PT1721965E - Processo para a produção e utilização de culturas de protozoários - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"PROCESSO PARA A PRODUÇÃO E UTILIZAÇÃO DE CULTURAS DE PROTOZOÁRIOS" A invenção diz respeito à preparação de culturas clonais de Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas galli-narum e Blastocystis sp. A Histomonose ou tiflo-hepatite no perú foi descrita pela primeira vez por Smith (1895). Dados essenciais para a etiologia foram obtidos através das investigações de Tyzzer (1920). Neste trabalho foram descritos pela primeira vez flagelos e pseudopodios, o gue classificou o agente como protozoário. A morfologia do parasita e a ocorrência em perus conduziu à designação Histomonas meleagridis. 0 reconhecimento de que este parasita também pode ocorrer em galinhas, conduziu à recomendação de manter estas espécies de animais separados. Como outras espécies de animais susceptíveis são consideradas a galinha da índia (ou pintada), faisão, pavão e codorniz enquanto as aves marinhas são consideradas não susceptíveis (McDougald, 2003). Devido à patogénese e à elevada prevalência da doença em perus esta espécie deve ser encarada como um dos hospedeiros mais susceptíveis.

Nos últimos dois anos assistiu-se na europa a uma 2 ΡΕ1721965 incidência aumentada da doença. 0 motivo é particularmente a proibição de profilácticos e terapêuticos com a ajuda dos quais a doença foi combatida durante décadas. No entanto foi proibida na União Europeia a utilização profiláctica de agentes terapêuticos em perus, nomeadamente de nifursol, derivados de imidazol como nitroimidazol e Dimetridazole como aditivos alimentares, já que a segurança destas substâncias (carcinogenicidade e genotoxicidade) para o consumidor não pode ser excluída. Também o Nitarsone (ácido 4-nitrofenilarsónico) utilizado na América do Norte para a profilaxia não é autorizado na Europa. Como consequência desta situação de emergência, em termos de profilaxia e terapia, teve que se proceder, nos últimos dois anos, ao abate sanitário em vários países da Europa (Hess et al., 2004).

Em galinhas poedeiras a doença decorre de forma mais moderada, devido ao aumento de formas alternativas de exploração mas também existe um aumento de ocorrência (Hafez et al., 2001; Esquenet et al., 2003).

Trabalhos essenciais sobre a multiplicação de Histomonas meleagridis em meio de cultura de células, foram realizados por Dwyer (1970) e mais tarde por Stepkowski (1978). Como base foi utilizado por ambos os autores fezes ou isolados de fezes, que se multiplicam em condições agnotobióticas. Por isso a multiplicação do agente só é possível num meio apropriado, que é principalmente determinado pela flora concomitante. 3 ΡΕ1721965

No geral, as culturas acima mencionadas apresentam a desvantagem de não serem uniformes do ponto de vista genético, e consistirem em vários patogéneos de uma e mesma espécie. Além disso não é assegurado que não se encontrem na cultura outros protozoários que são difíceis de diferenciar morfologicamente. A ocorrência de vários protozoários no intestino das aves já foi descrita várias vezes (McDougald, 2003), o que acentua enfaticamente esta problemática.

Como consequência da pouca caracterização das culturas, os resultados das experiências in vitro e in vivo em que estas culturas foram utilizadas, são para ser apreciados com reserva. O teste fidedigno de substâncias tanto in vitro como in vivo, requere uma cultura uniforme do ponto de vista genético, para evitar que determinados efeitos sejam atribuídos à presença de várias subpopulações ou outras espécies de protozoários. Os resultados de experiências com animais levadas a cabo no passado mais recente reflectem esta heterogeneidade (Hu e MacDougald, 2003; Hu et al., 2004; Landmann, 2004). A heterogeneidade de culturas ocasiona que determinadas subpopulações dominam fenotipicamente, o que origina conclusões falsas, no que diz respeito à sensibilidade do agente. Este problema está descrito exemplarmente para o agente da malária, Plasmodium 4 ΡΕ1721965 falciparum (Rosário, 1981; Trager et al., 1981; Burkot et al., 1984; LeBras et al., 1983). Como consequência disto ocorre o perigo de que nos testes in vitro ocorra simplesmente uma selecção e multiplicação de estirpes resistentes, que não permite qualquer conclusão sobre a sensibilidade de um agente. Também existe indicação sobre possíveis subpopulações diferentes de Histomonas meleagridis no trabalho de Gerbod et al.(2001). Os autores sequenciaram de 4 isolados uma parte do RN A ribossomal - esta segmento genético é usado frequentemente para análises filogenéticas - e constataram uma ligeira heterogeneidade nalgumas posições. Os autores excluíram que isto pudesse ser um indício para subpopulações diferentes. Indicação segura sobre subpopulações entre uma das três espécies de protozoários acima mencionados vem de Tetratrichomonas gallinarum, como relatado por Cepicka et al. (2005). Também de Blastocystis sp. está documentada pormenorizadamente a diversidade genética, também considerando uma possível problemática de Zoo-nose (Noel et al., 2003; Noel et al., 2003).

Em Kulda et al. (1974) foram realizadas experiências de infecção com Tetratrichomonas gallinarum e assim foi provocado com um isolado a histomonose típica de Histomonas meleagridis. Mostrou-se que esta cultura de infecção de Tetratrichomonas gallinarum estava contaminada com Histomonas meleagridis, com base no exame microscópico das fezes.

Em Goedbloed e Bool (1962) Perús foram infectados 5 ΡΕ1721965 com uma cultura de Histomonas meleagridis e também Tetratrichomonas gallinarum e em seguida foi feito o exame histológico. Após infecção mista foram detectados microscopicamente, nas fezes, ambos os agentes. Isto mostra o perigo de por reisolamento de culturas de protozoários, serem isoladas várias culturas , já gue não é conhecido um meio selectivo.

Bayon e Bishop (1937) descrevem o isolamento de Histomonas meleagridis do fígado de uma galinha, gue foi utilizado para diagnóstico. Das fezes do animal foi isolada uma mistura de Blastocystis, Trichomonas e Chilomastix, mas não Histomonas. Isto também indica claramente que em culturas de protozoários se trata na maior parte de co-infecção ou co-isolamento.

Bishop (1938) descreve também o isolamento de Trichomonas, Chilomaxtix e Blastocystis do ceco de uma galinha.

Em Norton et al. (1999) é descrita a frequência de Histomonas meleagridis e Tetratrichomonas gallinarum após infecção com o nemátodo Ascaridia dissimilis.

