ES2318283T3 - Guia de crecimiento de tejido de autoalineacion. - Google Patents
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Abstract
Guía de crecimiento de tejido que comprende, un núcleo interno que comprende una matriz de biopolímero que tiene una o más células ubicadas en su interior, comprendiendo la guía además; una vaina exterior que rodea dicho núcleo interior, estando dicho núcleo interior fijado a dicha vaina exterior en una primera región de unión y a una segunda región de unión; de forma tal que dichas células producen tensión mecánica en dicho núcleo entre la primera y la segunda región de unión.
Description
Guía de crecimiento de tejido de
autoalineación.
Esta invención se refiere a guías artificiales
que facilitan el crecimiento de tejidos, tales como nervios, y que
pueden, por ejemplo, ser quirúrgicamente implantados dentro de un
individuo para facilitar la regeneración de tejido dañado.
El tejido dañado dentro del cuerpo es usualmente
reparado mediante procesos naturales de regeneración. Sin embargo,
en ciertas circunstancias, la regeneración de tejido dañado está
limitada o no se produce en absoluto. El daño a los nervios en el
sistema nervioso periférico (PNS) o central (CNS), por ejemplo, a
continuación de un trauma o de cirugía, con frecuencia resulta en
la pérdida permanente de sensibilidad o función.
Las guías artificiales han sido desarrolladas
para facilitar la regeneración de tejido neural tanto en el CNS
como en el PNS. Tubos hechos de colágeno (Labrador et al.
(1998) Exp. Neurol. 149 243-252) hialuronano o
polilactona han sido utilizadas para proporcionar una guía global a
la neurita consiguiente y aislar la región de reparación en virtud
de la estructura tubular. Alternativamente, manojos de fibras
alineadas hechas de filamentos de carbono (Khan et al (1991)
Brain Res 541 139-145), papel de nitrocelulosa
(Houle et al (1989) Neurosci Lett 103,
17-23), colágeno (Liu et al (1997) Neurosci
Res 49 425-432; Yoshii and Oka, (2001) J. Biomed.
Materials Res. 56 400-405) o fibronectina (Priestley
et al (2002) J. Physiol-Paris 96
123-133) también ser utilizado para proporcionar
guía de contacto a un nivel celular (revisado por Brown, (2000)
Bioartificial Implants: Design and Tissue Engineering in Structural
Biological Materials, design and structure property relationships
(Ed M. Elices) Pergamon Materials Series Vol. 4
151-160).
Las guías artificiales pueden, por ejemplo, ser
implantadas dentro de un lugar del nervio dañado de forma tal que
los extremos de la guía contactan los muñones proximal y distal del
nervio dañado. El nervio de regeneración crece desde el muñón
proximal dentro del extremo proximal de la guía y luego a través de
la guía para contactar el muñón distal del nervio en el extremo
distal de la guía y eventualmente para restablecer una conexión
neural.
Materiales artificiales pueden ser utilizados en
una guía nerviosa ya sea solos o con la adición de factores de
crecimiento (Whitworth et al (1995) Eur. J. Neurosci.
7:2220-2225). El sembrado de implantes con células
de reparación neural, que producen factores de crecimiento, por
ejemplo células Schwann, es conocido para facilitar la regeneración
nerviosa (Rodríguez et al (2000) Exp. Neurol. 161
571-584).
A pesar de que los implantes artificiales han
producido algunos resultados esperanzadores, no se ha logrado
todavía una regeneración funcional de los nervios tanto del nervioso
central (CNS) después de un trauma o lesión.
Los presentes inventores han producido una guía
para el crecimiento de tejido que se siembra con células. La guía
se dispone de forma tal que una tensión mecánica uniaxial se genera
internamente dentro de la guía. Esta versión autoalinea las células
en la dirección del crecimiento de tejido para proporcionar un
sustrato de guía celular para el tejido de regeneración in
vivo.
Un aspecto de la invención proporciona una guía
de crecimiento de tejido para el crecimiento de tejido que
comprende,
un núcleo interior que comprende una matriz de
biopolímero que tiene una o más de células generadoras de tensión
dispuestas en el mismo, comprendiendo la guía además una vaina
exterior que rodea dicho núcleo interior, estando dicho núcleo
interior fijado a dicha vaina exterior en una primera región de
unión y una segunda región de unión;
de forma tal, que en el uso, las células en
dicha matriz generan tensión mecánica en el núcleo entre la primera
y la segunda región de unión.
Helmecke, cuando el núcleo se fija a la vaina en
la primera y la segunda región de unión, no hay tensión en el
núcleo. Cuando el núcleo está en su lugar dentro de la vaina, las
células dentro del núcleo comienzan a producir una fuerza de
contracción. La fuerza de contracción genera una carga de tensión
dentro de la matriz entre la primera y la segunda región de unión.
Esta carga de tensión mecánica es mayormente coaxial y corre
paralela a la dirección de recrecimiento del tejido (es decir
longitudinalmente a través del núcleo). La primera región de unión
está preferentemente o es adyacente al extremo proximal (entrada) de
la guía y la segunda región de unión está preferentemente o es
adyacente al extremo distal (salida) de la guía, a pesar de que en
algunas realizaciones la vaina exterior puede extenderse más allá
del núcleo en cada extremo, por ejemplo para facilitar el contacto
con los muñones de tejido que flanquean la región dañada.
La presencia de tensión mecánica dentro de la
matriz circundante provoca que las células dentro de la matriz se
alineen coaxialmente a lo largo del núcleo, es decir en la dirección
de recrecimiento. La tensión en el núcleo puede provocar también
que las fibras de la matriz se muevan en una alineación
comparable.
El nivel de guía de célula a través del
alineación de matrices extracelulares optimizan la migración de las
células y es ventajoso en una guía de reparación de tejidos (Ahmed
& Brown (1999) Cell. Motil. Cytoskeleton 42
331-343; Priestley et al (2002) J. Physiol.
Paris 96 123-133; Wojciak-Stothard
et al In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 33
110-117).
Los tejidos adecuados para reparación como se
describen aquí pueden regenerar o volver a crecer en una forma
unidireccional desde un extremo de tejido dañado hacia el otro (por
ejemplo un nervio) o en una forma bidireccional desde ambos
extremos de tejido dañado (por ejemplo tejido no neuronal tal como
tendón, ligamento, menisco, vaso sanguíneo, piel, tracto digestivo
y hueso).
Los tejidos adecuados incluyen músculos (en
particular juntas neuromusculares), vasos sanguíneos, tendones,
ligamentos, cápsulas, meniscos, huesos, piel y nervios. Algunas
realizaciones preferidas se refieren a la reparación de nervios y
de tejido neural.
El núcleo interior de la guía es preferentemente
lineal es decir es significativamente mayor en una dimensión que en
las otras dos, y convenientemente tiene forma de varilla es decir el
mismo tiene una sección transversal redonda, por ejemplo circular o
elíptica. En realizaciones en las cuales la guía se adapta para la
implantación, el núcleo interior puede tener un tamaño (es decir, un
diámetro) y una longitud apropiados para conectar diferentes
tejidos y regiones anatómicas. Por ejemplo, un núcleo interno
adecuado para conectar el nervio digital puede ser de
aproximadamente 1 mm de diámetro. Otros núcleos adecuados para la
reparación de nervios humanos pueden ser de entre
2-7 mm de diámetro.
