PT1786901E - Genes de inositol polifosfato 2-quinase e suas utilizações - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"GENES DE INOSITOL POLIFOSFATO 2-QUINASE E SUAS UTILIZAÇÕES" A presente invenção refere-se ao campo da biologia molecular de plantas. Especificamente, a presente invenção refere-se à identificação e utilização de genes que codificam a enzima inositol polifosfato 2-quinase (IPP2-K), que está envolvida na via da biossintese do ácido fitico em plantas e à utilização desses genes e seus mutantes para reduzir os níveis de ácido fitico, e/ou para aumentar os níveis de fósforo não ácido fitico em sementes de plantas e alimentos ou rações que contêm essas sementes. 0 papel do fósforo na nutrição animal é bem reconhecido. Oitenta por cento do fósforo no corpo dos animais encontra-se no esqueleto, proporcionando estrutura ao animal. Vinte por cento do fósforo nos animais pode ser encontrado nos tecidos moles, onde está envolvido numa miríade de reações bioquímicas incluindo a síntese e a atividade de DNA, RNA, fosfolípidos e algumas vitaminas B.

Embora o fósforo seja crítico para a saúde animal, nem todo o fósforo nas rações está biodisponível. 0 mio-inositol 1,2,3,4,5,6-hexa-quis-fosfato, normalmente conhecido como ácido fitico, é uma molécula abundante em 2 ΡΕ1786901 muitas sementes de plantas e tecido vegetativo, tal como raizes e tubérculos. Os sais do ácido fitico (ou fitatos) são a principal forma de armazenamento de fósforo nas sementes, representando tipicamente desde 65% até 80% do fósforo total da semente (P) . Quando as dietas à base de semente são consumidas por não-ruminantes, o ácido fitico consumido forma vários sais minerais nutricionalmente importantes no trato digestivo. A excreção desses sais reduz a retenção e a utilização (i.e., a biodisponibilidade) do fósforo e dos minerais. Consequentemente, isto resulta em deficiências minerais tanto em humanos como em animais alimentados com a semente. Para além disso, o fósforo ligado ao ácido fitico em desperdicios animais contribui para a poluição da água à superfície e no solo.

Foram propostas várias abordagens para reduzir o impacto negativo que o teor do ácido fitico na semente tem na dieta, na retenção de fósforo e minerais, e no ambiente. As abordagens incluem a remoção do ácido fitico dietéticos por intervenção pós-colheita e redução do teor de ácido fitico na semente, geneticamente. Sementes contendo ácido fitico reduzido são reivindicadas na US 5 689 054 (milho) e US 6 111 168 (soja) . A alteração dos níveis de fitato através da manipulação de mio-inositol 1-fosfato sintase é discutida em WO 00/73473, WO 99/05298, US 6 197 561 e US 6 291 224. A alteração dos níveis de fitato através de desvio para ononitol com inositol metil transferase é discutida em WO 99/37786. A US 6 197 561 propõe a alteração dos níveis de fitato através da alteração de várias enzimas 3 ΡΕ1786901 adicionais, incluindo fosfatidilinositol-3-quinase, mio-inositol 1,3,4-trifosfato 5/6-quinase, mio-inositol mono-fosfatase-3, inositol polifosfato 5-fosfatase, D-mio-ino-sitol-3-fosfato sintase, D-mio-inositol trifosfato 3-cinase, transportador de mio-inositol, fosfatase de milho, proteina de transferência do fosfatidilinositol, fosfa-tidilinositol-4-fosfato-5-quinase, fosfolipase especifica para fosfatidil-inositol, mio-inositol mono-fosfatase-1, fosfatidilinositol 4-quinase, fosfatidil-inositol (4,5)bis-fosfato 5-fosfatase, fosfatidilinositol sintase. A expressão da fitase, uma enzima capaz de degradar fitato, em plantas e sementes, é também revelada em US 6 399 861, US 6 303 766, US 5 994 628, US 5 714 474 e US 5 543 576. A US 2003/0009011 (WO 02/059324) revela os genes da inositol polifosfato quinase e sua utilização para modular os niveis de fitato, e adicionalmente propõe sequências de consenso para identificar outros genes de inositol polifosfato quinase. A US 2003/0079247 (WO 03/027243) revela genes de inositol polifosfato quinase adicionais, descritos como a família de genes de inositol 1,3,4-trisfosfato 5/6 quinase. O mutante lpa2, descrito em US 5 689 054 acima, contêm uma mutação num membro desta família de genes (ver também Plant Physiol. 2003 Feb; 131(2): 507-15). A US2004/0034888 revela uma quantidade de sequências de polinucleótidos de plantas. Não é aí descrita nenhuma utilidade específica para cada uma das sequências.

Shi et ai (Plant Physiology, 2003, 131, 507-515) 4 ΡΕ1786901 indicam que um mutante de milho particular com baixo teor de ácido fitico é provocada pela mutação de um gene da inositol fosfato quinase.

Verbsky et al (J. Biol. Chem. 2002, 27, 35, 31857-31862) revela uma sequência de DNA genómico humano que codifica a inositol 1,3,4,5, 6-pentaquis fosfato 2-quinase humana.

Apesar destas abordagens, existe ainda uma necessidade para melhorar o conteúdo nutricional das plantas, particularmente milho, através da redução dos niveis de ácido fitico e aumentando os niveis de fósforo não ácido fitico. A enzima IPP2-K catalisa múltiplos passos que conduzem à formação de ácido fitico. Ela catalisa, por exemplo: as reações de ATP + inositol 1,4,5,6-tetraquis-fosfato -► ADP + inositol pentaquisfosfato e ATP + inositol 1,3,4,5, 6-pentaquisfosfato -► ADP + inositol 1,2,3,4,5,6-hexafosfato. Adicionalmente, esta enzima catalisa as reações de ATP + inositol 1,4, 6-trif osf ato -> ADP + inositol 1,2,6-trifosfato. Uma redução na atividade da enzima IPP2-K no desenvolvimento das sementes da planta iria interromper a sintese do ácido fitico, reduzindo desse modo o nível do ácido fitico em sementes e tornando o fósforo mais disponível metabolicamente para os animais que são alimentados com a semente. A presente invenção debruça-se sobre a necessidade de melhorar a biodisponibilidade do fosfato 5 ΡΕ1786901 proporcionando sequências de ácido nucleico que codificam a totalidade ou uma porção da enzima IPP2-K enzima e as ferramentas para a manipulação da via biossintética do ácido fítico em células vegetais.

De acordo com a presente invenção, é proporcionado um polinucleótido de plantas isolado que codifica para uma inositol polifosfato 2-quinase, cujo polinucleótido codifica um polipéptido que compreende a SEQ ID NO: 2. A invenção também se refere a uma proteina isolada de inositol polifosfato 2-quinase de planta, que compreende um polipéptido que possui a sequência apresentada na SEQ ID NO: 2.

Ainda outro aspeto da presente invenção é um método de identificação de um tecido vegetal que compreende uma lesão num gene que codifica uma inositol polifosfato 2-quinase da presente invenção, que compreende: sujeitar um tecido vegetal a mutagénese; obter uma amostra de DNA a partir de um tecido vegetal sujeitado a mutagénese ou seus descendentes; e ensaiar a amostra de DNA para a lesão no gene que codifica inositol polifosfato 2-quinase.

Para além disso, a presente invenção refere-se a uma semente de milho que contém uma lesão induzida artificialmente num gene que codifica uma inositol polifosfato 2-quinase da presente invenção, em que a lesão afeta a atividade do gene que codifica a inositol polifosfato 2- 6 ΡΕ1786901 quinase e em que a lesão induzida artificialmente é um gene desativado.

Ainda noutra forma de realização, a presente invenção é dirigida a um método de diminuição do nivel de ácido fitico em rações animais, que compreende: produzir ração animal a partir de uma planta que contém uma lesão num gene que codifica uma inositol polifosfato 2-quinase de acordo com a presente invenção, em que a ração animal possui um nivel diminuído de fitato. A presente invenção também de refere a um método de diminuição do nível de fósforo em desperdícios animais que compreende: proporcionar ração animal de uma planta incluindo uma lesão num gene que codifica uma inositol polifosfato 2-quinase de acordo com a presente invenção.

Para além disso, a presente invenção envolve uma semente mutante não letal de uma espécie de planta cerealífera caracterizada por baixo teor de ácido fitico em relação ao germoplasma parental da espécie, em que a semente mutante possui atividade alterada de uma inositol polifosfato 2-quinase de acordo com a presente invenção.

Adicionalmente, a presente invenção refere-se a um anticorpo purificado criado utilizando um polipéptido que compreende a SEQ ID NO: 2 como um imunogénio.

Também, a presente invenção refere-se a um método 7 ΡΕ1786901 para aumentar o rendimento da semente de uma planta, compreendendo o referido método (1) integração no genoma da planta um vetor para transformação de células vegetais compreendendo (a) sequências nucleotidicas anti-sentido substancialmente complementares a (i) uma porção correspondente de uma cadeia de uma molécula de DNA que codifica a inositol polifosfato 2-quinase, em que a molécula de DNA que codifica a inositol polifosfato 2-quinase hibrida em condições de baixa restringência com SEQ ID N0:1 ou (ii) uma porção correspondente de uma sequência de RNA codificada pela molécula de DNA que codifica inositol polifosfato 2-quinase; e (b) sequências reguladoras ligadas operacionalmente às sequências de nucleótidos anti-sentido de modo a que as sequências de nucleótidos anti-sentido sejam expressas numa célula vegetal na qual é transformada; e (2) cultivar a referida planta, em que as referidas sequências de nucleótidos anti-sentido são transcritas e ligadas è referida sequência de RNA e a expressão de um gene da inositol polifosfato 2-quinase é inibido.

Ainda outro aspeto da presente invenção é um método para criar uma planta mutante possuindo uma caracte-rística desejada proporcionada pela desativação de um gene, num gene que codifica uma inositol polifosfato 2-quinase de acordo com a presente invenção, compreendendo o método: (a) proporcionar uma recolha de pólen da planta ou sementes da planta; tratar a referida recolha de pólen da planta ou sementes da planta com irradiação selecionada a partir do grupo que consiste em UV, irradiação gama, raios X, e ΡΕ1786901 neutrões rápidos; e selecionar as plantas mutantes que possuem a caraterística desejada. A FIG. IA apresenta a semelhança da IPP2-K de milho aqui reivindicada com outras quinases de inositol de milho. Um nivel baixo de semelhança de sequências sugere que a IPP2-K de milho é uma inositol fosfato quinase nova. A FIG. 1B apresenta a relação filogenética entre as sequências da proteina IPP2-K de milho e as inositol-fosfato quinases de milho e de outras espécies. Os genes da IPP2-K putativa de uma gama diversa de espécies (desde humanos até Arabidopsis) estão intimamente relacionadas. Em contraste, são agrupadas outras inositol fosfato quinases em diferentes ramos da árvore filogénica. A FIG. 2 apresenta uma comparação de sequências de aminoácidos previstas a partir dos genes putativos da IPP2-K de plantas. A FIG. 3 apresenta a organização genética de IPP2-K da linhagem de milho DAS 5XH751. A FIG. 4 apresenta a atividade da quinase in vitro da IPP2-K de milho, utilizando os substratos 32Ρ-γΑΤΡ, IP4 e IP5 como detetado com substrato marcado radioactivamente e TLC. A IPP2-K converte inositol 9 ΡΕ1786901 1,4,5, 6-tetraquisfosfato em pentaquisfosfato cie inositol, e converte inositol 1,3,4,5,6-pentaquisfosfato em fitato (inositol hexaquisfosfato). A FIG. 5 apresenta a conversão in vitro de inositol 1,4, 6-trifosfato em inositol 1,2, 6-trifosfato na presença da enzima IPP2-K e ATP como detetado por XH-NMR. A FIG. 6 apresenta o fósforo - espetro de NMR do extrato de semente de uma linhagem de milho DAS5XH751, indicando a espécie de inositol fosfato presente. SEQ ID NO:l é a sequência de nucleótidos para o cDNA que codifica uma IPP2-K de milho em sementes da linhagem DAS5XH751. SEQ ID NO:2 é a sequência de aminoácidos deduzida de uma IPP2-K derivada da sequência de nucleótidos da SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:3 é a sequência de nucleótidos para o DNA genómico que codifica a IPP2-K da linhagem de milho 5XH751. São aqui apresentadas definições para facilitar a compreensão da invenção. Unidades, prefixos, e símbolos podem ser indicados na sua forma aceite de SI. Salvo indicação em contrário, os ácidos nucleicos são escritos da 10 ΡΕ1786901 esquerda para a direita na orientação de 5' para 3' ; as sequências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação amino para carboxilo, respetivamente. Os intervalos numéricos registados na descrição são inclusivamente os números que definem o intervalo e incluem cada inteiro dentro do intervalo definido. Os aminoácidos podem ser aqui referidos através dos seus simbolos de três letras normalmente conhecidos ou através dos simbolos de uma letra recomendado pela Comissão de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Os nucleótidos podem de igual modo ser referidos através dos seus códigos de letra única normalmente aceites. Salvo referência em contrário, os termos software, elétrico, e eletrónico como aqui utilizados, são como definido em The New IEEE Standard Dictionary of Electrical e Electronics Terms (5th edition, 1993) . Os termos definidos abaixo são definidos mais completamente por referência à descrição como um todo. "RNA Anti-sentido" refere-se a um transcrito de RNA que é complementar à totalidade ou parte de um transcrito primário alvo ou mRNA e que bloqueia a expressão de um gene alvo (Pat. U.S. No. 5 107 065, aqui incorporada por referência). A complementaridade de um RNA anti-sentido pode ser com qualquer parte do transcrito do gene especifico, i.e., na sequência não codificante 5', sequência não codificante 3', intrões, ou a sequência codificante. "RNA funcional" refere-se a RNA de sentido, RNA anti-sentido, RNA de ribozima, RNAi, ou outro RNA que pode não ser traduzido, mas contudo tem um efeito nos processos celulares . 11 ΡΕ1786901 O termo "DNA complementar" (cDNA) refere-se a uma molécula de DNA de cadeia simples que pode ser formada a partir de um molde de mRNA pela enzima transcriptase reversa. Tipicamente, é empregue um iniciador complementar a porções de mRNA para a iniciação da transcrição reversa. Os especialistas na técnica também utilizam o termo "cDNA" para se referirem a uma molécula de DNA de cadeia dupla derivada de uma molécula de mRNA. 0 termo "contig" refere-se a uma montagem das sequências de ácidos nucleicos sobreponíveis para formar uma sequência de nucleótidos contígua. Por exemplo, podem ser comparadas várias sequências de DNA e alinhadas para identificar regiões comuns ou sobreponíveis. As sequências individuais podem ser então montadas numa única sequência de nucleótidos contígua. 0 termo "expressão" refere-se à transcrição e acumulação estável de RNA de sentido (mRNA) ou anti-sentido derivado do fragmento de ácido nucleico da invenção. Expressão, também pode referir-se à tradução de mRNA num polipéptido. "Inibição anti-sentido" refere-se à produção de transcritos de RNA anti-sentido capazes de suprimir a expressão da proteína alvo. "Sobre-expressão" refere-se à produção de um produto de um gene em organismos trans-génicos que excedem os níveis de produção em organismos normais ou não transformados. "Co-supressão" refere-se à produção de transcritos de RNA de sentido capazes de su- 12 ΡΕ1786901 primir a expressão de genes idênticos ou substancialmente semelhantes estranhos ou endógenos (Pat. U.S. No. 5 231 020, aqui incorporado por referência).

As proteínas de ligação ao DNA que utilizam motivos de reconhecimento de dedos de zinco (ZF) podem ser concebidas para reconhecer e modificar sequências de DNA específicas ou alterar a expressão. Esses dedos de zinco modificados (ZFs) podem ser utilizados para alterar diretamente um gene no seu ambiente nativo quando eles estão ligados operacionalmente a uma nuclease (ZFNs). A clivagem por nucleasse preferencial para um sítio, ou específica para um sítio, mediada através da ligação a ZF, pode realizar alterações na expressão ou atividade. As alterações nos genes alvo podem incluir substituições com DNA concebido através de recombinação homóloga, e interrupções de genes de inserções ou deleções. Exemplos de alterações de genoma mediadas por ZFN são encontradas em Biol Chem. 1999 Jul-Aug; 380(7-8): 841-848; Molecular and Cellular Biology 21(1): 289-297, 2001; Genetics 161: 1169-1175, 2002. Por contraste, os ZFs podem modular indiretamente a expressão e a atividade quando concebidos para funcionar como fatores de transcrição que interagem com o gene em trans. Esses ZFPs podem ser modificados para aumentar ou reduzir a transcrição (refs). A regulação da expressão de ZFP pode ser constitutiva, específica para o tecido, temporalmente específica, ou indutível. Exemplos de alterações na expressão mediada por ZFP são encontradas em Proc. Nat. Acad. Sei. 99(20): 13290-13295, 2002; Proc. Nat. 13 ΡΕ1786901