Isto indica que culturas clonais de protozoários não eram conhecidas até à data e por isso não podiam ser postas à disposição.

Na EP 600 396 A2 são publicados processos e 6 ΡΕ1721965 agentes para a prevenção ou para tratamento de infecções intestinais por protozoários particularmente Giardia lamblia. Nesse contexto são em primeiro lugar cultivadas e colhidas estirpes de Giardia lamblia de origem diversa, os protozoários obtidos são destruídos por meio de ultrassons para se obter, após concentração ulterior e tratamento, uma vacina correspondente.

Na GB 902 760 são descritos processos para a produção de endoparasitas, nos quais se utiliza radiação ultravioleta para os atenuar. FR 2 853 550 diz respeito a um aditivo alimentar para administração a animais que abrange ácido cinâmico, aldeído e tiossulfato. Aí é indicado que uma mistura contendo estas substâncias é capaz de combater efectiva-mente protozoários como Tetratrichomonas gallinarum e Histomonas meleagridis.

Tan Kevin et al. (Experimental Parasitology 96 (1) (2000:9-15) diz respeito ao cultivo de Blastocytis hominis em agar sólido. A US 5 824 537 diz respeito, entre outros a um processo para a clonagem in vitro de parasitas do género Babesia, em que células de parasitas individuais são obtidos de uma suspensão de eritrócitos infectados, em que estas células individuais podem finalmente ser utilizadas para a produção de uma cultura. 7 ΡΕ1721965

Clark et al. (Clinicai Microbiology Reviews 15 (3) (2002) : 329-341 é um artigo de revisão sobre processos para a cultura de protozoários, em que entre outros é descrita a cultura de Balastocystis Hominis.

Condicionada pela diversidade genética, mas particularmente através da ocorrência concomitante de vários protozoários num animal, são indispensáveis métodos exactos de diagnóstico. Isto é intensificado pelo facto de manifestamente as Tetratrichomonas gallinarum e Histomonas meleagridis podem provocar sintomas e modificações morfológicas semelhantes (Tyzzer, 1920; Allen, 1941). O diagnóstico de Histomonose é particularmente dificultada pelo facto do parasita morrer rapidamente no meio exterior e, por isso, já não poder ser detectado. Embora seja possível a cultura do agente fora de animais quentes, são necessárias condições especiais, para assegurar a sobrevivência de trofozoitos (Dwyer, 1970; McDougald e Galloway, 1973) . A detecção directa do agente só pode assim ser realizada por meio de histologia. Para isso estão descritos vários métodos, particularmente a coloração ácido periódico-Schiff (PAS-periodic acid-Schiff reaction), por meio da qual o agente não-flagelado pode ser detectado no tecido (Kemp e REID, 1966) . No entanto este método é trabalhoso e demorado o que reforça a necessidade de alternativas. A histologia é também dificultada pelo facto do agente não ser facilmente diferenciado de macrófagos e ΡΕ1721965 células de fungos, o que reforça adicionalmente a necessidade de melhores possibilidades de diagnóstico. Esquenet et ai. (2003) descrevem a detecção citológica por meio de coloração directa de preparados histológicos.

Até agora não estão disponíveis métodos de detecção moleculares diagnósticos para a detecção sensível e específica dos três agentes.

Tarefa da invenção é estabelecer culturas de Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocytis sp. E utilizar as culturas estabelecidas deste modo in vitro e in vivo, para ultrapassar as desvantagens do estado da técnica, particularmente a inhomogeneidade das culturas de protozoários, a partir de aves, conhecidas. Além disso é tarefa, desenvolver diagnósticos específicos, de modo que seja possível uma detecção do agente e uma diferenciação dos agentes.

De acordo com isto, com a presente invenção é providenciada uma cultura clonal de protozoários compreendendo células de protozoário de uma só espécie de protozoários, que é caracterizada em que a espécie de protozoário é escolhida do grupo que consiste em Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocytis sp., em que a cultura contem bactérias simbióticas ou o seu lisado.

De acordo com a presente invenção é designada por 9 ΡΕ1721965 "cultura clonal de protozoários" uma cultura proveniente de uma só célula de protozoário, que é ou de Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocytis sp. e por isso foi formada a partir desta. A cultura consiste assim em células de protozoários, provenientes da multiplicação de uma célula única. As células de protozoários são, assim, cópias de uma só célula de partida acima mencionada. Na cultura clonal podem encontrar-se outros organismos tais como bactérias, mas importante para a invenção é, no entanto que na cultura clonal só está presente uma única espécie de protozoário escolhida de entre o grupo que consiste em Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp., i.e. a cultura contem células de protozoário de uma destas espécies de protozoários, mas não células de protozoário das duas outras espécies de protozoários (p.ex. Histomonas meleagridis, mas não Tetratrichomonas galinarum e Blastocystis sp., Tetratrichomonas gallinarum mas não Histomonas meagridis e Blastocystis sp.). A preparação de uma cultura clonal deste tipo não pode ser realizada até agora no estado da técnica- apesar da necessidade existente desde há pelo menos 20 ou 30 anos (ver acima Dywer ou Stepkowski) e possibilita, a partir de agora, numerosas aplicações que abrangem desde a produção de vacinas e terapêuticos contra as espécies de protozoários aqui mencionadas até à investigação e caracterização dos mesmos em espécies de protozoários parasiticos de aves. 10 ΡΕ1721965

Na produção das culturas de protozoários de acordo com a invenção é, por um lado decisivo permitir o crescimento in vitro das células de protozoário, proporcionando condições de meio apropriadas (p.ex. temperatura, presença de bactérias simbióticas, fontes de carbono) e por outro lado isolar os protozoários. O isolamento ocorre preferivelmente através de micromanipulação, em que após o isolamento os protozoários são multiplicados num meio de crescimento apropriado (o meio de crescimento deve conter uma fonte de hidratos de carbono, particularmente um amido, como amido de arroz ou amido de milho, e, se apropriado, sais, particularmente sais de Earle, aminoácidos, particularmente L-Glutamina e antibióticos/antimicóticos, particularmente Penicilina, estreptomicina e anfotericina) para produzir finalmente uma cultura de protozoários. A cultura de protozoários de acordo com a invenção contem bactérias simbióticas e/ou o seu lisado. É conhecido que Histomonas meleagridis, tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp., se multiplicam eficientemente in vitro na presença de bactérias simbióticas ou dos seus produtos de metabolismo (p.ex. na forma de lisado). Por essa razão encontram-se preferencialmente na cultura de protozoários de acordo com a invenção, já que estas são utilizadas na produção das culturas. No processo são preferencialmente utilizadas bactérias (e/ou lisado), que também se encontram in vivo em simbiose com os protozoários. 11 ΡΕ1721965

Também é evidentemente possível remover substancialmente as bactérias da cultura de protozoário (p.ex. através de centrifugação ou filtração) no caso das culturas serem utilizadas, por exemplo, para investigação de condições de crescimento, para a produção de vacinas e anticorpos.

