PT1690535E - Utilização terapêutica de um precursor do óxido nítrico - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

UTILIZAÇÃO TERAPÊUTICO DE UM PRECURSOR DO ÓXIDO NÍTRICO A presente invenção refere-se à Citrulina para utilização num método de tratamento ou prevenção de uma condição ou distúrbio num indivíduo submetido a cirurgia cardíaca que está associado à função subótima do ciclo da ureia. Descrevem-se adicionalmente moléculas polinucleotídicas isoladas úteis para analisar os fenótipos da carbamilo fosfato sintetase I, péptidos codificados por estas moléculas, e as utilizações diagnósticas e terapêuticas das mesmas relacionadas com um polimorfismo da carbamilo fosfato sintetase I recém-identifiçado. Entre as tais utilizações estão métodos descritos para determinar a suscetibilidade de um indivíduo à hiperamoniemia, à produção reduzida de arginina e à toxicidade por transplante de medula óssea baseados numa análise de uma amostra de ácido nucleico isolada a partir de biópsias de tecidos do indivíduo.

Quadro de abreviaturas ABG - gás/gases no sangue arterial ALI - lesão aguda do pulmão ASO - oligonucleótido específico de alelo ATP - adenosina trifosfato BCAA - aminoácido(s) de cadeia ramificada BMT - transplante de medula óssea BSA - albumina sérica bovina

BuCy - bussulfano, ciclofosfamida BUN - ureia do sangue CBVP16 - ciclofosfamida, bis- cloroetilnitrosoureia, etopósido cc - centímetros cúbicos

CPSI - carbamilo fosfato sintetase I CTC - ciclofosfamida, tiotepa, carboplatina CVP16TB1 - ciclofosfamida, etopósido, irradiação corporal total ECMO - oxigenação por membrana extracorporal fl - comprimento completo GSHosc - glutationa sintetase HAT - hipoxantina, aminopterina, timidina HVOD - doença hepática veno-oclusiva iNO - óxido nítrico inalado KDa - quilodalton KLH - hemocianina de lapa 1 - litro LAT - tradução ativada por ligação LCR - reação em cadeia de ligase MAS - síndrome de aspiração de mecónio NAG - n-acetil-glutamato NASDA - amplificação baseada em sequências de ácidos nucleicos NO or NOx - óxido nítrico NOS - óxido nítrico sintetase 0/C - ornitina/citrulina PBSCT - transplante de células estaminais do sangue periférico PPHN - hipertensão pulmonar persistente em recém-nascidos PCR - reação em cadeia da polimerase RCR - reação em cadeia de reparação RDS - síndrome de dificuldade respiratória REF - mapeamento genético de endonucleases de restrição RT - transcriptase reversa SSCP - polimorfismo de conformação de cadeia simples SDA - ativação por deslocamento de cadeia SNP - polimorfismo de nucleótido único TC - tiotepa, ciclofosfamida TEAA - aminoácidos essenciais totais UC - ciclo da ureia UCF - função do ciclo da ureia VPA - ácido valproico Técnica Antecedente A via sintética in vivo da arginina começa com a ornitina. A ornitina combina-se com carbamilo fosfato para produzir citrulina, que por sua vez se combina com aspartato, na presença de adenosina trifosfato (ATP), para produzir argininosuccinato. Na etapa final, o fumarato separa-se do argininosuccinato, para produzir arginina. A via de degradação da arginina dá-se através da ação hidrolítica da arginase, para produzir ornitina e ureia. Estas reações formam o ciclo da ureia. 0 ciclo da ureia serve de via primária para remover os resíduos de azoto produzidos pelo metabolismo de proteínas endógenas e exógenas, e está representado esquematicamente na Fig. 1. A perturbação dos processos metabólicos é um efeito secundário frequente da quimioterapia. De facto, os agentes usados na quimioterapia de dose elevada afetam um número de processos celulares. Os processos metabólicos localizados em tecidos quimio-sensíveis, tais como o fígado e o trato gastrointestinal, estão sujeitos a um risco particularmente grande de perturbação. A renovação constante e o processamento do azoto envolvem todos os tecidos do corpo, mas as primeiras etapas críticas do ciclo da ureia limitam-se ao fígado e ao intestino. A quimioterapia de dose elevada associada ao transplante de medula óssea (BMT) interfere com a função hepática e é tóxica para o intestino. A hiperamoniemia idiopática, que é sugestiva da disfunção do ciclo da ureia, foi relatada como estando associada com uma alta mortalidade em pacientes submetidos a transplantes de medula óssea. Davies et al., Bone Marrow Transplantation, 17:1119-1125 (1996); Tse et al., American Journal of

Hematology, 38:140-141 (1991); e Mitchell et al., American Journal of Medicine, 85:662-667 (1988) .

Uma complicação comum do BMT é a doença hepática veno-oclusiva (HVOD) . A HVOD está associada à icterícia, ao aumento de tamanho do fígado e à perturbação do fluxo sanguíneo hepático normal. A HVOD ocorre em aproximadamente 20 a 40% dos pacientes e está associada com morbilidade grave e com mortalidade. O óxido nítrico (NO) desempenha um papel na regulação do tónus vascular e na manutenção da desobstrução das vénulas hepáticas e pulmonares após a quimioterapia de dose elevada. A função intacta do ciclo da ureia é importante não só para a excreção da amónia, mas também para a manutenção de níveis teciduais adequados de arginina, o precursor do NO. A carbamilo fosfato sintetase I (CPSI) é a enzima limitante da taxa que catalisa a primeira etapa comprometida da génese da ureia através do ciclo da ureia. A CPSI é altamente específica de tecidos, com uma função e produção substancialmente limitadas ao fígado e aos intestinos. Codificada genomicamente, a CPSI produz-se no citoplasma e é transportada para dentro das mitocôndrias onde é segmentada na sua forma monomérica madura de 160 kDa. A enzima combina a amónia e o bicarbonato para formar carbamilo com gasto de duas moléculas de ATP e utilizando o cofator N-acetilo-glutamato (NAG).

Qualquer predisposição genética para uma função reduzida do ciclo da ureia levaria à hiperamoniemia e provavelmente contribuiria à gravidade de distúrbios associados à função subótima do ciclo da ureia, incluindo a toxicidade relacionada com BMT. Como tal, existe uma necessidade na técnica para a caracterização de alelos presentes em populações que sofrem distúrbios associados com uma função subótima do ciclo da ureia, submetidas a BMT ou de outra forma enfrentando exposição a hepatotoxinas ambientais ou farmacológicas. Em vista do papel da CPSI no ciclo da ureia, existe uma necessidade particular para caracterização dos alelos da CPSI presentes em tais populações.

Russel I. et al. , ANESTHESIA AND ANALGESIA, vol. 87, N.° 1, julho de 1998, páginas 46-51, descrevem os efeitos do óxido nítrico inalado na hipertensão pulmonar pós-operatória em lactentes e crianças submetidos a reparação cirúrgica de doença cardíaca congénita.

Schulze-Neick et al, CIRCULATION, vol. 100, N.° 7, agosto de 1999, páginas 749-755, investigaram a disfunção endotelial pulmonar em crianças com doença cardíaca congénita através da avaliação da via da L-arginina-óxido nítrico (NO).

Sumário da Invenção A presente invenção divulga citrulina para utilização num método de tratamento ou prevenção de uma condição ou um distúrbio num indivíduo submetido a cirurgia cardíaca que está associado à função subótima do ciclo da ureia.

Preferivelmente a citrulina é administrada numa dose que varia desde cerca de 0,01 mg até cerca de 1.000 mg.

Mais preferivelmente, a citrulina administra-se num intervalo de doses de cerca de 0,5 mg até cerca de 500 mg.

Ainda mais preferivelmente, a citrulina administra-se num intervalo de doses de cerca de 1,0 mg até cerca de 250 mg.

Preferivelmente o indivíduo é um indivíduo humano.

Descreve-se um método de rastreio para a suscetibilidade à função subótima do ciclo da ureia. O método que compreende as etapas de: (a) obter uma amostra de ácidos nucleicos a partir do indivíduo; e (b) detetar um polimorfismo de um gene da carbamilo fosfato sintetase I (CPSI) na amostra de ácido nucleico a partir do indivíduo, a presença do polimorfismo indicando que a suscetibilidade do indivíduo à função subótima do ciclo da ureia. Descreve- se adicionalmente a deteção do polimorfismo com respeito à determinação da suscetibilidade de um indivíduo à toxicidade por transplante de medula óssea.

Preferivelmente, o polimorfismo do polipéptido de carbamilo fosfato sintetase I compreende uma transversão de C para A no exão 36 do gene da CPSI, mais preferivelmente no nucleótido 4340 de um ADNc que corresponde ao gene da CPSI. Mais preferivelmente, a transversão de C para A no nucleótido 4340 do ADNc que corresponde ao gene da CPSI compreende adicionalmente uma alteração no código do tripleto de AAC para ACC, que codifica um polipéptido de CPSI que tem um fração de treonina no aminoácido 1405.

Descreve-se adicionalmente um polipéptido de CPSI biologicamente ativo isolado e purificado. Preferivelmente, um polipéptido é um polipéptido recombinante. Mais preferivelmente, um polipéptido compreende a CPSI humana que tem uma fração de asparagina no aminoácido 1405.

Descreve-se adicionalmente um polinucleótido isolado e purificado que codifica um polipéptido de CPSI biologicamente ativo. Descreve-se adicionalmente um polinucleótido da presente invenção que compreende uma molécula de ADN a partir de um ser humano. Adicionalmente, descreve-se um polinucleótido que compreende um ADNc que corresponde ao gene CPSI e que inclui uma transversão de C para A no nucleótido 4340. Descreve-se ainda adicionalmente um polinucleótido que compreende adicionalmente um ADNc que corresponde ao gene CPSI que inclui uma alteração no código do tripleto de ACC para AAC no nucleótido 4340, e codifica um polipéptido de CPSI que tem uma fração de asparagina no aminoácido 1405.

Os kits e reagentes, que incluem os oligonucleótidos, as sondas de ácidos nucleicos e os anticorpos adequados para a utilização na realização dos métodos descritos no presente documento e para a utilização na deteção dos polipéptidos e polinucleótidos descritos no presente documento também estão descritos no presente documento. Os métodos de preparação dos polinucleótidos e polipéptidos descritos no presente documento também estão descritos no presente documento.

Descrevem-se adicionalmente os métodos terapêuticos baseados num polimorfismo de um gene da carbamilo fosfato sintetase I (CPSI) descrito no presente documento. Tais métodos terapêuticos incluem a administração de precursores do óxido nítrico no tratamento e na profilaxia dos distúrbios mediados ou modulados pela função subótima do ciclo da ureia (por exemplo, toxicidade por transplante de medula óssea) e as abordagens de terapia génica utilizando um polinucleótido isolado e purificado descrito no presente documento. É portanto um objeto da presente invenção proporcionar citrulina para utilização num método de tratamento ou prevenção de uma condição ou distúrbio num indivíduo submetido a cirurgia cardíaca que está associado à função subótima do ciclo da ureia.

Tendo sido acima relatados alguns dos objetos da invenção, outros objetos da invenção tornar-se-ão evidentes à medida que a descrição prossegue, quando tomados em conjunto com os desenhos e exemplos anexos, conforme melhor descritos no presente documento abaixo.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 é um esquema do ciclo da ureia; A Figura 2 é um esquema da proteína CPSI de consenso, que não reflete mutações reconhecidas; A Figura 3 é um esquema da proteína CPSI de consenso representando várias mutações conhecidas na proteína e representando o polimorfismo T1405N da presente invenção; A Figura 4 é um esquema da modificação pós-transcripcional reconhecida da CPSI; A Figura 5 é um esquema do locus genómico humano para a CPSI; A Figura 6 é um esquema de uma estratégia de clonagem para um ADNc de CPSI de comprimento completo; A Figura 7 é um esquema de uma estratégia de clonagem alternativa para um ADNc de CPSI de comprimento completo; A Figura 8 é uma representação gráfica da atividade metabólica da proteína CPSI expressa nas células COS-7; A Figura 9 é uma apresentação gráfica do tamanho e posição dos intrões no ADNc de CPSI; A Figura 10 é um diagrama do exão 36 (SEQ ID NO: 5) mostrando as localizações dos iniciadores oligonucleotídicos preferidos da presente invenção; A Figura 11 apresenta a sequência de aminoácidos de T1405 CPSI (SEQ ID NO:4) (codão de terminação traduzido como "X", 165049MM, l,163602e+07 CN), com o aminoácido inicial metionina considerado como estando numa posição -1; e A Figura 12 apresenta a sequência de aminoácidos de N1405 CPSI (SEQ ID NO:2) (codão de terminação traduzido como "X", 165062 MM, l,161634E+07 CN), com o aminoácido inicial metionina considerado como estando numa posição -1.

Descrição Detalhada da Invenção

Descreve-se no presente documento a surpreendente descoberta de um polimorfismo da carbamilo fosfato sintetase (CPSI), a enzima que catalisa a primeira etapa limitante da taxa do ciclo da ureia. Particularmente, o polimorfismo caracteriza-se por uma substituição de aminoácidos, treonina/asparagina no aminoácido 1405 (heterozigosidade = 0,44) na CPSI.

Também se descreve no presente documento a surpreendente observação de que uma única alteração nucleotídica no gene da CPSI é responsável pelo polimorfismo da CPSI. Particularmente, uma transversão de C para A com o exão 36 do gene da CPSI altera o código do tripleto de ACC para AAC e leva à alteração T1405N no polipéptido da CPSI codificado. À luz destas descobertas, a manipulação de moléculas de ácidos nucleicos derivadas a partir dos tecidos de indivíduos vertebrados pode ser efetuada para proporcionar a análise dos fenótipos da CPSI, para a geração de péptidos codificados por tais moléculas de ácidos nucleicos, e para métodos diagnósticos e terapêuticos relacionados com o polimorfismo da CPSI. As moléculas de ácidos nucleicos utilizadas nestes contextos podem ser amplificadas, tal como descrito abaixo, e geralmente incluem ARN, ADN genómico e ADNc derivado a partir de ARN. A. Considerações Gerais A maioria da informação estrutural atualmente disponível sobre a CPSI deriva de estudos da enzima CPSI em ratos. A enzima CPSI de ratos e a enzima CPSI humana compreendem cada uma, um polipéptido simples de 1.500 resíduos e exibem cerca de 95% de identidade de sequência. A informação sobre os polipéptidos e as sequências de ácidos nucleicos da CPSI de ratos é divulgada por Nyunoya, H., et ai., Journal of Biological chemistry 260:9346-9356 (1985) e nos números de acesso do GenBank AH005315, M12335, M12328, M12327, M12326, M12325, M12324, M12323, M12322, M12321, M12320, M12319, M12318 e M11710, incorporados no presente documento como referência. A informação estrutural sobre a CPSI de ratos deriva a partir dos estudos sobre homologia de sequências e de ligação de substrato e cofator; no entanto, não estão disponíveis quaisquer dados cristalográficos. A CPSI madura é de natureza modular, contendo 2 regiões principais. A primeira região, os resíduos 39-406, é homóloga à subunidade pequena da CPS heterodimérica de Escherichia coli. A informação sobre as sequências de ácidos nucleicos e polipéptidos da CPSI de bactérias e leveduras é divulgada nos números de acesso do GenBank AB 0 0 5 0 63, X67573, M27174, P07258, P03965, BAA21088, SYBYCP, SYBYCS e SYECCS, incorporados no presente documento como referência. A outra região, os resíduos 417-1500 (referida doravante como o "domínio CPS"), é homóloga à subunidade grande da CPS de E. coli. Meister, A., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 62:315-374 (1989). Esta subunidade é responsável pela síntese de carbamilo fosfato a partir da amónia e pela ligação dos substratos e cofatores. Meister, A., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 62:315-374 (1989) . O domínio CPS surgiu da duplicação génica e fusão em tandem no pró-genoma, e, como ilustrado esquematicamente na Figura 2, está ele mesmo composto por dois domínios de fosforilação e um domínio regulador C-terminal envolvido na ligação de n-acetil-glutamato (NAG) . Nyunoya, H., et ai., Journal of Biological Chemistry 260:9346-9356 (1985) .

Como ilustrado esquematicamente na Figura 2, os resíduos 407-416 atuam como uma ponte entre as duas subunidades principais, e os resíduos 1-38 constituem o péptido líder que dirige a CPSI imatura para as mitocôndrias antes de ser removida. Continuando com a Figura 2, a região semelhante a subunidade pequena é composta por dois subdomínios aproximadamente iguais. O subdomínio de interação, resíduos 39-212, corresponde à região que, na subunidade pequena da CPS de E. coli, é necessária para associação com a subunidade grande. O subdomínio de glutaminase, resíduos 213-406, é homólogo a várias glutamina amidotransferases e à região da CPSI que quando é gerada, livre de outros componentes exibiu considerável atividade de glutaminase, conforme descrito por Guillou, F., et al. Proc Natl Acad Sei 86:8304-8308 (1989); Nyunoya, H., et al. , Journal of Biological Chemistry 260:9346-9356 (1985); e Guy, Η. I. et al. ,

Journal of Biological Chemistry 270:2190-2197 (1995). Uma vez que a CPSI perdeu o resíduo de cisteína necessário para separar a glutamina, a função do subdominio da glutaminase é incerta nesta enzima.

Acredita-se que o domínio CPS (correspondente à subunidade grande em E.coli) catalisa a síntese de carbamilo fosfato a partir da amónia, de acordo com a reação:

Como ilustrado esquematicamente nas Figuras 1 e 2, esta reação compreende três etapas: fosforilação do bicarbonato por uma molécula de ATP que é designada no presente documento como ATPA, dando carboxifosfato; síntese de carbamato a partir de carboxifosfato e amónia; e fosforilação do carbamato por outra molécula de ATP (ATPb) , dando carbamilo fosfato, conforme descrito por Rubio, V. e Grisolia, S., Enzyme 26:233-239 (1981) .

Como ilustrado esquematicamente na Fig. 4, o domínio CPS parece ter surgido por duplicação e fusão em tandem do componente duplicado; portanto, as suas metades de terminal amino e COOH são homólogas, conforme descrito por Nyunoya, H., et al. , Journal of Biological Chemistry 260:934 6-9356 (1985)). Cada metade homóloga compreende um domínio de terminal amino e COOH de cerca de 40 e 30 kDa, respetivamente, dos quais se acredita que o domínio de 40 kDa da metade amino está envolvido na fosforilação do bicarbonato (domínio de fosforilação do bicarbonato, resíduos 417-788) (Fig. 2) . O domínio correspondente na metade COOH está envolvido na fosforilação do carbamato através do domínio de fosforilação do carbamato, resíduos 969-1329 (Fig. 2), conforme descrito por Alonso, E. e Rubio, V., European Journal of Biochemistry 229:377-384 (1995)).

Estes domínios de fosforilação são homólogos à biotina carboxilase (Toh, H. et al. , European Journal of

Biochemistry 215:687-696 (1993)), uma enzima de estrutura tridimensional conhecida que fosforila o bicarbonato assim como a DD-ligase e a glutationa sintetase (GSHase), duas enzimas que catalisam reações análogas (Artymiuk, P. J. et al. , Nature Struct. Biol. 3:128-132 (1996)). Como tal, a informação sobre estas enzimas é útil para interpretar as mutações encontradas em domínios homólogos nos pacientes com deficiência da CPSI.

Novamente com referência à Fig. 2, dos domínios de 20 kDa da região semelhante a subunidade grande, a função do domínio da metade amino-terminal, resíduos 789-968, permanece sem estar estabelecida. Em contraste, o domínio terminal COOH correspondente, resíduos 1330-1500, é chamado o domínio alostérico, porque o ativador, n-acetil-glutamato (NAG) da CPSI e os efetores nucleot ídicos da enzima de E.coli, UMP e IMP, ligam-se neste domínio, conforme descrito por Rodriguez-Aparicio, L. B. et al., Biochemistry 28:3070-3074 (1989) e Cervera, J. et al., Biochemistry 35 : 7247-7255 (1996) . A.1. Processamento de Enzimas. O ARNm da CPSI humana codifica uma pré-proteína de 1500 aminoácidos e 165 kDa. O terminal amino deste precursor contém 38 resíduos, incluindo 8 resíduos básicos e 1 resíduo ácido com uma sequência Pro-Gly, 4 resíduos antes do início da enzima madura (Nyunoya, H. et al., Journal of Biological Chemistry 260:9346-9356 (1985);

Lagace, M. et al. , Journal of Biological Chemistry 262:10415-10418 (1987). Esta sequência de sinal altamente conservada promove a entrada de enzimas para a matriz mitocondrial, onde é então removida para produzir a enzima madura de 160 kDa. A. 2. Expressão Normal de CPSI. A expressão enzimática da CPSI deteta-se inicialmente no fígado fetal humano pelas 5-10 semanas de gestação (Moorman, A. F. et al. Histochemical Journal 22:457-468 (1990)) . Pelas 20 semanas de gestação, o nível de CPSI alcança aproximadamente 50% do nível normal adulto, onde permanece até ao nascimento, após o qual aumenta gradualmente até níveis adultos pelos 20 anos de idade (Raiha, N. C. R. e Suihkonen, J. Acta Paediatrica Scand 57:121-127 (1968)). A expressão tecidual da CPSI está essencialmente limitada ao fígado, com quantidades residuais de atividade no intestino e rim. Quando o fígado desenvolve a sua estrutura acinosa na idade adulta, a CPSI é compartimentalizada em células parenquimatosas em torno das vénulas portais terminais (Moorman, A. F. et al. Histochemical Journal 22:457-468 (1990)).

Para além da sua compartimentalização, sabe-se que vários fatores são importantes na regulação da atividade e da expressão da CPSI. Por exemplo, níveis baixos ou ausentes de ornitina diminuem a atividade da CPSI, provavelmente devido a um efeito inibidor por parte do carbamilo fosfato (CP) acumulado, conforme descrito por Jackson, M. J. et al., Annual Review of Genetics 20:431-464 (1986); e Rubio, V., Biochemical Society Transactions 21:198-202 (1993) ) . Os níveis de ARNm de CPSI e de enzima aumentam com uma dieta rica em proteínas, e como resposta ao glucagon e aos glucocorticoides (Jackson, M. J. et al., Annual Review of Genetics 20:431-464 (1986); de Groot, C. J., et al., Biochemical & Biophysical Research Communications 124:882-888 (1984)). Em tecido hepático normal não estimulado que foi examinado, observou-se uma abundância de ARNm de CPSI. B. Técnicas de Rastreio

No presente documento, descreve-se um método de rastreio para a suscetibilidade à função subótima do ciclo da ureia resultando na eliminação diminuída de amónia e na produção diminuída de arginina num sujeito. O método compreende: (a) obter uma amostra de ácidos nucleicos a partir do indivíduo; e (b) detetar um polimorfismo de um gene da carbamilo fosfato sintetase I (CPSI) na amostra de ácidos nucleicos do indivíduo, a presença do polimorfismo indicando que a suscetibilidade do indivíduo à função subótima do ciclo da ureia resultando na eliminação diminuída de amónia e produção diminuída de arginina. No presente documento, a deteção do polimorfismo descreve-se particularmente com respeito à determinação da suscetibilidade de um sujeito à toxicidade por transplante de medula óssea. É adicionalmente indicado que o polimorfismo da presente descrição pode ser utilizado para prever a toxicidade numa série de condições para além do BMT ou da administração de ácido valproico conforme descrito no presente documento e nos Exemplos. 0 polimorfismo também está implicado na mediação ou modulação da eliminação de amónia e produção de arginina perturbadas em situações tais como a cirrose hepática adulta, toxicidade por outras medicações, recém-nascidos com função hepática deficiente, e semelhantes.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "polimorfismo" refere-se à ocorrência de duas ou mais sequências ou alelos alternativos geneticamente determinados numa população. Um marcador polimórfico é o locus no qual ocorre divergência. Os marcadores preferidos têm pelo menos dois alelos, cada um ocorrendo numa frequência de mais de 1%. Um locus polimórfico pode ser tão pequeno quanto um par de bases.

As moléculas de ácidos nucleicos úteis descritas no presente documento incluem as que hibridizarão especificamente com sequências da CPSI na região de transversão de C para A na base 4340 e dentro do exão 36 alterando o código do tripleto de ACC para AAC. Esta transversão leva à alteração T1405N no polipéptido da CPSI codificado. Tipicamente estes têm pelo menos cerca de 20 nucleótidos de comprimento e têm a sequência nucleotídica correspondente à região de transversão de C para A na base 4340 da sequência de ADNc da CPSI de consenso (EC6.3.4.16), que altera o código do tripleto de ACC para AAC. O termo "sequência de consenso", conforme utilizado no presente documento, destina-se a referir-se a uma sequência de ácidos nucleicos ou de proteínas para CPSI, os aminoácidos ou ácidos nucleicos das quais se sabe que ocorrem com alta frequência numa população de indivíduos que porta o gene que codifica para uma proteína com funcionamento normal, ou cujo ácido nucleico tem ele mesmo função normal.

As moléculas de ácidos nucleicos proporcionadas podem ser marcadas de acordo com qualquer método conhecido na técnica, tal como com radiomarcadores, marcadores fluorescentes, marcadores enzimáticos, marcadores de sequência, etc. De acordo com outro aspeto da invenção, as moléculas de ácidos nucleicos contêm a transversão de C para A na base 4340. Tais moléculas podem ser utilizadas como sondas oligonucleotídicas específicas de alelo para rastrear uma mutação particular, por exemplo, através de uma família de sujeitos.

Amostras corporais podem ser testadas para determinar se o gene da CPSI contém a transversão de C para A na base 4340. Amostras corporais adequadas para teste incluem aquelas que compreendem ADN, ARN ou proteínas obtidas a partir de biópsias, incluindo biópsias de tecido hepático e intestinal; ou a partir do sangue, pré-natal; ou tecidos embrionários, por exemplo.

No presente documento proporcionam-se um par de iniciadores oligonucleotídicos isolados: 5'-AGCTGTTTGCCACGGAAGCC-3' (SEQ ID NO:6) e 5'-CCCAGCCTCTCTTCCATCAGAAAGTAAG-3' (SEQ ID NO:7). Estes iniciadores derivam do exão 36 da CPSI (a localização do polimorfismo da presente invenção) e de sequências intrónicas relacionadas (SEQ ID NO:5) e produzem um fragmento de 119 pares de bases. Proporcionam-se outros iniciadores derivados do exão 36 da CPSI (a localização do polimorfismo da presente invenção) e de sequências intrónicas relacionadas (SEQ ID N0:5) nas SEQ ID NOs:8-10, na Figura 10 e no Exemplo de Referência 2 (SEQ ID NOs:15 e 16) .

Os iniciadores oligonucleotidicos são úteis no diagnóstico de um sujeito em risco de hiperamoniemia tal como pode resultar como uma complicação ou toxicidade de BMT. Os iniciadores dirigem a amplificação de um polinucleótido alvo antes da sequenciação. Estes iniciadores oligonucleotidicos únicos do exão 36 da CPSI foram desenhados e produzidos com base na identificação da transversão de C para A no exão 36.

Adicionalmente, no presente documento, proporcionam-se oligonucleotidos específicos de alelo isolados. Proporcionam-se também sequências substancialmente semelhantes a eles. Os oligonucleótidos específicos de alelo são úteis no diagnóstico de um sujeito em risco de hiperamoniemia, tal como pode resultar como uma complicação ou toxicidade de BMT. Estes iniciadores oligonucleotidicos únicos do exão 36 da CPSI foram desenhados e produzidos com base na identificação da transversão de C para A no exão 36.

Os termos "substancialmente complementar a" ou "substancialmente a sequência de" referem-se a sequências que hibridizam com as sequências proporcionadas (por exemplo, SEQ ID NOs: 5-10) sob condições de restringência e/ou sequências com suficiente homologia com qualquer de SEQ ID NOs: 5-10, de tal forma que os oligonucleótidos específicos de alelo da invenção hibridizem com a sequência. O termo "isolado" conforme utilizado no presente documento inclui oligonucleótidos substancialmente livres de outros ácidos nucleicos, proteínas, lípidos, hidratos de carbono ou outros materiais com os quais possam estar associados, sendo tal associação tanto em material celular como num meio de síntese. Um "polinucleót ido alvo" ou "ácido nucleico alvo" refere-se à sequência de ácidos nucleicos de interesse, por exemplo, um polinucleótido codificador da CPSI. Outros iniciadores que podem ser utilizados para hibridização com iniciadores são prontamente determináveis para peritos na especialidade com base na divulqação, no presente documento, do polimorfismo da CPSI.

Os iniciadores descritos no presente documento abrangem oligonucleótidos de comprimento suficiente e sequência apropriada de forma a proporcionar a iniciação da polimerização num número significativo de ácidos nucleicos no locus polimórfico. 0 locus da CPSI está ilustrado esquematicamente na Figura 5. Especificamente, o termo "iniciador" conforme utilizado no presente documento refere-se a uma sequência que compreende dois ou mais desoxirribonucleótidos ou ribonucleótidos, preferivelmente mais de três, e mais preferivelmente mais de oito e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 20 nucleótidos do gene da CPSI em que a sequência de ADN contém a transversão de C para A na base 4340 relativa a CPSI contida em SEQ ID NO's:l e 3. O alelo que inclui a citosina (C) na base 4340 relativa à CPSI é referido doravante como o "alelo CPSIa", o "alelo T1405", ou o "alelo codificador da treonina". O alelo que inclui a adenosina (A) na base 4340 relativa à CPSI é referido doravante como o "alelo CPSIb", o "alelo N1405" ou o "alelo codificador da arginina".

Um oligonucleótido que distingue entre os alelos CPSIa e CPSIb do gene da CPSI, em que o dito oligonucleótido hibridiza com uma porção do dito gene da CPSI que inclui o nucleótido 4340 do ADNc que corresponde ao dito gene da CPSI quando o dito nucleótido 4340 é adenosina, mas que não hibridiza com a dita porção do dito gene da CPSI quando o dito nucleótido 4340 é citosina, também é proporcionado no presente documento. Um oligonucleótido que distingue entre os alelos CPSIa e CPSIb do gene da CPSI, em que o dito oligonucleót ido hibridiza com uma porção do dito gene da CPSI que inclui o nucleótido 4340 do ADNc que corresponde ao dito gene da CPSI quando o dito nucleótido 4340 é citosina, mas não hibridiza com a dita porção do dito gene da CPSI quando o dito nucleótido 4340 é adenosina também é proporcionado no presente documento. Tais oligonucleótidos têm, preferivelmente, entre dez e trinta bases de comprimento. Tais oligonucleótidos podem opcionalmente compreender adicionalmente um marcador detetável.

As condições ambientais que conduzem à síntese incluem a presença de nucleósido trifosfatos e um agente para a polimerização, tal como a ADN polimerase, e uma temperatura e pH adequados. O iniciador é preferivelmente de cadeia simples para máxima eficácia na amplificação, mas pode ser de cadeia dupla. Se for de cadeia dupla, o iniciador é inicialmente tratado para separar as suas cadeias antes de ser utilizado para preparar produtos de extensão. O iniciador deve ser suficientemente longo para iniciar a síntese dos produtos de extensão na presença de agentes indutores da polimerização. O comprimento exato do iniciador irá depender de vários fatores, incluindo a temperatura, tampão e composição nucleotídica. O iniciador oligonucleotídico contém tipicamente 12-20 ou mais nucleótidos, embora possa conter menos nucleótidos.

Os iniciadores descritos no presente documento estão desenhados para ser "substancialmente" complementares a cada cadeia do locus genómico a ser amplificado. Isto significa que os iniciadores devem ser suficientemente complementares para hibridizar com as suas respetivas cadeias sob condições que permitem que o agente de polimerização atue. Em outras palavras, os iniciadores devem ter complementaridade suficiente com as sequências 5' e 3' que flanqueiam a transversão para aí hibridizar e permitir a amplificação do locus genómico.

Os iniciadores oligonucleotidicos descritos no presente documento empregam-se no método de amplificação que é uma reação enzimática em cadeia que produz quantidades exponenciais de locus polimórfico relativo ao número de etapas de reação envolvidas. Tipicamente, um iniciador é complementar à cadeia negativa (-) do locus polimórfico e o outro é complementar à cadeia positiva (+). A hibridização dos iniciadores com um ácido nucleico desnaturado seguido da extensão com uma enzima, tal como o fragmento longo da ADN polimerase I (Klenow) e nucleótidos, resulta em cadeias + e - recém-sintetizadas que contêm a sequência do locus polimórfico alvo. Devido a que estas sequências recém-sintetizadas também são moldes, ciclos repetidos de desnaturação, hibridização de iniciadores e extensão resultam na produção exponencial da região (isto é, a sequência do locus polimórfico alvo) definida pelos iniciadores. 0 produto da reação em cadeia é um ácido nucleico duplex discreto com terminais correspondentes às extremidades dos iniciadores específicos empregados.

Os iniciadores oligonucleotídicos descritos no presente documento podem ser preparados utilizando qualquer método adequado, tal como os métodos de fosfotriéster e fosfodiéster convencionais ou formas de realização automatizadas dos mesmos. Numa tal forma de realização automatizada, utilizam-se dietilfosforamidites como materiais de iniciação e podem ser sintetizadas conforme descrito por Beaucage et al. , Tetrahedron Letters 22:1859-1862 (1981). Descreve-se um método para sintetizar oligonucleotidos num suporte sólido modificado no documento de patente U.S. N.° 4.458.066.

Qualquer espécime de ácido nucleico, na forma purificada ou não purificada, pode ser utilizado como ácido nucleico ou ácidos nucleicos de iniciação, desde que contenham, ou sejam suspeitos de conter, uma sequência de ácidos nucleicos que contenha o locus polimórfico.

Portanto, o método pode amplificar, por exemplo, ADN ou ARN, incluindo ARN mensageiro, em que o ADN ou o ARN podem ser de cadeia simples ou cadeia dupla. No caso de que o ARN seja utilizado como um molde, utilizar-se-iam enzimas e/ou condições ótimas para a transcrição reversa do molde a ADN. Para além disso, pode-se utilizar um híbrido ADN-ARN que contenha uma cadeia de cada. Pode empregar-se também uma mistura de ácidos nucleicos, ou os ácidos nucleicos produzidos numa anterior reação de amplificação no presente documento, utilizando os mesmos ou diferentes iniciadores pode ser utilizada da mesma forma. A sequência de ácidos nucleicos específica a ser amplificada, isto é, o locus polimórfico, pode ser uma fração de uma molécula maior ou pode estar presente inicialmente como uma molécula distinta, para que a sequência específica constitua o ácido nucleico total. Não é necessário que a sequência a ser amplificada esteja presente inicialmente numa forma pura; pode ser uma fração menor de uma mistura complexa, tal como contida no ADN humano completo. 0 ADN utilizado no presente documento pode ser extraído a partir de uma amostra corporal, tal como sangue, material tecidual, preferivelmente tecido hepático, e semelhantes, através de uma variedade de técnicas tais como as descritas por Maniatis et. al. em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., páginas 280-281 (1982) . Se a amostra extraída é impura, ela pode ser tratada antes da amplificação com uma quantidade de reagente eficaz para abrir as células ou membranas celulares animais da amostra, e para expor e/ou separar a(s) cadeia(s) do(s) ácido(s) nucleico(s). Esta etapa de lise e desnaturação dos ácidos nucleicos para expor e separar as cadeias permitirá que a amplificação ocorra muito mais prontamente.

Os desoxirribonucleótido-trifosfatos dATP, dCTP, dGTP e dTTP adicionam-se à mistura de síntese, tanto separadamente ou em conjunto com os iniciadores, em quantidades adequadas e a solução resultante aquece-se até cerca de 90-100 °C durante cerca de 1 a 10 minutos, preferivelmente durante 1 a 4 minutos. Após este período de aquecimento, deixa-se arrefecer a solução, o que é preferível para a hibridização dos iniciadores. A mistura arrefecida adiciona-se um agente apropriado para efetuar a reação de extensão dos iniciadores (chamado doravante "agente para polimerização"), e permite-se que ocorra a reação sob condições conhecidas na técnica. O agente para polimerização pode também ser adicionado em conjunto com os outros reagentes se for termoestável. Esta reação de síntese (ou amplificação) pode ocorrer à temperatura ambiente até a uma temperatura superior à qual o agente para polimerização já não funcione. Assim, por exemplo, se ADN polimerase for utilizada como o agente, a temperatura geralmente não é superior a 40 °C. Mais convenientemente a reação ocorre à temperatura ambiente. O agente para polimerização pode ser qualquer composto ou sistema que funcionará de forma a alcançar a síntese de produtos de extensão de iniciadores, incluindo enzimas. Enzimas adequadas para esta finalidade incluem, por exemplo, a ADN polimerase I de E. coli, o fragmento de Klenow da ADN polimerase de E. coli, muteínas da polimerase, transcriptase reversa, outras enzimas, incluindo enzimas termoestáveis (isto é, aquelas enzimas que realizam extensão de iniciadores após terem sido sujeitas a temperaturas suficientemente elevadas para causar desnaturação), tal como a Taq polimerase. Uma enzima conveniente facilitará a combinação dos nucleótidos da maneira apropriada para formar os produtos de extensão dos iniciadores que são complementares a cada cadeia de ácidos nucleicos do locus polimórfico. Geralmente, a síntese iniciar-se-á na extremidade 3' de cada iniciador e prosseguirá em direção 5' ao longo da cadeia molde, até que termine a síntese, produzindo moléculas de diferentes comprimentos. A cadeia recém-sintetizada e a sua cadeia de ácidos nucleicos complementar formará uma molécula de cadeia dupla sob condições de hibridização descritas acima e este híbrido é utilizado nas etapas posteriores do método. Na seguinte etapa, a molécula de cadeia dupla recém-sintetizada é sujeita a condições de desnaturação utilizando qualquer dos procedimentos descritos acima para proporcionar moléculas de cadeia simples.

As etapas de desnaturação, hibridização e síntese de produtos de extensão podem repetir-se tantas vezes como seja necessário para amplificar a sequência de ácidos nucleicos do locus polimórfico alvo na medida do necessário para deteção. A quantidade da sequência de ácidos nucleicos específica produzida acumular-se-á de uma forma exponencial. PCR. A Practical Approach, ILR Press, Eds. McPherson et al. (1992) .

Os produtos de amplificação podem ser detetados através de análise por transferência de Southern, utilizando ou não sondas radioativas. Num tal método, por exemplo, uma pequena amostra de ADN que contém um nível muito baixo da sequência de ácidos nucleicos do locus polimórfico é amplificada e analisada através de uma técnica de transferência de Southern ou de forma semelhante, utilizando análise por dot blot. A utilização de sondas ou marcadores não radioativos é facilitada pelo elevado nível do sinal amplificado. De forma alternativa, as sondas utilizadas para detetar os produtos amplificados podem ser marcados direta ou indiretamente, por exemplo, com um radioisótopo, um composto fluorescente, um composto bioluminescente, um composto quimioluminiscente, um quelante metálico ou uma enzima. Os peritos na especialidade conhecerão outros marcadores adequados para ligação à sonda, ou serão capazes de os determinar, utilizando experimentação de rotina.

As sequências amplificadas através dos métodos descritos no presente documento podem ser adicionalmente avaliadas, detetadas, clonadas, sequenciadas e semelhantes, tanto em solução ou após ligação a um suporte sólido, através de qualquer método normalmente aplicado para a deteção de uma sequência de ADN especifica, tal como a sequenciação didesoxi, a PCR, a restrição de oligómeros (Saiki et al., Bio/Technology3:1008-1012 (1985), análise de sondas de oligonucleótidos específicos de alelo (ASO) (Conner et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80:278 (1983), ensaios de ligação de oligonucleótidos (OLAs) (Landgren et. al., Science 241:1007, 1988), e semelhantes. Foram revistas técnicas moleculares para análise de ADN (Landgren et. al., Science 242:229-237, 1988) .

Preferivelmente, o método de amplificação é por PCR, conforme descrito no presente documento e nos documentos de patente U.S. N.°s 4.683.195; 4.683.202 e 4,965,188 cada um das quais é incorporado no presente documento como referência; e como é normalmente utilizado pelos peritos na especialidade. Descreveram-se métodos alternativos de amplificação e podem também ser empregues desde que o locus da CPSI amplificado por PCR utilizando iniciadores da invenção seja de forma semelhante amplificado pelos meios alternativos. Tais sistemas alternativos de amplificação incluem, mas não se limitam, à replicação de sequências autossustentada, que começa com uma sequência de ARN de interesse e um promotor T7. A transcriptase reversa copia o ARN em ADNc e degrada o ARN, seguido da polimerização pela transcriptase reversa de outra cadeia de ADN. Outra técnica de amplificação de ácidos nucleicos é a amplificação de ácidos nucleicos baseada em sequências (NASBA™) que utiliza a transcrição reversa e a polimerase de ARN T7 e incorpora dois iniciadores para direcionar o seu esquema de ciclização. A amplificação NASBA™ pode começar tanto com ADN como com ARN e terminar com um ou outro, e amplifica até cerca de 108 cópias no prazo de 60 a 90 minutos.

Alternativamente, um ácido nucleico pode ser amplificado por transcrição ativada por ligação (LAT). A LAT funciona desde um molde de cadeia simples com um único iniciador que é parcialmente de cadeia simples e parcialmente de cadeia dupla. A amplificação inicia-se ligando um ADNc ao oligonucleótido promotor e no prazo de algumas horas, a amplificação é cerca de 108 a cerca de 109 vezes maior. O sistema da replicase QB pode ser utilizado ligando uma sequência de ARN chamada MDV-1 a ARN complementar a uma sequência de ADN de interesse. Após a mistura com uma amostra, o ARN híbrido encontra o seu complementar entre os ARNm do espécime e liga-se ativando a replicase para copiar os marcadores ao longo da sequência de interesse.

Outra técnica de amplificação de ácidos nucleicos, a reação em cadeia da ligase (LCR), funciona utilizando duas metades marcadas de diferente forma de uma sequência de interesse que estão unidas covalentemente pela ligase na presença da sequência contígua numa amostra, formando um novo alvo. A técnica de amplificação de ácidos nucleicos por reação em cadeia de reparação (RCR) utiliza dois pares de sondas oligonucleotídicas específicas de alvo e complementares, a polimerase termoestável e a ligase, e nucleótidos de ADN para amplificar geometricamente as sequências alvo. Um intervalo de 2 bases separa os pares de sondas oligo, e a RCR preenche e une o intervalo, imitando a reparação normal do ADN. A amplificação de ácidos nucleicos por ativação de deslocamento de cadeia (SDA) utiliza um iniciador curto que contém um sítio de reconhecimento para Hindi com uma cadeia secundária curta no extremo 5' que se liga ao ADN alvo. Uma ADN polimerase preenche a parte do iniciador oposta à cadeia secundária com análogos de adenina que contêm enxofre. Hindi é adicionada mas só corta a cadeia de ADN não modificada. Uma ADN polimerase isenta de atividade de exonuclease 5' entra no sitio de corte e começa a polimerizar, deslocando a cadeia inicial de iniciador a jusante e construindo uma nova que serve como mais iniciador. A SDA produz uma amplificação de mais de cerca de 107 vezes maior no prazo de 2 horas a 37 °C. Ao contrário da PCR e da LCR, a SDA não requer uma ciclização instrumentada da temperatura. Outro sistema de amplificação útil no método da invenção é o Sistema da Replicase QB. Embora a PCR seja o método preferido de amplificação da invenção, estes outros métodos também podem ser utilizados para amplificar o locus CPSI como descrito no método da invenção. Como tal, o termo "técnica de amplificação" conforme utilizado no presente documento e nas reivindicações pretende abranger todos os métodos precedentes.

Adicionalmente descrito no presente documento está um método para diagnosticar ou identificar um sujeito que possui uma predisposição ou suscetibilidade mais elevada para (em risco de) hiperamoniemia, compreendendo sequenciar um ácido nucleico alvo de uma amostra a partir de um sujeito através de sequenciação didesoxi, preferivelmente após a amplificação do ácido nucleico alvo. É adicionalmente descrito no presente documento um método para diagnosticar um sujeito que possui uma predisposição ou suscetibilidade mais elevada para (em risco de) hiperamoniemia, compreendendo contactar um ácido nucleico alvo de uma amostra a partir de um sujeito com um reagente que deteta a presença do polimorfismo da CPSI e detetar o reagente.

Outro método compreende contactar um ácido nucleico alvo de uma amostra a partir de um sujeito com um reagente que deteta a presença da transversão de C para A na base 4340, isto é, dentro do exão 36, e detetar a transversão. Uma série de métodos de hibridização são bem conhecidos para os peritos na especialidade. Muitos deles são úteis na realização da invenção. A doença hepática veno-oclusiva (HVOD) é uma toxicidade comum nos transplantes de medula óssea (BMT). Ocorre em aproximadamente 20 a 40% dos pacientes e está associada com morbilidade grave e com mortalidade. A frequência de ambos alelos da CPSI foi testada num grupo HVOD e num não-HVOD a serem submetidos a BMT numa tentativa de identificar evidências de desequilíbrio. Os resultados indicaram que o polimorfismo da CPSI divulgado no presente documento efetua suscetibilidade a uma toxicidade por BMT. Portanto, divulga-se no presente documento um método de rastrear os sujeitos para a suscetibilidade à toxicidade por BMT, e particularmente à HVOD, através da deteção do polimorfismo da CPSI.

Os materiais para utilização no método divulgado no presente documento são idealmente apropriados para a preparação de um kit de diagnóstico. Tal kit pode compreender um meio portador sendo compartimentalizado para receber em confinamento um ou mais meios de contenção tais como frascos, tubos e semelhantes, cada um dos meios de contenção compreendendo um dos elementos separados a serem utilizados no método. Por exemplo, um dos meios de contenção pode compreender meios para amplificar ADN da CPSI, os meios compreendendo a(s) enzima(s) e os iniciadores oligonucleotídicos necessários para amplificar dito ADN alvo a partir do sujeito.

Os iniciadores oligonucleotídicos incluem iniciadores que tenham uma sequência selecionada a partir do grupo incluindo, mas não limitado a: SEQ ID NOs:6-10, ou sequências de iniciadores substancialmente complementares ou substancialmente homólogas às mesmas. O alvo que flanqueia a sequência polinucleotídica 5' e 3' tem substancialmente a sequência estabelecida na SEQ ID NO:5, e sequências substancialmente complementares ou substancialmente homólogas à mesma. Outros iniciadores oligonucleotidicos para amplificar a CPSI serão conhecidos ou prontamente determináveis para os peritos na especialidade dada a descrição apresentada no presente documento.

Um kit descrito no presente documento pode adicionalmente compreender um reagente ou reagentes para extrair uma amostra de ácido nucleico a partir de uma amostra biológica obtida a partir de um sujeito. Comtempla-se que quaisquer desses reagentes, como seria prontamente aparente para um perito na especialidade, caem no âmbito da presente invenção. A titulo de exemplo especifico, um tampão de lise apropriado para o tecido acompanhado de uma suspensão de esferas de vidro para captura da amostra de ácido nucleico e um tampão de eluição para eluir a amostra de ácido nucleico das esferas de vidro compreendem reagentes para extrair uma amostra de ácido nucleico a partir de uma amostra biológica obtida a partir de um sujeito.

Outros exemplos incluem disponíveis comercialmente, tais como o GENOMIC ISOLATION KIT A.S.A.P.™ (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.), Genomic DNA Isolation System (GIBCO BRL, Gaithersburg, Md.), ELU-QUIK™ DNA Purification Kit (Schleicher & Schuell, Keene, N.H.), DNA Extraction Kit (Stratagene, La Jolla, Calif.), TURBOGEN™ Isolation Kit (Invitrogen, San Diego, Calif.), e semelhantes. A utilização destes kits de acordo com as instruções do fabricante é geralmente aceitável para a purificação do ADN antes de praticar os métodos dos descritos no presente documento. C. Definições que Afetam o Polinucleótido Codificador da CPSI e Polipéptidos da CPSI Codificados pelo Mesmo

Proporcionam-se os polinucleótidos codificadores da CPSI purificados e isolados e os polipéptidos da CPSI codificados pelos mesmos. Um polinucleótido codificador da CPSI particularmente proporcionado compreende um polinucleótido codificador da CPSI que inclui uma transversão de C para A na base 4340, isto é, dentro do exão 36 do gene da CPSI que altera o código do tripleto de ACC para AAC e leva à alteração T1405N no polipéptido da CPSI codificado. Também se proporciona particularmente o polipéptido da CPSI codificado compreendendo a alteração T1405N. Portanto, proporcionam-se no presente documento os polinucleótidos das variantes alélicas e os polipéptidos codificados pelos mesmos. Adicionalmente, também se proporciona no presente documento um polipéptido da CPSI biologicamente ativo, tal como o é um polinucleótido codificador da CPSI que codifica um tal polipéptido da CPSI. Atividades biológicas exemplares incluem a atividade biológica de mediar a primeira etapa do ciclo da ureia e a atividade biológica da reação cruzada com um anticorpo anti-CPSI.