La matriz de biopolímero del núcleo interior
puede ser un sustrato de base proteína fibrilar, preferentemente
auto gelificante, el cual es dócil y contra el libre mediante las
fuerzas generadas por las células incluidas. Los materiales
adecuados incluyen colágeno, fibrina/fibrinógeno, fibronectina,
gelatina y polímeros bioabsorbibles tales como polilactido, ácido
políglicolico, y policapriolactona. Preferentemente, la matriz de
biopolímero no se produce naturalmente en el cuerpo del mamífero y
no exhibe la organización y la morfología bruta del tejido de los
mamíferos.
Una matriz adecuada de colágeno puede ser un gel
formado de una red reconstituida de fibrillas enredadas de colágeno
de 20-500 nm de diámetro, comprendiendo típicamente
un 90%-99% del líquido intersticial, dependiendo de la fuente de
colágeno y del procedimiento de reconstrucción.
Las matrices adecuadas de colágeno incluyen
matrices de colágeno de tipo I las cuales pueden convenientemente
ser preparadas como se describe en Mudera V.C. et al Cell.
Motil. Cytoskeleton (2000) 45 1-9.
Una célula adecuada para su uso en la invención
aplica una fuerza de contracción a la matriz de biopolímero y cae
dentro de la alineación con la tensión resultante en la matriz.
Preferentemente las células también facilitan el crecimiento de
tejido dentro de la matriz, por ejemplo, mediante la producción de
uno o más factores promotores del crecimiento apropiados. Por
ejemplo, una célula adecuada para utilizarse en el crecimiento de
tejido neural (es decir una célula de reparación neural) puede
producir uno o más factores promotores del crecimiento neurales.
Los factores promotores del crecimiento neural incluyen
neurotropinas tales como neurotropina-3, factor de
crecimiento del nervio (NGF), factor de crecimiento glial (GGF) y
factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF). Preferentemente,
las células sembradas dentro de la matriz de biopolímero se alinean
y contraen pero no proliferan para formar tejido organizado.
Las células adecuadas para usar en el sembrado
de la matriz incluyen células de mamíferos tales como células
Schwann, fibroblastos neurales, fibroblastos, tenocitos
(osteoblastos), mioblastos, células del músculo liso y células
endoteliales. Las células adecuadas para la reparación neural
incluyen células Schwann, fibroblastos neurales y mezcla de los
mismos (Hall S (2001) J. Hand Surg. 2613 (2)
129-136). Las células de reparación neural pueden
obtenerse a partir de nervios adultos mediante digestión de
colagenasa o cultivo de explante, como se describe en "Neural
Cell Culture, a practical approach" Ed Cohen & Wilkin
221-236 IRL Press.
Preferentemente, las células no producen poli
péptidos de un tipo o calidad que no es normalmente encontrado en
el tejido de interés (es decir tejido nervioso). Por ejemplo, en
realizaciones preferidas, las células no contienen ADN foráneo para
la expresión de una proteína heteróloga.
En algunas realizaciones, además de las células
generadoras de tensión (por ejemplo fibroblastos), la matriz
también puede estar sembrada con células del tejido de interés. Por
ejemplo, pueden utilizarse tenocitos, células endoteliales o
epiteliales, vasos secretores o de glándulas (por ejemplo sebáceas,
células de los islotes pancreáticos, células de la corteza
adrenal), melanocitos, células Schwann o astrocitos. En dicha
realizaciones, el núcleo que contiene las células que generan la
tensión de alineación forma un sustrato de guía para el crecimiento
de las células del tejido incluidas.
En otras realizaciones, la matriz no se siembra
con las células del tejido de interés. En otras palabras, las
células dentro de las guías son heterólogas al tejido de interés.
Por ejemplo, la matriz puede estar desprovista de neuronas antes de
la implantación.
Las células pueden ser sembradas dentro de la
matriz mediante la mezcla de las mismas con la matriz líquida de
biopolímero y permitiendo luego que la matriz líquida se solidifique
en un gel. Convenientemente, el gel puede ser sembrado con 10^{4}
a 10^{7} células por ml, más preferentemente 2x10^{5} a 10^{6}
células por ml.
La vaina exterior es preferentemente un material
sólido que proporciona resistencia a la fuerza de contracción
impartida por las células en el núcleo, manteniendo de esta forma
tensión mecánica dentro del núcleo entre las dos regiones de unión.
El material de la vaina exterior es por lo tanto rígido relativo a
la matriz de biopolímero del núcleo, para alojar la tensión mecánica
en el núcleo. El material de la vaina preferentemente nuestra baja
adhesión o sustancialmente no adhesión con el núcleo fuera de las
zonas de unión. Preferentemente, la vaina rodea completamente al
núcleo, de forma tal que sólo los extremos del núcleo son expuestos
al exterior.
Los materiales adecuados para la vaina tienen
una alta biocompatibilidad es decir no producen reacciones adversas
dentro del cuerpo, y, en realizaciones preferidas, son reabsorbibles
in situ, por ejemplo biodegradables, para evitar la
necesidad de la extracción quirúrgica del sitio de aplicación
después de su uso. Ejemplos de materiales para la vaina adecuados
incluyen cristal fosfato, polilactona, poliglicona,
policapriolactona y hialurona o derivados de los mismos. Otros
materiales adecuados incluyen colágeno, fibrina, fibronectina,
celulosa, chitosan, y almidón. Materiales para la vaina adecuados no
reabsorbibles incluyen silicona.
En algunas realizaciones, la vaina es no
porosa.
Si el núcleo es un polímero no proteínico, el
extremo proximal de la vaina puede comprender un material agregado
proteínico para permitir que el núcleo sea preferencialmente
liberado del extremo proximal, mediado por proteasas de las células
del tejido entrante (por ejemplo un nervio regenerador).
La vaina exterior se fija al núcleo interior en
la primera región de unión y la segunda región de unión de forma
tal que el movimiento, particularmente axial o longitudinal del
núcleo relativo a la vaina se evita en estas regiones. Para
permitir la generación de una fuerza de contracción, el núcleo
preferentemente es libre de moverse relativo a la vaina entre la
primera y la segunda región de unión. Al evitar la adhesión del
núcleo a la vaina fuera de las regiones de unión definidas, el
material de la vaina preferentemente es no adherente.
El núcleo y la vaina pueden fijarse juntos en
las regiones de unión mediante cualquier procedimiento conveniente
y la persona entendida es capaz de identificar un número de técnicas
adecuadas.
En algunas realizaciones, la vaina exterior
puede fijarse mecánicamente al núcleo, es decir, a la matriz de
biopolímero, en la primera y segunda región de unión.
Por ejemplo, en la primera y la segunda región
de unión, la vaina exterior puede ser formada para proporcionar un
acoplamiento cooperativo con el núcleo interior. El acoplamiento
fija la vaina y el núcleo juntos en estas regiones.
Preferentemente, la vaina exterior comprende una o más aberturas o
salientes en su superficie interna. Las aberturas pueden extenderse
a través del lado de la vaina hacia la superficie exterior, o
pueden formar recesos o lugares que nos extienden hacia la
superficie exterior. Las aberturas adecuadas incluyen ranuras,
porros, hendiduras, y aberturas. Por ejemplo, las regiones de unión
de la vaina pueden comprender mangos porosos alrededor del
núcleo.
Preferentemente, el núcleo se acopla con las
aberturas o salientes en la vaina cuando éste se introduce dentro
de la vaina en forma líquida durante la producción de la guía.
