formulação. 16

Tampões aceitáveis para controlo do pH a um pH moderadamente acidico até um pH moderadamente básico incluem mas não estão limitadas a compostos tais como fosfato, acetato, citrato, arginina, TRIS e histidina. "TRIS" refere-se a 2-amino-2-hidroximetil-l,3-propanodiol, e a qualquer respetivo sal farmacologicamente aceitável. Tampões preferíveis são tampões de fosfato com solução salina ou um sal aceitável. 0 termo "tampão de fosfato" refere-se a soluções contendo ácido fosfórico ou respetivos sais, ajustadas para um pH desejado. Em geral, tampões de fosfato são preparados a partir de ácido fosfórico, ou um sal do ácido fosfórico, incluindo mas não se limitando a sais de sódio e potássio. São conhecidos na área vários sais do ácido fosfórico, como sais monobásicos, dibásicos e tribásicos de sódio e potássio do ácido. Também é conhecido que sais do ácido fosfórico ocorrem na forma de hidratos do sal ocorrente. Tampões de fosfato podem abranger uma gama de pHs, tal como desde cerca de pH 4 até cerca de pH 10, e gamas preferidas desde cerca de pH 5 até cerca de pH 9, e uma gama muito preferida de cerca de 6,0 ou perto deste até cerca de 8,0 ou perto deste, muito preferivelmente a pH 7,0 ou perto deste. O termo "frasco" refere-se de modo lato a um reservatório adequado para reter FSH em forma sólida ou líquida num estado esterilizado contido. Exemplos de um frasco usado aqui incluem ampolas, cartuchos, embalagens alveolares ou outro reservatório semelhante adequado para distribuição da FSH ao paciente via seringa, bomba (incluindo osmótica), cateter, emplastro transdérmico, pulverização pulmonar ou transmucosa. Frascos adequados para o embalamento de 17 produtos para administração parentérica, pulmonar, transmucosa ou transdérmica são bem conhecidos e reconhecidos na área.

Pretende-se que a expressão "utilização multidoses" inclua a utilização de um único frasco, ampola ou cartucho de uma formulação de FSH ou uma formulação da proteína para mais do que uma injeção, por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais injeções. As injeções são preferivelmente realizadas ao longo de um período de pelo menos ou cerca de 12 horas, 24 horas, 48 horas, etc., preferivelmente até um período de ou cerca de 12 dias. As injeções podem ser espaçadas no tempo, por exemplo, por um período de 6, 12, 24, 48 ou 72 horas. 0 termo "estabilidade" refere-se à estabilidade física, química e conformacional da proteína determinada nas formulações da presente invenção (incluindo manutenção da potência biológica). A instabilidade de uma formulação de proteína pode ser causada por degradação química ou agregação das moléculas de proteína para formar polímeros de ordem superior, por dissociação dos heterodímeros em monómeros, desglicosilação, modificação da glicosilação, oxidação (particularmente em heterodímeros da subunidade a) ou qualquer outra modificação estrutural que reduza pelo menos uma atividade biológica de um polipéptido incluído na presente invenção.

Uma solução ou formulação "estável" é tal que o grau de degradação, modificação, agregação, perda de atividade biológica e afins das proteínas aí contidas é controlado de modo aceitável e não aumenta inaceitavelmente ao longo do tempo. Preferivelmente, a formulação retém pelo menos ou 18 cerca de 80% da atividade da proteína rotulada durante um período até 2 anos. O problema subjacente à presente invenção consiste em proporcionar um método conveniente e rápido para determinar a quantidade de um poloxâmero numa amostra de proteína. Um poloxâmero pode ser utilizado como um surfactante e é selecionado de copolímeros de bloco de óxido de etileno e óxido de propileno, preferivelmente Pluronic® F77, Pluronic F87, Pluronic F88 e Pluronic® F68, em particular e preferivelmente Pluronic F68 (BASF, o Pluronic F68 também é conhecido como Poloxâmero 188).