Acad. Sei. 99(20): 13296-13301, 2002; Plant Cell Physiol. 43(12): 1465-1472, 2002; revisão em Curr. Opin. Plant Biol. 6: 163-168, 2003. O termo "gene" refere-se a um fragmento de ácido nucleico que expressa uma proteina especifica, incluindo sequências reguladoras que precedem (sequências não codificantes 5') e estão após (sequências não codificantes 3') a sequência codificante. "Gene nativo" refere-se a um gene como encontrado na natureza com as suas próprias sequências reguladoras. "Gene quimérico" refere-se a qualquer gene que não é um gene nativo, que compreende sequências reguladoras e codificantes que não são encontradas na natureza. Consequentemente, um gene quimérico pode compreender sequências reguladoras e sequências codificantes que são derivadas de diferentes fontes, ou sequências reguladoras e sequências codificantes derivadas da mesma fonte, mas dispostas de um modo diferente àquela que se encontra na natureza. "Gene endógeno" refere-se a um gene nativo na sua localização natural no genoma de um organismo. Uma cópia ou cópias adicionais de um gene endógeno pode ser reintroduzida no organismo hospedeiro numa localização cromossómica diferente, conduzindo diferenças ao nivel contextuai e de expressão. Um gene "estranho" refere-se a um gene que não é normalmente encontrado no organismo hospedeiro, mas que é introduzido no organismo hospedeiro através de transferência de gene. Os genes estranhos podem compreender genes nativos inseridos num organismo não nativo, ou genes quiméricos. Um "transgene" é um gene que 14 ΡΕ1786901 foi introduzido no genoma através de um processo de transformação. 0 termo "DNA genómico" refere-se a DNA cromos-sómico e pode incluir intrões. Um intrão é uma sequência interveniente. É uma sequência de DNA não codificante num gene que é transcrita em RNA nuclear heterogéneo (hnRNA) mas é então removida por excisão de RNA no núcleo, conduzindo a um mRNA maduro que é então traduzido no citoplasma. As regiões nas extremidades de um intrão são tipicamente auto-complementar, permitindo que se forme uma estrutura em gancho de cabelo naturalmente no hnRNA. 0 termo "polinucleótido de inositol polifosfato 2-quinase" ou "polinucleótido IPP2-K" refere-se a um polinucleótido que codifica um polipéptido com pelo menos atividades de inositol polifosfato 2-quinase, ou um polinucleótido capaz de modular a expressão de mRNA ou proteína de IPP2-K numa célula hospedeira. 0 termo também inclui fragmentos, variantes, homólogos, alelos ou precursores (e.g., pré-proteínas ou pro-proteínas) com qualquer uma das atividades acima referidas. 0 termo "IPP2-K" refere-se a inositol polifosfato 2-quinase em relação a qualquer ácido nucleico ou polipéptido, ou a atividade funcional associada. As enzimas IPP2-K da presente invenção possuem uma vasta especificidade de substrato e podem fosforilar várias espécies de fosfato de inositol incluindo, mas não limitado a trifos- 15 ΡΕ1786901 fato de inositol, tetraquisfosfato de inositol e penta-quisfosfato de inositol utilizando trifosfato de adenosina (ATP) como o dador de fosfato, resultando nos produtos de difosfato de adenosina (ADP) e um fosfato de inositol fosforilado. 0 termo "isolado" refere-se a um material, tal como um ácido nucleico ou uma proteína, que é: (1) substancialmente ou essencialmente isento de componentes que normalmente acompanham ou interagem com o material tal como este se encontra no ambiente como ocorrência natural ou (2) se o material está no seu estado natural, o material foi alterado através de intervenção humana deliberada para uma composição e/ou foi colocado num locus numa célula diferente do locus nativo para o material. 0 termo "lesão" refere-se a qualquer alteração molecular de um ácido nucleico em relação aos ácidos nucleicos de uma planta de tipo silvestre. Por exemplo, uma lesão pode ser uma deleção, inversão, inserção, duplicação, transversão, transição ou um rearranjo numa sequência de ácido nucleico. 0 termo "motivo" refere-se a regiões curtas de sequências conservadas de ácidos nucleico ou aminoácidos que compreendem parte de uma sequência mais longa. O termo "animal não ruminante" significa um animal com um estômago simples dividido nas regiões do 16 ΡΕ1786901 esófago, cárdia, fundus e piloro. Um animal não ruminante implica adicionalmente uma espécie de animal sem um rúmen funcional. Um rúmen é uma secção do sistema digestivo na qual a ração/alimento é ensopada e sujeita a digestão através de microrganismos antes de passar através do trato digestivo. Este fenómeno não ocorre num animal não ruminante. O termo animal não ruminante inclui, mas não está limitado a humanos, suinos, aves de capoeira, gatos e cães. 0 termo "ácido fítico" refere-se a ácido tetrafosfórico de mio-inositol, ácido pentafosfórico de mio-inositol, ácido hexafosfórico de mio-inositol e seus derivados tais como: tetraquisfosfato de 5-pirofosfato- inositol d, 3, 4, 6), pentaquisfosfato de 5-pirofosfato- inositol d, 2, 3, 4, 6) e tetraquisfosfato de 5,6-bis- pirofosfato-inositol (1, 2, 3, 4). Como um sal com catiões, o ácido fítico é "fitato." 0 termo "planta" inclui plantas e partes de plantas incluindo mas não limitado a células vegetais e tecidos vegetais tais como folhas, caules, raizes, flores, pólen, e sementes. A classe de plantas que pode ser utilizada na presente invenção é geralmente tão ampla como a classe de plantas superiores e inferiores passíveis de mutagénese incluindo angiospérmicas (plantas monocotile-dóneas e dicotiledóneas), gimnospérmicas, fetos e algas multicelulares. 0 termo "polinucleótido" refere-se a qualquer 17 ΡΕ1786901 ácido nucleico e inclui polímeros de cadeia simples e múltipla de bases de desoxirribonucleótidos ou ribonu-cleótidos. Os ácidos nucleicos também podem incluir fragmentos e nucleótidos modificados. Por isso, como aqui utilizados, os termos "ácido nucleico" e "polinucleótido" são utilizados indistintamente. 0 termo "promotor" refere-se tipicamente a uma sequência de DNA que dirige a transcrição de um gene estrutural para produzir RNA. Tipicamente, está localizado um promotor na região dos 500 pares de bases a montante de um gene, proximal em relação ao sítio de início de transcrição. Se um promotor é um promotor indutível, então a taxa de transcrição aumenta ou diminui em resposta a um agente de indução exógeno ou endógeno. Em contraste, a taxa de transcrição é regulada até um grau inferior por um agente de indução se o promotor é um promotor constitutivo.

Os termos "região de regulação da transcrição" e "região reguladora" refere-se à secção de DNA que regula a transcrição do gene. Uma região reguladora pode incluir uma variedade de elementos de atuação cis, incluindo, mas não limitado a, promotores, intensificadores e elementos de resposta a hormona. Também, uma vez que os intrões e 5' UTR têm sido conhecidos por influenciar a transcrição, uma região de regulação de transcrição pode incluir essas sequências. O termo "substancialmente semelhante" refere-se a 18 ΡΕ1786901 fragmentos de ácido nucleico em que alterações em um ou mais bases de nucleótidos resultam em substituição de um ou mais aminoácidos, mas não afetam as propriedades funcionais da proteína codificada pela sequência de DNA. "Substancialmente semelhante" também se refere a fragmentos de ácidos nucleicos em que alterações em uma ou mais bases de nucleótidos não afetam a capacidade do fragmento de ácido nucleico para mediar a alteração da expressão do gene através da tecnologia de anti-sentido ou co-supressão. "Substancialmente semelhante" também se refere a modificações dos fragmentos de ácido nucleico da presente invenção tais como deleção ou inserção de um ou mais nucleótidos que não afetam substancialmente as propriedades funcionais do transcrito resultante vis-à-vis a capacidade para medir a alteração da expressão do gene por tecnologia de anti-sentido ou co-supressão ou alteração das propriedades funcionais da molécula de proteína resultante. É por isso entendido que a invenção engloba mais do que as sequências exemplares específicas.

Por exemplo, é bem conhecido na arte que a supressão e co-supressão de anti-sentido de expressão de gene pode ser realizada utilizando fragmentos de ácido nucleico que representam menos do que a região codificante inteira de um gene, e através de fragmentos de ácido nucleico que não partilham 100% de identidade de sequência com o gene a ser suprimido. Para além disso, as alterações num gene que resultam na produção de um aminoácido 19 ΡΕ1786901 quimicamente equivalente num dado sitio, mas não afetam as propriedades funcionais da proteina codificada, são bem conhecidas na arte. Assim, um códão para o aminoácido alanina, um aminoácido hidrofóbico, pode ser substituído por um códão que codifica outro residuo menos hidrofóbico, tais como glicina, ou um residuo mais hidrofóbico, tal como valina, leucina, ou isoleucina. De um modo semelhante, alterações que resultam na substituição de um resíduo carregado negativamente por outro, tal como ácido aspártico por ácido glutâmico, ou um resíduo carregado positivamente por outro, tal como lisina por arginina, também é expec-tável que produza um produto funcionalmente equivalente. Alterações de nucleótidos que resultam na alteração das porções N-terminal e C-terminal da molécula de proteína também não seria expectável que alterassem a atividade da proteína. Cada uma das modificações propostas está bem dentro dos especialistas na arte, como é a determinação da retenção da atividade biológica dos produtos codificados.

Para além disso, fragmentos de ácido nucleico substancialmente semelhantes também podem ser caracte-rizados pela sua capacidade para hibridar, em condições de restringência (0,1 X SSC, 0,1% SDS, 65°C), com os fragmentos de ácido nucleico aqui revelados.

Fragmentos de ácido nucleico substancialmente semelhantes da presente invenção também podem ser caracte-rizados pela percentagem de semelhança das sequências de aminoácidos que eles codificam para as sequências de amino- 20 ΡΕ1786901 ácidos aqui reveladas, como determinado pelos algoritmos normalmente empregues pelos especialistas nesta técnica. São preferidos aqueles fragmentos de ácido nucleico cujas sequências de nucleótidos codificam sequências de amino-ácidos que são 80% semelhantes às sequências de aminoácidos aqui relatadas. Fragmentos de ácido nucleico mais preferidos codificam sequências de aminoácidos que são 90% semelhantes às sequências de aminoácidos aqui relatadas. São os mais preferidos os fragmentos de ácido nucleico que codificam sequências de aminoácidos que são 95% semelhantes às sequências de aminoácidos aqui relatadas. Foram realizados alinhamentos de sequência e os cálculos de percentagem de semelhança foram realizados utilizando programas do pacote informático GCG (Genetics Computer Group, Madison, WI). 0 alinhamento múltiplo das sequências foi realizado utilizando o método de alinhamento Clustal (Higgins, D. G. e Sharp, P. M. (1989) CABIOS. 5:151-153) com os parâmetros por defeito (PENALIZAÇÃO DE GAP = 10, PENALIZAÇÃO DO COMPRIMENTO DO GAP = 10) (de aqui em diante, denominado algoritmo de Clustal). Os parâmetros por defeito para alinhamentos par a par utilizando o método Clustal foram KTUPLE 1, PENALIZAÇÃO DE GAP = 3, WINDOW = 5 e DIAGONAIS SALVAS = 5.

Uma "porção substancial" de uma sequência de aminoácidos ou de nucleótidos refere-se a uma parte suficiente da sequência de aminoácidos de um polipéptido ou da sequência de nucleótidos de um gene para produzir a identificação putativa desse polipéptido ou gene, seja por 21 ΡΕ1786901 avaliação manual da sequência por um especialista na técnica, ou por comparação de sequências automatizada por computador e identificação utilizando algoritmos tais como BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S. F., et ai., (1993) J. Mol. Biol. 215: 403-410; ver também www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Em geral, é necessária uma sequência de dez ou mais aminoácidos contíguos ou trinta ou mais nucleótidos para identificar putativamente uma sequência de polipéptidos ou ácidos nucleicos como homóloga a uma proteina ou gene conhecidos. Para além disso, em relação às sequências de nucleótidos, podem ser utilizadas sondas de oligonucleótidos especificas para o gene que compreendem 20-30 nucleótidos contíguos em métodos de identificação de genes dependentes da sequência (e.g., hidridação de Southern) e isolamento (e.g., hibridação in situ de colónias de bactérias ou placas de bacteriófagos). Adicionalmente, podem ser utilizados oligonucleótidos curtos de 12-15 bases como iniciadores de amplificação em PCR de modo a obter um fragmento particular de ácido nucleico que compreende os iniciadores. Consequentemente, uma "porção substancial" de uma sequência de nucleótidos compreende uma parte suficiente da sequência para produzir a identificação especifica e/ou isolamento de um fragmento de ácido nucleico que compreende a sequência. A presente descrição revela sequências de aminoácidos e de nucleótidos parciais ou completas que codificam uma ou mais proteínas de plantas particulares. 0 especialista na técnica, que tem o benefício das sequências como aqui relatadas, pode agora utilizar a totalidade ou uma porção substancial das sequên- 22 ΡΕ1786901 cias reveladas para objetivos conhecidos dos especialistas na técnica. Consequentemente, a presente invenção compreende as sequências completas como relatado nas Listagem de sequências anexa, assim como porções substanciais das sequências como definidas acima. O termo "variante" refere-se a sequências substancialmente semelhantes. De um modo geral, as variantes de sequência de ácido nucleico da invenção possuirão pelo menos 46%, 48%, 50%, 52%, 53%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de nucleótidos nativa, em que a % de identidade de sequências é baseada na sequência inteira e é determinada por análise de GAP 10 utilizando os parâmetros por defeito. De um modo geral, as variantes da sequência de polipéptido da invenção possuirão pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98%, ou 99% de identidade de sequências em relação à proteina nativa, em que a % de identidade de sequências é baseada na sequência inteira e é determinada pela análise de GAP 10 utilizando os parâmetros por defeito. GAP utiliza o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970) para encontrar o alinhamento de duas sequências completas que maximiza o número de emparelhamentos e minimiza o número de gaps (interrupções). O termo "variante" também se refere a sequências 23 ΡΕ1786901 substancialmente semelhantes que contêm sequências de aminoácidos muito semelhantes aos motivos contidos na invenção e opcionalmente necessários para a função biológica da invenção. De um modo geral, as variantes da sequência de polipéptidos da invenção possuirão pelo menos 85%, 90% ou 95% da identidade de sequências com os resíduos de aminoácidos conservados nos motivos definidos.

As técnicas de DNA recombinante e de clonagem molecular convencionais aqui utilizadas são bem conhecidas na técnica e são descritas mais completamente em Sambrook, J. & Russell, D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY 2001 (de aqui em diante referido como "Sambrook").

As variantes incluídas na invenção podem conter substituições, deleções ou adições individuais para as sequências de ácidos nucleicos ou de polipéptidos que alteram, adicionam ou eliminam um único aminoácido ou uma pequena percentagem de aminoácidos na sequência codificada. Uma "variante modificada de modo conservador" é uma alteração que resulta na substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente semelhante. Quando o ácido nucleico é preparado ou alterado sinteticamente, pode ser tirada vantagem de preferências de códão conhecidas do hospedeiro pretendido.

Os fragmentos de ácido nucleico da presente invenção podem ser utilizados para isolar cDNAs e genes que 24 ΡΕ1786901 codificam proteínas homólogas a partir da mesma ou de outras espécies de plantas. 0 isolamento de genes homólogos utilizando protocolos dependentes da sequência é bem conhecido na técnica. Exemplos de protocolos dependentes da sequência incluem, mas não estão limitados a, métodos de hibridação de ácidos nucleicos, e métodos de amplificação de DNA e de RNA, como exemplificado por várias utilizações das tecnologias de amplificação de ácidos nucleicos (e.g., reação da polimerase em cadeia, reação da ligase em cadeia).

Por exemplo, os genes que codificam outras quina-ses de trifosfato de inositol, quinases de tetraquisfosfato de inositol, quinases de pentaquisfosfato de inositol, ou 2-quinases de polifosfato de inositol, seja como cDNAs ou DNAs genómicos, podem ser isolados diretamente utilizando a totalidade ou uma porção dos presentes fragmentos de ácido nucleico como sondas de hibridação de DNA para rastrear bibliotecas a partir de qualquer metodologia desejada empregando plantas bem conhecida dos especialistas na técnica. Sondas de oligonucleótidos específicas baseadas nas presentes sequências de ácidos nucleicos podem ser concebidas e sintetizadas através dos métodos conhecidos na técnica (Sambrook). Para além disso, as sequências inteiras podem ser utilizadas diretamente para sintetizar sondas de DNA através dos métodos conhecidos do especialista na técnica, tais como marcação aleatória de DNA iniciador, tradução de interrupções ("nick translation") , ou técnicas de marcação das extremidades, ou sondas de RNA utilizando sistemas de transcrição in vitro disponíveis. 25 ΡΕ1786901

Adicionalmente, podem ser concebidos iniciadores específicos e utilizados para amplificar uma parte ou a totalidade das presentes sequências. Os produtos de amplificação resultantes podem ser marcados diretamente durante as reações de amplificação ou marcados após as reações de amplificação, e utilizados como sondas para isolar o cDNA de comprimento total ou fragmentos genómicos em condições de restringência apropriada.

Adicionalmente, podem ser utilizados dois segmentos curtos dos presentes fragmentos de ácido nucleico nos protocolos da reação da polimerase em cadeia para amplificar fragmentos de ácido nucleico mais compridos que codificam genes homólogos de DNA ou RNA. A reação da polimerase em cadeia também pode ser realizada numa biblioteca de fragmentos de ácido nucleico clonados em que a sequência de um iniciador é derivada dos presentes fragmentos de ácido nucleico, e a sequência do outro iniciador tira vantagem da presença dos tratos poliadenílicos com a extremidade 3' do precursor do mRNA que codifica genes de plantas. Alternativamente, a segunda sequência do iniciador pode ser baseada nas sequências derivadas do vetor de clonagem. Por exemplo, o especialista na técnica pode seguir o protocolo RACE (Frohman et al., (1988) PNAS USA 85:8998) para criar cDNAs utilizando PCR para amplificar cópias da região entre um único ponto no transcrito e a extremidade 3' ou 5'. Os iniciadores orientados nas direções 3' e 5' podem ser concebidos a partir das presentes sequências. Utilizando 26 ΡΕ1786901 sistemas 3' RACE ou 5' RACE disponíveis comercialmente (Invitrogen, Carlsbad CA), podem ser isolados fragmentos de cDNA específicos para 3' ou 5' (Ohara et al., (1989) PNAS USA 86: 5673; Loh et al., (1989) Science 243:217). Os produtos criados pelos processos RACE de 3' e 5' podem ser combinados para criar cDNAs de comprimento total (Frohman, Μ. A. e Martin, G. R., (1989) Techniques 1:165). A disponibilidade das presentes sequências de nucleótidos e de aminoácidos deduzidas facilita o rastreio imunológico de bibliotecas de expressão de cDNA. Podem ser sintetizados péptidos sintéticos que representam porções das presentes sequências de aminoácidos. Estes péptidos podem ser utilizados para imunizar animais para produzir anticorpos policlonais ou monoclonais com especificidade para péptidos ou proteínas que compreendem as sequências de aminoácidos. Estes anticorpos podem ser então utilizados para rastrear bibliotecas de expressão de cDNA para isolar os clones de cDNA de comprimento total de interesse (Lemer, R. A. (1984) Adv. Immunol. 36: 1; Sambrook).

