PT1610834E - Guia para o crescimento de tecido com auto-alinhamento - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Guia para o crescimento de tecido com auto-alinhamento" A presente invenção refere-se a guias artificiais que facilitam o crescimento de tecidos, tais como nervos e podem, por exemplo, ser implantados cirurgicamente num indivíduo, para facilitar a regeneração do tecido lesionado. O tecido lesionado no organismo é normalmente reparado por processos de regeneração naturais. No entanto, nalguns casos, a regeneração do tecido lesionado é limitada, ou não ocorre de todo. A lesão dos nervos do sistema nervoso periférico (SNP) ou central (SNC), por exemplo após trauma ou cirurgia, resulta muitas vezes na perda permanente de sensibilidade ou função.

As guias artificiais foram desenvolvidas para facilitar a regeneração de tecido neural, tanto no SNC como no SNP. Têm-se utilizado tubos feitos de colagénio (Labrador et al (1998) Exp. Neurol. 149 243-252) hialuronano ou polilactona para se obter uma orientação global para o crescimento de neurites e isolar a região de reparação em virtude da estrutura tubular. Alternativamente, também se têm utilizado feixes de fibras alinhadas feitos de filamentos de carbono (Khan et al (1991) Brain Res 541 139-145), papel de nitrocelulose (Houle et al (1989) Neurosci Lett 103,17-23), colagénio (Liu et al (1997) Neurosci Res 49 425-432; Yoshii e Oka, (2001) J. Biomed.

Materials Res. 56 400-405) ou fibronectina (Priestley et al (2002) J. Physiol-Paris 96 123-133) para se obter uma orientação de contacto a um nível celular (revisto por Brown, (2000) Bioartificial Implants: Design and Tissue Engineering in Structural Biological Materials, design and structure property relationships (Ed M. Elices) Pergamon Materials Series Vol. 4 151-160).

As guias artificiais podem, por exemplo, ser implantadas num sítio de lesão do nervo de um modo tal que as extremidades da guia ficam em contacto com o coto proximal e distai do nervo lesionado. O nervo em regeneração cresce desde o coto proximal até à extremidade proximal da guia e desde aí, através da guia, para contactar o coto distai do nervo na 2 ΕΡ 1 610 834/ΡΤ extremidade distai da guia, restabelecendo eventualmente uma ligação neural.

Podem-se utilizar materiais artificiais num guia de nervos, quer isolados, quer com adição de factores de crescimento (Whitworth et al (1995) Eur. J. Neurosci. 7:2220-2225) . É conhecido que semear implantes com células de reparação neural, que produzem factores de crescimento, e.g. células de Schwann, facilita a regeneração de nervos (Rodriguez et al (2000) Exp. Neurol. 161 571-584).

Embora os implantes artificiais tenham conduzido a alguns resultados encorajadores, não se obteve ainda nenhuma regeneração funcional dos nervos do sistema nervoso central (SNC) após trauma ou lesão.

Os presentes inventores produziram uma guia para crescimento de tecido que é semeada com células. A guia é organizada de um modo tal que se gera uma tensão mecânica uniaxial, internamente, no seio da guia. Esta tensão auto-alinha as células na direcção do crescimento do tecido, obtendo-se um substrato para orientação celular, para a regeneração de tecido in vivo.

Um aspecto da invenção proporciona uma guia para crescimento de tecido que compreende um núcleo interno compreendendo uma matriz de biopolímero com uma ou mais células geradoras de tensão nele dispostas, tendo a guia também uma bainha externa a envolver o referido núcleo interno, estando o referido núcleo interno fixado na referida bainha externa numa primeira região de ligação e numa segunda região de ligação; de modo que, quando em utilização, as células na referida matriz produzem uma tensão mecânica no núcleo entre a primeira e segunda regiões de ligação.

Inicialmente, quando o núcleo é fixado à bainha na primeira e segunda regiões de ligação, não há tensão no núcleo. Quando o núcleo está no seu lugar, dentro da bainha, as células no núcleo começam a produzir uma força contráctil. A força contráctil produz uma carga de tensão no seio da matriz, entre a primeira e segunda regiões de ligação. Esta carga de tensão mecânica é essencialmente coaxial e corre 3 ΕΡ 1 610 834/ΡΤ paralela à direcção do novo crescimento de tecido (i.e. longitudinalmente através do núcleo). A primeira região de ligação é de preferência na, ou adjacente à extremidade proximal (entrada) da guia e a segunda região de ligação é de preferência na, ou adjacente à extremidade distai (saida) da guia, embora nalgumas concretizações a bainha externa se possa estender para além do núcleo em cada extremidade, por exemplo para facilitar o contacto com os cotos de tecido que flanqueiam a região lesionada. A presença de tensão mecânica no seio da matriz envolvente faz com que as células no seio da matriz se alinhem coaxialmente ao longo do núcleo, i.e. na direcção do crescimento. A tensão no núcleo pode também fazer com que as fibras da matriz se movam num alinhamento comparável.

Uma orientação ao nível celular através do alinhamento de matrizes extracelulares optimiza a migração celular e é vantajosa numa guia de reparação de tecido (Ahmed & Brown (1999) Cell. Motil. Cytoskeleton 42 331-343; Priestley et al (2002) J. Physiol. Paris 96 123-133; Wojciak-Stothard et al In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 33 110-117).

Os tecidos adequados para reparação como aqui descrito podem regenerar-se e crescer novamente de um modo unidireccional, a partir de uma extremidade de um tecido lesionado para a outra (e.g. um nervo), ou de um modo bidireccional a partir de ambas as extremidades do tecido lesionado (e.g. tecido não neuronal, tais como tendões, ligamentos, menisco, vasos sanguíneos, pele, tracto digestivo e osso).

Os tecidos adequados incluem músculos (em particular junções neuromusculares), vasos sanguíneos, tendões, ligamentos, cápsulas, menisco, ossos, pele e nervos. Algumas concretizações preferidas referem-se à reparação de nervos e tecido neural. O núcleo interno da guia é de preferência linear, i.e., é significativamente maior numa dimensão do que nas outras duas e é convenientemente em forma de vareta, i.e. tem uma secção transversal curva, por exemplo, circular ou elíptica. Em 4 ΕΡ 1 610 834/ΡΤ concretizações em que a guia é adaptada para implantação, o núcleo interno pode ter um tamanho (i.e. diâmetro) e comprimento adequados para ligar diferentes tecidos e regiões anatómicas. Por exemplo, um núcleo interno adequado para ligar o nervo digital pode ter cerca de 1 mm de diâmetro. Outros núcleos adequados para reparação de nervos humanos podem ter de 2-7 mm de diâmetro. A matriz de biopolímero do núcleo interno pode ser um substrato fibrilar à base de proteina, de preferência com auto-gelificação, que é maleável e pode ser contraída pelas forças produzidas pelas células embebidas. Os materiais adequados incluem colagénio, fibrina/fibrinogénio, fibronectina, gelatina e polímeros bioabsorvíveis, tais como ácido poliláctido, poliglicólico e policaprolactona. De preferência, a matriz de biopolímero não ocorre naturalmente no corpo do mamífero e não exibe a organização e morfologia geral do tecido de mamífero.