Como mencionado acima, formulações farmacêuticas devem ter um tempo de vida por armazenamento de até 2 anos a uma temperatura de armazenamento de 2-25°C. Isto implica ser esperado que a formulação permaneça estável durante este tempo. Uma vez que formulações líquidas contêm vários excipientes que podem afetar diretamente ou, via decomposição, indiretamente a estabilidade da formulação de proteína, é necessário dispor das ferramentas analíticas para avaliar a referida estabilidade da formulação.

Mais especificamente, surfactantes de poloxâmeros são copolímeros de bloco de óxido de etileno (EO) e óxido de propileno (PO) . O bloco de óxido de propileno (PO) fica ensanduichado entre dois blocos de óxido de etileno (EO).

H0-tCH£CHp}s.(CH/H05^{CHíCH20)si.H

Os poloxâmeros são sintetizados num processo em dois passos: 19 • Um hidrófobo com o peso molecular desejado é criado pela adição controlada de óxido de propileno aos dois grupos hidroxilo do propilenoglicol; e • Adiciona-se óxido de etileno para ensanduichar o hidrófobo entre grupos hidrófilos.

Os surfactantes de poloxâmero também são conhecidos como Pluronics.

No Pluronic® F77, (hidrófilo) é 70%, (polioxipropileno) é a percentagem de polioxietileno e o peso molecular do hidrófobo aproximadamente 2,306 Da.

No Pluronic F87, a percentagem de polioxietileno (hidrófilo) é 70%, e o peso molecular do hidrófobo (polioxipropileno) é aproximadamente 2,644 Da.

No Pluronic F88, a percentagem de polioxietileno (hidrófilo) é 80%, e o peso molecular do hidrófobo (polioxipropileno) é aproximadamente 2,644 Da.

No Pluronic F68, a percentagem de polioxietileno (hidrófilo) é 80%, e o peso molecular do hidrófobo (polioxipropileno) é aproximadamente 1,967 Da.

Propriedades típicas do Pluronic F77 estão listadas em baixo:

Peso Molecular Médio: 6600;

Ponto de fusão/escoamento: 48°C; Forma física Θ 20°C: sólido; 20

Viscosidade (Brookfield) cps: 480 [líquidos a 25°C, pastas a 60°C e sólidos a 77°C];

Tensão superficial, dynes/cm @ 25°C; 0,1 % Cone.: 47,0 0,01 % Cone.: 49,3 0,001 % Cone.: 52,8

Tensão interfacial, dynes/cm @ 25°C vs. Nujol; 0,1 % Cone.: 17,7 0,01 % Cone.: 20,8 0,01 % Cone.: 25,5

Humedecimento de Draves, Segundos 25°C 1,0% Cone.: >360 0,1 % Cone.: >360 Altura da Espuma

Ross Miles, 0,1 %, mm @ 50°C: 100 Ross Miles, 0,1 %, mm @ 2 6°C: 47 Dinâmica, 0, 1 %, mm @ 400 mL/ min:

Ponto de turvação em solução aquosa, °C 1 % Cone.: > 100 10% Cone.: > 100 HLB (equilíbrio hidrófilo-lipófilo): 25

Propriedades típicas do Pluronic F87 estão listadas em baixo:

Peso Molecular Médio: 7700;

Ponto de fusão/escoamento: 49°C;

Forma física @ 20°C: sólido;

Viscosidade (Brookfield) cps: 700 [líquidos a 25°C, pastas a 60°C e sólidos a 77°C];

Tensão superficial, dynes/cm @ 25°C; 0,1 % Cone.: 44,0 0,01 % Cone.: 47,0 21 0,001 % Cone.: 50,2