De acordo com uma implementação preferida as bactérias são enterobactérias, particularmente bactérias coliformes, estafilococos, estreptococos ou uma mistura destas. Já que as Histomonas meleagridis, tetratri-chomonas gallinarum e Blastocystis sp., são preferencialmente obtidas de fezes, a cultura bacteriana é composta preferencialmente das espécies de bactérias que aí se encontram. Foi descoberto de acordo com a invenção que nas fezes de aves para além das enterobactérias também estão presentes estafilococos e estreptococos, que podem ser utilizados individualmente ou em combinação para a cultura de células de protozoários.

Um aspecto adicional da presente invenção diz respeito a uma formulação de vacina que engloba células de protozoário inactivadas ou vivas de uma só espécie de protozoário escolhida do grupo que consiste em Histomonas meleagridis, tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp., ou um anticorpo dirigido contra células de protozoário 12 ΡΕ1721965 clonais de uma única espécie de protozoário escolhida do grupo que consiste em Histomonas meleagridis, tetratri-chomonas gallinarum e Blastocystis sp. A preparação de culturas clonais de protozoários ou células permite uma produção de vacinas direccionada, que pode ser usada, por um lado para a imunização activa e, por outro lado, para a imunização passiva de aves. Na produção de vacinas activas é necessário um antigénio de preferência tão homogénio quanto possível. No caso concreto é desejável providenciar uma cultura de protozoários clonal que contenha essencialmente só uma espécie de protozoários, contra a qual um animal deve ser vacinado. A utilização das culturas clonais de acordo com a invenção possibilita uma produção industrial desta vacina decisivamente melhorada e susceptível de ser standardtizada principalmente no que diz respeito a melhor reprodutibilidade e menor variação dos lotes. Por exemplo uma vacina activa, utilizada para imunizar aves contra Histomonas meleagridis, só deve conter essencialmente células de Histomonas meleagridis. Se não for o caso pode possivelmente ocorrer um processo de selecção que não preferencie a espécie desejada. Isto é, é bastante possível que a ave não seja imunizada contra o agente desejado mas contra outro ou outros antigenes presentes na cultura (p.ex. outros protozoários. No caso de vacinas passivas, por outro lado é essencial que sejam usados sobretudo anticorpos que actuem especificamente contra o antigene a combater (por exemplo células de protozoários) . Por isso é essencial que na produção deste 13 ΡΕ1721965 tipo de vacina sejam utilizadas tanto quanto possível culturas iniciais. Para isso são especialmente apropriadas as culturas clonais de protozoários, de acordo com a invenção. A formulação da vacina contem preferencialmente um adjuvante.

Para promover a resposta imunitária contra um antigénio, utilizam-se adjuvantes na produção de vacinas activas, em que os adjuvantes são preferencialmente escolhidos do grupo que consiste em adjuvantes completos de Freund, adjuvantes incompletos de Freund, hidróxido de alumínio, Bordella petrussis, saponina, muramil dipéptido, copolímero etileno acetato de vinil, óleo, ou um óleo mineral, particularmente óleo de amendoim, óleo de silicone e combinações destes assim como os adjuvantes descritos em Singh et al. (Nat. Biotech 17 (1999), 1075-1081).

Adjuvantes apropriados que podem ser utilizados de acordo com a invenção são bem conhecidos de um perito na matéria (vide p.ex. 0'Hagan, Derek T. (2000) "Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols", Humana Press; US 5, 885, 589; EP 109 942).

As células clonais de protozoário são preferencialmente atenuadas através de passagem, através de radiação, particularmente através de UV e radiação radioactiva, através de substâncias químicas ou através de vírus. 14 ΡΕ1721965

Para reduzir a patogenicidade das células de prototoário utilizadas nas vacinas estas células podem ser atenuadas.

Uma atenuação pode ocorrer, de acordo com a invenção, através de vários métodos. Mostrou-se de acordo com a invenção que sobretudo os métodos de atenuação acima mencionados são especialmente adequados para reduzir a patogenicidade das células de protozoário. Particularmente é preferida a atenuação através de várias passagens (pelo menos 10, preferivelmente pelo menos 50, ainda mais preferivelmente pelo menos 100 passagens). Através das passagens os protozoários são primeiramente propagados num recipiente de cultura e após terem atingido uma determinada densidade celular (p.ex. após 12 horas, preferivelmente após 24 horas, ainda mais preferencialmente após 48 horas de cultura) passadas para novo meio numa proporção de 1:10, 1:50, 1:20 ou 1:5.

De acordo com uma implementação preferida as células clonais de protozoário são inactivadas através de calor, formalina, beta-propiolactona ou combinações destas.

Alternativamente ou complementarmente à atenuação das células de protozoário estas podem ser inactivadas através de vários processos. Através da inactivação das células, é drasticamente reduzido o risco de infecção do animal vacinado. 15 ΡΕ1721965 A formulação da vacina é preferencialmente adaptada para administração intravenosa, subcutânea, intramuscular, oral ou intracloacal.

Um aspecto adicional da presente invenção diz respeito a um processo para a produção de uma cultura clonal de protozoários que compreende células de protozoário de uma só espécie de protozoário escolhida do grupo que consiste em Histomonas meleagridis, tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp. que compreende os passos: a) Preparar uma cultura de partida que compreende células de protozoário de pelo menos uma espécie de protozoário que consiste em Histomonas meleagridis, tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp., b) Cultivar as células da cultura de partida num meio de cultura que compreende uma fonte de hidratos de carbono e bactérias de pelo uma espécie de bactérias, que vivem, in situ simbioticamente com as células de protozoário, c) Isolar as células de protozoário por meio de micro-manipulação d) Cultivar as células de protozoário isoladas num meio de cultura como definido em b) e e) Se for caso disso determinar a pureza das culturas clonais de protozoários. A amostra de partida é preferencialmente fezes ou tecido. 16 ΡΕ1721965 Já que Histomonas meleagridis, tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp. passam uma parte do seu ciclo de vida no intestino de aves, as fezes são particularmente apropriadas para isolar estes protozoários e produzir culturas clonais destes.