Uma matriz de colagénio adequada pode ser um gel formado por uma malha reconstituída de fibrilhas de colagénio entrelaçadas com um diâmetro de 20-500 nm, compreendendo tipicamente 9 0 % — 9 9 % de líquido intersticial, dependendo da fonte de colagénio e método de reconstituição.

As matrizes de colagénio adequadas incluem matrizes de colagénio tipo I que podem ser preparadas convenientemente como descrito em Mudera V.C. et al Cell. Motil. Cytoskeleton (2000) 45 1-9.

Uma célula adequada para ser utilizada na presente invenção aplica uma força contráctil à matriz de biopolímero e fica alinhada com a tensão resultante na matriz. As células preferidas também facilitam o crescimento de tecido dentro da matriz, por exemplo, produzindo um ou mais factores de promoção do crescimento adequados. Por exemplo, uma célula adequada para ser utilizada no crescimento de tecido neural (i.e. uma célula de reparação neural) pode produzir um ou mais factores de promoção de crescimento. Os factores de promoção de crescimento neural incluem neurotrofinas, tais como neurotrofina-3, factor de crescimento nervoso (NGF), factor de crescimento glial (GGF) e factor neurotrófico derivado de 5 ΕΡ 1 610 834/ΡΤ cérebro (BDNF). De preferência, as células semeadas no seio da matriz de biopolímero alinham-se e contraem, mas não proliferam para formar tecido organizado.

As células adequadas para utilização no semeio da matriz incluem células de mamífero, tais como células de Schwann, fibroblastos neurais, fibroblastos, tenócitos (osteoblastos) , mioblastos, células de músculo liso e células endoteliais. As células adequadas para reparação neural incluem células de Schwann, fibroblastos neurais e suas misturas (Hall S (2001) J. Hand Surg. 2613 (2) 129-136). As células de reparação neural podem ser obtidas a partir de nervos de adulto por digestão com colagenase ou cultura de explantes, como descrito em 'Neural Cell Culture, a practical approach' Ed Cohen & Wilkin 221-236 IRL Press.

De preferência, as células não produzem polipéptidos de um tipo ou quantidade que não se encontra normalmente no tecido de interesse (e.g. tecido nervoso). Por exemplo, em concretizações preferidas, as células não contêm ADN estranho para expressão de uma proteína heteróloga.

Nalgumas concretizações, além de células que produzem tensão (e.g. fibroblastos), a matriz também pode ser semeada com células do tecido de interesse. Por exemplo, podem-se utilizar tenócitos, células endoteliais ou epiteliais, vasos secretores ou de glândulas (e.g. células sebáceas, células de ilhéus pancreáticos, células do córtex supra-renal), melanócitos, células de Schwann ou astrócitos. Nestas concretizações, o núcleo que contém as células que geram tensão alinhadas forma um substrato de orientação para o crescimento das células de tecido embebidas.

Noutras concretizações, a matriz não é semeada com células do tecido de interesse. Por outras palavras, as células no seio da guia são heterólogas em relação ao tecido de interesse. Por exemplo, a matriz pode ser destituída de neurónios antes da implantação.

As células podem ser semeadas no seio da matriz, misturando-as com a matriz de biopolímero líquida e em seguida deixando a matriz líquida solidificar num gel. De forma 6 ΕΡ 1 610 834/ΡΤ conveniente, ο gel pode ser semeado com 104 a 107 células por ml, mais preferencialmente 2xl05 a 106 células por ml. A bainha exterior é de preferência um material sólido que proporciona resistência à força contráctil conferida pelas células no núcleo, mantendo desse modo a tensão mecânica no núcleo entre as duas regiões ligadas. O material da bainha externa é assim rigido em relação à matriz de biopolimero do núcleo, de modo a acomodar a tensão mecânica no núcleo. O material da bainha apresenta de preferência uma adesão baixa, ou substancialmente nenhuma adesão com o núcleo fora das regiões de ligação. De preferência, a bainha envolve totalmente o núcleo, de modo que apenas as extremidades do núcleo estão expostas ao exterior.

Os materiais de bainha adequados têm uma biocompatibilidade elevada, i.e. não produzem reacções adversas no organismo e, em concretizações preferidas, são reabsorvíveis in situ, por exemplo biodegradáveis, de modo a evitar a necessidade de os remover cirurgicamente do sítio de aplicação, após utilização. Exemplos de materiais de bainha adequados incluem vidro de fosfato, polilactona, policaprolactona e hialuronano ou seus derivados. Outros materiais adequados incluem colagénio, fibrina, fibronectina, celulose, quitosano e amido. Materiais de bainha não reabsorvíveis, adequados, incluem silicone.

Nalgumas concretizações, a bainha é não porosa.

Quando o núcleo é uma proteína não polimérica, a extremidade proximal da bainha pode compreender um material de agregado proteico para permitir que o núcleo seja preferencialmente libertado da extremidade proximal, mediada por proteases celulares do tecido nascente (e.g. um nervo em regeneração) . A bainha externa está fixada ao núcleo interno na primeira região de ligação e a segunda região de ligação de modo que o movimento, em particular o movimento axial ou longitudinal, do núcleo em relação à bainha é impedido nestas regiões. Para permitir a produção de uma força de contracção, o núcleo está de preferência livre para se mover em relação à 7 ΕΡ 1 610 834/ΡΤ bainha entre a primeira e segunda regiões de ligação. Para impedir a adesão do núcleo à bainha fora das regiões de ligação definidas, o material da bainha é de preferência não aderente. O núcleo e bainha podem ser fixados juntamente nas regiões de ligação, por qualguer método conveniente e o perito na arte é capaz de identificar várias técnicas adequadas.

Nalgumas concretizações, a bainha externa pode ser mecanicamente fixada ao núcleo, i.e. a matriz de biopolímero, na primeira e segunda regiões de ligação.

Por exemplo, na primeira e segunda regiões de ligação, a bainha externa pode ser moldada para se obter uma ligação cooperativa com o núcleo interno. A ligação fixa a bainha e núcleo um ao outro nestas regiões. De preferência, a bainha externa compreende uma ou mais aberturas ou protuberâncias na sua superfície interna. As aberturas podem-se estender através do lado da bainha até à superfície externa, ou podem formar recessos ou nichos que não se estendem até às superfícies externas. As aberturas adequadas incluem fendas, poros, cavidades e aberturas. Por exemplo, as regiões de ligação da bainha podem compreender mangas porosas em torno do núcleo.