Cuando el núcleo se solidifica, el acoplamiento sostiene el núcleo
y la vaina juntos en las regiones de unión.
Otros procedimientos mecánicos de fijación,
tales como clavijas, suturas, grapas de presión o abrazaderas de
inserción, también pueden ser utilizados.
En algunas realizaciones, la vaina exterior
puede estar químicamente fijada al núcleo en la primera y la
segunda región de unión, por ejemplo utilizando un adhesivo tal como
una fibrina o un adhesivo de cianocrilato.
Tal como se describió con anterioridad, en
algunas realizaciones, la guía puede estar adaptada para la
implantación en un individuo para facilitar la reparación del tejido
dañado.
La vaina exterior puede, por ejemplo, estar
compuesta de un material no adherente que reduce o abroga la
formación de adhesiones entre la guía y el tejido que rodea la guía
implantada (es decir la vaina es anti- o no adhesiva a las capas
deslizantes de tejido circundante). La vaina exterior puede también
reducir o abolir el crecimiento interior de las células o tejidos
circundantes dentro del núcleo interior.
La vaina puede también ser adecuada y/o estar
adaptada para aceptar duras u otros medios de unión (por ejemplo,
pegamento) para sostener el núcleo contra los extremos del tejido
dañado.
Una guía adaptada para la implantación es
preferentemente reabsorbible in situ. Más preferentemente,
la estabilidad de la guía (y por lo tanto la tasa de reabsorción)
varía a lo largo de su longitud (por ejemplo cuando el tejido se
regenera en una dirección proximal a distal, puede haber una
gradación en la tasa de reabsorción de la guía entre los extremos
proximal (entrada) y distal (salida) y donde tejido se regenera
desde ambos extremos del tejido roto (es decir ambos tejidos son
proximales), puede haber una gradación en la tasa de reabsorción de
la guía entre los extremos de la guía y el medio).
Donde el tejido se regenera en una dirección
proximal a distal, por ejemplo en la reparación de una reunión, la
gradación de la tasa de reabsorción es preferentemente tal que el
extremo proximal de la guía se reabsorbe más rápidamente que el
extremo distal. Esto proporciona al extremo del nervio en
regeneración con una guía extendida al pasar a través de la guía.
La secreción de factores celulares, incluyendo proteasas, por parte
del nervio en regeneración causa una reabsorción proximal
preferencial cuando el nervio entra y crece a través del extremo
proximal de la guía.
La reabsorción de la vaina exterior en la
primera región de unión, después de regenerar tejido, tal como un
nervio, ha entrado el extremo proximal del núcleo, libera el núcleo
de la vaina exterior en el extremo proximal. El núcleo se sostiene
en su extremo proximal mediante el mismo tejido y la tensión
previamente ejercida entre la primera y la segunda región de unión
se transfiere al tejido en regeneración, ejerciendo una fuerza de
tracción. En otras palabras, la vaina exterior en la primera región
de unión se reabsorbe preferencialmente después de la entrada de
tejido en regeneración en el extremo proximal del núcleo, de forma
tal que el núcleo aplica tensión mecánica al tejido en
regeneración.
Donde el tejido se regenera en una forma
multidireccional (es decir desde ambos extremos rotos del tejido
dañado), la gradación de la tasa de reabsorción es preferentemente
tal en los extremos de la guía (que en efecto son ambos extremos
proximales) se reabsorben más rápidamente que el medio de la guía.
Esto prevé que los extremos del tejido en regeneración o la guía
extendida al pasar a través de la guía y encontrarse dentro de la
misma. Esta reabsorción preferencial es provocada por la liberación
de factores celulares, leyendo proteasa las, por parte del tejido
en regeneración cuando éste entra y crece a través de la guía.
La reabsorción de la vaina exterior en la
primera y la segunda regiones de unión, después de que el tejido en
regeneración ha entrado en los extremos del núcleo, libera el núcleo
de la vaina exterior. El núcleo es soportado en sus extremos
mediante el mismo tejido en regeneración y la tensión previamente
ejercida entre la primera y la segunda región de unión se
transfiere al plano del crecimiento anticipado del tejido,
ejerciendo una fuerza de tracción. En otras palabras, la vaina
exterior en la primera y la segunda región de unión se reabsorbe
preferentemente después de la entrada del tejido en regeneración
dentro de los extremos del núcleo, de forma tal que el núcleo
aplica tensión mecánica al tejido en regeneración.
Esto es ventajoso, ya que la aplicación de
tensión mecánica, en particular a los nervios, se conoce que
acelera el crecimiento (Smith et al (2001) Tiss Eng. 7
131-139).
Mientras que la reabsorción proximal
preferencial puede producirse automáticamente, cuando el tejido en
regeneración entra en la guía, la tasa de reabsorción puede ser
controlada adicionalmente a través de una guía que tiene una vaina
de base proteína mediante el remojado de uno o ambos extremos de la
guía en reactivos estabilizantes tales como soluciones de Cu++ o
Zn++, para generar un gradiente de concentración de estos iones a
través de la guía, o mediante la fabricación de la guía a partir de
un número de longitudes de material de guía cuya composición de
proteína de adhesión cambie gradualmente de este el extremo proximal
al distal de la guía.
En la práctica, una guía de la invención puede
ser montada y opcionalmente, permitirse el desarrollo de tensión en
el núcleo antes de la implantación, por ejemplo mediante el cultivo
de las células dentro del núcleo durante 8-12
horas. La guía puede ser entonces implantada dentro de un sitio de
tejido dañado de forma tal que los extremos del núcleo interior
contacten con los muñones proximal y distal del tejido dañado. La
guía puede ser sujetado en su sitio mediante pegamento u otros
medios de fijación, tales como suturas, por ejemplo a través de la
vaina exterior. En algunas realizaciones, los medios de fijación
pueden estar comprendidos dentro de la guía. El muñón proximal del
tejido en regeneración, tal como un nervio, puede entrar en la guía
en su extremo proximal y salir de la guía en su extremo distal para
contactar con el muñón distal. En otras realizaciones, el tejido en
regeneración de ambos muñones rotos puede entrar en la guía en sus
extremos y encontrarse dentro de la guía para restablecer una
conexión funcional.
Las guías como aquí se describen pueden ser
útiles en la reparación del daño en una variedad de tejidos,
incluyendo daño neural en el sistema nervioso central o periférico,
y en la generación de injertos para cirugía plástica.
Una guía de crecimiento de tejido como se
describe aquí puede ser lineal y tener un primer y un segundo
extremo. En realizaciones en las cuales el recrecimiento del tejido
es unidireccional, el primer extremo puede actuar como un puerto de
entrada proximal para el tejido en regeneración y el segundo extremo
como un puerto de salida distal. En realizaciones en las cuales el
recrecimiento del tejido es bidireccional, el primer y el segundo
extremo pueden actuar ambos como puertos de entrada proximales para
el tejido en regeneración.
En algunas realizaciones, la guía puede ser
ramificada es decir puede comprender más de los extremos, por
ejemplo, un tercer o cuarto extremo. Dicha guía ramificada puede
poseer más de un puerto de entrada y/o más de un puerto de salida.
Las realizaciones preferidas pueden comprender un único puerto de
entrada proximal y dos o más, por ejemplo tres, cuatro o cinco
puertos distales de salida. Una guía según estas realizaciones
preferentemente comprende una región de unión en cada uno de sus
extremos para permitir que la tensión mecánica se mantenga a través
del núcleo. Por ejemplo, una primera región de unión puede indicarse
adyacente al puerto de entrada proximal y una segunda y una tercera
(o más) regiones de unión respectivamente en los dos (o más)
puertos distales de salida.