Os fragmentos de ácido nucleico da presente invenção podem ser utilizados para criar plantas transgénicas nas quais a enzima inositol polifosfato 2-quinase revelada está presente a níveis inferiores ao normal. É desejável reduzir ou eliminar a expressão de genes que codificam a inositol polifosfato 2-quinase em plantas para algumas aplicações. Para realizar isto, pode 27 ΡΕ1786901 ser construído um gene quimérico concebido para a co-supressão da presente enzima biossintética do ácido fítico através da ligação de um gene ou fragmento de gene que codifica uma inositol polifosfato 2-quinase às sequências de promotor da planta. Alternativamente, pode ser construído um gene quimérico concebido para expressar RNA anti-sentido para a totalidade ou parte do presente fragmento de ácido nucleico através da ligação operacional do gene ou fragmento de gene na orientação reversa para sequências do promotor da planta. Genes quiméricos de co-supressão ou anti-sentido podem ser introduzidos em plantas através de transformação em que a expressão dos genes endógenos correspondentes é reduzida ou eliminada.

Uma metodologia alternativa para alcançar a quebra do gene envolve a utilização de RNA de interferência (RNAi) e silenciamento do gene pós-transcrição (PTGS) [Fraser et al. (2000), Nature, 408,325-330; Gonczy et al. (2000) , Nature, 408 (331-336) ] . A introdução de RNA de cadeia dupla (dsRNA) nas células destes organismos conduz à degradação específica da sequência dos transcritos de genes homólogos. As moléculas de RNA de cadeia dupla longa são reduzidas a pequenos RNAs de interferência de 21-23 nucleótidos (siRNAs) pela ação de uma ribonuclease endógena, Dicer. (Bernstein et al. (2001), Nature, 409, 363-366; Grishok et al. (2000), Science, 287 (5462), 2494-7; Zamore et al. (2000), Cell, 101(1), 25-33; Knight, S. W. e B. L. Bass. (2001), Science, 293(5538), 2269-2271). 28 ΡΕ1786901 A presente inositol polifosfato 2-quinase (ou porções desta) pode ser produzida em células de hospedeiros heterólogos, particularmente nas células de hospedeiros microbianas, e pode ser utilizada para preparar anticorpos contra estas proteínas através de métodos bem conhecidos destes especialistas na técnica. Os anticorpos são úteis para detetar inositol polifosfato 2-quinase in situ em células ou in vitro em extratos celulares. Células hospedeiras heterólogas preferidas para a produção da presente inositol polifosfato 2-quinase são hospedeiros microbianos. Sistemas de expressão microbiana e vetores de expressão que contêm sequências reguladoras que dirigem a expressão de nível elevado das proteínas estranhas são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Qualquer uma destas pode ser utilizada para construir um gene quimérico para a produção da presente inositol polifosfato 2-quinase. Este gene quimérico pode ser então introduzido em microrganismos apropriados através da transformação para proporcionar um nível de expressão elevado da enzima biossin-tética do ácido fítico codificada.

Os ácidos nucleicos isolados da presente invenção podem ser realizados utilizando (a) métodos recombinantes convencionais, (b) técnicas sintéticas, ou suas combinações. Em algumas formas de realização, os polinucleótidos da presente invenção podem ser clonados, amplificados, ou de outra forma construídos a partir de uma monocotiledónea ou dicotiledónea. Exemplos típicos de monocotiledóneas são milho, sorgo, cevada, trigo, milho-miúdo, arroz, ou relva- 29 ΡΕ1786901 dos. Dicotiledóneas típicas incluem soja, cártamo, girassol, canola, alfafa, batata, ou mandioca.

Podem ser obtidos fragmentos funcionais incluídos na invenção utilizando iniciadores que hibridam seletivamente em condições de restringência. Os iniciadores têm, de um modo geral, pelo menos 12 bases de comprimento e podem ser tão elevadas como 200 bases, mas terão, de um modo geral, desde 15 até 75, ou mais provavelmente desde 15 até 50 bases. Podem ser identificados fragmentos funcionais utilizando uma variedade de técnicas, tais como análise de restrição, análise de Southern, análise de extensão do iniciador, PCR e análise de sequências de DNA. A presente invenção inclui uma pluralidade de polinucleótidos que codificam para a sequência de amino-ácidos idêntica. A degeneração do código genético permite essas "variações silenciosas" que podem ser utilizadas, por exemplo, para hibridar seletivamente e detetar variações alélicas de polinucleótidos da presente invenção. Adicionalmente, a presente invenção inclui ácidos nucleicos isolados que compreendem variantes alélicas. O termo "alelo", como aqui utilizado refere-se a um ácido nucleico relacionado do mesmo gene.

Variantes de ácidos nucleicos incluídos na invenção podem ser obtidas, por exemplo, através de mutagénese dirigida por oligonucleótidos, mutagénese de varrimento por ligante, mutagénese utilizando a reação da polimerase em 30 ΡΕ1786901 cadeia, e semelhantes. Ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Brent et al., Eds., Wiley e Sons, New York (2003) (de aqui em diante conhecido como Brent). Também, ver de um modo geral, McPherson (ed.), DIRECTED MUTA-GENESIS: A Practical Approach, (IRL Press, 1991). Assim, a presente invenção também engloba moléculas de DNA que compreendem sequências de nucleótidos que possuem uma semelhança de sequência substancial com as sequências inventivas .

Em relação a sequências de ácidos nucleicos particulares, variantes modificadas de modo conservador referem-se aos ácidos nucleicos que codificam variantes das sequências de aminoácidos idênticas ou modificadas de modo conservador. Devido à degeneração do código genético, um número elevado de ácidos nucleicos funcionalmente idênticos codifica qualquer dada proteína. Por exemplo, os codões GCA, GCC, GCG e GCU codificam todos o aminoácido alanina. Assim, para cada posição onde uma alanina é especificada por um códão, o códão pode ser alterado para qualquer um dos codões correspondentes descritos sem alterar o poli-péptido codificado. Essas variações de ácido nucleico são "variações silenciosas" e representam uma espécie de variação modificada de modo conservador. Cada sequência de ácido nucleico aqui representada que codifica um poli-péptido, por referência ao código genético, também descreve cada variação silenciosa possível do ácido nucleico. Um especialista reconhecerá que cada códão num ácido nucleico (exceto AUG, que é normalmente o único códão para a meti-onina; e UGG, que é normalmente o único códão para o 31 ΡΕ1786901 triptofano) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Consequentemente, cada variação silenciosa de um ácido nucleico que codifica um polipéptido da presente invenção está implícita em cada sequência de polipéptido descritas e está dentro do âmbito da invenção reivindicada.

Em relação às sequências de aminoácidos, um especialista na técnica reconhecerá que substituições, deleções ou adições individuais a uma sequência de ácido nucleico, péptido, polipéptido, ou proteína que altera, adiciona ou elimina um único aminoácido ou uma pequena percentagem de aminoácidos na sequência codificada é uma "variante modificada de modo conservador" em que a alteração resulta na substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente semelhante. Assim, qualquer número de resíduos de aminoácidos selecionados a partir do grupo de números inteiros que consiste desde 1 até 50 pode ser alterado desse modo. Assim, por exemplo, podem ser realizadas 1, 2, 3, 14, 25, 37, 45 ou 50 alterações. Variantes modificadas de modo conservador proporcionam tipicamente atividade biológica semelhante como a sequência de polipéptidos não modificada a partir da qual são derivados. Por exemplo, a especificidade para o substrato, atividade da enzima, ou ligação ligando/recetor é, de um modo geral, pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% da proteína nativa para o seu substrato nativo. As tabelas de substituição conservadora que proporcionam aminoácidos funcionalmente semelhantes são bem conhecidas na técnica. 32 ΡΕ1786901

Por exemplo, os seis grupos seguintes contêm, cada um deles, aminoácidos que são substituições conservadoras para um outro: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L) , Metionina (M) ,

Valina (V); e 6) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y) , Triptofano (W) .

Ver também, (Creighton (1984) Proteins, W. H. Freeman and Company), também podem ser utilizados outros padrões de substituição conservadora aceitáveis conhecidos na técnica, tais como as matrizes de classificação dos programas de comparação de sequência como o pacote de programas informáticos GCG, BLAST, ou CLUSTAL por exemplo. A invenção reivindicada também inclui "misturadores" produzidos misturando a sequência dos polinucleótidos da invenção para obter uma caracteristica desejada. A mistura da sequência é descrita na Publicação de PCT No. 96/19256. Ver também, Zhang, J. H., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:4504-4509 (1997) . A presente invenção também inclui a utilização das regiões 5' e/ou 3' UTR para modulação da transcrição ou tradução de sequências heterólogas codificantes. Os motivos 33 ΡΕ1786901 de sequência positivos incluem sequências de consenso de iniciação de tradução (Kozak, Nucleic Acids Res. 15:8125 (1987)) e a estrutura de proteção de 7-metilguanosina (Drummond et al., Nucleic Acids Res. 13:7375 (1985)). Elementos negativos incluem estruturas de caule em ansa 5' UTR intramoleculares estáveis (Muesing et al., Cell 48:691 (1987)) e sequências AUG ou grelhas de leitura aberta curtas precedidas por um AUG apropriado na UTR a 5' (Kozak, supra, Rao et al., Mol. Cell. Biol. 8:284 (1988)).

Para além disso, os segmentos que codificam o polipéptido dos polinucleótidos da presente invenção podem ser modificados para alterar a utilização do códão. A utilização de códão alterada pode ser empregue para alterar a eficiência de tradução. A utilização de códão nas regiões codificantes dos polinucleótidos da presente invenção pode ser analisada estatisticamente utilizando pacotes de software disponíveis comercialmente, tais como "Codon Preference" disponível a partir do GCG, the University of Wisconsin Genetics Computer Group (ver Devereaux et al., Nucleic Acids Res. 12:387-395 (1984).

Por exemplo, os ácidos nucleicos da invenção ou os seus homólogos anti-sentido podem ser otimizados para aumentar a expressão nas plantas de interesse. Ver, por exemplo, Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:3324-3328; e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, cuja descrição é aqui incorporada por referência. Deste modo, os polinucleótidos podem ser sintetizados utilizando codões preferidos pelas plantas. 34 ΡΕ1786901 A presente invenção proporciona subsequências que compreendem ácidos nucleicos isolados que contêm pelo menos 20 bases contíguas das sequências reivindicadas. Por exemplo o ácido nucleico isolado inclui aqueles que compreendem pelo menos 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1 000 , 1 500 ou nucleótidos contíguos das sequências reivindicadas subsequências do ácido nucleico isolado podem ser utilizadas para modular ou detetar a expressão do gene através da introdução nas subsequências de compostos que se ligam, intercalam, clivam e/ou formam ligação reticulada com os ácidos nucleicos.

Os ácidos nucleicos da invenção reivindicada podem compreender convenientemente um sitio de multi-clonagem que compreende um ou mais sitios de endonuclease de restrição inseridos no ácido nucleico para auxiliar no isolamento do polinucleótido. Também, as sequências traduzí-veis podem ser inseridas para auxiliar no isolamento do polinucleótido traduzido da presente invenção. Por exemplo, uma sequência de marcador de hexa-histidina, ou uma sequência de fusão de GST, proporciona um meio conveniente para purificar as proteínas da invenção reivindicada.

Um polinucleótido da invenção reivindicada pode ser ligado a um vetor, adaptador, promotor, péptido de trânsito e ou ligante para a clonagem e/ou expressão de um polinucleótido da presente invenção. As sequências 35 ΡΕ1786901 adicionais podem ser adicionadas a essas sequências de clonagem e/ou expressão para otimizar a sua função na clonagem e/ou na expressão, para auxiliar no isolamento do polinucleótido, ou para melhorar a introdução do polinucleótido numa célula. A utilização de vetores de clonagem, vetores de expressão, adaptadores, e ligantes é bem conhecida e é substancialmente descrita na técnica. Para uma descrição desses ácidos nucleicos ver, por exemplo, Stratagene Cloning Systems, Catálogos 2004 (La Jolla, Calif.); e Amersham BioSciences, Inc, Catálogo 2004 (Piscataway, NJ.).

As composições de ácido nucleico isoladas desta invenção, tais como RNA, cDNA, DNA genómico, ou um seu híbrido, podem ser obtidas através de fontes biológicas de plantas utilizando qualquer número de metodologias de clonagem conhecidas dos especialistas na técnica. Em algumas formas de realização, as sondas de oligonucleótidos que hibridam seletivamente, em condições de restringência, com os polinucleótidos da presente invenção são utilizadas para identificar a sequência desejada numa biblioteca de cDNA ou DNA genómico.

Protocolos exemplares de isolamento de RNA total e mRNA são descritos em Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlim (1997); e Brent. Kits de isolamento de RNA total e mRNA estão disponíveis comercialmente a partir de fornecedores tais como a Stratagene (La Jolla, Calif.), Clonetech (Paio 36 ΡΕ1786901

Alto, Calif.) , Amersham Biosciences (Piscataway, N.J.), e 5' -3' (Paoli, Pa.). Ver também, Pat. U.S. Nos. 5 614 391; e, 5 459 253.

Protocolos de síntese de cDNA típicos são bem conhecidos do especialista na técnica e são descritos em referências convencionais como: Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlim (1997); e Brent. Kits de síntese de cDNA estão disponíveis a partir de uma variedade de fornecedores comerciais tais como Stratagene ou Pharmacia.

Um método exemplar de construção uma biblioteca de cDNA de comprimento total mais de 95% pura é descrita por Caminci et al., Genomics 37:327-336 (1996) . Outros métodos para produzir bibliotecas de comprimento total são conhecidos na técnica. Ver, e.g., Edery et al., Mol. Cell Biol. 15(6): 3363-3371 (1995); e Pedido PCT WO 96/34981. É frequentemente conveniente normalizar uma biblioteca de cDNA para criar uma biblioteca na qual cada clone é representado mais igualmente. São conhecidas na arte várias abordagens para normalizar bibliotecas de cDNA. A construção de bibliotecas normalizadas está descrita em Ko, Nucl. Acids. Res. 18(19): 5705-5711 (1990); Patanjali et al., Proc. Natl. Acad. U.S.A. 88: 1943-1947 (1991); Pat. U.S. Nos. 5 482 685 e 5 637 685; e Soares et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:9228-9232 (1994). 37 ΡΕ1786901

Bibliotecas de cDNA de subtração são outro meio para aumentar a proporção de espécies de cDNA menos abundantes. Ver, Foote et al. em, Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1997); Kho e Zarbl, Technique 3(2):58-63 (1991); Sive e St. John, Nucl. Acids Res. 16(22):10937 (1988); Brent; e, Swaroop et al., Nucl. Acids Res. 19(8):1954 (1991). Existem kits de subtração de cDNA disponíveis comercialmente. Ver, e.g., PCR-Select (Clontech).

Para construir bibliotecas genómicas, são gerados grandes segmentos de DNA genómicos por através de fragmentação aleatória. Exemplos de técnicas de biologia molecular e instruções apropriadas são encontrados em Sambrook, e Methods in Enzymology, Vol. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, Berger e Kimmel, Eds., San Diego: Academic Press, Inc. (1987), Brent; Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1997). Estão também disponíveis comercialmente Kits para a construção de bibliotecas genómicas. A biblioteca de cDNA ou genómica pode ser rastreada utilizando PCR diretamente com métodos conhecidos dos especialistas na técnica, ou utilizando uma sonda baseada na sequência de um ácido nucleico da presente invenção, tais como aquelas aqui reveladas. As sondas podem ser utilizadas para hibridação com sequências de DNA genómico ou de cDNA para isolar polinucleótidos homólogos na mesma espécie de planta ou em espécies diferentes. Os 38 ΡΕ1786901 especialistas na técnica entenderão que podem ser empregues vários graus de restringência de hibridação no ensaio; e quer o meio de hibridação ou o meio de lavagem podem ser restringentes. O grau de restringência pode ser controlado pela temperatura, força iónica, pH e a presença de um solvente parcialmente desnaturante, tal como a formamida.

Tipicamente, as condições de hibridação restringentes serão aquelas nas quais a concentração de sal é inferior a cerca de 1,5 M de iões de Na, tipicamente cerca de 0,01 até 1,0 M de concentração de iões Na (ou de outros sais) a pH 7,0 até 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30°C para sondas curtas (e.g., 10 até 50 nucleótidos) e pelo menos cerca de 60°C para sondas compridas (e.g., superior a 50 nucleótidos). As condições restringentes também podem ser alcançadas com a adição de agentes de desestabilização, tais como formamida.

Condições de restringência baixa exemplares incluem hibridação com uma solução tampão de 30 até 35% de formamida, 1 M de NaCl, 1% SDS (sulfato de dodecil de sódio) a 37°C, e uma lavagem em IX até 2X SSC (20 X SSC=3,0 M NaCl/0,3 M citrato trissódico) a 50° C. Condições de restringência moderada exemplares incluem hibridação em 40 até 45% de formamida, 1 M de NaCl, 1% de SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,5 X até 1 X de SSC a 55°C. Condições de restringência elevada exemplares incluem hibridação em formamida a 50%, 1 M NaCl, 1% SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,1 X SSC a 60°C. Tipicamente, o tempo de hibridação é desde 4 até 16 horas. 39 ΡΕ1786901

Um guia extenso para a hibridação de ácidos nu-cleicos é encontrado em Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with nucleic acid Probes, Part 1, Chapter 2 "OverView of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, N.Y. (1993); e Brent. Frequentemente, as bibliotecas de cDNA serão normalizadas para aumentar a representação de cDNAs relativamente raros.

Os ácidos nucleicos da invenção podem ser amplificados a partir de amostras de ácido nucleico, tais como amostras de ácido nucleico de plantas, utilizando técnicas de amplificação. Por exemplo, pode ser utilizada a tecnologia da reação da polimerase em cadeia (PCR) para amplificar a sequências de polinucleótidos da presente invenção e polinucleótidos relacionados, diretamente a partir de bibliotecas de DNA genómico, bibliotecas de cDNA, ou uma biblioteca de um modo geral construída a partir de transcritos nucleares em qualquer estágio do processamento de intrões. Podem ser produzidas bibliotecas a partir de uma variedade de tecidos vegetais tais como espigas, plân-tulas, folhas, talos, raízes, pólen, ou sementes. Também podem ser úteis a PCR e outros métodos de amplificação in vitro, por exemplo, para clonar sequências de ácidos nucleicos que codificam proteínas para serem expressas, para produzir ácidos nucleicos para utilizar como sondas para detetar a presença do mRNA desejado, em amostras, para sequenciação de ácidos nucleicos, ou para outros objetivos. 40 ΡΕ1786901

Exemplos de técnicas úteis para métodos de amplificação in vitro são encontrados em Berger, Sambrook, e Brent, assim como Mullis et al., Pat. U.S. No. 4 683 202 (1987); e, PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1990). São conhecidos na técnica kits comercialmente disponíveis para a amplificação genómica por PCR. Ver, e.g., Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech). A protein do gene 32 de T4 (Boehringer Mannheim) pode ser utilizada para melhorar o rendimento de produtos de PCR longos. Também foram descritos métodos de rastreio à base de PCR. Wilfinger et al. descrevem um método à base de PCR no qual o cDNA mais longo é identificado no primeiro passo de modo a que os clones incompletos podem ser eliminados do estudo. BioTechniques, 22(3):481-486 (1997).