De preferência, o núcleo liga-se às aberturas ou protuberâncias na bainha, quando é introduzido na bainha na forma líquida, durante a produção da guia. Quando o núcleo solidifica, a ligação mantém o núcleo e bainha unidos nas regiões de ligação.

Também se podem utilizar outros métodos de fixação mecânica, tais como pinos, suturas, grampos de pressão ou molas de inserção.

Nalgumas concretizações, a bainha externa pode ser quimicamente fixada ao núcleo na primeira e segunda regiões de ligação, por exemplo utilizando um adesivo, tal como um adesivo de fibrina ou cianoacrilato. 8 ΕΡ 1 610 834/ΡΤ

Como descrito acima, nalgumas concretizações a guia pode ser adaptada para implantação num indivíduo, para facilitar a reparação do tecido lesionado. A bainha exterior pode, por exemplo, ser composta por um material não aderente que reduz ou elimina a formação de adesões entre a guia e o tecido que envolve a guia implantada (i.e. a bainha é anti-adesiva ou não adesiva relativamente às camadas de tecido deslizante envolvente). A bainha externa pode também reduzir ou eliminar o crescimento para dentro das células ou tecidos envolventes, em direcção ao núcleo interno. A bainha pode também ser adequada e/ou adaptada para aceitar suturas ou outros meios de ligação (e.g. cola) para manter o núcleo contra as extremidades de tecido lesionado.

Uma guia adaptada para implantação é de preferência reabsorvível in situ. Mais preferencialmente, a estabilidade da guia (e portanto a taxa de reabsorção) varia ao longo do seu comprimento (e.g. quando o tecido se regenera numa direcção proximal para distai, pode haver uma gradação na taxa de reabsorção da guia entre as extremidades proximal (entrada) e distai (saída) e onde o tecido se regenera a partir de ambas as extremidades de tecido danificadas (i.e. ambas as extremidades são proximais), pode haver uma gradação na taxa de reabsorção da guia entre as extremidades da guia e o meio).

Quando o tecido se regenera numa direcção proximal para distai, por exemplo na reparação de nervos, a gradação da taxa de reabsorção é de preferência tal que a extremidade proximal da guia é reabsorvida mais rapidamente do que a extremidade distai. Isto proporciona à extremidade do nervo em regeneração uma maior orientação, à medida que passa através da guia. A secreção de factores celulares, incluindo proteases, pelos nervos em regeneração provoca uma reabsorção proximal preferencial à medida que o nervo entra por, e cresce através da extremidade proximal da guia. A reabsorção da bainha exterior na primeira região de ligação, após o tecido em regeneração, tal como um nervo, entrar na extremidade proximal do núcleo, liberta o núcleo da bainha externa, na extremidade proximal. O núcleo é mantido na 9 ΕΡ 1 610 834/ΡΤ sua extremidade proximal pelo próprio tecido e a tensão previamente exercida entre a primeira e segunda regiões de ligação é transferida para o tecido em regeneração, exercendo uma força de tracção. Por outras palavras, a bainha externa na primeira região de ligação é reabsorvida de preferência após entrada do tecido em regeneração na extremidade proximal do núcleo, de modo que o núcleo aplica uma tensão mecânica ao tecido em regeneração.

Quando o tecido se regenera de um modo multidimensional (i.e. a partir de ambas as extremidades danificadas do tecido lesionado), a gradação da taxa de reabsorção é de preferência tal que as extremidades da guia (que são ambas extremidades efectivamente extremidades proximais) são reabsorvidas mais rapidamente do que o meio da guia. Isto proporciona às extremidades do tecido em regeneração uma maior orientação à medida que passam através da guia e se encontram no seio desta. Esta reabsorção preferencial é provocada pela libertação de factores celulares, incluindo proteases, pelo tecido em regeneração à medida que entra e cresce através da guia. A reabsorção da bainha exterior na primeira e segunda regiões de ligação, após o tecido em regeneração entrar nas extremidades do núcleo, liberta o núcleo da bainha externa. 0 núcleo é mantido nas suas extremidades pelo próprio tecido em regeneração e a tensão previamente exercida entre a primeira e segunda regiões de ligação é transferida para o plano de crescimento de tecido prospectivo, exercendo uma força de tracção. Por outras palavras, a bainha externa na primeira e segunda regiões de ligação é reabsorvida de preferência após entrada do tecido em regeneração nas extremidades do núcleo, de modo que o núcleo aplica uma tensão mecânica ao tecido em regeneração.

Isto é vantajoso, na medida em que é conhecido que a aplicação de uma tensão mecânica ao tecido, em particular aos nervos, acelera o crescimento (Smith et al (2001) Tiss Eng. 7 131-139).

Enquanto que a reabsorção proximal preferencial pode ocorrer automaticamente, à medida que o tecido em regeneração 10 ΕΡ 1 610 834/ΡΤ entra na guia, a taxa de reabsorção pode ser também controlada através de uma guia com uma bainha à base de proteína, ensopando uma ou ambas as extremidades da guia em reagentes estabilizantes, tais como soluções de Cu++ ou Zn++, para produzir um gradiente de concentração destes iões através da guia, ou fabricando a guia a partir de vários comprimentos de material guia cuja composição em proteínas de adesão se altera gradualmente da extremidade proximal para a distai da guia.

Em utilização, uma guia de acordo com a invenção pode ser montada e pode, opcionalmente, deixar-se desenvolver uma tensão no núcleo antes da implantação, por exemplo por cultura de células no seio do núcleo, durante 8-12 horas. A guia pode em seguida ser implantada num local de lesão do tecido, de modo que as extremidades do núcleo interno ficam em contacto com os cotos proximal e distai do tecido lesionado. A guia pode ser mantida no seu lugar por cola, ou outros meios de fixação, tais como suturas, por exemplo, através da bainha externa. Nalgumas concretizações, os meios de fixação podem estar compreendidos no seio da guia. O coto proximal do tecido em regeneração, tal como um nervo, pode entrar na guia na sua extremidade proximal e sair da guia na sua extremidade distai, para entrar em contacto com o coto distai. Noutras concretizações, o tecido em regeneração de ambos os cotos danificados pode entrar na guia nas suas extremidades e encontra-se no seio da guia, restabelecendo uma ligação funcional.

As guias como aqui descrito podem ser úteis na reparação de lesões numa variedade de tecidos, incluindo lesões neurais no sistema nervoso central ou periférico e produção de enxertos para cirurgia plástica.