En otras realizaciones, una guía de la invención
puede ser adaptada para el crecimiento in vitro de tejido.
El tejido motivado dentro del guía puede, por ejemplo, se han
implantado a continuación en un individuo.
En dichas realizaciones, las células sembradas
en la matriz de biopolímero puedan comprender células generadoras
de tensión, tales como fibroblastos, y adicionalmente células del
tejido de interés (o células madres/progenitoras capaces de
diferenciarse en células del tejido objetivo). Las células del
tejido adecuadas incluyen tenocitos, células endoteliales o
epiteliales, vasos secretores o de glándulas (por ejemplo sebáceas,
células del islote pancreático, células de la corteza adrenal),
melanocitos, células de Schwann o astrocitos.
Una guía sembrada con células generadoras de
tensión y células de tejido objetivo puede ser cultivadas en un
bioreactor bajo condiciones estándar de cultivo de tejidos (por
ejemplo, 37ºC en DMEM + 10% suero fetal de ternero) para permitir
el crecimiento orientado de células del tejido objetivo dentro de la
guía.
La guía puede ser cultivada mediante inversión
en el medio de cultivo y/o el medio puede ser introducido
directamente en el interior de la guía por medio de capilares dentro
del núcleo.
El núcleo de una guía según estas realizaciones
puede comprender uno más capilares para el paso de medio nutriente
a través del núcleo. Preferentemente, el uno o más capilares forman
canales continuos ubicados coaxialmente a lo largo de la longitud
del núcleo.
Los capilares pueden ser introducidos en el
núcleo durante la producción mediante técnicas convencionales tales
como la incorporación y la extracción de un cable fino de sutura, la
incorporación de una fibra soluble, la introducción de una capa
químicamente degradable, o mediante tratamiento con una fuente
óptica/de radiación tal como un
láser.
láser.
Dicho uno o más capilares pueden ser conectados
a una fuente de medio nutritivo. El flujo del medio a través de los
capilares puede ser inducido, preferentemente mediante bombeo, por
ejemplo utilizando una bomba peristáltica. El flujo a través de los
capilares puede ser lineal, pulsado, o cíclico. El medio que fluye
a través de los capilares se difunde a través del núcleo para
proporcionar condiciones de crecimiento adecuadas a las células
incluidas.
Dos o más días de crecimiento del tejido según
esta realización pueden ser incubados en un bioreactor común de
flujo controlado mediante la conexión de un extremo de la guía a un
colector de flujo, por ejemplo utilizando una conexión de tipo
jeringa luer, de forma tal que el medio nutritivo fluye en vez del
colector a través de los capilares del núcleo y luego hacia una
salida.
Después del crecimiento dentro de la guía, las
células del tejido pueden ser aisladas y/o extraídas de la guía y
utilizadas para una variedad de propósitos, incluyendo la
implantación en un lugar de tejido dañado.
Una guía de crecimiento de tejido tal como se ha
descrito aquí puede ser producida mediante la introducción del
núcleo interior en la vaina exterior en forma líquida, de forma tal
que la vaina moldea el núcleo en la forma apropiada.
Un aspecto de la invención proporciona un
procedimiento de fabricación de la guía para el crecimiento de
tejido que comprende;
proporcionar una vaina exterior,
introducir células en una matriz líquida de
biopolímero,
introducir dicha matriz líquida en el interior
de la vaina exterior,
provocar o permitir que dicha matriz líquida se
fije; y
fijar la matriz a la vaina en una primera y una
segunda región de unión.
La matriz puede ser fijada a la vaina mediante
cualquiera de un rango de técnicas mecánicas o químicas tales como
se describieron con anterioridad.
Preferentemente, la vaina y la matriz son
fijadas juntas en las regiones de unión a través del acoplamiento
cooperativo de la matriz con la vaina.
Un procedimiento para la fabricación de una guía
para el crecimiento de tejido puede comprender;
proporcionar una vaina exterior que está formada
para acoplarse cooperativamente con el núcleo interior en la
primera y la segunda región de unión,
introducir células en una matriz líquida de
biopolímero,
introducir dicha matriz líquida en el interior
de la vaina exterior de forma tal que la matriz líquida se acopla
con dicha vaina en dichas regiones de unión, y
provocar o permitir que dicha matriz líquida se
fije, de forma tal que dicho acoplamiento evite el movimiento
coaxial del núcleo relativo a la vaina.
La vaina exterior puede ser lineal o puede tener
una o más ramas es decir puede serbi- o tri-furcada.
El núcleo, que se moldea a través de la vaina, naturalmente
adoptará la forma de la vaina.
La matriz puede ser fijada o solidificada
mediante cualquier técnica conveniente para formar el núcleo de la
guía, por ejemplo incubación a 37ºC durante 5 minutos; adición o
activación de la trombina en una solución de proteína que contienen
fibrinógeno (por ejemplo mediante la adición de Ca^{2+} a una
fracción de plasma); alegación recortada de geles de fibronectina
ricos en proteínas (Brown et al (1994) Biomaterials 15
457-464; Philips et al (2003) en prensa), o
adición de un catalizador polimerizador para autofijar polímeros
biodegradables.
Las matrices de biopolímero, células y vainas
exteriores adecuadas se han descrito con anterioridad.
En otras realizaciones, la matriz de biopolímero
sembrada puede ser introducida en la vaina exterior en una forma no
líquida por ejemplo de gel y luego fijarse en la primera y la
segunda región de unión. Por ejemplo, la matriz puede ser insertada
dentro de una vaina exterior tubular o la vaina puede ser enrollada
alrededor o aplicada a la matriz (por ejemplo mediante el colado de
un material de la vaina de fijación catalizada alrededor del núcleo
(por ejemplo un material rico en fibrina o un polímero biodegradable
autofijable)). La vaina puede ser entonces fijada en su sitio. Las
pasiones adecuadas evitan el movimiento axial del núcleo relativo a
la vaina y puede incluir adhesivos, clavijas, grapas y abrazaderas
de presión.
Un procedimiento para la producción de una guía
de crecimiento de tejido puede comprender la etapa adicional de:
provocar o permitir que las células dentro de dicha matriz generen
tensión mecánica entre la primera y la segunda región de unión.
La tensión mecánica puede ser generada en el
núcleo mediante el cultivo de las células en la matriz en
condiciones apropiadas, por ejemplo, mediante la colocación de la
guía en un medio último de células estándar, tal como DMEM, por
ejemplo en una placa de Petri, he incubado durante 8 a 12 horas a
37ºC. El medio de cultivo celular puede opcionalmente ser
suplementado con ascorbato, para facilitar la contracción.
Generalmente, las células en la guía de la
invención no proliferan para formar un tejido organizado dentro de
la matriz.
Las condiciones de cultivo para generar tensión
mecánica con distintas de las condiciones para la proliferación
celular para formar tejido organizado, lo cual requiere por ejemplo,
periodo de incubación de 1 a 18 días. La presencia de tejido
heterólogo organizado dentro de la guía puede impedir el progreso
del tejido endógeno de regeneración a través de la guía.
