PT1553980E - Ácido nucleico e proteína correspondente intitulada 238p1b2 útil no tratamento e detecção do cancro - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "ÁCIDO NUCLEICO E PROTEÍNA CORRESPONDENTE INTITULADA 238P1B2 ÚTIL NO TRATAMENTO E DETECÇÃO DO CANCRO"

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção descrita no presente documento refere-se a um gene e a sua proteína codificada, denominada 238P1B2, expressa em certos cancros, e a métodos de diagnóstico e terapêuticos e composições úteis na gestão de cancros que expressam 238P1B2.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 cancro é a segunda causa principal de morte em seres humanos a seguir à doença coronária. No mundo, milhões de pessoas morrem de cancro a cada ano. Somente nos Estados Unidos, como foi relatado pela American Câncer Society, o cancro causa a morte de bem mais de meio milhão de pessoas anualmente, com mais de 1,2 milhões de novos casos diagnosticados por ano. Enquanto as mortes por doença do coração têm diminuído significativamente, aquelas que são o resultado do cancro geralmente estão a subir. Prevê-se que no começo do próximo século, o cancro se tornará a causa principal de morte.

No mundo, diversos cancros distinguem-se como os principais causadores de morte. Em particular, carcinomas do pulmão, próstata, mama, cólon, pâncreas, e ovário representam a causa principal de morte por cancro. Estes e virtualmente todos os outros carcinomas compartem uma característica letal comum. Com muito poucas excepções, a doença metastática de um carcinoma é fatal. Além disso, mesmo para aqueles pacientes com cancro que inicialmente sobrevivem aos seus cancros primários, uma experiência comum tem mostrado que as suas vidas são dramaticamente 2 alteradas. Muitos pacientes com cancro padecem de ansiedade forte impulsionada pelo conhecimento do potencial para a recorrência ou fracasso do tratamento. Muitos pacientes com cancro padecem de debilitações físicas em seguida ao tratamento. Além disso, muitos pacientes com cancro sofrem uma recorrência.

No mundo, o cancro de próstata é o quarto cancro mais prevalente no homem. Na América do Norte e no norte da Europa, é de longe o cancro mais comum em homens e é a segunda causa principal de morte por cancro nos homens. Somente nos Estados Unidos, mais de 30.000 homens morrem anualmente desta doença - ultrapassado somente pelo cancro de pulmão. Apesar da magnitude destes números, não existe ainda um tratamento eficaz para o cancro metastático de próstata. Prostatectomia cirúrgica, terapêutica com radiação, terapêutica de ablação de hormonas, castração cirúrgica e quimioterapia continuam a ser as modalidades de tratamento principal. Infelizmente, estes tratamentos são ineficazes para muitos e são com frequência associados a consequências indesejáveis.

Na frente de diagnóstico, a falta de um marcador de tumor de próstata que possa detectar de maneira precisa tumores localizados em estágio precoce, permanece uma limitação significativa no diagnóstico e gestão desta doença. Embora o ensaio de antigénio específico para próstata no soro (PSA) tenha sido uma ferramenta muito útil, no entanto sua especificidade e utilidade geral são amplamente consideradas como deficientes em diversos aspectos importantes. 0 progresso na identificação de marcadores específicos adicionais para cancro de próstata tem sido melhorado pela geração de xenoenxertos de cancro de próstata que podem recapitular estágios diferentes da doença em ratinhos. Os xenoenxertos de LAPC (cancro de próstata de Los Angeles do inglês Los Angeles Prostate Câncer) são xenoenxertos de 3 cancro de próstata que têm sobrevivido à passagem em ratinhos com imunodeficiência combinada grave (SCID) e têm exibido a capacidade de mimetizar a transição de dependência de androgénio a independência de androgénio (Klein et ai., 1997, Nat. Med. 3:402). Marcadores de cancro de próstata mais recentemente identificados incluem PCTA-1 (Su et ai., 1996, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 7252), antigénio de membrana especifico da próstata (PSM) (Pinto et ai., Clin Câncer Res 1996 Sep 2 (9): 1445-51), STEAP (Hubert, et ai., Proc Natl Acad Sei USA. 7 de Dezembro de 1999; 96(25): 14523-8) e antigénio de célula estaminal de próstata (PSCA) (Reiter et ai., 1998, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95: 1735).

Enquanto marcadores anteriormente identificados tais como PSA, PSM, PCTA e PSCA têm promovido esforços para diagnosticar e tratar cancro de próstata, existe a necessidade de identificar marcadores adicionais e alvos terapêuticos para o cancro de próstata e cancros relacionados com a finalidade de melhorar adicionalmente o diagnóstico e a terapêutica.

Carcinoma de célula renal (RCC) é responsável por aproximadamente 3 por cento de malignidades em adultos. Quando os adenomas alcançam um diâmetro de 2 a 3 cm, existe potencial de malignidade. No adulto, os dois principais tumores renais malignos são adenocarcinoma de célula renal e carcinoma de célula transicional da pélvis renal ou uréter. A incidência de adenocarcinoma de célula renal é estimada em mais de 29.000 casos nos Estados Unidos, e mais de 11.600 pacientes morreram desta doença em 1998. O carcinoma de célula transicional é menos frequente, com uma incidência de aproximadamente 500 casos por ano nos Estados Unidos. A cirurgia tem sido a terapêutica primária para adenocarcinoma de célula renal durante muitas décadas. Até recentemente, a doença metastática tem sido refractária a 4 qualquer terapêutica sistémica. Com desenvolvimentos recentes em terapêuticas sistémicas, particularmente imunoterapêuticas, carcinoma de célula renal metastático pode ser abordado agressivamente em pacientes apropriados com uma possibilidade de respostas duráveis. Apesar disso, permanece uma necessidade de terapêuticas eficazes para estes pacientes.

De todos os casos novos de cancro nos Estados Unidos, o cancro de bexiga representa aproximadamente 5 por cento em homens (quinto neoplasma mais comum) e 3 por cento em mulheres (oitavo neoplasma mais comum). A incidência está a aumentar lentamente, concomitante com um envelhecimento da população. Em 1998, 54.500 casos foram estimados, incluindo 39.500 em homens e 15.000 em mulheres. A incidência ajustada à idade nos Estados Unidos é 32 por 100.000 para os homens e 8 por 100.000 em mulheres. A razão histórica homens/mulheres de 3:1 pode estar a diminuir com relação a padrões de tabagismo em mulheres. 11.000 mortes por cancro de bexiga foram estimados em 1998 (7.800 em homens e 3.900 em mulheres). A incidência de cancro de bexiga e mortalidade aumentam fortemente com a idade e será um problema crescente quando a população se torne mais velha. A maioria dos cancros de bexiga reocorre na bexiga. O cancro de bexiga é tratado com uma combinação de ressecção transuretral da bexiga (TUR) e quimioterapêutica ou imunoterapêutica intravesical. A natureza multifocal e recorrente do cancro de bexiga indica as limitações de TUR. A maioria dos cancros invasivos de músculos não são curados apenas por TUR. A cistectomia radical e desvio urinário é o meio mais eficaz para eliminar o cancro, mas porta um impacto inegável na diversão urinária e sexual. Continua a existir uma significativa necessidade para modalidades de tratamento que são benéficas para pacientes com cancro de bexiga.

Uma estimativa de 130.200 casos de cancro colorrectal 5 ocorreu em 2000 nos Estados Unidos, incluindo 93.800 casos de cancro de cólon e 36.400 de cancro rectal. Cancros colorrectais são a terceira causa mais comum de cancros em homens e mulheres. As taxas de incidência diminuíram significativamente durante 1992-1996 (-2,1% por ano). Investigações sugerem que estes declínios foram devido a um aumento do rastreio e remoção de pólipos, que previnem a progressão de pólipos para cancros invasivos. Estima-se em 56.300 mortes (47.700 de cancro de cólon, 8.600 de cancro rectal) em 2000, contribuindo para aproximadamente 11% de todas as mortes por cancro nos E.U.A..

Actualmente, a cirurgia é a forma mais comum de terapêutica para cancro colorrectal, e para cancros que não se espalharam, é com frequência curativa. Quimioterapica ou quimioterapca com radiação é administrada antes ou depois da cirurgia à maioria dos pacientes cujos cancros perfuraram profundamente a parede do intestino ou espalharam-se para os gânglios linfáticos. Uma colostomia permanente (a criação de uma abertura abdominal para a eliminação de resíduos do corpo) é ocasionalmente necessária para cancro de cólon e não é com frequência requerido para cancro rectal. Continua a existir uma necessidade para diagnóstico eficaz e modalidades de tratamento para cancro colorrectal.

Estima-se em 164.100 os novos casos de cancro de pulmão e de brônquio em 2000, contribuindo para 14% da totalidade de diagnósticos de cancro nos E.U.A. A taxa de incidência de cancro de pulmão e de brônquio está a diminuir significativamente em homens, de um máximo de 86,5 por 100,000 em 1984 para 70,0 em 1996. Nos anos 90 no séc. XX, a taxa de aumento entre mulheres começou a diminuir. Em 1996, a taxa de incidência em mulheres foi 42,3 por 100,000.

Estima-se que o cancro de pulmão e de brônquio causou 156.900 mortes em 2000, contribuindo para 28% de todas as 6 mortes por cancro. Durante 1992-1996, a mortalidade de cancro de pulmão diminuiu significativamente entre homens (-1,7% por ano) enquanto taxas para mulheres foram ainda significativamente crescentes (0,9% por ano). Desde 1987, mais mulheres morreram cada ano de cancro de pulmão que cancro de mama, que foi, durante mais de 40 anos, a principal causa de morte por cancro em mulheres. A diminuição de incidência de cancro de pulmão e taxas mortalidade resultou muito provavelmente da diminuição das taxas de tabagismo nos 30 anos anteriores; no entanto, os padrões de diminuição de tabagismo são mais lentos entre mulheres que homens. É preocupante que embora o declínio do hábito de fumar em adultos tenha diminuído, a utilização de tabaco entre jovens está a aumentar de novo.

Opções de tratamento para cancro de pulmão e de brônquio são determinadas pelo tipo e estágio do cancro e incluem cirurgia, terapêutica com radiação, e quimioterapica. Para muitos cancros localizados, cirurgia é usualmente o tratamento de escolha. Uma vez que usualmente quando a doença é descoberta já está espalhada, a terapêutica com radiação e quimioterapia são com frequência necessárias em combinação com cirurgia. Apenas quimioterapia ou esta combinada com radiação é o tratamento de escolha para cancro de pulmão de pequenas células; neste regime, uma grande percentagem de pacientes apresenta remissão, que em alguns casos é de longa duração. Existe, no entanto, uma necessidade contínua para abordagens de tratamento e diagnóstico eficazes para cancro de pulmão e de brônquios.

Segundo estimativas, pensa-se que ocorreram 182.800 novos casos invasivos de cancro de mama em mulheres nos Estados Unidos durante 2000. Adicionalmente, pensa-se que aproximadamente 1.400 novos casos de cancro de mama foram diagnosticados em homens em 2000. Após aumentar aproximadamente 4% por ano nos anos 80, taxas de incidência 7 de cancro de mama em mulheres têm estabilizado nos anos 90 em aproximadamente 110,6 casos por 100.000.

Somente nos E.U.A, estima-se que ocorreram 41.200 mortes (40.800 mulheres, 400 homens) em 2000 devido a cancro de mama. Cancro de mama está em segundo lugar entre mortes por cancro em mulheres. De acordo com os dados mais recentes, as taxas de mortalidade declinaram significativamente durante 1992-1996 com as maiores diminuições nas mulheres mais jovens, tanto brancas como negras. Estas diminuições foram provavelmente o resultado da detecção precoce e tratamento melhorado.

Levando em consideração as circunstâncias médicas e as preferências do paciente, o tratamento de cancro de mama pode envolver lumpectomia (retirada local do tumor) e retirada dos gânglios linfáticos sob o braço; mastectomia (retirada cirúrgica da mama) e retirada dos gânglios linfáticos sob o braço; terapêutica com radiação; quimioterapia; ou terapêutica hormonal. Com frequência, dois ou mais métodos são utilizados em combinação. Numerosos estudos têm mostrado que, para doença em estágio inicial, taxas de sobrevivência de longa duração após lumpectomia mais radioterapia são similares a taxas de sobrevivência após mastectomia radical modificada. Avanços significativos em técnicas de reconstrução proporcionam diversas opções para reconstrução de mama após a mastectomia. Recentemente, tal reconstrução tem sido feita ao mesmo tempo que a mastectomia. A excisão local de carcinoma ductal in situ (DCIS) com quantidades adequadas de tecido de mama normal circundante pode prevenir a recorrência local de DCIS. Radiação à mama e/ou tamoxifeno pode reduzir a probabilidade de DCIS ocorrer no tecido de mama restante. Isto é importante porque caso o DCIS não for tratado, pode-se desenvolver em cancro de mama invasivo. Apesar disso, existem sérios efeitos secundários ou sequelas a estes tratamentos. 8

Existe, portanto, uma necessidade de tratamentos eficazes para o cancro de mama.

Estima-se em 23,100 os novos casos de cancro de ovário nos Estados Unidos em 2000. 0 mesmo é responsável por 4% de todos cancros entre mulheres e ocupa a segunda posição entre os cancros ginecológicos. Durante 1992-1996, as taxas de incidência de cancro de ovário estavam significativamente a declinar. Como consequência do cancro de ovário, estima-se a ocorrência de 14.000 mortes em 2000. O cancro de ovário causa mais mortes que qualquer outro cancro do sistema reprodutivo feminino.

Cirurgia, terapêutica com radiação, e quimioterapia são opções de tratamento para o cancro de ovário. A cirurgia usualmente inclui a retirada de um ou ambos os ovários, As trompas de Falópio (salpingo-ooforectomia), e o útero (histerectomia). Em alguns tumores muito iniciais, somente o ovário envolvido será removido, especialmente em mulheres jovens que desejam ter filhos. Em doença avançada, é feita uma tentativa de retirar toda a doença intra-abdominal para potenciar o efeito de quimioterapia. Continua a existir uma importante necessidade para opções eficazes de tratamento para cancro de ovário.

Estimam-se em 28.300 os novos casos de cancro pancreático nos Estados Unidos em 2000. Nos últimos 20 anos, as taxas de cancro pancreático têm diminuído em homens. As taxas entre as mulheres têm permanecido aproximadamente constantes, mas pode estar a começar a diminuir. Estima-se em 28.200 o número de mortes causado pelo cancro pancreático em 2000 nos Estados Unidos. Nos últimos 20 anos, tem havido uma diminuição ligeira, mas significativa, nas taxas de mortalidade entre homens (aproximadamente -0,9% por ano), enquanto as taxas têm aumentado ligeiramente entre mulheres.

Cirurgia, terapêutica com radiação, e quimioterapica são opções de tratamento para cancro pancreático. Estas 9 opções de tratamento podem prolongar a sobrevivência e/ou aliviar os sintomas em muitos pacientes, mas não é provável que produzam uma cura para a maioria dos doentes. Existe uma necessidade significativa de opções adicionais de terapêutica e diagnóstico para o cancro pancreático. 0 documento WOOl/27158 revela um número de polipéptidos de receptor olfactivo humano e polinucleótidos que os codificam. 0 documento WO02/16548 e o documento EP-A-1270724, publicados em 2 de Janeiro de 2003, revelam proteínas de receptor acoplado a proteína G e polinucleótidos que as codificam. Nenhuma ligação é feita entre quaisquer destas proteínas e a sua expressão em tecido tumoral.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um gene, denominado 238P1B2, que se descobriu agora é sobre-expresso no(s) cancro(s) listado(s) no Quadro 1. A análise de expressão com Northern blot de expressão do gene 238P1B2 em tecidos normais mostra um padrão de expressão restrito em tecidos adultos. As sequências de nucleótido (Figura 2) e aminoácido (Figura 2, e Figura 3) de 238P1B2 são proporcionadas. O perfil relacionado com os tecidos de 238P1B2 em tecidos adultos normais, combinado com a sobre-expressão observada nos tumores listados no Quadro I, mostra que 238P1B2 é sobre-expressa aberrantemente em pelo menos alguns cancros, e assim serve como um alvo para diagnóstico, profiláctica, prognóstico, e/ou terapêutica útil para cancros do(s) tecido(s) tais como aqueles listados no Quadro I.

De acordo com a presente invenção, proporciona-se um método para detectar a presença de cancro de próstata numa amostra de teste, cujo método compreende colocar em contacto a amostra com uma sonda que se liga especificamente a um polinucleótido da Figura 2B (SEQ ID 10 NO: 8872); e detectar a ligação do polinucleótido a essa amostra.