Tensão interfacial, dynes/cm @ 25°C vs Nujol; \—1 o % Cone.: 17, 4 0, 01 % Cone.: 20 ,3 0, 01 % Cone.: 23 ,3 Humedecimento de Draves, Segundos 25 1,0% Cone.: >360 \—1 O % Cone.: >360 Altura da Espuma Ross Miles, 0,1 %, mm @ 50°C: 80 Ross Miles, 0,1 %, mm @ 26°C: 37 Dinâmica, 0,1 %, mm @ 400 mL/min

Ponto de turvação em solução aquosa, °C 1 % Cone.: > 100 10% Cone.: > 100 HLB (equilíbrio hidrófilo-lipófilo): 24

Propriedades típicas do Pluronic F88 estão listadas em baixo:

Peso Molecular Médio: 11400;

Ponto de fusão/escoamento: 54°C;

Forma física @ 20°C: sólido;

Viscosidade (Brookfield) cps: 2300 [líquidos a 25°C, pastas a 60°C e sólidos a 77°C];

Tensão superficial, dynes/cm @ 25°C; 0,1 % Cone.: 48,5 0,01 % Cone.: 52,6 0,001 % Cone.: 55,7

Tensão interfacial, dynes/cm @ 25°C vs Nujol; 0,1 % Cone. : 20,5 0,01 % Cone.: 23,3 0,01 % Cone.: 27,0 22

Humedecimento de Draves, Segundos 25°C 1,0% Cone.: >360 0,1 % Cone.: >360 Altura da Espuma

Ross Miles, 0,1 %, mm @ O co o o o LO Ross Miles, 0,1 %, mm @ 2 6°C: 37 Dinâmica, 0, 1 %, mm @ 400 mL/min

Ponto de turvação em solução aquosa, °C 1 % Cone: > 100 10% Cone.: >100 HLB (equilíbrio hidrófilo-lipófilo): 28

Propriedades típicas do Pluronic F68 estão listadas em baixo:

Peso Molecular Médio: 8400;

Ponto de fusão/escoamento: 52°C;

Forma física @ 20°C: sólido;

Viscosidade (Brookfield) cps: 1000 [líquidos a 25°C, pastas a 60°C e sólidos a 77°C];

Tensão superficial, dynes/cm @ 25°C; 0,1 % Cone. : 50,3 0,01 % Cone.: 51,2 0,001 % Cone.: 53,6

Tensão interfacial, dynes/cm Θ 25°C vs Nujol; 0,1 % Cone. : 19,8 0,01 % Cone.: 24,0 0,01 % Cone. : 2 6,0

Humedecimento de Draves, Segundos 25°C 1,0% Cone.: >360 0,1 % Cone.: >360

Altura da Espuma

Ross Miles, 0,1 %, mm @ 50°C: 35 23

Ross Miles, 0,1 %, mm @ 26°C: 40 Dinâmica, 0,1 %, mm @ 400 mL/min: > 600 Ponto de turvação em solução aquosa, °C 1 % Cone.: >100 10% Cone.: > 100 HLB (equilíbrio hidrófilo-lipófilo): 29

Outros polímeros de poloxâmeros com propriedades semelhantes às listadas acima também podem ser utilizados nas formulações da invenção. 0 surfactante de poloxâmero preferido presente nas formulações de proteína que são analisadas com o presente método é Pluronic F68 (= Poloxâmero 188).

Preferivelmente, a concentração de Pluronic, particularmente Pluronic F68, em formulações de proteínas líquidas é igual ou cerca de 0,01 mg/mL até igual ou cerca de 1 mg/mL, mais preferivelmente igual ou cerca de 0,05 mg/mL até igual ou cerca de 0,5 mg/mL, mais em particular e preferivelmente igual ou cerca de 0,2 mg/mL até igual ou cerca de 0,4 mg/mL, muito preferivelmente igual ou cerca de 0,1 mg/mL.