Uma guia de crescimento de tecido como aqui descrito pode ser linear e ter uma primeira e segunda extremidades. Em concretizações em que o novo crescimento de tecido é unidireccional, a primeira extremidade pode actuar como uma porta de entrada proximal para o tecido em regeneração e a segunda extremidade como uma porta de saída distai. Em concretizações em que o novo crescimento de tecido é bidireccional, a primeira e segunda extremidades podem actuar 11 ΕΡ 1 610 834/ΡΤ ambas como portas de entrada proximais para o tecido em regeneração.

Nalgumas concretizações, a guia pode ser ramificada i.e. pode compreender mais do que duas extremidades, por exemplo uma terceira e quarta extremidade. Esta guia ramificada pode possuir mais do que uma porta de entrada e/ou mais do que uma porta de saída. As concretizações preferidas podem compreender uma única porta de entrada proximal e duas ou mais, por exemplo, três, quatro ou cinco portas de saída distais. Uma guia de acordo com estas concretizações compreende de preferência uma região de ligação em cada uma das suas extremidades, para permitir que a tensão mecânica seja mantida ao longo do núcleo. Por exemplo, uma primeira região de ligação pode ser posicionada adjacente à porta de entrada proximal e uma segunda e terceira (ou mais) regiões de ligação, respectivamente, nas duas (ou mais) portas de saída distais.

Noutras concretizações, uma guia da invenção pode ser adaptada para o crescimento de tecido in vitro. O tecido crescido numa guia deste tipo pode, por exemplo, ser subsequentemente implantado num indivíduo.

Nestas concretizações, as células semeadas na matriz de biopolímero podem compreender células geradoras de tensão, tais como fibroblastos e adicionalmente células do tecido de interesse (ou células progenitoras/estaminais, capazes de se diferenciar em células do tecido alvo). As células de tecido adequadas incluem tenócitos, células endoteliais ou epiteliais, vasos secretores ou de glândulas (e.g. células sebáceas, células de ilhéus pancreáticos, células do córtex supra-renal), melanócitos, células de Schwann ou astrócitos.

Uma guia semeada com células geradoras de tensão e células do tecido alvo pode ser cultivada num biorreactor sob condições de cultura de tecido convencionais (por exemplo, 37°C em DMEM + soro fetal de vitela a 10%) para permitir o crescimento orientado das células do tecido alvo, no seio da guia. 12 ΕΡ 1 610 834/ΡΤ A guia pode ser cultivada por imersão no meio de cultura e/ou o meio pode ser introduzido directamente no interior da guia por meio de capilares no seio do núcleo. O núcleo de uma guia de acordo com estas concretizações pode compreender um ou mais capilares para a passagem de meio nutriente através do núcleo. De preferência, um ou mais capilares formam canais contínuos que correm coaxialmente ao longo do comprimento do núcleo.

Podem-se introduzir capilares no núcleo durante a produção, por técnicas convencionais, tais como incorporação e remoção de fio de sutura fino, incorporação de uma fibra solúvel, introdução de uma camada quimicamente degradável, ou tratamento com uma fonte óptica/de radiação, tal como um laser. O ou os capilares podem ser ligados a uma fonte de meio nutriente. O fluxo de meio através dos capilares pode ser induzido, de preferência por bombagem, por exemplo utilizando uma bomba peristáltica. O fluxo através dos capilares pode ser linear, pulsado ou cíclico. 0 meio que flui através dos capilares difunde-se através do núcleo para se obterem condições de crescimento adequadas para as células embebidas.

Podem-se incubar duas ou mais guias de crescimento de tecido de acordo com a presente concretização num biorreactor de fluxo controlado comum, ligando uma extremidade da guia a um colector de fluxo, por exemplo utilizando uma ligação do tipo luer-seringa, de modo que o meio nutriente flui desde o colector, através dos capilares do núcleo e em seguida até um fluxo de saída.

Após crescimento no seio da guia, as células de tecido podem ser isoladas e/ou extraídas da guia e utilizadas para uma variedade de fins, incluindo implantação num sítio de tecido lesionado.

Pode-se produzir uma guia de crescimento de tecido como aqui descrito introduzindo o núcleo interno na bainha externa numa forma líquida, de modo que a bainha molda o núcleo na forma adequada. 13 ΕΡ 1 610 834/ΡΤ

Um aspecto da invenção proporciona um método para produzir uma guia para o crescimento de tecido compreendendo: proporcionar uma bainha exterior, introduzir células numa matriz de biopolimero liquida, introduzir a referida matriz líquida no interior da bainha externa, provocar ou permitir o endurecimento da referida matriz líquida; e fixar a matriz à bainha na primeira e segunda regiões de ligação. A matriz pode ser fixada à bainha por qualquer uma de uma gama de técnicas mecânicas ou químicas, como descrito acima.

De preferência, a bainha e a matriz são fixadas juntamente nas regiões de ligação através da ligação de cooperação entre a matriz e a bainha.

Um método para produzir uma guia para o crescimento de tecido pode compreender: proporcionar uma bainha externa que é moldada para se ligar de forma cooperativa com o núcleo interno na primeira e segunda regiões de ligação, introduzir células numa matriz de biopolimero líquida, introduzir a referida matriz líquida no interior da bainha externa, de modo que a matriz líquida liga a referida bainha nas referidas regiões de ligação, e; provocar ou permitir o endurecimento da referida matriz líquida, de modo que a referida ligação impede o movimento coaxial do núcleo em relação à bainha. A bainha externa pode ser linear, ou pode ter uma ou mais ramificações, e.g. pode ser bifurcada, ou trifurcada. 0 núcleo, que é moldado pela bainha, irá adoptar naturalmente a forma da bainha. A matriz pode ser endurecida ou solidificada por qualquer técnica convencional para formar o núcleo da guia, por exemplo incubação a 37°C durante 5 minutos; adição ou activação de 14 ΕΡ 1 610 834/ΡΤ trombina numa solução de proteína contendo fibrinogénio (e.g. por adição de Ca2+ a uma fracção de plasma) ; agregação por corte de géis de proteína ricos em fibronectina (Brown et al (1994) Biomaterials 15 457-464; Phillips et al (2003) in press) , ou adição de catalisador de polimerização a polímeros biodegradáveis que auto-endurecem.

As matrizes de biopolímero, células e bainhas externas adequadas estão descritas acima.

Noutras concretizações, a matriz de biopolímero semeada pode ser introduzida na bainha externa numa forma não líquida, i.e. de gel e em seguida fixadas na primeira e segunda regiões de ligação. Por exemplo, a matriz pode ser inserida numa bainha externa tubular ou a bainha pode ser enrolada em torno da, ou aplicada na matriz (e.g. por moldagem de um material de bainha com endurecimento catalisado em torno do núcleo (e.g. um material rico em fibrina ou polímero biodegradável com auto-endurecimento). A bainha pode então ser fixada no lugar. As fixações adequadas impedem o movimento axial do núcleo em relação à bainha e podem incluir adesivos, pinos, molas e grampos de pressão.