Descrevem-se polinucleótidos correspondentes ou complementares a todos ou parte dos genes de 238P1B2, ARNm, e/ou sequências codificantes, preferentemente na forma isolada, incluindo polinucleótidos que codificam proteínas relacionadas com 238P1B2 e fragmentos de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ou mais de 25 aminoácidos contíguos; pelo menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100 ou mais de 100 aminoácidos contíguos de uma proteína relacionada com 238P1B2, bem como os próprios péptidos/proteínas; ADN, ARN, híbridos de ADN/ARN, e moléculas relacionadas, polinucleótidos ou oligonucleótidos complementares ou que têm pelo menos uma homologia de 90 % aos genes de 238P1B2 ou sequências de ARNm ou partes das mesmas, e polinucleótidos ou oligonucleótidos que hibridam com os genes de 238P1B2, ARNm, ou com polinucleótidos que codificam 238P1B2. Também se descrevem meios para isolar ADNc e os genes que codificam 238P1B2. Moléculas de ADN recombinante que contêm polinucleótidos de 238P1B2, células transformadas ou transduzidas com tais moléculas, e sistemas de hospedeiro-vector para a expressão de produtos de gene de 238P1B2 são também descritos. Pode haver uma condição de que a sequência de ácidos nucleicos inteira da Figura 2 não seja codificada e/ou a sequência de aminoácidos inteira da Figura 2 não seja preparada. A sequência de ácidos nucleicos inteira da Figura 2 pode ser codificada e/ou a sequência de aminoácidos inteira da Figura 2 pode ser preparada, qualquer uma das quais é em respectivas formas farmacêuticas unitárias humanas. A invenção proporciona métodos para detectar a presença e status de polinucleótidos de 238P1B2 em várias amostras biológicas, bem como métodos para identificar células que expressam 238P1B2. Uma forma de realização 11 típica desta invenção proporciona métodos para monitorizar produtos de gene de 238P1B2 numa amostra de tecido ou de hematologia que tem ou se suspeita que tenha alguma forma de desregulação do crescimento tal como cancro.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. A sequência de 238P1B2 SSH de 210 nucleótidos. Figura 2. A sequência de ADNc e aminoácido de 238P1B2 variante IA é mostrada na Figura 2A. A metionina de iniciação está sublinhada. A grelha de leitura aberta estende-se desde os ácidos nucleicos 2133 até 2897 incluindo o codão de terminação. A sequência de ácido nucleico e aminoácido de 238P1B2 variante 1B é mostrada na Figura 2B, o codão para a metionina de iniciação está sublinhada. A grelha de leitura aberta estende-se desde o ácido nucleico 1947 até 2897 incluindo o codão de terminação. A sequência de ácido nucleico e aminoácido de 238P1B2 variante 2 é mostrada na Figura 2C, o codão para a metionina de iniciação está sublinhada. A grelha de leitura aberta estende-se desde o ácido nucleico 2133 até 2897 incluindo o codão de terminação. A sequência de ácido nucleico e aminoácido de 238P1B2 variante 3 é mostrada na Figura 2D, o codão para a metionina de iniciação está sublinhada. A grelha de leitura aberta estende-se desde o ácido nucleico 2133 até 2897 incluindo o codão de terminação. A sequência de ácido nucleico e aminoácido de 238P1B2 variante 4 é mostrada na Figura 2E, o codão para a metionina de iniciação está sublinhada. A grelha de leitura aberta estende-se desde o ácido nucleico 2133 até 2897 incluindo o codão de terminação. A sequência de ácido nucleico e aminoácido de 238P1B2 variante 5 é mostrada na Figura 2F, o codão para a metionina de iniciação está sublinhada. A grelha de leitura aberta estende-se desde o ácido nucleico 2133 até 2897 incluindo o codão de 12 terminação. A sequência de ácido nucleico e aminoácido de 238P1B2 variante 6 é mostrada na Figura 2G, o codão para a metionina de iniciação está sublinhada. A grelha de leitura aberta estende-se desde o ácido nucleico 2133 até 2897 incluindo o codão de terminação.

Figura 3. Sequência de aminoácidos de 238P1B2 variante IA é mostrada na Figura 3A; tem 254 aminoácidos. A sequência de aminoácidos de 238P1B2 variante 1B é mostrada na Figura 3B; tem 316 aminoácidos. A sequência de aminoácidos de 238P1B2 variante 2 é mostrada na Figura 3C; tem 254 aminoácidos. Figura 4. A. Alinhamento de sequência de ácido nucleico de 238P1B2 variante 1 com receptor olfactivo de ratinho M0R14-1. B. Alinhamento de sequência de ácido nucleico de 238P1B2 variante 1 com receptor olfactivo de ratinho MOR14-10. C. Sequência de aminoácidos alinhamento de 238P1B2 v.lA com receptor olfactivo de ratinho M0R14-1. D. Sequência de aminoácidos alinhamento de 238P1B2 v.lA com próstata specific 0PCRPH0R-1. E. Sequência de aminoácidos alinhamento de 238P1B2 variante 1 com receptor olfactivo humano 5112. F. Alinhamento usando o alogaritmo Clustal das sequências de aminoácidos das três variantes de 238P1B2, o que representa que 238P1B2 V1B contém um aa 62 adicional no seu terminal N em relação a VIA, e que 238P1B2 V2 carrega uma mutação pontual de I para T no aa 225 em relação a VIA. Figura 5. Perfil de hidrofilicidade de aminoácido A) 238P1B2 e B) 238P1B2 varlA determinado pela análise de sequência de algoritmo de computador utilizando o método de Hopp e Woods (Ηορρ T.P., Woods K.R, 1981. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78:3824-3828) acedido na página web de Protscale (wwwexpasy.ch/cqibin/protscale.pl) através do servidor de biologia molecular ExPasy.

Figura 6 . Perfil de hidropaticidade de aminoácido de A) 238P1B2 e B) 238P1B2 varlA determinado pela análise de sequência de algoritmo de computador utilizando o método de Kyte e Doolittle (Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. 13

Biol. 157:105-132) acedido na página web de Protscale (www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) através do servidor de biologia molecular ExPasy.

Figura 7. Percentagem de perfil de resíduos de aminoácidos acessíveis de A) 238P1B2 e B) 238P1B2 varlA determinado pela análise de sequência de algoritmo de computador utilizando o método de Janin (Janin J., 1979 Nature 277:491-492) acedido na página web de Protscale (www♦expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl) através do servidor de biologia molecular ExPasy.

Figura 8. Perfil de flexibilidade de aminoácidos médio de A) 238P1B2 e B) 238P1B2 varlA determinado pela análise de sequência de algoritmo de computador utilizando o método de Bhaskaran e Ponnuswamy (Bhaskaran R., e Ponnuswamy P.K., 1988. Int. J. Pept. Protein Res. 32:242-255) acedido na página web de Protscale (www.expasy.ch/cgi-bin/ protscale.pl) através do servidor de biologia molecular ExPasy.

Figura 9. Perfil de aminoácidos da folha beta de A) 238P1B2 e B) 238P1B2 varlA determinado pela análise de sequência de algoritmo de computador utilizando o método de Deleage e Roux (Deleage, G., Roux B. 1987 Protein Engineering 1: 289-29 4) acedido na página web de Protscale (www.expasy.cb/cgi-bln/protscale.pl) através do servidor de biologia molecular ExPasy.

Figura 10. Visualização esquemática de variantes nucleotídicas de 238P1B2. Variante 238P1B2 v.2 através de 238P1B2 v.6 são variantes com variações nucleotídicas únicas. Caixa negra mostra a mesma sequência como 238P1B2 v.l. Números correspondem a aqueles de 238P1B2 v.l. SNPs são indicados acima da caixa.

Figura 11. Visualização esquemática de variantes proteicas de 238P1B2. Variante nucleotídica de 238P1B2 v.l na Figura 10 codifica variantes proteicas 238P1B2 v.lA e v.lB. Variante nucleotídica de 238P1B2 v.2 na Figura 10 codifica 14 a variante proteica de 238P1B2 v.2. Caixa negra mostra a mesma sequência como 238P1B2 v.l. Números em "()" logo abaixo da caixa correspondem a aqueles de 238P1B2 v.lA. Diferenças de aminoácidos únicos são indicados acima da caixa.

Figura 12. A, B. Predição de estrutura secundária para 238P1B2 variante la e variante lb. As estruturas secundárias de 238P1B2 variante la (A) e de variante lb (B) proteínas foram preditas utilizando o método HNN Hierarchical Neural Network (Rede Neural Hierárquica) (Guermeur, 1997, na World Wide Web URL pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=npsa_nn.html), acedido desde o servidor de biologia molecular ExPasy (na World Wide Web URL www. e xp asy. ch,/1 o o 1 s / ) . Este método prediz a presença e localização de alfa hélices, cadeias estendidas, e espirais aleatórias da sequência de proteína primária. A percentagem da proteína numa dada estrutura secundária é também listada para cada variante. C, D, E, F. Predição de domínios transmembranares para 238P1B2 variante la e lb. C, E. Representações esquemáticas da probabilidade de existência de regiões transmembranares e orientação de 238P1B2 variante la (C) e variante lb (E) com base no algoritmo TMpred de Hofmann e Stoffel que utiliza TMBASE (K. Hofmann, W. Stoffel. TMBASE - Uma base de dados de segmentos de proteína de extensão de membrana Biol. Chem. Hoppe-Seiler 374:166, 1993). D, F. Representação esquemática da probabilidade da existência de regiões transmembranares e a orientação extracelular e intracelular de 238P1B2 variante la (D) e variante lb (F) com base no algoritmo TMHMM de Sonnhammer, von Heijne, e Krogh (Erik L.L. Sonnhammer, Gunnar von Heijne, e Anders Krogh: A hidden Markov model for predicting transmembrane helices in protein sequences. Em Proc. of Sixth Int. Conf. on Intelligent Systems for Molecular Biology, p 175-182 Ed J. Glasgow, T. Littlejohn, F. Major, R. Lathrop, D. Sankoff, e 15 C. Sensen Menlo Park, CA: AAAI Press, 1998). Os algoritmos TMpred e TMHMM são acedidos desde o servidor de biologia molecular ExPasy (na World Wide Web URL www.expasy.ch/tools/) . Os resultados dos programas de predição de domínios transmembranares apresentados representam 238P1B2 variante la como a mais provável de conter 6 domínios transmembranares e variante 1 b 7 domínios transmembranares.

Figura 13: Topologia provável e estrutura de variantes de 238P1B2 I e 1B.

Figura 14. Expressão de 238P1B2 por meio de RT-PCR. ADNc de primeira cadeia foi preparado a partir do agrupamento vital 1 (fígado, pulmão e rim), agrupamento vital 2 (pâncreas, cólon e estômago), e agrupamento de cancro de próstata. A normalização foi realizada por meio de PCR utilizando iniciadores para actina e GAPDH. PCR semi-quantitativa, utilizando iniciadores para 238P1B2, foi realizada a 26 e 30 ciclos de amplificação. Os resultados mostram forte expressão de 238P1B2 em agrupamento de cancro de próstata, mas não no agrupamento vital I e agrupamento vital 2.

Figura 15. Expressão de 238P1B2 em tecidos normais. Dois northern blots de múltiplos tecidos (Clontech) ambos com 2 pg de ARNm/pista foram sondados com o fragmento SSH de 238P1B2. Padrões de tamanho em kilobases (kb) são indicados no lado. Os resultados mostram ausência de expressão de 238P1B2 em todos os 16 tecidos normais testados.

Figura 16. Expressão de 238P1B2 em múltiplos Tecidos normais. Um dot blot de ARNm que contém 76 amostras diferentes de tecidos humanos foi analisado utilizando uma sonda de SSH de 238P1B2. A expressão foi somente detectada em placenta.

Figura 17. Expressão de 238P1B2 em Espécimes de Cancro de paciente humano e Tecidos normais. ARN foi extraído de um agrupamento de três espécimes de paciente com cancro de próstata, bem como de próstata normal (NP), bexiga normal 16 (NB) , rim normal (NK), cólon normal (NC), pulmão normal (NL), mama normal (NBr), e ovário normal (NO. Northern blot com 10 pg de ARN total/pista foi sondado com sequência de 238P1B2 SSH. Padrões de tamanho em kilobases (kb) são indicados no lado. Os resultados mostram expressão de 238P1B2 no agrupamento de cancro de próstata e ovário normal.

Figura 18. Expressão de 238P1B2 em tecidos de paciente com cancro de próstata. 0 ARN foi extraído de próstata normal (N) , xenoenxertos de cancro de próstata (LAPC-4AD, LAPC-4AI, LAPC-9AD, LAPC-9A1), linhas de células de cancro de próstata (LNCaP e PC3), e tumores de pacientes com cancro de próstata (T) . Northern blots com 10 ug de ARN total foram sondados com o fragmento SSH de 238P1B2. Padrões de tamanho em kilobases estão no lado. Os resultados mostram forte expressão de 238P1B2 em tecidos de tumor de próstata. 0 painel inferior representa a coloração com brometo de etídio do gel. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Plano de Secções I. ) Definições II) polinucleótidos de 238P1B2 II. A.) Utilizações de polinucleótidos de 238P1B2 II.A.1.) Monitorização de Anormalidade genéticas II. A.2.) Antisenso II. A.3.) Iniciadores e Pares de iniciadores II. A.4.) Isolamento de moléculas de ácido nucleico que codificam 238P1B2 II. A.5.) Moléculas de ácido nucleico recombinantes e Sistemas de hospedeiro-vector III. ) proteínas relacionadas com 238P1B2 III.A.) Proteínas que portam motivo III.B.) Expressão de proteínas relacionadas com 238P1B2 III.C.) Modificações de proteínas relacionadas com 238P1B2 17 III. D.) Utilizações de proteínas relacionadas com 238P1B2 IV. ) Métodos para a detecção de 238P1B2 V. ) Métodos para monitorizar o Status de genes relacionados com 238P1B2 e Seus Produtos VI. ) Identificação de Moléculas Que Interagem Com 238P1B2 VII. ) Métodos de Diagnóstico e Prognóstico.

VIII. ) KITS I. ) Definições: A menos que seja definido de outra forma, todos os termos do estado da técnica, notações e outros termos científicos ou terminologia utilizada no presente documento têm a intenção de ter os significados comummente entendidos pelos peritos na especialidade à qual esta invenção pertence. Em alguns casos, termos com significados comummente entendidos são definidos no presente documento para clareza e/ou para pronta referência, e a inclusão de tais definições no presente documento não deve

necessariamente ser interpretada como que representa uma diferença substancial sobre o que é geralmente entendido na técnica. Muitas das técnicas e procedimentos descritos ou referenciados no presente documento são bem entendidos e comummente utilizados usando metodologia convencional pelos peritos na especialidade, tal como, por exemplo, as metodologias de clonagem molecular amplamente utilizadas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A

Laboratory Manual 2a edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. I. Como for apropriado, procedimentos que envolvem o uso de kits e reagentes comercialmente disponíveis são geralmente levados a cabo de acordo com protocolos e/ou parâmetros definidos pelo fabricante a não ser que de outro modo indicado.

Os termos "cancro de próstata avançado", "cancro de próstata localmente avançado", "doença avançada" e "doença localmente avançada" significam cancros de próstata que se estenderam através da cápsula da próstata, e são destinados 18 a incluir doença em estágio C sob o sistema da Associação Urológica Americana (do inglês American Urological Association - AUA), doença em estágio C1-C2 sob o sistema Whitmore- Jewett, e doença em estágio T3-T4 e N+ sob o sistema TNM (tumor, gânglio, metástase). Em geral, cirurgia não é recomendada para pacientes com doença localmente avançada, e estes pacientes têm resultados substancialmente menos favoráveis em comparação com pacientes que tem cancro de próstata clinicamente localizado (confinado em órgão). Doença localmente avançada é clinicamente identificada pela evidência palpável de induração além do limite lateral da próstata, ou assimetria ou induração acima da base da próstata.

Cancro de próstata localmente avançado é presentemente diagnosticado patologicamente em seguida a prostatectomia radical se o tumor invadir ou penetrar a cápsula prostática, se estenderá na margem cirúrgica, ou invadirá as vesículas seminais. "Alterar o padrão de glicosilação nativo" destina-se para os propósitos no presente documento a significar deletar uma ou mais fracções de hidratos de carbono encontradas na sequência nativa 238P1B2 (por meio da remoção do local de glicosilação subjacente ou por meio da deleção da glicosilação por meios químicos e/ou enzimáticos), e/ou adicionar um ou mais locais de glicosilação que não estão presentes na sequência nativa 238P1B2. Além disso, a frase inclui mudanças qualitativas na glicosilação das proteínas nativas, que envolvem uma mudança na natureza e proporções das várias fracções de hidratos de carbono presentes. 0 termo "análogo" refere-se a uma molécula que é similar estruturalmente ou partilha atributos similares ou correspondentes com outra molécula (por exemplo, uma proteína relacionada com 238P1B2). Por exemplo um análogo de uma proteína 238P1B2 pode ser especificamente ligado por 19 um anticorpo ou célula T que se liga especif icamente a 238P1B2. 0 termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais amplo. Portanto um "anticorpo" pode ser de ocorrência natural ou feito pelo homem tais como anticorpos monoclonais produzidos por tecnologia de hibridoma convencional. Anticorpos anti-238PlB2 compreendem anticorpos monoclonais e policlonais bem como fragmentos que contêm o domínio de ligação a antigénio e/ou uma ou mais regiões de determinação de complementaridade destes anticorpos.