As formulações de proteína analisadas de acordo com o método da presente invenção têm um pH entre igual ou cerca de 6,0 e igual ou cerca de 8,0, mais preferivelmente igual ou cerca de 6,8 até igual ou cerca de 7,8, incluindo cerca de pH 7,0, pH 7,2, e 7,4. Um tampão preferido é fosfato, e contraiões preferidos são iões sódio ou potássio. Tampões de solução salina com fosfato são bem conhecidos na área, tais como solução salina tamponada com Fosfato de Dulbecco. As concentrações de tampão na solução total podem variar entre igual ou cerca de 5 Mm, 9,5 Mm, 10 Mm, 50 Mm, 100 Mm, 24 150 Mm, 200 Mm, 250 Mm, e 500 Mm. Preferivelmente, a concentração de tampão é igual ou cerca de 10 Mm. É particularmente preferido um tampão 10 Mm em iões fosfato com um pH de 7,0.

Preferivelmente, as formulações de FSH analisadas de acordo com o método da presente invenção têm pH entre igual ou cerca de 6,0 e igual ou cerca de 8,0, mais preferivelmente igual ou cerca de 6,8 até igual ou cerca de 7,8, incluindo cerca de pH 7,0, pH 7,2, e 7,4. Um tampão preferido é fosfato, e contraiões preferidos são iões sódio ou potássio.

Preferivelmente, as formulações de misturas de FSH e LH analisadas de acordo com o método da presente invenção têm pH entre igual ou cerca de 6,0 e igual ou cerca de 9,0, mais preferivelmente igual ou cerca de 6,8 até igual ou cerca de 8,5, incluindo cerca de pH 7,0, pH 8,0, e 8,2, muito preferivelmente igual ou cerca de pH 8,0.

Preferivelmente, as formulações de hCG analisadas de acordo com o método da presente invenção têm pH entre igual ou cerca de 6,0 e igual ou cerca de 8,0, mais preferivelmente igual ou cerca de 6,8 até igual ou cerca de 7,8, incluindo cerca de pH 7,0, pH 7,2, e 7,4. A amostra de proteína é preferivelmente uma formulação liquida para administração de uma única dose ou múltiplas doses. Formulações líquidas da invenção destinadas a utilização de múltiplas doses compreendem preferivelmente um bacteriostático, como fenol, m-cresol, p-cresol, o-cresol, clorocresol, álcool benzílico, alquilparabeno (metilo, etilo, propilo, butilo e afins) , timol, cloreto de 25 benzalcónio, cloreto de benzetónio, desidroacetato de sódio e timerosal. São particularmente preferidos fenol, álcool benzilico e m-cresol, são mais preferidos fenol e m-cresol, é muito preferido m-cresol. 0 agente bacteriostático é usado numa quantidade que irá originar uma concentração que é eficaz para manter a formulação essencialmente livre de bactérias (adequada para injeção) ao longo do período de injeção de múltiplas doses, que pode ser igual ou cerca de 12 ou 24 horas até igual ou cerca de 12 ou 14 dias, preferivelmente igual ou cerca de 6 até igual ou cerca de 12 dias. 0 bacteriostático está preferivelmente presente numa concentração de igual ou cerca de 0,1 % (massa do bacteriostático/massa do solvente) até igual ou cerca de 2,0%, mais preferivelmente igual ou cerca de 0,2% até igual ou cerca de 1,0%. No caso do álcool benzilico, é particularmente preferida uma concentração de 0,9%). No caso do fenol, é particularmente preferido igual ou cerca de 0,5%. No caso do m-cresol, é particularmente preferida uma concentração de igual ou cerca de 0,3 % (por exemplo, igual ou cerca de 3 mg/mL em API).

Colunas de Exclusão por Tamanhos são bem conhecidas do profissional. São escolhidas de acordo com a respetiva proteína e poloxâmero presentes na amostra. O gel da coluna deve ser uma matriz de base polimérica. Uma coluna preferida é uma coluna de SE-HPLC com a designação TSK G3000PW da TosoHaas Inc. As esférulas da matriz têm uma dimensão das partículas 10 ou 17 pm, uma dimensão dos poros de cerca de 200 Â. A coluna está disponível no mercado. 0 passo de deteção pode ser realizado com qualquer um dos sistemas de deteção do IR, que são conhecidos do profissional. 26

Verificou-se que, em condições mais acidicas, o poloxâmero pôde ser separado mais facilmente das proteínas.