De acordo com uma implementação preferida a amostra inicial é preparada de uma ave escolhida do grupo que consiste em perú, galinha, faisão, pavão, codorniz e galinha da india (ou pintada).

Histomonas meleagridis, tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp. são parasitas que infestam particularmente as espécies acima. Por isso os protozoários são isolados preferencialmente destes animais. A fonte de hidratos de carbono é preferencialmente amido, particularmente de arroz, milho ou batata.

Mostrou-se que Histomonas meleagridis, tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp. preferem especialmente amido como fonte de carbono e têm a capacidade de o catabolizar através de absorção para o interior da célula.

As bactérias são preferencialmente enterobacté-rias, preferencialmente bactérias coliformes, estafilo-cocos, estreptococos ou uma mistura destas. 17 ΡΕ1721965

Mostrou-se de acordo com a invenção que Histo-monas meleagridis, tetratrichomonas gallinarum e Blasto-cystis sp. São susceptíveis de ser cultivadas em simbioase com as bactérias acima mencionadas (ou os seus lisados).

Sem a presença destas culturas de bactérias, que são isoladas preferencialmente das fezes de aves, os protozoários não conseguiriam sobreviver ex vivo e não poderiam ser cultivados. Por isso é decisivo que as bactérias estejam presentes tanto antes como após o isolamento em cada passo de cultura ex vivo, se se procura a viabilidade dos protozoários.

De preferência o meio de cultura contem ainda sais, particularmente sais de Earl, aminoácidos, particularmente L-Glutamina e antibióticos/antimicóticos, particularmente penicilina, estreptomicina e anfotericina.

De acordo com uma implementação preferida a pureza da cultura é determinada por meio de uma amplificação de ácidos nucleicos- ou técnica de hibridização ou por meio de uma técnica imunológica com anticorpos dirigidos contra células clonais de protozoários de uma só espécie de protozoário escolhida do grupo que consiste em Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp. A determinação da pureza serve sobretudo para confirmar a presença do parasita a isolar e a ausência de 18 ΡΕ1721965 células de outras espécies de protozoários, não desejadas, na cultura clonal de protozoários. Para determinação da pureza podem ser utilizados vários métodos, mas a são preferidos a amplificação de ácidos nucleicos técnicas de hibridização e técnicas imunológicas são preferidas. 0 conhecimento de regiões de ácidos nucleicos conservadas ou especificas das espécies entre o genoma dos protozoários possibilita indentificar primers específicos ou sondas (p.ex. através de sobreposição de sequências) produzir e utilizar (p.ex. PCR, Southern-Blot, hibridização in situ). Este tipo de técnicas são suficientemente conhecidas de um perito na matéria (ver p.ex. "Current Protocols in Molecular Biology"), Ed Fred M Ausubel et al., Wiley Inc) . Devido à possibilidade de produzir culturas clonais de protozoários com uma única espécie de protozoários com a ajuda da presente invenção, é ainda possível produzir anticorpos específicos contra estas espécies de protozoários e utilizar aqui para determinar a pureza das culturas (p.ex. por meio de ELISA ou RIA).

Preferivelmente são utilizados os oligonucleóti-dos 5'-GAAAGCATCTATCAAGTGGAA-3' e 5'-GATCTTTTCAAATTAGCT-TTAAA-3' para determinação de Histomonas meleagridis, 5'-GCAATTGTTTCTCCAGAAGTG-3' e 5'-GATGGCTCTCTTTGAGCTTG-3' para determinação de Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp. , 5'-TAACCGTAGTAATTCTAGGGC-3' e 5'-AACGTTAATATACGCTAT-TGG-3' para determinação de Blastocystis sp.

Estes oligonucleótidos mostraram-se particular- 19 ΡΕ1721965 mente adequados para determinar as espécies de protozoários individualmente, já que estes se liqam às regiões do genoma que codificam para o RNA ribossomal, que, por sua vez é utilizado para a caracterização filogenética de organismos. Os oligonucleótidos foram determinados devido a sobreposição de sequências com dados de sequências de rRNA de Histomonas meleagridis (AF293056), Tetratrichomonas galli-narum ((AF124608) e Blastocystis sp.(AF408427), publicadas.

De acordo com o processo de acordo com a invenção está disponível uma cultura clonal de protozoários cuja espécie de protozoário é escolhida do grupo que consiste em Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp.

Um outro aspecto da presente invenção diz respeito a um processo para determinar a influência de substâncias ou misturas de substâncias em células de protozoários de uma espécie de protozoário escolhida do grupo que consiste em Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp., que compreende os passos: -Preparação de uma cultura clonal de protozoários de acordo com a presente invenção, -Se nessário ajustar o número de células da cultura de protozoários, -Pôr em contacto e cultivar a cultura de protozoários com um meio de cultura de acordo com a invenção, -Adição de pelo menos uma substância ou pelo menos uma 20 ΡΕ1721965 mistura de substâncias que pode potencialmente exercer influência em células de protozoário -Determinação do número de células de protozoário na cultura de protozoários. -Comparação do número de células de protozoário com a flora concomitante antes e depois da adição da substância. A preparação de uma cultura clonal de protozoário permite, além disso, pôr à disposição um processo que é adequado para investigar a influência de substâncias ou misturas de substâncias no crescimento e na viabilidade de protozoários específicos. Já que até à data não tinha sido possível produzir uma cultura de protozoários que compreenda uma só espécie de protozoários (Histomonas meleagri-dis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp.) também não podiam ser realizados estudos com os quais se pudesse mostrar até que ponto determinadas substâncias têm efeito sobre o metabolismo de uma espécie concreta de protozoário.

Um processo deste tipo é de importância decisiva na investigação de novos medicamentos para aves, que são eficazes contra Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp.

Mostrou-se que a acção de substâncias sobre os protozoários é determinada mais adequadamente através da alteração do número de células (ver p.ex. Zenner et al., 2003; Caillait et al., 2002) . Para isso é primeiro determinado o número dos protozoários presentes numa cultura e, sendo necessário ajustado a um número determinado. Em seguida a cultura 21 ΡΕ1721965 clonal é cultivada na presença de substâncias que podem potencialmente perturbar o crescimento de protozoários. Após um tempo de incubação de pelo menos 12 horas, preferivelmente de pelo menos 24 horas, o número de protozoários é de novo determinado e comparado com o número de partida ou com um controle negativo (meio de cultura sem a adição de potenciais inibidores. Uma diminuição do número de células, em relação à amostra inicial ou um número reduzido de protozoários, em comparação com o controlo negativo mostra que a substância tem uma influência negativa na espécie de protozoários. 0 número de parasitas é determinado pelo número de células (p.ex. coloração vivas-mortas).