Um "fragmento de anticorpo" é definido como pelo menos uma porção da região variável da molécula de imunogloblina que se liga ao seu alvo, isto é, a região de ligação a antigénio. Pode cobrir especificamente anticorpos anti-238P1B2 únicos e clones dos mesmos (incluindo anticorpos agonistas, antagonistas e neutralizantes) e composições de anticorpo anti-238PlB2 com especificidade poliepitópica. 0 termo "sequências optimizadas para codão" refere-se a sequências de nucleótidos que foram optimizadas para uma espécie de hospedeiro particular por meio da substituição de quaisquer codões que tem uma frequência de utilização de menos de aproximadamente 20 %. Sequências de nucleótidos que foram optimizadas para a expressão numa dada espécie de hospedeiro por meio da eliminação de sequências de poliadenilação espúrias, eliminação de sinais splicing de exão/intrão, eliminação de repetições do tipo transposão e/ou optimização de conteúdo de GC além de optimização de codão são denominadas no presente documento como umas "sequências de melhora de expressão". O termo "agente citotóxico" refere-se a uma substância que inibe ou previne a actividade de expressão de células, função de células e/ou causa destruição de células. O termo destinado a incluir isótopos radioactivos agentes quimioterapêuticos, e toxinas tais como toxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente activas de 20 origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes dos mesmos. Os exemplos de agentes citotóxicos incluem, mas não são limitados a maytansinóides, itrio, bismuto, ricina, cadeia-A de ricina, doxorubicina, daunorubicina, taxol, brometo de etidio, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, dihidroxi antracina diona, actinomicina, toxina da difteria, exotoxina da Pseudomonas (PE) A, PE40, abrina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, gelonina, mitogelina, retstrictocina, fenomicina, enomicina, curicina, crotina, calicheamicina, inibidor de Sapaonaría offícínalis, e glucocorticóide e outros agentes quimioterapêuticos, bem como radioisótopos tais como At211, I131, I125, Y90, Re186, r188, g153f Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu. Os anticorpos podem também ser conjugados a uma enzima de activação de pró-fármaco anti-cancro capaz de converter o pró-fármaco à sua forma activa. 0 termo "homólogo" refere-se a uma molécula que exibe homologia a outra molécula, por meio de, por exemplo, que tem sequências de resíduos químicos que são as mesmas ou similares em posições correspondentes. "Antigénio Leucocitário Humano" ou "HLA" é uma proteína do Complexo Principal de Histocompatibilidade humano de classe I ou classe II (MHC) (veja-se, por exemplo, Stites, et al., IMMUNOLOGY, 8a ED., Lange Publishing, Los Altos, CA (1994).

Os termos "hibridam", "hibridar", "híbrida" e similares, utilizados no contexto de polinucleótidos, são destinados a referirem-se a condições de hibridação convencionais, preferentemente tais como hibridação em 50 % de formamida/6XSSC/0,1 % de SDS/ 100 pg/ml de ssDNA, em que temperaturas para hibridação são acima 37 graus C e temperaturas para lavar em 0,1XSSC/0,1 % de SDS são acima 55 graus C. 21

As frases "isolado" ou "biologicamente puro" referem-se a material que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham o material como é encontrado no seu estado nativo. Assim, péptidos isolados descritos no presente documento preferentemente não contêm materiais normalmente associados aos péptidos em seu ambiente in situ. Por exemplo, um polinucleótido é dito que é "isolado" quando é substancialmente separado de polinucleótidos contaminantes que correspondem ou são complementares a genes diferentes dos genes de 238P1B2 ou que codificam polipéptidos diferentes de produto génico de 238P1B2 ou fragmentos do mesmo. Um perito na especialidade pode prontamente utilizar procedimentos de isolamento de ácido nucleico para obter um polinucleótido de 238P1B2 isolado.

Uma proteína é dita que é "isolada", por exemplo, quando métodos físicos, mecânicos ou químicos são utilizados para retirar as proteínas 238P1B2 dos constituintes celulares que são normalmente associados à proteína. Um perito na especialidade pode prontamente utilizar métodos de purificação padrão para obter uma proteína 238P1B2 isolada. Alternativamente, uma proteína isolada pode ser preparada por meios químicos. 0 termo "mamífero" refere-se a qualquer organismo classificado como um mamífero, incluindo ratinhos, ratos, coelhos, cães, gatos, vacas, cavalos e seres humanos. 0 mamífero pode ser um ratinho. 0 mamífero pode ser um ser humano.

Os termos "cancro metastático de próstata" e "doença metastática" significam cancros de próstata que se espalharam a gânglios linfáticos regionais ou a locais distantes, e são destinados a incluir doença em estágio D sob o sistema AUA e estágio TxNxM+ sob o sistema TNM. Como é o caso com cancro de próstata localmente avançado, cirurgia geralmente não é indicada para pacientes com 22 doença metastática, e terapêutica hormonal (ablação de androgénio) é uma modalidade de tratamento preferida. Pacientes com cancro metastático de próstata eventualmente desenvolvem um estado refractário a androgénio dentro de 12 a 18 meses de inicio do tratamento. Aproximadamente a metade destes pacientes refractários a androgénio morrem dentro de 6 meses após desenvolver este status. 0 local mais comum para metástase de cancro de próstata é o osso. Metástases ósseas de cancro de próstata são com frequência osteoblásticos ao invés de osteoliticos (isto é, que resultam em formação óssea liquida). Metástases ósseas são encontradas a maioria com frequência na coluna vertebral, seguido pelo fémur, pélvis, caixa torácica, crânio e úmero. Outros locais comuns para metástase incluem gânglios linfáticos, pulmão, figado e cérebro. Cancro metastático de próstata é tipicamente diagnosticado por meio de linfadenectomia de pélvis aberta ou por laparoscopia, exames de radionúclido de corpo completo, radiografia do esqueleto, e/ou biópsia de lesão óssea. 0 termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, isto é, os anticorpos que compreendem a população são idênticos excepto pelas possíveis de mutações de ocorrência natural que estão presentes em quantidades menores.

Um "motivo', como em motivo biológico de uma proteína relacionada com 238P1B2, refere-se a qualquer padrão de aminoácidos que forma parte da sequência primária de uma proteína, que é associada a um função particular (por exemplo, interacção proteína-proteína, interacção proteína-ADN, etc) ou modificação (por exemplo, que é fosforilada, glicosilada ou amidada), ou localização (por exemplo, sequência secretora, sequência de localização nuclear, etc.) ou uma sequência que é correlacionada com ser imunogénica, humoral ou celular. Um motivo pode ser 23 contíguo ou capaz de ser alinhado a certas posições que são geralmente correlacionadas com uma certa função ou propriedade. No contexto de motivos HLA, "motivo" refere-se ao padrão de resíduos num péptido de comprimento definido, usualmente um péptido de desde aproximadamente 8 até aproximadamente 13 aminoácidos para um motivo HLA de classe I e desde aproximadamente 6 até aproximadamente 25 aminoácidos para um motivo HLA de classe II, que é reconhecido por uma molécula de HLA particular. Motivos de péptido para ligação a HLA são tipicamente diferentes para cada proteína codificada para cada alelo de HLA humano e diferem no padrão dos resíduos de âncora primários e secundários.

Um "excipiente farmacêutico" compreende um material tal como um adjuvante, um portador, agentes de tamponamento e ajuste de pH, agentes de ajuste de tonicidade, agentes humectantes, conservante, e similares. "Farmaceuticamente aceitável" refere-se a uma composição não tóxica, inerte, e/ou que é fisiologicamente compatível com seres humanos ou outros mamíferos. 0 termo "polinucleótido" significa uma forma polimérica de nucleótidos de pelo menos 10 bases ou pares de base de comprimento, ribonucleótidos ou deoxinucleótidos ou uma forma modificada de tipo de nucleótido, e significa que inclui formas de ADN e/ou ARN de cadeia simples e dupla. No estado da técnica, este termo é utilizado com frequência de maneira intercambiável com "oligonucleótido". Um polinucleótido pode compreender uma sequência de nucleótido revelada no presente documento em que timina (T) , como mostrado, por exemplo, na Figura 2, pode também ser uracil (U); esta definição pertence às diferenças entre as estruturas químicas de ADN e ARN, em particular a observação de que uma das quatro bases principais em ARN é uracil (U) ao invés de timina (T). O termo "polipéptido" significa um polímero de pelo 24 menos aproximadamente 4, 5, 6, 7, ou 8 aminoácidos. Por toda a memória descritiva, o padrão de designações de três letras ou letra única para aminoácidos é utilizado. No estado da técnica, este termo é com frequência utilizado de maneira intercambiável com "péptido" ou "proteína".

Um "resíduo de âncora primário" de HLA é um aminoácido numa posição específica ao longo de uma sequência de péptido que é entendido que proporciona um ponto de contacto entre o péptido imunogénico e a molécula de HLA. De um a três, usualmente dois, resíduos de âncora primários dentro de um péptido de comprimento definido geralmente definem um "motivo" para um péptido imunogénico. Estes resíduos são entendidos que se ajustam em contacto próximo com ranhura de ligação a péptido de uma molécula de HLA, com suas cadeias laterais enterradas em bolsas específicas da ranhura de ligação. Por exemplo, os resíduos de âncora primários para uma Molécula de HLA de classe I podem ser localizados na posição 2 (desde a posição amino terminal) e na posição carboxilo terminal de um epítopo de péptido 8, 9, 10, 11, ou 12 resíduo descrito no presente documento. Os resíduos de âncora primários de um péptido que se ligará a uma molécula de HLA de classe II pode ser espaçado um em relação ao outros, ao invés de em relação as terminações de um péptido, onde o péptido é geralmente de pelo menos 9 aminoácidos de comprimento.

Uma molécula de ADN ou ARN "recombinante" é uma molécula de ADN ou ARN que foi submetida a manipulação molecular in vitro.

Exemplos não limitativos de moléculas pequenas incluem compostos que se ligam ou interactuam com 238P1B2, ligandos incluindo hormonas, neuropéptidos, quimiocinas, odorantes, fosfolípido, e equivalentes funcionais dos mesmos que se ligam e preferentemente inibem a função da proteína 238P1B2. Tais moléculas pequenas não limitativas preferentemente têm um peso molecular de menos de 25 aproximadamente 10 kDa, mais preferentemente inferior a aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6, aproximadamente 5 ou aproximadamente 4 kDa. Moléculas pequenas podem fisicamente se associar com, ou ligar a, proteína 238P1B2; não são encontradas em vias metabólicas de ocorrência natural; e/ou são mais solúveis em soluções aquosas que não aquosas. "Restringência" de reacções de hibridação é prontamente determinável por um especialista na especialidade, e geralmente é um cálculo empírico dependente do comprimento de sonda, temperatura de lavagem, e concentração de sal. Em geral, sondas mais longas requerem temperaturas mais altas para hibridação apropriado, enquanto sondas mais curtas necessitam temperaturas mais baixas. Hibridação geralmente depende da habilidade das sequências de ácido nucleico desnaturadas de rehibridar quando cadeias complementares estão presentes num ambiente abaixo de sua temperatura de fusão. Quanto maior o grau de homologia desejado entre a sonda e a sequência hibridizável, maior é a temperatura relativa que pode ser utilizada. Como um resultado, segue que maiores temperaturas relativas tenderiam a tornar as condições de reacção mais restringentes, enquanto menores temperaturas menos. Para detalhes adicionais e explicação de restringência de reacções de hibridação, veja-se Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995). "Condições restringência" ou "condições de restringência elevada", como é definido no presente documento, são identificadas por, mas não são limitadas a, aquelas em que: (1) utilizam força iónica baixa e temperatura alta para lavar, por exemplo, 0,015 M de cloreto de sódio/0,0015 M de citrato de sódio/0,1 % de dodecil sulfato de sódio a 50 °C; (2) utilizam durante hibridação um agente desnaturante, tal como formamida, por 26 exemplo, 50 % (v/v) de formamida com 0,1 % de albumina de soro bovino/0,1 % de Ficoll/0,1 % polivinilpirrolidona/ 50 mM de tampão de fosfato de sódio a pH 6,5 com 750 mM de cloreto de sódio, 75 mM de citrato de sódio a 42 °C; ou (3) utilizam 50 % de formamida, 5 x SSC (0,75 M de NaCl, 0,075 M de citrato de sódio), 50 mM fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1 % de pirofosfato de sódio, 5 x Solução de Denhard, ADN de esperma de salmão sonicado (50 pg/ml), 0,1 % de SDS, e 10 % de sulfato de dextrano a 42 °C, com lavagens a 42 °C em 0,2 x SSC (cloreto de sódio/ citrato de sódio) e 50 % de formamida a 55 °C, seguido por uma lavagem de restringência elevada que consiste em 0,1 x SSC que contêm EDTA a 55 °C. "Condições moderadamente restringentes" são descritas por, mas não são limitadas a, aquelas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nova Iorque: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem o uso de solução de lavagem e condições de hibridação (por exemplo, temperatura, força iónica e % de SDS) menos restringentes que aquelas descritas anteriormente. Um exemplo de condições moderadamente restringentes é a incubação durante a noite a 37 °C numa solução que compreende: 20 % de formamida, 5 x SSC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato de trisódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,6) , 5 x de

Solução de Denhard, 10 % de sulfato de dextrano, e 20 mg/mL ADN de esperma de salmão cizalhado desnaturado, seguido por lavagem dos filtros em 1 x SSC at aproximadamente 37-50 °C. 0 perito na especialidade reconhecerá como ajustar a temperatura, força iónica, etc. conforme seja necessário para acomodar factores tais como comprimento de sonda e similares.

Um "supermotivo" HLA é uma especificidade de ligação de péptido compartida por moléculas de HLA codificada por dois ou mais alelos de HLA.

Como é utilizado no presente documento "tratar" ou "terapêutico" e termos gramaticalmente relacionados, 27 referem-se a qualquer melhora de qualquer consequência de doença, tal como sobrevivência prolongada, menos morbidez, e/ou um redução de efeitos secundários que são os subprodutos de um modalidade terapêutica alternativa; a erradicação completa de doença não é requerida.

Um "animal transgénico" (por exemplo, um ratinho ou rato) é um animal que tem células que contêm um transgene, cujo transgene foi introduzido no animal ou um ancestral do animal num estágio pré-natal, por exemplo, um embriónico. Um "transgene" é um ADN que é integrado no genoma de uma célula a partir do qua um animal transgénico se desenvolve.

Como é utilizado no presente documento, um HLA ou resposta imune celular "vacina" é um composição que contém ou codifica um ou mais péptidos descritos no presente documento. Existem numerosas tais vacinas, tal como um cocktail de um ou mais péptidos individuais; um ou mais péptidos descritos no presente documento compreendidos por um péptido poliepitótico; ou ácidos nucleicos que codificam tais péptidos individuais ou polipéptidos, por exemplo, um minigene que codifica um péptido poliepitótico. 0 "um ou mais péptidos" pode incluir qualquer número inteiro unitário de 1 - 150 ou mais, por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 00 \—1 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 , 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 , 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 , 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47 , 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75 , 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120 , 12 :5, 130, 135, 140, 145 , ou 15 0 ou mais pépt idos des crit< D S no presente documento. Os pépt idos ou polipéptidos pode opcionalmente ser modificados, tal como por meio de lipidação, adição de direcionamento como alvo ou outras sequências. Péptidos HLA de classe I descritos no presente documento podem ser misturados com, ou unidos a, Péptidos HLA de classe II, para facilitar activação de tanto linfócitos T citotóxicos como linfócitos T auxiliares. Vacinas de HLA podem também compreender células 28 apresentadoras de antigénio pulsada de péptido, por exemplo, células dendríticas. 0 termo "variante" refere-se a uma molécula que exibe uma variação de um tipo ou norma descrito, tal como uma proteína que tem um ou mais resíduos de aminoácido diferentes na(s) posição(ões) correspondente(s) de uma proteína especificamente descrita (por exemplo, a proteína 238P1B2 mostrada na Figura 2 ou a Figura 3. Um análogo é um exemplo de uma proteina variante. Isoformas splice e polimorfismo de nucleótidos únicos (SNPs) são exemplos adicionais de variantes. "Proteínas relacionadas com 238P1B2" incluem aquelas especificamente identificadas no presente documento, bem como variantes alélicas, variantes de substituição conservativa, análogos e homólogos que podem ser isolados/gerados e caracterizados sem experimentação indevida seguindo os métodos resumidos no presente documento ou prontamente dispooníveis no estado da técnica. Proteínas de fusão que combinam partes de proteínas 238P1B2 diferentes ou fragmentos das mesmas, bem como proteínas de fusão de uma proteína 238P1B2 e um polipéptido heterólogo são também incluídos. Tais proteínas 238P1B2 são colectivamente referidas como as proteínas relacionadas com 238P1B2, as proteínas descritas no presente documento, ou 238P1B2. 0 termo "proteína relacionada com 238P1B2" refere-se a um fragmento de polipéptido ou uma sequência de proteína 238P1B2 de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ou mais de 25 aminoácidos; ou, pelo menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 85, 90, 95, 100 ou mais de 100 aminoácidos. II) polinucleótidos de 238P1B2

Descrevem-se polinucleótidos correspondentes ou complementares a todos ou parte de um gene de 238P1B2, ARNm, e/ou sequência codificante, preferentemente na forma isolada, incluindo polinucleótidos que codificam uma 29 proteína relacionada com 238P1B2 e fragmentos do mesmo, ADN, ARN, híbrido de ADN/ARN, e moléculas relacionadas, polinucleótidos ou oligonucleótidos complementares a um gene de 238P1B2 ou sequência de ARNm ou um parte da mesma, e polinucleótidos ou oligonucleótidos que hibridam a um gene de 238P1B2, ARNm, ou a um polinucleótido que codifica 238P1B2 (colectivamente, "polinucleótidos de 238P1B2"). Em todos os casos quando referido nesta secção, T pode também ser U na Figura 2.