En algunas realizaciones preferidas, la guía
puede ser implantada en un cuerpo humano o animal para la
reparación de tejido dañado. Por ejemplo, el extremo proximal de la
guía puede ser unido a los extremos rotos de un tejido dañado de la
guía puede ser unido al muñón distal de un nervio dañado. Cuando
tejido es un nervio, el extremo proximal de la guía puede ser unido
al muñón proximal del nervio dañado y el extremo distal de la guía
puede ser unido al muñón distal del nervio dañado.
Una guía de crecimiento de tejido puede
opcionalmente ser implantada sin una etapa de pretensado como se
describió con anterioridad. La tensión mecánica se genera entonces
en el núcleo in situ.
En otras realizaciones preferidas, la una o más
células de reparación de tejido en la matriz de biopolímero puede
comprender fibroblastos u otras células generadoras de tensión, como
se describió con anterioridad, y adicionalmente células del tejido
de interés (o células progenitoras/madres capaces de diferenciarse
en las células del tejido objetivo). Las células del tejido
adecuadas incluyen tenocitos, células endoteliales o epiteliales,
vasos secretores o de glándulas (por ejemplo sebáceas, células del
islote pancreático, células de la corteza adrenal), melanocitos,
células de Schwann y astrocitos.
Un procedimiento de acuerdo con dichas
realizaciones puede comprender, después de que se ha generado
tensión mecánica en el núcleo mediante las células generadoras de
tensión, la etapa de cultivar células de tejido en dicha guía. Las
células pueden ser cultivadas mediante la adición de un medio
nutritivo y de condiciones adecuadas, como se describió con
anterioridad.
Después del cultivo, las células en dicho núcleo
pueden ser aisladas y/o extraída de la guía, por ejemplo, para su
uso en terapia, de acuerdo con técnicas estándar. En otras
realizaciones, el núcleo o la guía que contiene las células del
tejido cultivadas pueden ser usadas directamente en terapia, por
ejemplo en la implantación para la reparación de tejido dañado.
Otros aspectos de la invención proporcionan una
guía como se describió aquí para su uso en un procedimiento de
reparación de daño de tejido, en particular daño neural, y un
procedimiento de reparación de tejido dañado en un individuo que
comprende implantar una guía como se ha descrito aquí en dicho
individuo.
La implantación puede comprender unir o fijar la
guía a los extremos rotos de un tejido dañado (por ejemplo los
muñones proximal y distal de un nervio dañado), por ejemplo
utilizando suturas.
Otro aspecto de la invención proporciona un
procedimiento de reparación de tejido dañado que comprende unir los
extremos proximal y distal de una guía como se ha descrito con
anterioridad a los extremos rotos de un tejido dañado en un
individuo (por ejemplo los muñones proximal y distal respectivamente
de un nervio dañado).
Otro aspecto de la invención proporciona un
equipo que comprende una guía para el crecimiento de tejido como se
ha descrito con anterioridad o para la producción de una guía para
el crecimiento de tejido como se describió con anterioridad. Un
equipo puede comprender una matriz de biopolímero, por ejemplo en
una forma sólida o líquida, una vaina exterior y una o más células
generadoras de tensión y/o células de un tejido de interés.
Las matrices de biopolímero, vainas exteriores y
células de reparación neural adecuar las se han discutido con
anterioridad.
La matriz puede ser un gel ya preparado
preformado en la forma apropiada del núcleo o puede ser en forma de
polvo o de líquido para moldear dentro la forma del núcleo apropiada
utilizando la vaina exterior.
La vaina exterior puede ser en forma de un tubo
que rodea el núcleo interior, o dentro de la cual el núcleo
interior puede ser introducido. Alternativamente, la vaina exterior
puede ser en la forma de una hoja plana que se enrolla alrededor o
se aplica al núcleo antes del desarrollo de tensión en el núcleo y
la implantación.
Un equipo puede comprender uno más componentes
adicionales tales como equipo de sutura o pegamento para fijar la
guía a los extremos del tejido dañado, factores de crecimiento
adicionales para incorporar dentro del núcleo interior e
instrucciones para el uso.
Se ilustran ahora aspectos de la presente
invención con referencia a las figuras adjuntas y a la
ejemplificación experimental a continuación, a modo de ejemplo y no
delimitación. Aspectos y realizaciones adicionales serán evidentes
para aquellos con una habilidad ordinaria la técnica.
Se entenderá por parte de los expertos en la
materia que las características descritas en esta especificación
pueden ser utilizadas en cualquier combinación según la
invención.
Todos los documentos mencionados en esta
especificación se incorporan aquí a modo de referencia.
La figura 1 muestra datos de experimentos
fluorescentes inmunoteñidos que indican que los axones DRG son
orientados con las células de alineación de Schwann dentro de
células de colágeno atadas.
La figura 2 muestra datos de inmunofluorescencia
e indican la cantidad de neurofilamento presente en el muñón distal
de los nervios reparados en ratas implantadas con vías de tejido que
contienen colágeno comparadas con tubos vacíos.
La figura 3 muestra datos de inmunofluorescencia
que indican el número de tubos de células de Schwann que contienen
axones de regeneración en las ratas implantadas con guías de tejido
que contienen colágeno comparados con tubos vacíos o controles no
reparados después de 2, 4 y 8 semanas.
Se crearon recortes de colágeno en un sistema de
cultivo para probar la efectividad de las células de Schwann
alineadas sobre el crecimiento de las neuronas. El procedimiento
sigue el desarrollado previamente por este grupo (Eastwood et
al. (1994) Cell Motil Cytoskeleton. 1998;
40(1):13-21) pero empleando cultivos
primarios de células de Schwann.
El procedimiento para los cultivos primarios de
células de Schwann de ratas fue adaptado de Wigley and Hall (1998)
Glia 24; 290-303. Brevemente, cuatro ratas de Fisher
macho (150-200 g, Harlan) fueron sacrificados
mediante asfixia por CO_{2}. Utilizando un microscopio de
disección, se expuso cada nervio ciático en la cadera media y todas
las ramas principales de los nervios comunes del peroné y de la
tibia fueron diseccionados. Los nervios se lavaron entonces dos
veces en Hnaks's Balanced Salt Solution (HBSS, Gibco) que contenía
50 \mug/ml de Gentamycin (Sigma). El epineurium y el perineurium
fueron entonces pelados utilizando fórceps finos bajo el
microscopio de disección. Los nervios individuales se cortaron en
segmentos de 1 x 1 mm con un cortador de tejido McIlwain y se
colocaron en placas de 35 mm que contenía Dulbecco's Modified
Eagle's Medium (DMEM)(GIBCO, Grand Island, NY), suplementado con
10% de suero fetal de ternero (FCS), (DMEM/FCS), y 50 \mug/ml de
gentamicina. Los explantes se dejaron flotando en este medio
durante 4 días a 37ºC/10% CO_{2}. Dieciocho horas antes de la
disociación, se añadió colágeno/dispasa (0,1%, Boehringer Manheim
Biochemicals, Indianapolis, IN) al medio y los explantes fueron
disociados en el día 4 mediante suave trituración a través de una
pipeta de llama estrecha (0,5-1 mm de orificio).
Las células se colocaron a continuación en placas a 5 x 10^{4}
células/ml en DMEM/FCS suplementado con 20 ng/ml
GGF-2 y 10 ng/ml Forskolin (Sigma) en un matraz de
cultivo de tejido de 25 cm^{2} revestido de polilisina/laminina y
regresados al cultivo durante un máximo de 5 días antes del uso.