Um método para produzir uma guia de crescimento de tecido pode compreender o passo adicional de provocar ou permitir que as células no seio da referida matriz produzam uma tensão mecânica entre a primeira e segunda regiões de ligação.

Pode-se produzir uma tensão mecânica no núcleo cultivando as células na matriz em condições adequadas, por exemplo, colocando a guia num meio de cultura de células convencional, tal como DMEM, por exemplo numa placa de Petri e incubando durante 8 a 12 horas a 37°C. O meio de cultura de células pode ser opcionalmente suplementado com ascorbato, para facilitar a contracção.

De preferência, as células na guia da invenção não proliferam para formar um tecido organizado no seio da matriz.

As condições de cultura para produzir tensão mecânica são distintas das condições para a proliferação de células para formar um tecido organizado, as quais requerem, por exemplo, 15 ΕΡ 1 610 834/ΡΤ períodos de incubação de 1 a 18 dias. A presença de tecido organizado heterólogo no seio da guia pode impedir o progresso do tecido endógeno em regeneração, através da guia.

Nalgumas concretizações preferidas, a guia pode ser em seguida implantada num corpo humano ou animal para a reparação de tecido lesionado. Por exemplo, a extremidade proximal da guia pode ser ligada às extremidades danificadas de um tecido lesionado, ou a guia pode ser ligada ao coto distai de um nervo lesionado. Quando o tecido é um nervo, a extremidade proximal da guia pode ser ligada ao coto proximal do nervo lesionado e a extremidade distai da guia pode ser ligada ao coto distai do nervo lesionado.

Uma guia para crescimento de tecido pode opcionalmente ser implantada sem um passo de pré-tensão, como descrito acima. A tensão mecânica é então produzida no núcleo, in situ.

Noutras concretizações preferidas, a ou as células de reparação de tecido na matriz de biopolímero podem compreender fibroblastos ou outras células produtoras de tensão, como descrito acima e adicionalmente células do tecido de interesse (ou células progenitoras/estaminais capazes de se diferenciar em células de tecido alvo). As células de tecido adequadas incluem tenócitos, células endoteliais ou epiteliais, vasos secretores ou de glândulas (e.g. células sebáceas, células de ilhéus pancreáticos, células do córtex supra-renal), melanócitos, células de Schwann e astrócitos.

Um método de acordo com estas concretizações pode compreender, após a tensão mecânica ter sido produzida no núcleo pelas células geradoras de tensão, o passo de cultivar as células de tecido na referida guia. As células podem ser cultivadas por adição de meio nutriente e condições adequadas, como descrito acima.

Após cultura, as células no referido núcleo podem ser isoladas e/ou extraídas da guia, por exemplo, para utilização em terapia, de acordo com técnicas convencionais. Noutras concretizações, o núcleo ou guia que contém as células de tecido cultivadas pode ser utilizado directamente em terapia, por exemplo implantação para a reparação de tecido lesionado. 16 ΕΡ 1 610 834/ΡΤ

Outros aspectos da invenção proporcionam uma guia como aqui descrito, para utilização num método de reparação de tecido lesionado, em particular na lesão neural, e um método para reparar tecido lesionado num indivíduo, compreendendo implantar uma guia como aqui descrito, no referido indivíduo. A implantação pode compreender ligar ou fixar a guia às extremidades danificadas de um tecido lesionado (e.g. os cotos proximal e distai de um nervo lesionado), por exemplo utilizando suturas.

Outro aspecto da invenção proporciona um método para reparar tecido lesionado, compreendendo ligar a extremidade proximal e distai de uma guia, como descrito acima, às extremidades danificadas de um tecido lesionado, num indivíduo (e.g. os cotos proximal e distai, respectivamente, de um nervo lesionado).

Outro aspecto da invenção proporciona um kit que compreende uma guia para o crescimento de tecido, como descrito acima, ou para a produção de uma guia para crescimento de tecido, como descrito acima. Um kit pode compreender uma matriz de biopolímero, por exemplo numa forma sólida ou líquida, uma bainha externa e uma ou mais células geradoras de tensão e/ou células de um tecido de interesse.

As matrizes de biopolímero, bainhas externas e células de reparação adequadas são discutidas acima. A matriz pode ser um gel já preparado, pré-moldado numa forma de núcleo adequada, ou pode ser na forma de pó ou líquido, para moldagem na forma de núcleo adequada, utilizando a membrana externa. A bainha externa pode ser na forma de um tubo que envolve o núcleo interno, ou no qual se pode inserir o núcleo interno. Alternativamente, a bainha externa pode ser na forma de uma bainha plana que é enrolada em torno de, ou aplicada ao núcleo antes de se desenvolver uma pré-tensão no núcleo e implantação.

Um kit pode compreender um ou mais componentes adicionais, tais como um equipamento de sutura ou cola para fixar a guia às extremidades do tecido lesionado, factores de 17 ΕΡ 1 610 834/ΡΤ crescimento adicionais para incorporar no núcleo interno e instruções de utilização.

Alguns aspectos da presente invenção serão agora ilustrados em relação às figuras anexas e exemplos experimentais a seguir, a titulo de exemplo e não limitativo. Outros aspectos e concretizações serão evidentes para os peritos na arte.

Os peritos na arte deverão entender que as caracteristicas descritas neste pedido podem ser utilizadas em qualquer combinação de acordo com a invenção.

Todos os documentos mencionados neste pedido são aqui incorporados para referência. A Figura 1 mostra dados de experiências de imunocoloração com fluorescência que indicam que os axónios DRG estão orientados com as células de Schwann alinhadas, em géis de colagénio ancorados. A Figura 2 mostra dados de imunofluorescência que indicam a quantidade de neurofilamentos presentes no coto distai dos nervos reparados, em ratos implantados com guias de tecido contendo colagénio, em comparação com tubos vazios. A Figura 3 mostra dados e imunofluorescência que indicam o número de tubos de células de Schwann contendo axónios em regeneração, em ratos implantados com guias de tecido contendo colagénio, em comparação com o tubo vazio ou controlos sem reparação, após 2, 4 e 8 semanas.