Polinucleótidos de 238P1B2 incluem: um 238P1B2 polinucleótido que tem a sequência mostrada na Figura 2, a sequência de nucleótido de 238P1B2 como mostrado na Figura 2 em que T é U; pelo menos 10 nucleótidos contíguos de um polinucleótido que tem a sequência como mostrada na Figura 2; ou, pelo menos 10 nucleótidos contíguos de um polinucleótido que tem a sequência como mostrada na Figura 2 onde T é U. Por exemplo, nucleótidos de 238P1B2 compreendem, sem limitação: (I) um polinucleótido que compreende, que consiste essencialmente em, ou que consiste em uma sequência como mostrada na Figura 2, em que T pode também ser U; (II) um polinucleótido que compreende, que consiste essencialmente em, ou que consiste na sequência como mostrada na Figura 2A, desde o resíduo de nucleótido número 2133 até resíduo de nucleótido número 2894, seguido por um codão de terminação, em que T pode também ser U; (III) um polinucleótido que compreende, que consiste essencialmente em, ou que consiste na sequência como mostrada na Figura 2B, desde o resíduo de nucleótido número 1947 até o resíduo de nucleótido número 2894, seguido por um codão de terminação, em que T pode também ser U; (IV) um polinucleótido que compreende, que consiste essencialmente em, ou que consiste na sequência como mostrada na Figura 2C, desde o resíduo de nucleótido número 2133 até o resíduo de nucleótido número 2894, seguido por 30 um codão de terminação, em que T pode também ser U; (V) um polinucleótido que compreende, que consiste essencialmente em, ou que consiste na sequência como mostrada na Figura 2D, desde o resíduo de nucleótido número 2133 até o resíduo de nucleótido número 2894, seguido por um codão de terminação, em que T pode também ser U; (VI) um polinucleótido que compreende, que consiste essencialmente em, ou que consiste na sequência como mostrada na Figura 2E desde o resíduo de nucleótido número 2133 até o resíduo de nucleótido número 2894, seguido por um codão de terminação, em que T pode também ser U; (VII) um polinucleótido que compreende, que consiste essencialmente em, ou que consiste na sequência como mostrada na Figura 2F desde o resíduo de nucleótido número 2133 até o resíduo de nucleótido número 2894, seguido por um codão de terminação, em que T pode também ser U; (VIII) um polinucleótido que compreende, que consiste essencialmente em, ou que consiste na sequência como mostrada na Figura 2G, desde o resíduo de nucleótido número 2133 até o resíduo de nucleótido número 2894, seguido por um codão de terminação, em que T pode também ser U; (IX) um polinucleótido que codifica uma proteína relacionada com 238P1B2 é que pelo menos 90 % homóloga a uma sequência inteira de aminoácidos mostrada na Figura 2A-G; (X) um polinucleótido que codifica uma proteína relacionada com 238P1B2 que é pelo menos 90 % idêntica a uma sequência inteira de aminoácidos mostrado na Figura 2A-G; (XI) um polinucleótido que codifica pelo menos um péptido indicado nos Quadros V-XVIII ou Quadro XIX; (XII) um polinucleótido que codifica uma região de péptido de pelo menos 5 aminoácidos de um péptido da Figura 3A em qualquer incremento de número inteiro até 254 que inclui uma posição de aminoácido que tem um valor superior 31 a 0,5 no Perfil de hidrof ilicidade da Figura 5A, ou da Figura 3B em qualquer incremento de número inteiro até 316 que inclui uma posição de aminoácido que tem um valor superior a 0,5 no perfil de hidrofilicidade da Figura 5B; (XIII) um polinucleótido que codifica uma região de péptido de pelo menos 5 aminoácidos de um péptido da Figura 3A em qualquer incremento de número inteiro até 254 que inclui uma posição de aminoácido que tem um valor menos de 0,5 no perfil de hidropaticidade da Figura 6A, ou da Figura 3B em qualquer incremento de número inteiro até 316, que inclui uma posição de aminoácido que tem um valor menos de 0,5 no perfil de hidropaticidade da Figura 6B; (XIV) um polinucleótido que codifica uma região de péptido de pelo menos 5 aminoácidos de um péptido da Figura 3A em qualquer incremento de número inteiro até 254 que inclui uma posição de aminoácido que tem um valor superior a 0,5 na perfil de resíduos acessíveis em % da Figura 7A, ou da Figura 3B em qualquer incremento de número inteiro até 316, que inclui uma posição de aminoácido que tem um valor superior a 0,5 na perfil de resíduos acessíveis em % da Figura 7B; (XV) um polinucleótido que codifica uma região de péptido de pelo menos 5 aminoácidos de um péptido da Figura 3A em qualquer incremento de número inteiro até 254 que inclui uma posição de aminoácido que tem um valor superior a 0,5 no perfil de flexibilidade média na Figura 8A, ou da Figura 3B em qualquer incremento de número inteiro até 316, que inclui uma posição de aminoácido que tem um valor superior a 0,5 no perfil de flexibilidade média on a Figura 8B; (XVI) um polinucleótido que codifica uma região de péptido de pelo menos 5 aminoácidos de um péptido da Figura 3A em qualquer incremento de número inteiro até 254 que inclui uma posição de aminoácido que tem um valor superior a 0,5 no perfil de folha beta da Figura 9A, ou da Figura 3B em qualquer incremento de número inteiro até 316, que 32 inclui uma posição de aminoácido que tem um valor superior a 0,5 no perfil de folha beta da Figura 9B; (XVII) um polinucleótido que codifica uma proteína relacionada com 238P1B2 cuja sequência é codificada pelo ADN contido no plasmídeo depositado com Colecção Americana de Cultura Celular como N° de acesso PTA-4124 em 7 de Março de 2002; (XVIII) um polinucleótido é que completamente complementar a um polinucleótido de qualquer um de (I)- (XVII) ; (XIX) um polinucleótido que selectivamente híbrida sob condições restringentes com um polinucleótido de (I)- (XVIII) ; (XX) um péptido que é codificada por qualquer de (I)-(XIX); e, (XXI) um polinucleótido de qualquer de (I)-(XIX) ou péptido de (XX) juntamente com um excipiente farmacêutico e/ou numa forma farmacêutica unitária para ser humano

Como é utilizado no presente documento, um intervalo é entendido que especificamente revela todas as posições unitárias completas do mesmo. Polinucleótidos típicos de 238P1B2 codificam porções específicas de sequências de ARNm 238P1B2 (e aquelas que são complementares a tais sequências) tal como aquelas que codificam as proteínas e/ou fragmentos das mesmas, por exemplo: (a) 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, ou 254 aminoácidos contíguos de 238P1B2; (b) 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 33 33 125, 130, 135, 140, 145 , 150, 155, 160, 165 , 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 , 205, 210, 215, 220 , 225, 230, 235, 240, 245, 250 , ou 254 amino ácido s contíguos de vari ante IA; (c) 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25 , 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 , 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 , 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 , 150, 155, 160, 165 , 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 , 205, 210, 215, 220 , 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255 , 260, 265, 270, 275 , 280, 285, 290, 295, 300 , 30 5, 310, 3 15, ou 2 516 aminoác ddos cont íguos de variant e 1B ; ou (d) 4, 5, 6, 7, 8 , 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25 , 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 , 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110 , 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 , 150, 155, 160, 165 , 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200 , 205, 210, 215, 220 , 225, 230, 235, 240, 245, 250 , ou 254 amino ácido s contiguoí 3 de vari ante 2 • Por ex emplo , polinucleóti dos e seus péptidos codificados são descritos no presente documento, polinucleótidos representativos podem codificar de aproximadamente aminoácido 1 a aproximadamente aminoácido 10 da proteína 238P1B2 ou variantes mostradas na Figura 2 ou a Figura 3, polinucleótidos que codificam de aproximadamente aminoácido 10 a aproximadamente aminoácido 20 da proteína ou a Figura aproximadamente 30 da proteína ou a Figura aproximadamente 40 da proteína ou a Figura aproximadamente 238P1B2 ou variantes mostradas na Figura 2 3, polinucleótidos que codificam de aminoácido 20 a aproximadamente aminoácido 238P1B2 ou variantes mostradas na Figura 2 3, polinucleótidos que codificam de aminoácido 30 a aproximadamente aminoácido 238P1B2 ou variantes mostradas na Figura 2 3, polinucleótidos que codificam de aminoácido 40 a aproximadamente aminoácido 34 50 da proteína 238P1B2 ou variantes mostradas na Figura 2 ou a Figura 3, polinucleótidos que codificam de aproximadamente aminoácido 50 a aproximadamente aminoácido 60 da proteína 238P1B2 ou variantes mostradas na Figura 2 ou a Figura 3, polinucleótidos que codificam de aproximadamente aminoácido 60 a aproximadamente aminoácido 70 da proteína 238P1B2 ou variantes mostradas na Figura 2 ou a Figura 3, polinucleótidos que codificam de aproximadamente aminoácido 70 a aproximadamente aminoácido 80 da proteína 238P1B2 ou variantes mostradas na Figura 2 ou a Figura 3, polinucleótidos que codificam de aproximadamente aminoácido 80 a aproximadamente aminoácido 90 da proteína 238P1B2 ou variantes mostradas na Figura 2 ou a Figura 3, polinucleótidos que codificam de aproximadamente aminoácido 90 a aproximadamente aminoácido 100 da proteína 238P1B2 ou variantes mostradas na Figura 2 ou a Figura 3, ou regiões codificantes desde aproximadamente aminoácido 100 até aminoácidos posteriores 34 na sequencia, em incrementos de aproximadamente 10 aminoácidos, terminando no aminoácido carboxilo terminal indicado na Figura 2 ou a Figura 3. Consequentemente os polinucleótidos que codificam porções da sequência de aminoácidos (de aproximadamente 10 aminoácidos), de aminoácidos 100 até o aminoácido carboxilo terminal da proteína 238P1B2 são descritos no presente documento. Em que é entendido que cada posição de aminoácido particular revela que posição mais ou menos cinco resíduos de aminoácido.

Polinucleótidos que codificam porções relativamente longas de uma proteína 238P1B2 são também descritos no presente documento. Por exemplo, os polinucleótidos que codificam desde aproximadamente aminoácido 1 (ou 20 ou 30 ou 40 etc.) a aproximadamente aminoácido 20, (ou 30, ou 40 ou 50 etc.) da proteína 238P1B2 ou variantes mostradas na Figura 2 ou a Figura 3 podem ser gerados por uma variedade 35 de técnicas bem conhecidas no estado da técnica. Estes fragmentos de polinucleótido podem incluir qualquer porção da sequência de 238P1B2 ou variantes como mostrado na Figura 2.

Polinucleótidos ilustrativos adicionais incluem 238P1B2 fragmentos de polinucleótido que codificam um ou mais dos motivos biológicos contidos dentro de uma sequência de proteina de 238P1B2 ou sequência variante.

Descrevem-se epítopos de anticorpo que compreendem uma região de péptido, ou um oligonucleótido que codifica a região de péptido, que tem um, dois, três, quatro, ou cinco das seguintes caracteristicas: i) uma região de péptido de pelo menos 5 aminoácidos de um péptido particular da Figura 3, em qualquer incremento de número inteiro até o comprimento completo dessa proteina na Figura 3, que inclui uma posição de aminoácido que tem um valor igual a ou superior a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, ou que tem um valor igual a 1,0, no perfil de hidrofilicidade da Figura 5; ii) uma região de péptido de pelo menos 5 aminoácidos de um péptido particular da Figura 3, em qualquer incremento de número inteiro até o comprimento completo dessa proteina na Figura 3, que inclui uma posição de aminoácido que tem um valor igual a ou menos de 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1, ou que tem um valor igual a 0,0, no perfil de hidropaticidade da Figura 6; iii) uma região de péptido de pelo menos 5 aminoácidos de um péptido particular da Figura 3, em qualquer incremento de número inteiro até o comprimento completo dessa proteina na Figura 3, que inclui uma posição de aminoácido que tem um valor igual a ou superior a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, ou que tem um valor igual a 1,0, na perfil de resíduos acessíveis em % da Figura 7; iv) uma região de péptido de pelo menos 5 aminoácidos de um péptido particular da Figura 3, em qualquer incremento 36 de número inteiro até o comprimento completo dessa proteína na Figura 3, que inclui uma posição de aminoácido que tem um valor igual a ou superior a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, ou que tem um valor igual a 1,0, no perfil de flexibilidade média da Figura 8; ou v) uma região de péptido de pelo menos 5 aminoácidos de um péptido particular da Figura 3, em qualquer incremento de número inteiro até o comprimento completo dessa proteína na Figura 3, que inclui uma posição de aminoácido que tem um valor igual a ou superior a 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, ou que tem um valor igual a 1,0, no perfil de folha beta da Figura 9.

Fragmentos de polinucleótido típicos codificam uma ou mais das regiões de proteína 238P1B2 ou variante que exibem homologia a uma molécula conhecida. Fragmentos de polinucleótido típicos podem codificar um ou mais dos locais de N-glicosilação de proteína 238P1B2 ou variante, locais de fosforilação de proteína kinase dependente de cAMP e cGMP, locais de fosforilação de caseína kinase II ou local de N-miristoilação e locais de amidação. II.A.) Utilizações de polinucleótidos de 238P1B2 II.A. 1.) Monitorização de Anomalias genéticas

Os polinucleótidos dos parágrafos precedentes têm um número de utilizações específicas diferentes. O gene de 238P1B2 humano mapeia à localização cromossómica indicado no Exemplo 3. Por exemplo, por causa do gene de 238P1B2 mapear a este cromossoma, polinucleótidos que codificam regiões diferentes das proteínas 238P1B2 são utilizadas para caracterizar anormalidades citogenéticas deste local cromossómico, tais como anormalidades que são identificadas como sendo associadas a vários cancros. Em certos genes, uma variedade de anormalidades cromossómicas incluindo rearranjos foi identificada como anormalidades citogenéticas frequentes num número de cancros diferentes (veja-se, por exemplo, Krajinovic et al. , Mutat. Res. 37 382(3-4): 81-83 (1998); Johansson et al. , Blood 86(10): 3905-3914 (1995) e Finger et al., P.N.A.S. 85(23): 9158-9162 (1988)). Assim, os polinucleótidos que codificam regiões específicas das proteínas 238P1B2 proporcionam novas ferramentas que podem ser utilizadas para delinear, com maior exactidão que era possível anteriormente, anormalidades citogenéticas na região cromossómica que codifica 238P1B2 que pode contribuir ao fenótipo maligno, neste contexto, estes polinucleótidos satisfazem uma necessidade no estado da técnica de expandir a sensibilidade de rastreio cromossómico com a finalidade de identificar mais anormalidades cromossómicas mais subtis e menos comuns (veja-se, por exemplo, Evans et al. , Am. J. Obstet. Gynecol 171(4): 1055-1057 (1994)).

Além disso, como 238P1B2 foi mostrado que é altamente expressa em bexiga e outros cancros, os polinucleótidos de 238P1B2 são utilizadaos em métodos que avaliam o status de produtos de gene de 238P1B2 em tecidos normais versus cancerosos. Tipicamente, os polinucleótidos que codificam regiões especificas das proteínas 238P1B2 são utilizados para avaliar a presença de perturbações (tais como deleções, inserções, mutações de ponto, ou alterações que resultam num perda de um antigénio etc.) em regiões específicas do gene de 238P1B2, tal como regiões que contêm um ou mais motivos. Ensaios exemplares incluem tanto ensaios de RT-PCR bem como análise de polimorfismo de conformação de cadeia simples (SSCP) (veja-se, e. g., Marrogi et al., J. Cutan. Pathol. 26(8): 369-378 (1999), ambos dos quais utilizam polinucleótidos que codificam regiões específicas de uma proteína para examinar estas regiões dentro da proteína. II.A.2.) Antisenso

Descrevem-se ADN genómico, ADNc, ribozimas, e moléculas antisenso, bem como moléculas de ácido nucleico com base em um estructura principal alternativa, ou 38 incluindo bases alternativa, se derivadas de fontes naturais ou sintetizada, e incluem moléculas capazes de inibir a expressão ARN ou proteína de 238P1B2. Por exemplo, moléculas antisenso pode ser ARN ou outras moléculas, incluindo ácidos nucleicos peptídicos (PNA) ou moléculas não de ácido nucleico tais como derivados de fosforotioato, que se ligam especificamente a ADN ou ARN de uma maneira dependente de pares de base. Um perito na especialidade pode prontamente obter estas classes de moléculas de ácido nucleico utilizando os polinucleótidos de 238P1B2 e sequências de polinucleótido reveladas no presente documento.