Assim, a fase móvel utilizada no método de acordo com a presente invenção é um solvente aquoso, como água ou uma solução tamponada.

De acordo com a invenção, a fase móvel é ajustada para um pH menor do que 3, mais preferivelmente entre cerca de 1,6-2,0 e muito preferivelmente entre 1,9-2,0. Numa forma de realização, a proteína é um heterodímero, como FSH, CG, LH ou TSH. Em condições acidicas, uma proteína heterodimérica tende a decompor-se nas suas subunidades que migram mais facilmente, desse modo aperfeiçoando o passo de separação e deteção (resolução). Agentes acídicos adequados para ajustar o pH podem ser selecionados pelo profissional. O ácido mais preferido é ácido trifluoroacético (TFA).

Tipicamente, as amostras a serem avaliadas são preparadas e injetadas na coluna. Tomando em atenção o índice de refração no passo de deteção do método obtém-se um cromatograma contendo uma área de pico para o poloxâmero, bem como pelo menos um pico adicional para a(s) proteína(s) e excipientes. A avaliação da área de pico permite a quantificação do poloxâmero presente na amostra analisada. A quantificação é permitida uma vez que é preparada uma curva padrão com poloxâmeros (ver Exemplos).

EXEMPLOS A presente invenção será agora ilustrada através de exemplos. 27 EXEMPLO 1 (ver Figura 1) A finalidade deste Exemplo foi analisar a concentração do Poloxâmero 188 numa amostra da formulação de hCG liquida disponível no mercado Ovitrelle™ após 18 meses de armazenamento à temperatura ambiente. Assim, avaliou-se a estabilidade da formulação líquida relativamente ao Poloxâmero 188. A concentração do Poloxâmero 188 na altura da preparação era cerca de 100 mcg/mL. O protocolo para a quantificação do Poloxâmero 188 em Ovitrelle™ foi o seguinte. O injetável líquido Ovitrelle™ continha os ingredientes seguintes:

Coriogonadotropina alfa, manitol, L-metionina, Poloxâmero 188, ácido fosfórico, NaOH e água. 1. Equipamento e Materiais

Fornecedor HPLC ALLIANCE mod. 269 Waters Detetor IR mod. 2414 Waters "Software" Empower Waters Computador pessoal IBM (ou equiv.) Poloxâmero 188 - Lutrol F68 cód. 010293- 1 BASF Ácido trifluoroacético (TFA) cód. 9470 J.T. Baker (10 x 1 mL) Coluna analítica TSKgel G3000 PWxI cód. 08021 TOSOH D(-)Manitol cód. 1.05983 MERCK L-Metionina cód. 1.05707 MERCK Ácido Orto-Fosfórico 85% cód. 1.00573 MERCK Hidróxido de Sódio 50% cód. 7067 J.T. Baker Etanol qualidade de gradiente cód. 1.11727 MERCK Seringas Ovitrelle - formulação líquida de hCG 250 mcg SERONO 2. Procedimento 28 2.1 Eluente A (H20 / TFA 0,5%) A 950 mL de água purificada, num cilindro graduado de 1 litro, adicionaram-se 5 mL de ácido trifluoroacético (TFA) e perfez-se o volume, sob agitação, para 1000 mL. O pH do eluente situou-se entre 1,7 e 1,9. 2.2 Eluente B (Etanol a 20%) A 750 mL de água purificada, num cilindro graduado de 1 litro, adicionaram-se 200 mL de Etanol e perfez-se o volume, sob agitação, para 1000 mL. 2.3 Solução de lavagem para dispositivo de autoamostragem (Metanol a 10%) A 850 mL de água purificada, num cilindro graduado de 1 litro, adicionaram-se 100 mL de metanol e perfez-se o volume, sob agitação, para 1000 mL. 2.4 Solvente para lavagem de selagens (Metanol a 5%) A 900 mL de água purificada, num cilindro graduado de 1 litro, adicionaram-se 50 mL de metanol e perfez-se o volume, sob agitação, para 1000 mL. 2.5 Solução de diluição para curva padrão (formulação líquida sem Poloxâmero 188) A 850 mL de água purificada, num cilindro graduado de 1 litro, adicionaram-se 54,6 g de D(-) Manitol, 0,98 g de Ácido Orto-Fosfórico 85% e 200 mcg de L-Metionina. Ajustou-se a solução para pH 7,0 por adição gota-a-gota de Hidróxido de Sódio a 50%, e perfez-se o volume para 1 mL. A solução foi filtrada num filtro de 0,45 pm.