Alternativamente, as sequências da invenção podem ser utilizadas para isolar as sequências correspondentes noutros organismos, particularmente outras plantas, mais particularmente, outras monocotiledóneas. Deste modo, podem ser utilizados métodos tais como PCR, hibridação, e semelhantes para identificar as sequências que possuem uma semelhança de sequência substancial com as sequências da invenção. Ver, por exemplo, Sambrook, e Innis et al. (1990), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York). Sequências codificantes isoladas com base na sua identidade de sequências com as sequências codificantes inventivas inteiras aqui apresentadas ou 41 ΡΕ1786901 com seus fragmentos estão englobadas pela presente invenção .

Os ácidos nucleicos isolados da presente invenção também podem ser preparados por sintese quimica direta através de métodos tais como o método de fosfotriéster de Narang et ai., Meth. Enzymol. 68:90-99 (1979); o método de fosfodiéster de Brown et ai., Meth. Enzymol. 68:109-151 (1979); o método de dietilfosforamidite de Beaucage et al., Tetra. Lett. 22: 1859-1862 (1981); o método de triéster de fosforamidite de fase sólida descrito por Beaucage e Caru-thers, Tetra. Lett. 22(20):1859-1862 (1981), e.g., utilizando um sintetizador automatizado, e.g., como descrito em Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168 (1984); e, o método do suporte sólido da Pat. U.S. No. 4 458 066. A sintese química, de um modo geral, produz um oligonucleótido de cadeia simples. Este pode ser convertido em DNA de cadeia dupla através da hibridação com uma sequência complementar, ou por polimerização com uma poli-merase de DNA utilizando a cadeia simples como um molde. Um especialista irá reconhecer que embora a síntese química do DNA esteja limitada a sequências de cerca de 100 bases, podem ser obtidas sequências mais longas através da ligação de sequências mais curtas. A totalidade ou uma porção substancial dos fragmentos de ácido nucleico da presente invenção também podem ser utilizados como sondas para mapear geneticamente e fisicamente os genes de que fazem parte, e como marcadores 42 ΡΕ1786901 para caracteristicas ligadas a esses genes. Essa informação pode ser útil no melhoramento de plantas de modo a desenvolver linhas com os fenótipos desejados. Por exemplo, os presentes fragmentos de ácido nucleico podem ser utilizados como marcadores de polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição (RFLP). As transferências de Southern (Sambrook) de DNA genómico de plantas digerido por enzimas de restrição podem ser rastreadas com sonda com os fragmentos de ácido nucleico da presente invenção. Os padrões de bandas resultantes podem ser então sujeitos a análises genéticas utilizando programas de computador tais como MapMaker (Lander et al.r (1987) Genomics 1:174-181) para construir um mapa genético. Adicionalmente, os fragmentos de ácido nucleico da presente invenção podem ser utilizados para rastrear transferências de Southern que contêm DNAs genómicos tratados com endonucleases de restrição de um conjunto de indivíduos que representam os pais e a descendência de um cruzamento genético definido. A segregação dos polimorfismos de DNA é assinalada e utilizada para calcular a posição da presente sequência de ácido nucleico no mapa genético previamente obtido utilizando esta população (Botstein, D. et al., (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314-331). A produção e utilização de sondas derivadas de genes de plantas para utilização no mapeamento genético é descrito em R. Bematzky, R. e Tanksley, S. D. (1986) Plant Mol. Biol. Repórter 4(1):37-41. Numerosas publicações descrevem o mapeamento genético de clones de cDNA espe- 43 ΡΕ1786901 cíficos utilizando a metodologia delineada acima ou variações destes. Por exemplo, populações de intercruzamentos da F2, populações de retrocruzamentos, populações de cruzamentos aleatórios, linhas isogénicas próximas, e outros conjuntos de indivíduos podem ser utilizados para mapea-mento. Essas metodologias são bem conhecidas desses especialistas na técnica.

As sondas de ácido nucleico derivadas das presentes sequências de ácidos nucleicos também podem ser utilizadas para o mapeamento físico (i.e., colocação de sequências nos mapas físicos; ver Hoheisel, J. D., et al., In: Nonmammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319-346, e referências aí citadas).

Noutra forma de realização, as sondas de ácido nucleico derivadas das presentes sequências de ácidos nucleicos podem ser utilizadas em mapeamento por hibridação de fluorescência direta in situ (FISH) (Trask, B. J. (1991) Trends Genet. 7:149-154). Embora os métodos correntes de mapeamento de FISH favoreçam a utilização de clones grandes (vários até várias centenas KB; ver Laan, M. et al. (1995) Genome Research 5:13-20), os melhoramentos na sensibilidade podem permitir o desempenho de mapeamento de FISH utilizando sondas mais curtas.

Uma variedade de métodos baseados na amplificação de ácido nucleico do mapeamento genético e físico podem ser 44 ΡΕ1786901 realizados utilizando as presentes sequências de ácidos nucleicos. Exemplos incluem a amplificação especifica para o alelo (Kazazian, Η. H. (1989) J. Lab. Clin. Med. 114(2): 95-96), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield, V. C. et al. (1993) Genomics 16: 325-332), ligação especifica para o alelo (Landegren, U. et al. (1988) Science 241:1077-1080), reações de extensão de nucleótidos (Sokolov, B. P. (1990) Nucleico Acids Res. 18:3671), Mapeamento de Híbridos por Radiação (Walter, M. A. et al. (1997) Nature Genetics 7:22-28) e Happy Mapping (Dear, P. H. e Cook, P. R. (1989) Nucleic Acids Res.. 17:6795-6807). Para Estes métodos, a sequência de um fragmento de ácido nucleico é utilizada para conceber e produzir pares de iniciadores para utilização na reação de amplificação ou em reações de extensão do iniciador. A conceção desses iniciadores é bem conhecida dos especialistas na técnica. Nos métodos que empregam o mapeamento genético baseado na PCR, pode ser necessário identificar diferenças na sequência de DNA entre os pais do cruzamento do mapeamento na região que corresponde à presente sequência de ácido nucleico. Isto, contudo, não é, de um modo geral, necessário para os métodos de mapeamento.

Fenótipos de mutantes de perda de função podem ser identificados para os presentes clones de cDNA quer por protocolos de interrupção do gene alvo ou por identificação de mutantes específicos para os genes contidos em populações que contêm mutações em todos os genes possíveis (Ballinger e Benzer, (1989) Proc. Natl. Acad. Sei USA 45 ΡΕ1786901 86:9402; Koes et al., (1995) Proc. Natl. Acad. Sei USA 92:8149; Bensen et al., (1995) Plant Cell 7:75). A última abordagem pode ser realizada de vários modos. Primeiro, os segmentos curtos dos presentes fragmentos de ácido nucleico podem ser utilizados em protocolos da reação da polimerase em cadeia em conjunção com um iniciador de sequência de marcador de mutação em DNAs preparados a partir de uma população de plantas nas quais foram introduzidos transposões de mutador ou algum outro elemento de DNA que provoca mutação (ver Bensen, supra). A amplificação de um fragmento de DNA especifico com os iniciadores indica a inserção do elemento de marcador de mutação em, ou próximo de, o gene da planta que codifica o inositol polifosfato 2-quinase. Alternativamente, o presente fragmento de ácido nucleico pode ser utilizado como a sonda de hibridação contra os produtos de amplificação de PCR criados a partir da população de mutação utilizando o iniciador da sequência de marcador da mutação em conjunção com um iniciador de sitio genómico arbitrário, tal como aquele do adaptador sintético ancorado no sitio da enzima de restrição. Em terceiro, as mutações podem ser mapeadas em genes específicos utilizando endonucleases de cadeia simples capazes de clivar nas zonas de desemparelhamento (Till et al.(2004) Nucleic Acids Res. 32:2632-41), um método conhecido como TILLING. Finalmente, podem ser identificadas deleções utilizando métodos de PCR conhecidos dos especialistas na técnica, como descrito no Pedido de Patente US 20050053975 e como apresentado de seguida nos presentes exemplos. Com cada método, pode ser identificada e obtida uma planta 46 ΡΕ1786901 contendo uma mutação no gene endógeno que codifica uma inositol polifosfato 2-quinase. Esta planta mutante pode ser então utilizada para determinar ou confirmar a função natural do produto do gene.

As proteinas da presente invenção incluem proteínas que possuem as sequências descritas, assim como as proteinas codificadas pelos polinucleótidos revelados. Adicionalmente, as proteinas da presente invenção incluem proteinas derivadas da proteina nativa por deleção, adição ou substituição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sitios na proteina nativa. Essas variantes podem resultar de, por exemplo, polimorfismo genético ou de manipulação humana. Os métodos para essas manipulações são, de um modo geral, conhecidos na técnica.

Por exemplo, as variantes da sequência de aminoácidos do polipéptido podem ser preparadas por mutações na sequência de DNA clonada que codifica a proteina nativa de interesse. Os métodos para mutagénese e alterações na sequência de nucleótidos são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Walker e Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488 — 492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol. 154:367-382; Sam-brook; Pat. U.S. No. 4 873 192; e as referências ai citadas; aqui incorporadas por referência. Guias sobre substituições apropriadas de aminoácidos que não afetam a atividade biológica da proteina de interesse seriam rapidamen- 47 ΡΕ1786901 te entendidos pelos especialistas na técnica. Podem ser preferidas substituições conservadoras, tais como a permuta de um aminoácido por outro possuindo propriedades semelhantes .

Na construção de variantes das proteinas de interesse, as modificações às sequências de nucleótidos que codificam as variantes podem ser, de um modo geral, feitas de modo a que as variantes continuem a possuir a atividade desejada. As proteinas isoladas da presente invenção incluem um polipéptido que compreende pelo menos 25 aminoáci-dos contíguos codificados por qualquer um dos ácidos nucleicos da presente invenção, ou polipéptidos que são suas variantes modificadas de modo conservador. As proteinas da presente invenção ou suas variantes podem compreender qualquer número de residuos de aminoácidos contíguos de um polipéptido da presente invenção, em que esse número é selecionado a partir do grupo de inteiros que consistem desde 25 até ao número de residuos num polipéptido de comprimento total da presente invenção. Opcionalmente, esta subsequência de aminoácidos contíguos tem pelo menos 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100,150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, ou 500 aminoácidos de comprimento. A presente invenção inclui polipéptidos cataliti-camente ativos (i.e., enzimas). Os polipéptidos catalitica-mente ativos terão, de um modo geral, uma atividade específica de pelo menos cerca de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 48 ΡΕ1786901 70%, 80%, 90%, ou 95% aquela do polipéptido endógeno nativo (não-sintético). Para além disso, a especificidade do substrato (Kcat/Kin) pode ser, opcionalmente, substancialmente semelhante ao polipéptido endógeno nativo (não-sintético) , para cada atividade. Tipicamente, o Km será pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 95% aquela do polipéptido endógeno nativo (não-sintético) , para um qualquer dado substrato. Os métodos de ensaio e quantificação de medidas de atividade enzimática e especificidade para o substrato (Kcat/Km) , são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Ver, e.g., Segel, Biochemical Calculations, 2nd ed., John Wiley e Sons, New York (1976). A presente invenção inclui modificações que podem ser realizadas para uma proteína inventiva. Em particular, pode ser desejável diminuir a atividade do gene. Podem ser realizadas outras modificações para facilitar a clonagem, expressão, ou incorporação da molécula alvo numa proteína de fusão. Essas modificações são bem conhecidas dos especialistas na técnica e incluem, por exemplo, uma metionina adicionada ao terminal amino para proporcionar um sítio de iniciação, ou aminoácidos ou péptidos adicionais (e.g., poli His, GST, etc) colocados em qualquer um dos terminais para criar sítios de restrição localizados convenientemente ou codões de terminação ou purificação.

Uma proteína da presente invenção, uma vez expressa, pode ser isolada a partir das células através da 49 ΡΕ1786901 lise das células e aplicando técnicas de isolamento de proteínas convencionais aos lisados. A monitorização do processo de purificação pode ser realizada utilizando técnicas de transferência de Western ou radioimunoensaios ou outras técnicas de imunoensaio convencionais. Estão também disponíveis cassetes de expressão que dirigem a proteína expressa para ser segregada da célula para o meio. Nestes casos, a proteína expressa pode ser purificada a partir do meio de cultura de células utilizando técnicas de purificação de proteínas convencionais.

As proteínas da presente invenção também podem ser construídas utilizando métodos sintéticos não celulares. A síntese de fase sólida de proteínas inferiores a cerca de 50 aminoácidos de comprimento pode ser realizada através da ligação do aminoácido C-terminal da sequência a um suporte insolúvel seguido da adição sequencial dos restantes aminoácidos na sequência. Técnicas para síntese em fase sólida são descritas por Barany e Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis, pp. 3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A.; Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156 (1963), e Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chem. Co., Rockford, III. (1984). Proteínas de tamanho superior podem ser sintetizadas por condensação dos terminais amino e carboxilo de fragmentos mais curtos. Os métodos de formação de ligações peptídicas por ativação de uma extremidade do terminal carboxilo (e.g., através da utilização do reagente de 50 ΡΕ1786901 acoplamento N,N'-diciclo-hexilcarbodiimida) são conhecidos dos especialistas.

As proteínas desta invenção, recombinantes ou sintéticas, podem ser purificadas até à pureza substancial através de técnicas convencionais bem conhecidas na arte, incluindo solubilização com detergente, precipitação seletiva com substâncias tais como sulfato de amónia, cromatografia em coluna, métodos de imunopurificação, e outros. Ver, por exemplo, R. Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag: New York (1982); Deutscher, Guide to Protein Purification, Academic Press (1990). Por exemplo, podem ser criados anticorpos para as proteínas como aqui descrito. A purificação a partir de E. coli pode ser realizada seguindo os processos descritos na Pat. U.S. No. 4 511 503.

Os meios de deteção das proteínas da presente invenção não são aspetos críticos da presente invenção. As proteínas podem ser detetadas e/ou quantificadas utilizando qualquer um de um número de ensaios de ligação imunológica bem reconhecidos (ver, e.g., Pat. U.S. Nos. 4 366 241; 4 376 110; 4 517 288; e 4 837 168) . Para uma revisão dos imunoensaios gerais, ver também Methods in Cell Biology, Vol. 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, Ed., Academic Press, Inc. New York (1993); Basic and Clinicai Immunology 7th Edition, Stites & Terr, Eds. (1991). Para além disso, os imunoensaios da presente invenção podem ser realizados em qualquer uma de várias configurações, e.g., aquelas 51 ΡΕ1786901 revistas em Enzyme Immunoassay, Maggio, Ed., CRC Press, Boca Raton, Fia. (1980); Tijan, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam (1985); Harlow e Lane, supra; Immunoassay: A Practical Guide, Chan, Ed., Academic Press, Orlando, Fia. (1987); Principies and Practice of Immunoassays, Price and Newman Eds., Stockton Press, NY (1991); e Non-isotopic Immunoassays, Ngo, Ed., Plenum Press, NY (1988). Métodos tipicos incluem a análise de transferência de Western (imunotransferência) , métodos de bioquimica analítica, tais como eletroforese, eletroforese capilar, cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC), croma-tografia em camada fina (TLC), cromatografia de hiperdi-fusão, e semelhantes, e vários métodos imunológicos, tais como reações de precipitação em fluido ou em gel, imuno-difusão (simples ou dupla), imunoeletroforese, radioimuno-ensaios (RIAs), ensaios de imunoabsorção ligado a enzima (ELISAs), ensaios imunofluorescentess, e afins.

Os marcadores não radioativos são frequentemente ligados por meios indiretos. De um modo geral, uma molécula de ligando (e.g., biotina) é ligada covalentemente à molécula. O ligando liga-se então a uma molécula anti-ligando (e.g., estreptavidina) que é detetada inerentemente ou ligada covalentemente a um sistema sinal, tal como uma enzima detetável, um composto fluorescente, ou um composto quimioluminescente. Podem ser utilizados vários ligandos e 52 ΡΕ1786901 anti-ligandos. Quando um ligando possui um anti-ligando natural, por exemplo, biotina, tiroxina, e cortisol, pode ser utilizado em conjunto com os anti-ligandos que ocorrem naturalmente, marcados. Alternativamente, qualquer composto hapténico ou antigénico pode ser utilizado em combinação com um anticorpo.

As moléculas também podem ser conjugadas diretamente com os compostos de geram sinal, e.g., através da conjugação com uma enzima ou fluoróforo. Enzimas de interesse como marcadores serão principalmente hidrolases, particularmente fosfatases, esterases e glicosidases, ou oxi-dorredutases, particularmente peroxidases. Compostos fluorescentes incluem fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, danselo, umbeliferona, etc. Compostos qui-mioluminescentes incluem luciferina, e 0,2,3-di-hidro-ftalazinedionas, e.g., luminol. Para uma revisão de vários sistemas de produção de marcação ou sinal que podem ser utilizados, ver, Pat. U.S. No. 4 391 904, que é aqui incorporada por referência.

Alguns formatos de ensaio não requerem a utilização de componentes marcados. Por exemplo, podem ser utilizados ensaios de aglutinação para detetar a presença dos anticorpos alvo. Neste caso, as partículas revestidas com antigénio são aglutinadas pelas amostras que compreendem os anticorpos alvo. Neste formato, nenhum dos componentes precisa de ser marcado e a presença do anticorpo alvo é detetada por simples inspeção visual. 53 ΡΕ1786901

As proteínas da presente invenção podem ser utilizadas para identificar compostos que se ligam a (e.g., substratos), e/ou aumentar ou diminuir (i.e., modular) a atividade enzimática de polipéptidos cataliticamente ativos da presente invenção. O método compreende colocar em contacto um polipéptido da presente invenção com um composto cuja capacidade para se ligar a ou modular a atividade da enzima a ser determinada. 0 polipéptido empregue possuirá pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% da atividade específica do polipéptido de comprimento total, nativo, da presente invenção (e.g., enzima). Métodos de medição da cinética enzimática são bem conhecidos na técnica. Ver, e.g., Segel, Biochemical Calculations, 2nd ed., John Wiley e Sons, New York (1976).