Um aspecto adicional da presente invenção diz respeito a um processo para detecção de uma espécie de protozoário escolhido do grupo que consiste em Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp. numa amostra que compreende os passos: -preparar uma amostra -pôr a amostra em contacto com pelo menos um oligonu-cleótido especifico para Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp. ou com um anticorpo dirigido contra Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp. -sendo necessário submeter a amostra/mistura de oligo-nucleótidos a uma técnica de amplificação de ácidos nu-cleicos, -detecção de um produto de produto de amplificação de 22 ΡΕ1721965 ácidos nucleicos, de uma ligação oligonucleótido/célula de protozoário ou uma ligação célula de protozoário/anticorpo. 0 fornecimento de culturas de protozoário clonais permite estabelecer meios (p.ex. anticorpos), que podem ser utilizados para detectar especificamente protozoários numa amostra. Preferivelmente a amostra é um tecido, fezes, cultura ou ambiente (p.ex. uma amostra de um aviário ou recinto).

Preferivelmente são utilizados os nucleótidos 5'-GAAAGCATCTATCAAGTGGAA-3' e 5'-GATCTTTTCAAATTAGCTTTAAA-3' para determinação de Histomonas meleagridis, 5 ' -GCAATTGTTT-CTCCAGAAGTG-3' e 5'-GATGGCTCTCTTTGAGCTTG-3' para determinação de Tetratrichomonas gallinarum, 5'-TAACCGTAGTAATTCTA-GGGC-3' e 5'-AACGTTAATATACGCTATTGG-3' para determinação de Blastocystis sp.

Os oligonucleótidos podem ser utilizados tanto como sequência iniciadora/par de sequência iniciadora para amplificação de um segmento de genoma por meio de p.ex PCR como também como sonda de hibridização.

Um aspecto extra da presente invenção diz respeito a um estojo para detecção de Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp. ou anticorpos dirigidos contra uma destas células numa amostra que engloba: 23 ΡΕ1721965 a) Células clonais de protozoários de uma única espécie de protozoários escolhida do grupo que consiste em Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp. ou um anticorpo dirigido contra células de protozoário de uma única espécie de protozoário escolhida do grupo que consiste em Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp. e b) Meio para detecção de ligação células de protozoário/ anticorpo. 0 estojo de acordo com a invenção pode ser utilizado para detectar Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp. mas também para detectar a presença de anticorpos contra estas células de protozoário, numa amostra. A detecção de anticorpos numa amostra (células de protozoários são aplicadas e incubadas com uma amostra) serve por exemplo para observar o curso de imunização de uma ave ou simplesmente avaliar se a ave já apresenta um titulo de anticorpo suficiente contra Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp.

De preferência as células de protozoário clonais ou o anticorpo são imobilizadas num suporte sólido. É vantajoso se as células de protozoário ou o anticorpo contra estas células de protozoário estão ligados a um suporte sólido. 24 ΡΕ1721965

De acordo com uma implementação preferida, os meios para detecção são anticorpos conjugados, de preferência marcados especialmente, radioactivamente, com enzimas ou com fluorescência.

Processos para detecção de ligações anticorpo-ligando são conhecidas de um perito na matéria (ver p.ex. "Immunochemical Protocols", 3rd Edition (2005), ed. Burns, Robert, Humana Press).

Um aspecto adicional da presente invenção diz respeito a um alimento para animais (ração) ou um aditivo alimentar que compreende uma formulação de vacina de acordo com a invenção.

Uma ração, que conduz à vacinação de aves contra Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp. mostrou-se particularmente vantajosa, já que a vacinação dos animais pode assim ocorrer de modo fácil e eficiente. A presente invenção é adicionalmente descrita através das seguintes figuras e exemplos, sem contudo ser restrita a estes. A Figura 1 mostra a apresentação microscópica (x400; lOpm) da cultura de partida A com Histomonas meleagridis (a), Tetratrichomonas gallinarum (b) e Blastocystis sp. (c) . 25 ΡΕ1721965 A Figura 2 mostra culturas clonais de Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp. após micromanipulação A Figura 3 mostra a especificidade dos ensaios de PCR desenvolvidos. Em nenhuma das figuras se apresenta reacção cruzada embora em cada caso tenham sido utilizados 105 microorganismos de Histomonas meleagridis (Hm), Tetratrichomonas gallinarum (Tg) e Blastocystis sp. (Bl) para este ensaio. M: Marcadores do peso molecular, 1: Histomonas meleagridis, 2: Tetratrichomonas gallinarum e 3: Blastocystis sp. N: Controlo negativo. Primers utilizados: A: Hmf/Hmr (comprimento do produto de PCR: 574 bp (base pairs-pares de bases)); B: Tgf/Tgr (527 bp), C: Blf/Blr (457 bp). Oligonucleótidos correspondentes à tabela 4.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Produção de culturas clonais de Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp.

Ponto de partida para os trabalhos foram 2 culturas mistas (A e B), estabelecidas a partir de fezes de perú. A primeira cultura foi originada de um perú de 10 semanas, de uma população de 5000 animais, dos quais morreram 40% e o resto foi abatido (Hess et al., 2004). 26 ΡΕ1721965

Cerca de 1 g de fezes do ceco juntamente com alguma mucosa foram retomados em 9 ml de meio 199 + sais de Earle + L-Glutamina + 25 mM HEPES + L-aminoácidos (GibcoTM, Invitro-gen) . Foram ainda adicionados 11 mg de amido de arroz (Sigma Aldrich), 10% de de soro fetal de vitelo, antibiótico (200 IE de penicilina e 200pg de estreptomicina por ml de meio) e um antimicótico (2,5 pg de anfotericina B/ ml de meio). Este meio foi utilizado nos ensaios posteriores como meio padrão.

Foram efectuadas passagens dia sim dia não, nas quais 1 ml de meio foi transferido para um novo tubo de 50 ml (Sarstedt) estéril, contendo por sua vez 9 ml de meio padrão. À passagem 117 a cultura foi utilizada para a micromanipulação. A cultura de origem B foi produzida de forma semelhante à da cultura A. No entanto foi utilizado como material de partida apêndice (ceco) de um perú de uma exploração de Hobby na qual morreram 2 entre 6 animais. A cultura B foi usada para micromanipulação após a passagem 7.