Em alternativa, pode utilizar-se água como solução de diluição para a curva padrão. 29 2.6 Solução concentrada para a curva padrão

Dissolveram-se 200 mg de Poloxâmero 188 em 80 mL de água purificada, num cilindro graduado de 100 mL, e perfez-se o volume para 100 mL. A curva padrão foi preparada com base na concentração esperada nas amostras a analisar. Neste Exemplo, era esperada uma concentração de Poloxâmero 188 de cerca de 100 mcg/mL no injetável liquido Ovitrelle™; assim, a curva padrão situou-se no intervalo de 50-160 mcg/mL. 3 Preparação de amostras Ensaio em branco

Injetaram-se 0,05 mL de solução de diluição para curva padrão.

Amostras

Todas as amostras foram testadas sem qualquer pré-tratamento e injetaram-se 0,05 mL. 4. Condições Operacionais 4.1. Montagem dos instrumentos

As soluções seguintes foram conetadas às linhas de HPLC:

Linha A: Eluente A (H20 / TFA 0,5%)

Linha B: Eluente B (Etanol a 20%)

As linhas A e B foram cheias, o sistema foi purgado e enxaguado a uma taxa de fluxo de 2 mL/minuto durante 3 minutos. O desgaseificador em direto, se presente, foi ligado. Antes da análise, a válvula do solenoide do Detetor de IR do fluxo foi ligada no modo de purga durante pelo menos 30 minutos com a linha A. Efetuou-se a purga da célula de fluxo para inserir sob pressão fase móvel fresca no lado de referência da célula. 30

Conexão da coluna aos instrumentos e entrada dos parâmetros seguintes: • Temperatura do Detetor de IR: 30°C • Temperatura da coluna: +20 ± 5°C • Taxa de fluxo da coluna: 0,5 mL/minuto • Taxa de fluxo de Hélio: 20 mL/minuto (no caso do desgaseificador não estar ligado) • Temperatura do dispositivo

de autoamostragem: + 4°C • Circuito fechado de autoamostragem: 2 0 mcL • Dimensão da seringa: 250 mcL • Duração da análise: 40 minutos • Injeção seguinte: 5 minutos 4.2 Equilibração da coluna A coluna foi limpa sob pressão com eluente A, para equilibrar a coluna. A equilibração a referência ficou estável. ficou completada quando 4.3 Coluna de armazenamento

Depois de completada a análise, a coluna foi enxaguada com pelo menos 30 mL de água purificada, seguida de 30 mL de etanol a 20%. 4.4 Determinação da concentração de Poloxâmero 188 nas amostras de Ovitrelle O modelo utilizado para calcular a concentração de Poloxâmero 188 nas amostras de Ovitrelle foi a regressão linear. 31

Em que: Y = Área total do Poloxâmero 188 a = Ordenada na origem b = Valor do declive x = Concentração de Poloxâmero 188 em pg/mL injetados. A amostra foi integrada como mostrado na Fig. 1. A ordenada na origem (a) e o declive (b) da curva padrão foram calculados, a regressão linear foi calculada pelo "software" Statgraphics plus.