Os polinucleótidos e polipéptidos codificadores da CPSI proporcionados têm ampla utilidade dada a significância biológica do ciclo da ureia, tal como é conhecido na técnica. A titulo de exemplo, os polinucleótidos e os polipéptidos codificadores da CPSI são úteis na preparação de ensaios de rastreio e kits de ensaio que se utilizam para detetar a presença das proteínas e dos ácidos nucleicos desta invenção em amostras biológicas. Adicionalmente, é sabido que os polipéptidos isolados e purificados têm utilidade como aditivos de alimentação para gado e os polinucleótidos que codificam os polipéptidos são portanto úteis na produção dos polipéptidos.

Preferivelmente, os polinucleótidos e os polipéptidos da CPSI proporcionados isolam-se a partir de fontes de vertebrados e invertebrados. Portanto, proporcionam-se no presente documento homólogos da CPSI, incluindo, mas não limitados a, homólogos de bactérias, leveduras e mamíferos. Os membros de homólogos mamíferos da CPSI preferidos incluem, mas não estão limitados a, homólogos humanos e de ratos.

Os termos "produto génico da CPSI", "proteína da CPSI" e "polipéptido da CPSI" referem-se às proteínas que têm sequências de aminoácidos que são substancialmente idênticas às sequências de aminoácidos nativas na CPSI e que são biologicamente ativas na medida em que são capazes de mediar a síntese de carbamilo fosfato no ciclo da ureia, e de reação cruzada com anticorpos anti-CPSI produzidos contra um polipéptido da CPSI.

Os termos "produto génico da CPSI", "proteína da CPSI" e "polipéptido da CPSI" também incluem análogos de moléculas da CPSI que exibem pelo menos alguma atividade biológica em comum com os produtos génicos nativos da CPSI. Para além disso, os peritos na especialidade da mutagénese apreciarão que outros análogos, ainda por divulgar ou por descobrir, podem ser usados para construir análogos da CPSI. Não existe a necessidade de que um "produto génico da CPSI", "proteína da CPSI" ou "polipéptido da CPSI" compreenda toda, ou substancialmente toda a sequência de aminoácidos de um produto génico nativo da CPSI. Antecipa-se, no presente documento, que sequências mais curtas ou mais longas serão úteis. Portanto, o termo "produto génico da CPSI" também inclui polipéptidos e proteínas da CPSI de fusão ou recombinantes. Descrevem-se no presente documento métodos para preparação de tais proteínas.

Os termos "polinucleótido codificador da CPSI", "gene da CPSI", "sequência génica da CPSI" e "segmento génico da CPSI" referem-se a qualquer sequência de ADN que é substancialmente idêntica a uma sequência polinucleotídica que codifica um produto génico da CPSI, uma proteína da CSI ou um polipéptido da CPSI conforme descrito acima. Os termos também se referem ao ARN, ou sequências antisentido, compatíveis com tais sequências de ADN. Um "polinucleótido codificador da CPSI", "gene da CPSI", "sequência génica da CPSI" e "segmento génico da CPSI" também podem compreender qualquer combinação de sequências de controlo associadas. 0 termo "substancialmente idêntico", quando utilizado para definir tanto um produto génico da CPSI como uma sequência de aminoácidos da CPSI, ou um gene da CPSI ou sequência de ácidos nucleicos de CPSI, significa que uma sequência particular, por exemplo, uma sequência mutante, varia a partir da sequência de uma CPSI natural em uma ou mais deleções, substituições ou adições, sendo o efeito líquido das mesmas reter pelo menos alguma da atividade biológica da CPSI. Alternativamente, sequências análogas de ADN são "substancialmente idênticas" a sequências de ADN específicas divulgadas no presente documento se: (a) a sequência análoga de ADN deriva de regiões codificadoras do gene natural da CPSI; ou (b) a sequência análoga de ADN é capaz de hibridização de sequências de ADN de (a) sob condições de restringência moderadas e que codifiquem o produto biologicamente ativo da CPSI; ou (c) as sequências de ADN são degenerativas como resultado do código genético para as sequências análogas de ADN definidas em (a) e/ou (b) . Proteínas análogas substancialmente idênticas serão idênticas em mais de 60% à sequência correspondente da proteína nativa. Sequências com menos graus de semelhança mas atividade biológica comparável consideram-se equivalentes. Ao determinar sequências de ácidos nucleicos, todas as sequências de ácidos nucleicos capazes de codificar sequências de aminoácidos substancialmente semelhantes consideram-se substancialmente semelhantes a uma sequência de ácidos nucleicos de referência, independentemente das diferenças nas sequências de codões. C.l. Percentagem de Semelhança A percentagem de semelhança pode determinar-se, por exemplo, comparando a informação das sequências utilizando o programa de computador GAP, disponível a partir do Geneticist Computer Group da University of Wisconsin. 0 programa GAP utiliza o método de alinhamento de Needleman et al., J. Mol. Biol. 48:443 (1970), conforme revisto por Smith et al. , Adv. Appl. Math. 2:482 (1981) . Brevemente, o programa GAP define a semelhança como o número de símbolos alinhados (isto é, nucleótidos ou aminoácidos) que são semelhantes, divididos pelo número total de símbolos na sequência mais curta das duas. Os parâmetros predefinidos preferidos para o programa GAP incluem: (1) uma matriz de comparação unitária (contendo um valor de 1 para identidades e 0 para não identidades) de nucleótidos e a matriz de comparação ponderada de Gribskov et al., Nucl. Acids. Res. 14:6745 (1986), conforme descrito por Schwartz et al., eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 357-358 (1979); (2) uma penalidade de 3,0 para cada intervalo e uma penalidade adicional de 0,01 para cada símbolo e cada intervalo; e· (3) nenhuma penalidade para intervalos terminais. Descrevem-se outras técnicas de comparação nos Exemplos. O termo "homologia" descreve uma comparação baseada matematicamente de semelhanças de sequências que se utiliza para identificar genes ou proteínas com funções ou motivos semelhantes. Consequentemente, o termo "homologia" é sinónimo com o termo "semelhança" e "percentagem de semelhança" conforme definido acima. Portanto, as frases "homologia substancial" ou "semelhança substancial" têm significados semelhantes. C.2. Sequências de Ácidos Nucleicos É adicionalmente descrita no presente documento a utilização de genes e produtos génicos da CPSI que incluem nas suas respetivas sequências uma sequência que é essencialmente aquela de um gene CPSI, ou a proteína correspondente. O termo "uma sequência essencialmente como aquela de um gene da CPSI" significa que a sequência corresponde substancialmente a uma porção de um polipéptido da CPSI ou um polinucleót ido codificador da CPSI e tem relativamente poucas bases ou aminoácidos (sejam ADN ou proteína) que não são idênticos aos de uma proteína da CPSI ou um gene da CPSI (ou um equivalente biologicamente funcional dos mesmos, referindo-se a proteínas). 0 termo "equivalente biologicamente funcional" é bem compreendido na técnica e define-se adicionalmente em detalhe no presente documento. Consequentemente, as sequências que têm entre cerca de 70% e cerca de 80%; ou mais preferivelmente, entre cerca de 81% e cerca de 90%; ou ainda mais preferivelmente, entre cerca de 91% e cerca de 99% de aminoácidos que são idênticos ou funcionalmente equivalentes aos aminoácidos de uma proteína da CPSI ou um gene da CPSI, serão sequências que são "essencialmente as mesmas".

Também se descrevem produtos génicos da CPSI e genes da CPSI que têm codões funcionalmente equivalentes. O termo "codão funcionalmente equivalente" utiliza-se, no presente documento, para referir-se a codões que codificam o mesmo aminoácido, tais como os seis codões para a arginina ou a serina, e também para referir-se a codões que codificam aminoácidos biologicamente equivalentes (veja-se o Quadro D · QUADRO 1

Quadro do Código Genético

Aminoácidos_Codões

Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU

Cisteína Cys C UGC UGU

Ácido Aspártico Asp D GAC GAU

Ácido Glutâmico Glu E GAA GAG

Fenilalanina Phe F UUC UUU

Glicina Gly G GGA GGC GGG GGU

Histidina His H CAC CAU

Isoleucina He I AUA AUC AUU

Lisina Lys K AAA AAG

Leucina Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU

Metionina Met M AUG

Asparagina Asn N AAC AAU

Prolina Pro P CCA CCC CCG CCU

Glutamina Gin Q CAA CAG

Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU

Serina Ser S ACG AGU UCA UCC UCG UCU

Treonina Thr T ACA ACC ACG ACU

Valina Vai V GUA GUC GUG GUU

Triptofano Trp W UGG

Tirosina Tyr Y UAC UAU

Entende-se também que as sequências de aminoácidos e de ácidos nucleicos podem incluir resíduos adicionais, tais como aminoácidos de terminal N ou C adicionais ou sequências 5' ou 3' , e ainda assim ser essenciais conforme estabelecido numa das sequências divulgadas no presente documento, portanto, desde que a sequência cumpra os critérios estabelecidos acima, incluindo a manutenção da atividade proteica biológica no que respeita à expressão proteica. A adição de sequências terminais aplica-se particularmente às sequências de ácidos nucleicos que podem, por exemplo, incluir várias sequências não codificadoras que flanqueiam tanto as porções 5' como 3' da região codificadora ou podem incluir várias sequências internas, por exemplo, intrões, que se sabe que ocorrem dentro dos genes.

Descreve-se adicionalmente também a utilização de segmentos de ADN que são complementares, ou essencialmente complementares, com as sequências estabelecidas na memória descritiva. As sequências de ácidos nucleicos que são "complementares" são aquelas que têm emparelhamento de bases de acordo as regras de complementaridade padrão de

Watson e Crick. Conforme utilizado no presente documento, ο termo "sequências complementares" significa sequências de ácidos nucleicos que são substancialmente complementares, tal como pode ser avaliado pela mesma comparação nucleotidica estabelecida acima, ou conforme definido como sendo capazes de hibridizar com o segmento de ácidos nucleicos em questão sob condições relativamente restringentes tais como as descritas no presente documento. Um exemplo particular de um segmento de ácidos nucleicos complementar contemplado é um oligonucleótido antisentido. A hibridização de ácidos nucleicos será afetada por condições tais como concentração salina, temperatura ou solventes orgânicos, para além da composição base, comprimento das cadeias complementares, e o número de desemparelhamentos de bases nucleotidicas entre os ácidos nucleicos em hibridização, como será prontamente apreciado por parte dos peritos na especialidade. As condições de temperatura restringentes incluirão geralmente temperaturas por cima dos 30 °C, tipicamente por cima dos 37 °C e preferivelmente por cima dos 45 °C. As condições salinas restringentes serão vulgarmente menos de 1.000 mM, tipicamente menos de 500 mM, e preferivelmente menos de 200 mM. No entanto, a combinação de parâmetros é muito mais importante que a medida de qualquer parâmetro único, (veja-se, por exemplo, Wetmur & Davidson, J. Mol. Biol. 31:349-370 (1968)).

As sequências de sonda podem também hibridizar especificamente com ADN duplex sob determinadas condições para formar ADN triplex ou outros complexos de ADN de ordem mais elevada. A preparação de tais sondas e as condições de hibridização adequadas são bem conhecidas na técnica.

Conforme utilizado no presente documento, o termo "segmento de ADN" refere-se a uma molécula de ADN que foi isolada e libertada a partir de ADN genómico total de uma espécie particular. Adicionalmente, um segmento de ADN que codifica um polipéptido de CPSI refere-se a um segmento de ADN que contém sequências codificadores de CPSI, porém é afastado por isolamento ou libertado por purificação a partir do ADN genómico total de uma espécie de origem, tal como Homo sapiens. Incluído no termo "segmento de ADN" estão segmentos de ADN e fragmentos menores de tais segmentos, e também vetores recombinantes, incluindo, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, fagos, vírus e semelhantes.

De forma semelhante, um segmento de ADN que compreende um gene da CPSI isolado ou purificado refere-se a um segmento de ADN que inclui sequências codificadoras da CPSI isoladas substancialmente afastadas de outros genes ou sequências codificadoras de proteínas de ocorrência natural. A este respeito, o termo "gene" é utilizado por simplicidade para referir-se a uma proteína funcional, polipéptido ou unidade codificadora de péptidos. Como será entendido pelos peritos na especialidade, este termo funcional inclui tanto sequências genómicas como sequências de ADNc. "Isolado substancialmente afastado de outras sequências codificadoras" significa que o gene de interesse, neste caso, o gene da CPSI, forma a parte significativa da região codificadora do segmento de ADN, e que o segmento de ADN não contém grandes porções de ADN codificador de ocorrência natural, tais como fragmentos cromossómicos longos ou outros genes funcionais ou regiões codificadoras de ADNc. Claro que, isto se refere ao segmento de ADN conforme isolado originalmente, e não exclui genes ou regiões codificadoras adicionadas posteriormente ao segmento pela mão humana.

No presente documento descrevem-se adicionalmente segmentos de ADN isolados e vetores recombinantes incorporando sequências de ADN que codificam um polipéptido da CPSI que inclui na sua sequência de aminoácidos uma sequência de aminoácidos de qualquer de SEQ ID NOs:2,4,12 e 14. Descrevem-se adicionalmente no presente documento, a invenção refere-se a segmentos de ADN isolados e vetores de recombinação incorporando sequências de ADN que codificam uma proteína que inclui na sua sequência de aminoácidos a sequência de aminoácidos de um polipéptido da CPSI correspondente a tecidos humanos.

Entender-se-á também que a descrição não se limita às sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos particulares de SEQ ID NO's:1-4 e 11-14. Os vetores recombinantes e os segmentos de ADN isolados podem portanto incluir variadamente a própria região codificadora da CPSI, incluir regiões codificadoras que carregam alterações ou modificações selecionadas na região codificadora básica, ou incluir polipéptidos codificados mais longos que, não obstante, incluem regiões codificadoras de polipéptidos da CPSI ou podem codificar proteínas ou péptidos equivalentes biologicamente funcionais que têm sequências de aminoácidos variantes.

Descrevem-se adicionalmente no presente documento segmentos de ADN isolados e vetores recombinantes que codificam uma proteína ou péptido que inclui na sua sequência de aminoácidos uma sequência de aminoácidos essencialmente conforme estabelecido em qualquer de SEQ ID N0s:2, 4, 12 e 14. Naturalmente, onde o segmento de ADN ou vetor codifica um produto génico da CPSI de comprimento completo, a sequência de ácidos nucleicos mais preferida é aquela que é essencialmente conforme estabelecido em qualquer de SEQ ID NOs: 1, 3, 11 e 13 e que codifica uma proteína que exibe atividade no ciclo da ureia, conforme pode ser determinado, por exemplo, através de ensaios colorimétricos para detetar a produção de carbonilo fosfato a partir da amónia, conforme divulgado no presente documento no Exemplo 1. 0 termo "uma sequência essencialmente conforme estabelecido em qualquer das SEQ ID N0:2, 4, 12 e 14" significa que a sequência corresponde substancialmente a uma porção de uma sequência de aminoácidos das SEQ ID N0s:2, 4, 12 ou 14 e tem relativamente poucos aminoácidos que não são idênticos a, ou um equivalente biologicamente funcional dos aminoácidos de uma sequência de aminoácidos de qualquer de SEQ ID N0s:2, 4, 12 e 14. 0 termo "equivalente biologicamente funcional" é bem conhecido na técnica e define-se adicionalmente com detalhe no presente documento. Consequentemente, as sequências, que tenham entre cerca de 70% e cerca de 80%; ou mais preferivelmente, entre cerca de 81% e cerca de 90%; ou ainda mais preferivelmente, entre cerca de 91% e cerca de 99% de aminoácidos que são idênticos ou funcionalmente equivalentes aos aminoácidos em quaisquer das SEQ ID NOs: 2, 4, 12 e 14, serão sequências que são "uma sequência essencialmente conforme estabelecido nas SEQ ID NOs:2, 4, 12 e 14".

Descrevem-se adicionalmente no presente documento métodos de terapia génica que utilizam segmentos de ADN isolados e vetores recombinantes incorporando sequências de ADN que codificam uma proteína que inclui na sua sequência de aminoácidos uma sequência de aminoácidos de qualquer das SEQ ID NOs:2, 4, 12 e 14, SEQ ID NOs:2, 4, 12 e 14 incluindo sequências que derivam de tecido humano. Descrevem-se adicionalmente no presente documento sequências de ADN isoladas e vetores de ADN recombinantes que incorporam sequências de ADN que codificam uma proteína que inclui na sua sequência de aminoácidos a sequência de aminoácidos da proteína da CPSI a partir de tecido hepático humano.

Descrevem-se adicionalmente no presente documento sequências de ADN isoladas e vetores recombinantes que incluem na sua sequência uma sequência de ácidos nucleicos essencialmente conforme estabelecido em qualquer das SEQ ID NO:l, 3, 11 e 13. O termo "uma sequência essencialmente conforme estabelecido em qualquer das SEQ ID NO:l, 3, 11 e 13" utiliza-se no mesmo sentido conforme descrito acima e significa que a sequência de ácidos nucleicos corresponde substancialmente a uma porção de qualquer das SEQ ID NOs:l, 3, 11 e 13, respetivamente, e tem relativamente poucos codões que não são idênticos, ou funcionalmente equivalentes aos codões de qualquer das SEQ ID NOs:l, 3, 11 e 13, respetivamente. Uma vez mais, os segmentos de ADN que codificam produtos génicos exibindo atividade no ciclo da ureia, reatividade cruzada com um anticorpo anti-CPSI, ou outra atividade biológica do produto génico da CPSI serão os mais preferidos. 0 termo "codão funcionalmente equivalente" utiliza-se no presente documento para referir-se a codões que codificam o mesmo aminoácido, tais como os seis codões para a arginina ou serina, e também para referir-se a codões que codificam aminoácidos biologicamente equivalentes (veja-se o Quadro 1).

Os ácidos nucleicos descritos no presente documento, independentemente do comprimento da sequência codificadora em si, podem ser combinados com outras sequências de ADN, tais como promotores, potenciadores, sinais de poliadenilação, sítios de enzimas de restrição adicionais, sítios de clonagem múltipla, outros segmentos codificadores, e semelhantes, de tal forma que o seu comprimento global pode variar consideravelmente. Contempla-se portanto que um fragmento de ácido nucleico de quase qualquer comprimento possa empregar-se, com o comprimento total estando preferivelmente limitado pela facilidade de preparação e utilização no protocolo de ADN recombinante pretendido. Por exemplo, podem preparar-se fragmentos de ácidos nucleicos que incluam um fragmento curto complementar a uma sequência de ácidos nucleicos estabelecida em qualquer de SEQ ID NOs:l, 3, 11 e 13 respetivamente, tal como cerca de 10 nucleótidos, e que têm até 10.000 ou 5.000 pares de bases de comprimento, sendo preferíveis segmentos de 3.000 em certos casos. Também se contemplam segmentos de ADN com comprimentos totais de cerca de 1.000, 500, 200, 100 e cerca de 50 pares de bases de comprimento como sendo úteis.

Os segmentos de ADN descritos no presente documento abrangem proteínas e péptidos da CPSI equivalentes biologicamente funcionais. Tais sequências podem surgir como consequência da redundância de codões e equivalência funcional que se sabe que ocorrem naturalmente nas sequências de ácidos nucleicos e nas proteínas assim codificadas. Alternativamente, podem criar-se proteínas ou péptidos funcionalmente equivalentes através da aplicação da tecnologia do ADN recombinante, na qual alterações na estrutura proteica podem ser manipuladas, com base nas considerações das propriedades dos aminoácidos a serem trocados, por exemplo, a substituição de Ile e Leu nos aminoácidos 4 e 5 nas SEQ ID NOs :11-14. As alterações concebidas pelo Homem podem ser introduzidas através da aplicação de técnicas de mutagénese sítio-dirigida, por exemplo para introduzir melhorias na antigenicidade da proteína ou para testar mutantes da CPSI de forma a examinar a atividade no ciclo da ureia, ou outra atividade a nível molecular.

Se desejado, pode-se também preparar proteínas e péptidos de fusão, por exemplo, onde a região codificadora CPSI está alinhada dentro da mesma unidade de expressão com outras proteínas ou péptidos tendo funções desejadas, tais como para efeitos de purificação ou imunodeteção (por exemplo, proteínas que podem ser purificadas por cromatografia de afinidade e regiões de codificação de marcadores de enzimas, respetivamente).

Os vetores recombinantes formam importantes aspetos adicionais descritos no presente documento. Contempla-se que vetores particularmente úteis são aqueles vetores nos quais a porção codificadora do segmento de ADN está posicionada sob o controlo de um promotor. O promotor pode estar na forma do promotor que está naturalmente associada com o gene da CPSI, por exemplo em tecidos de mamíferos, tal como pode ser obtido através do isolamento das sequências não codificadoras 5' situadas a montante do segmento ou exão codificador, por exemplo, utilizando clonagem recombinante e/ou tecnologia de PCR, juntamente com as composições descritas no presente documento.

Noutras formas de realização, contempla-se que se ganharão certas vantagens posicionando o segmento codificador do ADN sob o controlo de um promotor recombinante ou heterólogo. Conforme utilizado no presente documento, um promotor recombinante ou heterólogo destina-se a referir-se a um promotor que normalmente não está associado com um gene da CPSI no seu ambiente natural. Tais promotores podem incluir promotores isolados a partir de células de bactérias, vírus, eucarióticas, ou de mamíferos. Naturalmente será importante empregar um promotor que dirija eficazmente a expressão do segmento de ADN no tipo celular eleito para a expressão. A utilização de combinações de promotores e tipos celulares para a expressão proteica é geralmente conhecida pelos peritos na especialidade da biologia molecular, por exemplo, veja-se Sambrook et al., 1989, incorporado no presente documento como referência. Os promotores empregues podem ser constitutivos ou induzíveis, e podem ser utilizados sob as condições adequadas para dirigir a expressão a alto nível do segmento de ADN introduzido, tal como é vantajoso na produção a grande escala de proteínas ou péptidos recombinantes. Sistemas de promotores adequados proporcionados para utilização na expressão de alto nível incluem, mas não estão limitados, ao promotor do vírus vaccinia e ao promotor do baculovírus.

Alternativamente, descreve-se no presente documento um vetor de expressão compreendendo um polinucleótido que codifica um polipéptido da CPSI tendo atividade no ciclo da ureia, reatividade cruzada com um anticorpo anti-CPSI, ou outra atividade biológica de acordo com a presente descrição. Também preferivelmente, um vetor de expressão descrito no presente documento compreende um polinucleótido que codifica um produto génico da CPSI humana. Mais preferivelmente, um vetor de expressão descrito no presente documento compreende um polinucleótido que codifica um polipéptido compreendendo uma sequência de resíduos de aminoácidos de qualquer de SEQ ID N0s:2, 4, 12 e 14. Mais preferivelmente, um vetor de expressão descrito no presente documento compreende um polinucleótido compreendendo a sequência de bases nucleotídicas de qualquer das SEQ ID NO:1, 3, 11 e 13.

Ainda mais preferivelmente, um vetor de expressão descrito no presente documento compreende um polinucleótido ligado operativamente a um potenciador-promotor. Mais preferivelmente ainda, um vetor de expressão descrito no presente documento compreende um polinucleótido ligado operativamente a um promotor procariótico. Alternativamente, um vetor de expressão descrito na invenção do presente documento compreende um polinucleótido ligado operativamente a um potenciador-promotor que é um promotor eucariótico, e o vetor de expressão compreende adicionalmente um sinal de poliadenilação que está posicionado a 3' do aminoácido do terminal carboxi e numa unidade de transcrição do polipéptido codificado.

Ainda noutra forma de realização, descrita no presente documento proporciona-se uma célula hospedeira recombinante transfectada com um polinucleótido, que codifica um polipéptido da CPSI tendo atividade na modulação do ciclo da ureia, reatividade cruzada com um anticorpo anti-CPSI, ou outra atividade biológica de acordo com a presente invenção. As SEQ ID NO's: 1-4 e 11-14 estabelecem sequências de nucleótidos e aminoácidos a partir de um vertebrado exemplar, o ser humano. Também se descrevem no presente documento polinucleótidos e polipéptidos da CPSI homólogos ou biologicamente equivalentes encontrados noutros vertebrados, incluindo o rato. Também são proporcionados pela presente invenção polinucleótidos e polipéptidos da CPSI homólogos ou biologicamente equivalentes encontrados em invertebrados, incluindo bactérias e leveduras.

Preferivelmente, uma célula hospedeira recombinante descrita no presente documento é transfectada com o polinucleótido que codifica o polipéptido da CPSI humana. Mais preferivelmente, uma célula hospedeira recombinante descrita na invenção do presente documento é transfectada com a sequência polinucleótídica de qualquer de SEQ ID NOs:l, 3. 11 e 13. Ainda mais preferivelmente, uma célula hospedeira recombinante descrita no presente documento é uma célula hospedeira eucariótica. Mais preferivelmente ainda, uma célula hospedeira recombinante descrita no presente documento é uma célula de vertebrado. Preferivelmente, uma célula hospedeira recombinante descrita no presente documento é uma célula de mamífero.

Noutro aspeto, uma célula hospedeira recombinante descrita no presente documento é uma célula hospedeira procariótica. Preferivelmente, uma célula hospedeira recombinante descrita no presente documento é uma célula bacteriana, preferivelmente uma estirpe de Escherichia coli. Mais preferivelmente, uma célula hospedeira recombinante compreende um polinucleótido sob o controlo transcripcional de sinais de regulação funcionais na célula hospedeira recombinante, em que os sinais de regulação controlam adequadamente a expressão do polipéptido da CPSI de forma a habilitar todas as modificações transcricionais e pós-transcricionais necessárias.

Descreve-se adicionalmente no presente documento um método de preparação de um polipéptido da CPSI compreendendo transfectar uma célula com polinucleótido que codifica um polipéptido da CPSI tendo atividade no ciclo da ureia, reação cruzada com um anticorpo anti-CPSI ou outra atividade biológica de acordo com a presente invenção, para produzir uma célula hospedeira transformada; e mantendo a célula hospedeira transformada sob condições biológicas suficientes para a expressão do polipéptido. Mais preferivelmente, a célula hospedeira transformada é uma célula eucariótica. Ainda mais preferivelmente, a célula eucariótica é uma célula de vertebrado. Alternativamente, a célula hospedeira é uma célula procariótica. Mais preferivelmente, a célula procariótica é uma célula bacteriana de Escherichia coli. Ainda mais preferivelmente, um polinucleótido transfectado na célula transformada compreende uma sequência de bases nucleotidicas de qualquer de SEQ ID NOs: 1, 3, 11 e 13. As SEQ ID N0's:l-4 e 11-14 estabelecem sequências de nucleótidos e aminoácidos para um vertebrado exemplar, o ser humano. Também se descrevem no presente documento polinucleótidos e polipéptidos da CPSI homólogos ou biologicamente equivalentes encontrados noutros vertebrados, particularmente vertebrados de sangue quente, e mais particularmente o rato. Também se descrevem no presente documento polinucleótidos e polipéptidos da CPSI homólogos ou biologicamente equivalentes encontrados em invertebrados, incluindo bactérias e leveduras.

Conforme mencionado acima, em conexão com formas de realização de expressão para preparar proteínas e péptidos da CPSI recombinantes, contempla-se que segmentos de ADN mais longos serão usados mais frequentemente, sendo os segmentos de ADN que codificam a proteína da CPSI inteira, os seus domínios funcionais ou produtos de clivagem dos mesmos, os mais preferidos. No entanto, apreciar-se-á que a utilização de segmentos de ADN mais curtos para dirigir a expressão dos péptidos da CPSI ou regiões nucleares epitópicas, tal como podem ser utilizados para gerar anticorpos anti-CPSI, também entra no âmbito da invenção.

Contempla-se que os segmentos de ADN que codificam antigénios peptídicos de cerca de 15 até cerca de 50 aminoácidos de comprimento, ou mais preferivelmente, de cerca de 15 até cerca de 30 aminoácidos de comprimento sejam particularmente úteis. Os segmentos de ADN que codificam péptidos terão geralmente um comprimento mínimo de codificação na ordem de cerca de 45 até cerca de 150, ou até cerca de 90 nucleótidos. Os segmentos de ADN que codificam proteínas de comprimento completo podem ter um comprimento mínimo de codificação na ordem de cerca de 4.500 até cerca de 4.600 nucleótidos para uma proteína de acordo com qualquer das SEQ ID NOs: 2, 4, 12 e 14.

Naturalmente, descrevem-se no presente documento segmentos de ADN que são complementares, ou essencialmente complementares, às sequências estabelecidas em qualquer de SEQ ID NO's: 1, 3, 11 e 13. Os termos "complementar" e "essencialmente complementar" definem-se acima. Com exceção de regiões intrónicas ou flanqueadoras, das quais se divulgam graficamente detalhes na Fig. 9, e permitindo a degeneração do código genético, sequências que têm entre cerca de 70% e cerca de 80%; ou mais preferivelmente, entre cerca de 81% e cerca de 90%; ou ainda mais preferivelmente, entre cerca de 91% e cerca e 99% de nucleótidos que são idênticos ou funcionalmente equivalentes (isto é, que codificam o mesmo aminoácido) de nucleótidos em qualquer de SEQ ID NOs:l, 3, 11 e 13 serão sequências que são "uma sequência essencialmente conforme estabelecido em qualquer de SEQ ID NOs:l, 3, 11 e 13". As sequências que são essencialmente as mesmas que aquelas estabelecidas em qualquer de SEQ ID NOs:l, 3,11 e 13 podem também ser funcionalmente definidas como sequências que são capazes de hibridizar com um segmento de ácidos nucleicos contendo o complemento em qualquer das SEQ ID NOs:l, 3, 11 e 13 sob condições relativamente restringentes. Condições de hibridação relativamente restringentes adequadas descrevem- se no presente documento e serão bem conhecidas por parte dos peritos na especialidade. C.3. Equivalentes Biologicamente Funcionais

Conforme mencionado acima, podem efetuar-se modificações e alterações na estrutura das proteínas e dos péptidos da CPSI descritos no presente documento e ainda assim obter uma molécula tendo características semelhantes ou de outro modo desejáveis. Por exemplo, certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos numa estrutura proteica sem perda apreciável de capacidade interativa com estruturas como, por exemplo, no núcleo de uma célula. Uma vez que é a capacidade interativa e a natureza de uma proteína o que define a atividade funcional biológica dessa proteína, podem ser efetuadas certas substituições de sequências de aminoácidos numa sequência proteica (ou, claro, na sua sequência codificadora de ADN subjacente) e não obstante obter uma proteína com propriedades semelhantes ou inclusivamente compensatórias (por exemplo, antagonistas contra agonistas) . Os requerentes contemplam portanto que se efetuem várias alterações na sequência das proteínas e péptidos da CPSI (ou no ADN subjacente) sem perda apreciável da sua utilidade ou atividade biológicas.

Também é bem compreendido pelo perito na especialidade que, inerente na definição de uma proteína ou péptido equivalentes biologicamente funcionais, está o conceito de que existe um limite do número de alterações que podem ser realizadas dentro de uma porção definida da molécula e ainda resultar numa molécula com um nível aceitável de atividade biológica equivalente. Os péptidos equivalentes biologicamente funcionais definem-se portanto no presente documento como aqueles péptidos nos quais certos aminoácidos, não a maioria ou todos, podem ser substituídos. Claro que, pode-se efetuar e utilizar uma pluralidade de diferentes proteínas/péptidos com diferentes substituições de acordo com a descrição do presente documento.

Entende-se também que onde se demostra que certos resíduos são particularmente importantes para as propriedades biológicas ou estruturais de uma proteína ou péptido, por exemplo, resíduos em sítios ativos, tais resíduos podem geralmente não ser substituídos. Este é o caso conforme divulgado no presente documento, onde quaisquer alterações por exemplo, nos domínios de fosforilação de um polipéptido da CPSI, poderiam resultar numa perda de um aspeto da utilidade do péptido resultante para a presente invenção.

As substituições de aminoácidos, tais como aquelas que possam ser empregues na modificação das proteínas e péptidos da CPSI descritas no presente documento, baseiam-se, geralmente, na semelhança relativa dos substituintes da cadeia lateral de aminoácidos, por exemplo, a sua hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho, e semelhantes. Uma análise do tamanho, forma e tipo dos substituintes da cadeia lateral de aminoácidos revela que a arginina, a lisina e a histidina são todos resíduos com carga positiva; que a alanina, a glicina e a serina têm todas um tamanho semelhante; e que a fenilalanina, o triptofano e a tirosina têm todos uma forma geralmente semelhante. Portanto, com base nestas considerações, a arginina, a lisina e a histidina; a alanina, a glicina e a serina; a fenilalanina, o triptofano e a tirosina definem-se no presente documento como equivalentes biologicamente funcionais.

Ao efetuar tais alterações, pode considerar-se o índice hidropático dos aminoácidos. Atribuiu-se a cada aminoácido um índice hidropático com base nas suas características de carga e de hidrofobicidade, estes são: isoleucina (+ 4,5); valina (+ 4,2); leucina (+ 3,8); fenilalanina (+ 2,8); cisteína/cistina (+ 2,5); metionina (+ 1,9); alanina (+ 1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); e arginina (-4,5).

Compreende-se geralmente na técnica a importância do índice hidropático dos aminoácidos ao conferir função biológica interativa a uma proteína (Kyte e Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982), incorporado no presente documento como referência). Sabe-se que certos aminoácidos podem ser substituídos por outros aminoácidos que tenham um índice ou pontuação hidropática semelhante e ainda assim reter uma atividade biológica semelhante. Ao realizar alterações baseadas no índice hidropático, prefere-se a substituição dos aminoácidos cujos índices hidropáticos estejam a 2 pontos do valor original, preferem-se particularmente aqueles que estejam a 1 ponto do valor original, e preferem-se ainda mais particularmente aqueles que estejam a 0,5 pontos do valor original.

Compreende-se também na técnica que a substituição de aminoácidos semelhantes pode realizar-se eficazmente com base na hidrofilicidade. O documento de patente U.S. N.° 4.554.101, incorporado no presente documento como referência, afirma que a maior hidrofilicidade média local de uma proteína, conforme governada pela hidrofilicidade dos seus aminoácidos adjacentes, correlaciona-se com a sua imunogenicidade e antigenicidade, isto é, com uma propriedade biológica da proteína. Compreende-se que um aminoácido pode ser substituído por outro que tenha um valor de hidrofilicidade semelhante e ainda assim obter uma proteína biologicamente equivalente.

Conforme detalhado no documento de patente U.S. N.° 4.554.101, atribuíram-se aos resíduos de aminoácidos os seguintes valores de hidrofilicidade: arginina (+ 3,0); lisina (+ 3,0); aspartato (+ 3,0±1); glutamato (+ 3,0±1); serina (+ 0,3); asparagina (+ 0,2); glutamina (+ 0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5+1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteina (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4).

Ao efetuar alterações baseadas em valores de hidrofilicidade semelhantes, prefere-se a substituição se aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estejam a 2 pontos do valor original, preferem-se particularmente aqueles que estejam a 1 ponto do valor original, e preferem-se anda mais particularmente aqueles que estejam a 0,5 pontos do valor original.

Embora a discussão se tenha focalizado em polipéptidos funcionalmente equivalentes surgindo a partir de alterações nos aminoácidos, apreciar-se-á que tais alterações possam ser efetuadas a partir da alteração do ADN codificante, tendo também em consideração que o código genético está degenerado e que dois ou mais codões podem codificar para o mesmo aminoácido. C.4. Técnicas de Modificação de Sequências

As modificações para as proteínas e péptidos da CPSI descritas no presente documento podem ser realizadas utilizando técnicas tais como mutagénese sitio-dirigida. A mutagénese sítio-específica é uma técnica útil na preparação de péptidos individuais, ou proteínas ou péptidos equivalentes biologicamente funcionais, através da mutagénese específica do ADN subjacente. A técnica proporciona adicionalmente uma pronta habilidade para preparar e testar variantes da sequência, por exemplo, incorporando uma ou mais das considerações precedentes, através da introdução de uma ou mais alterações da sequência de nucleótidos no ADN. A mutagénese sítio-específica permite a produção de mutantes através da utilização de sequências oligonucleotídicas específicas que codificam a sequência de ADN da mutação desejada, assim como um número suficiente de nucleótidos adjacentes, para proporcionar uma sequência de iniciadores de tamanho e complexidade de sequência suficiente para formar um duplex estável em ambos lados da junção da deleção a ser transversada. Tipicamente, prefere-se um iniciador de cerca de 17 a 30 nucleótidos de comprimento, sendo alterados cerca de 5 a 10 resíduos em ambos lados da junção da sequência.

Em geral, é conhecida na técnica a técnica da mutagénese sítio-específica conforme exemplificado por publicações (por exemplo, Adelman et al., 1983) . Como se apreciará, a técnica emprega tipicamente um vetor de fago que existe tanto numa forma de cadeia simples como de cadeia dupla. Os vetores típicos úteis na mutagénese sítio-dirigida incluem vetores tais como o fago M13 (Messing et al., 1981) . Estes fagos estão prontamente disponíveis comercialmente e a sua utilização é geralmente bem conhecida para os peritos na especialidade. Empregam-se também rotineiramente plasmídeos de cadeia dupla na mutagénese sítio-dirigida, o que elimina a etapa de transferência do gene de interesse de um plasmídeo para um fago.

Geralmente, a mutagénese sítio-dirigida de acordo com o presente documento realiza-se primeiro obtendo um vetor de cadeia simples ou desnaturando e separando as duas cadeias simples de um vetor de cadeia dupla que inclui na sua sequência uma sequência de ADN que codifica, por exemplo, um polipéptido da CPSI humana. Prepara-se um iniciador oligonucleotídico que carrega a sequência mutada desejada, geralmente sinteticamente, por exemplo através do método de Crea et al. (1978) . Este iniciador é então hibridizado com o vetor de cadeia simples, e submetido a enzimas de polimerização do ADN, tais como o fragmento de Klenow da polimerase I de E.coli, de forma a completar a síntese da cadeia portadora da mutação. Assim, forma-se um heteroduplex em que uma cadeia codifica a sequência original não mutada e a segunda cadeia carrega a mutação desejada. Este vetor heteroduplex utiliza-se então para transformar células adequadas, tais como células de E. coli, e selecionam-se clones que incluam vetores recombinantes portadores da disposição da sequência mutada.

Proporciona-se a preparação de variantes da sequência do gene mutado utilizando a mutagénese sítio-dirigida como um meio de produzir polipéptidos da CPSI potencialmente úteis ou outras espécies tendo atividade no ciclo da ureia e não pretende ser limitante já que existem outras formas com as quais se podem obter variantes de sequência destes péptidos. Por exemplo, podem tratar-se vetores recombinantes que codificam os genes desejados com agentes mutagénicos para obter variantes das sequências (veja-se, por exemplo, um método descrito por Eichenlaub, 1979) para a mutagénese de ADN de plasmídeos utilizando hidroxilamina. C. 5. Outros Equivalentes Estruturais

Para além da adição aos compostos de peptidilo da CPSI descritos no presente documento, os inventores também contemplam que outros compostos estericamente semelhantes possam ser formulados para imitar as porções fundamentais da estrutura peptídica. Tais compostos podem ser utilizados da mesma forma que os péptidos da invenção e consequentemente são também equivalentes funcionais. A geração de um equivalente funcional estrutural pode conseguir-se através das técnicas de modelação e desenho químico conhecidas pelos peritos na especialidade. D. Introdução de Produtos Génicos

Onde o gene em si se emprega para introduzir os produtos génicos, um método conveniente de introdução será através da utilização de um vetor recombinante que incorpora o gene desejado, em conjunto com as suas sequências de controlo associadas. A preparação de vetores de recombinação é bem conhecida pelos peritos na especialidade e descreve-se em várias referências, tais como, por exemplo, Sambrook et al. (1989), incorporadas especificamente no presente documento como referência.

Em vetores, compreende-se que as sequências codificadoras de ADN, neste caso aquelas que codificam produtos génicos da CPSI, posicionam-se adjacentemente a, e sob o controlo de um promotor. Compreende-se na técnica que para colocar uma sequência codificadora sob o controlo de um tal promotor, posiciona-se geralmente a extremidade 5' do sitio de iniciação da transcrição do quadro de leitura transcripcional do produto génico a ser expresso entre cerca de 1 até cerca de 50 nucleótidos "a jusante" (isto é, a 3') do promotor selecionado. Pode-se também desejar incorporar um sitio de poliadenilação apropriado na unidade transcripcional do vetor (por exemplo, 5'-AATAAA-3'), se não existia nenhum contido no ADN inserido original. Tipicamente, estes sítios de adição de poli A colocam-se a cerca de 30 a 2000 nucleótidos "a jusante" da sequência codificadora numa posição anterior à terminação da transcrição.

Embora se prefira a utilização das sequências de controlo do gene específico (isto é, um promotor de CPSI para um gene da CPSI), não há razão pela qual não se possam empregar outras sequências de controlo, desde que sejam compatíveis com o genótipo da célula a ser tratada. Deste modo, podem-se mencionar outros promotores úteis por meio de exemplo, incluindo, por exemplo, um promotor precoce SV40, um promotor de repetição terminal longa de retrovirus, um promotor de actina, um promotor de choque térmico, um promotor de metalotioneína e semelhantes.

Tal como se conhece na técnica, um promotor é uma região de uma molécula de ADN tipicamente de cerca de 100 pares de nucleótidos à frente (a montante) do ponto no qual começa a transcrição (isto é, um sítio de início da transcrição). Essa região contém tipicamente vários tipos de elementos de sequências de ADN que estão situados em posições relativas semelhantes em genes diferentes. Conforme utilizado no presente documento, o termo "promotor" inclui o que se refere na técnica como uma região promotora a montante, uma região promotora ou um promotor de uma unidade de transcrição de uma ARN polimerase II eucariótica generalizada.

Outro tipo de elemento de sequência regulador da transcrição distinto é um potenciador. Um potenciador proporciona especificidade de tempo, localização e nível de expressão para uma região codificadora particular (por exemplo, gene). Uma função principal de um potenciador é o aumento do nível de transcrição de uma sequência codificadora numa célula que contém um ou mais fatores de transcrição que se ligam àquele potenciador. Ao contrário de um promotor, um potenciador pode funcionar quando situado a distâncias variáveis a partir dos sítios de iniciação da transcrição desde que um promotor esteja presente.

Conforme utilizado no presente documento, a frase "potenciador-promotor" significa uma unidade composta que contém elementos tanto de potenciador como de promotor. Um potenciador-promotor está operativamente ligado a uma sequência codificadora que codifica pelo menos um produto génico. Conforme utilizado no presente documento, a frase "operativamente ligado" significa que um potenciador-promotor está ligado a uma sequência codificadora de tal forma que a transcrição dessa sequência codificadora é controlada e regulada por esse potenciador-promotor. Conhecem-se na técnica os meios para ligar operativamente um potenciador-promotor a uma sequência codificadora. Como também é bastante bem conhecido na técnica, a orientação e localização precisas relativas a uma sequência codificadora cuja transcrição é controlada, depende inter alia da natureza específica do potenciador-promotor. Portanto, um promotor mínimo de caixa TATA situa-se tipicamente desde cerca de 25 a cerca de 30 pares de bases a montante de um sítio de iniciação da transcrição e um elemento de promotor a montante está tipicamente localizado desde cerca de 100 até cerca de 200 pares de bases a montante do sítio de iniciação da transcrição. Em contraste, um potenciador pode estar situado a jusante do sítio de iniciação e pode estar a uma distância considerável desse sítio.

Um iniciador-promotor utilizado numa construção de vetor conforme descrita no presente documento pode ser qualquer potenciador-promotor que dirija a expressão numa célula a ser transfetada. Ao empregar um potenciador-promotor com propriedades bem conhecidas, pode-se otimizar o nível e o padrão da expressão de produtos génicos.

Para a introdução, por exemplo, do gene da CPSI humana incluindo as suas variações alélicas, propõe-se que se desejará preferivelmente empregar uma construção de vetor que transmita o gene desejado às células afetadas. Isto requererá, claro, que a construção seja transmitida às células alvo, por exemplo, células hepáticas de mamíferos. Propõe-se que isto seja conseguido mais preferivelmente através da introdução do gene desejado através da utilização de um vetor virai para carregar a sequência da CPSI para infetar eficazmente as células. Estes vetores serão preferivelmente um vetor adenoviral, retroviral, um vetor viral de vaccinia ou um vírus adeno-associado. Preferem-se estes vetores porque foram utilizados com êxito para transmitir sequências desejadas a células e têm tendência a ter uma elevada eficácia de infeção. Construções de vetor-gene CPSI adequadas adaptam-se para administração como composições farmacêuticas, conforme descrito no presente documento abaixo.

Os promotores virais usados normalmente para vetores de expressão derivam do vírus do polioma, citomegalovirus, Adenovirus 2 e Vírus Símio 40 (SV40). Os promotores precoces e tardios do vírus SV40 são particularmente úteis porque ambos se obtêm facilmente a partir do vírus como um fragmento que também contém a origem de replicação viral do SV40. Fragmentos menores ou maiores do SV40 podem também ser utilizados, desde que esteja incluída a sequência de aproximadamente 250 pares de bases que se prolonga desde o sítio de Hind III em direção ao sítio de Bql I situado na origem de replicação virai. Adicionalmente, é também possível, e frequentemente desejável, utilizar sequências promotoras ou de controlo normalmente associadas com a sequência génica desejada, desde que tais sequências de controlo sejam compatíveis com os sistemas da célula hospedeira. A origem de replicação pode ser proporcionada tanto através da construção do vetor para incluir uma origem exógena, tal como pode ser derivada do SV40 ou de outra fonte virai (por exemplo, Polioma, Adeno, VSV, BPV), ou pode ser proporcionada pelo mecanismo de replicação cromossómica da célula hospedeira. Se o vetor está integrado no cromossoma da célula hospedeira, o último é frequentemente suficiente.

Onde se emprega um gene da CPSI em si mesmo será mais conveniente utilizar simplesmente um gene da CPSI de tipo selvagem diretamente. O gene da CPSI pode portanto compreender o alelo codificador da treonina de tal forma que o aminoácido 1405 do polipéptido codificado inclua a treonina. Alternativamente, o gene da CPSI compreende o alelo codificador da arginina de tal forma que o aminoácido 1405 do polipéptido codificado compreenda a arginina. Adicionalmente, prevê-se que certas regiões de um gene da CPSI possam ser empregues exclusivamente sem empregar um gene da CPSI inteiro de tipo selvagem ou uma variante alélica inteira do mesmo. Propõe-se que em última análise será preferível empregar a região mais pequena necessária para modular o ciclo da ureia para que não se introduza ADN desnecessário nas células que recebem uma construção do gene da CPSI. Técnicas bem conhecidas para os peritos na especialidade, tais como a utilização de enzimas de restrição, permitirá a geração de pequenas regiões de um gene da CPSI exemplar. A capacidade destas regiões para modular o ciclo da ureia pode determinar-se facilmente através dos ensaios relatados nos Exemplos. Geralmente conhecem-se na técnica as técnicas para avaliar a modulação do ciclo da ureia. D.l. Animais Transgénicos

Proporciona-se também dentro do âmbito da presente invenção preparar um animal não humano transgénico que expresse um gene da CPSI da presente invenção ou no qual a expressão de um gene da CPSI esteja desativada. Os animais não humanos transgénicos proporcionados expressam ou a forma T1405 da CPSI ou a forma N1405 da CPSI. Um animal transgénico preferido é um ratinho. Técnicas de preparação de animais transgénicos são conhecidas na técnica. Descrevem-se técnicas exemplares no documento de patente U.S. N.° 5.489.742 (ratos transgénicos); documentos de patente U.S. N.°s 4.736.866, 5.550.316, 5.614.396, 5.625.125 e 5.648.061 (ratinhos transgénicos); documento de patente U.S. N.° 5.573.933 (porcos transgénicos); documento de patente U.S N.° 5.162.215 (espécies aviares transgénicas) e documento de patente U.S N.° 5.741.957 (espécies bovinas transgénicas), a totalidade do conteúdo de cada sendo incorporada no presente documento como referência.