Para isolar células individuais das culturas precursora A e B, foi usada micromanipulação, como já está descrito para outros protozoários. Por exemplo Farri et al. (Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene 72(2) (1978:205-206) usaram este método para clonar Entamoeba histolytica. Odula et al. (Experimental Parasi- 27 ΡΕ1721965 toloy 66(1988): 86-95) usaram o método para clonar o agente patogénico da Malária, Plasmodium falciparum. Finalmente, Bushek et al. (J.Eucaryotic Microbiol. 47(2000): 164-166) para estabelecer culturas clonais do microorganismo Perkinsus marinus, agente patogénico para as ostras.

Todos os trabalhos usam a funcionalidade da micromanipulação, gue manipula células individuais, podendo assim ser separadas. A micromanipulação foi realizada concretamente da forma que se segue:

Ambas as culturas de partida (A e B) das fezes de perus, foram diluídas 1:100 e por meio de um capilar (diâmetro exterior 1,0 mm), que foi aplicado a um esticador (P97, Sutter, USA e esticado até obter um diâmetro exterior de 25 pm (Microforge de Fonbrune, Bachofer, Alemanha).

Os parasitas foram retomados em 50 μΐ de meio de cultura e transferidos para um tubo eppendorf. A acção total foi realizada com um micromanipulador Narishige (Narishige, Japão) e um microscópio (Diaphot 300, Nikon, Áustria) sob uma ampliação de 400x. Para controlo do isolamento foi utilizada uma camara CCD e um monitor (Sony, Japão), que estavam ligadas ao microscópio. Após o isolamento, os microorganismos foram incubados a 40°C até 4 dias. O crescimento foi verificado por microscopia aos dias 2, 3 e 4. Cada colónia positiva ou suspeita foi transferida 28 ΡΕ1721965 para um tubo de plástico de 50 ml (Sarstedt) com 9,7 ml de meio padrão.

Decisivo para a cultura é a utilização de um substrato de crescimento ("meio Seeder"). Isto é necessário já que, pelo menos Histomonas meleagridis, não cresce na ausência de bactérias e uma fonte de hidratos de carbono, particularmente amido, tal como amido de arroz ou seja axenicamente.

Para produzir um substrato de crescimento apropriado, foi determinada a flora concomitante da cultura original. Para este efeito foram feito um esfregaço de 100 μΐ da colónia de origem em meio columbia ( + 5% de sangue) McConkey, Salmonella Detection and Identification Media (SMID)-meio de detecção e identificação de salmonela e placas de agar Sabouraud (todos: bioMerieux, Marcy 1'Etoi-le, France). A identificação das bactérias foi realizada com o microsistema API-20 E (bio Merieux, Marcy 1'Etoile, France). Como flora concomitante bacteriana foram identificados principalmente E.coli, estafilococos e estrepto-cocos. Uma parte das bactérias foi retirada da placa de agar sangue com uma ansa de inoculação e transferido para meio de cultura entes da micromanipulação.

Para realizar uma identificação adicional do agente patogénico, foi sequenciadas partes do RNA ribossomal e entradas num banco de dados público (números de acesso: AJ920322- AJ920324). 29 ΡΕ1721965

Exemplo 2: Determinação do padrao de crescimento das culturas clonais.

Após o isolamento, os parasitas foram mantidos durante 3-4 dias em tubos eppendorf, até serem transferidos para tubos de 50 ml, que, por sua vez, continham 9 ml de meio. Seguidamente, após 3-4 dias 1 ml de cultura foi transferido para um novo tubo no qual já se encontravam 9 ml de meio padrão, por isso um processo idêntico ao usado para as culturas A e B. A cultura adicional ocorreu com um processo análogo ao usado com as culturas de partida. Em tempos diferentes foram realizadas contagens, para determinar a velocidade de crescimento dos protozoários. Para isso foi efectuado um teste de viabilidade celular com azul de tripano (0,4%) (Tabela 1)

Tabela 1. Para testar o padrão de crescimento do agente pa-togénico clonado, foi produzido um perfil de crescimento em tempos diferentes, como apresentado na tabela seguinte (1)

Organismo Numero de passagens *Dia 0 #24h 48h 72h 96h Histomonas meleagridis 62 1,0 X 104 2,75 x 105 3,30 x 105 7,45 x 105 3,25 x 105 Tetratrichomonas gallinarum 114 1,0 X 104 7,5 x 104 8, 050 x 106 8,450 x 106 4,650 x 106 Blastocystis sp. 74 6,4 x 104 1,91 x 106 7,275 x 106 3,675 x 106 4,0 x 105 *Número dos protozoários vivos em 1 ml de meio, que foram transferidos para 9 ml de meio #Número de protozoários/ml a diferentes tempos após incubação 30 ΡΕ1721965

Exemplo 3: Sensibilidade das culturas para o preparado padrão Dimetridazole, como referência para o teste de substâncias in vitro.

Para testar a possibilidade de teste de substâncias, à cultura clonal de Histomonas foi adicionado o derivado de Imidazole, dimetridazole.

No total três tubos de 50 ml da cultura de Histomonas foram centrif ugados a 380 x g ao dia 3 de cultura. Os pellets dos três tubos foram juntos (pooled) e as Histomonas contadas. Em seguida foram ajustadas a uma concentração de 100000/ml. Em cada caso 1 ml de cultura de Histomonas foi transferido para um tubo eppendorf e incubado a 40°C com 0,4 mg de Dimetridazole. Em intervalos de 24 horas é realizada uma contagem dos parasitas, para testar o efeito de uma substância teste, como apresentado na tabela 2 a titulo de exemplo.

Tabela 2: Curso de crescimento do agente clonado Histomonas meleagridis, como modelo para o teste de substâncias in vitro aTempo Zero b24h 48h Adição de 0,4 mg de Dimetridazole 100.000 C _ Controlo (sem adição) 100.000 570.000 605.000 aNúmero de protozoários vivos em 1 ml de meio bNúmero de protozoários/ml a tempos de incubação diferentes c não estão presentes protozoários vivos 31 ΡΕ1721965 0 exemplo mostra claramente a eficiência da substância activa Dimetiltridazole.

Exemplo 4: Reprodução da histomonose em perus com 14 dias, como base para o estabelecimento de um modelo in vivo, apropriado para o teste de substâncias in vivo.

Para testar a infecciosidade das culturas, foi realizada uma experência animal, em que perus de 14 dias foram infectados por via intracloacal.