Aplicou-se a fórmula seguinte para calcular a concentração de Poloxâmero 188. n — 3Γ_^ *FD (FD = Fator de Diluição) Equação 1 ^-'Poloxâmero 188 , b A solução da equação 1 dá a concentração de Poloxâmero 188 em cada uma das amostras de Ovitrelle, expressa em pg/mL. A concentração de Poloxâmero encontrada nas amostras deste Exemplo (ver Figura 1) foi cerca de 94 mcg/mL. EXEMPLO 2 A finalidade deste Exemplo é analisar a concentração de Poloxâmero 188 numa amostra de formulação de hFSH liquida disponível no mercado Gonal-F RFF Pen™ após 18 meses de armazenamento à temperatura ambiente. Assim, pretendeu-se avaliar a estabilidade da formulação líquida relativamente ao Poloxâmero 188. A concentração do Poloxâmero 188 no momento da preparação era cerca de 100 mcg/mL. O protocolo para a quantificação do Poloxâmero 188 em Gonal-F RFF Pen™ foi idêntico ao mostrado no Exemplo 1 para Ovitrelle, com a 32 exceção de a taxa de fluxo da coluna ter sido 0,75 mL/minuto.

Foi possível separar o poloxâmero da hFSH e foi quantificado em separado. EXEMPLO 3 A finalidade deste Exemplo é analisar a concentração do Poloxâmero 188 numa amostra da formulação de hGH líquida disponível no mercado Serostim™. 0 protocolo foi idêntico ao do Exemplo 2.

Foi possível separar o poloxâmero da hGH e foi quantificado em separado. EXEMPLO 4 A finalidade deste Exemplo foi analisar a concentração do Poloxâmero 188 numa amostra de uma formulação de hlFN-beta líquida. O protocolo foi idêntico ao do Exemplo 2.

Foi possível separar o poloxâmero do hlFN-beta e foi quantificado em separado.

Lisboa, 8 de Março de 2012

Claims (12)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para a determinação quantitativa de um poloxâmero numa amostra de proteína líquida, que compreende os passos de sujeitar a referida amostra a: (a) um passo de separação utilizando uma coluna de cromatografia de exclusão por tamanhos; (b) um passo de eluição com uma fase móvel; e (c) opcionalmente um passo de deteção para o poloxâmero, em que a proteína tem uma massa molecular entre 5-7 0 kDa, preferivelmente entre 20-70 kDa, e em que o pH da fase móvel utilizada para o passo de eluição é ajustado para um valor inferior a 3.

2. Método da reivindicação 1, em que o poloxâmero é Poloxâmero 188.

3. Método de qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, em que a proteína é uma proteína heterodimérica.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que a proteína é uma gonadotropina selecionada de FSH, LH, hCG, TSH.

5. Método de qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, em que a proteína a ser analisada é interferão beta ou Hormona de Crescimento (GH).

6. Método de qualquer uma das reivindicações 1 até 5, em que a amostra é uma composição farmacêutica aquosa contendo FSH, LH, hCG, TSH, GH ou interferão beta. 2

7. Método de qualquer uma das reivindicações 1 até 6, em que a fase móvel é um solvente aquoso, em particular tamponado.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o pH da fase móvel é ajustado para cerca de 1,9-2,0.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 8, em que o passo de deteção para o poloxâmero envolve analisar o índice de refração.

10. Método de qualquer uma das reivindicações 1 até 9, em que a coluna de exclusão por tamanhos é uma coluna de SE-HPLC cheia com uma matriz de base polimérica contendo esférulas.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que as esférulas da matriz têm uma dimensão das partículas de 10 ou 17 pm.

12. Método de acordo com a reivindicação 10 ou 11, em que as esférulas da matriz têm uma dimensão dos poros de cerca de 200 Á. Lisboa, 8 de Março de 2012