No que respeita a um método exemplar para a preparação de um ratinho transgénico, injetam-se sequências de ADN clonadas recombinantes ou sintéticas ou segmentos de ADN codificando um produto génico da CPSI em óvulos de ratinho fertilizados. Os óvulos injetados implantam-se em fêmeas pseudo-gestantes e levados a termo para proporcionar ratinhos transgénicos cujas células expressam um produto génico da CPSI. Preferivelmente, as sequências injetadas constroem-se ligando sequências de promotores de forma a expressar a proteína desejada em células hepáticas do ratinho transgénico. D.2. Terapia Génica

Os genes da CPSI podem ser utilizados para terapia génica de acordo com a presente invenção. Descrevem-se métodos exemplares de terapia génica, incluindo transfeção lipossómica de ácidos nucleicos para células hospedeiras nos documentos de patente U.S. N. °s 5.279.833; 5.286.634; 5.399.346; 5.646.008; 5.651.964; 5.641.484 e 5.643.567, a totalidade do conteúdo de cada sendo incorporada no presente documento como referência.

Descreve-se brevemente a terapia génica da CPSI dirigida à modulação do ciclo da ureia numa célula alvo. As células alvo incluem, mas não estão limitadas a, células hepáticas e intestinais. Numa forma de realização, um método terapêutico da presente invenção proporciona um método para a modulação do ciclo da ureia numa célula compreendendo as etapas de: (a) transmitir à célula uma quantidade eficaz de uma molécula de ADN compreendendo um polinucleótido que codifica um polipéptido da CPSI que modula o ciclo da ureia; e (b) manter a célula sob condições suficientes para a expressão do dito polipéptido. A transmissão consegue-se preferivelmente injetando a molécula de ADN para dentro da célula. Quando a célula se encontra num sujeito, a transmissão é feita preferivelmente administrando a molécula de ADN no sistema circulatório do sujeito. Numa forma de realização preferida, a administração compreende as etapas de: (a) proporcionar um veiculo que contém a molécula de ADN; e (b) administrar o veículo ao sujeito.

Um veículo é preferivelmente uma célula transformada ou transfetada com a molécula de ADN ou uma célula transfetada derivada de uma tal célula transformada ou transfetada. Uma célula transformada ou transfetada exemplar e preferida é uma célula hepática. Meios para transformar ou transfetar uma célula com uma molécula de ADN da presente invenção estabelecem-se acima.

Alternativamente, o veículo é um vírus ou um anticorpo que infeta ou imunorreage especificamente com um antigénio do tumor. Os retrovirus utilizados para transmitir as construções aos tecidos alvo do hospedeiro são geralmente vírus nos quais a LTR (região de transferência linear) 3' foi inativada. Isto é, estas são LTR 3' sem potenciador, frequentemente referidas como SIN (vírus de auto-inativação) porque após a infeção produtiva para dentro da célula hospedeira, a LTR 3' é transferida para a extremidade 5' e ambas as LTRs virais estão inativas com respeito à atividade transcricional. Uma utilização destes vírus bem conhecida pelos peritos na especialidade é a clonagem de genes para os quais os elementos reguladores do gene clonado se inserem no espaço entre as duas LTRs. Uma vantagem de um sistema de infeção virai é que permite um nível muito elevado de infeção na célula recetora apropriada.

Utilizaram-se anticorpos para marcar e transmitir moléculas de ADN. Um conjugado de um anticorpo de poli-L-lisina modificado em N-terminal (NPLL) forma prontamente um complexo com ADN de plasmídeos. Utilizou-se um complexo de anticorpos monoclonais contra uma trombomodulina da superfície celular conjugados com NPLL para marcar um ADN de plasmideo exógeno para uma linha celular de pulmão de ratinho expressando antigénios e pulmão de ratinho. Aquelas células endoteliais direcionadas expressaram o produto codificado por tal ADN exógeno.

Prevê-se também que esta forma de realização que não é uma forma de realização de acordo com a presente invenção possa ser posta em prática utilizando vetores virais ou de fagos alternativos, incluindo vetores retrovirais e vírus de vaccinia cujo genoma tenha sido manipulado de modos alternativos de forma a tornar o vírus não-patogénico. Estabelecem-se métodos para criar uma tal mutação virai em detalhe no documento de patente U.S. N.° 4.769.331., incorporado no presente documento como referência.

Como meio de exemplo específico, um polinucleótido codificador da CPSI humana ou um homólogo de um polinucleótido codificador da CPSI a partir de outro vertebrado de sangue quente ou um homólogo de um polinucleótido codificador da CPSI a partir de uma fonte invertebrada, tal como bactérias ou leveduras introduz-se em células hepáticas isoladas ou outras células relevantes. A reinjeção das células portadoras do transgene no fígado ou outros tecidos relevante proporciona um tratamento para a suscetibilidade à hiperamonemia ou outras doenças relevantes em humanos e animais. E. Terapêutica de Suplementação

Para além do seu papel na eliminação de azoto, o ciclo da ureia é a fonte intrínseca de arginina do organismo que atua como precursor do óxido nítrico (NO) um potente vasodilatador. Proporcionam-se métodos de tratamento da função subótima do ciclo da ureia de acordo com a presente invenção, incluindo tratamento através da administração de precursores do óxido nítrico tais como a citrulina. Tipicamente, a função subótima do ciclo da ureia associa-se ao polimorfismo divulgado no presente documento. A função subótima do ciclo da ureia pode compreender adicionalmente a hiperamonemia ou a produção diminuída de arginina. 0 sujeito a ser tratado pode sofrer um distúrbio associado à função subótima do ciclo da ureia. Tais distúrbios incluem, mas não estão limitados a, distúrbios que envolvem tecido do fígado e/ou do intestino comprometido ou danificado. Distúrbios representativos incluem, mas não estão limitados a, hepatite (incluindo hepatite A, B e C), esclerose, hipertensão pulmonar, toxicidade por transplante de medula óssea num sujeito a ser submetido a transplante de medula óssea e combinações das mesmas. 0 sujeito a ser tratado pode também estar exposto ou a ponto de ser exposto a um estimulo ambiental associado com a função subótima do ciclo da ureia. Tais estímulos ambientais incluem mas não estão limitados a estímulos que envolvem comprometimento ou dano do fígado e/ou intestino. Estímulos ambientais representativos incluem, mas não estão limitados a, quimioterapia ou outra terapêutica farmacêutica, cirurgia cardíaca, stress oxidativo crescente, transplante de medula óssea, e combinações dos mesmos.

Assim, proporciona-se um método de tratamento ou prevenção de um distúrbio relacionado com a função subótima do ciclo da ureia num sujeito de acordo com a presente invenção. 0 método compreende administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um precursor do óxido nítrico, com a qual se alcance o tratamento ou a prevenção do distúrbio. 0 precursor do óxido nítrico pode incluir, mas não está limitado a, citrulina, arginina e combinações das mesmas. 0 precursor do óxido nítrico administra-se numa dose variando desde cerca de 0,01 mg até cerca de 1.000 mg, preferivelmente numa dose variando desde cerca de 0,5 mg até cerca de 500 mg, e mais preferivelmente numa dose variando desde cerca de 1,0 mg até cerca de 250 mg.

Opcionalmente, o método de terapêutica de suplementação da presente invenção compreende adicionalmente a etapa de inicialmente detetar um polimorfismo de um gene da carbamilo fosfato sintase I (CPSI) no sujeito. O polimorfismo de um gene da carbamilo fosfato sintetase preferivelmente compreende uma transversão de C para A no exão 36 da CPSI, mais preferivelmente compreende uma transversão de C para A no nucleótido 4340 de um ADNc que corresponde ao gene da CPSI, e ainda mais preferivelmente, a transversão de C para A no nucleótido 4340 do ADNc que corresponde ao gene da CPSI compreende adicionalmente uma alteração no código do tripleto de AAC para ACC, que codifica um polipéptido da CPSI tendo uma fração treonina no aminoácido 1405.

Observou-se um decréscimo significativo nos intermediários do ciclo da ureia (citrulina, arginina) em sujeitos a ser submetidos a BMT associado com o polimorfismo T1405N da CPSI divulgado no presente documento. De acordo com a presente invenção, também se proporciona um método para o tratamento ou profilaxia da toxicidade por BMT, tal como a HVOD, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um precursor do NO, tal como a citrulina e/ou a arginina, a um sujeito com necessidade da mesma de acordo com a presente invenção. Preferivelmente, o polimorfismo T1450N da CPSI divulgado no presente documento está presente no sujeito. Mais preferivelmente, administra-se uma quantidade terapeuticamente eficaz de citrulina ao sujeito.

De acordo com a presente invenção, proporciona-se portanto um método para reduzir a toxicidade e/ou a ocorrência de HVOD num sujeito a ser submetido a BMT. Este método compreende administrar ao sujeito de BMT uma quantidade eficaz de arginina e/ou citrulina, sendo preferida a citrulina, para reforçar a síntese de arginina e de NO no sujeito. O reforço da síntese de arginina e de NO no sujeito reduzirá e/ou impedirá substancialmente a ocorrência de HVOD associada com BMT. A citrulina é um agente de suplementação preferido dado que é mais prontamente convertida em NO. Adicionalmente e preferivelmente, contempla-se que os sujeitos que têm o polimorfismo da CPSI da presente invenção sejam candidatos preferidos para a suplementação de acordo com este método. O sujeito tratado na presente invenção nas suas várias formas de realização é desejavelmente um sujeito humano, ainda que se deva entender que os princípios da invenção indicam que a invenção é eficaz com respeito a todas as espécies de vertebrados, incluindo vertebrados de sangue quente tais como mamíferos e aves, que se destinam a estar incluídos no termo "sujeito". Neste contexto, entende-se que um mamífero inclui qualquer espécie de mamífero na qual o tratamento da hiperamonemia, toxicidade por BMT e outras doenças associadas com a função deficiente do ciclo da ureia é desejável, particularmente espécies de mamíferos agrícolas e domésticas.

Assim, contempla-se o tratamento de mamíferos tais como humanos, bem como aqueles mamíferos de importância devido a estarem em perigo de extinção (tais como os tigres da Sibéria), de importância económica (animais criados em quintas para consumo humano) e/ou de importância social (animais mantidos como animais de estimação ou em jardins zoológicos) para humanos, por exemplo, carnívoros além dos humanos (tais como gatos e cães), suínos (porcos e javalis), ruminantes (tais como gado, bois, ovelhas, girafas, veados, cabras, bisontes e camelos), e cavalos. Também se contempla o tratamento de aves, incluindo o tratamento daquelas espécies de aves que estão em perigo de extinção, mantidas em jardins zoológicos, bem como galiformes e anseriformes, e mais particularmente galiformes e anseriformes domesticados, isto é, aves de capoeira, tais como perus, galinhas, patos, gansos, pintadas, e semelhantes, já que têm importância económica para o ser humano. Assim, contempla-se o tratamento de gado, incluindo, mas não limitado a, suínos domesticados (porcos), ruminantes, cavalos, aves de capoeira e semelhantes. A quantidade de ingredientes ativos que podem ser combinados com os materiais portadores para produzir uma única forma de dosagem variarão dependendo do hospedeiro tratado e do modo particular de administração. Por exemplo, uma formulação destinada à administração em humanos pode conter desde 0,5 mg até 5 g de agente ativo composto com uma quantidade apropriada e conveniente de material portador que pode variar de 5 a 95 por cento da composição total. Por exemplo, num adulto humano, as doses por pessoa por administração são geralmente entre 1 mg e 500 mg até várias vezes por dia. Assim, as formas de dosagem unitárias conterão geralmente entre desde cerca de 1 mg até cerca de 500 mg de um ingrediente ativo, tipicamente 25 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 800 mg, ou 1000 mg.

Compreender-se-á, no entanto, que o nível de dose específico para qualquer sujeito em particular dependerá de uma série de fatores incluindo a idade, peso corporal, saúde em geral, sexo, dieta, momento de administração, via de administração, taxa de excreção, combinação de fármacos e a gravidade da doença em particular a ser sujeita a terapêutica. F. Composições Farmacêuticas

Descrevem-se adicionalmente composições farmacêuticas compreendendo um polipéptido ou, como descrito no presente documento, um portador fisiologicamente aceitável. Mais preferivelmente, uma composição farmacêutica compreende um polinucleótido que codifica um polipéptido da CPSI biologicamente ativo. Alternativamente, as composições proporcionadas compreendem citrulina ou arginina em dosagens conforme descrito acima.

Uma composição descrita no presente documento administra-se tipicamente por via oral ou parentérica em formulações de dosagem unitária contendo portadores, adjuvantes e veículos padrão, conhecidos e não tóxicos conforme desejado. O termo "parentérico" conforme utilizado no presente documento inclui técnicas de injeção ou infusão intravenosas, intramusculares e intra-arteriais.

Formulam-se preparações injetáveis, por exemplo suspensões aquosas ou oleaginosas injetáveis estéreis, de acordo com a técnica conhecida utilizando agentes dispersantes ou humectantes, e agentes de suspensão. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetável estéril num diluente ou solvente não tóxico parentericamente aceitável, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol.

Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregues estão a água, a solução de Ringer, e a solução isotónica de cloreto de sódio. Adicionalmente, óleos fixos, estéreis são convencionalmente empregues como meio solvente ou de suspensão. Para esta finalidade qualquer óleo fixo suave pode ser empregue, incluindo mono ou diglicéridos sintéticos. Adicionalmente, ácidos gordos tais como o ácido oleico têm utilidade na preparação de injetáveis.

Os portadores preferidos incluem soluções salinas neutras tamponadas com fosfato, lactato, Tris, e semelhantes. Claro que, no caso de uma composição farmacêutica proporcionada para utilização em terapêutica génica, purifica-se o vetor suficientemente para torná-lo essencialmente livre de contaminantes indesejáveis, tais como partículas ou endotoxinas adenovíricas defeituosas interferentes e outros agentes pirogénicos de tal forma que não cause quaisquer reações desfavoráveis no indivíduo que recebe a construção de vetor. Um meio preferido de purificação do vetor envolve a utilização de gradientes de densidade flutuante, tais como a centrifugação por gradiente de cloreto de césio.

Uma célula transfetada também pode servir como um portador. A título de exemplo, uma célula hepática pode ser removida de um organismo, transfetada com um polinucleótido da presente invenção utilizando métodos estabelecidos acima e posteriormente a célula transfetada devolvida ao organismo (por exemplo injetada intravascularmente). G. Geração de Anticorpos

Descreve-se ainda adicionalmente um anticorpo imunorreativo com um polipéptido ou polinucleótido conforme descrito no presente documento. Preferivelmente, um anticorpo descrito no presente documento é um anticorpo monoclonal. Conhecem-se na técnica meios para preparar e caracterizar anticorpos (veja-se, por exemplo, Antibodies A Laboratory Manual, E. Howell e D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) . Os anticorpos mais preferíveis distinguem entre as diferentes formas da CPSI que compreendem o polimorfismo da CPSI.

Brevemente, um anticorpo policlonal é preparado através da imunização de um animal com um imunogénio compreendendo um polipéptido ou polinucleótido descrito no presente documento, e recolha de antissoros desse animal imunizado. Pode utilizar-se uma ampla gama de espécies animais para a produção de antissoros. Tipicamente um animal utilizado para a produção de anti-antissoros é um coelho, um ratinho, um rato, um hámster ou um porquinho-da-índia. Devido ao volume sanguíneo relativamente elevado dos coelhos, o coelho é uma escolha preferida para a produção de anticorpos policlonais.

Como é bem conhecido na técnica, um dado polipéptido ou polinucleótido pode variar na sua imunogenicidade. É portanto frequentemente necessário emparelhar o imunogénio (por exemplo, um polipéptido ou polinucleótido) da presente invenção) com um portador. Portadores exemplares e preferidos são a hemocianina de lapa (KLH) e a albumina sérica bovina (BSA). Outras albuminas tais como a ovalbumina, albumina sérica de ratinhos ou albumina sérica de coelhos podem também ser utilizadas como portadores.

Os meios para conjugar um polipéptido ou um polinucleótido com uma proteína portadora são conhecidos na técnica e incluem glutaraldeído, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimidina, carbodiimida e benzidina bis-diazotizada.

Como também é bem conhecido na técnica, a imunogenicidade a um imunogénio particular pode ser potenciada através da utilização de estimuladores da resposta imune não específicos conhecidos como adjuvantes. Adjuvantes exemplares e preferidos incluem o adjuvante completo de Freund, os adjuvantes incompletos de Freund e adjuvante de hidróxido de alumínio. A quantidade de imunogénio utilizada na produção de anticorpos policlonais varia, inter alia, da natureza do imunogénio bem como do animal utilizado para a imunização. Podem utilizar-se uma série de vias para administrar o imunogénio, por exemplo subcutânea, intramuscular, intradérmica, intravenosa e intraperitoneal. A produção de anticorpos policlonais monitoriza-se através de amostras de sangue do animal imunizado em vários pontos após a imunização. Quando se obtém um nível desejado de imunogenicidade o animal pode ser sangrado e o soro isolado e armazenado.

Noutro aspeto, descreve-se no presente documento um método de produção de um anticorpo imunorreativo com um polipéptido de CPSI, o método compreendendo as etapas de: (a) transfetar células hospedeiras recombinantes com um polinucleótido que codifica o polipéptido; (b) cultivar as células hospedeiras sob condições suficientes para a expressão do polipéptido; (c) recuperar o polipéptido; e (d) preparar anticorpos para o polipéptido. Preferivelmente, o polipéptido de CPSI é capaz de mediar a primeira etapa do ciclo da ureia, tem reação cruzada com um anticorpo anti-CPSI, ou outra atividade biológica conforme descrito no presente documento. Descrevem-se mais adicionalmente no presente documento anticorpos preparados de acordo com o método descrito acima.

Um anticorpo monoclonal descrito no presente documento pode ser prontamente preparado através da utilização de técnicas bem conhecidas tais como aquelas exemplificadas no documento de patente U.S. N.° 4.196.265, incorporado no presente documento como referência. Tipicamente, uma técnica envolve primeiro imunizar um animal adequado com um antigénio selecionado (por exemplo, um polipéptido ou polinucleótido da presente invenção) de uma forma suficiente para proporcionar uma resposta imune. Os roedores tais como ratinhos e ratos são animais preferidos. Fusionam-se células do baço do animal imunizado com uma célula de um mieloma imortal. Onde o animal imunizado é um ratinho, uma célula de mieloma preferida é uma célula de mieloma murino NS-1.

As células do baço/mieloma fusionadas cultivam-se num meio seletivo para selecionar células do baço/mieloma fusionadas das células parentais não fusionadas. As células fusionadas separam-se da mistura de células parentais não fusionadas, por exemplo, através da adição de agentes que bloqueiam a síntese de novo dos nucleótidos no meio de cultivo tecidual. Agentes exemplares e preferidos são a aminopterina, o metotrexato e a azaserina. A aminopterina e o metotrexato bloqueiam a síntese de novo tanto de purinas como de pirimidinas, enquanto a azaserina só bloqueia a síntese de purinas. Onde se utilizam a aminopterina e o metotrexato, suplementa-se o meio com hipoxantina e timidina como uma fonte de nucleótidos. Onde se utiliza a azaserina, o meio suplementa-se com hipoxantina.

Este cultivo proporciona uma população de hibridomas da qual se selecionam hibridomas específicos. Tipicamente, a seleção de hibridomas efetua-se cultivando as células através de diluição de clone único em placas de microtitulação, seguido de testar a reatividade dos sobrenadantes clonais individuais com um polipéptido antigénico. Os clones selecionados podem então ser propagados indefinidamente para proporcionar o anticorpo monoclonal. A título de exemplo específico, para produzir um anticorpo conforme descrito no presente documento, injeta-se intraperitonealmente em ratinhos entre cerca de 1-200 g de um antigénio compreendendo um polipéptido da presente invenção. Estimulam-se as células dos linfócitos B a crescer injetando o antigeno em conjunto com um adjuvante tal como o adjuvante completo de Freund (um estimulador não especifico da resposta imune contendo Mycobacterium tuberculosis morta). Em algum momento (por exemplo, pelo menos dos semanas) após a primeira injeção, os ratinhos são reforçados através de injeção com uma segunda dose do antigénio misturado com adjuvante incompleto de Freund.

Algumas semanas após a segunda injeção, sangram-se os ratinhos pela cauda e os soros são titulados por imunoprecipitação contra antigénio marcado radioativamente. Preferivelmente, o processo de reforço e titulação repete-se até se alcançar uma titulação adequada. Remove-se o baço do ratinho com a titulação mais elevada e obtêm-se os linfócitos esplénicos homogeneizando o baço com uma seringa. Tipicamente, um baço de um ratinho imunizado contém aproximadamente 5xl07 a 2xl08 linfócitos.

As células dos linfócitos mutantes conhecidas como células de mieloma obtêm-se a partir de animais de laboratório nos quais se induziram tais células a crescer através de uma série de métodos conhecidos. As células de mieloma carecem da via de recurso da biossintese nucleotidica. Devido a que as células de mieloma são células tumorais, podem propagar-se indefinidamente em cultivos teciduais, e como tal são denominadas imortais. Estabeleceram-se numerosas linhas celulares de células de mieloma cultivadas a partir de ratinhos e ratos, tais como as células de mieloma murino NS-1.

As células de mieloma combinam-se sob condições apropriadas para fomentar a fusão com as células produtoras de anticorpos normais a partir do baço do ratinho ou rato injetados com o antigénio/polipéptido da presente invenção.

As condições de fusão incluem, por exemplo, a presença de polietilenoglicol. As células fusionadas resultantes são células de hibridoma. Tal como as células de mieloma, as células de hibridoma crescem indefinidamente em cultivo.

As células de hibridoma separam-se das células de mieloma não fusionadas através de cultivo num meio de seleção tal como o meio HAT (hipoxant ina, aminopterina, timidina). As células de mieloma não fusionadas carecem das enzimas necessárias para sintetizar nucleótidos a partir da via selvagem porque morrem na presença de aminopterina, metotrexato ou azaserina. Os linfócitos não fusionados também não continuam a crescer em cultivo tecidual. Como tal, só as células que se fusionaram com êxito (células de hibridoma) podem crescer nos meios de seleção.

Cada uma das células de hibridoma sobreviventes produz um único anticorpo. Estas células são então rastreadas para a produção do anticorpo especifico imunoreativo com um antigénio/polipéptido da presente invenção. Os hibridomas unicelulares isolam-se limitando as diluições dos hibridomas. Os hibridomas diluem-se em série várias vezes e, após permitir que as diluições cresçam, testa-se o sobrenadante para a presença do anticorpo monoclonal. Os clones que produzem esse anticorpo cultivam-se então em grandes quantidades para produzir um anticorpo da presente invenção em quantidade conveniente.

Através da utilização de um anticorpo monoclonal descrito no presente documento, os polipéptidos e polinucleótidos descritos no presente documento podem reconhecer-se como antigénios, e como tal identificados. Uma vez identificados, esses polipéptidos e polinucleótidos podem isolar-se e purificar-se através de técnicas tais como a cromatografia de afinidade de anticorpos. Na cromatografia de afinidade de anticorpos, une-se um anticorpo monoclonal a um substrato sólido e expõe-se a uma solução contendo o antigénio desejado. Remove-se o antigénio da solução através de uma reação imunospecífica com o anticorpo unido. Remove-se então o polipéptido ou polinucleótido facilmente do substrato e purifica-se. H. Deteção de um Polinucleótido ou um Polipéptido da Presente Invenção

Alternativamente, descreve-se no presente documento um método de deteção de um polipéptido conforme descrito no presente documento, onde o método compreende imunorreagir os polipéptidos com anticorpos preparados segundo os métodos descritos acima para formar conjugados de anticorpo-polipéptido e detetar os conjugados.

Descreve-se adicionalmente no presente documento um método de detetar transcritos de ARN mensageiro que codificam um polipéptido da presente invenção, onde o método compreende hibridizar os transcritos de ARN mensageiro com sequências polinucleótídicas que codificam o polipéptido para formar duplexes; e detetar o duplex. Descreve-se alternativamente um método de detetar moléculas de ADN que codificam um polipéptido da presente invenção, onde o método compreende hibridizar moléculas de ADN com um polinucleótido que codifica esse polipéptido para formar duplexes; e detetar os duplexes.

Os ensaios de deteção e rastreio descritos no presente documento podem ser utilizados como uma ferramenta de prognóstico. Os polinucleótidos codificadores da CPSI humana bem como os seus produtos proteicos podem prontamente ser utilizados no contexto clinico como um indicador de prognóstico para rastrear a suscetibilidade à hiperamoniemia e a outras doenças hereditárias relacionadas com a CPSI em humanos.

Os ensaios de deteção e rastreio descritos no presente documento também podem ser utilizados como parte de um diagnóstico. Os polinucleótidos codificadores da CPSI humana bem como os seus produtos proteicos podem prontamente utilizados no contexto clinico para diagnosticar a suscetibilidade à hiperamoniemia e a outras doenças hereditárias relacionadas com a CPSI em humanos. H.l. Ensaios de Rastreio para um Polipéptido da Presente Invenção

Descreve-se no presente documento um método de rastreio de uma amostra biológica quanto à presença de um polipéptido de CPSI. Preferivelmente, o polipéptido de CPSI possui atividade no ciclo da ureia, reatividade cruzada com um anticorpo anti-CPSI, ou outra atividade biológica, tal como descrito no presente documento. Uma amostra biológica a ser rastreada pode ser um fluido biológico tal como um fluido extracelular ou intracelular ou um extrato ou homogeneizado celular ou de tecido. Uma amostra biológica também pode ser uma célula isolada (por exemplo, em cultura) ou um conjunto de células tal como numa amostra de tecido ou amostra histológica. Uma amostra de tecido pode ser suspensa num meio liquido ou fixa num suporte sólido tal como uma lâmina de microscópio. Tecidos hepáticos compreendem tecidos particularmente contemplados.

De preferência, os anticorpos que distinguem entre o polipéptido N1405 CPSI e o polipéptido T1405 CPSI são proporcionados. Tais anticorpos podem comparar anticorpos policlonais, mas são de preferência anticorpos monoclonais preparados conforme descrito no presente documento acima.

De acordo com um método de ensaio de rastreio, uma amostra biológica é exposta a um anticorpo imunorreativo com o polipéptido, cuja presença está a ser testada. Tipicamente, a exposição é realizada através da formação de uma mistura em um meio liquido que contém ambos o anticorpo e o polipéptido candidato. Tanto o anticorpo ou a amostra com o polipéptido pode ser afixado num suporte sólido (por exemplo, uma coluna ou uma placa de microtitulação) . A amostra biológica é exposta ao anticorpo sob condições de reação biológicas e durante um período de tempo suficiente para a formação do conjugado de anticorpo- polipéptido. Condições de reação biológicas incluem a composição iónica e a concentração, temperatura, pH e semelhantes. A composição iónica e a concentração podem variar desde a da água destilada a uma solução a 2 molar de NaCl. Preferivelmente, a osmolaridade é desde cerca de 100 mosmols/1 até cerca de 400 mosmols/1 e, mais preferivelmente, desde cerca de 200 mosmols/1 até cerca de 300 mosmols/1. A temperatura é preferivelmente desde cerca de 4 °C até cerca de 100 0 C, mais preferivelmente desde cerca de 15 °C até cerca de 50 0 C e ainda mais preferivelmente desde cerca de 25 °C até cerca de 40 °C. O pH é preferivelmente desde cerca de um valor de 4,0 até um valor de cerca de 9,0, mais preferivelmente desde cerca de um valor de 6,5 até um valor de cerca de 8,5 e, ainda mais preferivelmente desde cerca de um valor de 7,0 até um valor de cerca de 7,5. O único limite das condições de reação biológicas é que as condições selecionadas permitem a formação do conjugado de anticorpo-polipéptido e que as condições não afetam de modo adverso ou o anticorpo ou o polipéptido. O tempo de exposição irá variar inter alia, com as condições biológicas utilizadas, a concentração de anticorpo e polipéptido e a natureza da amostra (por exemplo, amostra de fluido ou tecido). Meios para determinar o tempo de exposição são bem conhecidos para um perito na especialidade. Tipicamente, quando a amostra é fluido e da concentração de polipéptido nessa amostra é de cerca de 1CT10 Μ, o tempo de exposição é desde cerca de 10 minutos até cerca de 200 minutos. A presença de polipéptido na amostra é detetada através da deteção da formação e presença de conjugados de anticorpo-polipéptido. Meios para a deteção de tais conjugados ou complexos de anticorpo-antigénio (por exemplo, polipéptido recetor) são bem conhecidos na técnica e incluem procedimentos tais como centrifugação, cromatografia de afinidade e semelhantes, ligação de um anticorpo secundário ao complexo recetor canditato-anticorpo.

Por exemplo, a deteção é conseguida através da deteção de um indicador afixado para o anticorpo. Indicadores tais bem conhecidos e exemplares incluem marcadores radioativos (por exemplo, 32P, 125I, 14C) , um segundo anticorpo ou uma enzima, tal como peroxidase de rábano. Meios de fixação dos indicadores aos anticorpos são bem conhecidos na técnica. Kits comerciais estão disponíveis. H.2. Ensaio de Rastreio para Anticorpo Anti-Polipéptido

Descreve-se adicionalmente um método de rastreio de uma amostra biológica quanto à presença de anticorpos imunorreativos com um polipéptido de CPSI. De preferência, o polipéptido de CPSI tem uma atividade no ciclo da ureia, reatividade cruzada com um anticorpo anti-CPSI, ou outra atividade biológica, de acordo com a presente invenção. De acordo com um tal método, uma amostra biológica é exposta a um polipéptido de CPSI sob condições biológicas e durante um período de tempo suficiente para a formação do conjugado de anticorpo-polipéptido e os conjugados formados são detetados. H.3. Ensaio de Rastreio para Polinucleótido que Codifica um Polipéptido de CPSI conforme descrito no presente documento

Uma molécula de ácido nucleico e, em particular uma molécula sonda, pode ser utilizada para hibridizar como uma sonda oligonucleotidica com uma fonte de ácido nucleico que se suspeita codificar um polipéptido de CPSI conforme descrito no presente documento. Otimamente, o polipéptido de CPSI tem uma atividade de CPSI no ciclo da ureia, reatividade cruzada com um anticorpo anti-CPSI, ou outra atividade biológica conforme descrito no presente documento. A sondagem é geralmente conseguida por hibridização do oligonucleótido com uma fonte de ADN suspeita de possuir um gene CPSI. Em alguns casos, as sondas constituem apenas uma única sonda, e em outros, as sondas constituem um conjunto de sondas com base numa determinada sequência de aminoácidos ou sequências do polipéptido e são responsáveis, sua diversidade, para a redundância inerente ao código genético.

Uma fonte adequada de ADN para sondar desta maneira é capaz de expressar um polipéptido da presente invenção e pode ser uma biblioteca genómica de uma linha celular de interesse. Alternativamente, uma fonte de ADN pode incluir ADN total a partir da linha celular de interesse. Uma vez que o método de hibridização da presente invenção identificou um segmento de ADN candidato, confirma-se que um clone positivo foi obtido por posterior hibridização, mapeamento com enzimas de restrição, sequenciação e/ou expressão e testagem.

Em alternativa, tais moléculas de ADN podem ser utilizadas numa série de técnicas, incluindo a sua utilização como: (1) ferramentas de diagnóstico para detetar sequências de ADN normais e anormais em ADN derivado de células do sujeito, tais como um polimorfismo de CPSI descrito no presente documento; (2) meios para a deteção e isolamento de outros membros da família do polipéptido e polipéptidos relacionados a partir de uma biblioteca de ADN potencialmente contendo tais sequências; (3) iniciadores para hibridizar com sequências relacionadas com o objetivo de amplificar aquelas sequências; (4) iniciadores para alterar sequências de ADN de CPSI nativas; bem como outras técnicas que se baseiam na semelhança das sequências de ADN com as dos segmentos de ADN divulgadas no presente documento.

Tal como estabelecido acima, em certos aspetos, a informação de sequência de ADN proporcionada pela invenção permite a preparação de sequências de ADN (ou ARN) relativamente curto (por exemplo, sondas) que hibridizam especificamente com as sequências que codificam um gene de CPSI selecionado. Nestes aspetos, sondas de ácido nucleico de um comprimento apropriado são preparadas com base numa consideração da sequência de codificação para um polipéptido, conforme descrito no presente documento. A capacidade de tais sondas de ácido nucleico para hibridizar especificamente com outras sequências de codificação confere-lhes particular utilidade numa variedade de formas de realização. De forma mais importante, as sondas podem ser utilizadas numa variedade de ensaios para detetar a presença de sequências complementares numa dada amostra. Contudo, outras utilizações estão previstas, incluindo a utilização da informação da sequência para a preparação de iniciadores de espécies mutantes, ou de iniciadores para utilização na preparação de outras construções genéticas.

Para proporcionar certas das vantagens conforme descrito no presente documento, uma sequência de ácido nucleico preferida empregue para estudos ou ensaios de hibridização inclui sequências de sondas que são complementares a uma extensão de nucleótidos de pelo menos 14 a 40 ou mais nucleótidos de comprimento de uma sequência de ácido nucleico tal como descrito no presente documento, tal como uma sequência mostrada em qualquer das SEQ ID NOs: 1, 3, 11 e 13. Um tamanho de pelo menos 14 nucleótidos de comprimento ajuda a assegurar que o fragmento é de comprimento suficiente para formar uma molécula duplex que é estável e seletiva. Moléculas tendo sequências complementares ao longo de extensões maiores do que 14 bases de comprimento são geralmente preferidas, apesar de, que para aumentar a estabilidade e seletividade do híbrido, e, assim, melhorar a qualidade e grau de moléculas híbridas específicas obtidas. Geralmente preferir-se-á conceber moléculas de ácido nucleico tendo extensões complementares com genes de 14 a 20 nucleótidos, ou até mais, quando desejado. Tais fragmentos podem ser prontamente preparados, por exemplo, sintetizando diretamente o fragmento por meios químicos, por aplicação de tecnologia de reprodução de ácidos nucleicos, tal como a tecnologia de PCR do documento de Patente U.S. N.° 4.683.202, incorporado no presente documento como referência, ou por introdução de sequências selecionadas em vetores recombinantes para produção recombinante.

Consequentemente, uma sequência de nucleótidos tal como descrito no presente documento pode ser utilizada pela sua capacidade para formar seletivamente moléculas duplex com extensões complementares do gene. Dependendo da aplicação pretendida, empregam-se condições de hibridização variáveis para alcançar graus variáveis de seletividade da sonda para com a sequência alvo. Para aplicações que requerem um elevado grau de seletividade, empregam-se tipicamente condições relativamente restringentes para formar os híbridos. Por exemplo, selecionam-se condições de temperatura elevada e/ou baixa salinidade, tal como proporcionada por 0,02 M - 0,15 M de sal, a temperaturas de cerca de 50 °C até cerca de 70 0 C, incluindo em particular temperaturas de cerca de 55 °C, cerca de 60 °C e cerca de 65 °C. Tais condições são particularmente seletivas, e toleram pouca, se qualquer, não correspondência entre a sonda e o molde ou cadeia alvo. É claro que, para algumas aplicações, por exemplo, onde se deseja preparar mutantes empregando uma cadeia de iniciador mutante hibridizada a um molde subjacente, ou quando se pretende isolar sequências de codificação de polipéptido a partir de espécies relacionadas, equivalentes funcionais, ou semelhantes, condições de hibridização menos restringentes são normalmente necessárias para permitir a formação de heteroduplex. Sob tais circunstâncias, empregam-se condições tais como sal a 0,15 M-0,9 M, a temperaturas que variam desde cerca de 20 °C até cerca de 55 °C, incluindo particularmente temperaturas de cerca de 25 °C, cerca de 37 °C, cerca de 45 °C e cerca de 50 °C. Espécies de hibridização cruzada podem, assim, ser facilmente identificadas como sinais de hibridização positiva com respeito a hibridizações de controlo. Em qualquer caso, é geralmente apreciado que as condições podem ser tornadas mais restringentes pela adição de quantidades crescentes de formamida, que serve para destabilizar o duplex híbrido da mesma forma que o aumento da temperatura. Assim, condições de hibridização podem ser prontamente manipuladas, e assim será geralmente um método de eleição dependendo dos resultados desejados.

Em certas formas de realização, é vantajoso empregar um ácido nucleico, conforme descrito no presente documento em combinação com um meio apropriado, tal como um marcador, para determinar a hibridação. Uma ampla variedade de meios indicadores apropriados é conhecida na técnica, incluindo ligandos radioativos, enzimáticos ou outros, tais como avidina/biotina, que são capazes de fornecer um sinal detetável. Em formas de realização preferidas, emprega-se provavelmente um marcador enzimático tal como urease, fosfatase alcalina ou peroxidase, em vez de reagentes radioativos ou outros ambientalmente indesejáveis. No caso de marcadores enzimáticos, substratos indicadores calorimétricos são conhecidos que podem ser empregues para proporcionar um meio visível ao olho humano ou espectrofotometricamente, para identificar a hibridização específica com amostras contendo ácidos nucleicos complementares.

No geral, está previsto que as sondas de hibridização descritas no presente documento são úteis tanto como reagentes em solução de hibridização, bem como nas formas de realização que utilizam uma fase sólida. Em formas de realização envolvendo uma fase sólida, a amostra contendo ADN (ou ARN) de teste é adsorvida, ou de outra forma, fixa a uma matriz ou superfície selecionada. Este ácido nucleico de cadeia simples e fixo é então submetido a hibridização especifica com sondas selecionadas sob condições desejadas. As condições selecionadas dependem, inter alia, das circunstâncias particulares com base nos critérios particulares necessários (dependendo, por exemplo, dos conteúdos G+C, tipo de ácido nucleico alvo, fonte de ácido nucleico, o tamanho da sonda de hibridização, etc.). A seguir à lavagem da superfície hibridizada, de forma a remover moléculas de sonda ligadas de forma não especifica, é detetada a hibridização específica, ou mesmo quantificada, por meio do marcador. H.4. Kits de Ensaio

Descreve-se adicionalmente um kit de ensaio de diagnóstico para detetar a presença de um polipéptido conforme descrito no presente documento em amostras biológicas, em que o kit compreende um primeiro recipiente contendo um primeiro anticorpo capaz de imunorreagir com o polipéptido, com o primeiro anticorpo presente numa quantidade suficiente para realizar pelo menos um ensaio. Preferivelmente, os kits de ensaio da invenção compreendem adicionalmente um segundo recipiente contendo um segundo anticorpo que imunorreage com o primeiro anticorpo. Mais preferivelmente, os anticorpos utilizados nos kits de ensaio descritos no presente documento são anticorpos monoclonais. Ainda mais preferivelmente, o primeiro anticorpo está afixado a um suporte sólido. Mais preferivelmente ainda, os primeiro e segundo anticorpos compreendem um indicador, e, preferivelmente, o indicador é um marcador radioativo ou uma enzima.

Descrevem adicionalmente, um kit de diagnóstico para o rastreio de agentes. Um kit deste tipo pode conter um polipéptido descrito no presente documento. 0 kit pode conter reagentes para detetar uma interação entre um agente e um recetor da presente invenção. 0 reagente fornecido pode ser marcado radioativamente. 0 kit pode conter um agente marcado radioativamente conhecido capaz de se ligar ou interagir com um recetor descrito no presente documento.

Em alternativa, descreve-se no presente documento, kits de ensaio de diagnóstico para detetar a presença, em amostras biológicas, de um polinucleótido que codifica um polipéptido conforme descrito no presente documento, os kits compreendendo um primeiro recipiente que contém um segundo polinucleótido idêntico ou complementar a um segmento de pelo menos 10 bases de nucleótidos contíguos de, como um exemplo preferido, qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 11 e 13.

Descrevem-se adicionalmente kits de ensaio de diagnóstico para detetar a presença, numa amostra biológica, de anticorpos imunorreativos com um polipéptido conforme descrito no presente documento, os kits compreendendo um primeiro recipiente contendo um polipéptido CPSI, que imunorreage com os anticorpos, com o polipéptido presente numa quantidade suficiente para realizar pelo menos um ensaio. Preferivelmente, o polipéptido de CPSI tem atividade no ciclo da ureia, reatividade cruzada num anticorpo anti-CPSI, ou outra atividade biológica descrita no presente documento. Os reagentes do kit podem ser fornecidos como uma solução líquida, ligados a um suporte sólido ou como um pó seco. Preferivelmente, quando o reagente é fornecido numa solução líquida, a solução líquida é uma solução aquosa.

Preferivelmente, quando o reagente fornecido está ligado a um suporte sólido, o suporte sólido pode ser meios de cromatografia meios ou uma lâmina de microscópio. Quando o reagente fornecido é um pó seco, o pó pode ser reconstituído pela adição de um solvente adequado. O solvente pode ser fornecido.

EXEMPLOS

Os seguintes Exemplos foram incluídos para ilustrar modos preferidos da matéria acima descrita. Determinados aspetos dos seguintes Exemplos são descritos em termos de técnicas e procedimentos encontrados ou contemplados pelos presentes inventores como funcionando corretamente na prática da invenção. Estes exemplos são exemplificados através da utilização de práticas laboratoriais padrão dos inventores. Na luz da presente divulgação e do nível geral de experiência na técnica, os peritos apreciarão que os seguintes Exemplos se destinam a ser apenas exemplares no sentido em que numerosas alterações e modificações podem ser empregues.

Materiais e Métodos Utilizados nos Exemplos de Referência 1-2 e Exemplo 1

Os seguintes materiais e métodos são empregues em cada um dos Exemplos de Referência 1-2 e Exemplo 1. Materiais e métodos adicionais são também descritos em cada Exemplo. Recrutamento de Pacientes/Clínico: Mais de 200 pacientes a serem submetidos a BMT no Vanderbilt University Medical Center, Nashville, Tennessee, foram inscritos no Estudo de Lesão Pulmonar por BMT Após Enxerto (BMT-Lung Injury Following Engraftment - LIFE) dirigido à compreensão dos mecanismos de lesão pulmonar aguda e falência orgânica múltipla após o transplante. O consentimento foi buscado de pacientes consecutivos submetidos a BMT ou PBSCT para o tratamento de malignidade. As definições de falência orgânica (incluindo HVOD) e reversão foram prospetivamente definidas e dados foram recolhidos concorrentemente durante a hospitalização. Plasma, sedimentos celulares e urina foram recolhidos aquando da inscrição no estudo (antes de receber quimioterapia) e no dia do transplante (antes da infusão de medula óssea) depois da conclusão de quimio-radioterapia ablativa.

Análise de aminoácidos. Sangue e urina foram imediatamente centrifugados após a recolha. Todas as amostras foram mantidas em gelo, depois armazenadas a - 70 °C até analisadas. Sob estas condições de armazenamento, sabe-se que a glutamina, cisteína e homocistina decrescem, portanto estas não foram utilizadas na análise. Os aminoácidos plasmáticos foram medidos nos Vanderbilt Diagnostic Laboratories, Vanderbilt University, Nashville, Tennessee. De forma breve, um extrato de plasma isento de proteína foi preparado através de precipitação proteica com ácido sulfossalicílico e filtração através de um filtro ACRODISC™ 4 de 0,45 mm (Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan). Os aminoácidos foram separados por cromatografia de permuta catiónica utilizando um sistema de tampão de citrato de lítio de força iónica e de pH graduada de quatro componentes num analisador de aminoácidos Beckmann 7300 (Beckmann, Palo Alto, California). A derivatização após coluna dos aminoácidos com ninidrina permitiu a deteção de aminoácidos de amina primária a 570 nm, e aminas secundárias a 440 nm. A quantificação foi alcançada através da calibração instrumental com material de referência padrão (Sigma, St. Louis, Missouri).

Estatísticas. Os valores de aminoácidos plasmáticos foram expressos como média e erro padrão da média (SEM). As comparações entre os valores de aminoácidos entre a avaliação inicial e após quimioterapia foram realizadas utilizando o teste t de Student. A frequência alélica foi comparada entre pacientes com e sem HVOD utilizando a análise de Qui quadrado.

Pacientes. Os pacientes foram identificados a partir daqueles inscritos no Estudo Lift BMT na Vanderbilt University. ADN foi isolado a partir de amostras de sangue ou urina centrifugada pré-transplante. O estado de HVOD foi determinado utilizando o critério de Baltimore:

Bilirrubina >2,0 mg/dl

Hepatomegalia ganho de peso súbito de 2%

Genot ipagem. O ADN foi isolado utilizando um kit de sangue QIAmp (Qiagen). O polimorfismo T1405N altera a sequência de ADN conforme se segue: CCT-GCC-ACC-CCA-GTG Normal CCT-GCC-AAC-CCA-GTG Alteração A transversão de C para A substitui a pirimidina C com a purina A que destrói um sitio Ms/1. A utilização de um iniciador a partir de dentro do 35° intrão de CPSI e um iniciador exótico do exão 36 do gene CPSI amplifica por PCR de forma fiável um fragmento de 387 pb que engloba a região que contém a alteração. Esta combinação fornece uma amplificação robusta. Esferas de PCR Ready-to-Go também são utilizadas na amplificação (Pharmacia). 0 polimorfismo foi detetado utilizando um gel não desnaturante para tirar partido das estruturas secundárias criadas pela transversão C para A. Esta alteração cria estruturas secundárias suficientes para impedir uma digestão fiável por enzimas de restrição (Msl I) para detetar o polimorfismo. Esta alteração também interfere com a análise de sequência direta a não ser que ITP seja substituída por GTP na reação. Os géis não desnaturantes tiram partido das estruturas secundárias criadas por esta modificação. Quinze (15) indivíduos foram comparados através deste método e análise de sequência.

Para detetar os fragmentos de ADN no gel, uma coloração de prata foi adaptada. Este método rápido e não dispendioso permite a visualização de bandas pouco tempo depois da eletroforese.

Análise Estatística. Um tamanho de amostra suficiente foi obtido para realizar uma análise de Qui quadrado nos resultados. A equação de Hardy-Weinburg foi utilizada para calcular as frequências esperadas para os genótipos (p2 + 2pq + q2) . Os valores de P foram obtidos a partir de uma tabela de Qui quadrado padrão utilizando 2 graus de liberdade.

Exemplo de Referência 1

Alelos de Polimorfismo Exónico de CPSI (T1405N) não se

encontram em equilíbrio de Hardy-Weinburg com a Presença ou Ausência de HVOD

De acordo com a presente invenção, um polimorfismo comum perto da extremidade 3' do ARNm de CPSI (cerca de 0,44 de heterozigocidade) foi identificado. A análise de sequência desta alteração revelou uma transversão C para A na base 4340 alterando o código do tripleto de ACC para AAC. Isto resulta numa substituição de asparagina para treonina no aminoácido 1405 (referido no presente documento como "T1405N"). A treonina está dentro do domínio alostérico, antecedendo a sequência de assinatura PV(A/S)WP(T/S)(A/Q)E, uma sequência que é importante na ligação do cofator n-acetil-glutamato (NAG).