Materiais e métodos Géis de colagénio semeados com células para teste in vitro

Os géis de colagénio foram produzidos num sistema de cultura de modo a testar a eficácia das células de Schwann alinhadas no crescimento de neurónios. O método segue o desenvolvido anteriormente por este grupo (Eastwood et al. (1994) Cell Motil Cytoskeleton. 1998; 40(1):13-21) mas utilizando culturas primárias de células de Schwann. 18 ΕΡ 1 610 834/ΡΤ

Preparação de células de Schwann O método para culturas primárias de células de Schwann de rato foi adaptado de Wigley e Hall (1998) Glia 24; 290-303. Resumidamente, sacrificaram-se quatro ratos Fisher macho (150-200g, Harlan) por asfixia com CO2. Utilizando um microscópio de dissecação, cada nervo ciático foi exposto na zona média da anca e todas as ramificações principais dos nervos comuns do perónio e tibia foram removidos por dissecação. Os nervos foram em seguida lavados duas vezes em solução salina equilibrada de Hank (HBSS, Gibco) contendo 50pg/ml de gentamicina (Sigma). O epineuro e perineuro foram em seguida removidos utilizando fórceps finos, sob um microscópio de dissecação. Os nervos individuais foram cortados em segmentos de 1 x 1 mm com um cortador de tecido Mcllwain e colocados em placas de 35 mm contendo meio de Eagle modificado da Dulbecco (DMEM) (GIBCO, Grand Island, NI), suplementado com soro fetal de vitela a 10% (FCS), (DMEM/FCS) , e 50 pg/ml gentamicina. Os explantes foram deixados a flutuar neste meio durante 4 dias a 37°C/10% de CO2. Dezoito horas antes da dissociação, adicionou-se colagenase/dispase (0,1%, Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN) ao meio e os explantes foram dissociados no dia 4 por trituração suave, através de uma pipeta de ponta estreitada à chama (calibre 0,5-1 mm). As células foram em seguida plaqueadas a 5 x 104 células/ml em DMEM/FCS suplementado com 20 ng/ml GGF-2 e 10 ng/ml Forscolina (Sigma) em frascos de cultura de tecido de 25 cm2 revestidos com polilisina/laminina e recolocadas em cultura durante um máximo de 5 dias antes de utilização. As células foram recolhidas imediatamente antes da incorporação em géis de colagénio. A monocamada de células foi lavada com PBS isento de Ca2+ e Mg2+ antes de se utilizarem 3 ml de tripsina a 0,125% (em EDTA a 0,01% p/v em PBS) para se despegarem as células da superfície do frasco. Adicionaram-se em seguida 3 ml de DMEM/FCS para inactivar a tripsina. As células foram trituradas através de uma pipeta de ponta estreitada à chama (calibre 0,5-1 mm), recolhidas por centrifugação a 1500 rpm durante 5 minutos e ressuspensas em DMEM/FCS.

Misturaram-se 4 ml de 2 mg/ml de colagénio de cauda de rato do tipo I com 0,5 ml de lOx DMEM e neutralizou-se com NaOH 1 M antes da adição de 0,5 ml de suspensão de células de 19 ΕΡ 1 610 834/ΡΤ

Schwann (mistura de células de Schwann e fibroblastos de cultura primária de explante de nervo ciático de rato adulto, preparado como descrito acima; 250 000 células por ml) . Esta mistura foi moldada em dois moldes rectangulares (2,5 ml em cada) e formou um gel no espaço de 5 min a 37°C. Os géis rectangulares foram ancorados nas suas extremidades com uma malha porosa que se integrava com as extremidades do gel e formava uma barra de ancoragem. Uma vez endurecidos os géis, colocou-se por cima dos moldes 7 ml de meio (DMEM, FCS a 10%, penicilina/estreptomicina) suplementado com ácido ascórbico 50 pg/ml e incubado durante 18 h a 37°C para permitir a contracção e alinhamento.

As DRG foram recolhidas a partir de um rato SD adulto, seleccionado recentemente (200 g) e limpas de todos os processos nervosos. As DRG foram em seguida incubadas em DMEM contendo 0,125 % de colagenase durante 90 min a 37°C, em seguida a solução de colagenase foi removida e criou-se uma suspensão de células por trituração das DRG em meio de cultura. Deixaram-se assentar os detritos e a suspensão celular foi removida, centrifugada durante 5 min a lOOg e em seguida as células foram ressuspensas em 0,5 ml de meio de cultura. Semeou-se um gel de colagénio ancorado, rectangular, com células de Schwann e deixou-se contrair durante 18 h, como descrito acima. 0 meu de cultura foi escoado dos géis das células de Schwann alinhadas e adicionaram-se 250 μΐ da suspensão de DRG à superfície do gel. Deixou-se o gel para que os neurónios pudessem aderir, durante 10 min antes de ser coberto com 7 ml de meio de cultura (DMEM + soro fetal de vitela a 10%) e incubado durante 3 dias a 37°C, numa atmosfera humidificada com 5% de C02.

Imunocoloração de géis de colagénio

Após 3 dias de incubação, o meio foi removido e os géis foram lavados brevemente com PBS antes de fixação durante 20 min em paraformaldeído a 4% em tampão fosfato. Os géis foram corados para analisar a presença de β-tubulina, que é um marcador para neurónios. Todos os reagentes foram preparados em PBS e todas as incubações e lavagens foram realizadas à 20 ΕΡ 1 610 834/ΡΤ temperatura ambiente. Em resumo, os géis foram incubados em Triton-X a 0,1 % durante 10 min, em seguida bloqueados utilizando soro de suíno a 5 % antes de incubação em anti-β-tubulina de ratinho (1:400) (Sigma), durante 1 h. O anticorpo secundário era anti-IgG de ratinho (1:100) conjugado com TRITC, durante 45 min. Entre incubações, os géis foram lavados durante 3 x 15 min em 5 ml de PBS e antes da visualização, os géis foram armazenados durante pelo menos 24 h em 5 ml de PBS a 4 0 C . O crescimento neuronal foi visualizado utilizando um microscópio de fluorescência (Nikon Diaphot) ligado a uma câmara de vídeo digital (Hammamatsu Orca). As imagens foram capturadas a partir de campos representativos da região central do gel (contendo as células de Schwann contraídas, alinhadas) e as zonas delta protegidas contra o estresse, em cada extremidade. Capturaram-se aproximadamente 40 imagens de cada zona de 2 géis e o ângulo de cada percurso do axónio foi calculado utilizando o software Openlab (Improvision, UK) num Macintosh G4. Calculou-se o ângulo de desvio em relação ao eixo longitudinal do gel e é apresentada a frequência (número de axónios) com cada ângulo. Para as zonas alinhadas, encontrou-se um total de 744 axónios e para as zonas delta, encontrou-se um total de 766.

Construção de guias de tecido implantáveis

Desenvolveu-se uma guia de tecido implantável de modo a fornecer um gel de colagénio alinhado semeado com células de Schwann ao sítio de uma reparação de nervos, no rato. O elemento externo foi produzido a partir de um tubo de silicone (grau médico; comprimento de 10 mm, diâmetro de 3,17 mm, diâmetro interno de 1,98 mm; obtido da VWR) . O tubo de silicone foi perfurado em torno de cada extremidade utilizando uma agulha hipodérmica de 19G, para se obterem dois anéis de 8 orifícios de 0,5 mm-1 mm de diâmetro. As perfurações permitiram que o colagénio se integrasse com o tubo nestas regiões das extremidades.