Las células se recogieron inmediatamente antes de la incorporación
en los geles de colágeno. La mono capa de células se lavó con
Ca^{2+} y Mg^{2+} libre de PBS antes de que se utilizaran 3 ml
de 0,125% tripsina (en 0,01% w/v EDTA en PBS) para despegar las
células de la superficie del matraz. Se añadieron entonces
3 ml de DMEM/FCS para inactivar la tripsina. Las células se trituraron a través de una pipeta de llama estrecha (0,5-1 mm de orificio), recogidas mediante centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos y resuspendidas en DMEM/FCS.
3 ml de DMEM/FCS para inactivar la tripsina. Las células se trituraron a través de una pipeta de llama estrecha (0,5-1 mm de orificio), recogidas mediante centrifugación a 1500 rpm durante 5 minutos y resuspendidas en DMEM/FCS.
Se mezclaron 4 ml de 2mg/ml de colágeno de cola
de rata de tipo I con 0,5 ml 10x DMEM y se neutralizaron con NaOH 1
M antes de la adición de 0,5 ml de una suspensión de células de
Schwann (mezcla de células de Schwann y fibroblastos a partir de un
cultivo primario de explante de nervio ciático de rata adulta
preparado como se describió con anterioridad; 250.000 células por
ml). Esta mezcla se volcó en dos moldes rectangulares (2,5 ml en
cada uno) y se formó un gel dentro de los 5 min a 37ºC. Los geles
rectangulares fueron atados en sus extremos con una mezcla porosa
que se integraba con los extremos del gel y formaba una barra de
unión. Una vez que los geles se han fijado, los moldes fueron
llenados con 7 ml de medio (DMEM, 10% FCS,
penicilina/estreptomicina) suplementados con
50 \mug/ml de ácido ascórbico e incubados durante 18 h a 37ºC para permitir la contracción y la alineación.
50 \mug/ml de ácido ascórbico e incubados durante 18 h a 37ºC para permitir la contracción y la alineación.
Las DRGs fueron recogidas a partir de una rata
SD adulta recientemente entresacada (200 g) y limpiados de todos
los procesos nerviosos. Las DRGs se incubaron luego en DMEM
conteniendo 0,125% de colagenasa durante 90 min a 37ºC, luego se
extrajo la solución de colagenasa y se creó una suspensión de
células mediante la trituración de las DRGs en medio de cultivo.
Los residuos se dejaron sedimentar y se extrajo la suspensión de
células, se centrifugó durante 5 min a 100g luego las células fueron
resuspendidas en 0,5 ml de medio de cultivo. Un gel de colágeno
atado rectangular se sembró con células de Schwann y se dejó
contraer durante 18 h como se describió con anterioridad.
El medio de cultivo se terminó de los geles de
células de Schwann alineadas y se añadieron 250 \mul de la
suspensión de DRG a la superficie del gel. El gel se dejó para que
las neuronas se adhirieran durante 10 min antes de llenarse con 7
ml de medio de cultivo (DMEM + 10% suero fetal de ternero) y se
incubó durante 3 días a 37ºC en una atmósfera unificada con 5% de
CO2.
Después de tres días de incubación, se extrajo
el medio y lo geles se lavaron brevemente con PBS antes de una
fijación durante 20 min en 4% paraformaldehido en tampón posparto.
Los geles se tiñeron por la presencia de
\beta-tubulina, que es un marcador para neuronas. Todos los reactivos fueron realizados en PBS y todas las incubaciones y lavados se realizaron a temperatura ambiente. Brevemente, los geles se incubaron en 0,1% Triton-X durante 10 min, luego se bloquearon utilizando 5% de suero de cerdo antes de la incubación en anti-\beta-tubulina de ratón (1:400) (Sigma) durante 1 h. El anticuerpo secundario puede IgG antiratón (1:100) conjugado con TRITC, durante 45 min. Entre las incubaciones, los geles se lavaron en 3 x 15 min en 5 ml PBS, y antes de la visualización, los geles fueron almacenados durante al menos 24 h en 5 ml PBS a 4ºC.
\beta-tubulina, que es un marcador para neuronas. Todos los reactivos fueron realizados en PBS y todas las incubaciones y lavados se realizaron a temperatura ambiente. Brevemente, los geles se incubaron en 0,1% Triton-X durante 10 min, luego se bloquearon utilizando 5% de suero de cerdo antes de la incubación en anti-\beta-tubulina de ratón (1:400) (Sigma) durante 1 h. El anticuerpo secundario puede IgG antiratón (1:100) conjugado con TRITC, durante 45 min. Entre las incubaciones, los geles se lavaron en 3 x 15 min en 5 ml PBS, y antes de la visualización, los geles fueron almacenados durante al menos 24 h en 5 ml PBS a 4ºC.
El crecimiento neuronal se visualizó utilizando
un microscopio de fluorescencia (Nikon Diaphot) unido a una cámara
de vídeo digital (Hammamatsu Orca). Las imágenes fueron capturadas a
partir de campos representativos de la región central del gel (que
contiene las células de Schwann alineadas contraídas) y las zonas
delta protegidas de la tensión en cada extremo. Se capturaron
aproximadamente 40 imágenes de cada zona de 2 geles y el ángulo de
cada trayectoria de axón fue calculado utilizando software Openlab
(Improvision, UK) en una Macintosh G4. Se calculó el ángulo de
desviación del eje longitudinal del gel y se muestra la frecuencia
(número de axones) con cada ángulo. Para las zonas alineadas, se
rastrearon un total de 744 axones y para las zonas delta se
rastrearon 766.
Se desarrolló una guía de tejido implantable
para suministrar un gel de colágeno alineado sembrado con células
de Schwann en el lugar de un nervio reparado en la rata. El elemento
exterior se realizó a partir de un tubo de silicona (Grado médico;
longitud 10 mm, diámetro exterior 3,17 mm, diámetro interior 1,98
mm; obtenido a partir de VWR). El tubo de silicona se perforó
alrededor de cada extremo utilizando una aguja hipodérmica 19G para
dejar dos anillos de 8 orificios de 0,5 mm - 1 mm de diámetro. Las
perforaciones permiten que el colágeno se integre con el tubo en
esas regiones de extremo.
Los geles de colágeno se crearon con células de
Schwann como se describió con anterioridad, pero en lugar de verter
los geles en moldes, el gel fue arrojado a chorros desde una pipeta
dentro del tubo de silicona perforado. Se utilizó suficiente gel
para llenar completamente el lumen del tubo y para integrarlo con
los extremos mediante el flujo hacia fuera de las perforaciones. Se
utilizaron 2,5 ml de gel para llenar 10 tubos, que fueron dejados
para fijarse en una placa de Petri durante 5 min a 37ºC. Los tubos
llenados fueron luego cuidadosamente separados uno de otro y
cualquier exceso de colágeno se recortó antes de la incubación
durante toda la noche en medio de cultivo que contenía DMEM + 10%
FCS suplementado con 50 \mug/ml de ácido ascórbico.
Durante esta incubación, el gel se contrajo
dentro del tubo y se separó de las paredes del tubo en el medio,
mientras que permanecía adherido en sus extremos. Esto resulta en un
filamento fino de colágeno que contiene células de Schwann
alineadas que discurren a lo largo del centro del tubo, soportadas
en su sitio en los extremos del tubo.