Em todas as CPSIs ativada por NAG, um resíduo de treonina encontra-se entre os dois resíduos que antecedem a sequência de assinatura. (Rubio, Biochemical Society Transactions 21:198-202 (1998)). Com base nos estudos de função de estrutura, acredita-se que a formação de ligações de hidrogénio com o oxigénio de carbonilo do grupo acetamido de NAG desempenha um papel na ligação deste ativador. (Stapleton et al. , Biochemistry 35:14352-14361 (1996); Javid-Majd et al. , Biochemistry 35:14362-14369 (1996)). Prevê-se que a substituição da cadeia lateral de treonina por asparagina altera a formação de ligações de hidrogénio com NAG e resulta numa alteração qualitativa na função enzimática de CPSI e na sensibilidade para o conjunto disponível de NAG. Embora os solicitantes não desejem estar ligados por qualquer teoria particular de operação, especula-se que, com base no precedente dos efeitos de outros xenobióticos, que a disponibilidade limitada de NAG após aumento de doses de quimioterapia é um dos mecanismos que promove a disfunção do ciclo da ureia. 126 indivíduos foram genotipados a partir do grupo do Estudo Life BMT. 30 indivíduos manifestaram evidência de HVOD neste grupo (24%). 70 pacientes foram genotipados a partir de amostras de sangue e 56 de sedimentos celulares de urina. Amostras de 15 pacientes foram reamplifiçadas através de PCR e sequenciadas para confirmar a consistência dos resultados.

Os quadros 2 e 3 mostram os resultados de análise de genótipo para o polimorfismo T1405N entre pacientes HVOD+ e HVOD-. 0 alelo C, também referido no presente documento como o alelo CPSIa ou o alelo de codificação de treonina, tem uma frequência de 0,63 na população examinada e o alelo A, também referido no presente documento como o alelo CPSIb ou o alelo de codificação de asparagina, tem uma frequência de 0,38. O valor de Qui quadrado para o quadro é de 4,3 (P=0,1) indicando que o polimorfismo provavelmente não se encontra em equilíbrio de Hardy-Weinburg com a presença de HVOD. Assim, estes resultados fornecem evidência para o desiquilíbrio na distribuição dos alelos T1405N em pacientes de BMT com HVOD, indicando que o polimorfismo pode ser utilizado para identificar sujeitos que são suscetíveis à toxicidade por BMT.

Quadro 2

Genótipo HVOD+ HVOD- CC 13 (esperado 11,4) 32 (esperado 36,5) AC 16 (esperado 14,1) 50 (esperado 45,1) AA 1 (esperado 4,5) 14 (esperado 14,4)

Quadro 3

Alelos totais: Frequências esperadas: A: 9 6 AA: 0,15 C: 62 AC: 0,47 CC: 0,38

Dados adicionais reunidos a partir de um estudo de aproximadamente 200 pacientes forneceu evidência estatística adicional que suporta a utilização do polimorfismo na deteção de suscetibilidade à função subótima do ciclo da ureia. Estes dados foram submetidos aos métodos estatísticos descritos acima. A toxicidade por transplante de medula óssea resulta em morbilidade e mortalidade significativas. A HVOD está associada com um mau prognóstico em pacientes de BMT. Este estudo foi realizado para avaliar uma associação entre a enzima CPSI e a ocorrência de HVOD. 0 polimorfismo T1405N afeta a função da CPSI. A sua ampla distribuição na população sugere que ambas as formas proporcionam uma função adequada do ciclo da ureia sob condições normais. A adição de fatores de stress metabólicos (tais como quimioterapia de dose elevada) serve para diminuir a eficiência da CPSI abaixo de um limiar eficaz. A análise dos dados sugere assim, que é mais provável que a HVOD ocorra em pacientes com o alelo de codificação de treonina do que naqueles de asparagina 0 alelo de codificação de treonina é partilhado pela forma de CPSI de roedor.

Exemplo de Referência 2

Alterações Bioquímicas e Genéticas na Carbamilo Fosfato Sintetase I em Paciente com Complicações após Transplante de Medula Óssea. 0 transplante de medula óssea (BMT) e os transplantes de células estaminais do sangue periférico (PBSCT) estão a ser crescentemente utilizados como uma terapêutica primária para malignidades selecionadas. A utilização do suporte de células estaminais para a reconstituição hematopoiética permite um aumento substancial na dose de quimioterapia numa tentativa de erradicar cancros potencialmente letais. Com melhorias na profilaxia da infeção e prevenção da doença incapacitante de enxerto contra hospedeiro, a disfunção orgânica induzida pela quimioterapia permanece uma barreira significativa à utilização mais generalizada deste tratamento. A doença hepática veno-oclusiva (HVOD), uma síndrome clínica de hiperbilirrubinemia (bilirrubina sérica > 2,0 mg/dl), hepatomegalia, e retenção de fluido imediatamente após BMT, é uma principal toxicidade após BMT limitante da dose, que afeta até 54% dos pacientes. Muitos pacientes que desenvolvem HVOD depois de BMT também cumprirão os critérios para lesão pulmonar aguda (ALI). Aproximadamente metade dos pacientes com HVOD grave necessitam de ventilação mecânica, com uma taxa de mortalidade de atendimento superior a 90%. Estes dados ressaltam o grande impacto sobre a mortalidade da disfunção orgânica sequencial, mesmo numa população de pacientes jovem, e reforçam a associação clinicamente importante do mau prognóstico depois de lesão pulmonar aguda em pacientes com disfunção hepática. Os mecanismos responsáveis por esta interação orgânica permanecem incompletamente compreendidos.

Neste Exemplo, foi analisado se quimioterapia condicionada administrada antes de BMT pode afetar as enzimas precoces no UC e predispor secundariamente os pacientes a disfunção hepática e falência orgânica múltipla. As análises de aminoácidos plasmáticos suportaram as noções tanto de função comprometida do UC como de produção reduzida de óxido nítrico (NOx) . À luz destas descobertas, os pacientes foram rastreados para o polimorfismo de nucleótido único (SNP) exónico em CPS-I divulgado no presente documento. Descobriu-se que a homozigosidade para o SNP estava associada com uma incidência reduzida de HVOD e sobrevivência precoce melhorada após BMT, consistente com uma interação farmacogenética significativa. Métodos

Recrutamento de Pacientes/Clínico: Ao longo dos últimos três anos 200 pacientes submetidos a BMT na Vanderbilt University Medical Center foram inscritos sequencialmente no Estudo de Lesão Pulmonar por Transplante de Medula Óssea Após Enxerto (BMT-LIFE), uma investigação exploratória clínico-bioquímica coordenada, destinada à compreensão dos mecanismos de lesão pulmonar aguda e falência orgânica múltipla após o transplante. As definições de falência orgânica e reversão foram prospectivamente definidas e os dados foram recolhidos simultaneamente durante a hospitalização e até 60 dias após o BMT. Os critérios de exclusão incluíram ativa virai e terapêutica de dose aumentada prévia com suporte de células estaminais hematopoiéticas (ou PBSCT ou BMT). A doença hepática veno-oclusiva (HVOD) foi identificada em pacientes com bilirrubina > 2 mg/dl antes de 21 dias após o transplante com ganho de peso > 5% a partir da avaliação inicial ou novo início de hepatomegalia moderada. A lesão pulmonar aguda (ALI) foi definida como infiltrados bilaterais na radiografia para três datas consecutivas com uma razão de pressão parcial de oxigénio no sangue arterial para a fração da concentração de oxigénio inspirada (Pa02/Fi02) inferior a 300 na ausência de disfunção cardíaca clínica. Pacientes vivos 60 dias após o transplante foram definidos como sobreviventes. Plasma, sedimentos de células circulantes e urina foram recolhidos aquando da inscrição no estudo (antes de receber quimioterapia) e no dia do BMT, vários dias depois de completar a quimioterapia de dose elevada, mas antes da infusão de medula. As amostras foram separadas em alíquotas e imediatamente colocadas em gelo antes do armazenamento a -80 °C antes da análise.

Análise de aminoácidos. A análise de aminoácidos foi realizada em amostras de plasma de criopreservadas dos dias -8 e 0 (pré-tratamento e dia do transplante) em 60 pacientes. As amostras dos pacientes foram inicialmente selecionadas aleatoriamente para estudos piloto; as amostras subsequentemente analisadas foram especificamente enriquecidas para incluir pacientes adicionais com o genótipo AA de SNP de CPS-I (ver abaixo) e pacientes adicionais com as complicações pós-BMT de HVOD e ALI. Um extrato isento de proteína de plasma foi preparado através da precipitação proteica com ácido sulfossalicílico e filtração através de um Acrodisc 4 de 0,45 pm (Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan).

Os aminoácidos foram separados por cromatografia de permuta catiónica utilizando um sistema de tampão de citrato de lítio de força iónica e de pH graduada de quatro componentes num analisador de aminoácidos Beckmann 7300 (Beckmann, Paio Alto, Califórnia). A derivatização após coluna dos aminoácidos com ninidrina permitiu a deteção de aminoácidos de amina primária a 570 nm, e aminas secundárias a 440 nm. A quantificação foi alcançada através da calibração instrumental com materiais de referência padrão (Sigma, St. Louis, Missouri). Citrulina, arginina e ornitina foram examinadas como índices mensuráveis de fluxo de intermediários através do ciclo da ureia.

Medição de metabolitos do óxido nítrico (NOx) plasmáticos. NOx plasmáticos foram medidos num subgrupo de pacientes utilizando reagentes de Griess modificados após as amostras terem sido desproteinizadas e incubadas com esferas de cádmio para converter nitrato em nitrito.

Deteção do polimorfismo T1405N. Os iniciadores oligonucleotídicos a partir de dentro do 36° exão (CGGAAGCCACATCAGACTGG (SEQ ID NO:15) e do intrão (GGAGAGT GAAAC T T GAC AAT CAT C (SEQ ID NO:16)) de CPS1 e a reação em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar de forma fiável um fragmento de 251 pb que abrange a região que contém a alteração de ADN genómico obtido a partir de preparações de camadas leucocitárias ou sedimento urinário Esta combinação de iniciadores forneceu uma amplificação reprodutível utilizando esferas de PCR Ready-to-Go (Pharmacia) e condições de ciclo de PCR conforme se seguem: 35 ciclos de 1 minuto de hibridização a 55 °C, 1 minuto de extensão a 72 °C e 1 minuto de desnaturação a 94 °C.

Após o tratamento com formamida, as amostras foram submetidas a eletroforese durante 4 horas a 4 °C num gel MDE não desnaturante (FMC, Rockland, Maine), em seguida coradas com nitrato de prata para detetar fragmentos de ADN. A genotipagem de confirmação de 17 indivíduos utilizando tanto eletroforese em gel não desnaturante como análise de sequência direta produziram resultados idênticos. Os pacientes foram classificados como tendo genótipos de SNP homozigotos de CC ou AA, ou como sendo heterozigotos (AC). Para comparação, utilizando métodos idênticos, uma coorte de 100 pacientes com doença de Alzheimer foi analisada para avaliar a distribuição de genótipos de SNP de CPSI.

Análise Estatística. Níveis de aminoácidos plasmáticos antes e depois da quimioterapia e níveis entre grupos de pacientes foram comparados utilizando o teste T de Student ou Teste da soma dos números de ordem de Wilcoxon (se os dados não foram distribuídos normalmente). A distribuição de genótipos de CPSI foi comparada entre os grupos por meio do cálculo das frequências alélicas para todo o grupo e pesquisando evidência de desequilíbrio de Hardy-Weinberg em subgrupos especificamente selecionados utilizando análise de P2. Avaliações de sensibilidade, especificidade, valores preditivos e risco relativo foram geradas a partir de tabelas de contingência dois-por-dois construídas utilizando valores de aminoácidos específicos em grupos de pacientes divididos por presença e ausência de resultados clínicos específicos (por exemplo HVOD, ALI e morte). RESULTADOS

Duzentos pacientes foram inscritos no estudo BMT-LIFE. 52% foram submetidos a transplante autólogo (idade média de 46±1 anos); 48% receberam enxertos alogénicos (idade média de 40±1 anos). Dos pacientes submetidos a transplantes alogénicos, 24% receberam enxertos a partir de dadores não aparentados correspondentes para HLA. Aproximadamente dois terços dos pacientes no grupo autólogo eram mulheres, refletindo o aumento da prevalência de cancro de mama nesta população. As indicações para o transplante foram diversas, mas 79% dos pacientes foram transplantados devido a cancro de mama, leucemia ou linfoma não-Hodgkin. Os diferentes regimes preparativos utilizados antes de BMT incluíram CTC (ciclofosfamida, tiotepa, carboplatina) , BuCy (bussulfano, ciclofosfamida), CVP16TBI (ciclofosfamida, etopósido, irradiação corporal total), CBVP16 (ciclofosfamida, bis-cloroetilnitrosoureia, etopósido) e TC (tiotepa, ciclofosfamida).

Tanto a morbilidade como a mortalidade não são incomuns após o BTM. Embora a mortalidade total em 60 dias no estudo tenha sido de 14%, ela foi de 20% em pacientes que receberam aloenxertos. Complicações de lesão pulmonar aguda (ALI) e doença hepática veno-oclusiva (HVOD) ocorreram cada em 19% dos pacientes. Estas complicações foram mais do que duas vezes mais comuns em pacientes que receberam aloenxertos. No grupo de pacientes que desenvolveram HVOD, 62% (24/38) também cumpriram os critérios para ALI durante a hospitalização. Apenas 38% (14/38) dos casos de ALI ocorreram em pacientes que nunca cumpriram critérios para HVOD.

Um subconjunto (60/200) dos pacientes, especificamente enriquecido durante a seleção de amostras com pacientes adicionais com genótipo AA de SNP de CPS-I e pacientes adicionais com complicações pós-transplante, tinham determinações de aminoácidos plasmáticos antes da administração de quimioterapia e no dia do transplante. A comparação dos níveis de aminoácidos selecionados que participam no UC (citrulina, ornitina e arginina) antes e depois da quimioterapia revelou diferenças significativas. Os níveis de citrulina caíram em praticamente todos os pacientes com uma diminuição média do grupo desde 23,4±1,3 μΜ até 9,1±0,7 μΜ (P <0,05). Os níveis de arginina aumentaram em aproximadamente 35% (P <0,05) e os níveis de ornitina aumentaram em 21% (P <0,05). A razão de ornitina/citrulina (razão O/C), um índice de fluxo através das etapas precoces do UC (isto é, valores mais baixos indicam melhor fluxo do ciclo), aumentou de 3,9±0,7 aquando da inscrição no estudo para 11,8±1,8 após a quimioterapia de indução (P <0,05). Desvios também ocorreram em aminoácidos que não fazem parte do UC. Os níveis de glicina e alanina, dois aminoácidos alifáticos, diminuíram significativamente em 11% e 19%, respetivamente, num padrão não consistente com a diminuição do fluxo de intermediários através do ciclo simplesmente devido a uma diminuição da ingestão de proteínas (aguda ou crónica). Os níveis de fenilalanina e metionina aumentaram em 43% e 23%, respetivamente, sugerindo disfunção hepática subclínica.

Os níveis plasmáticos basais de citrulina e as razões O/C tiveram importância prognóstica. Sobreviventes de sessenta dias do BMT tiveram níveis basais mais elevados de citrulina que tiveram os não sobreviventes (24,4±1,3 contra 17,7±2,9 μΜ, respetivamente; P <0,05). O risco relativo para a morte antes dos 60 dias após o BMT foi de 2,92 para os pacientes com um nível de citrulina na inscrição inferior a 20. O valor preditivo negativo para a morte de um nível de citrulina plasmática superior a 20 μΜ foi de 90%. As razões O/C aquando da inscrição foram significativamente menores em pacientes que nunca desenvolveram HVOD (2,8±0,2) nem ALI (2,9±0,2) quando comparados aos pacientes que posteriormente desenvolveram estas complicações (5,8±1,9 e 6,5±2,7, respetivamente; P <0,05 ) . A comparação de razões O/C entre sobreviventes e não sobreviventes de 60 dias de BMT aquando da inscrição no estudo mostrou uma tendência para valores menores nos sobreviventes (3,3±0,2 contra 6,9±3,9; P=0,06). O valor preditivo negativo para a morte num período de 60 dias após BMT associado com uma razão O/C basal inferior a 2,5 foi de 92%. Vários níveis intermediários de aminoácidos do ciclo da ureia após a terapêutica preparativa, no dia do BMT, também tiveram significância. Os níveis de arginina plasmáticos foram superiores nos sobreviventes (114,5 5,9 μΜ) quando comparados com os não sobreviventes (92,3±10,4 pm) (P <0,05). As razões O/C foram significativamente mais elevadas, sugerindo uma UCF mais comprometida, em pacientes que mais tarde desenvolveram ALI quando comparados com aqueles que nunca desenvolveram disfunção pulmonar grave (18,4±5,9 contra 9,5±0,7; P <0,05). Embora o valor preditivo negativo para o desenvolvimento de ALI de uma razão O/C pós-quimioterapia inferior a dez tenha sido elevado (86%), o risco relativo para a mortalidade associada com este limiar foi de apenas 1,44. Houve uma tendência de razões O/C mais elevadas em pacientes no dia do BMT em pacientes que posteriormente desenvolveram HVOD (P = 0, 09) .

Os níveis de metabolitos do óxido nítrico (NOx) no plasma foram medidos em 62 pacientes. Os níveis plasmáticos de NOx caíram 20% após a terapêutica de indução, desde 40±2 μΜ na inscrição no estudo para 32±2 μΜ no dia do BMT (P <0,05) . O valor de NOx mediano no dia do BMT em 20 pacientes que desenvolveram HVOD ou ALI foi de 28 μΜ; para pacientes sem estas complicações o NOx plasmático foi de 35 μΜ. Não foram observadas diferenças claras entre NOx plasmático quando os pacientes com genótipos diferentes de SNP de CPSI foram comparados.

Para avaliar se certos pacientes podem ter uma predisposição genética para desenvolver complicações mórbidas subsequentes à terapêutica de indução e BMT, todos os pacientes no estudo foram genotipados para um SNP de CPSI. De 200 pacientes, os dados foram analisados a partir de 196 pacientes (ou seja, 2 exclusões clínicas; 2 amplificações por PCR sem sucesso) para determinar se o SNP C4340A de CPS-I estava em equilíbrio de Hardy-Weinberg com

o desenvolvimento de HVOD. A distribuição de genótipos de SNP de CPSI em pacientes submetidos a BMT foi idêntica à do grupo de controlo (100 pacientes com doença de Alzheimer): 44% CC (tipo selvagem) , 45% CA (heterozigotos) e 11% AA (homozigotos para a transversão). A taxa de ataque de HVOD naqueles com o genótipo CC ou AC foi de 18% e 24%, respetivamente. Não existiram casos de HVOD em pacientes com o genótipo AA. A verificação de que esta distribuição alélica não estava em equilíbrio de Hardy-Weinburg com o desenvolvimento de HVOD (P2 = 5,06, P <0,05) sugere que o genótipo AA de SNP altera a suscetibilidade à toxicidade hepática subsequente à quimioterapia de indução. Existiram também tendências de diferenças na mortalidade 60 dias após BMT entre os genótipos de SNP. Os não sobreviventes constituíram 15% e 20% dos grupos de genótipo AC e CC, respetivamente. De forma interessante, todos os pacientes com o genótipo AA sobreviveram 60 dias após o BMT (P2 = 3,36; P = 0,06) . É de notar que, a quase totalidade da pontuação P2 é proveniente da célula sobrevivente/AA. Não existiram diferenças significativas entre os pacientes com genótipos C4340A SNP diferentes na taxa de ataque de ALI (16%, 15% e 25% nos grupos AA, AC e CC, respetivamente) .

Enquanto a ALI foi associada com mortalidade significativa em pacientes tanto com os genótipos AC ou CC (71% e 66%, respetivamente), todos os pacientes com o genótipo AA que desenvolveram ALI, eventualmente, tiveram resolução dos infiltrados pulmonares bilaterais em CXR e da troca de gases comprometida e sobreviveram 60 dias após o BMT. Discussão

Os dados apresentados neste Exemplo refletem uma estreita associação entre HVOD e ALI em pacientes após o BMT, com quase dois terços dos pacientes com critérios de cumprimento de HVOD para ALI. No presente estudo, 68% (26/38) dos pacientes que desenvolveram ALT necessitaram de ventilação mecânica. Rubenfelt e Crawford relataram uma sobrevivência significativa, definida como extubação seguida de alta hospitalar com trinta dias de sobrevivência, de apenas 6% em pacientes que necessitam de ventilação mecânica após BMT. Veja-se Rubenfeld, G.D. e Crawford, S.W., Annals of Internal Medicine (1996) 125: 625-33. A HVOD continua a ser a principal toxicidade limitante da dose da quimioterapia de dose aumentada. Caracteriza-se clinicamente pela retenção de fluidos, icterícia, ascite e aumento hepático doloroso ocorrendo dentro de 3 semanas após o BMT. Estudos de autópsias desses pacientes não sobreviventes que cumprem estes critérios clínicos fornecem confirmação histológica em >80% dos casos e são consistentes com a ideia de que a trombose local potenciada pode ser um evento iniciante na patogénese da HVOD. A queda significativa nos níveis de citrulina e aumento nos níveis de ornitina plasmáticos de pacientes submetidos a BMT sugere uma perturbação significativa no fluxo de intermediários de carbono através do UC hepático em pacientes após a quimioterapia de indução. A análise dos padrões de outros aminoácidos argumenta que este efeito não é simplesmente devido à diminuição da ingestão de proteínas. Em contraste com os padrões observados em pacientes com inanição, onde os níveis de glicina e aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA) são geralmente significativamente elevados, observou-se uma queda na glicina e nenhuma mudança significativa nos BCAAs. Além disso, a inanição tende a aumentar a atividade da CPSI no fígado e não deveria levar a aumentos da ornitina plasmática. A capacidade de pré-tratamento de pacientes submetidos a BMT para manter o fluxo de intermediários através do UC teve especial importância de prognóstico. Os não sobreviventes de sessenta dias após o BMT e aqueles pacientes que desenvolveram HVOD ou ALI tinham níveis significativamente mais baixos de citrulina e razões 0/C superiores em comparação com os pacientes que não desenvolveram essas complicações. De interesse foi a observação de que os não sobreviventes de BMT tinham valores de arginina plasmáticos mais baixos após a terapia de indução, quando comparados com pacientes sobreviventes. À luz da aglomeração de células que contêm enzimas do UC precoces nas vénulas hepáticas terminais, as concentrações locais de ambos arginina e óxido nítrico (NO) podem ser muito maiores e podem desempenhar um papel importante na manutenção do desimpedimento destes vasos e na regulação do fluxo sanguíneo hepático regional. Os estudos que mostram uma redução significativa nos níveis de NOx plasmático após quimioterapia de indução apoiam a ideia de que a produção de NO é alterada durante o BMT. A discrepância aparente entre os níveis plasmáticos de arginina aparentemente normais no dia do transplante e NOx plasmático marcadamente reduzido ressalta a complexa cinética in vivo do fluxo de arginina e citrulina através de diferentes leitos orgânicos. Estudos de isótopos estáveis da homeostasia da arginina corporal total indicaram que apenas cerca de 15% da renovação da arginina plasmática está associado com a formação de ureia, e que apenas 1,2% da renovação da arginina plasmática está associado com a formação de NO. Além disso, estudos in vitro documentaram um direcionamento substancial de intermediários do ciclo de ureia, de citrulina a arginina, que não é influenciado pela provisão exógena de substrato. A capacidade de um paciente individual para manter a função do ciclo da ureia e produção hepática de NO durante os fatores de stress da quimioterapia de indução pode, em parte, influenciar sua resistência a complicações após o BMT.

Uma vez que não existe disparidade de géneros na ocorrência de HVOD, os inventores concentraram-se em potenciais problemas farmacogenéticos relacionados com CPSI, um gene codificado autossomicamente, em vez de no gene de ornitina transcarbamilase ligada a X. Enquanto se caracterizavam as alterações moleculares subjacentes às causas de deficiência em CPSI neonatal e de inicio tardio, um SNP comum perto da extremidade 3' do ARNm de CPSI (heterozigosidade de 0,44) foi identificado. Esta transversão C4340A codifica uma substituição prevista de asparagina (AAC) para treonina (ACC) no aminoácido 1405 (T1405N). Esta treonina está dentro do domínio alostérico, precedendo a sequência PV(A/S)WP (T/S) (A/Q)E importante na ligação de um cofator, n-acetil-glutamato (NAG), que aumenta a atividade enzimática. Embora os solicitantes não desejem estar ligados por qualquer teoria particular de operação, especula-se que, com base no precedente dos efeitos de outros xenobióticos, que a disponibilidade limitada de NAG após aumento de doses de quimioterapia é um dos mecanismos que promove a disfunção do ciclo da ureia. No entanto, parece ser que a presença do genótipo AA SNP de CPS-I está associado com a proteção contra o desenvolvimento de HVOD, resolução de ALI se ocorre, e sobrevivência de 60 dias melhorada após BMT. Assim, os dados sugerem que a alteração na função do UC desempenha um papel na modificação da interação fígado-pulmão durante a sépsis e lesão pulmonar aguda.

Em resumo, este Exemplo documenta um comprometimento significativo na função hepática do UC em pacientes que recebem quimioterapia de dose aumentada antes do BMT. Pacientes com uma desorganização mais grave na função do ciclo têm maior probabilidade de desenvolver complicações mórbidas depois do BMT. Adicionalmente, uma associação significativa entre um SNP C4340A de CPS-I e ambas complicações pós-BMT e sobrevivência a curto prazo foi identificada. Tais dados são úteis na avaliação do risco para pacientes submetidos a BMT e proporcionam uma razão para tentativas terapêuticas para suportar a função do UC durante a quimioterapia de dose elevada.

Exemplo 1

Terapêutica de Suplementação de Arginina/Citrulina A diminuição adicionada nos produtos do ciclo da ureia (arginina e citrulina) e aumento nos precursores (amónia, glutamina, etc.) resultando do polimorfismo contribuem para a toxicidade associada ao BMT. Como parte do Estudo BMT Life, os níveis de arginina e citrulina foram medidos em 10 pacientes submetidos a BMT. A quimioterapia de dose elevada utilizada no BMT perturba as funções normais das enzimas do ciclo da ureia e contribui para a ocorrência de, ou toxicidade associada com HVOD. Para avaliar adicionalmente esta informação, uma análise de plasma armazenado a partir de dez pacientes submetidos a BMT antes do tratamento e depois da conclusão da quimioterapia de indução foi realizada. Os perfis de aminoácidos foram determinados a partir de todas as amostras. Foi prestada atenção particular aos intermediários do ciclo da ureia citrulina, arginina, e ornitina. Conforme mostrado no Quadro 4, uma diminuição marcada nos níveis de citrulina de todos os pacientes a partir de uma média basal pré-tratamento de 24±3 pmol/l para uma média pós-tratamento de 8±1 pmol/l (P <0,001). Os níveis de arginina plasmática caíram desde uma média de 91±6 pmol/l para 70±6 pmol/l (P <0,05), apesar da utilização de nutrição parentérica contendo arginina em vários pacientes:

Quadro 4

Aminoácido Pré-Quimio. Pós-Quimio. Valor de P citrulina 24±3 μΜ 8±1 μΜ <0,001 arginina 91±6 μΜ > 70±6 μΜ 0,03 A queda na citrulina e arginina foi semelhante em pacientes que receberam e que não receberam nutrição parentérica total e foi a mesma em indivíduos do sexo masculino e do sexo feminino. As diminuições na citrulina sugerem que existe uma diminuição no fluxo através das primeiras etapas do ciclo da ureia (Figura 1).

Assim, de acordo com a presente invenção, é proporcionado um método para redução da toxicidade e/ou da ocorrência de HVOD num paciente submetido a BMT. Este método compreende a administração ao paciente de BMT de arginina e/ou citrulina, com a citrulina sendo preferível, numa quantidade eficaz para reforçar a síntese de arginina e NO no paciente. 0 reforço da síntese de arginina e NO no paciente reduz e/ou previne substancialmente a ocorrência de HVOD associada com BMT. A citrulina é um agente de suplementação preferido uma vez que é mais prontamente convertida em NO.

Exemplo de Referência 3

Construção de um Clone de Expressão de CPSI de Comprimento Completo Funcional

Depois de se tentarem uma série de estratégias, um clone de expressão de ADNc de CPSI humana contendo a totalidade da região de codificação foi construído. As Figuras 6 e 7 apresentam diagramas esquemáticos que ilustram o método utilizado para construir o clone de expressão. Este clone foi completamente sequenciado e não contém quaisquer alterações em relação à sequência de CPSI de consenso que foi caracterizada na técnica. A capacidade do clone para produzir proteína CPSI foi testada em células COS-7. As células COS-7 foram escolhidas pela sua falta de atividade ou produção de CPSI nativa. Uma análise de transferência de Western das células COS-7 transfetadas com a construção f1CPSI-PCDNA3.1 foi preparada. Extratos de células HepG2 foram utilizadas como um controlo uma vez que estas células derivadas do fígado retêm a atividade de CPSI. Células COS-7 não transfetadas foram utilizadas como um controlo negativo. Ao contrário das células COS-7 não transfetadas, as células HepG2 e COS-7-flCPSI demonstraram a banda de 160 kDa esperada utilizando um anticorpo de coelho anti-CPSI de rato. Adicionalmente, um ensaio colorimétrico foi realizado para detetar a produção de carbamilo fosfato a partir de amónia. Conforme mostrado graficamente na Fig. 8, as células transfetadas demonstraram uma atividade semelhante às células HepG2 enquanto as células COS-7 não transfetadas não. A mutagénese sítio dirigida foi realizada inserto de CPSI contendo T1405 e uma cópia com o codão polimórfico N1405 foi criada. O codão polimórfico N1405 foi sequenciado no seu comprimento completo e nenhumas outras alterações foram detetadas. O sistema QuikChange (Stratagene), que tira partido da metilação introduzida no ADN por bactérias hospedeira, foi utilizado para preparar esta construção.

Estas construções são utilizadas para proporcionar um fornecimento constante de proteína CPSI recombinante conforme codificada por ambos os alelos, (T1405, N1405) utilizando células COS e as respetivas construções de CPSI/PC DNA 3.1 como um sistema de expressão. CPSI enzimaticamente ativa foi produzida utilizando este sistema, conforme mostrado pelo gráfico na Fig. 8.

Um componente destas experiências consiste em determinar o efeito in vitro do polimorfismo T1405N na função de CPSI. Conforme discutido nos Exemplos de Referência 1 e 2, esta alteração afeta a sensibilidade da enzima para concentrações de NAG. O rastreio de 20 indivíduos para a alteração de C para A mostrou uma taxa de heterozigosidade de 50% com 25% do grupo homozigótico AA. Isto sugere que uma porção significativa da população geral tem uma potencial anormalidade qualitativa na função de CPSI. Esta anormalidade, enquanto é silenciosa sob condições normais, é desmascarada por condições de stress e toxinas tais como quimioterapia de dose elevada ou administração de ácido valproico. A comparação dos produtos proteicos é depois realizada em estádios. 0 primeiro estágio examina as caracteristicas físicas do ARNm e proteína expressos. Utilizando o inserto flCPSI como uma sonda, transferências de Northern de mensageiro preparado a partir das linhas celulares COS-7 expressando são sondados. Controlos positivos incluem mensageiro hepático humano e HepG2. Os controlos negativos foram células COS-7 transfetadas com pcDNA3.1 de cassete vazia. 0 mensageiro derivado de flCPSI expresso é algo menor do que a CPSI nativa (4,9 kb contra 5,7 kb) uma vez que o clone não contém a região não traduzida 3' de 1 kb.

Utilizando os mesmos controlos, análises de transferência de Western de lisados celulares por SDS-PAGE são realizadas. A coloração de azul de Comassie é utilizada para examinar a produção de proteína total. Para a deteção de CPSI específica, um anticorpo policlonal de coelho anti-CPSI de rato é utilizado. Este anticorpo deteta a CPSI expressa a partir de células COS-7 bem como as amostras de controlo. Finalmente, alterações na estrutura da proteína são determinadas através do exame do padrão de mobilidade através de eletroforese 2-D, uma ferramenta útil para a deteção de alterações conformacionais. Quaisquer alterações grandes na conformação explicam provavelmente a alteração na função da CPSI para essa mutação. 0 próximo estádio envolve a medição das caracteristicas funcionais das enzimas expressas. Um ensaio colorimétrico sensível foi modificado para este propósito (Pierson, D. L., J. Biochem. Biophis. Methods, 3:31-37 (1980)). O ensaio modificado permite 4-5 análises a partir de 20-50 mg de tecido ou células. O tecido é primeiramente homogeneizado em KC1 a 0,45 M. Moléculas pequenas, incluindo ATP e NAG, são removidas através de uma coluna SEPHADEX G25 (Boehringer). A mistura de reação contém bicarbonato de amónio, ATP, DTT de magnésio, n- acetilglutamato (NAG), e trietanolamina. A concentração de qualquer reagente pode ser variada, e as experiências sobre as células HepG2 mostram atividade diminuída tanto com concentrações altas como baixas de NAG (0,50 mM) . A ausência de NAG em experiências de expressão de células COS-7 não produz uma atividade enzimática mensurável.

Uma vez que a CPSI é uma enzima alostérica, ela não segue a cinética de Michaelis-Menton sob concentrações variadas de NAG; no entanto, quando a quantidade de NAG é fixa, a produção de carbamilo fosfato é estável. Conforme mostrado na Fig. 8, a produção de carbamilo fosfatase é medida através da adição de hidroxilamina à solução depois da incubação a 37 °C durante períodos de tempo variados (0, 5, 10, 20, 25, 30 minutos). Esta etapa, levada a cabo a 95 °C, também serve para inativar a enzima e impedir a produção adicional de carbamilo fosfato. A hidroxilamina converte a carbamilo fosfato em hidroxiureia que é subsequentemente tratada com uma solução de ácido acético/sulfúrico com butanodiona para derivar um composto com pico de absorção a 458 nm. A reação é depois girada a 12.000 X g durante 15 minutos para remover a proteína precipitada. A seguir, a absorvância a 458 nm é medida para cada reação. A atividade tipicamente começa a reduzir depois de 20-30 minutos de reação.

Um número de sedimentos celulares de expressão são agrupados para análise. Para assegurar que as medições de atividade são baseadas em quantidades consistentes de enzima, a CPSI expressa é quantificada por análise de transferência Western da amostra agrupada utilizando um anticorpo de CPSI tal como o anticorpo de coelho anti-CPSI de rato descrito no presente documento acima. A atividade basal é primeiramente determinada utilizando quantidades fixas de substrato e cofator e uma análise de curso de tempo. Quantidades variadas de bicarbonato de amónia, ATP, e NAG são depois utilizadas para determinar a eficácia de ligação para estes elementos. Estes elementos variam de 0 a 10 vezes a quantidade normal. A atividade enzimática é também medida depois do tratamento térmico do produto homogeneizado. As experiências de marcação de proteínas (pulse-chase) são realizadas para determinar a estabilidade da proteína ao longo do tempo. A expressão estável da proteína de CPSI é obtida utilizando o método conforme descrito acima. O estabelecimento de linhagens de células transfectadas estáveis permite a produção de quantidades suficientes de ambas as variedades de CPSI para levar a cabo esses estudos. Em estudos de atividade, são observadas alterações na atividade do tipo N1405 quando comparado ao T1405 da CPSI. Uma alteração na atividade enzimática sob concentrações variadas de NAG também é observada. Esses resultados sustentam o papel desse polimorfismo na presente invenção na predição de suscetibilidade para a função sub-ótima do ciclo da ureia e hiperamonemia e a produção diminuída de arginina associada à mesma.

Exemplo de referência 4

Relação do Polimorfismo T1405N e Intermediários do Ciclo da Ureia com a Elevação de Amónia Observada em Pacientes com Terapêutica com Ácido Valproico O ácido valproico (VPA) é uma medicação comumente utilizada em convulsão, particularmente para o tratamento de convulsão de ausência ou como uma terapêutica adjuvante de outros distúrbios de convulsão. A toxicidade oriunda de tratamento com VPA é um processo complexo e multivariado e provavelmente reflete várias ruturas metabólicas. A hiperamonemia e esteatose e necrose microvesicular hepática são as complicações médicas graves mais comumente reportadas.

Embora o desenvolvimento de hiperamonemia tóxica envolva apenas um pequeno número de pacientes, ela traz morbidez e mortalidade significativas e várias mortes têm sido atribuídas a essa complicação. 0 desenvolvimento de hiperamonemia assintomática (nível de amónia no plasma maior do que 60 pmol/L) ocorre dentro de uma hora de administração de VPA e é, contudo, relativamente comum.

Mecanismos de Hiperamonemia induzida por VPA. Os mecanismos pelos quais o VPA causa hiperamonemia têm sido objeto de algum debate e uma série de diferentes teorias atualmente têm suporte na técnica. Um modelo renal propõe que a alteração no metabolismo de glutamina resulta numa carga de amónia aumentada ao fígado, enquanto a maioria das outras se concentra sobre os diferentes aspetos da função do ciclo da ureia. Veja, por exemplo, Warter et al, Revue Neurologique, 139: 753-757 (1983) . Uma vez que o ciclo da ureia é o principal mecanismo para a remoção de amónia em seres humanos, acredita-se que a hiperamonemia se origina, de alguma forma, das interações inibitórias do VPA e/ou seus metabólitos com a função e capacidade do ciclo da ureia.

Evidência para disfunção do ciclo da ureia em terapêutica com VPA se origina de uma série de observações experimentais e clínicas além das elevações de amónia no plasma descritas acima. Por exemplo, Marrini et al mediram uma redução na atividade de CPSI tanto na linha de base como estimulada em animais não nefrectomizados após uma carga de aminoácido e VPA (Marrini et al, Neurology 38: 365-371 (1988)). Marrini et al também observaram que ratos nefrectomizados injetados com uma carga de aminoácido e VPA também desenvolveram hiperamonemia. Outro grupo, Castro-Gago et al, mediu os aminoácidos no soro em 22 crianças epiléticas tratadas com VPA e descobriram uma redução no ácido aspártico e ornitina, implicando numa diminuição na eficácia do ciclo da ureia ao invés de um aumento nos precursores (Castro-Gago et al, Childs Neurons System 6: 434-436 (1990)).

Significância da Carbamilo fosfato sintetase I. Os mecanismos de défices no ciclo da ureia induzidos por VPA envolvem, tipicamente, a carbamilo fosfato sintetase mitocondrial (CPSI). Descobriu-se que um paciente com toxicidade grave após overdose de VPA tinha 50% da atividade normal de CPSI (Bourrier et al, Prese Medicale 17: 2063-2066 (1988)). Os requerentes observaram vários pacientes com deficiência branda de CPSI que deterioram quando ácido valproico era fornecido, com reversão imediata após descontinuação.

Papel do NAG. N-acet il-glutamato (NGA) é um cofator alostérico requerido para CPSI. NAGA é sintetizada a partir de glutamato e acetil CoA nas mitocôndrias, com uma distribuição celular que espelha aquela da CPSI (Shigesada et al, Journal of Biological Chemistry 246: 5588- 5595 (1971)). Ela é sintetizada a partir de glutamato (do catabolismo de aminoácido) e acetil CoA. Existem várias formas pelas quais uma alteração na disponibilidade de NAG é considerada como reduzindo a atividade da CPSI. Deficiências genéticas na sintetase de NAG foram observadas e essa enzima é conhecida por ser competitivamente inibida por substratos alternativos, tais como propionil CoA ou succinato (Bachmann et al, New England Journal of Medicine 304: 543 (1981); Kamoun et al, Lancet 48 (1987); Coude et al, J. Clin. Invest. 64: 1544- 1551 (1979); Rabier et al, Biochem. e Biophys. Research Comm. 91: 456-460 (1979); Rabier et al, Biochimie 68: 639-647 (1986)). Foi mostrado experimentalmente que a CPSI é inibida de uma maneira competitiva pela presença de quantidades aumentadas de propionil CoA e que a terapêutica com VPA causa um aumento na concentração de propionato no sangue (Coulter et al, Lancet 1 (8181): 1310-1311 (1980); Gruskay et al, Ped. Res. 15: 475 (1981); Schmidt, R. D., Clin. Chim. Acta. 74:39-42 (1977)).Também foi mostrado que a exposição ao VPA diminui as concentrações de NAG em hepatócitos intactos, através de diminuições nas concentrações de acetil CoA e glutamina (Coude et al, Biochem. J. 216: 233-236 (1983)). A diminuição na concentração de glutamina é atribuída à inibição de piruvato desidrogenase e piruvato carboxilase.

Alternativamente, foi sugerido que a privação de acetil CoA mitocondrial ocorre porque a CoA é divergida, quando de terapêutica com VPA, para o fabrico de valproil CoA (Becker et al, Archives of Biochemistry & Biophysics 223: 381-392 (1983)). É bem sabido que o VPA também rompe a p-oxidação de ácido gordo, com resultante diminuição da acetil CoA (Eadie et al, Med. Toxicol. 3: 85-106 (1998)). Todos esses mecanismos poderiam levar a uma diminuição no NAG, uma vez que ele é sintetizado pela acetil CoA. Dado os efeitos do VPA sobre a disponibilidade de NAG, segue que qualquer alteração nas propriedades de ligação da CPSI ao NAG afetaria sua atividade.

Assim, esse Exemplo apresenta experimentação para determinar a correlação entre a presença ou ausência do polimorfismo do assunto presentemente divulgado no gene de polimorfismo com a suscetibilidade à hiperamonemia utilizando VPA como um agente modelo para a produção de hiperamonemia. Inicialmente, ADN genómico é isolado de pacientes que estão começando terapêutica com ácido valproico para genotipagem do polimorfismo T1405N de acordo com os métodos descritos aqui, tal como amplificação por PCR e uso de géis de não-desnaturação. Após genotipagem desses pacientes, determinação de aminoácidos e amónia pré-e pós-tratamento é realizada para esses pacientes. Particularmente, o ADN é isolado de sangue íntegro utilizando o kit QIAmpJ (Qiagen) descrito no Exemplo de referência 1.

Em seguida, a concentração total de VPA no plasma é determinada através de uma técnica de imunoensaio enzima-mediada (EMITJ Syva-Behring, San Jose, Califórnia num analisador Syva 30RJ). Essa técnica utiliza ligação competitiva por sítios de ligação de anticorpo ao VPA entre o VPA no plasma do paciente e aquele em complexo com a enzima G6PDH. A libertação do complexo VPA-enzima do anticorpo reativa a enzima e sua atividade é avaliada pela taxa de formação de NADH quando de adição do substrato. A produção de NADH é monitorizada via espectroscopia a 340 nanômetros (nm) . O VPA livre (não ligado à proteína) é isolado do plasma utilizando um dispositivo de filtro com micro-partição centrífugo com um corte de 3000 Daltons (CENTRIFREE, Amicon, Beverley, Massachusetts). A concentração de VPA no ultra-filtrado do plasma é medida conforme descrito para o VPA total.

Os dados colhidos de pacientes com VPA são analisados para correlações entre o genótipo e o fenótipo.

Adicionalmente, o fracionamento de VPA livre e conjugado é comparado para avaliar os efeitos sobre a produção e disponibilidade do NGA. A última comparação é preparada dado que existem efeitos conhecidos do VPA sobre a disponibilidade de NGA. Por exemplo, foi mostrado que a exposição ao VPA diminui as concentrações de NAG em hepatócitos intactos através de diminuição das concentrações de acetil CoA e_ glutamina. Veja Coude et al, Biochem. J., 216: 233-236 (1983). Assim, essa comparação reflete que alterações nas propriedades de ligação da CPSI ao NAG afetam a atividade da CPSI.

Exemplo de referência 5

Deteção de Polimorfismos Adicionais na CPSI

Utilizando técnicas desenvolvidas para análise por mutação da mensagem de CPSI, 10 pacientes não deficientes de CPSI são selecionados com relação a polimorfismos adicionais na região de codificação. Isso é feito utilizando transcritos "ilegítimos" de linhagens de células linfoblastoides e de fibroblasto. Polimorfismos com um efeito difundido sobre a população seriam evidentes numa amostra desse tamanho. Conforme é utilizado no presente documento e nas reivindicações, o termo "polimorfismo" refere-se à ocorrência de duas ou mais sequências ou alelos alternativos geneticamente determinados numa população. Um marcador polimórfico é o locus no qual a divergência ocorre. Marcadores exemplificativos têm pelo menos dois alelos, cada um ocorrendo numa frequência de mais de 1%. Um locus polimórfico pode ser tão pequeno quanto um par de base. Marcadores polimórficos proporcionados, assim, incluem polimorfismos na extensão do fragmento de restrição, número variável de repetições aleatórias (VNTR's), regiões hipervariáveis, minissatélites, repetições de dinucleótido e repetições de tetra-nucleótido.

Uma série de técnicas de deteção por "mutação" foram realizadas, todas as quais são baseadas em alterações detetáveis na mobilidade do ADN fita simples não desnaturado, conforme descrito por Summar, M., J. Inherited Metabolic Disease 21: 30-39 (1998). Exemplos de mutações de CPSI identificadas por essas técnicas são divulgados na Fig. 3. Em virtude do grande tamanho da mensagem da CPSI (cerca de 5.700 bases), um método para rastrear uma grande quantidade de ADN em algumas reações pode ser empregue. A caracterização de perfil por endonuclease de restrição (REF) proporciona a seleção de grandes fragmentos de ADN, de até cerca de 2.000 pb, com excelente sensibilidade.

Reações com transcriptase reversa (RT) são realizadas utilizando 1 g de ARN total e um iniciador de oligo-dT ou um iniciador antisentido a partir do ponto mediano da mensagem de CPSI. Utilizando o produto de RT como um modelo, reações de PCR são realizadas com 4 conjuntos de iniciadores diferentes, criando 4 fragmentos de sobreposição abrangendo a região de codificação de 4.600 bases. Reações de PCR de controlo são realizadas com cada conjunto de experiências, para assegurar que o modelo contaminante não é amplificado. ADN genómico não é preferido para esse estudo em virtude do tamanho do gene (80.000+ pb) , do número de intrões (36) e pelo fato de o sequenciamento dos limites intrão-exão para a CPSI não terem sido completados. Contudo, localizações intrónicas são caracterizadas graficamente na Fig. 9.

Os 4 produtos de RT/PCR de sobreposição descritos acima são usados para seleção por mutação. A análise cuidadosa dos mapas de restrição levou à seleção de três enzimas de restrição para cada fragmento, as quais clivam os mesmos em pedaços oscilando de 100-250 pb. Fragmentos desse tamanho são ideais para análise de polimorfismo conformacional em cadeia simples (SSCP). As enzimas são selecionadas de modo que cada fragmento possa ser avaliado uniformemente através de sua extensão.

Antes de digestão, os produtos de PCR são purificados através de eletroforese em gel e isolamento das lâminas de agarose. Após 3 horas, os fragmentos digeridos são precipitados com etanol. Esses fragmentos são separados num gel de poliacrilamida de não desnaturação a 6% a 4 °C operando em uma constante de 35 watts. Essas condições maximizam a deteção de alterações conformacionais nos fragmentos cadeia simples, conforme descrito por Liu, Q. e Sommer, S. S., Biotechniques 18(3): 470-477 (1995). A deteção de ADN é feita através de coloração com prata e os géis são classificados com relação aos desvios na mobilidade. Baseado na localização de qualquer fragmento desviado, a análise direta de sequência do produto de RT/PCR é realizada utilizando um protocolo de ciclo-sequenciamento. Para eliminar a possibilidade de uma mutação resultante de erros na Taq polimerase, um produto de RT fresco é amplificado e sequenciado em cada caso. As 4.600 bases inteiras da mensagem de codificação são rapidamente selecionadas desse modo. Quaisquer regiões contendo áreas não claras são sequenciadas, buscando alterações na sequência esperada.

Os produtos de digestão por restrição de cada fragmento de RT/PCR são isolados. Esses fragmentos individuais são, então, executados contra a digestão combinada num gel de não desnaturação, conforme descrito acima. Através de caracterização do padrão de fragmentos dessa forma, as porções da mensagem de CPSI envolvidos em quaisquer desvios de mobilidade observados são prontamente identificados.

Polimorfismos detetados nessas experiências são genotipifiçados contra o painel de pais no Centre d'Etude Polymorphsim Humanise (CEPH) para estabelecer a frequência. Todas as alterações são examinadas com relação a seu efeito sobre a utilização de codão e aqueles resultando em mutações antisentido são examinadas utilizando os dados de caracterização de CPSI descritos aqui.