Os géis de colagénio foram produzidos com células de Schwann como descrito acima, mas em vez de vazar os géis nos moldes, o gel foi esguichado a partir de uma pipeta para o 21 ΕΡ 1 610 834/ΡΤ tubo de silicone perfurado. Utilizou-se gel suficiente para encher completamente o lúmen do tubo e integrar com as extremidades, fluindo através das perfurações. Utilizaram-se 2,5 ml de gel para encher 10 tubos, que foram então deixados assentar numa placa de Petri durante 5 min, a 37°C. Os tubos cheios foram em seguida cuidadosamente separados uns dos outros e qualquer excesso de colagénio foi removido antes de incubação durante a noite em meio de cultura contendo DMEM + FCS a 10% suplementado com ácido ascórbico 50 pg/ml.

Durante esta incubação, o gel contraiu-se dentro do tubo e afastou-se das paredes do tubo no meio, permanecendo ancorado pelas extremidades. Isto resultou numa cadeia de colagénio fina contendo células de Schwann alinhadas que correm ao longo do centro do tubo, mantidas no lugar nas extremidades do tubo.

As construções foram analisadas quanto à contracção do gel e integridade da ligação utilizando um microscópio de contraste de fase invertido. Por exemplo, a coloração do gel com hematoxilina e eosina mostrou as células e uma imagem de contraste de fase de uma secção não corada da mesma construção, mostrou a sua posição no tubo.

Implantação do dispositivo de colagénio auto-alinhado

Separaram-se aleatoriamente ratos Fisher fêmea (150-200 g, Harlan, n=27) em três grupos experimentais e anestesiaram-se profundamente, utilizando isofluorano administrado por inalação.

Utilizando um microscópio de dissecação, o nervo ciático esquerdo de cada animal foi exposto na zona média da anca e excisou-se uma secção de 5 mm. Implantaram-se dispositivos que contêm colagénio e células de Schwann auto-alinhadas num grupo de animais, enquanto que o segundo grupo recebeu tubos de silicone vazios de igual comprimento. As condutas foram mantidas no lugar utilizando suturas epineurais 10/0 em cada coto. No grupo experimental final deixou-se um intervalo entre os cotos de 5 mm (i.e. não se implantou nenhum dispositivo). As feridas foram fechadas em camadas e deixaram-se os animais recuperar. 22 ΕΡ 1 610 834/ΡΤ

Sacrificaram-se três animais de cada grupo experimental por asfixia por CO2 a 2, 4 e 8 semanas após cirurgia. Os nervos foram novamente expostos e excisou-se um comprimento de 25 mm de nervo incorporando o sitio cirúrgico, sob microscópio de dissecação. Os nervos e condutas ou controlos foram em seguida fixados por imersão durante a noite, em paraformaldeido a 4%. O tecido foi em seguida embebido em cera de poliéster e cortaram-se secções de 7 ym do sitio do implante com cotos de nervos (em secção longitudinal) e do coto a 1 cm distai em relação ao sitio do implante (em secção transversal). As secções foram em seguida imunocoradas em duplicado, utilizando anticorpo monoclonal de ratinho anti-neurofilamentos de 200 kD, para identificar axónios em regeneração visualizados com FITC anti-ratinho (Sigma 1:100) e anticorpo policlonal de coelho anti-SlOO, para identificar as células de Schwann (DAKO, diluído 1:200) visualizadas com anti-TRITC de coelho (Sigma, diluído 1:100). Incubaram-se anticorpos primários durante a noite a 4°C e incubaram-se anticorpos secundários à temperatura ambiente, durante uma hora.

Quantificação da regeneração A regeneração foi quantificada quer no sítio do implante, quer a 1 cm distai em relação à extremidade proximal do coto distai. Para quantificar a regeneração através do defeito do nervo, três secções longitudinais separadas por 100 ym foram seleccionadas aleatoriamente de cada animal e imunocoradas como descrito anteriormente. Uma imagem digital do centro exacto da região entre cotos de cada secção foi então capturada utilizando uma câmara Zeiss AxioCam HRm combinada com um software Zeiss Axiovision, ligada a um microscópio de fluorescência Olympus Provis. A área da imagem imunocorada com anticorpo anti-neurofilamento foi então calculada utilizando o software de análise de imagem Zeiss KS-300. A regeneração também foi quantificada distalmente em relação ao sítio dor corte transversal calculando a percentagem de tubos de células de Schwann imunorreactivas S-100 que contêm axónios imunorreactivos com neurofilamentos, em secções transversais do nervo, tomadas a 1 cm distai da extremidade proximal do coto distai. As análises estatísticas 23 ΕΡ 1 610 834/ΡΤ dos resultados foram realizadas utilizando ANOVA de uma via com comparação múltipla de Bonferoni após os testes.

Resultados Géis de colagénio alinhados orientaram neurónios in vitro

Os géis de colagénio semeados com células de Schwann rectangulares foram ancorados nas suas extremidades durante 18 horas e em seguida imunocorados utilizando um anticorpo contra o marcador de células de Schwann, S100. As projecções de microscópio confocal revelaram que as células de Schwann dentro dos géis ficaram alinhadas ao longo do eixo de tensão formado pelo alinhamento de ancoragem (i.e. paralelo ao eixo longo do gel). A presença de barras de ancoragem em cada extremidade dos géis de colagénio rectangulares proporciona regiões triangulares que estão protegidas contra o estresse (designadas por zonas delta) (Eastwood et al., 1998. Cell Motil Cytoskeleton 40:13-21). Verificou-se que os processos de células de Schwann se desenvolvem com uma orientação aleatória nestas zonas delta. As zonas delta proporcionaram portanto uma região de controlo útil em que as células contraídas dentro do gel não estão alinhadas axialmente.