Podem ser criados anticorpos contra uma proteína da presente invenção, incluindo variantes individuais, alélicas, de estirpe, ou de espécie, e seus fragmentos, nas suas formas que ocorrem naturalmente (comprimento total) e nas formas recombinantes ou sintéticas. Adicionalmente, os anticorpos são criados para estas proteínas nas suas configurações nativas ou nas configurações não nativas. Os anticorpos anti-idiotípicos também podem ser criados. Muitos métodos de produção de anticorpos são conhecidos dos especialistas.

Em alguns casos, é desejável preparar anticorpos monoclonais de vários hospedeiros de mamíferos, tais como 54 ΡΕ1786901 murganhos, roedores, primatas, humanos, etc. A descrição de técnicas para preparar esses anticorpos monoclonais é encontrada em, e.g., Basic and Clinicai Immunology, 4th ed., Stites et al., Eds., Lange Medicai Publications, Los Altos, Calif., e referências ai citadas; Harlow e Lane, Supra; Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, 2nd ed., Academic Press, New York, N.Y. (1986); e Kohler e Milstein, Nature 256:495-497 (1975).

Outras técnicas adequadas envolvem a seleção de bibliotecas de anticorpos recombinantes em vetores fágicos ou semelhantes (ver, e.g., Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989); e Ward et al., Nature 341:544-546 (1989); e Vaughan et al., Nature Biotechnology 14:309-314 (1996)). Alternativamente, a avidez elevada de anticorpos monoclonais humanos pode ser obtida a partir de murganhos transgénicos que compreendem os fragmentos do loci da Ig de cadeias pesada e leve humana não rearranjadas (i.e., mini-locus de murganhos transgénicos). Fishwild et al., Nature Biotech. 14:845-851 (1996). Também, podem ser produzidas imunoglobulinas recombinantes. Ver, Cabilly, Pat. U.S. No. 4 816 567; e Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86:10029-10033 (1989).

Os anticorpos desta invenção podem ser utilizados para cromatografia de afinidade no isolamento de proteínas da presente invenção, para o rastreio de bibliotecas de expressão para produtos de expressão particular tais como proteína normal ou anormal ou para criar anticorpos anti- 55 ΡΕ1786901 idiotípicos que são úteis para detetar ou diagnosticar várias condições patológicas relacionadas com a presença dos respetivos antigénios.

Frequentemente, as proteínas e os anticorpos da presente invenção podem ser marcados por ligação, quer covalentemente ou não covalentemente, uma substância que proporciona um sinal detetável. São conhecidas uma variedade de marcadores e técnicas de conjugação e são relatadas extensivamente na literatura cientifica e de patentes. Marcadores adequados incluem radionucleótidos, enzimas, substratos, cofactores, inibidores, meios fluorescentes, meios quimioluminescentes, partículas magnéticas, e semelhantes. A presente invenção proporciona ainda um método para modular (i.e., diminuir) a concentração ou composição dos polipéptidos da invenção reivindicada numa planta ou parte desta. A modulação pode ser realizada aumentando ou diminuindo a concentração e/ou a composição (i.e., a proporção dos polipéptidos da invenção reivindicada) numa planta. 0 método compreende transformar uma célula vegetal com uma cassete de expressão que compreende uma sequência de nucleótidos anti-sentido substancialmente complementar a (1) uma porção correspondente de uma cadeia de uma molécula de DNA que codifica inositol polifosfato 2-quinase, em que a molécula de DNA que codifica inositol 56 ΡΕ1786901 polifosfato 2-quinase híbrida em condições de baixa restringência com a SEQ ID NO: ou (2) uma porção correspondente de uma sequência de RNA que codifica pela molécula de DNA que codifica inositol polifosfato 2-quinase; e (b) sequências reguladoras ligadas operacionalmente às sequências de nucleótidos anti-sentido de modo a que as sequências de nucleótidos anti-sentido são expressos numa célula vegetal na qual se transformou.

Em algumas formas de realização, o conteúdo e/ou a composição de polipéptidos da presente invenção numa planta pode ser diminuída através da alteração, in vivo ou in vitro, do promotor de um gene não isolado da presente invenção para regular negativamente a expressão do gene. Em algumas formas de realização, as regiões codificantes de genes nativos da presente invenção podem ser alteradas via substituição, adição, inserção, ou deleção para diminuir a atividade da enzima codificada. Ver, e.g., Kmiec, Pat. U.S. No. 5 565 350; Zarling et al., PCT/US93/03868. Um método de regulação negativa da proteína envolve a utilização de sequências PEST que proporcionam um alvo para a degradação da proteína.

Em algumas formas de realização, um ácido nu-cleico isolado (e.g., um vetor) que compreende uma sequência de promotor é transfetado numa célula vegetal. Subsequentemente, uma célula vegetal que compreende o promotor ligado operacionalmente a um polinucleótido da presente invenção é selecionado por meios conhecidos dos espe- 57 ΡΕ1786901 cialistas na técnica tais como, mas não limitado a, transferência de Southern, sequenciação de DNA, ou análise de PCR utilizando iniciadores específicos para o promotor e para o gene e detetar amplicões produzidos a partir dai. Uma planta ou parte de planta alterada ou modificada pelas formas de realização acima mencionadas é cultivada em condições de formação da planta durante um tempo suficiente para diminuir a concentração e/ou composição dos polipéptidos da presente invenção na planta. As condições de formação de planta são bem conhecidas na técnica.

Em geral, o conteúdo do polipéptido é aumentado ou diminuído em pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% em relação a uma planta de controlo nativa, parte da planta, ou célula sem a cassete de expressão acima mencionada. A modulação na presente invenção pode ocorrer durante e/ou subsequente ao crescimento da planta até ao estágio de desenvolvimento desejado. A modulação das expressão do ácido nucleico temporalmente e/ou em tecidos particulares pode ser controlada empregando o promotor apropriado ligado operacionalmente a um poli-nucleótido da presente invenção em, por exemplo, uma orientação anti-sentido como discutido em maior detalhe, supra. A indução da expressão de um polinucleótido da presente invenção pode também ser controlada pela administração exógena de uma quantidade eficaz do composto da indução. Os promotores indutiveis e os compostos de indução que ativam a expressão a partir destes promotores são bem conhecidos na técnica. Em certas formas de realização, os polipéptidos 58 ΡΕ1786901 da presente invenção são modulados em monocotiledóneas ou dicotiledóneas, por exemplo milho, soja, girassol, cártamo, sorgo, canola, trigo, alfafa, arroz, cevada e milho-miúdo. 0 método de transformação não é critico para a presente invenção; estão presentemente disponíveis vários métodos de transformação. À medida que estão disponíveis métodos mais novos para transformar culturas ou outras células hospedeiras, eles podem ser aplicados diretamente. Consequentemente, foram desenvolvidos uma variedade de métodos para inserir uma sequência de DNA no genoma de uma célula hospedeira para obter a transcrição e/ou tradução da sequência para realizar alterações fenotípicas no organismo. Deste modo, qualquer método que proporciona uma transformação/transfeção eficiente pode ser empregue.

Uma sequência de DNA que codifica para um polinucleótido desejado da presente invenção, por exemplo um cDNA ou uma sequência genómica que codifica uma proteína de comprimento total, pode ser utilizada para construir uma cassete de expressão que pode ser introduzida na planta desejada. Os ácidos nucleicos isolados da presente invenção podem ser introduzidos nas plantas de acordo com técnicas conhecidas na arte. De um modo geral, as cassetes de expressão são preparadas como descrito acima e adequadas para transformação de células vegetais. Técnicas para transformar uma larga variedade de espécies de plantas superiores são bem conhecidas e 59 ΡΕ1786901 descritas na literatura técnica, cientifica, e de patentes. Ver, por exemplo, Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22:421-477 (1988). Por exemplo, a construção de DNA pode ser introduzida diretamente no DNA genómico da célula vegetal utilizando técnicas tais como electroporação, poração com PEG, bombardeamento de particulas, distribuição de fibras de silicio, ou microinjeção de protoplastos de células vegetais ou callus embriogénicos. Ver, e.g., Tomes et ai., Direct DNA Transfer into Intact plant cells Via Microprojectile Bombardment. pp.197-213 in Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods, Eds. O. L. Gamborg e G. C. Phillips, Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, 1995. Alternativamente, as construções de DNA podem ser combinadas com regiões de flanqueamento de T-DNA adequadas e introduzidas num vetor hospedeiro de Agro-bacterium tumefaciens convencional. As funções de virulência do hospedeiro de Agrobacterium tumefaciens irão dirigir a inserção da construção e do marcador adjacente para o DNA da célula vegetal quando a célula é infetada pela bactéria. Ver, Pat U.S. No. 5 591 616. A introdução das construções de DNA utilizando precipitação com polietilenoglicol é descrita em Paszkowski et ai., Embo J. 3:2717-2722 (1984) . As técnicas de electroporação são descritas em Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 82:5824 (1985). As técnicas de transformação de balistica são descritas em Klein et al., Nature 327:70-73 (1987). 60 ΡΕ1786901

As técnicas de transformação mediadas por Agro-bacterium tumefaciens estão bem descritas na literatura cientifica. Ver, por exemplo Horsch et al., Science 233:496-498 (1984), e Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 80: 4803 (1983). Por exemplo, a transformação do milho com

Agrobacterium é descrita na Pat. U.S. No. 5 981 840. A transformação de soja com Agrobacterium é descrita na Pat. U.S. No. 5 563 055.

Outros métodos de transformação incluem (1) transformação mediada por Agrobacterium rhizogenes (ver, e.g., Lichtenstein e Fuller In: Genetic Engineering, Vol. 6, P. W. J. Rigby, Ed., London, Academic Press, 1987; e Lichtenstein, C. P. e Draper, J. In: DNA Cloning, Vol. 11, D. M. Glover, Ed., Oxford, IRI Press, 1985), O Pedido PCT/US87/02512 (WO 88/02405 publicado a 7 de Abr. De 1988) descreve a utilização da estirpe de A. rhizogenes A4 e o seu plasmideo Ri juntamente com os vetores de A. tumefaciens pARC8 ou pARC16, (2) incorporação de DNA mediado por lipossomas (ver, e.g., Freeman et al., Plant Cell Physiol. 25:1353 (1984)), e (3) o método de agitação em vórtice (ver, e.g., Kindle, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:1228 (1990)). O DNA também pode ser introduzido em plantas através da transferência direta do DNA no pólen como descrito por Zhou et al., Methods in Enzymology 101:433 (1983); D. Hess, Intern Rev. Cytol., 107:367 (1987); Luo et al., Plant Mol. Biol. Repórter 6:165 (1988). A expressão de 61 ΡΕ1786901 polinucleótidos que codificam o polipéptido pode ser obtida por injeção do DNA nos órgãos reprodutores de uma planta como descrito por Pena et al., Nature 325:274 (1987). 0 DNA também pode ser injetado diretamente nas células de embriões imaturos e a reidratação de embriões dessecados como descrito por Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. 75: 30 (1987); e Benbrook et al., in Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham, Mass., pp. 27-54 (1986).

As células hospedeiras de animais e eucariontes inferiores (e.g., leveduras) são competentes ou tornadas competentes para transformação por vários meios. Existem vários métodos bem conhecidos de introdução de DNA em células animais. Estas incluem: precipitação com fosfato de cálcio, fusão das células recipientes com protoplastos bacterianos contendo o DNA, tratamento das células recipientes com lipossomas contendo o DNA, DEAE dextrano, electroporação, biolística, e micro-injeção do DNA diretamente para as células. As células transfetadas são cultivadas através de meios bem conhecidos na técnica. Kuchler, R. J., Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson e Ross, Inc. (1977).

As células vegetais transformadas que são derivadas por qualquer uma das técnicas de transformação acima podem ser cultivadas para regenerar uma planta total que possui o genótipo transformado. Essas técnicas de regeneração baseiam-se frequentemente na manipulação de certas fito-hormonas num meio de crescimento de cultura de 62 ΡΕ1786901 tecidos, baseando-se tipicamente num marcador de biocida e/ou herbicida que foi introduzido juntamente com um polinucleótido da presente invenção. Para transformação e regeneração de milho ver, Gordon-Kamm et al., The Plant Cell 2:603-618 (1990).

As células vegetais transformadas com um vetor de expressão de plantas podem ser regeneradas, e.g., a partir de células únicas, tecidos de callus ou discos de folhas de acordo com técnicas convencionais de cultura de tecidos vegetais. É bem conhecido na técnica que podem ser cultivadas com sucesso várias células, tecidos, e órgãos de quase qualquer planta para regenerar uma planta inteira. A regeneração de plantas a partir de protoplastos em cultura é descrita em Evans et al., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, Macmillan Publishing Company, New York, pp.124-176 (1983); e Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, CRC Press, Boca Raton, pp. 21-73 (1985). A regeneração de plantas que contêm o gene estranho introduzido através de Agrobacterium pode ser alcançada como descrito por Horsch et al., Science, 227:1229-1231 (1985) e Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80:4803 (1983). Este processo produz tipicamente rebentos num período de duas a quatro semanas e estes rebentos transformantes são então transferidos para um meio de indução de raízes apropriado contendo o agente de seleção e um antibiótico para prevenir o crescimento 63 ΡΕ1786901 bacteriano. Plantas transgénicas da presente invenção podem ser férteis ou estéreis. A regeneração também pode ser obtida a partir de callus de plantas, explantes, órgãos, ou partes destes. Essas técnicas de regeneração são descritas de um modo geral em KJee et al., Ann. Rev. Plant Phys. 38:467-486 (1987) . A regeneração de plantas a partir de protoplastos isolados de plantas ou de vários explantes é bem conhecida na técnica. Ver, por exemplo, Methods for Plant Molecular Biology, A. Weissbach e H. Weissbach, eds., Academic Press, Inc., San Diego, Calif. (1988). Para cultura e regeneração de células de milho ver, de um modo geral, The Maize Handbook, Freeling e Walbot, Eds., Springer, New York (1994); Corn and Corn Improvement, 3rd edition, Sprague e Dudley Eds., American Society of Agronomy, Madison, Wis. (1988) .

Um especialista reconhecerá que após a cassete de expressão ser incorporada de forma estável em plantas transgénicas e confirmada como estando operacional, pode ser introduzida noutras plantas por cruzamento sexual. Pode ser utilizada qualquer uma de várias técnicas de melhoramento convencionais, dependendo da espécie a ser cruzada.

Em culturas propagadas vegetativamente, as plantas transgénicas maduras podem ser propagadas retirando cortes, via produção de sementes apomíticas, ou através de técnicas de cultura de tecidos para produzir múltiplas 64 ΡΕ1786901 plantas idênticas. A seleção de transgénicos desejáveis é realizada e as novas variedades são obtidas e propagadas vegetativamente para utilização comercial. Em culturas propagandas por semente, as plantas transgénicas maduras podem ser auto-cruzadas para produzir uma planta endogâmica homozigótica. A planta endogâmica produz sementes contendo o novo ácido nucleico heterólogo introduzido. Estas sementes podem ser cultivadas para produzir plantas que iriam produzir o fenótipo selecionado.

As partes obtidas a partir da planta regenerada, tais como flores, sementes, folhas, ramos, fruta, e semelhantes estão incluídas na invenção, desde que estas partes compreendam células que compreendem o ácido nucleico isolado da presente invenção. A descendência e variantes, e mutantes das plantas regeneradas também estão incluídas dentro do âmbito da invenção, desde que estas partes compreendam as sequências de ácidos nucleicos introduzidos.

As plantas transgénicas que expressam um marcador de seleção podem ser rastreadas quanto à transmissão do ácido nucleico da presente invenção através de, por exemplo, técnicas convencionais de imunotransferência e de deteção de DNA. As linhas transgénicas são também avaliadas tipicamente nos níveis de expressão do ácido nucleico heterólogo. A expressão ao nível do RNA pode ser determinada inicialmente para identificar e quantificar as plantas positivas para a expressão. Podem ser empregues técnicas convencionais para análise de RNA e incluem 65 ΡΕ1786901 ensaios de amplificação por PCR utilizando iniciadores de oligonucleótido concebidos para amplificar apenas os moldes de RNA heterólogo e os ensaios se hibridação em solução utilizando sondas especificas para o ácido nucleico heterólogo. As plantas positivas para o RNA podem ser então analisadas para a expressão da proteina através de análise de imunotransferência de Western utilizando os anticorpos especificamente reativos da presente invenção. Adicionalmente, pode ser realizada hibridação in situ e imuno-citoquimica de acordo com protocolos convencionais utilizando sondas de polinucleótido especificas para o ácido nucleico heterólogo e anticorpos, respetivamente, para localizar sitios de expressão no tecido transgénico. De um modo geral, são normalmente rastreadas várias linhas transgénicas para o ácido nucleico incorporado para identificar e selecionar plantas com os perfis de expressão mais apropriados.