As técnicas descritas no Exemplo 3 foram utilizadas para expressar mutantes sitio-dirigidos contendo essas alterações. Utilizando esse sistema, os efeitos in vitro das alterações sobre a produção e atividade de CPSI são observados.

Um polimorfismo T344A foi deteção na CPSI. Iniciadores de oligonucleótido foram usados a partir do 10° exão (UI119:tactgctcagaatcatggc - SEQ ID NO:17) e intrão (LI10+37: tcatcaccaactgaacagg - SEQ ID NO:18) para amplificar um fragmento de 91 pb contendo a alteração. As condições do ciclo de PCR foram: 35 ciclos de 1 minuto de hibridização a 59°C, 1 minuto de extensão a 72°C e 1 minuto de desnaturação a 94°C. Os pacientes foram classificados como tendo os genótipos de SNP homozigóticos de AA ou TT ou como sendo heterozigóticos (AT) . A distribuição na população de adultos desse polimorfismo é de 35% AA, 44% AT e 21% TT.

Um polimorfismo 118-CTT também foi detetado na CPSI. Iniciadores de oligonucleótido foram usados a partir da região não traduzida 5' (U5'-74: ggttaagagaaggaggagctg -SEQ ID NO:19) e intrão (L175: aaccagtcttcagtgtcctca - SEQ ID NO:20) para amplificar um fragmento de 249 pb contendo a alteração. As condições do ciclo de PCR foram: 35 ciclos de 1 minuto de hibridização a 59°C e 1 minuto de desnaturação a 94°C. Os pacientes foram classificados como tendo um genótipo homozigótico com a inserção ou deleção do trinucleótido 118 ou como sendo heterozigóticos. A distribuição na população de adultos desse polimorfismo é de 34% CTT-, 43% heterozigóticos e 23% CTT+.

Exemplo de referência 6

Alterações Bioquímicas e Genéticas na Carbamilo fosfato sintetase em Pacientes Neonatais com Hipertensão Pulmonar Persistente

Esse Exemplo investiga o papel da limitação da produção de NO endógeno na patogénese de hipertensão pulmonar persistente (PPHN) no neonato doente. 0 NO endógeno é o produto do intermediário do ciclo da ureia arginina. A produção de arginina depende da enzima que limita a taxa do ciclo da ureia, carbamilo fosfato sintetase (CPSI). Recém-nascidos possuem menos de metade da função do ciclo da ureia normal, tornando os mesmos particularmente suscetíveis às alterações mínimas na forma e função da enzima. Um polimorfismo exónico comum (T1405N) na CPSI foi observado, o qual afeta o fluxo através da primeira etapa do ciclo da ureia.

Nesse Exemplo, foi testado se recém-nascidos que desenvolveram PPHN teriam níveis menores de precursores de NO (arginina e citrulina) do que controlos equivalentes. Se pacientes com PPHN tinham predominantemente os genótipos de CPSI CC (treonina/treonina) ou AC (asparagina/treonina) os quais estão associados a uma menor função do que o genótipo de CPSI AA (asparagina/asparagina) também foi analisado. Métodos. Quarenta e sete neonatos > 2 kg, >35 semanas e <72 _horas de idade foram admitidos na Unidade de Tratamento Intensivo Neonatal do Vanderbilt com (n = 22) e sem (n = 25) hipertensão pulmonar ecocardiograficamente documentada foram arrolados. Medições de importância clínica da gravidade da dificuldade respiratória foram registadas. Os níveis de amónia e perfis de aminoácidos no plasma foram obtidos. Os genótipos foram determinados passando o ADN amplificado por PCR sobre géis de não desnaturação MDE.

Resultados. Pacientes que desenvolveram PPHN tinham um nível médio de arginina de 21,5 pmol/l, enquanto aqueles que não tinham em média 38,3 ymol/l (P = 0, 0004) . Os níveis médios de citrulina eram de 6,1 pmol/l e 10,3 pmol/1, respetivamente (P = 0,02). Os níveis de arginina e citrulina estavam inversamente correlacionados com a gravidade da hipoxemia, conforme medido pelo índice de oxigenação, dias de ventilação mecânica e dias requerendo suplemento com O2. A análise do genótipo de pacientes com PPHN com relação ao T1405N mostrou 5CCs, 17ACs, e OAAs, enquanto os controlos tinham 7CCs, 16ACs, e 2AAs (Pi-quadrado P = 0,005 utilizando a frequência de alelos esperada na população) . Bebés com o genótipo CC tinham níveis médios menores de arginina e citrulina (21,5 pmol/1 e 5,8 pmol/l) do que bebés com o genótipo AA (31,5 pmol/1 e 13,5 pmol/l), consistente com uma diferença funcional entre as duas formas da enzima.

Conclusões. Esse Exemplo mostra que o desenvolvimento de PPHN em recém-nascidos doentes está associado à disponibilidade inadequada dos intermediários do ciclo da ureia, arginina e citrulina. O polimorfismo T1405N no ADN da CPSI leva à função enzimática diminuída e, subsequentemente, níveis menores de precursores de NO.

Discussão. A carbamilo fosfato sintetase (CPS I) catalisa a etapa de terminação de taxa no ciclo da ureia, desse modo, determinando os níveis teciduais dos intermediários do ciclo da ureia, incluindo arginina e citrulina. Conforme divulgado aqui, um polimorfismo exónico de C para A amplamente distribuído no gene da CPSI altera uma treonina conservada para uma asparagina na posição 1405 próximo do domínio crítico de ligação de N-acetil-glutamato. Os dados mostraram que a versão contendo asparagina de CPSI mostra cinética mais eficaz em estudos de função enzimática. O alelo T1405N exibe 50% de heterozigosidade e parece ser uma variante silenciosa em adultos saudáveis normais. Contudo, as consequências da alteração qualitativa podem ser disfarçadas por condições estressantes. Conforme divulgado nos Exemplos de referência 1 e 2 e exemplo 1, em adultos expostos à quimioterapia em alta dose quando de preparo para transplante de medula óssea essa enzima contendo treonina produz níveis inadequados de arginina e citrulina e está associada a uma incidência aumentada de doença veno- oclusiva hepática, lesão pulmonar aguda e morte. Uma vez que o óxido nítrico (NO) é gerado em células endoteliais a partir de L-arginina pela sintase de óxido nítrico (NOS), níveis diminuídos de intermediários do ciclo da ureia poderiam predispor a perturbações no tônus vascular através de limitação da produção de NO endógeno.

No estudo com grupo prospetivo desse Exemplo, a possibilidade de que um processo similar pudesse estar envolvido na patogénese de hipertensão pulmonar persistente do neonato (PPHN) foi investigada. O NO endogenamente produzido funciona na regulação de resistência vascular pulmonar e na transição da circulação fetal para neonatal. Lipsitz, E. C., et al, J Pediatr Surg (1996) 31: 137-140; Abman, S.H., et al Am J Physiol (1990) 259: H1921-H1927. Entre 20 semanas de gestação e nascimento, a produção e função de CPSI são menores do que 50% dos níveis num adulto. Essa deficiência fisiológica poderia disfarçar o efeito da mutação genética T1405N, particularmente se associada a outros estresses neonatais que afetam a função hepática; por exemplo, asfixia ou sepsia.

Pacientes elegíveis para esse estudo incluíam neonatos nascidos a aproximadamente 35 semanas de gestação e 2 kg de peso ao nascer que foram admitidos na unidade de tratamento intensivo neonatal (NICU) do Vanderbilt University Medical Center entre 1 de Julho de 1999 e 29 de Fevereiro de 2000 por sintomas de dificuldade respiratória. Os bebés com anomalias congénitas múltiplas, sindromes genéticas conhecidas e causas anatômicas de hipertensão pulmonar (hérnia diafragmática congénita, sindrome de Potter, distrofia torácica asfixiante, etc.) foram excluídos. O consentimento dos pais foi obtido para todos os arrolados. 3 cc de sangue de cinquenta e um neonatos foram colhidos nas primeiras 72 horas de vida para perfis de aminoácidos no plasma, níveis de amónia e BUN, determinação de metabólitos de ácido nítrico e genotipagem de CPSI. Sangue foi coletado antes de transfusão de sangue, captação entérica ou parentérica de proteína, administração de óxido nítrico inalado ou canulação com ECMO.

Os dados colhidos quando de arrolamento incluíam (1) características de linha de base (peso ao nascer, idade gestacional, raça, escores de Apgar, diagnóstico primário, quaisquer complicações pulmonares e a idade pós-natal no momento em que o sangue foi colhido) e (2) medidas de suporte reparatório (Fi02, MAP, iNO, ECMO) e resposta clínica (ABGs, duração de ventilação mecânica e suplemento com 02, sobrevivência). O índice máximo de oxigenação (01 = F1O2 x MAP/ Pa02] foi utilizado como uma medida da gravidade de dificuldade respiratória. Os diagnósticos primários predominantes incluíam (1) asfixia ao nascer: escore de Apgar a 5 minutos <5 com acidose misturada no primeiro ABG ou gás no sangue do cordão mais evidência ou disfunção neurológica e outra lesão de órgãos terminais, (2) sindrome de dificuldade respiratória (RDS): sintomas clínicos de dificuldade respiratória com campos pulmonares de padrão de vidro moído e broncogramas de ar quando de raio X do peito mais hipercapnia/hipoxia combinada quando de ABG (Nota: dada a idade gestacional desses neonatos, bebés com esse quadro poderiam ter deficiência de surfactante ou pneumonia congénita; contudo, em nenhum caso havia uma cultura de aspirado traqueal positivo obtido) e (3) sindrome de aspiração de mecônio (MAS): história de coloração de mecônio ao parto mais sintomas clínicos de dificuldade respiratória, hipoxemia e infiltrados espessos quando de raio X do peito.

Os bebés foram definidos como tendo hipertensão pulmonar (PPHN) se eles desenvolvessem hipoxemia significativa (Pa02 < 100 sob 100% de 02 > 6 horas) com anatomia intracardíaca normal e evidência ecocardiográfica de pressão arterial pulmonar elevada. A última foi definida como (1) fluxo ductal do forâmen bidirecional ou da direita para a esquerda ou (2) pressão arterial pulmonar elevada (> 35 mmHg) baseado em estimativa por Doppler do jato de regurgitação da tricúspide conforme lido por uma terceira parte às cegas. A análise de aminoácidos foi realizada sobre amostras de plasma fresco em 47 pacientes. Um extrato isento de proteína de plasma foi preparado através de precipitação da proteína com ácido sulfo-salicílico e filtração através de um filtro Acrodisc de 0,45 pm (Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan). Os aminoácidos foram separados através de cromatografia por de permuta catiónica utilizando um sistema tampão de citrato de lítio com resistência iónica e pH graduados com quatro componentes sobre um analisador de aminoácidos Beckmann 7300 (Beckmann, Palo Alto, Califórnia). Derivatização de aminoácidos pós-coluna com niidrina permitiu a deteção de aminoácidos de amina primária a 570 nm e de aminas secundárias a 44 0 nm. Quantificação foi obtida através de calibração do instrumento com materiais de referência padrões (Sigma, St. Louis, Missouri). Citrulina e arginina foram detetadas como índices mensuráveis de fluxo de intermediários através do ciclo da ureia.

Medição de metabólitos de óxido nítrico no plasma (N0X) . N0X no plasma foi medido utilizando reagentes de Griess modificados após as amostras terem sido desproteinizadas e incubadas com glóbulos de cádmio para converter o nitrato em nitrito.

Deteção de SNP. Iniciadores de oligonucleótido de dentro do 36° exão (U4295 - SEQ ID N0:15) e intrão (LI36 -SEQ ID NO: 16) da CPSI e a reação em cadeia de polimerase (PCR) para amplificar confiavelmente um fragmento de 251 pb abrangendo a região contendo a alteração do ADN genómico obtida de preparados de sangue íntegro. Essa combinação de iniciadores proporciona amplificação reproduzível utilizando Taq polimerase (Promega) e condições de ciclo de PCR como segue: 35 ciclos de 1 minuto de hibridização a 67 °C, 1 minuto de extensão a 72 °C e 1 minuto de desnaturação a 94 °C. Após tratamento com formamida, as amostras foram submetidas à eletroforese durante 5 horas a 4 °C num gel de não-desnaturação MDE™ (FMC, Rockland, Maine), então, coradas com nitrato de prata para detetar os fragmentos de ADN. Os pacientes foram classificados como homozigóticos para os genótipos de SNP CC ou AA ou como sendo heterozigóticos (AC). A genotipagem utilizando eletroforese em gel de não-desnaturação e análise direta de sequência proporcionaram resultados idênticos àqueles discutidos acima. Assim, a distribuição na população de adultos do polimorfismo T1405N foi determinada como sendo: 45% CC, 44% AC e 11% AA.

Uma técnica idêntica àquela descrita acima foi utilizada para detetor o polimorfismo T344A. Iniciadores de oligonucleótido foram utilizados a partir do 10° exão (UI119:tactgctcagaatcatggc - SEQ ID NO:17) e intrão (LI10+37: tcatcaccaactgaacagg - SEQ ID NO:18) para amplificar um fragmento de 91 pb contendo a alteração. As condições do ciclo de PCR foram: 3 5 ciclos de 1 minuto de hibridização a 59 °C, 1 minuto de extensão a 72 °C e 1 minuto de desnaturação a 94 °C. Os pacientes foram classificados como tendo genótipos de SNP homozigóticos de AA ou TT ou como sendo heterozigóticos (AT). A distribuição na população de adultos desse polimorfismo é de 35% AA, 44% AT e 21% TT.

Uma técnica idêntica àquela descrita acima foi utilizada para detetor o polimorfismo 118-CCT. Iniciadores de oligonucleótido foram utilizados a partir da região não traduzida 5' (U5'-74: ggttaagagaaggaggagctg - SEQ ID NO:19) e intrão (L175: aaccagtcttcagtgtcctca - SEQ ID NO:20) para amplificar um fragmento de 249 pb contendo a alteração. As condições do ciclo de PCR foram: 3 5 ciclos de 1 minuto de hibridização a 59°C, 1 minuto de extensão a 72°C e 1 minuto de desnaturação a 94°C. Os pacientes foram classificados como tendo um genótipo homozigótico com a inserção ou deleção do trinucleótido 118 ou como sendo heterozigóticos. A distribuição na população de adultos desse polimorfismo é de 34% de CTT-, 43% de heterozigóticos e 23% de CCT+.

Os níveis de amónia e aminoácido no plasma foram comparados entre os grupos de pacientes utilizando teste t de Student. As distribuições de genótipos de CPSI foram comparadas através dos grupos calculando a frequência alélica para o grupo todo e buscando evidência de desequilíbrio de Hardy-Weinberg em subgrupos especificamente selecionados utilizando análise por Pi ao Quadrado. Dos 51 neonatos originalmente arrolados, 25 desenvolveram PPHN, enquanto 26 não. Não existiam diferenças estatisticamente significativas nas características de linha de base dos dois grupos incluindo peso ao nascer, idade gestacional, raça ou idade pós-natal em horas dos bebés ao arrolamento. Contudo, havia uma leve predominância de homens no grupo de controlo. A distribuição de diagnósticos primários estava uniformemente distribuída. No grupo com PPHN, 5 bebés tinham asfixia ao nascer, 9 bebés tinham RDS, 5 bebés tinham síndrome de aspiração de mecónio e 6 bebés tinham outros diagnósticos, incluindo 4 bebés com PPHN primário. No grupo de controlo, 4 bebés tinham asfixia ao nascer, 8 bebés tinham RDS, 3 bebés tinham MAS e 11 bebés tinham outros diagnósticos. Os outros diagnósticos incluíam taquicardia supra ventricular, anemia, trauma ao nascer e sépsis virai. Nenhum bebé no estudo teve uma cultura de sangue bactéria-positiva.

Conforme esperado, bebés que tinham PPHN complicaram a sua patologia primária desenvolveram enfermidade mais grave do que os controlos em alguns critérios clínicos. Oito dos bebés com PPHN requereram tratamento com NO inalado (iNO), 2 requereram ECMO e 2 morreram (um bebé com asfixia e falência orgânica múltipla tomando iNO; outro bebé com displasia capilar alveolar foi retirado de ECMO). Obviamente, nenhum dos controles foi tratado com iNO ou ECMO; e não houve mortalidade no grupo de controlo.

Três bebés no grupo com PPHN foram excluídos da análise. Verificou-se que o bebé tendo displasia capilar alveolar quando de biópsia do pulmão foi considerado como tendo uma etiologia anatômica para hipertensão pulmonar. Outro bebé foi erroneamente arrolado com uma hérnia diafragmática congénita e o terceiro foi arrolado a 119 horas de idade após TPN ter sido iniciada. Um bebé no grupo de controlo foi excluído da análise após a análise de cariótipo revelar a etiologia dessa hipotonia como sendo síndrome de Prader-Willi.

Os bebés que desenvolveram PPHN tinham níveis significativamente menores de arginina e citrulina no soro quando de análise de aminoácido. 0 nível médio de arginina em casos de PPHN era de 21,5 + 9,2 pmol/l, enquanto o nível médio de arginina do grupo de controlo era de 38,3 + 18,4 pmol/1 (p = 0, 0004) . O nível médio de citrulina em casos de PPHN era de 6,1 + 3,6 pmol/l comparado a 10,3 + 7 pmol/l no grupo de controlo (p = 0,02) . Não existiam diferenças significativas nos níveis de outros aminoácidos entre os dois grupos, incluindo glutamina, glicina, alanina, lisina, valina, ornitina e leucina. O nível de aminoácidos essenciais total (TEAA) era ligeiramente menor nos casos de PPHN, cerca de 537 pmol/1 versus cerca de 654 pmol/l, mas essa diferença não era estatisticamente significativa (p = 0,08) . Por peso ao nascer, idade gestacional ou número de horas de vida pós-natal. Verificou-se que o nível de TEAA era significativamente maior nos quatro bebés cujo sangue foi colhido antes de seis horas de idade (cerca de 1021,5 pmol/l vs. cerca de 542 pmol/l, p = 0,0026) . Presume-se que essa diferença reflita o cessar recente do influxo de proteína parentérica nesses bebés a partir da circulação placentária.

Nenhuma diferença nos níveis de arginina e citrulina foi encontrada quando as categorias de diagnóstico primário de asfixia, RDS, MAS e "outras" foram separadamente analisadas. Em cada grupo, bebés com hipertensão pulmonar tendiam a ter valores menores, mas os resultados não eram estatisticamente significativos, dado o pequeno número de bebés em cada grupo. Por exemplo, bebés com asfixia" com PPHN tinham um nível médio de arginina de cerca de 18,5 pmol/l comparado a cerca de 52,7 pmol/l em controlos com asfixia (p = 0,06) e um nível médio de citrulina de cerca de 6,8 pmol/l comparado a cerca de 14,3 pmol/l (p = 0,04) .

Existia uma relação inversa entre os níveis de arginina e citrulina no soro e a gravidade de hipoxemia. Os valores de arginina e citrulina caíram progressivamente à medida que o índice de oxigenação aumentava, os dias de ventilação mecânica aumentavam e os dias requerendo oxigénio suplementar aumentavam, com o peso ao nascer, idade gestacional ou número de horas de vida pós-natal. Os níveis de NH3 em bebés com PPHN tendiam a ser ligeiramente maiores do que em controlos (54 + 18,1 pmol/l vs. 45,6 + 12 ymol/l), mas esses valores não eram estatisticamente significativos (p = 0,08).

Quando de análise do genótipo T1405N da CPSI, dos 22 bebés que desenvolveram PPHN, 5 eram CC e 17 eram AC. Não existiam AAs nos casos de PPHN. Nos 25 controles, existiam 7 CCs, 16 ACs e 2 AAs. Essas distribuições de genótipos foram, então, comparadas calculando-se a frequência alélica esperada para o grupo todo, revelando evidência de desequilíbrio de Hardy-Weinberg no grupo com PPHN. Quando de análise por Pi ao Quadrado, esses dois grupos eram significativamente diferentes um do outro, com um p-valor = 0,005. Dos dois bebés com o genótipo AA, um bebé tinha RDS, enquanto o outro sofria de asfixia ao nascer. Nenhum bebé obteve uma 01 > 15; ambos estiveram < 1 semana no ventilador e < 10 dias sob oxigénio.

Bebés com o genótipo CC tinham níveis médios de arginina de 21,9 ± 7 ymol/l e níveis de citrulina de 5T8 + 1,8 pmol/l, enquanto bebés com o genótipo AA tinham um nível médio de arginina de 31,5 + 3,5 pmol/l e um nível médio de citrulina de 13,5 + 6,4 ymol/l. Novamente, dado o pequeno número de AAs, esses dados tinham dificuldade de atingir a significância estatística com valores de p de 0,1 e 0,006, respetivamente.

REFERÊNCIAS

As referências listadas abaixo, bem como todas as referências citadas na memória descritiva suplementam, explicam, proporcionam antecedentes para, ou ensinam metodologia, técnicas e/ou composições empregues no presente documento.

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Será compreendido que vários detalhes da invenção podem ser alterados sem se afastar do âmbito da invenção. Além disso, a descrição anterior é para o propósito ilustrativo apenas, e não para o propósito de limitação da invenção estando a invenção definida pelas reivindicações. É descrito no presente documento o seguinte (não de acordo com a presente invenção): 1. Um método de rastreio para a suscetibilidade a função subótima do ciclo da ureia num sujeito, o método compreendendo as etapas de: (a) obter uma amostra de ácido nucleico a partir do sujeito; e (b) detetar um polimorfismo de um gene de carbamilo fosfato sintase I (CPSI) na amostra de ácido nucleico a partir do sujeito, a presença do polimorfismo indicando a suscetibilidade do sujeito para uma função subótima do ciclo da ureia. 2. 0 método da forma de realização 1, em que a suscetibilidade do sujeito a uma função subótima do ciclo da ureia é adicionalmente caracterizada como uma suscetibilidade à hiperamoniemia ou diminuição da produção de arginina 3. 0 método da forma de realização 1, em que o polimorfismo do polipéptido de carbamilo fosfatase

sintase I compreende uma transversão de C para A dentro do exão 36 de CPSI 4. 0 método da forma de realização 3, em que o polimorfismo do polipéptido de carbamilo fosfatase sintase I compreende uma transversão de C para A no nucleótido 4340 de um ADNc que corresponde ao gene CPSI . 5. 0 método da forma de realização 4, em que a transversão de C para A no nucleótido 4340 do ADNc que corresponde ao gene CPSI compreende adicionalmente uma alteração no código de tripleto de AAC para ACC, que codifica um polipéptido de CPSI tendo uma fração de treonina no aminoácido 1405. 6. O método da forma de realização 1, em que o polimorfismo é detetado através da amplificação de um ácido nucleico alvo na amostra de ácido nucleico a partir do sujeito utilizando uma técnica de amplificação. 7. O método da forma de realização 6, em que o polimorfismo é detetado através da amplificação de um ácido nucleico alvo na amostra de ácido nucleico a partir do sujeito utilizando um par de oligonucleótidos, em que um primeiro oligonucleótido do par hibridiza com uma primeira porção do gene CPSI, em que a primeira porção inclui o polimorfismo do gene CPSI, e em que o segundo do par de oligonucleót idos hibridiza com uma segunda porção do gene CPSI que é adjacente à primeira porção. 8. O método da forma de realização 5, em que a primeira porção do gene CPSI inclui o exão 36. 9. O método da forma de realização 8, em que a primeira porção do gene CPSI inclui o nucleótido 4340 de um ADNc que corresponde ao gene CPSI. 10. O método da forma de realização 7, em que o primeiro e segundo oligonucleótidos compreendem cada um marcador detetável, e em que o marcador do primeiro oligonucleótido é distinguível do marcador do segundo oligonucleótido. 11. O método da forma de realização 10, em que o dito marcador do dito primeiro oligonucleótido é um radiomarcador, e em que o dito marcador do dito segundo oligonucleótido é um marcador de biotina. 12. 0 método da forma de realização 1, em que o polimorfismo é detetado através da sequenciação de um ácido nucleico alvo na amostra de ácido nucleico a partir do sujeito. 13. 0 método da forma de realização 12, em que a sequenciação compreende sequenciação didesoxi. 14. 0 método da forma de realização 1, em que a etapa de deteção do polimorfismo é detetada através do contacto de um ácido nucleico alvo com a amostra de ácido nucleico a partir do sujeito com um reagente que deteta a presença do polimorfismo de CPSI e deteção do reagente. 15. 0 método da forma de realização 14, em que o reagente deteta uma transversão de C para A dentro do exão 36 de CPSI. 16. 0 método da forma de realização 15, em que o reagente deteta uma transversão de C para A no nucleótido 4340 de um ADNc que corresponde ao gene CPSI. 17. O método da forma de realização 2, em que a hiperamoniemia é adicionalmente descrita como hiperamoniemia associada com exposição do sujeito a uma toxina. 18. O método da forma de realização 17, em que a exposição do sujeito a uma toxina compreende adicionalmente a exposição a álcool, exposição a medicação, terapêutica de transplante de medula óssea, terapêutica com ácido valproico ou combinações das mesmas. 19. O método da forma de realização 1, em que o sujeito é um sujeito humano. 20. Um método de rastreio para a suscetibilidade à toxicidade por transplante de medula óssea num candidato para um transplante de medula óssea, o método compreendendo as etapas de: (a) obter uma amostra de ácido nucleico a partir do candidato; e (b) detetar um polimorfismo de um gene de carbamilo fosfato sintase I (CPSI) na amostra de ácido nucleico a partir do candidato, a presença do polimorfismo indicando que a suscetibilidade do candidato para a toxicidade por transplante de medula óssea. 21. 0 método da forma de realização 20, em que o polimorfismo do polipéptido de carbamilo fosfatase

sintase I compreende uma transversão de C para A

dentro do exão 36 de CPSI 22. O método da forma de realização 21, em que o polimorfismo do polipéptido de carbamilo fosfatase sintase I compreende uma transversão de C para A no nucleótido 4340 de um ADNc que corresponde ao gene CPSI. 23. O método da forma de realização 22, em que a transversão de C para A no nucleótido 4340 do ADNc que corresponde ao gene CPSI compreende adicionalmente uma alteração no código de tripleto de AAC para ACC, que codifica um polipéptido de CPSI tendo uma fração de treonina no aminoácido 1405. 24. O método da forma de realização 20, em que o polimorfismo é detetado através da amplificação de um ácido nucleico alvo na amostra de ácido nucleico a partir do sujeito utilizando uma técnica de amplificação. 25. O método da forma de realização 24, em que o polimorfismo é detetado através da amplificação de um ácido nucleico alvo na amostra de ácido nucleico a partir do sujeito utilizando um par de oligonucleótidos, em que um primeiro oligonucleótido do par hibridiza com uma primeira porção do gene CPSI, em que a primeira porção inclui o polimorfismo do gene CPSI, e em que o segundo do par de oligonucleót idos hibridiza com uma segunda porção do gene CPSI que é adjacente à primeira porção. 26. 0 método da forma de realização 26, em que a primeira porção do gene CPSI inclui o exão 36. 27. 0 método da forma de realização 26, em que a primeira porção do gene CPSI inclui o nucleótido 4340 de um ADNc que corresponde ao gene CPSI. 28. O método da forma de realização 25, em que o primeiro e segundo oligonucleótidos compreendem cada um marcador detetável, e em que o marcador do primeiro oligonucleótido é distinguível do marcador do segundo oligonucleótido. 29. O método da forma de realização 28, em que o dito marcador do dito primeiro oligonucleótido é um radiomarcador, e em que o dito marcador do dito segundo oligonucleótido é um marcador de biotina. 30. O método da forma de realização 20, em que o polimorfismo é detetado através da sequenciação de um ácido nucleico alvo na amostra de ácido nucleico a partir do sujeito. 31. O método da forma de realização 20, em que a sequenciação compreende sequenciação didesoxi. 32. O método da forma de realização 20, em que a etapa de deteção do polimorfismo é detetada através do contacto de um ácido nucleico alvo com a amostra de ácido nucleico a partir do sujeito com um reagente que deteta a presença do polimorfismo de CPSI e deteção do reagente. 33. O método da forma de realização 32, em que o reagente deteta uma transversão de C para A dentro do exão 36 de CPSI. 34. O método da forma de realização 33, em que o reagente deteta uma transversão de C para A no nucleótido 4340 de um ADNc que corresponde ao gene CPSI. 35. O método da forma de realização 20, em que a toxicidade por transplante de medula óssea é doença hepática veno-oclusiva. 36. O método da forma de realização 20, em que o candidato é um candidato humano. 37. Um par de oligonucleótidos, em que um primeiro oligonucleótido do par hibridiza com uma primeira porção do gene CPSI, em que a primeira porção inclui o polimorfismo do gene CPSI, e em que o segundo do par de oligonucleótidos hibridiza com uma segunda porção do gene CPSI que é adjacente à primeira porção. 38. O par de oligonucleótidos da forma de realização 37, em que a primeira porção do gene CPSI inclui o exão 36. 39. O par de oligonucleótidos da forma de realização 38, em que a primeira porção do gene CPSI inclui o nucleótido 4340 de um ADNc que corresponde ao gene CPSI. 40. O par de oligonucleótidos da forma de realização 37, em que os ditos primeiro e segundo oligonucleótidos compreendem cada um marcador detetável, e em que o dito marcador do dito primeiro oligonucleótido é distinguível do dito marcador do dito segundo oligonucleótido. 41. O par de oligonucleótidos da forma de realização 40, em que o dito marcador do dito primeiro oligonucleót ido é um radiomarcador, e em que o dito marcador do dito segundo oligonucleótido é um marcador de biotina. 42. Um conjunto de iniciadores oligonucleotídicos que compreendem um iniciador antisentido e um iniciador de sentido, em que o dito conjunto de iniciadores oligonucleotídicos é adequado para amplificação de uma porção do gene CPSI, em que a porção inclui um polimorfismo do gene CPSI. 43. 0 conjunto de oligonucleótidos da forma de realização 42, em que a porção do gene CPSI inclui o exão 36. 44. 0 conjunto de oligonucleótidos da forma de realização 43, em que a primeira porção do gene CPSI inclui o nucleótido 4340 de um ADNc que corresponde ao gene CPSI. 45. O conjunto de iniciadores oligonucleotidicos da forma de realização 42, em que o dito iniciador anti-sentido tem uma sequência de nucleótidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10; e em que o dito iniciador de sentido tem uma sequência de nucleótidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8 . 46. Um kit para deteção de um polimorfismo num gene que codifica a carbamilo fosfatase sintase I (CPSI) num sujeito, o kit que compreende: (a) um reagente para deteção da presença de um polimorfismo do gene CPSI numa amostra de ácido nucleico a partir do sujeito; e (b) um recipiente para o reagente. 47. O kit da forma de realização 46, em que o reagente para deteção da presença do polimorfismo do gene CPSI compreende um reagente que deteta uma transversão de C para A dentro do exão 36 de CPSI. 48. O kit da forma de realização 47, em que o reagente para deteção da presença do polimorfismo do gene CPSI compreende um reagente que deteta uma transversão de C para A no nucleótido 4340 de um ADNc que corresponde ao gene CPSI. 49. O kit da forma de realização 46, que compreende adicionalmente meios para amplificação de uma molécula de ácido nucleico contendo um polimorfismo do gene CPSI. 50. O kit da forma de realização 49, em que os meios de amplificação incluem uma enzima polimerase adequada para utilização numa reação em cadeia da polimerase e um par de oligonucleótidos. 51. O kit da forma de realização 46, em que um primeiro oligonucleótido do par de oligonucleótidos hibridiza com uma primeira porção do gene CPSI, em que a primeira porção inclui o polimorfismo do gene CPSI, e em que o segundo do par de oligonucleótidos hibridiza com uma segunda porção do gene CPSI que é adjacente à primeira porção. 52. O kit da forma de realização 51, em que a primeira porção do gene CPSI inclui o exão 36. 53. O kit da forma de realização 52, em que a primeira porção do gene CPSI inclui o nucleótido 4340 de um ADNc que corresponde ao gene CPSI. 54. O kit da forma de realização 46, que compreende adicionalmente meios para extração de uma amostra de ácido nucleico a partir de uma amostra biológica obtida a partir de um sujeito. 55. Um polipéptido de carbamilo fosfatase sintetase I (CPSI) humana biologicamente ativo, purificado e isolado tendo uma transversão de treonina para asparagina num domínio alostérico do polipéptido. 56. O polipéptido da forma de realização 55, adicionalmente caracterizado como um polipéptido recombinante. 57. O polipéptido da forma de realização 55, em que o polipéptido de carbamilo fosfatase sintetase compreende um aminoácido conforme essencialmente estabelecido em qualquer de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO:14. 58. O polipéptido da forma de realização 55, modificado para estar numa forma marcada de forma detetável. 59. Um anticorpo isolado e purificado capaz de se ligar preferencialmente ao polipéptido da forma de realização 55. 60. O anticorpo da forma de realização 59, adicionalmente caracterizado como um anticorpo monoclonal ou como um anticorpo policlonal. 61. Uma linha celular de hibridoma que produz o anticorpo monoclonal da reivindicação 60. 62. Uma molécula de ácido nucleico isolada e purificada, que codifica um polipéptido de carbamilo fosfatase sintase I humana (CPSI) biologicamente ativo, purificado e isolado tendo uma transversão de treonina para asparagina num domínio alostérico do polipéptido. 63. A molécula de ácido nucleico da forma de realização 62, caracterizada adicionalmente como um ADNc isolado e purificado correspondendo a um gene CPSI nativo e como tendo uma transversão de C para A no nucleótido 4340 que altera aí um codão de ACC para AAC. 64. A molécula de ácido nucleico da forma de realização 63, em que o polipéptido de CPSI codificado compreende um aminoácido conforme essencialmente estabelecido em qualquer de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO:14. 65. A molécula de ácido nucleico da forma de realização 64, definida adicionalmente como compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a CPSI conforme essencialmente estabelecido em qualquer de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO:13. 66. A molécula de ácido nucleico da forma de realização 65, caracterizada adicionalmente como uma molécula de ácido nucleico isolada selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma molécula de ácido nucleico isolada que hibridiza com uma sequência de aminoácidos conforme essencialmente estabelecido em qualquer de SEQ ID NO:1, SEQ ID N0:11 e SEQ ID N0:13 sob condições de restringência de lavagem representadas por uma solução de lavagem tendo cerca de 200 mM de concentração salina e uma temperatura de lavagem de pelo menos cerca de 45 °C, e que codifica um polipéptido de CPSI; e (b) uma molécula de ácido nucleico isolada que difere da molécula de ácido nucleico isolada de (a) acima na sequência de nucleótidos devido à degeneração do código genético, e que codifica um polipéptido de CPSI codificado pela molécula de ácido nucleico isolada de (a) acima. 67. A molécula de ácido nucleico da forma de realização 62, definida adicionalmente como uma molécula de ADN. 68. A molécula de ácido nucleico da forma de realização 62, em que um segmento de codificação de CSPI da mesma está posicionado sob o controlo de um promotor. 69. A molécula de ácido nucleico da forma de realização 62, que compreende adicionalmente um vetor recombinante. 70. A molécula de ácido nucleico da forma de realização 69, em que o vetor é um vetor de expressão recombinante. 71. Uma célula hospedeira recombinante que compreende a molécula de ácido nucleico da reivindicação 62. 72. A célula hospedeira recombinante da forma de realização 71, em que a célula hospedeira é uma célula procariótica ou é uma célula eucariótica. 73. Um método de preparação de um polipéptido de carbamilo fosfato sintetase I, que compreende: transformar uma célula com a molécula de ácido nucleico da reivindicação 62 para produzir um polipéptido de carbamilo fosfato sintetase I sob condições adequadas para a expressão do dito polipéptido. 74. Um método de deteção numa amostra de um ARN que codifica o polipéptido de carbamilo fosfato sintetase I codificado pelo ácido nucleico da reivindicação 62, o dito método compreendendo as etapas de: (a) contactar a dita amostra sob condições de hibridização com a molécula de ácido nucleico da forma de realização 62 para formar um duplex; e (b) detetar a presença do dito duplex. 75. Um método de deteção de uma molécula de ADN que codifica um polipéptido de carbamilo fosfato sintetase I, o método compreendendo as etapas de: (a) hibridizar moléculas de ADN com a molécula de ácido nucleico da forma de realização 62 para formar um duplex; e (b) detetar o duplex. 76. Um método de produção de um anticorpo imunorreativo com um polipéptido de carbamilo fosfato sintetase I, o método compreendendo as etapas de: (a) transfetar uma célula hospedeira recombinante com a molécula de ácido nucleico da forma de realização 62, que codifica um polipéptido de carbamilo fosfato sintetase I; (b) cultivar a célula hospedeira sob condições suficientes para a expressão do polipéptido; (c) recuperar o polipéptido; e (d) preparar o anticorpo para o polipéptido. 77. 0 método da forma de realização 76, em que o polipéptido compreende um aminoácido conforme essencialmente estabelecido em qualquer de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:12 e SEQ ID NO:14. 78. O método da forma de realização 76, em que a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de ácidos nucleicos conforme essencialmente estabelecido em qualquer de SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO:13. 79. Um anticorpo produzido pelo método da forma de realização 76. 80. Um método de deteção de um polipéptido de carbamilo fosfato sintetase, o método compreendendo as etapas de: (a) imunorreagir o polipéptido com um anticorpo preparado de acordo com o método da forma de realização 76 para formar um conjugado de anticorpo-polipéptido; e (b) detetar o conjugado. 81. Um kit de ensaio para a deteção da presença de um polipéptido de carbamilo fosfato sintetase I numa amostra biológica, o kit compreendendo um primeiro recipiente que contém um primeiro anticorpo capaz de imunorreagir com um polipéptido de carbamilo fosfato sintetase I da forma de realização, 55, em que o primeiro anticorpo está presente numa quantidade suficiente para realizar pelo menos um ensaio. 82. O kit de ensaio da forma de realização 81, que compreende adicionalmente um segundo recipiente que contém um segundo anticorpo que imunorreage com o primeiro anticorpo. 83. O kit de ensaio da forma de realização 81, em que o primeiro anticorpo e o segundo anticorpo compreendem anticorpos monoclonais. 84. O kit de ensaio da forma de realização 81, em que o primeiro anticorpo está afixado a um suporte sólido. 85. O kit de ensaio da forma de realização 81, em que o primeiro e segundo anticorpos compreendem cada um um indicador. 86. 0 kit de ensaio da forma de realização 85, em que o indicador é um marcador radioativo ou uma enzima. 87. Um kit de ensaio para deteção da presença, numa amostra biológica, de um anticorpo imunorreativo com um polipéptido de carbamilo fosfato sintetase I, o kit compreendendo um primeiro recipiente que contém um polipéptido de carbamilo fosfato sintetase I da forma de realização, 55 que imunorreage com o anticorpo, com o polipéptido presente numa quantidade suficiente para realizar pelo menos um ensaio. 88. Um kit de ensaio para deteção da presença, em amostras biológicas, de uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipéptido de carbamilo fosfato sintetase I, o kit que compreendendo um primeiro recipiente que contém uma molécula de ácido nucleico idêntica ou complementar a uma molécula de pelo menos dez bases nucleotidicas contíguas da molécula de ácido nucleico da forma de realização 62. 89. Um animal não humano transgénico tendo incorporado no seu genoma uma molécula de ácido nucleico da forma de realização 88, o segmento de ácido nucleico estando presente no dito genoma num número de cópias eficaz para conferir expressão no animal de um polipéptido de CPSI. 90. O animal não humano transgénico da forma de realização 89, em que a expressão do polipéptido de CPSI é conferida no tecido hepático do animal. 91. Um método para potenciar o metabolismo da amónia num sujeito vertebrado, o método compreendendo a introdução num tecido no dito sujeito vertebrado, associado com o metabolismo da amónia, de uma construção que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um produto de gene CPSI ligado operativamente a um promotor, em que a produção do produto de gene CPSI resulta no metabolismo potenciado da amónia. 92. 0 método da forma de realização 91, em que a construção compreende adicionalmente um vetor selecionado a partir do grupo que consiste num vetor plasmidico ou um vetor virai. 93. 0 método da forma de realização 92, em que a construção compreende adicionalmente um complexo de lipossoma. 94. 0 método da forma de realização 91, em que o produto de gene CPSI compreende uma proteína que tem uma sequência de aminoácidos conforme essencialmente estabelecido em qualquer de SEQ ID N0:2, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO:14. 95. 0 método da forma de realização 91, em que a sequência de ácidos nucleicos é selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma sequência de ácido de ADN conforme

essencialmente estabelecido em qualquer de SEQ ID NO: 1, SEQ ID N0:11 e SEQ ID N0:13 ou as suas cadeias complementares;

(b) uma sequência de ADN que hibridiza com uma sequência de ácidos nucleicos conforme essencialmente estabelecido em qualquer de SEQ ID NO:1, SEQ ID N0:11 e SEQ ID N0:13 sob condições de restringência de lavagem representadas por uma solução de lavagem tendo cerca de 200 mM de concentração salina e uma temperatura de lavagem de pelo menos cerca de 45 °C, e que codifica um polipéptido de CPSI; e (c) uma sequência de ADN que difere de uma molécula de ácido nucleico isolada de (a) ou (b) acima devido à degeneração do código genético, e que codifica um polipéptido de CPSI codificado pela molécula de ácido nucleico isolada de (a) ou (b) acima. 96. Um método de tratamento ou prevenção da função subótima do ciclo da ureia num sujeito, o método compreendendo administrar, a um sujeito em necessidade da mesma, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um precursor do óxido nítrico, através da qual o tratamento ou prevenção da função subótima do ciclo da ureia é alcançada. 97. 0 método da forma de realização 96, em que a função subótima do ciclo da ureia compreende adicionalmente hiperamoniemia ou produção de arginida diminuída. 98. 0 método da forma de realização 96, em que o sujeito sofre de um distúrbio associado com função subótima do ciclo da ureia ou em que o sujeito está exposto ou em vias de ser exposto a um estimulo ambiental associado com a função subótima do ciclo da ureia. 99. 0 método da forma de realização 98, em que o distúrbio é selecionado a partir do grupo que consiste em hepatite, esclerose, hipertensão pulmonar, toxicidade por transplante de medula óssea num sujeito submetido a transplante de medula óssea e combinações das mesmas. 100. O método da forma de realização 98, em que o estímulo ambiental é selecionado a partir do grupo que consiste em quimioterapia, cirurgia cardíaca, stress oxidativo aumentado, transplante de medula óssea, e combinações dos mesmos. 101. O método da forma de realização 96, em que o precursor do óxido nítrico é selecionado a partir do grupo que consiste em citrulina, arginina e combinações das mesmas. 102. O método da forma de realização 96, em que o precursor do óxido nítrico é administrado numa dose que varia desde cerca de 0,01 mg até cerca de 1.000 mg. 103. O método da forma de realização 102, em que o precursor do óxido nítrico é administrado numa dose que varia desde cerca de 0,5 mg até cerca de 500 mg. 104. O método da forma de realização 103, em que o precursor do óxido nítrico é administrado numa dose que varia desde cerca de 1,0 mg até cerca de 250 mg. 105. O método da forma de realização 96, em que o sujeito é um ser humano. 106. O método da forma de realização 96, que compreende adicionalmente a etapa de inicialmente detetar um polimorfismo do gene da carbamilo fosfato sintetase I (CPSI) no sujeito. 107. O método da forma de realização 106, em que o polimorfismo do polipéptido de carbamilo fosfatase

sintase compreende uma transversão de C para A dentro do exão 36 de CPSI 108. O método da forma de realização 107, em que o polimorfismo do polipéptido de carbamilo fosfatase sintase compreende uma transversão de C para A no nucleótido 4340 de um ADNc que corresponde ao gene CPSI. 109. O método da forma de realização 108, em que a transversão de C para A no nucleótido 4340 do ADNc que corresponde ao gene CPSI compreende adicionalmente uma alteração no código de tripleto de AAC para ACC, que codifica um polipéptido de CPSI tendo uma fração de treonina no aminoácido 1405. 110. Um método de tratamento ou prevenção da toxicidade por transplante de medula óssea num sujeito submetido a transplante de medula óssea, o método compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um precursor do óxido nítrico, através da qual a toxicidade por transplante de medula óssea é tratada ou prevenida no sujeito. 111. 0 método da forma de realização 110, em que o precursor do óxido nítrico é selecionado a partir do grupo que consiste em citrulina, arginina e combinações das mesmas. 112. O método da forma de realização 110, em que o precursor do óxido nítrico é administrado numa dose que varia desde cerca de 0,01 mg até cerca de 1.000 mg. 113. O método da forma de realização 112, em que o precursor do óxido nítrico é administrado numa dose que varia desde cerca de 0,5 mg até cerca de 500 mg. 114. O método da forma de realização 113, em que o precursor do óxido nítrico é administrado numa dose que varia desde cerca de 1,0 mg até cerca de 250 mg. 115. O método da forma de realização 110, em que a toxicidade por transplante de medula óssea compreende a doença hepática veno-oclusiva. 116. O método da forma de realização 110, em que o sujeito é um ser humano. 117. O método da forma de realização 116, que compreende adicionalmente a etapa de inicialmente detetar um polimorfismo do gene da carbamilo fosfato sintetase I (CPSI) no sujeito. 118. O método da forma de realização 117, em que o polimorfismo do polipéptido de carbamilo fosfatase

sintase compreende uma transversão de C para A dentro do exão 36 de CPSI 119. O método da forma de realização 118, em que o polimorfismo do polipéptido de carbamilo fosfatase sintase compreende uma transversão de C para A no nucleótido 4340 de um ADNc que corresponde ao gene CPSI. 120. O método da forma de realização 119, em que a transversão de C para A no nucleótido 4340 do ADNc que corresponde ao gene CPSI compreende adicionalmente uma alteração no código de tripleto de AAC para ACC, que codifica um polipéptido de CPSI tendo uma fração de treonina no aminoácido 1405.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Summar, Marshall L. Christman, Brian

<12 0> POLIMORFISMO DE CARBAMILO FOSFATO SINTETASE I E MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO E TERAPÊUTICOS RELACIONADOS COM O MESMO

<130> Número de registo do Procurador 1242-19 PCT <140> PCT/US00/15079 <141> 01-06-2000 <150> 09/323.472 <151> 01-06-1999 <160> 20 <170> Patentln Ver. 2.0

<210> 1 <211> 5761 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>

<221> CDS <222> (124) . . (4626) <4 0 0> 1 gtcagcctta aacactgact gcacccctcc cagatttctt ttacattaac caaaaagtet $0 tatcacacaa tctcataaaa tttatgtaat ttcatttaat tttagccaca aatcatettc 120 aaa atg aeg agg act ttg aca gee ttc aaa gtg geg agg aca ctg aag 168

Nee Thr Arg lie Leu Thr Ala Phe Lye Val Val Arg Thr Leu Lys

1 S 10 IS act ggt ttc ggc ttt ace aat gtg act gca cac caa aaa tgg aaa ttt 216

Tbr Gly Phe Gly Phe Tbr Aaa Val Tbr Ala Hia Gin Lys Trp Lys Phe 20 25 30 tea age cct 99c ate agg etc ett tet gtc aag gca cag aca gca cac 364

Ser Arg Pro Cly He Arg Leu Leu See Val Lya Ala Gin The Ala His 35 40 4$ att gtc ctg gaa gat gga act aag atg aaa ggt tac tee ttt ggc cat 312 lie Val Leu Glu Αβρ Gly Thr Lya Hat Lya Gly Tyr Ser Phe Sly His SO 55 60 cca tee tet gtt get ggt gaa gtg gtt ttt aat act ggc ctg gga ggg 360

Pro Ser Ser Val Ala Sly Glu val Val Phe Aan The Gly Leu Gly Gly 65 20 75 tac cca gaa get att act gac cct gee tac aaa gga cag att etc aca 400

Tyr Pro Glu Ala 11a The Aap Peo Ala Tyr Lya Gly Gin 11a Leu The

00 05 90 9S atg gee aac cct att att ggg aat ggt gga get cct gat act act get 456

Mat Ala Asn Pro He lie Gly Asn Cly Gly Ala Pro Aap Thr Thr Ala

IOO 105 HO ctg gat gaa ctg gga ett age aaa tat ttg gag tet aat gga ate aag S04

Leu Aap Glu Leu Gly Leu Ser Lya Tyr Leu Glu Ser Aan Gly lie Lye 115 120 135 gtt tea ggt ttg ctg gtg ctg gat tat agt aaa gac tac aac cac tgg S52