Se determinaron las construcciones para la
contracción del gel y la integridad del atado utilizando un
microscopio de contraste fase de etapa inversa. Por ejemplo, el
teñido del gel con haematoxilina y eosina mostró las células, y una
imagen de contraste de fase de una sección no obtenida de la misma
construcción mostró su posición en el tubo.
Se seleccionaron al azar ratas hembras de
Fischer (150-200 g, Harlan, n=27) en tres grupos
experimentales iguales y se anestesiaron profundamente utilizando
Isofluorano administrado mediante inhalación.
Utilizando un microscopio de disección, se
expuso el nervio ciático izquierdo de cada animal en el muslo medio
y se recorta una sección de 5 mm. Los dispositivos que contienen
colágeno auto alineado y células de Schwann se implantaron en un
grupo de animales, mientras que el segundo grupo recibió tubos de
silicona vacíos de la misma longitud. Los conductos se sujetaron en
su sitio utilizando cuatro suturas epineuriales 10/0 en cada muñón.
El grupo experimental final fue dejado con un intervalo entre
muñones de 5 mm (es decir no se implantó ningún dispositivo). Las
heridas fueron cerradas en capas y se dejó recuperar a los
animales.
Se sacrificaron tres animales de cada agrupo
experimental mediante asfixia por CO_{2} a las 2, 4 y 8 semanas
después de la cirugía. Los nervios fueron re expuestos y una
longitud de 25 mm de nervio incorporado en el sitio quirúrgico se
extrajo bajo un microscopio de disección. Los nervios y conductos o
los controles fueron fijados por inmersión durante toda la noche en
4% paraformaldehido. El tejido se incluyó entonces en cera de
poliéster y se cortaron secciones de 7 \mum del sitio de
implantación con muñones de nervios (en sección longitudinal) y del
muñón distal 1 cm distal al sitio de implante (en sección
transversal). Las secciones fueron entonces doblemente
inmunoteñidas utilizando un neurofilamento monoclonal de rata
anti-200kD para identificar los axones de
regeneración visualizados con FITC anti-ratón (Sigma
1:100) y anti-S100 policlonal de conejo para
identificar las células de Schwann (DAKO, diluido 1:200)
visualizadas con TRITC anti-conejo (Sigman, diluido
1:100). Los anticuerpos primarios fueron incubados durante toda la
noche a 4ºC y los anticuerpos secundarios fueron incubados a
temperatura ambiente durante una hora.
La regeneración fue cuantificada tanto en el
lugar de implante como también a 1 cm distal del extremo proximal
del muñón distal. Para cuantificar la regeneración a través del
defecto del nervio, tres secciones longitudinales separadas
mediante 100 \mum fueron elegidas al azar de cada animal e
inmunoteñidas como se describió previamente. Una imagen digital del
centro exacto de la región entre muñones de cada sección se capturó
entonces utilizando una cámara Zeiss AxioCam HRm combinada con
software Zeiss Axiovision unido a un microscopio de fluorescencia
Olympus Provis. El área de la imagen inmunoteñida con anticuerpo
anti neurofilamento fue calculada entonces utilizando el software
de análisis de imágenes Zeiss KS-300.
La regeneración también fue cuantificada distal
al sitio de transacción mediante el cálculo del porcentaje de tubos
de células de Schwann inmunoreactivos S-100 que
contenían axones de neurofilamentos inmunoreactivos en secciones
transversales de nervio tomado 1 cm distal del extremo proximal del
muñón distal. Los análisis estadísticos de los resultados fueron
realizados utilizando una ANOVA de un factor con pruebas posteriores
de comparación múltiple de Bonferoni.
Geles de colágeno rectangulares sembrados con
células de Schwann fueron atados en sus extremos durante 18 horas
luego inmunoteñidos utilizando un anticuerpo contra el marcador S100
de la célula de Schwann. Las proyecciones de microscopio confocal
revelaron que las células de Schwann dentro de los geles se alinean
a lo largo del eje de atención formado por la alineación atada (es
decir paralelo al eje largo del gel). La presencia de las barbas
atadas en cada extremo de los geles de colágeno rectangulares
proporciona regiones triangulares que están protegidas de la
tensión (denominadas zonas Delta)(Eastwood et al. (1998) Cell
Motil Cytoskeleton. 1998; 40:13-21). Los procesos
de las células de Schwann fueron observados desarrollando con
orientación al azar en estas zonas Delta. Las zonas Delta por lo
tanto proporcionaron una región de control útil en la cual las
células contraídas dentro del gel no están alineadas axialmente.
Las neuronas DRG que son sembradas sobre este
sustrato alineado crecen paralelas al eje de atención, (es decir
fueron orientadas con las células de Schwann alineadas), con la
mayoría de axones mostrando una desviación de menos de 10º (figura
1). De forma inversa, en las zonas delta las neuronas DRG crecen en
todas direcciones.
El crecimiento neuronal se mejora mediante guías
de tejido in vivo.
Una guía de tejido implantable para la
reparación de nervios se desarrolló utilizando un tubo exterior de
silicona como se ha descrito aquí con anterioridad. Las guías fueron
implantadas en un modelo de lesión de nervio periférico en la rata.
La regeneración neuronal fue significativamente mayor después de 4 y
8 semanas en ratas que recibieron el dispositivo de colágeno
celular en comparación con un tubo de silicona vacío o sin
reparación. La figura 2 muestra la cantidad de neurofilamento
presente en el muñón distal de los nervios reparados como se
determinó mediante cuantificación de imágenes inmunofluorescentes de
sección longitudinal. Esto da una indicación del nivel de
regeneración neuronal a través del intervalo y mostró que en cada
punto de tiempo ésta fue mayor en la presencia de colágeno
contraído en comparación con controles de tubos vacíos. Una
evaluación adicional de regeneración comprendió la cuantificación
del número de tubos de células de Schwann S100 positivos que
contenían neuronas positivas para el neurofilamento en secciones
transversales 1 mm distales del muñón distal. Antes de la
transección, todos los tubos de células de Schwann habrían contenido
neuronas y en consecuencia la degeneración Wallerian dejaría estos
tubos vacíos para la ocupación mediante axones de regeneración. La
figura 3 muestra que después de 4 y 8 semanas, significativamente
más tubos de células de Schwann contenían axones de regeneración en
las ratas que recibieron dispositivos que contenían colágeno
comparados con tubos vacíos o controles sin reparar.
Los extremos atados opuestos de geles de
colágeno que son sembrados con células contráctiles se muestran
aquí para promover la formación de una construcción celular
alineada. Este sustrato proporciona señales de guía que resultan en
un crecimiento neuronal altamente alineado a partir de DRGs cuando
se comparan con las zonas delta alineadas al azar. La implantación
de guías de tejido alineadas que contienen matrices de colágeno
celular en sitios de lesión de nervios periféricos muestra que
incrementa el crecimiento de los nervios, tanto en términos de
tejido neuronal absoluto detectado en el muñón distal, y en el
número de Bandas de Büngner inervadas distales a la reparación.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante está prevista únicamente para ayudar al lector y no
forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha puesto
el máximo cuidado en su realización, no se pueden excluir errores u
omisiones y la OEP declina cualquier responsabilidad en este
respecto.
\bulletLABRADOR et al. Exp.
Neurol., 1998, vol. 149, 243-252
[0003]
\bulletKHAN et al. Brain
Res, 1991, vol. 541, 139-145 [0003]
\bulletHOULE et al. Neurosci
Lett, 1989, vol. 103, 17-23 [0003]
\bulletLIU et al. Neurosci
Res, 1997, vol. 49, 425-432 [0003]
\bulletYOSHII; OKA. J.