As plantas transgénicas da presente invenção podem ser homozigóticas para o ácido nucleico heterólogo adicionado; i.e., uma planta transgénica que contém duas sequências de ácidos nucleicos adicionadas, um gene no mesmo locus em cada cromossoma de um par de cromossomas. Uma planta transgénica homozigótica pode ser obtida através de cruzamentos sexuais (auto-cruzamentos) uma planta transgénica heterozigótica que contém um ácido nucleico heterólogo adicionado simples, germinando alguma da semente produzida e analisando as plantas resultantes produzidas para a expressão alterada de um polinucleótido da presente 66 ΡΕ1786901 invenção em relação a uma planta de controlo (i.e., nativa, não-transgénica). 0 retrocruzamento com uma planta parental e cruzamento externo com uma planta não transgénica também estão contemplados. Alternativamente, a propagação de plantas transgénicas heterozigóticas pode ser realizada através de apomixia. A presente invenção proporciona um método de genotipar uma planta compreendendo um polinucleótido da presente invenção. A genotipagem proporciona um meio de distinguir homólogos de um par de cromossomas e pode ser utilizada para diferenciar segregantes numa população de plantas. Podem ser utilizados métodos de marcador molecular para estudos filogenéticos, caracterizando relações genéticas entre as variedades das culturas, identificando cruzamentos ou híbridos somáticos, localizando segmentos de cromossoma que afetam as características monogénicas, clonagem à base de mapa, e o estudo de herança quantitativa. Ver, e.g., Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Chapter 7, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1997). Para métodos de marcador molecular, ver de um modo geral, The DNA Revolution by Andrew H. Paterson 1996 (Chapter 2) in: Genome Mapping in Plants (ed. Andrew H. Paterson) by Academic Press/R. G. Landis Company, Austin, Tex., pp.7-21. 0 método particular de genotipagem da presente invenção pode empregar qualquer número de técnicas analíticas de marcador molecular tais como, mas não limitado 67 ΡΕ1786901 a, polimorfismos de comprimento de fragmentos de amplificação (AFLPs). Os AFLPs são o produto de diferenças alé-licas entre fragmentos de DNA amplificados por PCR provocadas pela variabilidade da sequência de nucleótidos. Assim, a presente invenção proporciona ainda um meio para seguir a segregação de um gene ou ácido nucleico da presente invenção assim como sequências cromossómicas ligadas geneticamente a esses genes ou ácidos nucleicos utilizando técnicas como a análise de AFLP.

As plantas que podem ser utilizadas no método da invenção incluem plantas monocotiledóneas e dicotiledóneas. Plantas preferidas incluem milho, trigo, arroz, cevada, aveia, sorgo, milho-miúdo, centeio, soja, girassol, cár-tamo, alfafa, canola Brassica napus, algodão, ou relvado.

As sementes derivadas de plantas regeneradas a partir de células de plantas transformadas, partes de plantas ou tecidos de plantas, ou descendência derivada das plantas transformadas regeneradas, podem ser utilizadas diretamente como ração ou alimento, ou ainda pode ocorrer processamento. A presente invenção será ainda descrita por referência aos seguintes exemplos detalhados.

EXEMPLOS A presente invenção é ainda definida nos Exemplos seguintes, nos quais todas as partes e percentagens são em 68 ΡΕ1786901 peso e os graus são Celsius, salvo referência em contrário. Deve ser entendido que estes Exemplos, embora indiquem formas de realização preferidas da invenção, são fornecidos apenas a titulo ilustrativo.

Exemplo 1. Identificação de genes candidatos

IPP2-K

As sequências de DNA para genes previstos de pentaquisfosfato de inositol-quinase (In5-K) de humanos e de leveduras foram descritas em Verbsky, J.W. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 31857-31862 (de aqui em diante "Verbsky") . Os fragmentos de sequências do gene IPP2-K do milho putativo semelhantes foram identificados em bases de dados públicas incluindo GenBank (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/). Os fragmentos da sequência de milho foram alinhados com sequências humanas e de leveduras, e também utilizados para pesquisa nas bases de dados do NCBI de acordo com os algoritmos BLAST (Altschul, S.F. et al. (1991) J. Mol. Biol. 215:403-10). Várias sequências de Arabidopsis thaliana (AT5g42810, ATlg22100, ATlg58936) e de outras espécies foram identificadas no domínio público incluindo, mas não limitadas a BM520171, BE556094, BG882429 (Glycine max) ; C73039, AA750614, AL606608.3, AAAA01003483, AP008210, AK102842, XM 474214 (Oryza sativa) ; BH647760, BH724856 (Brassica oleracea); TC238218 (TIGR contig compreendendo os ESTs CA732984, BQ579364, BE430881, CD876080, BE498028, CA714664, BE498127, BJ233635, BE496998, CA604588, BJ212905, BJ220381 BE445478 CA700172 CA613702 de Triticum 69 ΡΕ1786901 aestivum), TC97085 (TIGR contig compreendendo CD233879, BG054179, BE594569, CD207152 de Sorgo bicolor), BN45053K04, BN25068E01, Brassica_napustuc04-02-05_2912, TC1941 (TIGR contig compreendendo CD832483, CD827663, CD837809 e CD832284 de Brassica napus).

Adicionalmente, as sequências que possuem niveis de semelhança de sequência baixos e se prevê que sejam funcionalmente distintos foram identificadas em bases de dados públicas e pedidos de patente publicadas (Shi, J. et al WO2003027243) . Estas sequências podem ser diferenciadas daquelas semelhantes a IPP2-K aqui reivindicada na base do grau de semelhança. As percentagens de semelhança e as relações filogenéticas entre estas sequências são apresentadas nas Figuras IA e 1B.

Adicionalmente, foram utilizadas aplicações de Alinhamento Múltiplo de Sequências do Vetor NTI para criar o alinhamento das sequências de aminoácidos previstas dos genes putativos de IPP2-K de milho, Arabidopsis e Arroz. Com base na identidade das sequências de aminoácidos, os resultados destes alinhamentos definiram regiões conservadas que são designadas como sequências de consenso como apresentadas em diagrama na Figura 2. Foram determinadas cinco sequências de consenso para definir motivos que são caracteristicas dos genes IPP2-K. Utilizando estes motivos para pesquisar bases de dados (e.g. GeneBank), alguém com experiência na técnica pode identificar genes putativos de IPP2-K adicionais de uma variedade de espécies de plantas: 70 ΡΕ1786901

1:DAXDWXYXXEGXXNLXLXYXGSSP

2:VEIKXKCGFLXXSXXIXXXNXXKXXXXRXXMXQXCKXXXXXISXXSE YXPLDLFSGSKXXXXXAIKXXXXTPQNXXXXXXGSLXXGG 3:ISXXSEYXPLDLFSGSK 4:LXXLLXXQKLDXXIEGXIHXYY 5:LIXXTAXDCSXMISF

Exemplo 2: Isolamento de sequências de cDNA de comprimento total

Pesquisas das bases de dados públicas de sequências de milho (www.maizegdb.org) identificaram sequência expressas marcadoras (ESTs) BG842305, AW066374 e BE639260 como fragmentos de sequência contígua (contig) ZMtuc02-12-23.4536. Este contig tem 1,7 kb de comprimento. A sequência de proteína traduzida deste contig contém sequências que eram muito semelhantes às caixas A, B, C e D conservadas identificadas no gene da quinase de pentaquisfosfato de inositol humana (In5-K) como descrito por Verbsky. Foi utilizada uma abordagem de RT-PCR para obter clones de cDNA de milho de IPP2-K como descrito neste exemplo.

Foi isolado mRNA com cauda de Poli (A)+ de sementes de milho (DAS 5XH751) aos 9 dias após polinização (DAP) utilizando uma combinação de reagente TRIzol (Invi-trogen, Carlsbad, CA) e um kit MACS kit (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Foi realizada uma reação de transcrição reversa neste mRNA para criar cDNA utilizando um iniciador especifico para o gene derivado de ZMtuc02-12-03.4536 (5'— TCG GAA ATT ACT GTG ACA AGC-3') e a enzima Superscriptase 71 ΡΕ1786901 II (Invitrogen) como sugerido pelo fabricante. A amplificação de um cDNA de IPP2-K foi realizada utilizando diferentes iniciadores específicos para o gene derivados de ZMtuc02-12-23.4536 (5'-GAA TCG GCA CGA GGC AGC AGC GGC AGC-3' e 5'-TGA CAA GCC ACG GTG TAT GCA-3'). O cDNA amplificado foi clonado no vetor plasmidico, vetor pCR2.1 utilizando um kit TA cloning de acordo com a recomendação dos fabricantes (Invitrogen) . Este cloned de cDNA de IPP2-K de milho (1,6 kb de comprimento) foi designado como zmIP5K-l.

Para obter sequências correspondentes às regiões 5'- e 3'-não traduzidas (UTRs) do cDNA de IPP2-K, foram realizadas experiências de amplificação rápida das extremidades de cDNA (RACE) utilizando o kit GeneRacer™ da Invi-trogen. Para a 5'-RACE, o mRNA das sementes a 9 DAP foi tratado com fosfatase de intestino de vitela e pirofosfa-tase ácida de tabaco como descrito pelo fabricante. Um oligonucleótido de RNA (RNA âncora) fornecido com o kit foi ligado ao mRNA descrito acima de acordo com as instruções do kit. A transcrição reversa foi dirigida por outro iniciador especifico para o gene IPP2-K (5'- GCA ATA GCA AAT TGA GAT ACA TTC ATA C-3'). A extremidade 5' do cDNA da quinase de IPP2-K de milho putativo foi subsequentemente amplificada utilizando um iniciador derivado da sequência do RNA âncora e de um iniciador especifico para um gene diferente (5'-TTC CAG GCG TTA AGG GTC GAG CCT-3'). 0 amplicão resultante foi clonado no vetor plasmidico pCR2.1 e sequenciado. 72 ΡΕ1786901

Para obter sequências 3'-UTR, a transcrição reversa do mRNA de sementes 9 DAP foi dirigida com um iniciador oligo-d(T) e um iniciador derivado do RNA âncora na extremidade 3' de acordo com o kit GeneRacer™. As extremidades 3' dos transcritos do IPP2-K putativo foram então amplificados com iniciadores específicos para o gene derivados de zmIP5K-l (5'-CGT GTT TCT AGG GAT TTT CTG GAG CTT-3') e da sequência do 3'-RNA âncora que flanqueia o iniciador oligo-d(T). Os produtos de PCR foram clonados no pCR2.1 e sequenciados. Subsequentemente, os dados de sequência dos clones derivados de ambas as experiências de RACE 5'- e 3' foram utilizados para construir iniciadores de PCR específicos para IPP2-K correspondendo às UTRs (5'-CTT CAG TCC CTT TCC CCG GGC T-3' e 5'-TTT TTT TTT TTT GGA GGA TGA AAG TTT CAC CAA ACA TTT CT-3'). Utilizando estes iniciadores, a amplificação por RT-PCR do mRNA de sementes 9 DAP foi realizada utilizando a Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen) para produzir cDNAs de IPP2-K putativa de comprimento total. Os produtos de PCR resultantes foram então clonados no pCR2.1 e foram sequenciados quatro clones independentes. A sequência de nucle-ótidos do clone que representa o cDNA de IPP2-K de comprimento total é designada como (SEQ ID NO 1) e a sequência de aminoácidos prevista da proteína codificada por este cDNA é designada como (SEQ ID NO 2).

Exemplo 3: Identificação de sequências de DNA genómico

Utilizando a sequência do cDNA de IPP2-K de milho 73 ΡΕ1786901 putativo isolado como uma sequência de pesquisa, a base de dados genómica de milho (www.maizegdb.org) foi pesquisada de acordo com BLAST e sobreposição adicional, foram identificados fragmentos de sequência semelhantes de função desconhecida. Estas sequências foram montadas em contigs/sim-pletos incluindo ZMGSStuc28403.1, ZMGSStuc 03-04-29.4761.

Foram realizadas transferências de Southern Genó-micas utilizando protocolos convencionais (Sambrook). Foi analisado o DNA genómico do milho (DAS 5XH751) quer digerido ou não digerido unicamente com as enzimas BamH I, EcoR I, Hind III e Not I. Os fragmentos de gDNA foram separados por eletroforese em agarose a 0,8%, transferidos para uma membrana de nylon e hibridados em condições de restringência (0,2 X SSC, 60°C graus) com 25 ng de sonda de cDNA de 1,6 kb de IPP2-K de milho (zmIP5K-l) marcada com 32P-dCTP (Prime-It II labeling kit, Stratagene, La Jolla, CA) . As bandas que correspondem a 2 ou 3 genes foram identificadas como possíveis IPP2-K candidatos, indicando que o gene está presente com uma família de genes pequena.

Exemplo 4. Isolamento de clones genómicos de IPP2-K a partir de uma biblioteca em fago lambda. 0 DNA genómico de milho (DAS5XH751) foi isolado a partir de tecido de folha com 3 semanas de idade que tinha sido moído num pó fino em azoto líquido. O gDNA foi extraído utilizando métodos convencionais à base de brometo de cetiltrimetilamónia (CTAB) como descrito em Sambrook num 74 ΡΕ1786901 tampão consistindo em Tris a 100 mM pH 7,5, NaCl a 0,7 M, EDTA a 10 mM, CTAB a 1%, β-mercaptoetanol a 1%. 0 DNA resultante foi digerido com a enzima de restrição BamR I e as extremidades foram sujeitas a uma reação de enchimento utilizando a enzima Klenow (Stratagene, La Jolla, CA) de acordo com as recomendações do fabricante. Após as reações de enchimento, o DNA foi extraido, precipitado e ligado num vetor de bacteriófago lambda (Lambda FixII, Stratagene) que foi pré-digerido com Xho I de acordo com o protocolo descrito pelo fabricante exceto que o tampão de ligação e a enzima ligase foram fornecidos pela Promega (Madison, WI). Utilizando o Gigapack kit da Stratagene, a mistura de ligação foi adicionada ao extrato de empacotamento Gigapack III XL de acordo com as recomendações do fabricante e a biblioteca empacotada foi plaqueada em meio LB utilizando métodos convencionais descritos por Sambrook. A biblioteca genómica de milho resultante tinha um titulo de fagos de 3,6 X 106 PFUs. Após amplificação de rotina, o titulo final da biblioteca foi de 3,6 X IO10 PFU/mL.

Os métodos para o rastreio da biblioteca de lambda foram derivados de Sambrook. A biblioteca genómica do milho DAS5XH751 foi plaqueada a uma densidade elevada e transferida para membranas de nylon. As membranas foram hibridadas em condições de restringência (2 lavagens com 1 X SSC, 2 lavagens com 0,2 X SSC a 65°C) com uma sonda que consiste num clone de fragmento de cDNA de 1,6 kb de IPP2-K (zmIPSK-1) marcado como descrito acima. As placas positivas foram isoladas e sujeitas a 2 rondas adicionais de 75 ΡΕ1786901 rastreio, resultando em vários clones de lambada positivos putativos. A sequenciação do DNA dos fragmentos clonados confirmou a identidade destas sequências como derivado do gene IPP2-K genómico. Estas sequências juntamente com clones BAC descritos abaixo foram utilizados para criar a sequência genómica contígua designada como (SEQ ID NO 3).

Exemplo 5: Isolamento e caracterização de um clone de BAC contendo o gene IPP2-K.

Foi preparada uma biblioteca de cromossomas artificiais bacterianos (BAC) a partir do DNA genómico de milho (DAS endogâmico 5XH751) de acordo com métodos descritos por Zhang (2002). O tecido da planta foi recolhido a partir de tecidos de plântulas de 2 semanas de idade e congelado em azoto líquido. O tecido congelado foi moído em pó fino em azoto líquido, transferido para 1 X HB (10X stock: Trizma base a 0,1 M, KC1 a 0,8 M, EDTA a 0,1 M, espermidina a 10 mM, espermina a 10 mM, pH 9,4-9,5) mais 0,15% de β- mercaptoetanol e Triton X-100 a 0,5%, agitado em remoinho durante 10 minutes em gelo e filtrado através de duas camadas de gaze e uma camada de Miracloth. O homogenato foi sedimentado e lavado com tampão de lavagem gelado (Trizma base a 0,01 M, KC1 a 0,08 M, EDTA a 0,01 M, espermidina a 1 mM, espermina a 1 mM, Triton X-100 a 2%, β-mercaptoetanol a 0,015%, pH 9,4-9,5). O sedimento dos núcleos foi ressuspenso em tampão de lavagem e re-sedimentado por 76 ΡΕ1786901 centrifugação a 1 800 X g, a 4°C durante 15 minutos 3 vezes. Os núcleos sedimentados foram ressuspensos em 1 mL de 1 X HB e contados. A concentração de núcleos foi ajustada para 5 x 107 núcleos/mL com 1 X HB. Os núcleos intactos foram incorporados em rolhões de agarose como descrito em Zhang (2002), lavados em EDTA a 0,5 M, pH 9,0-9,3 durante uma hora a 50°C, lavados em EDTA a 0,05 M, pH 8,0 durante uma hora em gelo, e armazenados em EDTA a 0,05 M, pH 8,0 a 4°C. Foi realizada purificação posterior de DNA megabase nos rolhões através de lavagem dos rolhões com núcleos três vezes durante uma hora em 10-20 volumes de TE gelado (Tris-HCl a 10 mM a pH 8,0, EDTA a 1 mM, pH 8,0) mais fluoreto de sulfonilo de fenilmetilo a 0,1 mM (PMSF). O DNA foi lavado adicionalmente três vezes durante uma hora em 10-20 volumes de TE gelado. O DNA genómico nos núcleos incorporados foi digerido com a enzima de restrição EcoRI diretamente nos rolhões de agarose, como descrito em Zhang (2002) . Após digestão, as reações foram paradas com 1/10 volume de EDTA a 0,5 M, pH 8,0. A eletroforese em gel em campo pulsado seguida por seleção por tamanho em rolhões de agarose foi realizada no DNA digerido antes da ligação em vetores BAC de acordo com Zhang (2002) .