Tecnologia antisenso requer a administração de oligonucleótidos exógenos que se ligam a um alvo polinucleótido localizado dentro das células. 0 termo "antisenso" refere-se ao facto de que tais oligonucleótidos são complementares aos seus alvos intracelulares, por exemplo, 238P1B2. Veja-se, por exemplo, Jack Cohen, Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, 1989; e Synthesis 1:1-5 (1988). Os oligonucleótidos antisenso de 238P1B2 descritos no presente documento incluem derivados tais como S-oligonucleótidos (derivados de fosforotioato ou S-oligos, veja-se, Jack Cohen, supra), que exibem acção inibidora do crescimento de célula de cancro melhorada. S-oligos (fosforotioatos de nucleósido) são análogos isoelectrónicos de um oligonucleótido (O-oligo) em que um átomo de oxigénio não de ponte do grupo fosfato é substituído por um átomo de enxofre. Os S-oligos descritos no presente documento podem ser preparados por meio de tratamento do correspondente 0-oligos com 3H-1,2- benzoditiol-3-ona-l,1-dióxido, que é um reagente de transferência de enxofre. Veja-se, por exemplo, Iyer, R. P. et al., J. Org. Chem. 55: 4693-4698 (1990); e Iyer, R. P. et al., J. Am. Chem. Soc. 112: 1253-1254 (1990). Oligonucleótidos antisenso adicionais de 238P1B2 39 incluem oligonucleótidos antisenso de morfolino conhecidos no estado da técnica (veja-se, por exemplo, Partridge et al., 1996, Antisense & Nucleic Acid Drug Development 6: 169-175) .

Os oligonucleótidos antisenso de 238P1B2 descritos no presente documento tipicamente pode ser ARN ou ADN que é complementar a e híbrida de maneira estável com os primeiros 100 codões 5' ou os últimos 100 codões 3' de uma sequência genómica de 238P1B2 ou o correspondente ARNm. A complementaridade absoluta não é requerida, embora altos graus de complementaridade sejam preferidos. A utilização de um oligonucleótido complementar a esta região possibilita a hibridação selectiva para ARNm de 238P1B2 e não para ARNm especificando outras subunidades reguladoras de proteína quinase. Os oligonucleótidos antisenso de 238P1B2 podem ser fragmentos de 15 a 30 mer da molécula de ADN antisenso que tem uma sequência que híbrida a ARNm de 238P1B2. Opcionalmente, oligonucleótido antisenso de 238P1B2 é um oligonucleótido de 30 mer que é complementar a uma região nos primeiros 10 codões 5' ou os últimos 10 codões 3' de 238P1B2. Alternativamente, as moléculas antisenso são modificadas para utilizar ribozimas na inibição de expressão de 238P1B2, veja-se, por exemplo, L. Um. Couture & D. T. Stinchcomb; Trends Genet 12: 510-515 (1996) . II.A.3.) Iniciadores e Pares de iniciadores

Descrevem-se iniciadores e pares de iniciadores, que possibilitam a amplificação específica de polinucleótidos descritos no presente documento ou de qualquer parte específica do mesmo, e sondas que selectivamente ou especificamente hibridam a moléculas de ácido nucleico descritas no presente documento ou a qualquer parte do mesmo. As sondas podem ser marcadas com um marcador detectável, tal como, por exemplo, um radioisótopo, composto fluorescente, composto bioluminescente, um 40 composto quimioluminescente, quelante de metal ou enzima. Tais sondas e iniciadores são utilizados para detectar a presença de um polinucleótido de 238P1B2 numa amostra e como um meio para detectar uma célula que expressa uma proteína 238P1B2.

Exemplos de tais sondas incluem polipéptidos que compreendem todo ou parte da sequência de ADNc de 238P1B2 humana mostrado na Figura 2. Os exemplos de pares de iniciadores capazes de especificamente amplificar ARNm de 238P1B2 são também descritos nos exemplos. Como será entendido pelo perito na especialidade, uma grande quantidade de iniciadores e sondas pode ser preparada com base nas sequências proporcionadas no presente documento e utilizadas de maneira eficaz para amplificar e/ou detectar um ARNm de 238P1B2.

Os polinucleótidos de 238P1B2 descritos no presente documento são úteis para uma variedade de propósitos, incluindo, mas não são limitados a sua utilização como sondas e iniciadores para a amplificação e/ou detecção do gene de 238P1B2 (s), ARNm (s), ou fragmentos do mesmo; como reagentes para o diagnóstico e/ou prognóstico de cancro de próstata e outros cancros; como sequências codificantes capazes de direccionar a expressão de polipéptidos 238P1B2; como ferramentas para modular ou inibir a expressão do gene de 238P1B2 (s) e/ou tradução do transcripto de 238P1B2 (s); e como agentes terapêuticos.

Qualquer sonda como descrita no presente documento pode ser utilizada para identificar e isolar um 238P1B2 ou sequência de ácidos nucleicos ralacionadas com 238P1B2 de um de fonte de ocorrência natural, tal como seres humanos ou outros mamíferos, bem como the sequência isolada de ácidos nucleicos por si, que compreenderia todos ou a maioria das sequências encontradas na sonda utilizada. II.A.4) Isolamento de Moléculas de ácido nucleico que codificam 238P1B2 41

As Sequências de ADNc 238P1B2 descritas no presente documento permitem o isolamento de outros polinucleótidos que codificam produto(s) génico(s) de 238P1B2, bem como o isolamento de polinucleótidos que codificam homólogos de produto génico de 238P1B2, alternativamente isoformas spliced, variantes alélicas, e formas mutantes de um produto génico de 238P1B2 bem como polinucleótidos que codificam análogos de proteínas relacionadas com 238P1B2. Vários métodos de clonagem molecular que podem ser utilizados para isolar ADNc de comprimento completo que codificam um gene de 238P1B2 são bem conhecidos (veja-se, por exemplo, Sambrook, J. et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Press, Nova Iorque, 1989; Current Protocols in Molecular Biology. Ausubel et al, Eds., Wiley e Sons, 1995) . Por exemplo, metodologias de clonagem de fago lambda podem ser utilizadas de maneira conveniente, utilizando sistemas de clonagem comercialmente disponíveis (por exemplo, Lambda ZAP Express, Stratagene). Clones de fago que contêm gene de ADNc de 238P1B2 podem ser identificados por meio de sondagem com um ADNc de 238P1B2 marcado ou um fragmento do mesmo. Por exemplo, um ADNc de 238P1B2 (por exemplo, a Figura 2) ou uma porção do mesmo pode ser sintetizada e utilizado como uma sonda para recuperar ADNc de comprimento completo e sobrepostos que correspondem a um gene de 238P1B2. 0 próprio gene de 238P1B2 pode ser isolado pelo rastreio de bibliotecas de ADN genómico, bibliotecas de cromossoma artificial bacteriana (BACs), bibliotecas de cromossoma artificial de levedura (YACs), e similares, com sondas ou iniciadores ADN de 238P1B2. II.A.5.) Moléculas de ácido nucleico recombinantes e Sistemas de hospedeiro-vector

Moléculas de ADN ou ARN recombinantes pode conter polinucleótido 238P1B2, um fragmento, análogo ou homólogo do mesmo, incluindo, mas não são limitados a fagos, 42 plasmídeos, fagómidos, cosmideos, YACs, BACs, bem como vários vectores virais e não virais bem conhecidos no estado da técnica, e células transformadas ou transfectadas com tais moléculas de ADN ou ARN recombinantes. Métodos para gerar tais moléculas são bem conhecidos (veja-se, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).

Um sistema de hospedeiro-vector pode compreender uma molécula de ADN recombinante que contêm um 238P1B2 polinucleótido, fragmento, análogo ou homólogo do mesmo dentro de uma célula hospedeira procariótica adequados ou eucariótica. Os exemplos de células hospedeirsa eucarióticas adequadas incluem um célula de levedura, um célula vegetal, ou um célula animal, tal como um célula de mamífero ou um célula de insecto (por exemplo, um - célula infectável baculovírus por tal como um célula Sf9 ou HighFive). Os exemplos de células de mamífero adequadas incluem várias linhas de células de cancro de próstata tais como DU145 e TsuPrl, outras linhas de células de cancro de próstata transfectáveis ou transduzíveis, células primárias (PrEC), bem como um número de células de mamífero rotineiramente utilizadas para a expressão de proteínas recombinantes (por exemplo, COS, CHO, 293, células 293T). Mais particularmente, um polinucleótido que compreende a sequência codificante de 238P1B2 ou um fragmento, análogo ou homólogo do mesmo pode ser utilizado para gerar proteínas 238P1B2 ou fragmentos das mesmas utilizando qualquer número de sistemas de hospedeiro-vector rotineiramente utilizado e amplamente conhecido no estado da técnica.

Uma ampla gama de sistemas de hospedeiro-vector adequados para a expressão de proteínas 238P1B2 ou fragmentos das mesmas estão disponíveis, veja-se, por exemplo, Sambrook et al, 1989, supra; Current Protocols in Molecular Biology, 1995, supra). Vectores preferidos for expressão em mamífero incluem, mas não são limitados a 43 pcDNA 3,1 myc-His-tag (Invitrogen) e o vector retroviral pSRatkneo (Muller et al, 1991, MCB 11: 1785). Utilizando estes vectores de expressão, 238P1B2 pode ser expressa em diversos linhas de células cancro de próstata e não de próstata, incluindo, por exemplo, 293, 293T, rat-1, NIH 3T3 e TsuPrl. Estes sistemas de hospedeiro-vector são úteis para a produção de uma proteína 238P1B2 ou fragmento do mesmo. Tais sistemas de hospedeiro-vector podem ser utilizados para estudar as propriedades funcionais de 238P1B2 e mutações ou análogos de 238P1B2.

Proteína 238P1B2 humana recombinante ou um análogo ou homólogo ou fragmento da mesma pode ser produzida por células de mamífero transfectadas com uma construção que codifica um nucleótido relacionada com 238P1B2. Por exemplo, células 293T podem ser transfectadas com um plasmídeo de expressão que codifica 238P1B2 ou fragmento, análogo ou homólogo do mesmo, uma proteína relacionada com 238P1B2 é expressa nas células 293T, e a proteína 238P1B2 recombinante é isolada utilizando métodos de purificação padrão (por exemplo, purificação por afinidade utilizando anticorpos anti-238P1B2). Uma sequência de 238P1B2 codificante pode ser subclonada no vector retroviral pSRaMSVtkneo e utilizada para infectar várias linhas de células de mamíferos, tal como NIH 3T3, TsuPrl, 293 e rat-1 com a finalidade de estabelecer linhas de células que expressam 238P1B2. Vários outros sistemas de expressão bem conhecidos no estado da técnica podem também ser utilizados. Construções de expressão que codificam um péptido líder unido em quadro a uma sequência de 238P1B2 codificante pode ser utilizado para a geração de uma forma secretada de proteína 238P1B2 recombinante.

Como é discutido no presente documento, a redundância no código genético permite a variação em gene de sequências de 238P1B2. Em particular, é conhecido no estado da técnica que espécies de hospedeiro específicas com frequência têm 44 preferências de codão específicas, e assim um perito pode adaptar a sequência revelada conforme for preferido para um hospedeiro desejado. Por exemplo, sequências de codão de análogo preferidas tipicamente têm codões raros (isto é, codões que tem uma frequência de utilização de menos de aproximadamente 20 % em sequências conhecidas do hospedeiro desejado) substituído com codões de frequência mais alta. Preferências de codões para uma espécie específica são calculadas, por exemplo, utilizando quadros de uso de codão disponíveis da INTERNET tal como na URL www.ÃDN.affrc.gojp/- nakamura/codon.html.

Modificações de sequência adicionais são conhecidas para melhorar expressão de proteína num hospedeiro celular. Estas incluem a eliminação de sequências que codificam sinais de poliadenilação espúrios, sinais locais splice de exão/intrão, repetições do tipo transposão, e/ou outras tais sequências bem caracterizadas que são deletérias à expressão de gene. 0 conteúdo de GC da sequência é ajustado a níveis médios para um dado hospedeiro celular, como é calculado por referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Onde for possível, a sequência é modificada para evitar estruturas de ARNm secundárias hairpin preditas. Outras modificações úteis incluem a adição de uma sequência consenso de iniciação traducional no começo da grelha de leitura aberta, como é descrito em Kozak, Mol. Cell Biol., 9: 5073-5080 (1989). Peritos na especialidade entendem que a regra geral de que ribossomas eucarióticos iniciam a tradução exclusivamente no codão AUG 5' proximal é anulada somente sob condições raras (veja-se, por exemplo, Kozak PNAS 92(7) : 2662-2666, (1995) e Kozak NAR 15(20): 8125-8148 (1987)). III.) Proteínas relacionadas com 238P1B2

Descrevem-se proteínas relacionadas com 238P1B2. Proteínas 238P1B2 específicas compreendem um polipéptido que tem toda ou parte da sequência de aminoácidos de 45 238Ρ1Β2 humano como mostrado na Figura 2 ou na Figura 3. Alternativamente, proteínas 238P1B2 compreendem polipéptidos variantes, homólogos ou análogos que têm alterações na sequência de aminoácidos de 238P1B2 mostrado na Figura 2 ou na Figura 3.

Em geral, variantes alélicas de ocorrência natural de 238P1B2 humano compartem um alto grau de identidade estrutural e homologia (por exemplo, 90 % ou mais de homologia) . Tipicamente, variantes alélicas de uma proteína 238P1B2 contêm substituições de aminoácido conservativas dentro das sequências de 238P1B2 descritas no presente documento ou contêm uma substituição de um aminoácido de uma posição correspondente num homólogo de 238P1B2. Uma classe de 238P1B2 variantes alélicas são proteínas que compartem um alto grau de homologia com pelo menos uma pequena região de um particular sequência de 238P1B2 de aminoácidos, mas ainda contêm um radical saindo da sequência, tal como um substituição não conservativa, truncação, inserção ou frame shift. Em comparações de sequências de proteína, os termos, similaridade, identidade, e homologia cada um tem um significado distinto como é apreciado no campo da genética. Além disso, ortologia e paralogia podem ser conceitos importantes que descrevem o relacionamento de membros de uma dada família de proteína em um organismo com respeito aos membros da mesma família em outros organismos.

Abreviações de aminoácido são proporcionadas no Quadro II. Substituições de aminoácido conservativas podem com frequência serem feitas numa proteína sem alterar a conformação ou a função da proteína. As proteínas descritas no presente documento podem compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 substituições conservativas. Tal mudanças incluem substituir qualquer de isoleucina (I), valina (V), e leucina (L) por qualquer outro destes aminoácidos hidrofóbicos; ácido aspártico (D) 46 por ácido glutámico (E) e vice versa; glutamina (Q) por asparagina (N) e vice versa; e serina (S) por treonina (T) e vice versa. Outras substituições podem também ser consideradas conservativas, dependendo do ambiente do aminoácido particular e seu papel na estrutura tridimensional da proteína. Por exemplo, glicina (G) e alanina (A) pode com frequência ser interchangeable, como pode alanina (A) e valina (V). Metionina (M), que é relativamente hidrofóbica, pode com frequência ser intercambiada com leucina e isoleucina, e algumas vezes com valina. Lisina (K) e arginina (R) são com frequência intercambiável em localizações em que a característica significativa do resíduo de aminoácido é sua cargas e os pK que diferem destes dois resíduos de aminoácido não são significativo. Ainda outras mudanças podem ser consideradas "conservativas" em particular ambientes (veja-se, por exemplo, Quadro III no presente documento; páginas 13-15 "Biochemistry" 2a ED. Lubert Stryer ed (Stanford University) ; Henikoffet et al., PNAS 1992 Vol 89 10915-10919; Lei et al., J Biol Chem 1995 May 19; 270 (20): 11882-6).