Val See Gly Leu Leu Val Leu Asp Tyr Sex Lya Asp Tyr Aan Hie Trp 130 135 140 ctg get acc aag agt tta ggg caa tgg eta cag gaa gaa aag gtt cct 600

Leu Ala Thr Lya Ser Leu Gly Gin Trp Leu Gin Glu Clu Lya Val Pro 145 150 155 gca att tat gga gtg gac aca aga atg ctg act aaa ata att egg gat 640

Ala He Tyr Gly val Asp Thr Arg Met Leu Thr Lya He He Arg Asp 160 165 170 175 aag ggt acc atg ett ggg sag att gaa ttt gaa ggt cag cct gtg gat 696

Lya Gly Thr Met Leu Gly Lya lie Glu Phe Glu Gly Gin Pro Val Aap 100 185 190 ttt gtg gat cca aat aaa cag aat ttg att get gag gtt tea acc aag 744

Phe Val Aap Pro Aan Lya Gin Aan Leu lie Ala Glu Val Ser Thr Lya 199 300 305 gat gtc aaa gtg tac ggc aaa gga aac ccc aca aaa gtg gta get gta 793

Asp Val Lya Val Tyr Gly Lya Gly Aan Pro Thr Lya Val Val Ala Val 210 315 230 gac tgt ggg att aaa aac aat gta ate ege ctg eta gta aag ega gga 040

Asp cya Gly lie Lye Aan Asn Val He Arg Leu Leu val Lya Arg Gly

33S 330 33S see gaa gtg cac eta gtt ccc egg aac cat gat tee acc aag atg gag 088

Ala Glu Val Hie Leu Val Pro Trp Aen Hia Asp Phe Thr Lye Met Glu 340 34S 350 355 tat gat ggg att ttg ate geg gga gga ccg ggg aac cea get ett gca 936

Tyr Aap Gly lie Leu lie Ala Gly Gly Pro Gly Aen Pro Ala Leu Ala 360 365 370 gaa cca eta att cag aat gtc aga aag att ttg gag agt gat ege aag 984 elu Pro Leu He Gin Asn Val Arg Lya lie Leu Glu Ser Aap Arg Lys 37S 380 385 gag cca ttg ttt gga ate agt aca gga aac tta ata aea gga ttg get 1033

Glu Pro Leu Phe Gly lie Ser Thr Gly Aen Leu He Thr Gly Leu Ala 290 395 300 get ggt gee aaa ace tac aag atg tec atg gee aac aga ggg cag aat 1080

Ala Gly Ala Lys Thr Tyr Lys Met Ser Met Ala Aen Arg Gly Gin Aen 305 310 315 cag cct gtt ttg aat ate aca aac aaa cag get ttc att act get cag 1128

Gin Pro Val Leu Aen lie Thr Aen Lya Gin Ala Phe lie Thr Ala Gin 320 335 330 335 aat cat ggc tat gec ttg gac aac ace etc cct get ggc tgg aaa cca 1176

Aan His Gly Tyr Ala Leu Aep Aen Thr Leu Pro Ala Gly Trp Lye Pro 340 345 350 ett ttt gtg aet gtc aac gat caa aca aat gag ggg att atg cat gag 1334

Leu Phe Val Asn Val Asn Asp Gin Thr Aen Glu Gly lie Met Hie Glu 355 360 365 age aaa ccc ttc ttc get gtg cag ttc cac cca gag gtc acc ccg ggg 1273

Ser Lys Pro Phe Phe Ala Val Gin Phe Hia Pro Glu val Thr pro Gly 370 375 380 , cca ata gac act gag cac ctg ttt gac ccc CCC CCC cca ccg ata aag 1330

Pro lie Aap Thr Glu Tyr [>eu Phe Aep Ser Phe Phe Ser Leu lie Lys 365 390 395

aaa gga aaa get acc acc att aca tea gtc tta ccg aag cca gca eta 136S

Lya Gly Lye Ala Thr Thr He Thr ser Val Leu Pro Lys Pro Ala Leu 400 405 410 41$ gtt gca tet egg gtt gag gtt tcc aaa gtc ett att eta gga tea gga 1416

Val Ala Ser Arg Val Glu Val Ser Lys Val Leu lit Leu Gly Ser Gly 430 435 430 ggt ctg tcc att ggt cag get gga gas tec gac tac tea gga tet caa 1464

Oly Leu Ser He Gly Gin Ala Gly Glu Phe Asp Tyr Ser Gly Ser Gin 435 440 44$ get gta aaa gee atg aag gaa gaa aat gee aaa act get ctg atg aac 1S12

Ala Val Lys Ala Met Lya Glu clu Aen val Lye Thr Val Leu net Aan 450 455 460 cca aac att gea tea gtc cag acc aat gag geg ggc tta aag caa geg 1560

Pro Aan lie Ala Ser Val Gin Thr Aan Glu Val Gly Leu Lye Gin Ala 46S 470 475

gat act gtc tac ttt ett ccc ate acc cct cag ttt gtc aca gag gtc 160S

Aap Thr Val Tyr Phe Leu Pro He Thr Pro Gin Pbe Val Thr Glu Val 480 485 450 495 ate aag gea gaa cag cca gat ggg tta att ctg ggc atg ggt ggc cag 1656 lie Lye Ala Glu Gin Pro Asp Gly Leu lie Leu Gly net Gly Gly Gin 500 SOS 510 aca get ctg aac tgt gga gtg gaa eta ttc aag aga ggt gtg etc aag 1704

Thr Ala Leu Ann Cys Gly Val Glu Leu Phe Lye Arg Gly Val Leu Lye 515 520 525 gaa tat ggt gtg aaa gtc ctg gga act tea gtt gag tec att atg get 1752

Glu Tyr Gly Val Lys val Leu Gly Thr Ser Val Glu Ser He Met Ala 530 535 540 aeg gaa gac agg cag ctg ttt tea gat aaa eta aat gag ate aat gaa 1800

Thr Glu Asp Arg Gin Leu Phe Ser Asp Lys Leu Asn Glu lie Asn Glu 545 550 555 aag att gee cca agt ttt gea gtg gaa teg att gag gat gea ctg aag 1848

Lys He Ala Pro Ser Phe Ala Val Glu Ser lie Glu Aap Ala Leu Lye

560 565 570 57S gea gea gac acc att ggc tac cca gtg atg ate cgt tee gee cat gea 1896

Ala Ala Asp.Thr He Gly Tyr Pro Val Met lie Arg Ser Ala Tyr Ala 580 585 590 ctg ggt ggg tta ggc tea ggc ate tgt Ccc aac aga gag act ttg atg 1944

Leu Gly Gly Leu Gly Ser Gly lie Cys Pro Asn Arg Glu Thr Leu Met 595 600 605 gac etc age aca aag gee ttt get atg acc aac caa att ctg gtg gag 1992

Asp Leu 9er Thr Lys Ala Phe Ala Met Thr Asn Gin lie Leu val Glu 610 615 620 aag tea gtg aca ggt tgg aaa gaa ata gaa tat gaa gtg gtt ega gat 2040

Lys Ser Val Thr Gly Trp Lys Glu lie Glu Tyr Glu Val Val Arg Asp 625 630 635 get gat gac aat tgt gtc act gtc tgt aac atg gaa aat gtt gat gee 2068

Ala Asp Asp Asn Cys Val Thr Val Cys Asn Met Glu Asn Val Asp Ala

«40 «45 «50 «SS atg ggt gtt cac aca ggt gac tea gtt gtc gtg gcc cct gee cag aca 2136

Mat Gly Val Hie Thr Gly Asp Ser Val Val Val Ala Pro Ala Gin Thr «60 665 670 etc tcc aat gcc gag ttt cag atg ttg aga ege act tea ate aat gtc 2154

Leu Ser Asn Ala Glu Pbe Gin Met Leu Arg Arg Thr. Ser lie Aan val 67S 680 685 get ege cac ttg ggc att gtg ggt gaa tgc aac aet cag ttt gcc etc 2232

Val Arg His Leu Gly lie Val Gly Glu Cya Aan lie Gin Phe Ala Leu 690 69S 700 cat cct acc tea atg gaa tac tgc ate att gaa gtg aat gcc aga ctg 2280

His Pro Thr Ser Met Glu Tyr Cye lie He Glu Val Asn Ala Arg Leu 70S 710 715 tee ega age tet get ctg gcc tea aaa gcc act ggc tac cca ttg gca 2328

Ser Arg ser Ser Ala Leu Ala Ser Lye Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala 720 725 730 735 tec att get gca aag att gcc eta gga ate cca ett cca gaa att aag 2376

Phe lie Ala Ala Lye lie Ala Leu Gly He Pro Leu Pro Glu lie Lye 740 74S 750 aac gtc gta tec ggg aag aca tea gcc tgt ttt gaa cct age ctg gat 2424

Aan Val Val Ser Gly Lys Thr Ser Ala Cya Phe Glu Pro Ser Leu Aap 755 760 765 tac atg gtc acc aag act ccc ege tgg gat ett gac cgt ttt cat gga 2472

Tyr Met Val Thr Lya lie Pro Arg Trp Aap Leu Aap Arg Phe Hia Gly 770 775 780 aca tet age eg a att ggt age tet atg aaa agt gta gga gag gtc atg 2520

Thr Ser Ser Arg lie Gly Ser Ser Met Lya Ser Val Gly Glu Val Met 785 790 795 .get att ggt cgt acc ttt gag gag agt ttc cag aaa get tta egg atg 2568

Ala He Gly Arg Thr Phe Glu Glu Ser Phe Gin Lya Ala Leu Arg Met 800 805 810 815 tgc cac cca cct ata gaa ggt ttc act ccc cgt etc cca atg aac aaa 2616

Cya His Pro Ser He Glu Gly Phe Thr Pro Arg Leu. Fro Met Aan Lya 820 825 830 gaa tgg cca cct aat tta gat ett aga aaa gag ttg tet gaa cca age 2664

Glu Trp Pro Ser Asn Leu Aap Leu Arg LyB Glu Leu Ser Glu Pro Ser 83S 840 845 age aeg cgt ate tat gcc att gcc aag gcc ate gat gac aac atg tec 2712

Ser Thr Arg lie Tyr Ala lie Ala Lya Ala He Abp Aap Aan Met Ser 6S0 855 880 CCt get gag act gag aag etc aca cac acc gac aag egg ttc teg tac 3760

Leu Asp Clu lie Glu Lye Leu Thr Tyr lie Asp Lys Trp Phe Leu Tyr 865 870 875 aag atg cgt gat act tta aac atg gaa aag aca etg aaa ggg etc aac 2808

Lye Met Arg Asp lie Leu Asa Met Glu Lye Thr Leu Lye Gly Leu Asa

880 885 880 88S agt gag tcc atg aca gaa gaa acc ctg aaa agg gca aag gag att ggg 2856

Ser Glu Ser Met Thr Glu Glu Thr Leu Lye Arg Ala Lys Glu lie Gly 800 905 910 ttc tea gat aag cag att tea aaa tgc ett ggg etc act gag gee cag 3904

Phe Ser Aep Lye Gin lie Ser Lye Cya Leu Gly Leu Thr Glu Ala Gin

915 930 93S aca agg gag ctg agg tta aag aaa aac ate cac cct tgg gtt aaa cag 29S2

Thr Arg Glu Leu Arg Leu Lye Lys Aan He Hie Pro Trp Val Lys Glu 930 935 940 att gat aca ctg get gca gaa tac cca tea gta aca aac tat etc tat 3000 lie Asp Thr Leu Ala Ala Glu Tyr Pro Ser Val Thr Aan Tyr Leu Tyr 945 950 955 gtt acc tac aat ggt cag gag cat gat gtc aat ttt gat gac cat gga 3048

Val Thr Tyr Aan Gly Gin Glu Hie Asp Val Aan Phe Asp Asp His Gly 960 965 970 975 atg atg gtg eta ggc tgt ggt cca tat cac att ggc age agt gtg gaa 3096

Met Met Val Leu Gly Cye Gly Pro Tyr His lie Gly Ser Ser Val Glu 980 9SS 990 ttt gat tgg tgt get gtc tet agt ate ege aca ctg cgt caa cct ggc 3144

Phe Aep Trp Cya Ala Val Ser Ser lie Arg Thr Leu Arg Gin Leu Gly 995 1000 1005 aag aag aeg gtg gtg gtg aat tgc aat cct gag act gtg age aca gac 3192

Lys Lys Thr val Val Val Aan Cye Asn Pro Clu Thr Val Ser Thr Aep 1010 1015 1020 ttt gat gag tgt gac aaa etg tac ttt gaa gag teg tcc ctg gag aga 3240

Phe Asp Glu Cye Asp Lys Leu Tyr Phe Glu Glu Leu Ser Leu Glu Arg

1035 1030 103S ate eta gac ate tac cat cag gag gca tgt ggt ggc tgc ate ata tea 3288 lie Leu Asp He Tyr His Gin Glu Ala Cye Cly Gly Cye lie lie Ser 1040 1045 1050 1055 gtt gga ggc cag ate cca aac aac ctg gca gtt cct eta tac aag aat 3336

Val Gly Gly Gin lie Pro Asn Asn Leu Ala Val Pro Leu Tyr Lys Asn 1060 1065 1070 ggt see aag ate atg ggc «ca age ccc ctg cag ate gac agg get gag 3304

Sly Val Lya He Met sly Thr Ser Pro Leu Gin lie Asp Arg Ala Glu 1075 1060 1085 gat ege tee ate ttc tea get gtc ttg gat gag ctg aag gtg get cag 3433

Asp Arg Ser lie Phe Ser Ala Val Leu Asp Glu Leu Lye Val Ala Gin 1090 1095 1100 gea cet tgg aaa get gtt aat act ttg aat gaa gca ctg gaa ttt gca 3480

Ala Pro Trp Lye Ala Val Asn Thr Leu Asa Glu Ala Leu Glu Phe Ala 1105 mo ms aag tet gtg gac tac ccc tgc ttg ttg agg cet tec tat gtt ttg agt 3530

Lye Ser Val Asp Tyr Pro Cye Leu Leu Arg Pro Ser Tyr Val Lau Ser 1120 1135 1130 1135 ggg tet get atg aat gtg gta ttc tet gag gat gag atg aaa aaa ttc 3576

Sly Ser Ala Met Asn Val Val Phe Ser Glu Asp Slu Met Lye Lye Phe 1140 114S 1150 eta gaa gag geg act aga gtt tet cag gag cac cca gtg gtc etg aca 3624

Leu Glu Glu Ala Thr Arg Val Ser Gin Glu His Pro Val Val Leu Thr 1155 1160 1165 aaa ttt gtt gaa ggg gee ega gaa gta gaa atg gac get gtt ggc aaa 3672

Lys Phe Val Glu Gly Ala Arg Glu Val Glu Met Asp Ala Val Gly Lys 1170 1175 1100 gat gga agg gtt ate tet cat gee ate tet gaa cat gtt gaa gat gca 3720

Asp Gly Arg Val He Ser His Ala He Ser Glu His Val Glu Asp Ala 1105 1190 1195 ggt gtc cac teg gga gat gee act ctg atg ctg ccc aca caa acc ate 3760

Gly Val Hie Ser Gly Asp Ala Thr Leu Met Leu Pro Thr Gin Thr He 1200 1305 1210 1315 age caa ggg gee att gaa aag gtg aag gat get ace egg aag att gca 3016

Ser Gin Gly Ala lie Glu Lyo Val Lys Asp Ala Thr Arg Lye lie Ala 1330 1225 1330 aag get ttt gee ate tet ggt cca ttc aac gtc caa ttt ett gtc aaa 3064

Lys Ala Phe Ala Ha Ser Gly Pro Phe Aan Val Gin Phe Leu Val Lya 1335 1240 1245 gga aat gat gtc ttg gtg att gag tgt aac ttg aga get tet ega tec 3912

Gly Asn Asp Val Leu Val lie Glu Cys Asn Leu Arg Ala Ser Arg Ser 1250 1Í5S 1360 ttc ccc ttt gtt tee aag act ett ggg gtc gac ttc att gat gtg gee 3960

Phe Pro Phe Val Ser Lys Thr Leu Gly Val Asp Phe He Asp Val Ala 12(5 1270 1275 acc dag gcg acg act gga gag aac gtc gat gag aaa cat cct cca aca 4006

Thr Lye Val Met lie Sly Glu Aan Val Asp Glu Lya His Leu Pro The 1260 1365 1290 1295 ttg gac cat ccc ata act cct get gac tat gtt gca att aag get ccc 4056

Leu Asp Hie Pro lie II* Pro Ala Asp Tyr Val Ala lie Lya Ala Pro 1300 1305 1310 atg ttt tcc tgg ccc egg ttg agg gat get gac ccc act ctg aga tgt 4104

Met Phe Ser Trp Pro Arg Leu Arg Aap Ala Aap Pro lie Leu Arg Cya 1315 1320 1325 gag atg get tcc act gga gag gtg get tgc ttt ggt gaa ggt att cat 41S2

Glu Met Ala Ser Thr Gly Glu Val Ala Cya Fhe (Sly Glu Gly He Mia 1330 1335 1340 aca gcc ttc eta aag gca atg ett tcc aca gga ttt aag ata ccc cag 4200

Thr Ala Phe Leu Lya Ala Met Leu Ser Thr Gly Phe Lys lie Pro Gin 1345 1350 1355 aaa ggc ate ctg ata ggc ate cag caa tea ttc egg cca aga ttc ett 4246

Lys Gly lie Leu lie Gly lie Gin Gin Ser Phe Arg Pro Arg Phe Leu 1360 1365 1370 1375 ggt gtg get gaa caa tta cac aat gaa ggt ttc aag ctg ttt gcc acg 4296

Gly Val Ala Glu Cln Leu His Aen Glu Gly Phe Lys Leu Phe Ala Thr 1360 1365 1390 gaa gcc aca tea gác tgg etc aac gcc aac aat gtc cct gcc aac cca 4344

Glu Ala Thr Ser Asp Trp Leu Aen Ala Aen Aen Val Pro Ala Aan Pro 1395 1400 1405 gtg gca tgg ceg tet caa gaa gga cag aat ccc age etc tet tcc ate 4392

Val Ala Trp Pro Ser Gin Glu Gly Gin Aen Pro Ser Leu Ser Ser lie 1410 1415 1420 aga aaa ttg att aga gat ggc age att gac eta gtg att aac ett ccc 4440

Arg Lys Leu lie Arg Aap Gly Ser tie Asp Leu Val He Asn Leu Pro 1425 1430 1435 aac aac aac act aaa ttt gtc cat gat aat tat gtg att egg agg aca 4466

Aen Aan Asn Thr Lye Phe Val Hie Aep Asn Tyr Val He Arg Arg Thr 1440 ,1445 14S0 1455 get gtt gat agt gga ate cct etc etc act aat ttt cag gtg ace aaa 4536

Ala Val Aep Ser Sly He Pro Leu Leu Thr Asn Phe Gin Val Thr Lys 1460 1465 1470 ett ttt get gaa get gtg cag aaa tet ege aag gtg gac tcc aag agt 4584

Leu Phe Ala Glu Ala Val Gin Lys Ser Arg Lys Val Asp Ser Lys Ser 1«7S 1480 1485 ctt tte cac tac agg cag tac age get gga aaa gca gca tag 4628

Leu Phe His Tyr Arg din Tyr Ser Ala Gly Lya Ala Ala 1490 1495 1500 agatgeagae accccagccc cattattaaa tcaacctgag ccacatgtta tctaaaggaa 4886 ctgatteaca actttctcag agatgaatat Cgacaactaa acttcatttc agtttacttt 4748 gttatgeett aatattctgt gecttttgca attaaattgt cagccacttc ttcaaaacct 4806 tacagccctt cctaagttac tetteatgag atttcatcca ettactaata ctgtattttt 4866 ggtggactag gcctgcctat gtgctcatgt gtagcttttt actttttatg gtgetgatta 4926 atggtgatca aggtaggaaa agttgctgtt ctattttctg aactctttct ataetttaag 4986 atactctatt tttaaaacac tatctgcaaa ctcaggacac tttaacaggg cagaatactc 5046 taaaaacttg ataaaatgaa atatagattt aatttatgaa ccttccatca tgatgtttgt 5106 gtattgette tttttggatc ctcattctca cccatttgge taatccagga atattgttat 5166 ccct tcccat tatattgaag ttgagaaatg tgacagaggc atttagagta tggacttttc 5226 ttttcttttt ctttttcttt ttttcctttt gagatggagt cacactctcc aggctggagt S286 gcagtggcac aatetegget cactgcaatt tgcgtctccc aagttcaagc gattctcctg 5346 ctttagacta tggatttctt taaggaatac tggtttgcag ttttgttttc tggactatat 5406 cagcagatgg tagacagtgt ttatgtagat gtgttgttgt etttatcatt ggattttaac 5466 ttggcccgag tgaaataatc agatttttgt cattcacact ctcccccagt tttggaataa 5S26 cttggaagta aggttcattc ccttaagacg atggattctg ttgaactatg gggccccaca 5586 ctgcactatt aattccaccc actgtaaggg caaggacacc attccttcta catataagaa 5646 aaaagtctct ccccaagggc agcctttgtt aettttaaac attttctgtt attacaagtg S706 ctctaattgt gaacttttaa ataaaacact actaagaggt aaaaaaaaaa aaaaa 5761

<210> 2 <211> 1500 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Thr Arg tie Leu Thr Ala Phe Lye Val Val Arg Thr Leu Lya Thr IS 10 15

Gly Phe Gly Phe Thr Aan Val Thr Ala Xia Gin Lye Trp Lya Phe Ser 20 25 30

Arg Pro Gly He Arg Leu Leu Ser Val Lya Ala Clo Thr Ala Hie lie 35 40 45

Val Leu Glu Asp Gly Thr Lya Met Lya Gly Tyr Ser Phe Gly Hie Pro 50 55 60

Ser Ser Val Ala Gly Glu Val Val Phe Aan Thr Gly Leu Gly Gly Tyr <5 70 75 00

Pro Glu Ala tie Thr Asp Pro Ala Tyr Lya Gly Gin He Leu Thr Met 85 90 95

Ala Aan Pro He lie Gly Aan Gly Gly Ala Pro Aap Thr Thr Ala Leu 100 10S 110

Aap Glu Leu Gly Leu Ser Lya Tyr Leu Glu Ser Aan Gly lie Lye Val 115 120 125

Ser Gly Leu Leu Val Leu Aap Tyr Ser Lya Aap Tyr Asa Hie Trp Leu 130 135 140

Ala Thr Lya Ser Leu Gly Gin Trp Leu Gin Glu Glu Lya Val Pro Ala 145 150 155 160

He Tyr Gly Val Aep Tbr Arg Met Leu Thr Lya He He Arg Aap Lya 165 170 175

Gly Thr Met Leu Gly Lye lie Glu Phe Glu Gly Gin Pro val Aap Phe 180 18S 190

Val Aap Pro Aan Lya Gin Aan Leu lie Ala Glu Val Ser Tbr Lya Aap 195 200 205

Val Lya Val Tyr Gly Lya Gly Aan Pro Thr Lya Val val Ala Val Asp 210 215 220

Cya Gly He Lya Aan Aan Val He Arg Leu Leu Val Lye Arg Gly Ala 225 230 235 240

Glu Val His Leu Val Pro Trp Aan Hie Aap Pbe Thr Lya Met Glu Tyr 245 250 255

Aap Gly He Leu He Ala Gly Gly Pro Gly Aan Pro Ala Leu Ala Glu 260 265 270

Pro Leu He Gin Aan Val Arg Lya He Leu Glu Ser Aap Arg Lya Glu 275 280 255

Pro Leu phe Cl/ lie Ser The cly Asn Leu He Thr Gly Leu Ale Ale 290 295 300

Gly Ala Lye Thr Tyr Lye Met Ser Met Ala Aen Arg cly Gin Aen Gin 30S 310 315 320

Pro Val Leu Asn tie Thr Aen Lys Gin Ala Phe lie Thr Ala Gin Aen 325 330 335

Hie Gly Tyr Ala Leu Asp Aen Thr Leu Pro Ala Gly Trp Lys Pro Leu 340 345 350

Phe Val Asn Val Aen Asp Gin Thr Asn Glu Gly lie Met Hie Glu Ser 355 360 365

Lye Pro Phe Phe Ala Val Gin Phe His Pro Glu Val Thr Fro Gly Pro 370 375 380 lie Asp Thr Glu Tyr Leu Phe Asp Ser Phe Phe Ser Leu lie Lye Lye 385 390 395 400

Gly Lys Ala Thr Thr lie Thr Ser Val Leu Pro Lys pro Ala Leu Val 405 410 415

Ala Ser Arg Val Glu Val Ser Lys Val Leu lie Leu Gly Ser Gly Cly 420 425 430

Leu Ser He Cly Gin Ala Gly Glu Phe Asp Tyr Ser Gly Ser Gin Ala 435 440 445

Val Lys Ala Met Lys Glu Glu Asn Val Lys Thr Val Leu Met Αβπ Pro 450 455 460

Aen He Ala Ser Val Gin Thr Asn Glu Val Gly Leu Lye Gin Ala Asp 465 470 475 480

Thr Val Tyr Phe Leu Pro lie Thr Pro Gin Phe Val Thr Glu Val lie 485 490 495

Lys Ala Glu Gin Pro Asp Gly Leu He Leu Gly Met Gly Gly Gin Thr $00 505 510

Ala Leu Asn Cya Gly Val Glu Leu phe Lye Arg Gly Val Leu Lye Glu 51S 520 525

Tyr Gly Val Lys Val Leu Gly Thr ser val Glu Ser lie Met Ala Thr 530 S3S 540

Glu Asp Arg Gin Leu Phe Ser Asp Lys Leu Asn Glu tie Aen Glu Lys 545 550 555 560

He Ale Pro Ser Phe Ala Val Glu Ser lie Glu Asp Ala Leu Lys Ala S6S S70 SIS

Ala Aap Thr He Gly Tyr Pro Val Met He Arg Ser Ala Tyr Ala Leu 580 S8S 590

Gly Gly Leu Gly Ser Gly lie Cya Pro Asn Arg Glu Thr Leu Met asp S9S 600 60S

Leu Ser Thr Lys Ala Phe Ala Met Thr Asn Gin lie Leu Val Glu Lys <10 61S <20

Ser Val Thr Gly Trp Lye Glu lie Glu Tyr Glu Val Val Arg Asp Ala OS _ <30 OS <40

Asp Asp Asn Cys Val Thr Val Cya Asn Met Glu Asn Val Asp Ala Met 64S <50 <55

Gly val Hie Thr Gly Asp Ser Val Val Val Ala Pro Ala Gin Thr Leu «0 «5 670

Ser Aan Ala Glu Phe Gin Met Leu Arg Arg Thr Ser lie Asn Val Val 675 680 685

Arg Hla Leu Gly lie Val Gly Glu Cys Asn lie Gin Phe Ala Leu His 690 695 700

Pro Thr Ser Met Glu Tyr Cys lie lie Glu Val Asn Ala Arg Leu Ser 70S 710 71S 720

Arg Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala Phe 72S 730 735

He Ala Ala Lys He Ala Leu Gly He Pro Leu Pro Glu He Lys Asn 740 745 750

Val val Ssr Gly Lys Thr Ser Ala Cys Phe Glu Pro Ser Leu Asp Tyr 755 7<0 765

Met Val Thr Lys lie Pro Arg Trp Asp Leu Asp Arg Phe His Gly Thr 770 77S 780

Ser Ser Arg He Gly Ser Ser Met Lys Ser Val Gly Glu Val Met Ala 785 790 795 800

He Gly Arg Thr Phe Glu Glu Ser Phe Gin Lys Ala Leu Arg Met Cya 80S 810 815

His Pro Ser lie Glu Gly Phe Thr Pro Arg Leu Pro Met Asn Lya Glu 820 825 830 . Trp Pro Ser Asn Leu Asp Leu Arg Lys Glu Leu Ser Glu Pro Ser Ser 835 040 845

Thr Arg He Tyr Ala lie Ala Lya Ala lie Aap Asp Asn Met Ser Leu 850 05S 880

Aap Glu He Glu bye Leu Thr Tyr lie Aap Lye Trp Phe Leu Tyr Lya 865 870 87S 880

Met Arg Asp He Leu Asn Met Glu Lys Thr Leu Lys Gly Leu Asn Ser

885 890 89S

Glu Ser Met Thr Glu Glu Thr Leu Lys Arg Ala Lys Glu lie Gly Phe 900 905 910

Ser Asp Lys Gin lie Ser Lys Cys Leu Gly Leu Thr Glu Ala Gin Thr 91S 930 935

Arg Glu Leu Arg Leu Lys Lys Asn lie HI· Pro Trp Val Lys Gin lie 930 935 940

Asp Thr Leu Ala Ala Glu Tyr Pro Ser Val Thr Asn Tyr Leu Tyr Val 94S 950 9S5 960

Thr Tyr hen Gly Glu Glu His Asp Val Asn Phe Asp Asp His Gly Met 96S 970 975

Met Val Leu Gly Cys Gly Pro Tyr His He Gly Ser Ser Val Glu Pbe 980 985 990

Asp Trp Cys Ala Val Ser Ser lie Arg Thr Leu Arg Gin Leu Gly Ly· 995 1000 1005

Lys Thr Val Val Val Asn Cys Asn Pro Glu Thr Val Ser Thr Asp Phe 1010 101S 1030

Asp Glu Cys Asp Lye Leu Tyr Phe Glu Glu Leu Ser Leu Glu Arg He 102S 1030 1035 1040

Leu Asp He Tyr His Gin Glu Ala Cys Gly Gly Cys Zle lie Ser Val 104S 10S0 1055

Gly Gly Gin He Pro Asn Asn Leu Ala Val Pro Leu Tyr Lys Asn Gly 1060 1065 1070

Val Lys tie Met Gly Thr Ser Pro Leu Gin He Asp Arg Ala Glu Asp 1075 1080 1085

Arg Ser He Phe Ser Ala Val Leu Asp Glu Leu Lys Val Ala Gin Ala 1090 1095 1100

Pro Trp Lys Ala Val Asn Thr Leu Asn Glu Ala leu Glu Phe Ala Lys 110S 1110 1115 1130

Ser Val Asp Tyr Pro Cys Leu Leu Arg Pro Ser Tyr Val Leu Ser Gly 1125 1130 1135

Ser Ala Mat Aan Vai Vai Pbe Ser Glu Asp Glu Met Lys Lye íhe Leu 1140 1145 1150

Glu Glu Ala Thr Arg Vai Ser Gla Glu Hie Pro Vai Vai Leu Thr Lye 1155 1160 1165

Pbe Vai Glu Gly Ala Arg Glu Vai Glu Met Asp Ala vai Gly Lys Asp 1170 1175 1180

Gly Arg Vai He Ser His Ala Ile Ser Glu Mis Vai Glu Aep Ala Gly 11B5 1190 1195 1200

Vai Hls Ser Gly Asp Ala Thr Leu Met Leu Pro Thr Gin Thr Ile Ser

1205 1210 12IS

Gin Gly Ala Ile Glu Lys Vai Lys Asp Ala Thr Arg Lys Ile Ala Lys 1220 1225 1230

Ala Phe Ala Ile Ser Gly Pro Phe Aan Vai Gin Phe Leu Vai Lys Gly 1235 1360 124S

Aan Asp Vai Leu Vai Ile Glu Cys Asn Leu Arg Ala Ser Arg Ser Phe 1250 1255 1260

Pro Phe Vai Ser Lys Thr Leu Gly Vai Asp Phe Ile Asp Vai Ala Thr 1265 1270 1275 1280

Lys Vai Net lie Gly Glu Aen Vai Asp Glu Lys His Leu Pro Thr Leu 1285 1290 1295

Aep Hls Pro lie lie Pro Ala Asp Tyr Val Ala Ile Lye Ala Pro Met 1300 1305 1310

Phe Ser Tip Pro Arg Leu Arg Asp Ala Asp Pro lie Leu Arg cys Glu 1315 1320 1325

Met Ala Ser Thr Gly Glu Val Ala eye Phe Gly Glu Gly Ile Hie Thr 1330 1335 1340

Ala Phe Leu Lys Als Met Leu Ser Thr Gly Pbe Lys lie Pro Gin Lys 1345 1350 1355 1360

Gly Ile Leu He Gly lie Gin Gin Ser Phe Arg Pro Arg Phe Leu cly 1365 1370 1375

Val Ala Glu-Gin Leu His Asn Glu Gly Phe Lys Leu Phe Ala Thr Glu 13Θ0 1385 1390

Ala Thr Ser Asp Trp Leu Aen Ala Asn. Asn Val Pro Ala Asn Pro Val 1395 1400 1405

Ala Trp Pro Ser Gin Glu Cly Gin Ann Pro Ser Leu Ser See lie Arg 1410 1415 1430

Lye Leu lie Arg Asp Gly Ser He Asp Leu Val lie Aon Leu Pro Asn 1425 1430 1435 1440

Asn Asn Thr Lye Phe val His Asp Asn Tyr val lie Arg Arg Thr Ala 1445 14 SO 1455

Val Asp Ser Gly lie Pro Leu Leu Thr Asn Phe Gin Val The Lya Leu 1460 1465 1470

Phe Ala Glu Ala val Gin Lye Ser Arg Lys Val Asp Ser Lye Ser Leu 1475 1400 1485

Phe His Tyr Arg Gin Tyr Ser Ala Gly Lye Ala Ala 1490 1495 1500

<210> 3 <211> 5761 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>

<221> CDS <222> (124).. (4626) <400> 3 gteageetta aacactgact gcacccctcc cagatttctt ttacattaac taaaaagcct 60 tatcacacaa tctcataaaa tttatgtaat ttcatttaat tttagceaca aaccatcttc 130 aaa atg aeg agg ate ttg aca get ttc aaa gtg gtg agg aca ctg aag 160

Met Thr Arg lie Leu Thr Ala Phe Lys Val Val Arg Thr Leu Lys 1 s 10 is act ggt tee ggc ttt ace aae gtg act gca cac can aaa tgg aaa ttt 316

Thr Gly Phe Gly Pbe Thr Asn val Thr Ala Hia Gin Lys Trp Lys Phe 30 35 30 tea aga cct ggc ate agg etc ett tet gtc aag gca cag aca gca cac 364

Ser Arg Pro Gly He Arg Leu Leu Ser Val Lys Ala Gin Thr Ala Hia 35 40 45 att gtc ctg gaa gat gga act aag atg aaa ggt tac tcc ttt ggc cat 312 lie Val Leu Glu Aep Gly Thr Lye Met Lye Gly Tyr Set Phe Gly Hie SO 55 60 cca tcc tee gtt gee ggt gaa gtg gtt etc aat act ggc ceg gga ggg 360

Pro Ser Ser Val Ala Gly Glu Val Val Phe Aan Thr Gly Leu Gly Gly 65 70 75 tac cca gaa get att act gac cct gcc tac aaa gga cag act etc aca 408

Tyr Pro Glu Ala He Thr Asp Pro Ala Tyr Lye Gly Gin lie Leu Thr 80 85 PO 95 atg gcc aac cct act att ggg aat ggt gga get cct gat act act get 456

Met Ala Aen Pro lie lie Gly Aan Gly Gly Ala Pro Asp Thr Thr Ala 100 105 110 ctg gat gaa ctg gga etc age aaa tat ttg gag tcc aat gga ate aag 504

Leu Asp Glu Leu Gly Leu Ser Lys Tyr Leu Glu Ser Aan Gly lie Lys 11S 130 125 get tea ggt ttg ctg gtg ctg gat tat agt aaa gac tac aac cac tgg 552

Val Set Gly Leu Leu Val Leu Asp Tyr Ser Lys Asp Tyr Asn His Trp 130 135 140 ctg get acc aag agt tea ggg caa tgg eta cag gaa gaa aag gtt cct 600

Leu Ala Thr Lye Ser Leu Gly Gin Trp Leu Gin Glu Glu Lye Val Pro 145 ISO 155 gca att tat gga gtg gac aca aga atg ctg act aaa ata att egg gat 648

Ala He Tyr Gly Val Asp Thr Arg Met Leu Thr Lye lie He Arg Asp 160 165 170 175 aag ggt acc atg ett ggg aag att gaa ttt gaa ggt cag cct gtg gat 696

Lys Gly Thr Met Leu Gly Lys He Glu Phe Glu Gly Gin Pro Val Asp ISO 185 190 ttt gtg gat cca aat aaa cag aat ttg att get gag gtt tea acc aag 744

Phe Val Asp Pro Asn Lys Gin Asn Leu lie Ala Glu Val Ser Thr Lys

195 200 20S gat gtc aaa gtg tac ggc aaa gga aac ccc aca aaa gtg gta get gta 792

Asp Val Lys Val Tyr Gly Lys Gly Asn Pro Thr by· Val val Ala val 210 215 220 gac tgt ggg att aaa aac aat gta acc ege ctg eta gta aag ega gga 840

Asp Cys Gly lie Lys Asn Asn Val lie Arg Leu Leu Val Lys Arg Gly 225 230 235 get gaa gtg cac tta gtt ccc tgg aac cat gat ttc acc aag atg gag B88

Ala Glu Val Hie Leu Val Pro Trp Aen His Asp Phe Thr Lys Met Glu 240 245 2S0 255 tat gat ggg att ttg ate geg gga gga ceg ggg aac cca get ett gca 936

Tyr Aap Gly lie Leu lie Ale Gly Gly Pro Gly Asn Pro Ala Leu Ala 260 265 270 gaa cca eta att cag aat gtc aga aag att ttg gag agt gat ege aag $0«

Glu Pro Leu lie Gin Aen Val Arg Lya lie Leu Glu Ser Aap Arg Lya 27S 260 286 gag cca ttg ttt gga ate agt aca gga aac tta ata aea gga ttg get 1032

Glu Pro Leu Phe Gly lie Ser Thr Gly Aan Leu lie Thr Gly Leu Ala 290 295 300 get ggt gcc aaa ace tac aag atg tcc atg gcc aac aga ggg cag aat 1000

Ala Gly Ala Lya Thr Tyr Lye Net Ser Met Ala Aan Arg Gly Gin Aen 305 310 315 cag ect gtt ttg aat ate aca aac aaa cag get ttc att act get cag 1128

Gin Pro Val Leu Asn lie Thr Aan Lya Gin Ala Phe lie Thr Ala Gin 320 325 330 335 aat cat ggc tat gcc ttg gac aac acc etc cct get ggc tgg aaa cca 1176

Aen Hie Gly Tyr Ala Leu Asp Asn Thr Leu Pro Ala Gly Trp Lye Pro 340 34S 350 ett ttt gtg aat gtc aac gat caa aca aat gag ggg att atg cat gag 1224

Leu Phe Val Asn Val Aen Asp Gin Thr Aen Glu Gly He Met Hie Glu 355 360 365 age aaa ccc ttc ttc get gtg cag ttc cac cca gag gtc acc ccg ggg 1272

Ser Lya Pro Phe Phe Ala Val Gin Phe Hie Pro Glu Val Thr Pro Gly 370 375 380 cca ata gac act gag tac ctg ttt gat tcc ttt ttc tea ctg ata aag 1320 pro lie Aap Thr Glu Tyr Leu Phe Aap Ser Phe Phe Ser Leu lie Lye

365 390 39S aaa gga aaa get acc acc att aca tea gtc tta ccg aag cca gca eta 1368

LyB Gly Lye Ala Thr Thr He Thr Ser Val Leu Pro Lys Pro Ala Leu 400 405 410 415 gtt gca tet egg gtt gag gtt tcc aaa gtc ett att eta gga tea gga 1416

Val Ala Ser Arg Val Glu Val Ser Lye Val Leu lie lieu Gly Ser Gly 420 425 430 ggt ctg tcc att ggt cag get gga gaa ttt gat tac tea gga tet caa 1464

Gly Leu Ser lie Gly Gin Ala Gly Glu Phe Asp Tyr Ser Gly Ser Gin 43S 440 445 get gta aaa gcc atg aag gaa gaa aat gtc aaa act gtt ctg atg aac 1512

Ala Val Lye Ala Met Lye Glu Glu Aen Val Lye Thr Val Leu Met Aen 450 455 460 cca aac att gca tea gtc cag acc aat gag gtg ggc tta aag caa geg 1560

Pro Asn lie Ale Ser Val Gin Thr Asa Glu Val Gly Leu Lys Gin Ala 465 470 475 gat act gee eac ett ett eee ate ace cct cag ttt gtc aca gag gtc 1608

Asp Thr Val Tyr Phe Leu Fro lie Thr Pro Gin Phe Val Thr Glu Val 400 «05 «90 495 ate aag gca gaa cag cca gat ggg tta att ctg ggc atg ggt ggc cag 1555 lie Lye Ala Olu Gin Fro Aap 01y Leu lie Leu Gly Met Gly Gly Gin 500 S05 S10 aca get ctg aac tgt gga gtg gaa eta tec aag aga ggt gtg etc aag 170«

Thr Ala Leu Aba Cys Gly Val Glu Leu Phe Lye Arg Gly Val Leu Lys

515 520 52S gaa tat ggt gtg aaa gtc ctg gga ace tea gtt gag tec att atg get 1752

Glu Tyr Gly Val Lye val Leu Gly Thr Ser Val Glu Ser lie Met Ala 530 535 540 aeg gaa gac agg cag ctg tte tea gat aaa cca aat gag ate aat gaa 1800

Thr Glu Abp Arg Gin Leu phe Ser Asp Lys Leu Asn Glu lie Asn Glu 545 550 555 aag att get cca agt ttt gca gtg gaa teg att gag gat gca ctg aag 1848

Lys lie Ala Pro Ser Phe Ala Val Glu Ser He Glu Asp Ala Leu Lys 560 585 570 575 gca gca gac acc att ggc tac cca gtg atg ate cgt tcc gec tat gca 1898

Ala Ala Aap Thr lie Gly Tyr Pro Val Met lie Arg Ser Ala Tyr Ala 580 58$ 590 ctg ggt ggg tta ggc tea ggc ate tgt ccc aac aga gag act ttg atg 1944

Leu Gly Gly Leu Gly ser Gly He Cya Pro Asn Arg Glu Thr Leu Met 595 600 605 gac etc age aca aag gcc ttt get atg acc aac caa act ctg gtg gag 1992

Asp Leu Ser Thr Lys Ala Phe Ala Met' Thr Aon Gin 11« Leu Val Glu 610 615 620 aag tea gtg aca ggt tgg aaa gaa ata gaa tat gaa gtg gtt ega gat 2040

Lys Ser Val Thr Gly Trp Lys Glu He Glu Tyr Glu Val Val Arg Asp 625 630 635 get gat gac aat tgt gtc act gtc tgt aac atg gaa aat gtt gat gcc 2088

Ala Asp Asp Asn Cye Val Thr Val Cys Asn Net Glu Asn Val Asp Ala

640 645 650 65S atg ggt gtt cac aca ggt gac tea gtt gtt gtg get cct gcc cag aca 2136

Met Gly Val His Thr Gly Asp Ser Val Val Val Ala Pro Ala Gin Thr 660 66S 670 etc tcc aat gcc gag ttt cag atg teg aga cgt act tea ate aat gtt 2184

Leu Ser Aan Ala Glu Phe Gin Met Leu Arg Arg Thr Ser lie Aen Val 6IS 680 6Θ5 gtt cgc cac teg ggc ate gtg ggc gaa cgc aac att cag tct gcc ctt 3232

Val Arg Hie Leu Gly lie Val Gly Glu Cya Aan He Gin Phe Ala Leu 690 695 700 cat cct acc tea atg gaa tac cgc ate att gaa geg aat gcc aga ctg 2200

His Pro Thr Ser net Glu Tyr Cye lie tie Glu Val Aen Ala Arg Leu 70S 710 715

tcc ega age tct get ctg gcc tea aaa gcc act ggc tac cca ttg gca 232 B

Ser Arg Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lya Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala 720 725 730 735 ttc att get gca aag att gcc eta gga ate cca etc cca gaa act aag 2076

Phe lie Ala Ala Lye He Ala Leu Gly tie Pro Leu Pro Glu lie Lye 740 7«S 750 aac gtc gta tcc ggg aag aca tea gcc tgt ttt gaa cct age ctg gat 2424

Aen Val Val Ser Gly LyB Thr Ser Ala Cye Phe Glu Pro Ser Leu Aap

755 760 76S tac atg gtc acc aag att ccc cgc tgg gat ctt gac cgt ttt cat gga 2472

Tyr Met Val Thr Lys lie Pro Arg Trp Aap Leu Aep Arg Phe His Gly 770 775 780 aca tct age eg* att ggt age tct atg aaa agt gta gga gag gcc atg 2520

Thr Ser Ser Arg lie Gly Ser Ser Met Lye Ser Val Gly Glu Val Met

705 790 79S get att ggt cgt acc ttt gag gag agt ttc cag aaa get tta egg atg 2568

Ala lie Gly Arg Thr Phe Glu Glu Ser Phe Gin Lys Ala Leu Arg Met 000 805 010 015 tgc cac cca tcc ata gaa ggc ttc act ccc cgc etc cca atg aac aaa 2616

Cye Hie Pro Ser lie Glu Gly Phe Thr Pro Arg Leu Pro Met Aen Lys 020 025 030 gaa tgg cca tct aat tta gat ctt aga aaa gag ttg tct gaa cca age 2664

Glu Trp Pro Ser Asn Leu Asp Leu Arg Lye Glu Leu Ser Glu Pro Ser 03S 040 B45 age aeg cgt ate tat gcc att gcc aag gcc act gat gac aac atg tcc 2712

Ser Thr Arg He Tyr Ala lie Ala Lye Ala lie Asp Asp Aen Met Ser 050 055 860 ctt gat gag ate gag aag etc aca tac att gac aag tgg ttt ttg tat 2760

Leu Asp Glu He Glu Lye Leu Thr Tyr lie Asp Lys Trp Phe Leu Tyr B65 070 075 aag atg cgt gat att tta aac atg gaa aag aca ctg aaa ggg etc aac 2Β0Θ

Lys Met Arg Aap He Uu Asn Met Glu Lye Thr Leu Lye Gly Leu Asn BBO 88$ 890 895 agt gag tcc atg aca gaa gaa acc ctg aaa agg gea aag gag att ggg 2856

Ser Glu Ser Met Thr Glu Glu Thr Leu Lya Arg Ala Lye Glu lie Gly BOO »05 910 ttc tea gat aag cag att tea aaa tgc ett ggg etc act gag gee cag 2904

Phe Ser Asp Lye Gin lie Ser Lya Cys Leu Gly Leu Thr Glu Ala Gin 915 920 925 aca agg gag ctg agg tta aag aaa aac ate cac ect tgg gtt aaa cag 2952

Thr Arg Glu Leu Arg Leu Lya Lya Aan lie Hia Pro Trp Val Lya Gin 930 935 940 att gat aca ctg get gca gaa tac cca tea gta aca aac tat etc tat 3000

He Asp Thr Leu Ala Ala Glu Tyr Pro Ser Val Thr Aan Tyr Leu Tyr 945 9S0 955 get acc tac aat ggt cag gag cat gat gtc aat ttt gat gac. cat gga 3048

Val Thr Tyr Aan Gly Gin Glu Hie Asp Val Aen Phe Aap Aap His Gly 960 965 970 975 atg atg gtg eta ggc tgt ggt cca tat cac att ggc age agt gtg gaa 3096

Met Met Val Leu Gly Cya Gly Pro Tyr Kla lie Gly Ser Ser Val Glu 980 985 990 ttt gat tgg tgt get gtc tet agt ate ege aca ctg cgt caa ett ggc 3144

Pbe Aep Trp Cye Ala Val Ser Ser lie Arg Thr Leu Arg Gin Leu Gly 995 1000 1005 aag aag aeg gtg gtg gtg aat tgc aat cct gag act gtg age aca gac 3193