Como descrito em Zhang (2002), o DNA do vetor BAC pECBACl foi digerido com a enzima de restrição EcoRI. O DNA do vetor linearizado foi desfosforilado com a enzima CIAP (Invitrogen) e a reação de 400 yL foi parada com 4 mL de 77 ΡΕ1786901 EDTA a 0,5 M, pH 8,0, 20 mL de SDS a 14% e 40 mL de proteinase K a 1 mg/mL em TE frio. O DNA foi precipitado adicionando 1/10 do volume de NaAC a 3 M, pH 7,0 e 2 volumes de etanol a 100%, incubando a -80°C durante 10 minutos após a centrifugação a 10 000 rpm durante 15 minutos. Após lavagem e ressuspensão, a concentração do DNA foi ajustada para 10 ng/mL e o vetor foi armazenado a -20 °C. A ligação do DNA genómico de megabases ao vetor de BAC pECBACl foi realizada como se segue: o DNA genómico eluido a partir do rolhão de agarose foi dialisado 2X contra um litro de 0,5 x TE gelado, em gelo, durante 1 hora. A concentração do DNA recolhido foi estimada num gel de agarose a 1%. As reações de ligação foram realizadas a uma proporção de peso molecular de vetor: DNA de 1:4 com a enzima ligase de DNA de T4 de acordo com processos convencionais como descrito em Zhang (2002). As reações de ligação foram incubadas a 16°C durante 8-12 horas. A transformação das misturas de ligação em células competentes de E. coli (DHB10B, Invitrogen) foi realizada via electroporação utilizando um Cell Porator System com Voltage Booster e cuvetes de 0,15 cm gap Cell Porator (Labrepco, Horsham PA). Os parâmetros da electroporação foram uma capacitância de 330 pF, resistência de 4K ohms. Após electroporação, as células foram recuperadas a 37°C com agitação em ~1 mL de meio SOC, sedimentadas por centrifugação e armazenadas em meio de congelação (2,5 p/v 78 ΡΕ1786901 caldo LB granulado, KH2PO4 a 13 mM, K2HPO4 a 36 mM, citrato de sódio a 1,7 mM, (NH4)2S04 a 6,8 mM, glicerol a 4,4% p/v) até serem plaqueadas. As culturas foram plaqueadas em meio LB mais 1,5% de bactoagar, X-gal a 90 yg/mL, IPTG a 90 yg/mL e cloranfenicol a 12,5 yg/mL a uma densidade que resultou em colónias discretas de bactérias. Foram repicadas colónias individuais utilizando um robot Q-bot (Genetix, Boston MA) numa rotina de repicagem e dispostas em 300 placas de 384 poços. 0 teste de titulo desta biblioteca de BAC de milho derivou da variedade endogâmica DAS 5XH751 indicou que a biblioteca continha aproximadamente 115 000 clones com um tamanho de inserção médio de fragmentos genómicos de 130 kb. A biblioteca de BAC de milho 5XH751 em série foi aplicada em membranas de nylon de 22 cm2 em grelhas de 4X4 utilizando um robot Q-bot (Genetix, Boston MA) numa rotina de transferência. Os filtros foram cultivados em LB agarose a 37°C durante a noite, depois desnaturadas, fixadas e secas de acordo com Sambrook exceto que foi adicionado um passo de lise, antes da hibridação. Os filtros foram hibridados em condições de restringência (2 lavagens com 1 X SSC em SDS a 0,1%, 2 lavagens com 0,2 X SSC, SDS a 0,1% a 65°C) com uma sonda que consiste num fragmento de 916 pb de IPP2-K (zmIP5K-l) criado por PCR a partir do clone de cDNA (zmIP5K-l) utilizando os iniciadores especificos para IPP2-K (IP5K-PF3: 5'-AGTCCCTTTCCCCGGGCTGTGGTAC-3' e IP5K-PR 1: 5'-TTAAGTTGTTCTGAGGAGTTGAGAAAAGGGA-3'). Aminoácido sonda foi radiomarcada com γ32-Ρ dCTP uti- 79 ΡΕ1786901 lizando um kit de marcação aleatória de iniciador da Invitrogen. A visualização dos clones positivos foi realizada através de fosforimagiologia durante uma exposição de 16 horas com ecrãs de armazenamento com fósforo seguido por análise com Storm phosphorimager (Molecular Dynamics, Moun-tain View CA) correndo o software da Incogen (Williamsburg, VA) High Density Filter Reader. Foram recuperadas culturas de clones positivos a partir da ordem da placa da biblioteca e cultivados durante a noite a 37°C meio LB. 0 DNA do BAC foi extraído a partir dos clones isolados utilizando um kit Qiagen (Valência CA) Large Construct kit de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores de PCR específicos para as regiões codificantes de IPP2-K (IP5-IPF: 5'-CGCGGATGCCAAGGACTGGGTTTACAAGGG-3' e IP5-IPR: 5'-TTACAACAGCAGCACCAAGCAGCAGGAAC-3') foram utilizados para amplificar os clones positivos putativos e confirmar a presença do gene IPP2-K gene no BAC. Os clones de BAC continham os genes IPP2-K foram restritos com Not I, sujeitas a eletroforese em gel em campo pulsado e analisadas. 0 tamanho da inserção foi estimado como sendo de aproximadamente 180 kb de comprimento, correspondendo à região genómica dos cromossomas de milho que contêm o gene IPP2-K. A sequenciação do clone de BAC que contém IPP2-K foi realizada através de sequenciação direta do DNA do BAC ou através da subclonagem de "shotgun" do BAC seguido por sequenciação do plasmídeo e montagem de contig (Lark Technologies, Houston TX) . As corridas de sequências múltiplas de BAC foram criadas e alinhadas com sequências do 80 ΡΕ1786901 clone do fago lambda descritas acima para derivar a sequência genómica contígua designada como (SEQ ID NO 3). A estrutura dos loci genómicos que contêm o gene IPP2-K de milho DAS 5XH75 é apresentado na Figura 3.

Exemplo 6: Caracterização da atividade de IPP2-K in vitro

Um fragmento do clone de cDNA de IPP2-K de milho que corresponde à grelha de leitura aberta prevista (ORF) de 1,32 kb foi clonado no vetor de expressão plasmídico pGEX-2T (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) e expresso em células de E. coli (BL21(DE3) pLysS) de acordo com as recomendações do fabricante. Este vetor é concebido para criar uma fusão em-grelha do péptido de GST (gluta-tiona-S-transferase) no terminal N da proteína expressa. A proteína total foi extraída das células de E. coli num tampão de lise de extração convencional (Tris-HCl a 50 mM pH 7,5, NaCl a 150 mM, EDTA a 10 mM, DTT a 1 mM, PMSF a 1 mM, lisozima a 1 mg/mL seguido pela adição de Triton X-100 a 0,4%). O lisado de E. coli resultante foi sonicado em gelo utilizando um Branson Sonifier 450 (Branson Ultrasonic Corporation, Danbury CT) durante quatro ciclos de 30 segundos cada um com um parâmetro de saída de 20% e 50% de ciclo de trabalho. A proteína expressa em bactérias foi passada por uma coluna de glutationa-agarose, lavada 3X com tampão A (Tris-HCl a 50 mM, pH 7,5, NaCl a 150 mM, EDTA a 10 mM, DTT a 1 mM, PMSF a 1 mM e Triton X- 81 ΡΕ1786901 100 a 0,4%), 3 X com tampão B (Tris-HCl a 50 mM, pH 8,0) e eluída com glutationa a 10 mM, em Tris-HCl a 50 mM. As frações de 0,5 mL contendo as proteínas como determinado pelo reagente de ensaio de proteína da Bio-Rad (Hercules CA) foram reunidas e analisadas por SDS-PAGE (Sambrook). A identidade da proteína expressa heterologamente, purificada foi confirmada como sendo a IPP2-K de milho utilizando métodos de "fingerprinting" de fragmentos de péptidos como descrito por Shevchenko, A. et al. (1996) Anal. Chem. 68 : 850-858. A capacidade da proteína de IPP2-K de milho expressa heterologamente para fosforilar espécies de inositol-fosfato múltiplas, incluindo tetraquisfosfato de inositol (IP4) e pentaquisfosfato de inositol (IP5), foi confirmada por autorradiografia após os fosfatos de inositol marcados com 32-p terem sido separados com cromatografia de camada fina convencional (Figura 4.). Os ensaios de atividade de IPP2-K de milho da proteína purificada foram realizados num tampão de reação contendo HEPES a 20 mM (pH 7,5), MgCl2 a 6 mM, LiCl a 10 mM, DTT a 1 mM, substratos de inositol fosfato a 40 ng/mL, ATP a 40 mM e 5 mCi de ATP marcado com γ-22Ρ (3000 Ci/mmol). As misturas de reação foram aplicadas numa placa de TLC de PEI celulose e reveladas em HC1 a 1,0 N. Os resultados destes ensaios de atividade de quinase indicaram que a enzima IPP2-K de milho foi capaz de catalisar a conversão do 1, 3, 4, 5, 6 pentaquisfosfato de inositol (IP5) para criar 1, 2, 3, 4, 5, 6 hexaquisfosfato de inositol (ácido fítico) 82 ΡΕ1786901 através de uma reação de fosforilação na posição 2 do anel de inositol (Figura 4). Adicionalmente, esta enzima do milho foi capaz de fosforilar 1, 4, 5, 6 tetralfosfato de inositol (IP4) para produzir IP5. A atividade observada adicional da enzima incluiu a capacidade para converter 1,4, 6-trifosfato de inositol (IP3) num produto de IP3 marcado radioactivamente. Com base nestes resultados, a enzima do milho é uma quinase de polifosfato de inositol.

Para caracterizar adicionalmente a especificidade isomérica da atividade da quinase de 1,4,6-trifosfato de inositol de IPP2-K observada no ensaio de TLC descrito acima, foi utilizada uma abordagem com base em NMR para examinar a conversão do substrato. Neste exemplo, uma solução contendo 600 pL de Tris DCI a 50 mM, pH 7,5, LiCl a 10 mM, MgCl2 a 6 mM, DTT a 1 mM, 1,4, 6-trif osf ato de inositol a 1 mM, e ATP a 1 mM em D2O foi colocada num tubo de NMR de 5 mm e analisada por NMR de protões num NMR Bruker DRX-600. Os resultados foram recolhidos utilizando um sequência de pulso RECUR-TOCSY de modo a eliminar o pico de água residual grande a 4,8 ppm enquanto retém os picos de substrato que ficam por baixo, de acordo com o método de Liu et al. (2001). Após caracterização dos materiais de partida, foram adicionados ao tubo 45 pg de enzima IPP2-K de milho expressa heterologamente e purificada e a reação foi monitorizada como antes utilizando NMR de protões. Todos os espectros foram obtidos à temperatura ambiente a uma frequência de ressonância de protões de 600 MHz. Foram utilizados um total de 128 rastreios com pontos de dados de 83 ΡΕ1786901 32Κ, uma largura de pulso de 30 graus, e um atraso de relaxamento de 2 segundos. A recolha dos resultados e o processamento foi realizado utilizando o software convencional de Bruker XWIN-NMR. Os espetros que representam os pontos de tempo de 0 e de 120 minutos de incubação a 37 °C na presença de enzima são apresentados na Figura 5. A comparação de espectros dos pontos de partida e final indica que na presença da enzima IPP2-K, o 1,4,β-trifosfato de inositol é convertido em 1,2,6-trifosfato de inositol (Figura 5). Este resultado demonstra claramente que a IPP2-K pode catalisar a desfosforilação e fosforilação de 1,4,6-trifosfato de inositol como observado nos ensaios de TLC; para além disso, a atividade da quinase de IPP2-K é especifica para a fosforilação na posição 2 do inositol, confirmando que a enzima codificada pelo gene IPP2-K é uma quinase de polifosfato de inositol-2.

Exemplo 7. Caracterização da atividade de IPP2-K in vivo A funcionalidade da proteína codificada pelo cDNA de IPP2-K isolado de milho DAS 5XH751 pode ser testada através de experiências de complementação genética. Num exemplo, os mutantes da planta dicotiledónea Arabidopsis thaliana contendo alterações no gene IPP2-K podem apresentar um fenótipo de acumulação de ácido fítico reduzida. Por exemplo, podem identificar-se as linhas de Arabidopsis publicamente disponíveis, descritas como contendo inserções de T-DNA no gene previsto de IPP2-K através da pesquisa da 84 ΡΕ1786901 base de dados TAIR (www.arabidopsis.org) utilizando a sequência de cDNA de IPP2-K de milho como uma sequência da pesquisa. As linhas que contêm essas inserções de T-DNA podem apresentar uma expressão diminuída ou desativada do gene IPP2-K interrompido, resultando na diminuição ou perda da atividade enzimática. As sementes da descendência auto-polinada destas linhas podem estar sujeitas A análise de conteúdo de fitato utilizando um ensaio de quelante descrito por Raboy na Patente dos Estados Unidos número 006111168A. Está previsto que a desativação do gene de IPP2-K de Arabidopsis, que é homólogo ao gene IPP2-K do milho, e resultando na eliminação da atividade de IPP2-K, pode conduzir a uma redução na acumulação de fitato. Está previsto que quando essas plantas são modificadas através da transformação genética como descrito em Weigel, D. & Glazebrook, J. (2002) Arabidopsis A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) para expressar um gene IPP2-K de milho funcional, essas linhas mutantes podem recuperar a acumulação normal, próxima do normal ou aumentada dos níveis de ácido fítico.

Noutro exemplo semelhante às experiências de Arabidopsis descritas acima, um especialista na técnica pode identificar mutantes de milho de coleções genéticas disponíveis ao público tais como (http://www.uniformmu.org; ou http://w3.aces. uiuc.edu/maize-coop/) que estão desativados no gene IPP2-K. Por exemplo, alguns mutantes de milho podem ser desativados no gene IPP2-K devido à presença de um elemento de transposão Mu inserido no gene. 85 ΡΕ1786901

Está previsto que estes mutantes podem apresentar níveis reduzidos de acumulação de ácido fítico. Esses mutantes podem ser complementados através da expressão do gene do milho funcional através de transformação genética. Quando essas plantas são modificadas através de transformação genética para expressar o gene IPP2-K do milho, está previsto que essas linhas mutantes irão recuperar os níveis normais ou próximo do normal de acumulação de ácido fítico.

Nos exemplos citados acima, um especialista na técnica pode utilizar análise de NMR para determinar a quantidade específica e o tipo de metabolitos de fosfato de inositol presentes em plantas alteradas geneticamente. Prevê-se que as plantas que apresentam uma diminuição na acumulação de ácido fítico devido à alteração da expressão do gene IPP2-K também possuam quantidades alteradas e/ou tipos de precursores de fitato tais como IP5, IP4 etc. Por exemplo, extratos de plantas desses mutantes podem ser analisados utilizando NMR de fósforo para determinar o efeito da redução do fitato na acumulação dos precursores de fitato. Para ilustrar este exemplo, foi realizada uma determinação das moléculas de fosfato de inositol presentes em sementes de milho maduras da linha endogâmica DAS 5XH751. Neste exemplo, foram extraídos 10 g de farinha de milho de sementes de milho secas, maduras em HC1 a 0 5 N, filtrados, concentrados até à secura e lavados com 80% de metanol. A lama de metanol foi concentrada num alcatrão preto e dissolvida numa solução de D2O contendo EDTA a 30 mg/mL. O pH da solução foi ajustado para >12 com NaOH. A 86 ΡΕ1786901 análise de NMR de fósforo foi realizada subsequentemente sem filtração. Os espetros de NMR de fósforo foram obtidos a 400,13 MHz num espectrofotómetro Bruker DRX-400 ajustado com uma sonda de 5 mm 1 H/13C/19F/31 P. Todos os espetros foram obtidos com desacoplamento de protões à temperatura ambiente. Foram obtidos um total de 23K transientes utilizando pontos de dados de 64K, uma largura de pulso de 30 graus e um atraso de relaxamento de 2,0 segundos resultando num tempo total de aquisição de 16 horas. Os dados brutos foram cheios em zero para espetros de 32K pontos e processados utilizando uma função de peso exponencial de 1,0 Hz. O espetro resultante é apresentado na Figura 6. No milho não-mutado, prevê-se que o hexaquisfosfato de inositol (fitato) seja a espécie de fosfato de inositol predominante, com pequenas quantidades de penta- e tetra-quisfosfatos inositol presentes, como observado na Figura 6.

Exemplo 8: Mutagénese de sementes de milho utilizando irradiação de neutrões rápidos (FN).

As metodologias e as consequências genéticas gerais do bombardeamento FN das células estão bem descritas por van Harten (1998) , e este método foi utilizado com sucesso em plantas de Arabidopsis, como descrito por Li, X. et al. (2001) Plant J. 27: 235-242. Pode esperar-se tipicamente que o FN produza deleções no intervalo de tamanho aproximado de algumas centenas de pares de bases até vários milhares de pares de bases ou mais. A eficácia 87 ΡΕ1786901 da irradiação de FN está dependente do tipo e da qualidade do material biológico sujeito a tratamento. Neste exemplo, a irradiação foi realizada utilizando uma fonte de feixe de neutrões rápidos no Instituto de Investigação de Energia Atómica em Budapeste, Hungria. Numa experiência para mutagenizar uma amostra de semente de milho, a semente em grosso que tinha sido seca até aprox. 40% de humidade após-colheita foi testada quanto ao teor de água antes da irradiação através da medição de massa antes e após tratamento durante 14 h a 80 °C num forno de secagem de laboratório. Com base na % de água na amostra p/p, o tempo de exposição real ao feixe calculado foi ajustado de acordo com a calibração do feixe do instrumento. Para estas amostras, foi aplicada uma geometria de irradiação a BIF de BRR de 2Y/Cd de geometria de rotação. As exposições foram monitorizadas por U-235, câmaras de fissão Th-232 e um contador de GM. As exposições a irradiação foram realizadas em pacotes individuais de sementes durante 1145 segundos cada um para produzir uma taxa de dose de kerma média actual para 2Y/Cd de 12,71 mGy/s +3%. As amostras de sementes de milho múltiplas foram tratadas com uma gama de dose alvo de 11-20 Gy (11, 13, 15, 17, 20 Gy) de neutrões rápidos. As sementes Ml resultantes foram plantadas e cultivadas em condições de campo convencionais da zona Centro-Oeste, com polinização aberta e cada espiga de Ml foi recolhida individualmente para produzir uma familia de M2. As espigas maduras individuais foram recolhidas, secas, cobertas com casca e empacotadas em envelopes individuais marcados com identificadores específicos para a família M2. ΡΕ1786901

Exemplo 9: Isolamento de DNA genómico a partir de sementes mutagenizadas. O DNA genómico foi isolado a partir de sementes de milho completas, secas num formato de 96 poços utilizando o método da Tecnologia de Charge-Switch (CST) de Invitrogen (Carlsbad, CA) com as seguintes modificações. As amostras de sementes de cada familia M2 foram removidas individualmente dos envelopes para extração do DNA genómico. Foram colocadas 6 sementes de cada familia em cada poço (1 familia por poço) de uma placa de 24 poços fundos (CoStar Scientific, Cambridge MA), embebidas em água durante a noite e subsequentemente liofilizadas numa câmara de liofilização (Virtis, Gardiner NY) sob vácuo durante um minimo de 48 horas. As sementes secas foram moidas até pó utilizando um Genogrinder (Spex Certiprep, Metuchen NJ) ajustado para o máximo em combinação com esferas de carboneto de tungsténio (Small Parts, Inc., Miami Lakes FL) e ressuspensas em tampão aquoso consistindo em SDS 0,25%, EDTA a 10 mM, pH 8,0, Tris a 50 mM pH 8,0. Após centrifugação, o sobrenadante do extrato foi transferido para uma nova placa e misturada numa combinação de 6 amostras (famílias M2) por poço. As proteínas foram precipitadas a partir de uma solução por adição de NaCl para 750 mM e KOAc para 1,2 M de concentração final no gelo seguido por uma breve centrifugação. Foi adicionado PEG8000 ao sobrenadante para uma concentração final de 8%, misturado e centrifugado para precipitar o gDNA. Os sedimentos 89 ΡΕ1786901 foram ressuspensos em mistura de digestão CST (Invitrogen) e o gDNA foi extraido de acordo com o protocolo do fabricante utilizando um sistema de manuseamento de liquidos robótico Biomek FX (Beckman-Couter, Inc., Fullerton CA). Após eluição, as amostras de DNA foram fracionadas em múltiplas placas seladas e armazenadas a -80°C ou a 4°C num recipiente de humidade.