Descrevem-se uma ampla variedade de variantes ou análogos de proteínas 238P1B2 aceitos no estado da técnica tais como polipéptidos que tem inserções de minoácido, deleções e substituições. As variantes de 238P1B2 podem ser feitas utilizando métodos conhecidos no estado da técnica tal como mutagénese dirigida de local, rastreio de alanina, e mutagénese por PCR. A mutagénese dirigida de local (Cárter et al ., Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)), mutagénese de cassete (Wells et al., Gene, 34: 315 (1985)), mutagénese de selecção de restricção (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)) ou outras técnicas conhecidas podem ser realizadas no ADN clonado para produzir o ADN variante 238P1B2. 47

Análise de aminoácido de exploração pode também ser utilizada para identificar um ou mais aminoácidos juntamente com uma sequência contígua que é envolvida num actividade biológica específica tal como uma interacção proteína-proteína. Entre os aminoácidos de exploração preferidos estão aminoácidos relativamente pequenos, neutros. Tais aminoácidos incluem alanina, glicina, serina, e cisteína. Alanina é tipicamente um aminoácido de exploração preferido entre este grupo porque elimina a cadeia lateral além do carbono beta e é menos provável de alterar a conformação da cadeia principal da variante. Alanina é também tipicamente preferida porque é o aminoácido mais comum. Além disso, é com frequência encontrada tanto nas posições enterradas como expostas (Creighton, The proteins, (W. H. Freeman & Co., N. I.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)). Se a substituição de alanina não rende quantidades adequadas de variante, um aminoácido isostérico pode ser utilizado.

Como é definido no presente documento, variantes de 238P1B2, análogos ou homólogos, têm o atributo distintivo de que tem pelo menos um epítopo que tem "reacção cruzada " com uma proteína 238P1B2 que tem uma sequência de aminoácidos da Figura 3. Como é utilizado nesta sentença,"reacção cruzada" significa que um anticorpo ou célula T que se liga especificamente a um 238P1B2 variante também especificamente se liga a uma proteína 238P1B2 que tem uma sequência de aminoácidos indicada na Figura 3. Um polipéptido deixa de ser uma variante de uma proteína mostrado na Figura 3, quando não contém mais qualquer epítopo capaz de ser reconhecido por um anticorpo ou célula T que se liga especificamente à proteina de partida 238P1B2. Aqueles peritos no estado da técnica entendem que anticorpos que reconhecem proteínas se ligam a epítopos de tamanhos variáveis, e um agrupamento da ordem de aproximadamente quatro ou cinco aminoácidos, contíguos ou 48 não, é considerado como um número típico de aminoácidos num epítopo mínimo. Veja-se, por exemplo, Nair et ai., J. Immunol 2000 165 (12): 6949-6955; Hebbes et ai., Mol Immunol (1989) 26 (9): 865-73; Schwartz et ai, J Immunol (1985) 135 (4) : 2598-608.

Outras classes de variantes proteicas relacionadas a 238P1B2 compartem 70 %, 75 %, 80 %, 85 % ou 90 % ou mais similaridade com uma sequência de aminoácidos da Figura 3, ou um fragmento do mesmo. Outra classe especifica de 238P1B2 variantes proteicas ou análogos compreendem um ou mais dos motivos biológicos de 238P1B2 descritos no presente documento ou presentemente conhecido no estado da técnica. Assim, análogos de fragmentos de 238P1B2 (nucleico ou aminoácido) pode ter propriedades funcionais alteradas (por exemplo, imunogénica) em relação ao fragmento de partida. É para ser apreciado que motivos agora ou que se tornarão parte do estado da técnica são para ser aplicados às sequências nucleicas ou de aminoácidos da Figura 2 ou a Figura 3.

Como é discutido no presente documento, polipéptidos podem conter menos da sequência de aminoácidos completa de uma proteína 238P1B2 mostrada na Figura 2 ou a Figura 3. Por exemplo, péptidos/proteínas representativos podem ter qualquer 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou mais aminoácidos contíguos de uma proteína 238P1B2 mostrada na Figura 2 ou a Figura 3.

Além disso, polipéptidos representativos podem consistir em aproximadamente aminoácido 1 a aproximadamente aminoácido 10 de uma proteína 238P1B2 mostrado na Figura 2 ou a Figura 3, polipéptidos que consistem em aproximadamente aminoácido 10 a aproximadamente aminoácido 20 de uma proteína 238P1B2 mostrada na Figura 2 ou a Figura 3, polipéptidos que consistem em aproximadamente aminoácido 20 a aproximadamente aminoácido 30 de uma proteína 238P1B2 mostrado na Figura 2 ou a Figura 3, polipéptidos que 49 consistem em aproximadamente aminoácido 30 a aproximadamente aminoácido 40 de uma proteína 238P1B2 mostrado na Figura 2 ou a Figura 3, polipéptidos que consistem em aproximadamente aminoácido 40 a aproximadamente aminoácido 50 de uma proteína 238P1B2 mostrado na Figura 2 ou a Figura 3, polipéptidos que consistem em aproximadamente aminoácido 50 a aproximadamente aminoácido 60 de uma proteína 238P1B2 mostrado na Figura 2 ou a Figura 3, polipéptidos que consistem em aproximadamente aminoácido 60 a aproximadamente aminoácido 70 de uma proteína 238P1B2 mostrado na Figura 2 ou a Figura 3, polipéptidos que consistem em aproximadamente aminoácido 70 a aproximadamente aminoácido 80 de uma proteína 238P1B2 mostrado na Figura 2 ou a Figura 3, polipéptidos que consistem em aproximadamente aminoácido 80 a aproximadamente aminoácido 90 de uma proteína 238P1B2 mostrado na Figura 2 ou a Figura 3, polipéptidos que consistem em aproximadamente aminoácido 90 a aproximadamente aminoácido 100 de uma proteína 238P1B2 mostrado na Figura 2 ou a Figura 3, etc. por toda a totalidade de uma sequência de 238P1B2 de aminoácidos. Além disso, polipéptidos que consistem em aproximadamente aminoácido 1 (ou 20 ou 30 ou 40 etc.) a aproximadamente aminoácido 20, (ou 130, ou 140 ou 150 etc.) de uma proteína 238P1B2 mostrado na Figura 2 ou a Figura 3. É para ser apreciado nas posições de início e de parada neste parágrafo referem-se à posição especificada bem como aquela posição mais ou menos 5 resíduos. A proteínas relacionadas com 238P1B2 são geradas utilizando tecnologia de síntese de péptido padrão ou utilizando métodos clivagem química bem conhecidos no estado da técnica. Alternativamente, métodos recombinantes podem ser utilizados para gerar moléculas de ácido nucleico que codificam uma proteína relacionada com 238P1B2. 50

Moléculas de ácido nucleico podem proporcionar um meio para gerar fragmentos definidos de uma proteína 238P1B2 (ou variantes, homólogos ou análogos da mesma). III.A.) Proteínas que portam motivo

Polipéptidos 238P1B2 adicionais compreendem os resíduos de aminoácido de um ou mais dos motivos biológicos contidos dentro de uma sequência de polipéptido de 238P1B2 indicados na Figura 2 ou a Figura 3. Vários motivos são conhecidos no estado da técnica, e uma proteína pode ser avaliada para a presença de tal motivos por um número de sites de Internet disponíveis ao público (veja-se, por exemplo, os endereços World Wide Web URL: pfam.wustl.edu/; searchlauncher.bem.tmc.edu/seq-search/struc-predict.html; psort.ims.u-tokyo.ac.jp/; www.cbs.dtu. dk/; www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html; www.expasy.ch/ferramentas/scnpsiti.html; Epi-matrix™ e

Epimer™, Brown University, www.brown.edu/Research/TB- HIVLab/epimatrix-/epimatrix.html; e BIMAS, bimas.dert.nih.gov/.).

Uma variedade de referências reflectem o estado da técnica com respeito à identificação e geração de epítopos numa proteína de interesse bem como análogos da mesma.

Veja-se, por exemplo, o documento WO 9733602 de Chesnut et al; Sette, Immunogenetics 1999 50 (3-4): 201-212; Sette et al., J. Immunol. 2001 166 (2): 1389-1397; Sidney et al.,

Hum. Immunol. 1997 58(1): 12-20; Kondo et al.,

Immunogenetics 1997 45(4): 249-258; Sidney et al., J.

Immunol. 1996 157(8): 3480-90; e Falqu et al., Nature 351: 290-6 (1991); Hunt et al., Science 255: 1261-3 (1992);

Parker et al, J. Immunol. 149: 3580-7 (1992); Parker et al., J. Immunol. 152: 163-75 (1994)); Kast et al, 1994 152 (8): 3904-12; Borras-Cuesta et al., Hum. Immunol. 2000 61(3): 266-278; Alexander et al., J. Immunol. 2000 164(3); 164 (3) : 1625-1633; Alexander et al., PMID: 7895164, UI: 95202582; 0'Sullivan et al., J. Immunol. 1991 147(8): 2663- 51 2669; Alexander et al., Immunity 1994 1(9): 751-761 e Alexander et al., Immunol. Res. 1998 18(2) : 79-92 .

As proteínas relacionadas com 238P1B2 podem estar em muitas formas, preferentemente na forma isolada. Uma molécula de proteína 238P1B2 purificada será substancialmente livre de outras proteínas ou moléculas que prejudiquem a ligação de 238P1B2 a anticorpo, célula T ou outro ligando. A natureza e grau de isolamento e purificação dependerá da utilização pretendida. As proteínas relacionadas com 238P1B2 incluem proteínas relacionadas com 238P1B2 purificadas e funcionais, proteínas relacionadas com 238P1B2 solúveis. Um funcional, proteína 238P1B2 solúvel ou fragmento da mesma pode reter a capacidade de ser ligado pelo anticorpo, célula T ou outro ligando.

As proteínas 238P1B2 podem compreender fragmentos biologicamente activos de uma sequência de 238P1B2 de aminoácidos mostrada na Figura 2 ou a Figura 3. Tais proteínas exibem propriedades da proteína de partida 238P1B2, tal como a capacidade para provocar a geração de anticorpos que se ligam especificamente a um epítopo associado à proteína de partida 238P1B2; de ser ligado por tal anticorpos; para provocar a activação de HTL ou CTL; e/ou, de ser reconhecido pelo HTL ou CTL que também especificamente se liga à proteína de partida.

Polipéptidos relacionados com 238P1B2 que contêm estruturas particularmente interessantes podem ser preditos e/ou identificados utilizando várias técnicas analíticas bem conhecidas no estado da técnica, incluindo, por exemplo, os métodos de Chou- Fasman, Gamier- Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karmais-Schultz ou análise de Jameson-Wolf, ou com base em imunogenicidade. Fragmentos que contêm tais estruturas são particularmente úteis em gerar anticorpos anti-238PlB2 específicos de unidade, ou células T ou na identificação de factores celulares que se 52 ligam a 238P1B2. Por exemplo, perfis de hidrofilicidade podem ser gerados, e fragmentos imunogénicos de péptido identificados, utilizando o método de Hopp, T. P. e Woods, K. R., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78: 3824-3828. Perfis de hidropaticidade podem ser gerados, e fragmentos imunogénicos de péptido identificados, utilizando o método de Kyte, J, e Doolittle, R. F., 1982, J. Mol. Biol. 157: 105-132. Perfis de Residuos acessíveis em percentagem (%) podem ser gerados, e fragmentos imunogénicos de péptido identificados, utilizando o método de Janin J., 1979, Nature 277: 491-492. Perfis de flexibilidade média podem ser gerados, e fragmentos imunogénicos de péptido identificados, utilizando o método de Bhaskaran R., Ponnuswamy P. K., 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32: 242-255. Perfis de folha beta podem ser gerados, e fragmentos imunogénicos de péptido identificados, utilizando o método de Deleage, G., Roux B. , 1987, Protein Engineering 1: 289-294.

Os epítopos de CTL podem ser determinados utilizando algoritmos específicos para identificar péptidos dentro de uma proteína 238P1B2 que são capazes de se ligar de forma óptima a alelos de HLA especificados (por exemplo, pela utilização do site de SYFPEITHI na World Wide Web URL syfpeithi.bmi-heidelberg.com/; Epimatrix™ e Eimer™, Brown University, URL (www.brown.edu/Research/IB-HIV Lab/epirnatrix/epirnatrix.htrnl); e BIMAS, URL bimas.dert.nih.gov/). 0 algoritmo de busca de motivo de péptido HLA foi desenvolvido pelo Dr. Ken Parker com base em ligação de sequências de péptido específicas na ranhura de moléculas de HLA de classe I, em particular HLA-A2 (veja-se, por exemplo, Falqu et al., Nature 351: 290-6(1991); Hunt et al., Science 255: 1261-3 (1992); Parker et al., J. Immunol. 149: 3580-7 (1992); Parker et al., J. Immunol. 152: 163-75 (1994)). Este algoritmo possibilita a localização e 53 classificação de péptidos 8 mer, 9 mer, e 10 mer de um sequência de proteína completa para ligação predita a HLA-A2 bem como numerosas outras moléculas de HLA de classe I. Muitos péptidos de ligação de HLA classe I são de 8, 9, 10 ou 11 mers. Por exemplo, para classe I HLA-A2, os epítopos preferentemente contêm uma leucina (L) ou metionina (M) na posição 2 e uma valina (V) ou leucina (L) na porção C terminal (veja-se, por exemplo, Parker et al., J. Immunol. 149: 3580-7 (1992)). A pontuação de ligação corresponde à metade do tempo de dissociação estimado de complexos que contêm o péptido a 37 °C a pH 6,5. Péptidos com a maior pontuação de ligação são preditos que são os mais firmemente ligados a HLA Classe I na superfície celular durante o maior período de tempo e assim representam os melhores alvos imunogénicos para reconhecimento de célula T. A ligação real de péptidos a um alelo HLA pode ser avaliada pela estabilização de Expressão de HLA na linha celular defeituosa no processamento de antigénio T2 (veja-se, por exemplo, Xue et al., Prostate 30: 73-8 (1997) e Peshwa et al., Prostate 36: 129-38 (1998)). A imunogenicidade de péptidos específicos pode ser avaliada in vitro pela estimulação de linfócitos T CD8+ citotóxicos (CTL) na presença de células apresentadoras de antigénio tais como células dendríticas. É para ser apreciado que cada epítopo predito pelo site de BIMAS, sites Epimer™ e Epimatrix™, ou especificados pelos motivos HLA classe I ou classe II disponíveis no estado da técnica ou que se tornem parte dos estado da técnica tal como indicado no Quadro IV (ou determinado utilizando o site da World Wide Web URL syfpeithi. bmi-heidelberg.com/, ou BIMAS, bimas.dcrt.nih.gov/) são para ser "aplicados" a uma proteína 238P1B2 descrita no presente documento. Como é utilizado neste contexto "aplicadpo" significa que uma proteína 238P1B2 é avaliada, por exemplo, 54 visualmente ou by métodos de descoberta de padrões com base em computador, como é apreciado por aqueles de pericia relevante na especialidade. Cada subsequência de uma proteina 238P1B2 de 8, 9, 10 ou 11 resíduos de aminoácido que porta um motivo de HLA Classe I, ou uma subsequência de 9 ou mais resíduos de aminoácido que porta um motivo de HLA Classe II são descritos no presente documento. III. B.) Expressão de proteínas relacionadas com 238P1B2

Como é descrito nos exemplos que seguem, 238P1B2 pode ser de maneira conveniente expressa em células (tal como células 293T) transfectadas com um vector de expressão comercialmente disponível tal como um vector de expressão dirigido por CMV que codifica 238P1B2 com um 6XHis C-terminal e etiqueta MYC (pcDNA3,1/mycHIS, Invitrogen ou Tag5, GenHunter Corporation, Nashville TN). O vector Tag5 proporciona um sinal de secreção de IgGK que pode ser utilizado para facilitar a produção de um proteína 238P1B2 secretada em células transfectasdas. A 238P1B2 com etiqueta de HIS secretada no meio de cultura pode ser purificada, por exemplo, utilizando uma coluna de níquel utilizando técnicas padrão. III.C.) Modificações de proteínas relacionadas com 238P1B2 Modificações de proteínas relacionadas com 238P1B2 tais como modificações covalentes são descritas no presente documento. Um tipo de modificação covalente inclui fazer reagir resíduos de aminoácido direccionados como alvo de um polipéptido 238P1B2 com um agente derivatizante orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais seleccionadas ou os resíduos N ou C terminais de uma proteína 238P1B2. Outro tipo de modificação covalente de um polipéptido 238P1B2 descrito no presente documento compreende alterar o padrão de glicosilação nativo de uma proteína descrita no presente documento. Outro tipo de modificação covalente de 238P1B2 compreende ligar um polipéptido 238P1B2 a um de uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, 55 polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol, ou polioxialquilenos, na maneira indicado em Patente U.S. Nos. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ou 4.179.337.