Biomed. Materials Res., 2001, vol. 56,
400-405 [0003]
\bulletPRIESTLEY et al. J.
Physiol-Paris, 2002, vol. 96,
123-133 [0003]
\bulletBROWN. Bioartificial Implants:
Design and Tissue Engineering in Structural Biological Materials,
design and structure property relationships. Pergamon Materials
Series, 2000, vol. 4, 151-160 [0003]
\bulletWHITWORTH et al. Eur.
J. Neurosci., 1995, vol. 7, 2220-2225
[0005]
\bulletRODRIGUEZ et al. Exp.
Neurol., 2000, vol. 161, 571-584
[0005]
\bulletAHMED; BROWN. Cell.
Motil. Cytoskeleton, 1999, vol. 42,
331-343 [0011]
\bulletPRIESTLEY et al. J.
Physiol. Paris, 2002, vol. 96, 123-133
[0011]
\bulletWOJCIAK-STOTHARD et al. In Vitro
Cell Dev. Biol. Anim., vol. 33, 110-117
[0011]
\bulletMUDERA V.C. et al.
Cell. Motil. Cytoskeleton, 2000, vol. 45,
1-9 [0017]
\bulletHALL S.J. Hand Surg.,
2001, vol. 2613 (2), 129-136 [0019]
\bullet Neural Cell Culture, a practical
approach. IRL Press, 221-236 [0019]
\bulletSMITH et al. Tiss
Eng., 2001, vol. 7, 131-139 [0043]
\bulletBROWN et al.
Biomaterials, 1994, vol. 15, 457-464
[0064]
\bulletEASTWOOD et al. Cell
Motil Cytoskeleton, 1994, vol. 40 (1),
13-21 [0090]
\bulletWIGLEY; HALL.
Glia, 1998, vol. 24, 290-303
[0091]
\bulletEASTWOOD et al. Cell
Motil Cytoskeleton, 1998, vol. 40, 13-21
[0106].
Claims (30)
1. Guía de crecimiento de tejido que
comprende,
un núcleo interno que comprende una matriz de
biopolímero que tiene una o más células ubicadas en su interior,
comprendiendo la guía además;
una vaina exterior que rodea dicho núcleo
interior,
estando dicho núcleo interior fijado a dicha
vaina exterior en una primera región de unión y a una segunda
región de unión;
de forma tal que dichas células producen tensión
mecánica en dicho núcleo entre la primera y la segunda región de
unión.
2. Guía según la reivindicación 1, en la que
dicha tensión mecánica en dicho núcleo causa la alineación de las
células.
3. Guía según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en la que dicha tensión mecánica en dicho núcleo
causa la alineación de las fibras de dicha matriz de
biopolímero.
4. Guía según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, en la que la matriz de biopolímero es una matriz de
colágeno.
5. Guía según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores adaptada para su uso como un implante en la reparación de
tejido dañado.
6. Guía según la reivindicación 5, en la que la
vaina comprende uno o más puertos de entrada para la entrada de
tejido de regeneración.
7. Guía según la reivindicación 5 o la
reivindicación 6, adaptada para la regeneración de nervios.
8. Guía según la reivindicación 7, en la que la
vaina comprende un puerto de entrada del nervio en regeneración y
un puerto de salida para la salida del nervio en regeneración.
9. Guía según la reivindicación 8, que comprende
una o más fijaciones en lugar del punto de entrada adyacente al
extremo proximal de un nervio dañado y el punto de salida en el
extremo distal de un nervio dañado.
10. Guía según cualquiera de las
reivindicaciones 5 a 9, en la que la tensión mecánica en núcleo
imparte tracción sobre el tejido de regeneración en la guía.
11. Guía según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que dichas células comprenden una
o más células de Schwann, fibroblastos neurales, fibroblastos,
tenocitos, astrocitos, osteoblastos, mioblastos, melanocitos,
células del músculo liso, células secretoras o vasos de glándulas,
células epiteliales y células endoteliales.
12. Guía según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que dichas células comprenden
células de Schwann y fibroblastos.
13. Guía según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que dicha vaina es
bioabsorbible.
14. Guía según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que dicha vaina es no porosa.
15. Guía según cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 14, en la que dicha vaina se selecciona a
partir del grupo que consiste en silicona, cristal de fosfato,
polilactona, poliglicona, policarpiolactona, hialurona o derivados
de la misma, colágeno, fibrina, fibronectina, celulosa, chitosan y
almidón.
16. Guía según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la vaina se fija
mecánicamente al núcleo en la primera y la segunda región de
unión.
17. Guía según la reivindicación 16, en la que
dicha vaina exterior está formada para acoplarse cooperativamente
con el núcleo interior en la primera y la segunda región de unión
para evitar el movimiento coaxial del núcleo relativo a la
vaina.
18. Guía según la reivindicación 17, en la que
dicha vaina comprende una o más aberturas que se acoplan
cooperativamente con el núcleo interior en la primera y la segunda
región de unión.
19. Guía según la reivindicación 18, en la que
dichas aberturas comprenden una pluralidad de poros.
20. Guía según la reivindicación 18, en la que
dichas aberturas comprenden uno o más orificios en la vaina.
21. Guía según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en la que la vaina está químicamente fijada
al núcleo en la primera y la segunda región de unión.
22. Guía según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 adaptada para su uso in vitro como un
bioreactor para el crecimiento de tejido.
23. Procedimiento para fabricar una guía para el
crecimiento de tejido que comprende:
proporcionar una vaina exterior,
introducir células en una matriz líquida de
biopolímero,
introducir dicha matriz líquida en el interior
de la vaina exterior,
provocar o permitir que dicha matriz líquida se
fije; y
fijar la matriz a la vaina en la primera y la
segunda región de unión.
24. Procedimiento según la reivindicación 23, en
el que la vaina se acopla cooperativamente a la matriz en la
primera y la segunda región de unión, evitando dicho acoplamiento el
movimiento coaxial del núcleo relativo a la vaina.
25. Procedimiento según la reivindicación 23 o
la reivindicación 24, que comprende causar o permitir que las
células dentro de dicha matriz generen tensión mecánica entre la
primera y la segunda región de unión.
26. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 25, que comprende implantar dicha guía en un
cuerpo humano o animal.
27. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 26, en el que las células comprenden
fibroblastos y una o más células de dicho tejido.
28. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 27, en el que las células del tejido
comprenden fibroblastos y una o más células madres o células
progenitoras de células de dicho tejido.
29. Uso de una guía según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 21 en la fabricación de un medicamento para su
utilización en un procedimiento para reparación de tejido dañado que
comprende unir un primer y un segundo extremo de la guía a los
extremos rotos de un tejido dañado en un individuo, y permitir que
dicho tejido se regenere a través de dicha guía.
30. Uso según la reivindicación 29, en el que el
tejido dañado es un nervio.
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US20130345729A1 (en) * | 2012-06-22 | 2013-12-26 | Collagen Matrix, Inc. | Compression and kink resistant implants |
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Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
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US6057137A (en) * | 1994-10-06 | 2000-05-02 | Regents Of The University Of Minnesota | Tissue-equivalent rods containing aligned collagen fibrils and schwann cells |
US5948654A (en) * | 1996-08-28 | 1999-09-07 | Univ Minnesota | Magnetically oriented tissue-equivalent and biopolymer tubes comprising collagen |
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