Exemplo 10: Seleção com base em PCR de mutantes de deleção.

De modo a pesquisar deleções num gene alvo, pode ser aplicado um método à base de PCR. Exemplos de vários destes métodos são descritos no pedido de patente US 20050053975. Por exemplo, os iniciadores de oligonucleótido correspondentes à sequência genómica de flanco o gene de interesse pode ser concebido com base nos dados de sequência para o locus. As amostras de DNA podem ser sujeitas a amplificação por PCR utilizando métodos comercialmente disponíveis e enzimas (LA-Taq) otimizados para PCR longo de acordo com as recomendações do fabricante (Takara-Bio, Inc., Shiga, Japão). A deteção de deleções pode ser efetuada por eletroforese em gel de agarose de rotina (Sam-brook) para visualizar as bandas do produto de PCR. Para ilustrar a utilidade deste método, os iniciadores de oli-gonucleótidos que correspondem à sequência genómica de DNA de flanco um locus Adh-1 de milho foram concebidos com base na informação publicada. Estes iniciadores foram utilizados 90 ΡΕ1786901 para amplificar o DNA genómico de milho sob as seguintes condições: misturas de reação contendo tampão LA-Taq IX, 1,6 mM de dNTPs, 0,5 mM de MgCl2, 2% de DMSO e enzima LA-Taq foram adicionados ao DNAg molde (1-30 ng) e 0,4 mM de iniciadores de oligonucleótido (iniciador Adhl6s: 5'-GTCTGACAACGCCTGAGATTGAATCGAAGACC- 3', iniciador Adh21a: 5'-CAGCTACCACTTGCGCTTGAGGGATTTGAA-3'). A reação de PCR foi amplificada sob o seguinte regime de temperaturas num termociclador automático (MJ Research, Waltham, MA):

Passo 1: 94°C durante 1 minuto; Passo 2: 98°C durante 10 segundos; Passo 3: 7 0°C durante 15 minutos; Passo 4: passos repetidos 2 & 3 por mais 31 ciclos; Passo 5: 72°C durante 10 minutos; e Passo 6: 4°C em armazenamento .

Os produtos de PCR resultantes foram analisados utilizando eletroforese em gel de agarose convencional. O amplicão assim produzido incluiu todo o gene Adh-1 mais vários kb da sequência de flanco, para um total de 12,3 kb da sequência de DNA. No evento em que o DNAg molde utilizado nesta reação contém uma deleção numa extensão de 12,3 kb, pode detetar-se um pequeno produto de PCR, que indica uma mutação no germoplasma fonte. Aplicou-se este método a vários outros genes de interesse. Como apresentado nestes exemplos, um praticado na técnica pode detetar reações de PCR que apresentam amplicões de tamanho reduzido em relação aos controlos. A fonte de sementes do DNA molde 91 ΡΕ1786901 utilizado nestas reações pode ser concebida como um mutante putativo de deleção e sujeito a análise repetida. Uma vez confirmada a deleção, o milho mutante dessa familia pode ser cultivado e auto-polinizado para produzir germoplasma homozigótico. Os niveis de fitato em sementes deste germoplasma podem ser medidos em 10 a 20 M3 de sementes utilizando ensaios convencionais para a deteção de ácido fitico como descrito por Raboy supra. A semente contendo fitato reduzido pode ser recultivado e testado para o melhoramento do valor nutricional em ensaios com ração animal ou outras utilizações.

Referências:

Altschul, S.F. et al. (1991) J. Mol. Biol. 215:403-10

Guthrie, C. & Fink, G. (1991) Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. Meth. Enzymol. vl94. Academic Press, Inc., San Diego, CA.

Ives, E.B. et al. (2000) J. Biol. Chem. 275: 36575-36583

Li, X. et al. (2001) Plant J. 27: 235-242

Liu, M. et al. (2001) J. Magn. Reson. 153,133-137

Raboy, V. (2000) Low Phytic Acid Mutants and Selection Thereof. USA patent # US006111168 Procurador: Os estados 92 ΡΕ1786901

Unidos da América representados pela Secretary of Agriculture, Washington, DC.

Sambrook, J. & Sambrook, D.W. (2001) Molecular Cloning A

Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Shevchenko, A. et ai. (1996) Anal. Chem. 68:850-858

Shi. J., et al. (2003) Phytate Polinucleotides and methods

of Use. Pedido de Patente Internacional #W02003027243. Requerente:Pioneer Hi-Bred International, Inc., USA van Harten, A.M. (1998) in Mutation Breeding Theory and Practical Applications. Cambridge University Press, Cambridge, UK.

Verbsky, J.W. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 31857-31862

Weigel, D. & Glazebrook, J. (2002) Arabidopsis A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Zhang, H.-B. (2002) Construction and Manipulation of Large-

Insert Bacterial Clone Libraries Manual. Department of Soil and Crop Sciences and Crop Biotechnology Center, Texas A&M University. disponivel online: http://hbz7.tamu. edu/ index.htm 93 ΡΕ1786901

SEQ fX> NO. I i efcEcsgccçç cttccccggg csgcggcac(c «gtaetagtâ eeagcatcEC ttcB-ggctcc 61 secaagegea gacaccgesg cagcggçsge ggcscggtct ggtgacccee çgççgegfces 121 ageetgctcC tccggEgate gceggaeEgg cggggtágge aeesgcggaeí cgea^cecgv Ifil ccecttccgc tgcãgaagat ectcgstgça g«tggatggg gtteçgeaag e«geeg«tgc «1 «aaggaçtgg gfcttaeaagg gsgwggçgc ggçeaaççte açecçgegçfc acswegctç 301 gtegccetcc atgcttggca açgtactgcg getcaagaag attctaaaaa seaagtcgca 361 9^95ecaccg agttgtâctg tsttcscaag tcatgagcsa ctcctgtggg gccatatccc 421 agaactggtt gsgtcggtca aaeeagettg cttegetcae ggecatgeag tgçatgtxaí: 481 gagc«aacac ctgggtgcca atcetgtcgsi cggtggggtc cgcgtaegtg Efetctagaga 541 fctttctggag ct&gtcgaaa agastgfctet tagcageegfc ccfcgetggga gagtaaatgc 601 aagttçastt gataacaetç} çtgatgecgc tettçtaat® gcageec&ct ctttsCtttc 661 tggcassteee sagggxísgca gctcjeatagc tgtagagata aaggecsaat gtgsgtttc t 711 gccstcstca gastatstat cagssgatss taetatceae asastestas egagatataa 781 gatgcatceg eaccccsaat tEtaccasgg tgsgatatcg: aegactagtg agcacaatce 841 teStgateta fctttctgggrfc cãasâgsgsg sâtatgcHtg geestcaâgt eectfcfcfcctc 901 aâctcctcag eaceacteea ggatttfctgt caBtggatct ttagcttttg gtg.gcatsg*s 961 aggtggtges gstagtgtte «cctgctgs eaetetteag· tgtettgsag etcccagcaa 1021 gsttagtggc ct&asãetee ctgecttcat: tg&gctcctg teagagacaa tttttasgte 1081 tgsggtàKta «gcaaectgt tageeactea aeagetgsat gateatsr*£» tt&àâggggfc 1141 ««ttcatctg tsetácasea tastttctcã gcctfcettt* gtetgcsasô acctaaetga 1201 tgtôgsgcta fcigcggasgt acaetctett gcattctetfc ccgttssacs aaagectgaa 1261 gatcgttagg gaettççrtca tttetgctâe cgcráaaggác tgcsgcctgâ tgatc&gcSrt: 1321 ccggccaage gegaBtggta gtaeegsttc tgagtatgAt tcagtgtfcCC ttgftatcagc 1381 gâagcgaace tatgagtaca segeatattt esítgaEctçf gatgtga&ac etctgsratáa 1441 gatggagcat tattttaaac tggateagag gatagtcaat tcctacacaa gaaatggggg ÍSÔ1 aggtcttgec atctceassg ggcagtaste ccaaagacac ttcgaggatt cagetccaag 1961 eacggggagc ctetcttcct gt.atácattc ggageagygt gcatcaggea gtgttggttg 1621 ttgttcctgc tgcttggt.ge KgctgttçEa scttestgsg taeagtceca aggttgggag 1661 getCgãccct taaçgccrtgg aaagggcaca gggagctgtg ttgtccgtca gfcçgctgttg l?41 caactaagtft gtgeataeae egtggcttgt eseagcaatt tecgeagatg tccaacgtte 1801 gctgagacas efcgsacttct taeegtggca aéeactesfct gtaacatcaa gtcgasaatg 1861 ágggctgaag tttccctcac sggctsecai atgtgagats tgtectcect ttgtaccact 19Í1 ôagtggecet gtgteatgta tgaatgtatc fecaatítget attgcagaas Egttfcggte® 1381 aaçtctcaaa aaaaaaaaaa aaoaaasasa aa SEQ 1D NO, 2 ni emdgvSqa aáakd wykgegaan lílsytgsspsml gkví rlkJkí 1 knksqrapsd vfssheq i Iwghipel vesvkqgclaqayavhvmsqhlgaiihvdggvrvrvsrdnelveknvlssrpagrvtiasssfintadaalHadhs lfsgjnpkgsscíavdkakcgflpsseyisedntikklvlrykmhqblkfyqgessklseyTipidlfsgskèncma ÍksIfsipt|jmlnfvngslafggmÊggadsv1ipadHkdedískjsgiklpdfteHseíilrsevlgn!1atqMddh diegvihlyy^íisqpcivcknttdveJIrkylílbslpidkslkjvrdfHsatakdcsJmísftprengstdseydsvf lesak'.rty€ykayfldidvkpSdkniebyfk3dqrivnfytíT!ggg!aiskgq ΡΕ1786901 94 SEQID NO, 3 * 1 ECGCttggEa gacgaggcct tgaecfcgasc cgEgttcaec agtctttgcg aEttgtgctg 61 agegtgctta ecagçcetgt ttátgagfcgt tggaggcacs: setaattacg gtácccgacs 121 agaaaEatca ôs&taaafcag caateetgge atatatetas aagtgataaa taataaacsa im Ecaacttatg taacttgget aggtgeateg castgtccct aicccccacc agaaââatss 24X tcaaaçacgt eatCEaesgt cctacaccat ««!«#«*« etectcctcg agacgatcca 301 cstcctggas ectatfcafegc caígeacgtt çççgecgatc aeeaçataag tacatafcEtE 361 étstáEtEtt aattaaactfc tttaasataa tttcegasaa aasegatast ttEgtttcgt m tttatçatgg agitaggaga ssctgeettt cetcfctgcss Uttgggagt tttggacQsa 481 scgagagcee gaattcgacg «tiggcggcgg cgcgtcgcc» «tacgcagcg Gesatgfcgga 541 gctecatgea ascgtgtgte cgccçgcgtg gcgticaetc tccctecaçg tttcggcgtc 601 ctcgícgcct tcetgggtaae tetççagcta ctseeeactg çcccttccct tcagtccett 661 tcetcgggct gtgetaccag tactegrtace agcatctcfct cagg«Eeeae casgcgcags 721 ceccgcssce gHtggcagegg cacgatctgg tgaccecccg ccscgtcaag cctgcteetç 701 eget.Qatcgc cggactggcg gggtaggeac eaéGggfsgcg catjcccgcct cctfcecgctg 841 gtaagaeegfc aagegtgacg CGGgeeegct cctccctccg ctcgetteeí; ^gctctecc© mi attGtggcgt: accsgtctça ccgcggcttg gggattggat «cggagçtag Etaaccagca 861 §agesagata gcãgatgcag actgectgcc ectctagtet gatttttgça gt«6«c&ett 1021 etgttEggEt cgtgtgeetc ggtgtcígac ageagaagat cctcgetggã gatogatflgg 108! 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Lisboa 19 de abril de 2013

Claims (24)

1. ΡΕ1786901 1 REIVINDICAÇÕES 1. Polinucleótido isolado de planta que codi fica para uma inositol polifosfato 2-quinase e cujo polinucleótido codifica um polipéptido compreendendo a SEQ ID NO: 2.
2. 2. Polinucleótido isolado de planta como reivindicado na reivindicação 1, em que o polinucleótido compreende a SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO:3.
3. 3. Polinucleótido da reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o polinucleótido codifica para uma inositol polifosfato 2-quinase de milho.
4. 4. Polinucleótido de qualquer reivindicação anterior, em que o polinucleótido é DNA.
5. 5. Polinucleótido de qualquer reivindicação anterior, em que o polinucleótido é RNA.
6. 6. Proteína de inositol polifosfato 2-quinase isolada de planta compreendendo um polipéptido possuindo a sequência apresentada em SEQ ID NO: 2.
7. 7. Método de identificação de um tecido de planta compreendendo uma lesão num gene que codifica uma 2 ΡΕ1786901 inositol polifosfato 2-quinase como reivindicado na reivindicação 6, compreendendo: (a) sujeitar um tecido de planta a mutagénese; (b) obtenção de uma amostra de DNA do tecido de planta sujeito a mutagénese ou seus descendentes; (c) ensaio da amostra de DNA para a lesão no gene que codifica a inositol polifosfato 2-quinase.
8. 8. Método da reivindicação 7, em que a mutagénese é mutagénese por neutrões rápidos e o tecido de planta é tecido de milho.
9. 9. Semente de milho contendo uma lesão induzida artificialmente num gene que codifica uma inositol polifosfato 2-quinase como reivindicado na reivindicação 6, em que a lesão afeta a atividade do gene que codifica a inositol polifosfato 2-quinase e em que a lesão induzida artificialmente é um gene desativado.
10. 10. Planta de milho produzida por crescimento da semente da reivindicação 9.
11. 11. Planta de milho da reivindicação 10 em que à referida planta foi retirada a bandeira.
12. 12. cultura de tecidos de células regeneráveis contendo a lesão induzida artificialmente num gene que 3 ΡΕ1786901 codifica a inositol polifosfato 2-quinase produzida a partir da planta da reivindicação 10.
13. 13. Cultura de tecidos da reivindicação 12, em que as células da cultura de tecidos são de um tecido selecionado a partir do grupo consistindo em folha, pólen, embrião, raiz, ponta da raiz, antera, seda, flor, grão, espiga, maçaroca, palha e caule.
14. 14. Método de diminuir o nivel de ácido fitico em ração animal, compreendendo: produção de ração animal a partir de uma planta contendo uma lesão num gene que codifica uma inositol polifosfato 2-quinase como reivindicado na reivindicação 6, em que a ração animal tem um nível diminuído de fitato.
15. 15. Método de diminuição do nível de fósforo em desperdício animal compreendendo: proporcionar ração animal a partir de uma planta incluindo uma lesão num gene que codifica uma inositol polifosfato 2-quinase como reivindicado na reivindicação 6.
16. 16. Semente mutante não letal de uma espécie de planta de cereal caracterizada por um baixo conteúdo em ácido fitico relativamente ao germoplasma parental das espécies, em que a semente mutante tem atividade alterada de uma inositol polifosfato 2-quinase como reivindicado na reivindicação 6. 4 ΡΕ1786901
17. 17. Ração animal compreendendo a semente da reivindicação 16.
18. 18. Anticorpo purificado produzido utilizando um polipéptido compreendendo a SEQ ID NO: 2 como um imuno-génio.
19. 19. Kit de imunodeteção compreendendo, em meios de contenção adequados, o anticorpo de acordo com reivindicação 18, e um reagente de imunodeteção.
20. 20. Anticorpo purificado da reivindicação 18, operativamente ligado a uma marca detetável.
21. 21. Método de aumento de rendimento da semente a partir de uma planta, compreendendo o referido método (1) integração no genoma da planta de um vetor para transformação de células vegetais compreendendo: (a) sequências de nucleótidos anti-sentido substancialmente complementares a (i) uma porção correspondente de uma cadeia de uma molécula de DNA que codifica a inositol polifosfato 2-quinase, em que a molécula de DNA que codifica a 2-quinase polifosfato de inositol hibrida sob condições de restringência baixa ou moderada com a SEQ ID N0:1 ou (ii) uma porção correspondente a uma sequência de RNA codificada pela referida 5 ΡΕ1786901 molécula de DNA que codifica a inositol polifosfato 2-quinase; e (b) sequências reguladoras operativamente ligadas às sequências de nucleótidos anti-sentido de modo que as sequências de nucleótidos anti-sentido são expressas numa célula de planta na qual é transformada; e (2) crescimento da referida planta, enquanto as referidas sequências de nucleótidos anti-sentido são transcritas e se ligam à referida sequência de RNA e inibem a expressão de um gene de inositol polifosfato 2-quinase.
22. 22. Método de produção de uma planta mutante possuindo uma caracteristica desejada proporcionada por um gene desativado num gene que codifica uma inositol polifosfato 2-quinase como reivindicado na reivindicação 6, compreendendo o método: (a) proporcionar uma coleção de pólen da planta ou sementes da planta; (b) tratar a referida coleção de pólen de planta ou sementes de planta com irradiação selecionada a partir do grupo consistindo em UV, irradiação gama, raios X, e neutrões rápidos; e (c) seleção das plantas mutantes possuindo a caracteristica desejada. 6 ΡΕ1786901
23. 23. Método da reivindicação 22, em que a coleção de sementes de planta é uma coleção de grãos de milho ou sementes de canola.
24. 24. Método da reivindicação 23, em que a irradiação é de neutrões rápidos e em que o pólen irradiado é utilizado como uma fonte de mutação. Lisboa, 19 de abril de 2013