As proteínas relacionadas com 238P1B2 descritas no presente documento podem também ser modificadas para formar uma molécula quimérica que compreende 238P1B2 fusionada a outra, polipéptido heterólogo ou sequência de aminoácidos. Tal uma molécula quimérica pode ser sintetizada quimicamente ou de forma recombinante. Uma molécula quimérica pode ter uma proteína descrita no presente documento fusionada a outro antigénio associado a tumor ou fragmento do mesmo. Alternativamente, uma proteína descrita no presente documento pode compreender um fusão de fragmentos de uma sequência de 238P1B2 (aminoácido ou ácido nucleico) tal que uma molécula é criada que não é, através de seu comprimento, directamente homóloga às sequências aminoácido ou de ácido nucleico mostradas na Figura 2 ou a Figura 3. Tal uma molécula quimérica pode compreender múltiplos da mesma subsequência de 238P1B2. Uma molécula quimérica pode compreender uma fusão de um proteína relacionada com 238P1B2 com uma etiqueta de epítopo de polihistidina, que proporciona um epítopo ao qual níquel imobilizado pode selectivamente se ligar, com citocinas ou com factores de crescimento. A etiqueta de epítopo é geralmente colocada na porção amino ou carboxil terminal de uma proteína 238P1B2. Alternativamente, a molécula quimérica pode compreender uma fusão de uma proteína relacionada com 238P1B2 com um imunoglobulina ou um região particular de um imunoglobulina. Para um forma bivalente da molécula quimérica (também referida como um "imunoadesina") , tal um fusão poderia ser à região Fc de uma molécula de IgG. As fusões de Ig preferentemente incluem a substituição de uma forma solúvel (domínio transmembrana deletado ou inactivado) de um polipéptido 56 238Ρ1Β2 em lugar de pelo menos uma região variável dentro de um molécula de Ig. A fusão de imunoglobulina pode incluir a dobradiça, CH2 e CH3, ou a dobradiça, regiões CHI, CH2 e CH3 de uma molécula IgGI. Para a produção de fusões de imunoglobulina veja-se, por exemplo., Patente U.S. No. 5.428.130 depositada em 27 de Junho de 1995. IILD.) Utilizações de proteínas relacionadas com 238P1B2

As proteínas descritas no presente documento têm um número de utilizações especificas diferentes. Como 238P1B2 é altamente expressa em próstata e outros cancros, proteínas relacionadas com 238P1B2 são utilizadas em métodos que avaliam o status de produtos de gene de 238P1B2 em tecidos normal versus cancerosos, deste modo elucidando o fenotipo de malignidade. Tipicamente, polipéptidos de regiões específicas de uma proteína 238P1B2 são utilizados para avaliar a presença de perturbações (tal como deleções, inserções, mutações de ponto etc.) naquelas regiões (tal como regiões que contêm um ou mais motivos). Ensaios exemplares utilizam anticorpos ou células T que têm como alvo proteínas relacionadas com 238P1B2 que compreendem os resíduos de aminoácido de um ou mais dos motivos biológicos contidos dentro de uma sequência de polipéptido de 238P1B2 com a finalidade de avaliar as características desta região em tecidos normais versus cancerosos ou para provocar um resposta imune ao epítopo. Alternativamente, proteínas relacionadas com 238P1B2 que contêm os resíduos de aminoácido de um ou mais dos motivos biológicos numa proteína 238P1B2 são utilizadas para rastrear os factores que interagem com essa região de 238P1B2. fragmentos de proteína de 238PlB2/subsequências são particularmente úteis em gerar e caracterizar anticorpos específicos de domínio (por exemplo, anticorpos que reconhecem um epítopo extracelular ou intracelular de uma proteína 238P1B2), para identificar agentes ou factores celulares que se ligam a 238P1B2 ou um particular domínio 57 estrutural do mesmo, e em vários contextos terapêutico e diagnóstico, incluindo, mas não são limitados a ensaios de diagnóstico, vacinas contra cancro e métodos de preparar taisl vacinas.

As proteínas codificadas pelos genes de 238P1B2, ou pelos análogos, homólogos ou fragmentos do mesmo, têm uma variedade de utilizações, incluindo, mas não são limitadas a gerar anticorpos e em métodos para identificar ligandos e outros agentes e constituintes celulares que se ligam a um produto génico de 238P1B2. Anticorpos criados contra uma proteína 238P1B2 ou fragmento do mesmo são úteis em ensaios de diagnóstico e prognóstico, e metodologias de obtenção de imagem na gestão de cancros humanos caracterizados pela expressão de proteína 238P1B2, tal como aqueles listados no Quadro I. Tais anticorpos podem ser expressos intracelularmente e utilizados em métodos de tratamento de pacientes com tais cancros. Ácidos nucleicos ou proteínas relacionados com 238P1B2 são também utilizados em gerar respostas de HTL ou CTL. Vários ensaios imunológicos úteis para a detecção de proteínas 238P1B2 são utilizados, incluindo, mas não são limitados a vários tipos de radioimunoensaios, ensaios absorventes ligados a enzima (ELISA), ensaios fluorescentes ligados a enzima (ELISA), métodos imunocitoquímicos, e similares. Os anticorpos pode ser marcados e utilizados como reagentes para a obtenção de imagem imunológica capazes de detectar células que expressam 238P1B2 (por exemplo, em métodos de obtenção de imagem radiocintigráfica). Proteínas 238P1B2 são também particularmente úteis em gerar vacinas contra cancro, como descrito adicionalmente no presente documento. IV.) Métodos para a detecção de 238P1B2

Descrevem-se métodos para detectar polinucleótidos de 238P1B2 e proteínas relacionadas com 238P1B2, bem como métodos para identificar uma célula que expressa 238P1B2. 0 58 perfil de expressão de 238P1B2 o torna um marcador de diagnóstico para doença metastasizada. Consequentemente, o status de produtos de gene de 238P1B2 proporciona informação útil para predizer uma variedade de factores incluindo susceptibilidade to doença em estágio avançado, taxa de progressão, e/ou agressividade de tumor. Como é discutido em detalhe no presente documento, o status de produtos de gene de 238P1B2 em amostras de paciente pode ser analisado por uma variedade protocolos que são bem conhecidos no estado da técnica incluindo análise imunohistoquimica, a variedade de técnicas de Northern blotting incluindo hibridação in situ, análise de RT-PCR (por exemplo em amostras microdissecadas de captura por laser), análise de Western blot e análise de arranjo de tecido.

Mais particularmente, descrevem-se ensaios para a detecção de polinucleótidos de 238P1B2 numa amostra biológica, tal como soro, osso, próstata, e outros tecidos, urine, sémen, 1 preparações celulares, e similares. Polinucleótidos de 238P1B2 detectáveis incluem, por exemplo, um gene de 238P1B2 ou fragmento do mesmo, ARNm de 238P1B2, ARNm de 238P1B2 de variante de splice alternativo, e moléculas de ADN ou ARN recombinantes que contêm um polinucleótido de 238P1B2. Um número de métodos para amplificar e/ou detectar a presença de polinucleótidos de 238P1B2 são bem conhecidos no estado da técnica e podem ser utilizados na prática destes ensaios.

Um método para detectar um ARNm de 238P1B2 numa amostra biológica pode compreender produzir ADNc a partir da amostra por transcrição reversa utilizando pelo menos um iniciador; amplificar o ADNc assim produzido utilizando um polinucleótidos de 238P1B2 como iniciadores senso e antisenso para amplificar ADNc de 238P1B2 nos mesmos; e detectar a presença do ADNc de 238P1B2 amplificado. Opcionalmente, a sequência do ADNc amplificado de 238P1B2 59 pode ser determinado.

Um método de detectar um gene de 238P1B2 numa amostra biológica pode compreender em primeiro lugar isolar ADN genómico da amostra; amplificar o ADN genómico isolado utilizando polinucleótidos de 238P1B2 como iniciadores senso e antisenso; e detectar a presença do gene de 238P1B2 amplificado. Qualquer número de combinações apropriadas de sonda senso e antisenso pode ser desenhada de uma sequência de 238P1B2 de nucleótido (veja-se, por exemplo, a Figura 2) e utilizado para este propósito.

Também se descrevem ensaios para detectar a presença de uma proteina 238P1B2 num tecido ou outra amostra biológica tal como soro, sémen, osso, próstata, urine, preparações celulares, e similares. Métodos para detectar uma proteina relacionada com 238P1B2 são também bem conhecidos e incluem, por exemplo, imunoprecipitação, análise imunohistoquimica, análise de Western blot, ensaios de ligação molecular, ELISA, ELIFA e similares. Por exemplo, um método de detectar a presença de um proteína relacionada com 238P1B2 numa amostra biológica compreende em primeiro lugar colocar em contacto a amostra com um anticorpo contra 238P1B2, um fragmente reactivo contra 238P1B2 do mesmo, ou uma proteína recombinante que contêm um região de ligação a antigénio de um anticorpo contra 238P1B2; e então detectar a ligação de proteína relacionada com 238P1B2 na amostra. Métodos para identificar uma célula que expressa 238P1B2 são também descritos. Um ensaio para identificar uma célula que expressa um gene de 238P1B2 pode compreender detectar a presença de ARNm de 238P1B2 na célula. Métodos para a detecção de ARNm particular em células são bem conhecidos e incluem, por exemplo, ensaios de hibridação utilizando sondas de ADN complementar (tal como hibridação in situ utilizando ribossondas de 238P1B2 marcadas, Northern blot e técnicas relacionadas) e vários ensaios de 60 amplificação de ácido nucleico (tal como RT-PCR utilizando iniciadores complementares específicos para 238P1B2, e outros métodos de detecção tipo amplificação, tal como, por exemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA e similares). Alternativamente, um ensaio para identificar uma célula que expressa um gene de 238P1B2 compreende detectar a presença de proteína relacionada com 238P1B2 na célula ou secretada pela célula. Vários métodos para a detecção de proteínas são bem conhecidos no estado da técnica e são utilizados para a detecção de proteínas relacionadas com 238P1B2 e células que expressam proteínas relacionadas com 238P1B2. A análise de expressão de 238P1B2 é também útil como uma ferramenta para identificar e avaliar agentes que modulam a expressão do gene de 238P1B2. Por exemplo, a expressão de 238P1B2 é significativamente regulada positivamente em cancro de próstata, e é expressa em cancros dos tecidos listados no Quadro 1. A identificação de uma molécula ou agente biológico que inibe a expressão de 238P1B2 ou sobre-expressão em células de cancro é de valor terapêutico. Por exemplo, tal agente pode ser identificado pela utilização de um exame que quantifique a expressão de 238P1B2 por meio de RT-PCR, hibridação de ácido nucleico ou ligação de anticorpo. V.) Métodos para monitorizar o Status de genes relacionados com 238P1B2 e Seus Produtos

Oncogénese é conhecido que é um processo multi-etapa onde o crescimento celular se torna progressivamente desregulado e as células progridem de um estado fisiológico normal a pré-canceroso e então a estados cancerosos (veja-se, por exemplo, Alers et al. , Lab Invest. 77(5):437-438 (1997) e Isaacs et al., Câncer Surv. 23:19-32 (1995)). Neste contexto, examinar uma amostra biológica para evidenciação de crescimento celular desregulado (tal como expressão aberrante de 238P1B2 em cancros) possibilita a detecção precoce de tal fisiologia aberrante, antes de um 61 estado patológico tal como cancro que progrediu a um estágio que as opções terapêuticas são mais limitadas e ou o prognóstico é pior. Em tais exames, o status de 238P1B2 numa amostra biológica de interesse pode ser comparado, por exemplo, ao status de 238P1B2 numa amostra normal correspondente (por exemplo, uma amostra daquele indivíduo ou alternativamente outra indivíduo que não é afectado por um patologia). Um alteração no status de 238P1B2 na amostra biológica (como em comparação com a normal amostra) proporciona evidência de crescimento celular desregulado. Além de utilizar uma amostra biológica que não é afectada por uma patologia como um amostra normal, um pode também usar um valor normativo predeterminado tal como um nível predeterminado normal de expressão de ARNm (veja-se, por exemplo, Grever et al., J. Comp. Neurol. 1996 Dec 9; 376(2):306-14 e Patente U.S. No. 5.837.501) para comparar o status de 238P1B2 numa amostra. 0 termo "status" neste contexto é utilizado de acordo com seu significado aceito pela especialidade e refere-se à condição ou estado de um gene e seus produtos. Tipicamente, peritos na especialidade usam um número de parâmetros para avaliar a condição ou estado de um gene e sua produtos. Estes incluem, mas não são limitados à localização de produtos génicos expressos (incluindo a localização de células que expressam 238P1B2) bem como o nível, e actividade biológica de produtos génicos expressos (tal como ARNm de 238P1B2, os polinucleótidos e polipéptidos). Tipicamente, uma alteração no status de 238P1B2 compreende uma mudança na localização de 238P1B2 e/ou células que expressam 238P1B2 e/ou um aumento em ARNm de 238P1B2 e/ou expressão de proteína. 0 status de 238P1B2 numa amostra pode ser analisado por um número de meios bem conhecidos no estado da técnica, incluindo sem limitação, análise imunohistoquímica, hibridação in situ, análise de RT-PCR em amostras 62 microdissecadas de captura por laser, análise de Western blot, e análise de arranjo de tecido. Os protocolos típicos para avaliar o status de um gene de 238P1B2 e produtos génicos são encontrados, por exemplo, em Ausubel et al. eds., 1995, Current Protocols in Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) e 18 (PCR Analisys) . Assim, o status de 238P1B2 numa amostra biológica é avaliada por meio de vários métodos utilizados por peritos na especialidade incluindo, mas não são limitadas a análise de Southern genómica (para examinar, por exemplo, perturbações num gene de 238P1B2), análise de Northern e/ou análise de PCR de ARNm de 238P1B2 (para examinar, por exemplo, alterações nas sequências de polinucleótido ou níveis de expressão de ARNm de 238P1B2), e, análise Western e/ou imunohistoquímica (para examinar, por exemplo, alterações em sequências de polipéptido, alterações em localização de polipéptido dentro de uma amostra, alterações em níveis de expressão de proteínas 238P1B2 e/ou associações de proteínas 238P1B2 com parceiros de ligação a polipéptido). Os polinucleótidos detectáveis de 238P1B2 incluem, por exemplo, um gene de 238P1B2 ou fragmento do mesmo, ARNm de 238P1B2, variantes de splice alternativos, ARNm de 238P1B2, e moléculas de ADN ou ARN recombinantes que contêm um 238P1B2 polinucleótido. 0 perfil de expressão de 238P1B2 o torna um marcador diagnóstico para doença local e/ou metastasizada, e proporciona informação sobre o crescimento ou potencial oncogénico de uma amostra biológica. Em particular, o status de 238P1B2 proporciona informação útil para predizer susceptibilidade a estágios de doença particulares, progressão, e/ou agressividade de tumor. Descrevem-se métodos e ensaios para determinar 238P1B2 status e diagnóstico de cancros que expressam 238P1B2, tal como cancros dos tecidos listados no Quadro I. Por exemplo, devido a que ARNm de 238P1B2 é tão altamente expresso em 63 próstata e outros cancros em relação a tecido normal de próstata, ensaios que avaliam os níveis de ARNm de transcriptos de 238P1B2 ou proteínas numa amostra biológica podem ser utilizados para diagnosticar uma doença associada a desregulação de 238P1B2, e pode proporcionar informação de prognóstico útil em definir as opções terapêuticas apropriadas. 0 status de expressão de 238P1B2 proporciona informação incluindo a presença, estágio e localização de células displásicas, pré-cancerosas e cancerosas, predizendo a susceptibilidade a vários estágios de doença, e/ou for determinar a agressividade do tumor. Além disso, a perfil de expressão o torna útil como um reagente para a obtenção de imagens para doença metastasizada. Consequentemente, descrevem-se vários métodos de prognóstico e diagnóstico molecular para examinar o status de 238P1B2 em amostras biológicas tais como aqueles de indivíduos que sofrem de, ou suspeitos de sofrer de uma patologia caracterizada por crescimento celular desregulado, tal como cancro.

Como foi descrito anteriormente, o status de 238P1B2 numa amostra biológica pode ser examinado por um número de procedimentos bem conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, o status de 238P1B2 numa amostra biológica tomada de uma localização específica no corpo pode ser examinado pela avaliação da amostra para a presença ou ausência de células que expressam 238P1B2 (por exemplo, aqueles que expressam ARNm de 238P1B2 ou proteínas) . Este exame pode proporcionar evidência de crescimento celular desregulado, por exemplo, quando células que expressam 238P1B2 são encontradas numa amostra biológica que não contêm normalmente tais células (tal como um gânglio linfático), devido a que tais alterações no status de 238P1B2 numa amostra biológica são com frequência associados a crescimento celular desregulado. Especificamente, um 64 indicador de crescimento celular desregulado é a metástase de células de cancro de um órgão de origem (tal como a próstata) a uma área diferente do corpo (tal como um gânglio linfático) . Neste contexto, a evidência de crescimento celular desregulado é importante, por exemplo, devido a que metástases de gânglio linfático ocultas podem ser detectadas num proporção substancial de pacientes com cancro de próstata, e tais metástases são associadas a predictores conhecido de progressão de doença (veja-se, por exemplo, Murphy et al., Próstata 42(4):315-317 (2000); Su et al., Semin. Surg. Oncol. 18(1) : 17-28 (2000) e Freeman et al., J Urol 1995 Aug 154 (2 Pt 1):474-8).