Os neurónios DRG que foram semeados neste substrato alinhado cresceram paralelos ao eixo de tensão, (i.e. estavam orientados com as células de Schwann alinhadas) , apresentando a maioria dos axónios um desvio inferior a 10° (Figura 1). Pelo contrário, nas zonas delta os neurónios DRG cresceram em todas as direcções. O crescimento neuronal é melhorado por guias de tecido in vivo

Desenvolveu-se uma guia de tecido implantável para a reparação de nervos, utilizando um tubo externo de silicone, como aqui descrito. As guias foram implantadas num modelo de lesão de nervos periféricos no rato. A regeneração neuronal era significativamente maior após 4 e 8 semanas em ratos que receberam o dispositivo de colagénio celular, em comparação com um tubo de silicone vazio, ou nenhuma reparação. A Figura 2 mostra a quantidade de neurofilamento presente no coto distai dos nervos reparados, tal como determinado por 24 ΕΡ 1 610 834/ΡΤ quantificação de imagens de imunofluorescência de secção longitudinal. Isto deu uma indicação do nivel de regeneração neuronal através do hiato e mostrou que em cada ponto de tempo este era maior na presença de colagénio contraído, em comparação com controlos de tubo vazio. Uma outra determinação de regeneração compreendida a quantificação do número de células de Schwann positivas para S100 que continham neurónios positivos para neurofilamentos em secções transversais 1 mm distais em relação ao coto distai. Antes do corte transversal, todos os tubos de células de Schwann conterão neurónios e a degeneração waleriana subsequente deixará estes tubos vazios para ocupação por axónios em regeneração. A Figura 3 mostra que após 4 e 8 semanas, significativamente mais tubos de células de Schwann continham axónios em regeneração nos ratos que receberam dispositivos contendo colagénio, em comparação com tubo vazio, ou controlos sem reparação. É aqui mostrado que a ancoragem de extremidades opostas de géis de colagénio que são semeados com células contrácteis promove a formação de uma construção celular alinhada. Este substrato proporciona vias de orientação que resultam num crescimento neuronal de DRG altamente alinhado, quando comparado com as zonas delta alinhadas aleatoriamente. Verifica-se que a implantação de guias de tecido alinhadas que contêm matrizes de colagénio celular em sítios de lesão de nervos periféricos aumenta o crescimento de nervos, quer em termos de tecido neuronal absoluto, detectado no coto distai, quer no número de bandas de Bungner inervadas, distais em relação ao sítio de reparação.

Lisboa, 2009-02-26

Claims (30)

1. ΕΡ 1 610 834/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Guia para crescimento de tecido compreendendo um núcleo interno que compreende uma matriz de biopolimero com uma ou mais células nele posicionadas, em que a guia compreende ainda; uma bainha externa que envolve o referido núcleo interno, estando o referido núcleo interno fixado na referida bainha externa numa primeira região de ligação e uma segunda região de ligação; de modo que as referidas células produzem uma tensão mecânica no referido núcleo entre a primeira e segunda regiões de ligação.
2. 2. Guia de acordo com a reivindicação 1, em que a referida tensão mecânica no referido núcleo provoca o alinhamento das células.
3. 3. Guia de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que a referida tensão mecânica no referido núcleo provoca o alinhamento das fibras da referida matriz de biopolimero.
4. 4. Guia de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a matriz de biopolimero é uma matriz de colagénio.
5. 5. Guia de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, adaptada para utilização como um implante na reparação de tecido lesionado.
6. 6. Guia de acordo com a reivindicação 5, em que a bainha compreende uma ou mais portas de entrada para entrada de tecido em regeneração.
7. 7. Guia de acordo com a reivindicação 5 ou a reivindicação 6, adaptada para a regeneração de nervos.
8. 8. Guia de acordo com a reivindicação 7, em que a bainha compreende uma porta de entrada para entrada de nervos em ΕΡ 1 610 834/ΡΤ 2/4 regeneração e uma porta de saída para a saída de um nervo em regeneração.
9. 9. Guia de acordo com a reivindicação 8, compreendendo uma ou mais fixações para fixar no local o ponto de entrada adjacente à extremidade proximal de um nervo lesionado e o ponto de saída na extremidade distai de um nervo lesionado.
10. 10. Guia de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 9, em que a tensão mecânica no núcleo confere tracção ao tecido em regeneração na guia.
11. 11. Guia de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que as referidas células compreendem uma ou mais células de Schwann, fibroblastos neurais, fibroblastos, tenócitos, astrócitos, osteoblastos, mioblastos, melanócitos, células de músculo liso, células de vasos secretores ou de glândulas, células epiteliais e células endoteliais.
12. 12. Guia de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que as referidas células compreendem células de Schwann e fibroblastos.
13. 13. Guia de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida bainha é bioabsorvível.
14. 14. Guia de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida bainha é não porosa.
15. 15. Guia de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, em que a referida bainha é seleccionada do grupo constituído por silicone, vidro de fosfato, polilactona, poliglicona, policapriolactona, hialuronano ou seus derivados, colagénio, fibrina, fibronectina, celulose, quitosano e amido.
16. 16. Guia de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a bainha é mecanicamente fixada ao núcleo, na primeira e segunda regiões de ligação.
17. 17. Guia de acordo com a reivindicação 16, em que a referida bainha externa é moldada para se ligar de forma cooperativa ao núcleo interno, na primeira e segunda regiões ΕΡ 1 610 834/ΡΤ 3/4 de ligaçao, para impedir o movimento coaxial do núcleo em relação à bainha.
18. 18. Guia de acordo com a reivindicação 17, em que a referida bainha compreende uma ou mais aberturas que se ligam de forma cooperativa ao núcleo interno, na primeira e segunda regiões de ligação.
19. 19. Guia de acordo com a reivindicação 18, em que as referidas aberturas compreendem uma pluralidade de poros.
20. 20. Guia de acordo com a reivindicação 18, em que as referidas aberturas compreendem um ou mais orifícios na bainha.
21. 21. Guia de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que a bainha é quimicamente fixada ao núcleo na primeira e segunda regiões de ligação.
22. 22. Guia de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, adaptada para utilização in vitro como biorreactor para o crescimento de tecido.
23. 23. Método para produzir uma guia para o crescimento de tecido, compreendendo; proporcionar uma bainha externa, introduzir células numa matriz líquida de biopolímero, introduzir a referida matriz líquida no interior da bainha exterior, provocar ou permitir o endurecimento da referida matriz líquida; e fixar a matriz à bainha numa primeira e segunda regiões de ligação.
24. 24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que a bainha se liga de forma cooperativa à matriz, na primeira e segunda regiões de ligação, em que a referida ligação impede o movimento coaxial do núcleo em relação à bainha.
25. 25. Método de acordo com a reivindicação 23 ou a reivindicação 24 compreendendo provocar ou permitir que as ΕΡ 1 610 834/ΡΤ 4/4 células no seio da referida matriz originem uma tensão mecânica entre a primeira e a segunda regiões de ligação.
26. 26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, compreendendo implantar a referida guia num corpo humano ou animal.
27. 27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 26, em que as células compreendem fibroblastos e uma ou mais células do referido tecido.
28. 28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 27, em que as células de tecido compreendem fibroblastos e um ou mais células estaminais ou células progenitoras do referido tecido.
29. 29. Utilização de uma guia de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, no fabrico de um medicamento para ser utilizado num método de reparação de lesão de um tecido, compreendendo ligar uma primeira e uma segunda extremidades da guia às extremidades danificadas de um tecido lesionado, num indivíduo, e permitir que o referido tecido regenere através da referida guia.
30. 30. Utilização de acordo com a reivindicação 29, em que o tecido lesionado é um nervo. Lisboa, 2009-02-26