Lya Lye Thr Val Val val Aen eye Asn Pro Glu Thr Val Ser Thr Asp 1010 1015 1020 ttt gat gag tgt gac aaa ctg tac ttt gaa gag ttg tcc ttg gag aga 3240

Phe Aep Glu Cye Aep Lye Leu Tyr Phe Glu Glu Leu Ser Leu Glu Arg

1025 1030 103S ate eta gac ate tac cat cag gag gca tgt ggt ggc tgc ate ata tea 3288 lie Leu Asp He Tyr Hie Gin Glu Ala Cya Gly Gly Cys lie He Ser

1040 104S 1050 10SS gtt gga ggc cag att cca aac aac ctg gca gtt cct eta tac aag aat 3336

Val Gly Gly Gin He Pro Aen Aen Leu Ala Val Pro Leu Tyr Lye Aan 1060 106S 1070 ggt gtc aag ate atg ggc aca age ccc ctg cag ate gac agg get gag 3384

Gly val Lye He Met Gly Thr Ser Pro Leu Gin lie Asp Arg Ala Glu 1075 1080 1085 gat ege tcc ate ttc tea get gtc ttg gat gag ctg aag gtg get cag 3432 Α·ρ Arg Ser II* Phe Ser Ala Val Leu Asp Glu Leu Lye Val Ala Gin 1090 109S ' 1100 gca cct egg aaa gec gee aac act ttg aac gaa gca ccg gaa ttt gca 3400

Ala Pro Trp Lya Ala Val Aan Thr Leu Aen Clu Ala Leu Glu Fhe Ala 110S 1110 Ills aag cct geg gae cac ccc tgc ttg ttg agg cct tcc tat gtt ttg agt 3520

Lya Ser Val Asp Tyr Pro Cys Leu Leu Arg Pro Ser Tyr Val Leu Ser 1120 113S 1130 1135 ggg tet get atg aat gtg gta ttc tet gag gat gag atg aaa aaa ttc 3576

Gly Ser Ala Met Aan Val Val Phe Ser Glu Aep Glu Met Lye Lys Fhe 1140 1145 11S0 eta gaa gag geg act aga gtt tet cag gag cac cca gtg gtc ctg aca 3624

Leu Glu Glu Ala Thr Arg Val Ser Gin Glu His Pro Val Val Leu Thr 1155 1160 1165 aaa ttt gtt gaa ggg gcc eg a gaa gta gaa atg gac get gtt ggc aaa 3672

Lya Phe Val Glu Gly Ala Arg Glu Val Glu Met Asp Ala Val Gly Lya 1170 1175 1180 gat gga agg gtt ate tet eat gcc ate tet gaa cat gtt gaa gat gca 3720

Asp Gly Arg Val lie Ser His Ala lie Ser Glu His Val Glu Asp Ala 1185 1190 1195 ggt gtc cac teg gga gat gcc act ctg atg ctg ccc aca caa acc ate 3768

Gly Val His Ser Gly Asp Ala Thr Leu Met Leu Pro Thr Gin Thr lie

1200 1205 1210 121S age caa ggg gcc att gaa aag gtg aag gat get acc egg aag att gca 3816

Ser Gin Gly Ala lie Glu Lys Val Lys Asp Ala Thr Arg Lys lie Ala 1220 122S 1230 aag get ttt gcc ate tet ggt cca ttc aac gtc caa t.tt ett gcc aaa 3864

Lya Ala Phe Ala He Ser Gly Pro Phe Aen Val Gin Phe Lai Val Lye 1235 1240 1245 gga aat gac gtc ttg gtg att gag tgt aac ttg aga get tet ega . tec 3912

Gly Aen Asp Val Leu Val lie Glu Cys Aon Leu Arg Ala Ser Arg ser 1250 12S5 1260 ttc ccc ttt gtt tec aag act cct ggg gtt gac ttc att gat gtg gcc 3960

Phe Pro Fhe Val Ser Lye Thr Leu Gly Val Asp Phe lie Asp Val Ala 1265 1270 1275 acc aag geg atg att gga gag aat gtt gat gag aaa cat ett cca aca 4008

Thr Lys Val Met lie Gly Glu Aen Val Aap Glu Lys His Leu Pro Thr

1280 1285 1290 129S ttg gac cat ccc ata att cct get gac tat gtt gca att aag get ccc 4056

Leu Asp His Pro lie lie Pro Ala Asp Tyr Val Αία II· Lye Ala Pro 1300 1305 1310 atg tct tec tgg ccc egg ttg agg gat get gac ccc att ctg aga tgt 4104

Met Phe Ser Trp Pro Arg Leu Arg Asp Ala Asp Pro lie Leu Arg Cya 1315 1310 1335 gag atg get tcc act gga gag gtg get tgc ttt ggt gaa ggt act eat 4153

Glu Met Ala Ser Thr Gly Glu Val Ala Cys Phe Gly Glu Gly lie His 1330 1335 1340 aca gee ttc eta aag gca atg etc tcc aca gga ttt aag ata ccc cag 4100

Thr Ala Phe Leu Lys Ala Met Leu Ser Thr Gly Phe Lye lie Pro Gin 1345 1350 1355 aaa ggc ate ctg ata ggc ate cag caa tea tcc egg cca aga ttc ett 4248

Lye Gly He Leu lie Gly lie Gin Gin Ser Phe Arg Pro Arg Phe Leu 1340 1355 1370 1375 ggt gtg get gaa caa tta cac aac gaa ggc tcc aag ctg ttt gcc aeg 4296

Gly Val Ala Glu Gin Leu His Asn Glu Gly Phe Lys Leu Phe Ala Thr 1380 1385 1390 gaa gcc aca tea gac tgg etc aac gcc aac aat gtc cct gcc acc cca 4344

Glu Ala Thr Ser Asp Trp Leu Asa Ala Aen Asn Val Pro Ala Thr Pro 1395 1400 1405 gtg gca tgg ccg tct caa gaa gga cag oat ccc age etc tct tcc ate 4392

Val Ala Trp Pro Ser Gin Glu Gly Gin Aen Pro Ser Leu Ser Ser lie 1410 1415 1420 aga aaa ttg att aga gat ggc age att gac eta gtg att aac ett ccc 4440

Arg Lys Leu lie Arg Asp Gly Ser lie Asp Leu Val lie Asn Leu Pro 1425 1430 1435 aac aac aac act aaa ttt gtc cat gat aat tat gtg att egg agg aca 4480 ' Asn Asn Asn Thr Lys Phe Val His Asp Asn Tyr Val He Arg Arg Thr 1440 1445 1450 14S5 get gtt gat agt gga ate cct etc etc act aat ttt cag gtg acc aaa 4S36

Ala. Val Asp Ser Gly He Pro Leu Leu Thr Asn Phe Gin val Thr Lys 1460 146S 1470 ett ttt get gaa get gtg cag aaa tct ege aag gtg gac tcc aag agt 4584

Leu Phe Ala Glu Ala Val Gin Lys Ser Arg Lys Val Aop Ser Lys Ser 1475 1400 1405 etc ttc cac tsc agg cag tac agt get gga aaa gca gca tag 4626

Leu Phe Hie Tyr Arg Sin Tyr Ser Ala Gly Lyo Ala Ala 1490 1495 1500 agatgeagae accccagccc cattattaaa tcaacctgag ccacatgtta tctaaaggaa 4686 ctgattcaca actttctcag agatgaatat tgataactaa acttcatttc agcccacccc 4746 getatgcctt aatatcctgt gtcttttgca attaaattgt cagtcacctc ttcaaaacct 4806 tacagtcctt cctaagttac tcttcatgag atttcatcca tttactaata ctgcattctt 4866 ggtggactag gcttgcccat gcgcttatgt gtagcttttt acccttcacg gtgctgatta 4926 atggtgatca aggcaggaaa agctgctgct ctattttctg aactctttct atactttaag 4986 acactctatt tttaaaacac cacctgcaaa ctcaggacac tttaacaggg cag&atactc S046 taaaaacttg ataaaatgaa atatagattt aattbatgaa ccttccaCca tgatgtttgt 5106 gtatcgcctc ctcttggatc ctcattctca cccatttggc taatccagga atattgttat 5166 cccttcccat tacattgaag ttgagaaatg cgacagaggc atteagagta tggacttttc 5226 tcctcttctt ctttttcttt ttttcttttt gagatggagt cacactctcc aggctggagt 5286 gcagtggcac aatctcggct cactgcaatt tgcgtctccc aagttcaagc gattctcctg S346 ctttagacta tggatttctt taaggaatac tggtttgcag ctttgttttc tggactatat 5406 cagcagatgg tagacagtgt ctatgtagac gtgttgttgt ttttatcatt ggattttaac 5466 ttggcccgag tgaaataatc agatttttgt catccacact cccccccagc ettggaaeaa SS26 cttggaagta aggttcattc ccttaagacg acggattctg ttgaactatg gggtcccaca S586 ctgcactatt aattccaccc actgtaaggg caaggacacc actccttcca catataagaa 5646 aaaagtetct ccccaagggc agcctttgtt accttcaaac attttctgtt attacaagtg 5706 ctctaategt gaactcttaa ataaaacact attaagaggt aaaaaaaaaa aaaaa 5761

<210> 4 <211> 1500 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Met Thr Arg lie Leu Thr Ala Phe Lys Val val Arg Thr Leu Lye Thr 15 10 15

Gly Ph* Gly Phe Thr Aeo Val Thr Ala Hie Gin Lye Tip Lye Phe Ser 20 25 30

Arg Pro Gly Tie Arg Leu Leu Ser Val Lye Ala Gin Thr Ala Hie lie 39 40 49

Vai Leu Glu Asp Gly Thr Lys Met Lya Gly Tyr Ser Phe Gly Hie Pro 50 55 60

Ser Ser Vai Ala Gly Glu Vai Vai Phe Asn Thr Gly Leu Gly Gly Tyr 6S 70 7S 00

Pro Glu Ala lie Thr Aep Pro Ala Tyr Lye Gly Gin lie Leu Thr Met 05 90 95

Ala Asn Pro lie lie Gly Aan Gly Gly Ala Pro Asp Thr Thr Ala Leu 100 105 110

Asp Glu Leu Gly Leu Ser Lys Tyr Leu Glu sér Asa Gly Ile Lye Vai 115 120 125

Ser Gly Leu Leu Vai Leu Asp Tyr Ser Lya Asp Tyr Asn His Trp Leu 130 135 140

Ala Thr Lys Ser Leu Gly Gin Trp Leu Gin Glu Glu Lye Vai Pro Ala 145 ISO 155 160 lie Tyr Gly Vai Asp Thr Arg Met Leu Thr Lye Zle Ile Arg Asp Lys 1«S 170 175

Gly Thr Met Leu Gly Lys lie Glu Phe Glu Gly Gin Pro Vai Asp Phe 180 165 190

Vai Aap Pro λβη Lys Gin Asn Leu lie Ala Glu Vai Ser Thr LyB Asp 195 200 205

Vai Lys Vai Tyr Gly Lys Gly Asn Pro Thr Lys Vai Vai Ala Vai Asp 210 215 220

Cys Gly Ile Lys Asn Asn Vai Ile Arg Leu Leu Vai Lys Arg Gly Ala 22S 230 235 240

Glu Vai His Leu Vai Pro Trp Asn Hi a Asp Phe Thr Lya Met Glu Tyr 245 250 2S5

Aap Gly lie Leu lie Ala Gly Gly Pro Gly Asn Pro Ala Leu Ala Glu 260 265 270

Pro Leu Ile Gin Asn Vai Arg Lys Ile Leu Glu Ser Asp Arg Lys Glu 275 200 205

Pro Leu Phe Gly Ile Ser Thr Gly Asn Leu Ile Thr Gly Leu Ala Ala 390 29S 300

Gly Ala Lys Thr Tyr Lys Met Ser Met Ala Asn Arg Gly Gin Asn Gin 305 310 315 320

Pro Val Leu Asn lie Thr Asn Lye Gin Ala Phe He Thr Ala Gin Asn 335 330 335

Hi* Gly Tyr Ala Leu Asp Asn Tbr Leu Pro Ala Gly Trp Lys Pro Leu 340 345 . 350

Phe Val Asn Val Asn Asp Gin Thr Asn Glu Gly lie Met His Clu Ser 355 350 355

Lys Pro Phe Phe Ala Val Gin Phe Mis Pro Glu Val Thr Pro Gly Fro 370 375 350

He Asp Thr Glu Tyr Leu Phe Asp Ser Phe Phe Ser Leu lie Lye Lye 38S 390 39S 400

Gly Lye Ala Thr Thr He Thr Ser Val Leu Pro Lys Pro Ala Leu Vel 40S 410 415

Ala Ser Arg Val Glu Val Ser Lys Val Leu lie Leu Gly Ser Gly Gly 430 435 430

Leu Ser He Gly Gin Ala Gly Glu Phe Asp Tyr Ser Gly Ser Gin Ala 435 440 445

Val Lys Ala Met Lys Glu Glu Asn Val Lye Thr Val Leu Met Asn Pro 450 4SS 4G0

Asn lie Ala Ser Val Gin Thr Asn Glu Val Gly Leu Lys Gin Ala Asp 455 470 475 480

Thr Val Tyr Phe Leu Pro lie Thr Pro Gin Phe Val Thr Glu Val lie 485 490 495

Lys Ala Glu Gin Pro Asp Gly Leu lie Leu Gly Met Gly Gly Gin Thr 500 505 510

Ala Leu Asn Cye Gly Val Glu Leu Phe Lye Arg Gly Val Leu Lys Glu 515 530 S35

Tyr Gly Val Lye Val Leu Gly Thr Ser Val Glu Ser lie Met Ala Thr 530 535 540

Glu Asp Arg Gin Leu Phe Ser Aep Lys Leu Asn Glu lie Aan Glu Lys 545 550 555 550

Zle Ala Pro Ser Phe Ala Val Glu Ser He Glu Asp Ala Leu Lys Ala 565 570 575

Ala Aep Thr lie Gly Tyr Pro Val Met He Arg Ser Ala Tyr Ala Leu 550 S85 590

Gly Gly Leu Gly Ser Gly lie Cys Pro Asn Arg Glu Thr Leu Met Asp 595 <00 <05

Leu Ser Thr Lye Ala Phe Ala Met Thr Aen Gin lie Leu Val Glu Lys £10 <15 <20

Ser Val Thr Gly Trp Lye Glu He Glu Tyr Glu Val Val Arg Aep Ala <25 <30 <35 640

Aep Aep Aen Cys Val Thr Val Cys Aen Met Glu Aen Val Aep Ala Met 645 <50 655

Gly Val His Thr Gly Aep Ser Val Val Val Ala Pro Ala Gin Thr Leu 660 665 <70

Ser Aen Ala Glu Phe Gin Met Leu Arg Arg Thr Ser lie Aen Val Val <75 <50 6Θ5

Arg His Leu Gly He Val Gly Glu Cys Aen lie Gin Phe Ala Leu Hie 690 <95 700

Pro Thr Ser Hat Glu Tyr Cys lie He Glu Val Aen Ala Arg Leu Ser 705 710 715 720

Arg Ser Ser Ala Leu Ala ser Lye Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala Phe 725 730 735 lie Ala Ala Lys He Ala Leu Gly lie Pro Leu Pro Glu lie Lys Aen 740 745 750

Val Val Ser Sly Lye Thr Ser Ala Cys Phe Glu Pro Ser Leu Asp Tyr 755 7<0 7S5

Met Val Thr Lye He Pro Arg Trp Aep Leu Aep Arg Phe Hie Gly Thr 770 775 780

Ser Ser Arg lie Gly Ser Ser Met Lye Ser Val Gly Glu Val Met Ala 785 790 795 800 lie Gly Arg Thr Phe Glu Glu Ser Phe Gin Lya Ala Leu Arg Met Cye 80S 810 815

Hie Pro Ser He Glu Gly Phe Thr Pro Arg Leu Pro Met Aen Lye Glu 820 825 830

Trp Pro Ser Asu Leu Aep Leu Arg Lye Glu Leu Ser Glu Pro Ser Ser 835 840 845

Thr Azg He Tyr Ala He Ala Ly· Ala He Aep Aep Aan Met Ser Leu 850 555 8<0

Asp Glu lie Glu Lye Leu Thr Tyr lie Aep Lya Trp Phe Leu Tyr Lye 865 870 875 880

Mec Arg Aap lie Leu Aan Met Glu Lya Thr Leu Lys Gly Leu Aen ser aes aso ess

Glu Ser Met Thr Glu Glu Thr Leu Lys Arg Ala Lya Glu He Gly Phe 900 90S 910

Ser Aap Lys Glu lie Ser Lys Cye Leu Gly Leu Thr Glu Ala Gin Thr 915 920 92S

Arg Glu Leu Arg Leu Lya Lya Aan lie Hla Pro Trp Val Lys Gin lie 930 93S 940

Asp Thr Leu Ala Ala Glu Tyr Pro Ser val Thr Aan Tyr Leu Tyr val 94S 950 9SS 960

Thr Tyr Asn Gly Gin Glu Hla Aep Val Asn Phe Aap Aap Hia Gly Mec 965 970 975

Met Val Leu Gly Cys Gly Pro-Tyr Hia lie Gly Ser Ser Val Glu Phe 980 . 90S 990

Asp Trp Cys Ala Vál Ser Ser lie Arg Thr Leu Arg Gin Leu Gly Lys 995 1000 1005

Lye Thr Val Val Val Aan Cys Asn Pro Glu Thr Val Ser Thr Aap Phe 1010 1015 1020

Asp Glu Cye Asp Lya Leu Tyr Phe Glu Glu Leu Ser Leu Glu Arg lie 1035 1030 1035 1040

Leu Aap He Tyr Hia Gin Glu Ala Cya Gly Gly Cys He lie Ser val 1045 1050 1055

Gly Gly Gin He Pro Aan Aan Leu Ala Val Pro Leu Tyr Lys Asn Gly 1060 1065 1070

Val Lya lie Mec Gly Thr ser Pro Leu Gin He Aap Arg Ala Glu Aep 1075 10a0 1085

Arg Ser lie Phe Ser Ala Val Leu Asp Glu Leu Lys Val Ala Gin Ala 1090 1095 1100

Pro Trp Lye Ala Val Aan Thr Leu Asn Glu Ala Leu Glu Phe Ala Lya 1105 1110 Ills 1120

Ser Val Asp Tyr Pro Cye Leu Leu Arg Pro Ser Tyr Val Lau Ser Gly 1125 1130 1135

Ser Ala Met Aan Val Val Phe Ser Glu Asp Glu Mec Lys Lys Phe Leu 1140 1145 1150

Glu Glu Ala Thr Arg Val Ser Gin Glu Hia Pro Val Val Leu Thr Lya 11SS 1160 lies

Phe Val Glu Gly Ala Arg Glu Val Glu Met Asp Ala val Gly Lye Asp 1170 1175 1180

Gly Arg Val lie Ser His Ala lie Ser Glu His Val Glu Aep Ala Gly 11BS 1190 119$ 1200

Val His Ser Gly Aep Ala Thr Leu Met Leu Pro Thr Gin Tbr lie Ser 1205 1210 1515

Gin Gly Ala lie Glu Lys Val Lys Aep Ala Thr Arg Lye He Ala Lys 1220 1225 1230

Ala Phe Ala lie Ser Gly Pro Phe Asn Val Gin Phe Leu Val Lye Gly 1235 1240 1245

Asn Aep Val Leu Val lie Glu Cye Asn Leu Arg Ala Ser Arg Ser Phe 1250 1255 1260

Pro Phe Val Ser Lye Thr Leu Gly Val Asp Phe lie Aep Val Ala Thr 1265 1370 1275 1280

Lys Val Met lie Gly Glu Aen Val Aap Glu LyB Hie Leu Pro Thr Leu

1283 1290 129S

Aep Hie Pro lie He Pro Ala Aep Tyr Val Ala lie Lys Ala Pro Met 1300 1305 1310

Phe Ser Trp Pro Arg Leu Arg Aep Ala Aep Pro lie Leu Arg Cya Glu 1315 1320 1325

Met Ala Ser Thr Gly Glu Val Ala Cye Phe Gly Glu Gly lie Hie Thr 1330 1335 1340

Ala Phe Leu Lye Ala Met Leu ser Thr Gly Phe Lye lie Pro Gin Lye 1345 1350 1355 1360

Gly He Leu lie Gly lie Gin Gin Ser Phe Arg Pro Arg Phe Leu Gly 136S 1370 1375

Val Ala Glu Gin Leu Hie Asn Glu Gly Phe Lye Leu Phe Ala Thr Glu 1380 1385 1390

Ala Thr Ser Aep Trp Leu Aen Ala Asn Aen Val Pro Ala Thr Pro Val 1395 1400 1405

Ala Trp Pro Ser Gin Glu Gly Gin Asn Pro Ser Leu Ser Ser He Arg 1410 141S 1420

Lye Leu He Arg Asp Gly Ser He Asp Leu Val. He Aen Leu Pro Asn 1425 1430 1435 1440

Aan Asn Thr Lye Phe Val Hi» Asp Ann Tyr Val lie Arg Arg Thr Ala 144 S 1450 1455

Val Asp Ser Gly lie Pro Leu Leu Thr Asn Phe Gin Val Thr Lys Leu 1460 1465 1470

Phe Ala Glu Ala Val Gin Lys Ser Arg Lys Val A»p Ser Lys Ser Leu 1475 1480 1485

Phe His Tyr Arg Gin Tyr Ser Ala Gly Lys Ala Ala 1490 1495 1500

<210> 5 <211> 495 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> exão <222> (111)..(224) <22 0> <221> misc_feature <222> (70)..(70)

<223> n = G, A, T/U, C <400> 5 ctacttctca tgttcagcaa tttcttcttc tttatgtttt aaattacatg ttccataaaa 60 ataagaaacn cactgtgata cggtaattga ttttttcatt ttaaatgcag ctg ttt 116 gee aeg gaa gee aca tea gae tgg etc aac gcc aac aat gtc ect gee 164 ace cca gtg gca tgg ccg tct caa gaa gga cag aat ccc age etc tct 213 tec ate aga aag taagaaetag gcatactgtt ttctgaaata atttagagga 264 ttaactttga gaaccagtat atgaatattc accttgcttg attgcaagtc ttttaaaaca 324 aatttaaaaa tgaatacatt tgtggatgat tgtcaagttt caetctccat cactatggaa 304 tacataacgt catgtgtaca tggtgatatg aaacgtgttt eaaaatactt ettagtaagg 444 atactttcct tgacggaaac aagtgagagt atgaagaatg taatgeagea c 495 <210> 6 <211> 20

<212> ADN <213> Homo sapiens <400> 6 agctgtttgc cacggaagcc20

<210> 7 <211> 28 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 7 cccagcctct cttccatcag aaagtaag 28

<210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 8 cacggaagcc acatcagact20

<210> 9 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 9 ttctgatgga agagaggctt g 21

<210> 10 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 10 agagtgaaac ttgacaatca tcca24

<210> 11 <211> 5761 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>

<221> CDS <222> (124).. (4626) <4 Ο 0> 11 gtcagcctta aacactgact gcacccctcc cagattcctt ttacactaac taaaaagtct 60 tatcacacaa tctcataaaa tttatgCaac ttcatttaat tttagccaca aatcatcttc 120 aaa atg acg agg tta ttg aca get ttc aaa gtg gtg agg aca ctg aag 168

Met Thr Arg Leu Leu Tbr Ala Phe Lya Val Val Arg Thr Leu Lye

15 10 IS act ggt ttt ggc ttt see aat gtg act gca cac caa aaa tgg aaa ttt 216

Tbr Gly Phe Gly Phe Thr Aan Val Thr Ala Hie Gin Lye Trp Lye Phe 20 25 30 tea aga cct ggc ate agg etc etc tet gtc aag gca cag aca gca cac 264

Ser Arg Pro Gly lie Arg Leu Leu Ser Val Lye Ala Gin Thr Ala Hie 35 40 45 att gtc ctg gaa gat gga act aag atg aaa ggt tac tcc ttt ggc cat 312

He Val Leu Glu Asp Gly Thr Lye Met Lye Gly Tyr Ser Phe Cly Hie 50 55 60 cca tec tet gtt get ggt gaa gtg gtt ttt aat act ggc ctg gga ggg 360

Pro Ser Ser Val Ala Gly Glu Val Val Phe Aan Thr Gly Leu Gly Gly 65 70 75 tac cca gaa get att act gac cct gcc tac aaa gga cag att etc aca 408

Tyr Pro Glu Ala lie Thr Aap Pro Ala Tyr Lye Gly Gin He Leu Thr

80 85 »0 9S atg gcc aac cct att att ggg aat ggt gga get cct gat act act get 456

Met Ala Abu Pro He He Gly Aen Gly Gly Ala Pro Aap Thr Tbr Ala 100 105 110 ctg gat gaa ctg gga ett age aaa tat ttg gag tet aat gga ate aag 504

Leu Asp Glu Leu Gly Leu Ser Lya Tyr Leu Glu Ser Aan Gly He Lys 11S 120 125 gcc tea ggt teg ctg geg ctg gat tat agt aaa gac tac aac cac tgg 552

Val Ser Gly Leu Leu Val Leu Asp Tyr Ser Lys Aap Tyr Aen His Trp 130 13S 140 ctg get acc aag agt tta ggg caa tgg eta cag gaa gaa aag gte cct 600

Leu Ala Thr Lye Ser Leu Sly Oln Trp Leu Gin Glu Glu Lys Val Pro 145 ISO 155 gea att tac gga gtg gac aca aga atg ctg act aaa ata act egg gac 64e

Ala He Tyr Gly val Asp Thr Arg Met Leu Thr Lye lie lie Arg Aap 160 165 170 175 aag ggc acc atg etc ggg aag att gaa etc gaa ggt cag cct gtg gat 696

Lye Gly Thr Met Leu Gly Lys lie Glu Phe Glu Gly Gin Pro Val Aap 180 105 190 etc gtg gat cca aac aaa cag aat teg ate.get gag gtt tea acc aag 744

Phe Val Asp Pro Aen Lys Gin Asn Leu He Ala Glu Val Ser Thr Lye 195 200 205 gat gtc aaa gtg tac ggc aaa gga aac ccc aca aaa gtg gta get gta 792

Aep Val Lye Val Tyr Gly Lye Gly Asn Pro Thr Lys Val Val Ala Val 210 215 220 gac tgc ggg att aaa aac aat gta ate ege ctg eta gta aag ega gga 840

Aep Cye Gly lie Lye Asn Asn Val lie Arg Leu Leu Val Lye Arg Gly 225 230 235 get gaa gtg cac tta gtt ccc tgg aac cat gat etc acc aag atg gag 888

Ala Glu Val His Leu Val Pro Trp Asn Hie Aep Phe Thr Lye Met Glu 240 245 250 255 tat gat ggg att ttg ate geg gga gga ccg ggg aac cca get ett gea 936

Tyr Asp Gly lie Leu lie Ala Gly Gly Pro Gly Aen Pro Ala Leu Ala 260 265 270 gaa cca eta att cag aat gtc aga aag act ttg gag agt gat ege aag 984

Glu Pro Leu He Gin Asn Val Arg Lys lie Leu Glu Ser Asp Arg Lys 275 250 205 gag cca ttg ttt gga ate agt aca gga aac tta ata aca gga ttg get 1032

Glu Pro Leu Phe Gly He Ser Thr Gly Aen Leu He Thr Gly Leu Ala 290 295 300 get ggt gcc aaa acc tac sag atg tcc atg gcc aac aga ggg cag aat 1080

Ala Gly Ala Lye Thr Tyr Lye Met Ser Met Ala Asn Arg Gly Gin Aen 305 310 315 cag cct gtt ttg aat ate aca aac aaa cag get ttc att act get cag 1128

Gin Pro Val Leu Asn lie Thr Aen Lys Gin Ala Phe lie Thr Ala Gin 920 90S 330 335 aat cat ggc tat gcc ttg gac aac acc etc cct get ggc tgg aaa cca 1170

Asn His Gly Tyr Ala Leu Asp Asn Thr Leu Pro Ala Gly Trp Lys Pro 340 345 350 ett ttt gtg aat gtc aac gat caa aca aat gag ggg att atg cat gag 1234

Leu Phe Val Asn Val Asn Asp Gin Thr Asn Glu Gly lie Met Hla Glu 35$ 360 365 age aaa ccc ttc ttc get gtg cag ttc cac cca gag gtc acc ccg ggg 1272

Ser Lys Pro Phe Phe Ala Val Gin Phe His Pro Glu Val Thr Pro Gly 370 375 380 cca ata gac act gag tac ctg ttt gat tcc ttt ttc tea ctg ata aag 1320

Pro lie Asp Thr Glu Tyr Leu Phe Asp Ser Phe Phe Ser Leu lie Lys 385 390 355 aaa gga aaa get acc acc att aca tea gtc tta ccg aag cca gca eta 1368

Lys Gly Lys Ala Thr Thr lie Thr Ser Val Leu Pro Lys Pro Ala Leu 400 405 410 415 gtt gca tet egg gtt gag gtt tcc aaa gtc ett att eta gga tea gga 1416

Val Ala Ser Arg Val Glu Val Ser Lye Val Leu lie Leu Gly Ser Gly 430 425 430 ggt ctg tcc att ggt cag get gga gaa ttt gat tac tea gga tet caa 1464

Gly Leu Ser He Gly Gin Ala Gly Glu Phe Aep Tyr Ser Gly Ser Gin 435 440 445 get gta aaa gcc atg aag gaa gaa aat gtc aaa act gtt ctg atg aac 1512

Ala Val Lys Ala net Lys Glu Glu Asn Val Lys Thr Val Leu Met Aon 4S0 455 460 cca aac att gca tea gcc cag acc aat gag gtg ggc tta aag caa geg 1560

Pro Aen lie Ala Ser Val Glu Thr Asn Glu Val Gly Leu Lys Gin Ala

465 470 47S gat act gtc tac ttt ett ccc ate acc cct cag ttt gtc aca gag gtc 1608

Aep Thr Val Tyr Phe Leu Pro He Thr Pro Gin Phe val Thr Glu Val 480 485 490 495 ate aag gca gaa cag cca gat ggg tta att ctg ggc atg ggt ggc cag 1656 lie Lys Ala Glu Gin pro Aep Gly Leu lie Leu Gly Met Gly Gly Gin 500 505 510 aca get ctg aac tgt gga gtg gaa eta ttc aag aga ggt gtg etc aag 1704

Thr Ala Leu Aen Cye Gly Val Glu Leu Phe Lye Arg Gly Val Leu Lya

515 520 52S gaa tat ggt gtg aaa gtc ctg gga act tea gtt gag tcc att atg get 17S2

Glu Tyr Gly Val Lys Val Leu Gly Thr Ser Val Glu Ser lie Met Ala 530 S3S 540 aeg gaa gac egg cag ctg etc tea gat aaa eta aat gag ate aat gaa 1800

Thr Glu Asp Arg da Leu Phe set Asp Lye Leu Aen Qlu He Asa Clu 545 550 555 aag att get cca agt ttt gca gtg gaa teg att gag gat gca ctg aag 1848

Lye lie Ala Pro Ser Phe Ala Val Glu Set lie Glu Aop Ala Leu Lys 560 56S S70 575 gca gca gac ace act ggc tac cca gtg atg ate cgt tec gcc tat gca 1896

Ala Ala Asp Tbr He Gly Tyr Pro Val Met He Arg Ser Ala Tyr Ala 580 585 590 ctg ggt ggg tea ggc tea ggc ate tgt ccc aac aga gag act ttg atg 1944

Leu Gly Gly Leu Gly Ser Gly He Cys pro Asn Arg Glu Thr Leu Met

59S GOO 60S gac etc age aca aag gcc ttt get atg acc aac caa att ctg gtg gag 1992

Asp Leu Ser Thr Lya Ala Phe Ala Met Thr Asn Glu He Leu Val Glu 610 615 620 aag tea gtg aca ggt tgg aaa gaa ata gaa tat gaa gtg gtt ega gat 2040

Lys Ser val Thr Gly Trp Lye Glu He Glu Tyr Glu Val Val Arg Asp 625 630 635 get gat gac aat tgt gee act gtc tgt aac atg gaa aat gtt gac gcc 2088

Ala Asp Asp Asn Cya Val Thr Val Cye Aen Met Glu Asn Val Asp Ala 640 64S 650 655 atg ggt gtt cac aca ggc gac tea gtt gtt gtg get cct gcc cag aca 2136

Met Gly Val His Thr Gly Asp Ser val Val Val Ala Pro Ala Gin Thr 660 665 670 etc tcc aat gcc gag ttt cag atg ttg aga cgt act tea ate aat gtt 2184

Leu Ser Asn Ala Glu Phe Gin Met Leu Arg Arg Thr Ser He Asn Val 675 680 685 . gtt ogc cac ttg ggc att gtg ggt gaa tgc aac att cag ttt gcc ett 2232

Val Arg His Leu Gly He val Gly Glu Cye Asn lie Gin Phe Ala Leu 690 695 700 cat cct acc tea atg gaa tac tgc ate att gaa gtg aat gcc aga ctg 2280

Hie Pro Thr Ser Met Glu Tyr Cys lie He Glu Val Ash Ala Arg Leu 70S 710 715 tec ega age tet get ctg gcc tea aaa gcc act ggc tac cca ttg gca 2328

Ser Arg Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lye Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala 720 72S 730 735 ttc att get gca aag att gcc eta gga ate cca etc cca gaa att aag 2376

Phe lie Ala Ala Lya He Ala Leu Gly He Pro Leu Pro Glu lie Lys 740 74S 750 aac gtc gta tcc ggg aag aca tea gee tgt ttt gaa cct age ctg gat 3434

Aen Val Val Ser Gly Lye Thr Ser Ala Cyo Phe Glu Pro Ser Leu Aep 755 760 765 tac atg gtc ace aag att ece ege tgg gat ett gac cgt ttt eat gga 2472

Tyr Met Val Thr Lye lie Pro Arg Trp Aep Leu Αβρ Arg Phe Hie Gly 770 775 700 aca tet age ega att ggt age tet atg aaa agt gta gga gag gtc atg 2520

Thr Ser Ser Arg lie Gly Ser Ser Met Lys Ser Val Gly Glu Val Met 785 790 795 get att ggt cgt acc ttt gag gag agt ttc cag aaa get tta egg atg 2568

Ala lie Gly Arg Thr Phe Glu Glu Ser Phe Gin Lye Ala Leu Arg Met 800 805 810 815 tgc cac cca tet ata gaa ggt ttc act ccc cgt etc cca atg aac aaa 2616

Cye Hie Pro Ser lie Glu Gly Phe Thr Pro Arg Leu Pro Met Aan Lya 820 82S 830 gaa tgg cca tet aat tta gat ett aga aaa gag ttg tet gaa cca age 3664

Glu Trp Pro Ser Aan Leu Asp Leu Arg Lya Glu Leu Ser Glu Pro Ser 835 840 . 845 age aeg cgt ate tat gcc att gcc aag gcc act gat gac aac atg tcc 3712

Ser Thr Arg lie Tyr Ala lie Ala Lys Ala lie Aap Aap Am Met Ser 850 855 860 ett gat gag att gag aag etc aca tac att gac aag tgg ttt ttg tat 2760

Leu Asp Glu lie Glu Lya Leu Thr Tyr He Asp Lys Trp Phe Leu Tyr 865 870 875 aag atg cgt gat att tta aac atg gaa aag aca ctg aaa ggg etc aac 2808

LyB Met Arg Asp lie Leu Asn Met Glu Lye Thr Leu Lye Gly Leu Aan 880 885 890 895 agt gag tcc atg aca gaa gaa acc ctg aaa agg gca aag gag att ggg 2856

Ser Glu Sar Mat Thr Glu Glu Thr Leu Lye Arg Ala Lye Glu lie Gly 900 90S 910 ttc tea gat aag cag att tea aaa tge ett ggg etc act gag gcc cag 2904

Phe Ser Aep Lye Gin lie Ser Lye Cya Leu Gly Leu Thr Glu Ala Gin 915 920 925 aca agg gag ctg agg tta aag aaa aac ate cac cct tgg gtt aaa cag 29S2

Thr Arg Glu Leu Arg Leu Lye Lys Aan He His Pro Trp Val Lya Gin 930 935 940 att gat aca ctg get gca gaa tac cca tea gta aca aac tat etc tat 3000

He Aap Thr Leu Ala Ala Glu Tyr Pro Ser Val Thr Asn Tyr Leu Tyr 945 9S0 955 get ace tac aat ggt cag gag cat gat gtc aat ttt gat gac cat gga 3048

Val Thr Tyr Aen Gly Gin Glu Hi* Aep Val Aan Phe Asp Aap Hie Gly

940 965 970 97S atg atg gtg eta ggc tgt ggt cca tat cac att ggc age agt gtg gaa 3096

Met Met Val Leu Gly Cye Gly Pro Tyr Hie lie Gly Ser Ser Val Glu 980 985 990 ttt gat tgg tgt get gtc tet agt ate ege aca ctg cgt caa ett ggc 3144

Phe Aep Trp Cya Ala Val Ser Ser He Arg Thr Leu Arg Gin Leu Gly 99$ 1000 1005 . aag aag aeg gtg gtg gtg aat tgc aat cct gag act gtg age aca gac 3192

Lye Lys Thr Val val Val Aan Cya Aon Pro Glu Thr Val Ser Thr Aap 1010 101S 1020 ttt gat gag tgt gac aaa ctg tac ttt gaa gag ttg tcc ttg gag aga 3240

Phe Aap Glu Cya Aap Lye Leu Tyr Phe Glu Glu Leu Ser Leu Glu Arg 1025 1030 1035 ate eta gac ate tac cat cag gag gca tgt ggt ggc tgc ate ata tea 3208 lie Leu Aap lie Tyr Hie Gin Glu Ala Cya Gly Gly Cya He lie Ser

1040 1045 1050 10SS gtc gga ggc cag att cca aac aac ctg gca gtt cct eta tac aag aat 3336

Val Gly Gly Gin lie Pro Aan Aan Leu Ala Val Pro Leu Tyr Lye Aan 1060 1065 1070 ggt gtc aag ate atg ggc aca age ccc ctg cag ate gac agg get gag 3304

Gly Val Lya He Met Gly Thr Ser Pro Leu Gin lie Aep Arg Ala Glu 1075 1080 1085 gat ege tcc ate ttc tea get gtc ttg gat gag ctg aag gtg get cag 3432

Aap Arg Ser lie Phe Ser Ala Val Leu Aep Glu Leu Lye Val Ala Gin 1090 1095 1100 gca cct tgg aaa get gtt aat act ttg aat gaa gca ctg gaa ttt gca 3480

Ala Pro Trp Lya Ala Val Aan Thr Leu Aan Glu Ala Leu Glu Phe Ala 110S 1110 1115 aag tet gtg gac tac ccc tgc ttg ttg agg cct tcc tat gtt ttg agt 3528

Lya Ser Val hap Tyr Pro Cya Leu Leu Arg Pro Ser Tyr Val Leu Ser 1120 1125 1130 113$ ggg tet get atg aat gtg gta ttc tet gag gat gag atg aaa aaa ttc 3S76

Gly Ser Ala Met Aen Val val Phe Ser Glu Asp Glu Met Lya Lya Phe 1140 114$ 1150 cca gaa gag geg act aga gtt tet cag gag cac cca gtg gtc ctg aca 3624

Leu Glu Glu Ala Thr Arg Val Ser Gin Glu Hie Pro Val Val Leu Thr liss 1160 lies aaa etc gee gaa ggg gee ega gaa gta gaa atg gae get gtt ggc aaa 3672

Lya Phe Val Glu Gly Ala Arg Clu Val Glu Mat Aap Ala Val Sly Lye 1170 1175 1180 gat gga agg gtt ate tee cat gee ate tet gaa cat get gaa gat gea 3720

Asp Gly Arg Val lie Ser Hie Ala He Ser Glu His val Glu Asp Ala 118S 1190 1195 ggt gte cac teg gga gat gee act ccg atg ctg ecc aea eaa ace ate 3765

Gly Val His Ser Gly Asp Ala Thr Leu Met Leu Pro Thr Glo Thr He 1200 1205 1210 1215 age eaa. ggg gee att gaa aag gtg aag gae get acc egg aag act gea 3816

Ser Gin Gly Ala lie Glu Lys Val Lys Asp Ala Thr Arg Lye He Ala 1220 1225 1230 aag get ttt gee ate tet ggt cca ttc aac gte eaa ttt ett gte aaa 3864

Lye Ala Phe Ala He Ser Gly Pro Fbe Aan Val Gin Pbe Leu Val Lys 123S 1240 1245 gga aat gat gte ttg gtg att gag tgt aac ttg aga get tet ega tee 3912

Gly Asn Asp Val Leu Val lie Glu Cys Aen Leu Arg Ala Ser Arg Ser 1250 1255 1260 ttc ccc ttt gtt tee aag act ett ggg gtt gae ttc att gat gtg gee 3960

Phe Pro Pbe Val Ser Lys Thr Leu Gly Val Asp Phe lie Asp Val Ala 1265 1270 1275 acc aag gtg atg att gga gag aat gtt gat gag aaa cat ett cca aea 4008

Thr Lys Val Met He Gly Glu Aan Val Aep Glu Lys Hie Leu Pro Thr 1280 1285 1290 1295 ttg gae cat ccc ata att ecc get gae tat gtt gea att aag get ccc 4056

Leu Asp His Pro lie He Pro Ala Asp Tyr Val Ala lie Lys Ala Pro 1300 1305 1310 atg ttt tec tgg ccc egg ttg agg gat get gae ccc att ctg aga tgt 4104

Met Phe Ser Trp Pro Arg Leu Arg Asp Ala Aep Pro lie Leu Arg Cys 1315 1320 1325 gag atg get tee act gga gag gtg get tgc ttt ggt gaa ggt att cat 4152

Glu Met Ala Ser Thr Gly Glu Val Ala Cys Phe Gly Glu Gly lie His 1330 1335 1340 aea gee ttc eta aag gea atg ett tec aea gga ett aag ata ccc cag 4200

Thr Ala Pbe Leu Lys Ala Met Leu Ser Thr Gly Phe Lye He Pro Gin 1345 1350 1355 aaa ggc ate ctg ata ggc ate cag eaa tea ttc egg cca aga ttc ett 4248

Lya Gly He Leu He Gly He Gin Gin Ser Phe Arg Pro Arg Phe Leu 1360 1365 1370 1375 ggt gtg get gaa cm tea cac ut gaa ggt etc aag ctg ttt gee a eg 4396

Gly Val Ala Glu Gin Leu Hi· Asn Glu Gly phe Ly· Leu Phe Ala Thr 1360 1385 1390 gaa gee aca tea gac egg cte aae gee aac aat gtc cct gee aac cea 4344

Glu Ala Thr Set Asp Trp Leu Aan Ala Asn Asa Val Pro Ala Asa Pro 1395 1400 1405 gtg gca egg ccg tet caa gaa gga cag aat ccc age etc tet tee ate 4392

Val Ala Trp Pro Ser Gin Glu Gly Gin Aan Pro Ser Leu Ser Ser He 1410 1415 1420 aga aaa ttg att aga gat ggc age att gac eta gtg att aac ett ccc 4440

Arg Lye Leu lie Arg Asp Gly Ser lie Aep Leu Val lie Αβπ Leu Pro 1425 1430 1435 aac aac aac act aaa ttt gtc cat gat aat tat gtg att egg agg aca 4488

Aan Aan Asn Thr Ly· Phe val His Asp Aan Tyr val He Arg Arg Thr 1440 1445 1450 1455 get gtt gat agt gga ate cct etc etc act aat ttt cag gtg ace aaa 4S36

Ala val Asp Ser Gly He Pro Leu Leu Thr Asn Phe Gin Val Thr Lye 1460 1465 1470 ett ttt get gaa get gtg cag aaa tet ege aag gtg gac tee ãag agt 4584

Leu Phe Ala Glu Ala val Gin Lye ser Arg Lye val Asp Ser Lye Ser 1475 1480 1485 ett ttc cac tac agg cag tac agt get gga aaa gca gca tag 4626

Leu Phe His Tyr Arg Gin Tyr Ser Ala Gly Lys Ala Ala 1490 1495 1500 agatgeagae accccagccc eattattaaa tcaacctgag ecacatgtta tctaaaggaa 4686 ctgattcaca actttctcag agatgaatat tgataactaa acttcatttc agtttacttt 4746 - gttatgeett aatattctgt gtcttttgca attaaattgt cagtcacttc ttcaaaacct 4806 tacagtcctt cctaagttac tcttcatgag atttcatcca tttactaata ctgtattttt 4866 ggtggactãg gcttgcctat gtgcttatgt gtagcttttt actttttatg gtgctgatta 4926 atggtgatca aggtaggaaa agttgctgtt ctattttctg aactctttct ataetttaag 4986 atactctatt tttaaaacac tatctgcaaa ctcaggacac tttaacaggg cagaatactc 5046 taaaaacttg ataaaatgaa atatagattt aatttatgaa ccttccatca tgatgtttgt 5106 gtattgette tttttggatc cteattetca cccatttgge taatccagga atattgttat 5166 cccttcccat tatattgaag ttgagaaatg tgacagaggc atttagagta tggacttttc 5226 ttttcttttt ctttctcttt ttttcttttt gagatggagt cacactcccc aggccggagt 5286 gcagtggcac aatctcggct caccgcaatt tgcgtctccc aagttcaagc gattctcccg 5346 ctttagacta tggacttctc taaggaacac tggtttgcag tcttgtttcc tggactatat 5406 cagcagatgg tagacagtgt ttacgtagat gtgttgttgt ttttatcatt ggattttaac 5466 ttggcccgag tgaaataatc agatttttgt cattcacact ctcccccagt tttggaataa S536 cttggaagta aggttcattc ccttaagacg atggattctg ttgaactatg gggtcecaea 5586 ctgcactatt aattccaccc actgtaaggg caaggacacc attccttcta catataagaa 5646 aaaagtctct ccccaagggc agcctttgtt acttttaaat attttcegtt attacaagtg 5706 ctctaattgt gaacCtttaa ataaaatact attaagaggt aaaaaaaaaa aaaaa 5761

<210> 12 <211> 1500 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 12

Met Thr Arg Leu Leu Thr Ala Phe lye Val Val Arg Thr Leu Lye Thr 1 S 10 15

Cly Phe Gly Phe Thr am Val Thr Ala Hie Gin Lys Trp Lye Phe Ser 20 25 30

Arg Pro Gly lie Arg Leu Leu Ser Val Ly· Ala Gin Thr Ala Hie lie 35 40 45

Val Leu Glu Asp Gly Thr Lys Met Lye Gly Tyr Ser Phe Gly Hia Pro 50 55 60

Ser Ser Val Ala Gly Glu Val Val Phe Aan Thr Gly Leu Gly Gly Tyr 6S 70 75 80

Pro Glu Ala lie Thr Asp Fro Ala Tyr Lye Gly Gin lie Leu Thr Met 85 90 95

Ala AM Fro lie lie Gly Aen Gly Gly Ala Pro Aap Thr Thr Ala Leu 100 105 110

Aap Glu Leu Gly Leu Ser Lys Tyr Leu Glu Ser Aen Gly lie Lye Val 115 120 125

Ser Gly Leu Leu Vai Leu Asp Tyr Ser Lys Aap Tyr Aen Hia Trp Leu 130 135 140

Ala Thr Lys Ser Leu Sly Gin Trp Leu Gin Glu Glu Lya Vai Pro Ala 14S 150 15S 160 lie Tyr Gly Vai Aap Thr Arg Met Leu Thr Lya lie Ile Arg Aap Lya 165 170 175