Perus comerciais (18 animais) foram seguidos desde um dia de idade e alimentados com ração padrão. Com 14 dias os 18 animais foram divididos de modo que 14 animais ficaram no mesmo compartimento e 4 animais foram transportados para outro compartimento. Dos 14 animais, 10 foram infectados por via cloacal com 200.000 protozoários (número de passagem 7x até clonagem; 7x após a clonagem). Os animais foram clinicamente testados diariamente para anotar todas as anomalias (particularmente diarreias). A tabela 2 dá uma ideia geram sobre o curso da doença nos animais infectados e nos animais de contacto. 32 ΡΕ1721965

Tabela 3: Ocorrência de diarreias e curso de doença da histomonose em perus com 14 dias

Animais controlo Animais infectados Animais em contacto Dia/ Animal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 6 7 X 8 — _ _ — — — _ — _ X — — _ X _ — — — 9 — _ _ — xb — _ — _ X — — _ _ — — — 10 — _ _ — X X X — X X X — X _ _ X — X 11 — _ — - tc t X t t t X t t _ _ X t _ 12 — _ — — t X t X X _ 13 — _ — — t t _ X 14 Animais abatidos t t a-:sem diarreia bx:diarreia típica cor de açafrão ct animais mortos 0 facto de todos os animais (animais infectados e animais de contacto) morrerem entre o dia 11 e o dia 14 após a infecção, acentua a eficiência do modelo animal estabelecido.

Exemplo 5: Estabelecimento de métodos moleculares de diagnóstico para detecção especifica de Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp.

As culturas clonais foram utilizadas para estabelecer métodos de detecção clonais com a caracteristica de detectar especificamente o respectivo agente patogénico. 33 ΡΕ1721965

Para este efeito foram construídos oligonucleó-tidos com a ajuda dos quais pode ser detectado especi-ficamente o respectivo agente patogénico.

Com base nas diferenças genómicas na área do RNA ribossomal foram construídos oligonucleótidos que permitem a detecção específica do respectivo agente, por meio de hibridização ou amplificação do fragmento genómico (PCR).

Tabela 4: Oligonucleótidos para detecção especifica de Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp.

Sequência iniciadora Sequência Posição do nucleótidoa,b'c Ampli ficado Hmf 5 ' -GAA AGC ATC TAT CAA GTG GAA-3' 768-788 bpa 574 bp Hmr 5 ' -GAT CTT TTC AAA TTA GCT TTA AA-3' 1342-1320 bpa Tgf 5 ' -GCA ATT GTT TCT CCA GAA GTG-3' 152-171 bpb 52 7 bp Tgr 5’-GAT GGC TCT CTT TGA GCT TG-3' 660-679 bpb Blf 5 ' -TAA CCG TAG TAA TTC TAG GGC-3' 120-140 bpc 45 7 bp Blr 5 ' -AAC GTT AAT ATA CGC TAT TGG-3' 557-577 bpc a: segundo o número de acesso: AF293056 b: segundo o número de acesso: AF124608 c: segundo o número de acesso: AF408427 34 ΡΕ1721965

Literatura:

Allen, E.A., (1941) Am.J.Vet.Res., 2:214-217.

Bayon and Bishop, (1937) Nature, 139:370-371.

Bishop A. (1938) Parasitology, 30: 181-194.

Burkot, T.R., et al. (1984) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 78:339-341.

Callait, M.P., et al. (2002) Poult Sei. 81:1122-7.

Cepicka, I., et al. (2005) Vet. Parasitol. 128:11-21.

Dwyer, D.M., (1970) J. Parasitol. 56:191-192.

Esquenet, C., et al. (2003) Avian Pathol. 32:303-306.

Gerbod, D., et al. (2001) J. Eukaryot. Microbiol. 48:498- 504 .

Goedbloed and Bool, (1962) Avian Dis., 6:302-315.

Hafez, H.M., et. (2001)Tierárzt1. Praxis 3:168.

Hess, M., et.al. (2004) 5th International Symposium on Turkey Diseases, Berlin, 16.-19.06.2004, 254-257.

Hu, J., et al. (2004) Avian Dis. 48:746-750.

Hu, J.H., McDougald, L.R., (2003) Avian Dis. 47:489-492.

Kemp, R.L., Reid, W.M., (1966) Avian Dis. 10:357-363.

Kulda et al. (1974) Acta Vet. Brno, 43:53-64.

Landmann, W.J.M., et al. (2004) 5th International Symposium on Turkey Diseases, Berlin 16.-19.06.2004, 258-268.

LeBras, J., et al. (1983) Exp. Parasitol. 56:9-14.

McDougald, L.R., Galloway, R.B., (1973) Avian Dis 17:847- 850 .

McDougald, L.R., (2003) Other protozoal diseases of the intestinal tract- Histomoniasis (Blackhead). InSaif, Y.M.,

Barnes, H.J. 35 ΡΕ1721965

Glisson, J.R., Fadly, A.M., Mc Dougald, L.R. Swayne, D.E., (Ed) , Diseases of Poultry, Iowa State Press, Ames, Iowa p 1001-1008.

Noel, C., et al. (2003) Mol. Biochem. Parasitol. 126:119- 123 .

Noel, C., et al. (2005) J. Clin. Microbiol. 43:348-355.

Norton et al. (1999) Avian Diseases, 43:342-348.

Rosário, V., (1981) Science 212: 1037-1038.

Smith, T., (1895) Na infectious disease among turkeys caused by Protozoa (infectious enterohepatitis). US Dep. Agric. Bur. Anim. Indust., Buli. No.8,7.

Strepkowski, S., Klimont, S., (1979). Obserwacje dad in vitro Histomonas meleagridis (Smith, 1895), Med. Wet. 8:502-505.

Trager, W, et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. 78:6527- 6530 .

Tyzzer, E.E., (1920) J.Parasitol. 6:124-130.

Zenner, L., et al. (2003) Parasite 10:153-7.