Gly Thr Met Leu Gly Lya 11« Glu Pbe Glu Gly Gin Pro Vai Aap Phe 1Θ0 IBS 1»0

Vai Aap Pro Asn Lya Gin Aan Leu Ile Ala Glu Vai Ser Thr Lys Aap 195 300 305

Vai Lya Vai Tyr Gly Lya Gly Aan Pro Thr Lya Vai Vai Ala Vai Aap 310 21S 220

Cya Gly Ile Lya Aan Aan Vai Ile Arg Leu Leu Vai Lya Arg Gly Ala 225 230 235 340

Glu Vai Híb Leu Vai Pro Trp Aan Hia Aap Phe Thr Lya Met Glu Tyr 34S 350 255

Aap Gly lie Leu lie Ala Gly Gly Pro Gly Aan Pro Ala Leu Ala Glu 260 265 370

Pro Leu Ile Gin Aan Vai Arg Lya Ile Leu Glu Ser Aap Arg Lya Glu 275 280 IBS

Pro Leu Phe Gly Ile Ser Thr Gly Asn Leu ile Thr Gly Leu Ala Ala 390 295 300

Gly Ala Lya Thr Tyr Lys Met Ser Het Ala Aan Arg Gly Gin Aan Gin 305 310 315 320

Pro Vai Leu Aen Ile Thr Aan Lya Gin Ala Phe Ile Thr Ala Gin Asn 325 330 335

Hia Gly Tyr Ala Leu Aap Aan Thr Leu Pro Ala Gly Trp Lya Pro Leu 340 345 350

Phe Vai Aan Vai Aan Aap Gin Thr Aen Glu Gly lie Met Hia Glu Ser 355 360 365

Lye Pro Phe Phe Ala Vai Gin Phe Hia Pro Glu Vai Thr Pro Gly Pro 370 375 380 lie Aap Thr Glu Tyr Leu Phe Aap Ser Phe Phe Ser Leu Ile Lya Lya 38S 390 395 400

Gly Lya Ala Thr Thr Ile Thr Ser Vai Leu Pro Lya Pro Ala Leu Vai 405 410 415

Ala Ser Arg Vai Clu Vai Ser Lye Vai Leu lie Leu Gly Ser Cly Gly 420 435 430

Leu Ser lie Gly Gin Ala Gly Glu Phe Asp Tyr Ser Gly Ser Gin Ala 435 440 445

Vai Lya Ala Met Lye Glu Glu Asn Vai Lye Thr Vai Leu Met Aen Pro 450 455 460

Asn Ile Ala Ser Vai Glu Thr Aan Glu Vai Gly Leu Lys Gin Ala Asp 465 470 475 400

Thr Vai Tyr Phe Leu Pro He Thr Pro Gin Phe Vai Thr Glu vai lie 485 490 495

Lys Ala Glu Gin Pro Asp Gly Leu Ile Leu Gly Net Gly Gly Gin Thr 500 505 510

Ala Leu Aan Cys Gly Vai Glu Leu Phe Lys Arg Gly Vai Leu Lya Glu 515 530 52S

Tyr Gly Vai Lys Vai Leu Gly Thr Ser Vai Glu Ser lie Met Ala Thr 530 S3S 540

Glu Aep Arg Gin Leu Phe Ser Aap Lye Leu Asn Glu Ile Abo Glu Lys 545 550 555 560

He Ala Pro Ser Phe Ala Vai Glu Ser Ile Glu Asp Ala Leu Lys Ala 565 570 575

Ma Asp Thr Ile Gly Tyr Pro Vai Met lie Arg Ser Ala Tyr Ma Leu 580 SBS 590

Gly Gly Leu Gly Ser Gly He Cys Pro Asn Arg Glu Thr Leu Met Asp 595 600 605

Leu ser Thr Lys Ma Phe Ala Met Thr Asn Gin Ile Leu Vai Glu Lys 610 615 620

Ser Vai Thr Gly Trp Lys Glu Ile Glu Tyr Glu Vai Vai Arg Asp Ma 625 630 635 640

Asp Asp Asn Cys Vai Thr Vai Cys Asn Met Glu Asn Vai Asp Ma Met 645 650 655

Gly Vai Hie Thr Gly Asp ser Vai Vai Vai Ala Pro Ala Gin Thr Leu 660 66S 670

Ser Asn Ma Glu Phe Gin Met Leu Arg Arg Thr Ser Ile Asn Vai Vai 675 680 685

Arg Hie Leu Gly lie Val Gly Glu Cya Aan lie Gin Phe Ala Leu Hie 690 <95 700

Pro Thr Ser Met Glu Tyr Cye lie lie Glu Val Aon Ala Arg Leu Ser 70S 710 71S 720

Arg Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala Phe 72S 730 735

He Ala Ala Lye lie Ala Leu Gly lie Pro Leu Pro Glu lie Lye Asn 740 74S 7S0

Val Val Ser Gly Lya Thr Ser Ala Cya Phe Glu Pro Ser Leu Asp Tyr 75S 760 765

Met Val Thr Lya He Pro Arg Trp Aep Leu Asp Arg Phe Hie Gly Thr 770 775 780

Ser Ser Arg lie Gly Ser Ser Met Lya Ser Val Gly Glu Val Met Ala 785 790 795 800 lie Gly Arg Thr Phe Glu Glu Ser Phe Gin Lya Ala Leu Arg Met.Cya

80S 810 BIS

Hia Pro Ser lie Glu Gly Phe Thr Pro Arg Leu Pro Met Asn Lye Glu 820 825 B30

Trp Pro Ser Asn Leu Asp Leu Arg Lya Glu Leu Ser Glu Pro Ser Ser 835 840 845

Thr Arg He Tyr Ala lie Ala Lya Ala He Asp Aep Aan Met Ser Leu 850 855 860

Aap Glu He Glu Lys Leu Thr Tyr He Aep Lya Trp Phe Leu Tyr Lya 665 870 875 880

Met Arg Aap He Leu Aan Met Glu Lys Thr Leu Lya Gly Leu Asn Ser 88S 890 895

Glu Ser Met Thr Glu Glu Thr Leu Lya Arg Ala Lya Glu lie Gly Phe 900 90S 910

Ser Aap Lye Gin He Ser Lys Cya Leu Gly Leu Thr Glu-Ala Gin Thr 915 920 925

Arg Glu Leu Arg Leu Lye Lya Aan He His Pro Trp Val Lya Gin lie 930 935 940

Asp Thr Leu Ala Ala Glu Tyr Pro Ser Val Thr Aan Tyr Leu Tyr Val 945 950 955 960

Thr Tyr Aan Gly Gin Glu His Aap Val Aan Phe Aap Asp Hia Gly Met

965 970 S7S

Met Val Leu Gly Cye Cly Pro Tyr His lie Gly Ser Ser Val Glu Phe 980 985 990

Aep Trp Cye Ala Val Ser Ser He Arg Thr Leu Arg Gin Leu Gly Lye 995 1000 100S

Lye Thr Val Val Val Asn Cys Asa Pro Glu Thr Val Ser Thr Asp Phe 1010 101S 1020

Asp Clu Cys Asp tye Leu Tyr Phe Glu Glu Leu Ser Leu Glu Arg lie 1025 1030 1035 1040

Leu Asp lie Tyr His Gin Glu Ala Cys Gly Gly Cye lie lie Ser Val 1045 1050 1055

Gly Gly Gin lie Pro Asn Asn Leu Ala Val Pro Leu Tyr Lye Asn Gly 10C0 1065 1070

Val Lye lie Met Gly Thr Ser Pro Leu Gin He Asp Are Ala Glu Asp 1075 1080 1085

Arg Ser lie Phe Ser Ala val Leu A8p Glu Leu Lya Vel Ala Gin Ala 1090 1095 1100

Pro Trp Lye Ala Val Asn Thr Leu Asn Glu Ala Leu Glu Phe Ala Lye 1105 1110 1115 1120

Ser Val Asp Tyr Pro Cys Leu Leu Arg Pro Ser Tyr Val Leu Ser Gly 1125 1130 1135

Ser Ala Met Asn Val val Phe Ser Glu Asp Glu Met Lye Lys Phe Leu 1140 1145 1150

Glu Glu Ala Thr Arg Val Ser Cln Clu Hie Pro Val Val Leu Thr Lye 1155 1160 1165

Phe Val Glu Gly Ala Arg Glu Val Glu Met Asp Ala Val Gly Lys Asp 1170 1175 1180

Cly Arg Val lie Ser Mia Ala lie Ser Glu His Val Glu Asp Ala Gly 1185 1190 1195 1200

Val His Ser Gly Asp Ala Thr Leu Met Leu Pro Thr Gin Thr lie Ser 1205 1210 1215

Gin Gly Ala lie Glu Lys Val Lys Asp Ala Thr Arg Lye lie Ala Lys 1220 1225 1230

Ala Phe Ala lie Ser Gly Pro Phe Asn Val Gin Phe Leu Val Lye Gly 1235 1240 1245

Asa Asp Val Leu Val He Glu Cys Asa Leu Arg Ale Ser Arg See Phe 1350 1255 1250

Pro Phe Val Ser Lys Thr Leu Gly Val Asp Phe He Asp Val Ala The 1355 1270 127S 1250

Lye Val Net lie Gly Glu Asa Val Asp Glu Lys His Leu Pro Thr Leu 1385 1250 1295

Asp His Pro lie He Pro Ala Asp Tyr val Ala lie Lys Ala Pro Met 1300 1305 1310

Phe Ser Trp Pro Arg Leu Arg Asp Ale Asp Pro lie Leu Arg Cys Glu 1315 1320 1325

Met Ala Ser Thr Gly Glu Val Ala Cys Phe Gly Glu Gly lie His Thr 1330 1335 1340

Ala Phe Leu Lys Ala Met Leu Ser Thr Gly Phe Lys He Pro Gin Lye 1345 1350 1355 1360

Gly He Leu He Gly He Gin Gin Ser Phe Arg Pro Arg Phe Leu Gly 1365 1370 1375

Val Ala Glu Gin Leu His Asm Glu Gly Phe Lye Leu Phe Ala Thr Glu 1380 1385 1390

Ala Thr Ser Asp Trp Leu Asn Ala Asa Asn Val Pro Ala Asn Pro Val 1395 1400 1405

Ala Trp Pro Ser Gin Glu Gly Gin Asn Pro Ser Leu Ser Ser lie Arg 1410 1415 1420

Lys Leu He Arg Asp Gly Ser lie Asp Leu val He Asn Leu Pro Aon 1425 1430 143S 1440

Asn Asn Thr Lys Phe val His Asp Asn Tyr Val lie Arg Arg Thr Ala 1445 1450 1455 val Asp Ser Gly lie Pro Leu Leu Thr Aon Phe Gin Val Thr Lys Leu 1460 1465 1470

Phe Ala Glu Ala Val Gin Lys Ser Arg Lys Val Aap Ser Lye Ser Leu 1475 1480 1485

Phe His Tyr Arg Gin Tyr Ser Ala Gly Lys Ala Ala 1480 1495 1500

<210> 13 <211> 5761 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>

<221> CDS <222> (124) . . (4626) <4 0 0> 13 gtcagcctca aacactgacc gcacccctcc cagattectt ttacattaac taeaaagect £0 tatcacacaa tctcataaaa tttatgtaac ttcatttaat ettagccaca aatcatcttc 120 aaa atg acg agg att act aca get tee aaa gtg gCg agg aca ccg aag 165

Met The Arg lie Ila rhr Ala Phe Lye Val Val Arg Thr Leu Lye 1 5 10 15 act ggt ttt ggc Ctt acc aat gtg ace gca cac caa aaa egg aaa ttt 21£

Thr Gly Phe Gly Phe Thr Asa Val Thr Ala His Gin Lys Trp Lys Phe 20 25 30 tea aga cct ggc ate agg etc ctt tet gtc aag gca cag aca gca cac 264

Ser Arg Pro Gly lie Arg Leu Leu Ser Val Lys Ala Gin Thr Ala His 35 40 45 att gtc ctg gaa gat gga act aag atg aaa ggt tac tcc ttt ggc cat 312 lie Val Leu Glu Asp Gly Thr Lys Met Lys Gly Tyr Ser Phe Gly His 50 SS ¢0 cca tcc tet gtt get ggt gaa gtg gtt ttt aat act ggc ctg gga ggg 360

Pro Ser Ser val Ala Gly Glu Val Val Phe Asn Thr Gly Leu Gly Gly 6S 70 75 tac cca gaa get act act gac cct gec tac aaa gga cag att etc aca 405

Tyr Pro Glu Ala lie Thr Asp Pro Ala Tyr Lys Gly Gin lie Leu Thr Θ0 85 90 95 atg gcc aac cct att att ggg aat ggt gga get cct gat act act get 456

Met Ala Aaa Pro lie lie Gly Asn Gly Gly Ala Pro Asp Thr Thr Ala 100 105 110 ctg gat gaa ctg gga ctt age aaa tat teg gag tet aat gga ate aag 504

Leu Asp Glu Leu Gly Leu Ser Lys Tyr Leu Glu Ser Asn Gly lie Lys 11S 120 125 gtt tea ggt ttg ctg gtg ctg gat tat age aaa gac tac aac cac tgg 552

Val Ser Gly Leu Leu Val Leu Asp Tyr Ser Lys Asp Tyr Asn His Trp 130 135 140 ctg get acc aag agt eta ggg caa tgg eta cag gaa gaa aag gtt cct 600

Leu Ala Thr Lya Ser Leu Gly Gin Trp Leu Gla Glu Glu Lys Val Pro

145 150 15S gea ate tat gga geg gac aca aga atg ctg see ana sea act egg gat 648

Ala tla Tyr Gly Val Asp The Arg Met Leu Thr Lye lie lie Arg Asp 160 165 170 175 aag ggt ace atg ett ggg aag ate gaa tet gaa ggt cag cct gtg gat 696

Lye Gly Thr Met Leu Gly Lys He Glu Phe Glu Gly Gin Pro Val Asp 180 185 190 ttt gtg gat cca aat aaa cag aat ttg att get gag get tea acc aag 74«

Phe Val Asp Pro Asn Lys Gin Asn Leu lie Ala Glu Val Ser Thr Lys 19$ 300 305 gat gtc aaa gtg tac gge aaa gga aac cce aca aaa gtg gta get gta 792

Aap Val Lys Val Tyr Gly Lys Gly Asn Pro Thr Lye Val Val Ala Val 210 315 230 gac tgt ggg att aaa aac aat gta ate ege ctg eta gta aag ega gga 840

Aap Cya Gly lie Lys Aen Asn Val He Arg Leu Leu Val Lys Arg Gly 225 310 235

get gaa gtg cac tta gtt ccc tgg aac eat gat tee acc aag atg gag BBS

Ala Glu Val His Leu Val Pro Trp Asn His Asp Phe Thr Lys Met Glu 240 145 250 255 tat gat ggg ate Ctg ate geg gga gga ccg ggg aac cca get ett gca 936

Tyr Asp Gly lie Leu lie Ala Gly Gly Pro Gly Asn Pro Ala Leu Ala 260 365 270 gaa cca eta att cag aat gtc aga aag att ttg gag agt gat ege aag 964

Glu Pro Leu lie Gin Asn Val Arg Lys He Leu Glu Ser Asp Arg Lys

275 280 2BS ' gág cca ttg ttt gga ate agt aca gga aac tta ata aca gga ttg get 1032

Glu Pro Leu Phe Gly He Ser Thr Gly Asn Leu lie Thr Gly Leu Ala 290 29$ 300 get ggt gee aaa acc tac aag atg tee atg gee aac aga ggg cag aat 1080

Ala Gly Ala Lys Thr Tyr Lys Met Ser Met Ala Asn Arg Gly Gin Aan 3OS 310 315 cag cct gtt ttg aat ate aca aac aaa cag get tee att act get cag 1128

Gin Pro Val Leu Aen He Thr Asn Lye Gin Ala Phe lie Thr Ala Gin 320 325 330 335 aat cat gge tat gee ttg gac aac acc etc cct get gge tgg aaa cca 1176

Aan Hia Gly Tyr Ala Leu Asp Asn Thr Leu Pro Ala Gly Trp Lys Pro 340 345 350 ett ttt gtg aat gtc aac gat caa aca aac gag ggg att atg cat gag 1324

Leu Phe Val Asn Val Asn Asp Gin Thr Asn Glu Gly Ila Met His Glu

3SS 360 36S age aaa ccc ccc ttc get gtg cag ttc cac cca gag gtc acc ccg ggg 1372

Ser Lye Pro Phe Phe Ala Val Gin Phe His pro Glu Val Thr Pro Gly 370 375 380 cca ata gac act gag tac ctg ttt gat tcc ttt ttc tea Ctg aca aag 1320

Pro lie Asp Thr Glu Tyr Leu Phe Asp Ser Phe Phe Ser Leu lie Lys 385 390 395 aaa gga aaa get acc acc ate aca cca gtc tta ccg aag cca gca eta 1368

Lys Gly Lya Ala Thr Thr lie Thr Ser Val Leu Pro Lys Pro Ala Leu 400 405 410 415 gtt gca tet egg gtt gag gtt tcc aaa gtc ett att eta gga tea gga 1416

Val Ala Ser Arg Val Glu Val Ser Lye Val Leu lie Leu Gly Ser Gly 420 425 430 ggt ctg tcc att ggt cag get gga gaa ttt gat tac tea gga tet caa 1464

Gly Leu Ser lie Gly Glu Ala Gly Glu Phe Asp Tyr Ser Gly Ser Glu 43S 440 445 get gta aaa gcc atg aag gaa gaa aat gtc aaa act gtt ctg atg aac 1512

Ala Val Lye Ala Met Lye Glu Glu Asn Val Lys Thr Val Leu Met Aen 450 455 460 cca aac att gca tea gtc cag acc aat gag gtg ggc tta aag caa geg 1560

Pro Asn lie Ala Ser Val Gin Thr Asn Glu Val Gly Leu Lys Gin Ala 46S 470 475 gat act gtc tec ttt ett ccc ate acc cct cag ttt gtc aca gag gtc 1608

Asp Thr Val Tyr Phe Leu Pro lie Thr Pro Gin Phe Val Thr Glu val 480 485 490 495 ate aag gca gaa cag cca gat ggg tta att ctg ggc atg ggt ggc cag 1656 lie Lye Ala Glu Gin Pro Asp Gly Leu He Leu Gly Met Gly Gly Gin 500 505 510 aca get ctg aac tgt gga gtg gaa eta ttc aag aga ggt gtg etc aag 1704

Thr Ala Leu Aen Cys Gly Val Glu Leu Phe Lys Arg Gly Val Leu Lys 515 520 525 gaa tat ggt gtg aaa gtc ctg gga act tea gtt gag tcc att atg get 1752

Glu Tyr Gly Val Lys Val Leu Gly Thr Ser Val Glu Ser lie Met Ala 530 535 540 aeg gaa gac agg cag ctg ttt tea gat aaa cca aat gag ate aat gaa 1800

Thr Glu Asp Arg Gin Leu Phe Ser Asp Lye Leu Aen Glu lie Asu Glu 545 550 SS5 aeg att get cca agt ttt gca gtg gaa teg att gag gat gca ctg aag 1848

Lya lie Ala Pro Ser Phe Ala Vel Glu Ser lie Glu Asp Ala Leu Lys 560 565 S70 $75 gca gca gac acc acc ggc tac cca gtg atg ate cgt tec gcc cat gca 1696

Ala Ala Asp Thr lie Gly Tyr Pro Val Hat He Arg Ser Ala Tyr Ala S60 585 S90 ctg ggt ggg tta ggc tea ggc ate tgt ccc aac aga gag act ttg atg 1944

Leu Gly Gly Leu Gly Ser Gly lie Cye Pro Aan Arg Glu Thr Leu Met

595 600 60S gac etc age aca aag gcc ttt get atg acc aac caa att ctg gtg gag 1992

Asp Leu Ser Thr Lye Ala Fhe Ala Met Thr Aan Gin lie Leu Val Glu 610 615 620 aag tea gtg aca ggt tgg aaa gaa ata gaa tat gaa gtg gtt ega gat 2040

Lya Ser Val Thr Gly Trp Lya Glu He Glu Tyr Glu Val Val Arg Asp

625 630 63S get gat gac aat tgt gtc act gtc tgt aac atg gaa aat gtt gat gcc 2066

Ala Aap Asp Asn Cya Val Thr Val Cya Aan Met Glu Aan Val Asp Ala 640 645 650 655 atg ggt gtt cac aca ggt gac tea gtt gtt gtg get cct gcc cag aca 2136

Met Gly Val Hie Thr Gly Aap Ser Val Val Val Ala Pro Ala Gin Thr 660 665 670 etc tec aat gcc gag ttt cag atg ttg aga cgt act tea ate aat gtt 2164

Leu Ser Asn Ala Glu Phe Gin Met Leu Arg Arg Thr Ser lie Asn Val 675 660 685 gtt ege cac ttg ggc att gtg ggt gaa tgc aac att cag ttt gcc ett 2232 val Arg His Leu Gly He Val Gly Glu eye Asn He Gin Phe Ala Leu 690 695 700 cat cct acc tea atg gaa tac tgc ate att gaa gtg aat gcc aga ctg 2280

Bis Pro Thr Ser Met Glu Tyr Cya lie lie Glu Val Asn Ala Arg Leu 705 710 715 tcc ega age tet get ctg gcc tea aaa gcc act ggc tac cca ttg gca 2328

Ser Arg Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala 720 725 730 735 tte att get gca aag att gcc eta gga ate cca ett eca gaa act aag 2376

Phe lie Ala Ala Lya lie Ala Leu Gly He Pro Leu Pro Glu He Lya 740 745 750 aac gcc gta tcc ggg aag aca tea gee tgt ttt gaa ccc age ctg gat 2424

Asn Val Val Ser Gly Lya Thr Ser Ala Cya Phe Glu Pro Ser Leu Aap 7SS 760 765 taç atg gtc acc aag att ccc ege tgg gat ett gac cgt ttt cat gga 2472

Tyr Met Val Thr Lya lie Pro Arg Trp Aap Leu Asp Arg Phe His Gly 770 775 700 aca tet age cga act ggc age tet aeg aaa age gta gga gag gee atg · 3530

The Ser See Arg He Sly Sec Ser Met Lya Ser Val Gly Glu Val Met 70S 790 795 get att ggt cgt ace ttt gag gag age ttc cag aaa gee tta egg atg 3560

Ala lie Gly Arg The Che Glu Glu Ser Phe Gin Lye Ala Leu Arg Met 000 005 010 015 tgc cac cea tot ata gaa ggt ttc act ccc cgt etc cca atg aac aaa 2616

Cye Hie Pro Sec He Glu Gly Phe Thr Pro Arg Leu Pro Met Aec Lya 020 035 030 gaa tgg cea tet aat tta gat ett aga aaa gag ttg tet gaa cca age 2664

Glu Trp Pro Ser Aan Leu Asp Leu Arg Lya Glu Leu Sex Glu Pro Ser 035 040 045 age aeg cgt ate tat gee att gee aag gee att gat gac aac atg tec 3712

Ser Thr Arg lie Tyr Ala lie Ala Lya Ala He Asp Asp Aen Met Ser 050 055 060 ett gat gag att gag aag etc aca tac att gac aag tgg ttt ttg tat 2760

Leu Asp GLu lie Glu Lya Leu Thr Tyr lie Aep Lye Trp Phe Leu Tyr 065 070 075 aag atg cgt gat att tta aac atg gaa aag aca ctg aaa ggg etc aac 2000

Lye Met Arg Asp He Leu Aen Met Glu Lya Thr Leu Lye Gly Leu Aen 080 085 890 095 agt gag tcc atg aca gaa gaa acc ctg aaa agg gca aag gag att ggg 2S56

Ser Glu Ser Met Thr Glu Glu Thr Leu Lye Arg Ala Lye Glu He Gly 900 »05 910 etc tea gat aag cag att tea aaa tgc ett ggg etc ace gag gcc cag 3904

Phe Ser Aep Lye Gin lie Ser Lye Cye Leu Gly Leu Thr Glu Ala Gin 915 920 925 aca agg gag ctg agg tta aag aaa aac aec cac cct tgg gtt aaa cag 2952

Thr Arg Glu Leu Arg Leu Lye Lye Aen lie Hie Pro Trp Val Lye Gin 930 935 940 att gat aca ctg get gca gaa tac cca tea gta aca aac tat etc tat 3000 lie Aep Thr Leu Ala Ala Glu Tyr Pro Ser Val Thr Aen Tyr Leu Tyr 945 950 955 gtt acc eac aat ggt cag gag cat gat gtc aat ttt gat gac cat gga 3048

Val Thr Tyr Aen Gly Gin Glu Hie Aep Val Aen Phe Aep Asp Hie Gly 960 965 970 975 atg atg gtg eta ggc tgt ggt cca tat cac att ggc age agt gtg gaa 3096

Met Met Val Leu Gly Cye Gly Pro Tyr His He Gly Ser Ser Val Glu 980 985 990 ttt sat tgg tgt get gtc tet agt ate ege aca ctg egt caa ett ggc 3144

Fhe Aap Trp eye Ala Val Ser Ser lie Arg Thr Leu Arg Gin Leu Gly

99S 1000 10ÚS aag aag aeg gtg gtg gtg aat tgc aat ect gag act gtg age aca gae 3192

Lye Lye Thr Val Val Val Asn Cya Asn Pro Glu Thr Val Ser Thr Asp 1010 1015 1020 ttt gat gag tgt gae aaa ctg tac ttt gaa gag ttg tee ttg gag aga 3240

Phe Asp Glu Cya Aap Lys Leu Tyr Phe Glu Glu Leu Ser Leu Olu Arg 1025 1030 1035 ate eta gae ate tac cat cag gag gca tgt ggt gge tgc ate ata tea 3280 lie Leu Asp lie Tyr Hie Gin Glu Ala Cya Gly Gly Cya He lie Ser 1040 1045 1050 1055 gtt gga ggc cag att cca aac aac ctg gca gtt cct eta tac aag aat 3336

Val Gly Gly Gin lie Pro Aan Asn Leu Ala Val Pro Leu Tyr Lys Asn 1060 1065 1070 ggt gtc aag ate atg ggc aca age ccc ctg cag ate gae agg get gag 3384

Gly Val Lye He Met Gly Thr Ser Pro Leu Gin lie Asp Arg Ala Glu 1075 1080 1085 gat ege tee ate ttc tea get gtc ttg gat gag ctg aag gtg get cag 3432

Asp Arg Ser He Phe Ser Ala Val Leu Aap Glu Leu Lys Val Ala Gin 1090 1095 1100 gca cct tgg aaa get gtt aat act ttg aat gaa gca ctg gaa ttt gca 3480

Ala Pro Trp Lys Ala Val Asn Thr Leu Aan Glu Ala Leu Glu Phe Ala 11OS 1110 1115 aag tet gtg gae tac ccc tgc ttg ttg agg cct tee tat gtt ttg agt 3S28

Lys Ser Val Asp Tyr Pro Cya Leu Leu Arg Pro Ser Tyr Val Leu Ser 1120 1125 1130 1135 ggg tet get atg aat gtg gta ttc tet gag gat gag atg aaa aaa ttc 3576

Gly Ser Ala Met Asn Val Val Phe Ser Glu Asp Glu Met Lya Lye Phe 1140 1145 1150 eta gaa gag geg act aga gtt tet cag gag cae cca gtg gtc ctg aca 3624

Leu Glu Glu Ala Thr Arg Val Ser Gin Glu Mis Pro Val Val Leu Thr 1155 1160 1165 aaa ttt gtt gaa ggg gee ega gaa gta gaa atg gae get gtt ggc aaa 3672

Lys Phe Val Glu Gly Ala Arg Glu Val Glu Met Asp Ala val Gly Lys 1170 1175 1180 gat gga agg gtt ate tet cat gee ate tet gaa cat gtt gaa gat gca 3720

Asp Gly Arg Val He Ser Hie Ala lie Ser Glu Hie Val Glu Aap Ala lies 1190 1195 ggt gtc cac ccg gga gat gcc act ctg acg ctg ccc aca caa acc ate 3758

Gly Val His Ser Gly Asp Ala Thr Leu Met Leu Pro Thr Gin Thr lie 1300 1205 1210 1315 age caa ggg gcc att gaa aag gtg aag gat get acc egg aag att gca 3816

Ser Gin Gly Ala He Glu Lye Val Lya Asp Ala Thr Arg Lya He Ala 1330 1225 1230 aag get ttt gcc ate tet ggt cca ttc aac gtc caa ttt etc -gtc aaa 3864

Lye Ala Phe Ala He Ser Gly Pro Phe Asn Val Gin Phe Leu Val Lys 1235 1240 1245 gga aat gat gtc ttg gtg att gag tgt aac ttg aga get tet ega tee 3912

Gly Asn Asp Val Leu val lie Glu Cys Asn Leu Arg Ala Ser Arg Ser 1250 1255 1260 ttc ccc ttt gtt tee aag act ett ggg gtt gac ttc att gat gtg gcc 3960

Phe Pro Phe Val Ser Lye Thr Leu Gly Val Asp Phe lie Aep Val Ala 1265 1270 1275 acc aag gtg atg att gga gag aat gtt gat gag aaa cat ett cca aca 4008

Thr Lys Val Met He Gly Glu Asn Val Asp Glu Lys His Leu Pro Thr 1280 1285 1290 1295 ttg gac cat ccc ata att ect get gac tat gtt gca att aag get ccc 4056

Leu Asp His Pro He lie Pro Ala Asp Tyr Val Ala lie Lys Ala Pro 1300 1305 1310 atg ttt tec tgg ccc egg ttg agg gac get gac ccc att ctg aga tgt 4104

Met Phe Ser Trp Pro Arg Leu Arg Asp Ala Asp Pro lie Leu Arg Cys 1315 1320 1325 gag atg get tee act gga gag gtg get tgc ttt ggt gaa ggt att cat 4152

Glu Met Ala Ser Thr Gly Glu Val Ala cys Phe Gly Glu Gly He His 1330 1335 1340 aca gcc ttc eta aag gca atg ett tee aca gga ttt aag ata ccc cag 4200

Thr Ala Pba Leu Lys Ala Met Leu Ser Thr Gly Phe Lys lie Pro Gin 134S 1350 1355 aaa ggc ate ctg ata ggc ate cag caa tea ttc egg cca aga ttc ett 4248

Lys Gly He Leu He Gly lie Gin Gin Ser phe Arg Pro Arg phe Leu 1360 1365 1370 1375 ggt gtg get gaa caa tta cac aat gaa ggt ttc aag ctg ttt gcc acg 4296

Gly Val Ala Glu Gin Leu His Asn Glu Gly Phe Lys Leu Phe Ala Thr 1380 1385 1390 gaa gcc aca tea gac tgg etc aac gcc aac aat gtc cct gcc aac cca 4344

Glu Ala Thr Ser Asp Trp Leu Asn Ala Asn Asn Val Pro Ala Asn Pro

1395 1400 140S gtg gca egg ceg tee caa gaa gga cag aat ccc age etc tet tee ace 4392

Val Ala Trp Pro Ser Gin Glu Gly Gin Aaa Pro Sar Leu Set Ear lie 1410 141S 1420 aga aaa ttg act aga gat ggc age att gac eta gtg att aac ett ccc 4440

Arg Lye Leu lie Arg Asp Gly Ser lie Aep Leu Val lie Ann Leu Pro 1425 1430 1435 aac aac aac act aaa ttt gtc cat gat aat tat gtg att egg agg aca 4488

Aen Aan Aan Thr Lys Phe Val Hie Asp Aen Tyr val lie Arg Arg Thr 1440 1445 14S0 1455 get gtt gat agt gga ate cct etc etc act aat ttt cag gtg acc aaa 4S36

Ala Val Aep Ser Gly lie Pro Leu Leu Thr Aan Phe Gin Val Tbr Lye 1460 1465 1470 ett ttt get gaa get gtg cag aaa tet ege aag gtg gac tcc aag agt 4584

Leu Phe Ala Glu Ala Val Gin Lys Ser Arg Lys Val Asp Ser Lye Ser 1475 1480 1485 ett ttc cac tac agg cag tac agt get gga aaa gca gca tag 4626

Leu Phe His Tyr Arg Gin Tyr Ser Ala Gly Lye Ala Ala 1490 1495 1500 agatgeagae accccagccc cattattaaa tcaacctgag ccacatgtta tctaaaggaa 4686 ctgattcaca actttctcag agatgaatat tgataactaa actteatttc agtttacttt 4746 gttatgeett aatattctgt gtcttttgca attaaattgt cagtcacttc ttcaaaacct 4806 tacagtcctt cctaagttac tettcatgag atttcatcca tttactaata ctgtattttt 4866 ggtggactag gcttgcctat gtgctcatgt gtagcttttt actttttatg gtgctgatta 4926 atggtgatca aggtaggaaa agttgctgtt ctattttctg aactctttct ataetttaag 4986 . atactctatt tttaaaacac tatctgcaaa ctcaggacac tttaacaggg cagaatactc S046 taaaaacttg ataaaatgaa atatagattt aatttatgaa ccttccatca tgatgtttgt 5106 gtattgette tttttggatc ctcattctca cccatttggc taatccagga atattgttat 5166 cccttcccat tatattgaag ttgagaaatg tgacag&ggc atttagagta tggacttttc 5226 ttttcttttt ctttttcttt ttttcttttt gagatggagt cacactctcc aggctggagt 5286 gcagtggcac aatetegget cactgcaatt tgcgtctccc aagttcaagc gattctcctg 5346 ctttagacta tggatttctt taaggaatac tggtttgcag ttttgttttc tggactatat 5406 cagcagatgg tagacagtgt ttatgtagat gtgttgctgt ttttatcatt ggatttcaac 5466 ttggcccgag tgaaacaatc agatecccgt cattcacacc ctcccccagt cttggaataa S526 cttggaagta aggttcattc ccttaagacg atggattctg ttgaactátg gggtcccaca 5566 etgcactatt aattccaccc actgtaaggg caaggacacc attccttcta eatataagaa 5646 aaaagtctct ccccaagggc agcctttgtt acttttaaat atcctctgtt attacaagtg 5706 ctctaattgt gaacttttaa ataaaatact attaagaggt aaaaaaaaaa aaaaa 5761

<210> 14 <211> 1500 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 14

Met Thr Arg He He Tbr Ala Phe lye val val A_rg Thr Leu Lye Tlir 1 S 10 IS

Gly Pho Gly phe Tbr Asn Val Thr Ala His Gin Lye Trp Lye Phe Ser 20 25 30

Arg Pro Gly lie Arg Leu Leu Ser Val Lye Ala Gin Thr Ala His He 35 40 45

Val Leu Glu Asp Gly tbr Lye Met Lys Gly Tyr Ser Phe Gly Hie Pro SO 55 60

Ser Ser Val Ala Gly Glu Val Val Phe Asn Thr Gly Leu Gly Gly Tyr 65 70 75 00

Pro Glu Ala He Thr Asp Pro Ala Tyr Lys Gly Gin He Leu Tbr Met 6S »0 95

Ala Asn Pro He He Gly Asn Gly Gly Ala Pro Asp Thr Thr Ala Leu 1O0 105 110

Asp Glu Leu Gly Leu ser Lye Tyr Leu Glu Ser Aeh Gly He Lys Val 115 120 125

Ser Gly Leu Leu Val Leu Asp Tyr Ser Lye Asp Tyr Asn His Trp Leu 130 135 140

Ala Tbr Lys Ser Leu Gly Gin Trp Leu Gin Glu Glu Lys Val Pro Ala 145 150 155 160

He Tyr Gly Val Asp Thr Arg Met Leu Thr Lys He lie Arg Asp Lys

165 170 17S

Gly Thr Met Leu Gly Lye lie Glu Phe Glu Gly Gin Pro Val Asp Phe 1B0 185 190

Val Asp Pro Aan Lye Gin Aen Leu lie Ala Glu Val Ser Thr Lys Asp 19S 200 20S

Val Lye val Tyr Gly Lya Gly Asn Pro Thr Lye Val Val Ala Val Asp 210 215 220

Cys Gly lie Lye Asn Aen Val lie Arg Leu Leu Val Lys Arg Gly Ala 22S 230 235 240

Glu Val His Leu Val Pro Trp Aen His Asp Phe Thr Lye Met Glu Tyr 245 250 255

Asp Gly lie Leu lie Ala Gly Gly Pro Gly Asn Pro Ala Leu Ala Glu 260 265 270

Pro Leu lie Gin Asn val Arg Lye He Leu Glu Ser Asp Arg Lys Glu 275 280 285

Pro Leu Phe Gly He Ser Thr Gly Asn Leu He Thr Gly Leu Ala Ala 290 295 300

Gly Ala Lya Thr Tyr Lys Met Ser Met Ala Asn Arg Gly Gin Asn Gin 305 310 315 -320

Pro Val Leu Asn He Thr Asn Lys Gin Ala Phe He Thr Ala Gin Asn 325 330 335

His Gly Tyr Ala Leu Asp Asn Thr Leu Pro Ala Gly Trp Lys Pro Leu 340 345 350

Phe Val Asn Val Asn Asp Gin Thr Asn Glu Gly lie Met His Glu Ser 355 360 365 . Lys Pro Phe Phe Ala Val Gin Phe His Pro Glu Val Thr Pro Gly Pro 370 37S 380 lie Asp Thr Glu Tyr Leu Phe Asp Ser Phe Phe Ser Leu He Lys Lye 385 390 395 400

Gly Lye Ala Thr Thr He Thr Ser Val Leu pro Lys Pro Ala Leu Val

405 410 41S

Ala Ser Arg Val Glu Val Ser Lys Val Leu He Leu Gly Ser Gly Gly 420 425 430

Leu Ser He Gly Gin Ala Gly Glu Phe Asp Tyr Ser Gly Ser Gin Ala 435 440 445

Val Lye Ala Met Lya Glu Glu Aan Val Lys Thr Val Leu Met Aen pro 4 50 455 440

Aen lie Ala Ser val Gin Thr Aan Glu val Gly Leu Lya Gin Ala Aep 445 470 475 460

Thr Val Tyr Phe Leu Pro lie Thr Pro Gin Phe Val Thr Glu Val lie 485 490 49$

Lya Ala Glu Gin Pro Asp Gly Leu lie Leu Gly Met Gly Gly Gin Thr 500 505 510

Ala Leu Aan Cye Gly Val Glu Leu Phe Lya Arg Gly Val Leu Lya Glu 515 520 525

Tyr Gly Val Lya Val Leu Gly Thr Ser Val Glu Ser He Met Ala Thr 530 535 540

Glu Aep Arg Gin Leu Phe Ser Aap Lya Leu Aen Glu lie Aan Glu Lya 545 550 S5S 560 lie Ala Pro Ser Phe Ala Val Glu Ser He Glu Aap Ala Leu Lya Ala S65 570 575

Ala Aap Thr lie Gly Tyr Fro Val Met lie Arg Ser Ala Tyr Ala Leu 580 585 590

Gly Gly Leu Gly Ser Gly He Cye Pro Aen Arg Glu Thr Leu Met Aap 595 600 605

Leu Ser Thr Lya Ala Phe Ala Met Thr Aan Gin lie Leu Val Glu Lye 610 615 620

Ser Val Thr Gly Trp Lya Glu He Glu Tyr Glu Val Val Arg Aap Ala 625 630 635 640

Aap Aap Aan Cya Val Thr val Cye Aan Met Glu Aan Val Aap Ala Met 64S 650 655

Gly Val Hi· Thr Gly Aap Ser Val Val val Ala Pro Ala Gin Thr Leu 660 665 670

Ser Aan Ala Glu Phe Gin Met Leu Arg Arg Thr Ser lie Aan Val Val 675 6S0 60S

Arg His Leu Gly lie Val Gly Glu Cya Aan lie Gin Phe Ala Leu Hla 690 695 700

Pro Thr Ser Met Glu Tyr Cye He He Glu Val Aen Ala Arg Leu Ser 70S 710 715 720

Arg Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lya Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala Phe

725 730 73S

Zle Ala Ala Lye lie Ala Leu Sly lie Pro Leu Pro Glu lie Lye Aan 740 745 750

Val Val Ser Gly Lye Thr Ser Ala Cye Phe Glu Pro Ser Leu Aap Tyr 7SS 760 765

Met Val Thr Lye Zle Pro Arg Trp Aap Leu Aap Arg Phe Hie Gly Thr 770 775 700

Ser Ser Arg Zle Gly Ser Ser Met Lya Ser Val Gly Glu Val Hah Ala 785 790 79S 800 lie Gly Arg Thr Phe Glu Glu ser Phe Gin Lya Ala Leu Arg Mae Cye 80S 010 015

Hia Pro Ser He Glu Gly Phe Thr Pro Arg Leu Pro Met Asn LyB Glu 030 825 B30

Trp Pro Set Aon Leu Aap Leu Arg Lye Glu Leu Ser Glu Pro Ser Ser 83S 840 045

Thr Arg lie Tyr Ala lie Ala Lya Ala lie Aap Aap Aen Met Ser Leu 050 855 860

Aap Glu lie Glu Lya Leu Thr Tyr lie Aap Lya Trp Phe Leu Tyr Lya 865 070 075 080

Met Arg Aap lie Leu Aan Met G1Ú Lya Thr Leu Lya Gly Leu Aan Ser 80S 890 895

Glu Ser Met Thr Glu Glu Thr Leu Lya Arg Ala Lya Glu lie Gly Phe 900 90S 910

Ser Aap Lya Gin He Ser Lya Cye Leu Gly Leu Thr Glu Ala Gin Thr 915 920 92S . Arg Glu Leu Arg Leu Lya Lya Aan He Hie Pro Trp Val Lya Gin He. 930 935 940

Aap Thr Leu Ala Ala Glu Tyr Pro Ser Val Thr Aan Tyr Leu Tyr Val 945 »50 955 960

Thr Tyr Abu Gly Gin Glu Hia Aap Val Aan Phe Aap Aap Hia Gly Met 965 970 975

Met Val Leu Gly Cys Gly Pro Tyr Hie lie Gly Ser Ser Val Glu Phe 9Θ0 985 990

Aep Trp Cye Ala Val Ser ser He Arg Thr Leu Arg Glu Leu Gly Lya 995 1000 1005

Lye Thr Val Val Val Asn Cye Asn Pro Glu Thr Val Ser Thr Asp Phe 1010 1015 1030

Aop Glu Cya Asp Lye Leu Tyr Phe Glu Glu Leu Ser Leu Glu Arg lie 1025 1030 1035 1040

Leu Aep lie Tyr His Gin Glu Ala Cye Gly Gly Cye lie lie Ser Val 104S 1050 1055

Gly Gly Gin lie Pro Asn Asn Leu Ala Val Pro Leu Tyr Lye Asn Gly 1060 106S 1070

Val Lye lie Met Gly Thr Ser Pro Leu Gin lie Ãsp Arg Ala 01u Asp 1075 1000 1085

Arg Ser lie Phe Ser Ala Val Leu Asp Glu Leu Lya Val Ala Cln Ala 1090 1095 1100

Pro Trp Lye Ala Val Asn Thr Leu Aon Glu Ala Leu Glu Phe Ala Lye 1105 1110 1115 1120

Ser Val Aep Tyr Pro Cye Leu Leu Arg Pro Ser Tyr Val Leu Ser Gly 1125 1130 1135

Ser Ala Met Aon val val Phe ser Glu Aep Glu Met Lye Lye Phe Leu 1140 114S 11S0

Glu Glu Ala Thr Arg Val Ser Gin Glu Hie Pro Val Val Leu Thr Lye 1155 1160 1165

Phe Val Glu Gly Ala Arg Glu Val Glu Met Aep Ala Val Gly Lye Aep 1170 1175 1180

Gly Arg Val He Ser Hia Ala lie Ser Glu Hie Val Glu Aop Ala Gly 1185 1190 1195 1200

Val Hie Ser Gly Asp Ala Thr Leu Met Leu Pro Thr Gin Thr lie Ser 1205 1210 1215

Gin Gly Ala lie Glu Lye Val Lye Aop Ala Thr Arg Lyo lie Ala Lye 1220 122S 1230

Ala Phe Alá He Ser Gly Pro Phe Aon Val Gin Phe Leu Val Lyo Gly 1235 1240 124S

Am Aop Val Leu Val He Glu Cye Aen Leu Arg Ala Ser Arg Ser Phe 1250 1255 1260

Pro Phe Val Ser Lye Thr Leu Gly Val Aop Phe lie Aop Val Ala Thr 1265 1370 1275 1250

Lyo Val Met He Gly Glu Asn Val Aap Glu Lyo Hie Leu Pro Thr Leu 1365 1390 1395

Asp His Pro lie He Pro Ale Asp Tyr Val Ala lie Lye Ala Pro Met 1100 1305 1310

Phe Ser Trp Pro Arg Leu Arg Αβρ Ala Asp Pro lie Leu Arg Cye Olu 1315 1320 1325

Met Ala Ser Thr Gly Olu Val Ala Cye Phe Oly Olu Gly He Hie Tbr 1330 1335 1340

Ala Phe Leu Lys Ala Met Leu Ser Thr Oly Phe Lye lie Pro 01n Lye 1345 13S0 1355 1360

Oly'lie Leu lie Oly lie Gin Ola Ser Pbe Arg Pro Arg Phe Leu Oly 1355 1310 1375 val Ala Glu Gin Leu Hie Aen Glu Gly Phe Lye Leu Phe Ala Thr Glu 1380 1355 1390

Ala Thr Ser Aep Trp Leu Aon Ala Aen Aen val Pro Ala Aen Pro Val 1395 1400 1405

Ala Trp Pro Ser Gin Olu Sly Oln Aen Pro Ser Leu Ser Ser He Arg 1410 141S 1430

Lye Leu He Arg Asp Oly Ser lie Asp Leu Val He Aon Leu Pro Aen 1425 1430 1435 1440

Aen Aan Thr Lys Phe Val His Asp Aen Tyr Val lie Arg Arg Thr Ala 1445 1450 1455

Val Aep Ser Gly He Pro Leu Leu Thr Aen Phe Oln Val Thr Lys Leu 1450 1485 1470

Phe Ala Olu Ala Val Oln Lye Ser Arg Lye Val Aep Ser Lye Ser Leu 1475 1450' 1485

Phe Hie Tyr Arg Gin Tyr Ser Ala Gly Lye Ala Ala 1490 1495 1500

<210> 15 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 15 cggaagccac atcagactgg20 <210> 16 <211> 24

<212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 16 ggagagtgaa acttgacaat catc24

<210> 17 <211> 19 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 17 tactgctcag aatcatggc 19

<210> 18 <211> 19 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 18 tcatcaccaa ctgaacagg 19

<210> 19 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 19 ggttaagaga aggaggagct21

<210> 20 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 20 aaccagtctt cagtgtcctc a 21

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 4458066 A [0054] [0313] • US 4683195 A [0063] [0313] • US 4683202 A [0063] [0201] [0313] • US 4965188 A [0063] [0313] • US 4554101 A [0119] [0120] [0313] • US 5489742 A [0140] [0313] • US 4736866 A [0140] [0313] • US 5550316 A [0140] [0313] • US 5614396 A [0140] [0313] • US 5625125 A [0140] [0313] • US 5648061 A [0140] [0313] • US 5573933 A [0140] [0313] • US 5162215 A [0140] [0313] • US 5741957 A [0140] [0313] • US 5279833 A [0142] [0313] • US 5286634 A [0142] [0313] • US 5399346 A [0142] [0313] • US 5646008 A [0142] [0313] • US 5651964 A [0142] [0313] • US 5641484 A [0142] [0313] • US 5643567 A [0142] [0313] • US 4769331 A [0148] [0313] • US 4196265 A [0174] [0313] • US 0015079 W [0316] • US 09323472 B [0316]

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Lisboa, 22 de Junho de 2015

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Citrulina para utilização num método de tratamento ou prevenção de uma condição ou distúrbio num sujeito submetido a cirurgia cardíaca que está associado com a função subótima do ciclo da ureia.
2. 2. A citrulina para utilização num método de tratamento ou prevenção de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de que a citrulina é administrada numa dose que varia desde cerca de 0,01 mg até cerca de 1.000 mg.
3. 3. A citrulina para utilização num método de tratamento ou prevenção de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo facto de que a citrulina é administrada num intervalo de doses de cerca de 0,5 mg até cerca de 500 mg.
4. 4. A citrulina para utilização num método de tratamento ou prevenção de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo facto de que a citrulina é administrada num intervalo de doses de cerca de 1,0 mg até cerca de 250 mg.
5. 5. A citrulina para utilização num método de tratamento ou prevenção de acordo com qualquer das reivindicações até 4, em que o sujeito é um sujeito humano. Lisboa, 22 de Junho de 2015