Lisboa 21 de Março de 2012

Claims (19)

1. ΡΕ1721965 1 REIVINDICAÇÕES 1. Cultura clonal de protozoários que compreende células de protozoário de uma só espécie de protozoários, em que a espécie de protozoário é escolhida do grupo que consiste em Histomonas meleagridis, Tetratri-chomonas gallinarum e Blastocystis sp., caracterizada em que a cultura contem bactérias simbióticas ou o seu lisado.
2. 2. Cultura de protozoários de acordo com a reivindicação 1, caracterizada em que as bactérias são enterobactérias, particularmente bactérias coliformes, estafilococos, estreptococos ou misturas destes.
3. 3. Formulação de vacina que compreende células de protozoário clonais, inactivadas ou vivas, de uma só espécie de protozoário escolhida do grupo que consiste em Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp. ou um anticorpo dirigido contra células de protozoário clonais de uma só espécie de protozoário escolhida do grupo que consiste em Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp.
4. 4. Formulação de vacina de acordo com a reivindicação 3, caracterizada em que a vacina compreende um adjuvante, que é preferivelmente escolhido do grupo que consiste em adjuvante completo de Freund, adjuvante incompleto de Freund, hidróxido de alumínio, Bordetella per- 2 ΡΕ1721965 tussis, saponina, muramil dipéptido, copolímero etileno-acetato de vinilo, óleo, preferencialmente um óleo vegetal ou um óleo mineral, particularmente óleo de amendoim, óleo de silicone e combinações destes.
5. 5. Formulação de vacina de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizada em que as células de protozoário clonais são inactivadas através de passagens, através de radiação, particularmente radiação UV ou radioactiva, através de substâncias quimicas ou através de vírus ou através de calor, formalina, beta-propiolactona ou combinações destas.
6. 6. Formulação de vacina, de acordo com uma das reivindicações 3 a 5, caracterizada em que a vacina é adaptada para administração intravenosa, subcutânea, intramuscular, oral ou intracloacal.
7. 7. Processo para a produção de uma cultura clo-nal de protozoários que compreende células de protozoário de uma só espécie de protozoário escolhida do grupo que consiste em Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp. que compreende os passos: a) Preparar uma amostra de partida que compreende células de protozoário de pelo menos uma espécie de protozoário escolhida do grupo que consiste em Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blasto cystis sp. 3 ΡΕ1721965 b) Cultivar as células da cultura de partida num meio de cultura que compreende uma fonte de hidrato de carbono e bactérias de pelo menos uma espécie de bactérias que vivem in situ, em simbiose, com as células de protozoário ou um lisado destas, c) Isolar as células de protozoário por meio de micro-manipulação, d) Cultivar as células de protozoário isoladas num meio de cultura como definido em b) e e) Sendo necessário, determinar a pureza da cultura clonal de protozoário.
8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado em que a amostra de partida é uma amostra de fezes, tecido, cultura ou ambiente.
9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado em que a amostra de partida é de uma ave escolhida do grupo que consiste em perú, galinha, faisão, pavão, codorniz e pintada (galinha da índia).
10. 10. Processo de acordo com uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada em que a fonte de hidratos de carbono é amido, em particular de arroz, de milho ou de batata.
11. 11. Processo de acordo com uma das reivindicações 7 a 10, caracterizada em que as bactérias são enterobactérias, em particular bactérias coliformes, esta-filococos, estreptococos ou misturas destas. 4 ΡΕ1721965
12. 12. Processo de acordo com uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado em que o meio de cultura contem adicionalmente sais, em particular sais de Earle, aminoácidos, particularmente L-Glutamina e antibióticos/an-timicóticos, particularmente penicilina, estreptomicina e anfotericina.
13. 13. Processo de acordo com uma das reivindicações 7 a 12, caracterizado em que a pureza da cultura é determinada por meio de uma técnica de amplificação de ácidos nucleicos ou técnica de hibridização ou por meio de uma técnica imunológica com anticorpos dirigidos contra células clonais de uma só espécie de protozoário escolhida do grupo que consiste em Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp.
14. 14. Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado em que os oligonucleótidos 5'-GAAAGCATCT-ATCAAGTGGAA-3' e 5'-GATCTTTTCAAATTAGCTTTAAA-3' são utilizados para determinar Histomonas meleagridis, 5'-GCAATT-GTTTCTCCAGAAGTG-3' e 5'-GATGGCTCTCTTTGAGCTTG-3' para determinar Tetratrichomonas gallinarum, 5'-TAACCGTAGTAATTCTA-GGGC-3' e 5'-AACGTTAATATACGCTATTGG-3' para determinar Blastocystis sp.
15. 15. Processo para determinação da influência de substâncias ou misturas de substâncias em células de protozoário de uma espécie de protozoário escolhida do 5 ΡΕ1721965 grupo que consiste em Histomonas meleagridis, Tetra-trichomonas gallinarum e Blastocystis sp., que compreende os passos: - preparar uma cultura clonal de protozoários de acordo com a reivindicação 1 ou 2, - se necessário ajustar o número de células da cultura de protozoários, pôr em contacto e cultivar a cultura clonal de protozoários com um meio de cultura como definido nas reivindicações 7 e 10 a 12, - adicionar pelo menos uma substância ou pelo menos uma mistura de substâncias, que pode exercer influência em células de protozoário, - determinar o número de células de protozoário na cultura de protozoários, - comparar o número de células de protozoário antes e após a adição de pelo menos uma substância ou pelo menos uma mistura de substâncias.
16. 16. Processo para detecção de uma espécie de protozoário escolhida do grupo que consiste em Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp., numa amostra que compreende os passos: -preparar uma amostra, -pôr em contacto a amostra com pelo menos um oligo-nucleótido especifico para Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp., ou um anticorpo 6 ΡΕ1721965 dirigido contra Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp., -sendo necessário, submeter a mistura amostra/oligonu-cleótido a uma técnica de amplificação de ácidos nucleicos, -detecção de um produto de amplificação de ácidos nucleicos, uma ligação oligonucleótido/célula de protozoário ou uma ligação célula de protozoário/anticorpo.
17. 17. Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado em que os oligonucleótidos 5'-GAAAGCATCT-ATCAAGTGGAA-3' e 5'-GATCTTTTCAAATTAGCTTTAAA-3' são utilizados para determinar Histomonas meleagridis, 5'-GCAATT-GTTTCTCCAGAAGTG-3' e 5'-GATGGCTCTCTTTGAGCTTG-3' para determinar Tetratrichomonas gallinarum, 5'-TAACCGTAGTAATTCTA-GGGC-3' e 5'-AACGTTAATATACGCTATTGG-3' para determinar Blastocystis sp.
18. 18. Estojo para detecção de Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp., ou anticorpos dirigidos contra uma destas células, numa amostra que abrange a)células de protozoário clonais de uma só espécie de protozoário escolhida do grupo que consiste em Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp., ou um anticorpo dirigido contra células de protozoário de uma só espécie de protozoário escolhida do grupo que consiste em Histomonas meleagridis, Tetratrichomonas gallinarum e Blastocystis sp. e 7 ΡΕ1721965 b)meio para detecçao da ligaçao célula de protozoário/ anticorpo.
19. 19. Alimento para animais ou aditivo alimentar que compreende uma vacina segundo uma das reivindicações 3 a 6 . Lisboa, 21 de Março de 2012