Descrevem-se métodos para monitorizar produtos de gene de 238P1B2 pela determinação do status de produtos de gene de 238P1B2 expressos por células de um indivíduo que se suspeita que tenha uma doença associada a crescimento celular desregulado (tal como hiperplasia ou cancro) e então comparar o status assim determinado com o status de produtos de gene de 238P1B2 numa amostra normal correspondente. A presença de produtos aberrantes de gene de 238P1B2 na amostra de teste em relação à amostra normal proporciona uma indicação da presença de crescimento celular desregulado dentro das células do indivíduo.

Descrevem-se ensaios úteis na determinação da presença de cancro num indivíduo, que compreende detectar um aumento significativo em ARNm de 238P1B2 ou expressão de proteína numa amostra de célula ou tecido de teste em relação a níveis de expressão na correspondente célula ou tecido normal. A presença de ARNm de 238P1B2 pode, por exemplo, ser avaliada em amostras de tecido incluindo, mas não são limitadas a aqueles listados no Quadro I. A presença de expressão significativa de 238P1B2 em qualquer destes tecidos é útil para indicar a emergência, presença e/ou gravidade de um cancro, uma vez que os correspondentes tecidos normais não expressam ARNm de 238P1B2 ou o 65 expressam em níveis menores. 0 status de 238P1B2 pode ser determinado ao nível de proteína ao invés de ao nível de ácido nucleico. Por exemplo, tal método compreende determinar o nível de proteína 238P1B2 expressa por células num amostra de tecido de teste e comparar o nível assim determinado com o nível de 238P1B2 expressa numa amostra normal correspondente. A presença de proteína 238P1B2 pode ser avaliada, por exemplo, utilizando métodos de imunohistoquimica. 0 anticorpo contra 238PlB2s ou parceiros de ligação capazes de detectar a expressão de proteína 238P1B2 são utilizados numa variedade de formatos de ensaio bem conhecidos no estado da técnica para esta propósito. 0 status de sequências de nucleótido e aminoácidos 238P1B2 pode ser avaliado numa amostra biológica com a finalidade de identificar perturbações na estrutura destas moléculas. Estas perturbações podem incluir inserções, deleções, substituições e similares. Tais avaliações são úteis porque perturbações nas sequências de nucleótido e aminoácidos são observada num grande número de proteínas associadas a um fenótipo de crescimento desregulado (veja-se, por exemplo, Marrogi et al. , 1999, J. Cutan. Pathol. 26(8) :369-378) . Por exemplo, uma mutação na sequência de 238P1B2 pode ser indicativa da presença ou promoção de um tumor. Tais ensaios portanto têm diagnóstico e valor preditivo onde uma mutação em 238P1B2 indica uma potencial perda de função ou aumento em crescimento de tumor.

Uma ampla variedade de ensaios para observar perturbações em sequências de nucleótido e aminoácidos são bem conhecidas no estado da técnica. Por exemplo, o tamanho e estrutura de sequência de ácido nucleico ou aminoácidos de produtos de gene de 238P1B2 são observados pelos protocolos de Northern, Southern, Western, PCR e sequenciamento de ADN discutido no presente documento. Além disso, outros métodos para a observação de perturbações em 66 sequências de nucleótido e aminoácidos tais como análise de polimorfismo de conformação de cadeia simples são bem conhecidos no estado da técnica (veja-se, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5.382.510 depositada em 7 de Setembro de 1999, e 5.952.170 depositada em 17 de Janeiro de 1995).

Adicionalmente, se pode examinar o status de metilação de um gene de 238P1B2 numa amostra biológica. A desmetilação e/ou hipermetilação aberrante de ilhas CpG em regiões reguladoras 5' de gene com frequência ocorre em células imortalizadas e transformadas, e pode resultar em expressão alterada de vários genes. Por exemplo, hipermetilação de promotor da glutationa classe pi S-transferase (uma proteína expressa em próstata normal, mas não expressa em >90 % dos carcinomas de próstata) parece silenciar de maneira permanente a transcrição deste gene e é a alteração genómica detectada com mais frequência em carcinomas de próstata (De Marzo et ai., Am. J. Pathol. 155(6):1985-1992 (1999)). Além disso, esta alteração está presente em pelo menos 70 % de casos de neoplasia intraepitelial de próstata de alto grau (PIN) (Brooks et ai., Câncer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998,7:531-536). Em outro exemplo, a expressão do gene específico de tumor LAGE-I (que não é expressa em próstata normal, mas é expressa em 25-50 % de cancros de próstata) é induzida por desoxi-azacitidina em células linfoblastóide, sugerindo que a expressão tumoral é devida a desmetilação (Lete et ai., Int J. Câncer 76 (6):903-908 (1998)). Uma variedade de ensaios para examinar o status de metilação de um gene são bem conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, um pode utilizar, em abordagens de hibridação Southern, enzimas de restricção sensíveis a metilação que não podem clivar sequências qie contêm locais CpG metilados para avaliar o status de metilação de ilhas CpG. Além disso, MSP (PCR específica de metilação) pode rapidamente traçar o perfil do status de metilação de todos os locais CpG presentes num 67

Ilha de CpG de uma dada gene. Este procedimento envolve modificação inicial de ADN por bissulfito sódio (que converterá todas citosinas não metiladas a uracil) seguido por meio de amplificação utilizando iniciadores específicos para ADN metilado versus não metilado. Protocolos que envolvem interferência de metilação podem também ser encontrados, por exemplo, em Current Protocols In Molecular Biology, Unit 12, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995. A amplificação génica é um método adicional para a avaliação do status de 238P1B2. A amplificação génica é medida numa amostra directamente, por exemplo, por meio de Southern blotting ou Northern blotting convencionais para quantificar a transcrição de ARNm (Thomas, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:5201-5205), dot blotting (análise de ADN), ou hibridação in situ, utilizando uma sonda marcada de maneira apropriada, com base nas sequências proporcionadas no presente documento. Alternativamente, são utilizados anticorpos que reconhecem duplexes específicos, incluindo duplexes de ADN, duplexes de ARN, e duplexes hibridos de ADN-ARN ou duplexes de ADN-proteína. Os anticorpos por sua vez são marcados e o ensaio é levado a cabo onde o duplex é ligado a um superfície, de modo que após a formação de duplex na superfície, a presença de anticorpo ligado ao duplex pode ser detectada. O tecido ou sangue periférico submetido a biópsia pode ser de maneira conveniente ensaiado para a presença de células de cancro utilizando, por exemplo, Northern, dot blot ou análise de RT-PCR para detectar a expressão de 238P1B2. A presença de ARNm que pode ser amplificado por RT-PCR de 238P1B2 proporciona uma indicação da presença de cancro. Ensaios de RT-PCR são bem conhecidos no estado da técnica. Ensaios de detecção por RT-PCR para células de tumor em sangue periférico estão actualmente sendo avaliados para utilizar no diagnóstico e gestão de um número de tumores sólidos humanos. No campo de cancro de 68 próstata, estes incluem ensaios de RT-PCR para a detecção de células que expressam PSA e PSM (Verkaik et al, 1997, Urol. Res. 25:373-384; Ghossein et al. , 1995, J. Clin. Oncol. 13:1195-2000; Heston et al., 1995, Clin. Chem. 41:1687-1688) .

Descrevem-se uma avaliação da susceptibilidade que um indivíduo tem para desenvolver cancro. Descrevem-se um método para predizer a susceptibilidade a cancro que compreende detectar ARNm de 238P1B2 ou proteína 238P1B2 num amostra de tecido, sua presença a indicar a susceptibilidade a cancro, em que o grau de ARNm de expressão 238P1B2 se correlaciona ao grau de susceptibilidade. A presença de 238P1B2 em próstata ou outro tecido pode ser examinada, com a presença de 238P1B2 na amostra a proporcionar uma indicação de susceptibilidade a cancro de próstata (ou a emergência ou existência de um tumor de próstata). De maneira similar, um pode avaliar a integridade sequências de nucleótido e aminoácidos de 238P1B2 numa amostra biológica, com a finalidade de identificar perturbações na estrutura destas moléculas tais como inserções, deleções, substituições e similares. A presença de uma ou mais perturbações em produtos de gene de 238P1B2 na amostra é uma indicação de susceptibilidade a cancro (ou a emergência ou existência de um tumor).

Descrevem-se métodos para medir a agressividade do tumor. Um método para medir agressividade de um tumor pode compreender determinar o nível de ARNm de 238P1B2 ou proteína 238P1B2 expressa por células de tumor, comparando o nível assim determinado com o nível de ARNm de 238P1B2 ou proteína 238P1B2 expressa num tecido normal correspondente tomado do mesmo indivíduo ou uma amostra de referência de tecido normal, em que o grau de expressão de ARNm de 238P1B2 ou proteína 238P1B2 na amostra de tumor em relação à amostra normal indica o grau de agressividade. A agressividade de um tumor pode ser avaliada pela 69 determinação da extensão a qual 238P1B2 é expressa nas células de tumor, com maiores níveis de expressão a indicar tumores mais agressivos. Descrevem-se a avaliação da integridade de sequências de nucleótido e aminoácidos de 238P1B2 numa amostra biológica, com a finalidade de identificar perturbações na estrutura destas moléculas tais como inserções, deleções, substituições e similares. A presença de uma ou mais perturbações indica tumores mais agressivos.

Descrevem-se métodos para a observação da progressão de uma malignidade num indivíduo ao longo do tempo. Métodos para a observação da progressão de uma malignidade num indivíduo ao longo do tempo pode compreender determinar o nível de ARNm de 238P1B2 ou proteína 238P1B2 expressa por células numa amostra do tumor, comparando o nível assim determinado ao nível de ARNm de 238P1B2 ou proteína 238P1B2 expressa numa amostra de tecido equivalente tomada do mesmo indivíduo num momento diferente, em que o grau de expressão ARNm de 238P1B2 ou proteína 238P1B2 na amostra de tumor ao longo do tempo proporciona informação sobre a progressão do cancro. A progressão de um cancro pode ser avaliada pela determinação de expressão de 238P1B2 nas células de tumor ao longo do tempo, onde a expressão aumentada ao longo do tempo indica uma progressão do cancro. Também, um pode avaliar a integridade da sequências de nucleótido e aminoácidos de 238P1B2 numa amostra biológica com a finalidade de identificar perturbações na estrutura destas moléculas tais como inserções, deleções, substituições e similares, onde a presença de uma ou mais perturbações indica uma progressão do cancro.

As abordagens de diagnóstico anteriores podem ser combinadas com qualquer um de uma ampla variedade de protocolos de prognóstico e diagnóstico conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, descrevem-se métodos para a observação de uma coincidência entre a expressão de gene de 70 238Ρ1Β2 e produtos de gene de 238P1B2 (ou perturbações em gene de 238P1B2 e produtos de gene de 238P1B2) e um factor que é associado a malignidade, como um meio para o diagnóstico e prognóstico do status de uma amostra de tecido. Uma ampla variedade de factores associados a malignidade pode ser utilizada, tal como a expressão de genes associados a malignidade (por exemplo, expressão de PSA, PSCA e PSM para cancro de próstata etc.) bem como observações citológicas completas (veja-se, por exemplo, Bocking et al., 1984, Anal. Quant. Cytol. 6(2):74—88; Epstein, 1995, Hum. Pathol. 26(2):223-9; Thorson et al., 1998, Mod. Pathol. 11(6):543-51; Baisden et al., 1999, Am. J. Surg. Pathol. 23(8):918-24). Métodos para a observação de uma coincidência entre a expressão de gene de 238P1B2 e produtos de gene de 238P1B2 (ou perturbações em gene de 238P1B2 e produtos de gene de 238P1B2) e outro factor que é associados a malignidade são úteis, por exemplo, devido a que a presença de um conjunto de factores específicos que coincidem com doença proporciona informação crucial para o diagnóstico e prognóstico do status de uma amostra de tecido. Métodos para a observação de uma coincidência entre a expressão de gene de 238P1B2 e produtos de gene de 238P1B2 (ou perturbações em gene de 238P1B2 e produtos de gene de 238P1B2) e outro factor associado a malignidade pode envolver detectar a sobreexpressão de ARNm de 238P1B2 ou proteína numa amostra de tecido, detectar a sobreexpressão de ARNm ou proteína de PSA numa amostra de tecido (ou expressão de PSCA ou PSM), e observar uma coincidência de ARNm ou proteína de 238P1B2 e sobreexpressão ARNm ou proteína de PSA (ou expressão de PSCA ou PSM). A expressão de ARNm de 238P1B2 e PSA em tecido de próstata pode ser examinado, onde a coincidência de sobreexpressão ARNm de 238P1B2 e PSA na amostra indica a existência de cancro de próstata, susceptibilidade a cancro de próstata ou a 71 emergência ou status de um tumor de próstata. Métodos para detectar e quantificar a expressão de ARNm ou proteína de 238P1B2 são descritos no presente documento, e tecnologias padrão para a detecção e quantificação de ácido nucleico e proteína são bem conhecidas no estado da técnica. Métodos padrão para a detecção e quantificação de ARNm de 238P1B2 incluem hibridação in situ utilizando ribosondas de 238P1B2 marcadas, Northern blot e técnicas relacionadas utilizando sondas de polinucleótidode 238P1B2, análise de RT-PCR utilizando iniciadores específicos para 238P1B2, e outros métodos de detecção de tipo amplificação, tal como, por exemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA e similares. RT-PCR semi-quantitativa pode ser utilizada para detectar e quantificar expressão de ARNm de 238P1B2. Qualquer número de iniciadores capaz de amplificar 238P1B2 pode ser utilizado para este propósito, incluindo, mas não são limitadas aos vários conjuntos de iniciadores especificamente descritos no presente documento. Anticorpos policlonais ou monoclonais podem ser especificamente reactivos com a proteína de tipo selvagem 238P1B2 pode ser utilizado num ensaio de imunohistoquímica de tecido submetido a biópsia. VI.) Identificação de Moléculas Que interagem Com 238P1B2 A proteína 238P1B2 e sequências de ácido nucleico reveladas no presente documento possibilitam que um perito na especialidade identifique proteínas, moléculas pequenas e outros agentes que interagem com 238P1B2, bem como vias activadas por 238P1B2 via qualquer um de uma variedade de protocolos aceitos na técnica. Por exemplo, um pode utilizar um dos denominados sistemas de captura de interacção (também referido como o "ensaio de dois híbridos"). Em tais sistemas, as moléculas interagem e reconstituem um factor de transcrição que dirige a expressão de um gene repórter, depois da expressão do gene 72 repórter é ensaiado. Outros sistemas identificam interacções proteína-proteína in vivo através de reconstituição de um activador transcricional eucariótico, veja-se, por exemplo, Patente U.S. Nos. 5.955.280 depositada em 21 de Setembro de 1999, 5.925.523 depositada em 20 de Julho de 1999, 5.846.722 depositada em 8 de Dezembro de 1998 e 6.004.746 depositada em 21 de Dezembro de 1999. Algoritmos são também disponíveis no estado da técnica para predições com base em genoma de proteína função (veja-se, por exemplo, Marcotte, et al., Nature 402:4 Novembro de 1999, 83-86).

Alternativamente um pode seleccionar bibliotecas de péptido para identificar moléculas que interagem com proteína sequências de 238P1B2. Em tais métodos, péptidos que se ligam a 238P1B2 são identificadas pela selecção de bibliotecas que codificam uma colecção randómica ou controlada de aminoácidos. Péptidos codificados pelas bibliotecas são expressos como proteínas de fusão de proteínas de envoltório de bacteriófago, as partículas bacteriófago são então seleccionadas contra a(s) proteína(s) 238P1B2.

Consequentemente, péptidos que tem uma ampla variedade de utilizações, tal como agente terapêutico, reagentes de prognóstico ou diagnóstico, são assim identificados sem qualquer informação anterior sobre a estrutura da molécula de ligando ou receptor esperada. Bibliotecas de péptido típicas e métodos de selecção que podem ser utilizadas para identificar moléculas que interagem com sequências de proteína 238P1B2 são reveladas, por exemplo, em Patente U.S. Nos. 5.723.286 depositada em 3 de Março de 1998 e 5.733.731 depositada em 31 de Março de 1998.

Alternativamente, linhas de células que expressam 238P1B2 são utilizadas para identificar interacções proteína-proteína mediadas por 238P1B2. Tais interacções podem ser examinadas utilizando técnicas de 73 imunoprecipitação (veja-se, por exemplo, Hamilton B.J., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 261:646-51). A proteína 238P1B2 pode ser imunoprecipitada de linhas de células que expressam 238P1B2 utilizando anticorpos anti-238P1B2. Alternativamente, anticorpos contra etiqueta de His pode ser utilizado numa linha célula engenheirada para expressar fusões de 238P1B2 e uma etiqueta de His (vectores mencionados anteriormente). 0 complexo imunoprecipitado pode ser examinado para associação de proteína por meio de procedimentos tais como Western blotting, marcação de proteínas com metionina 35S, microsequenciamento de proteína, cloração com prata e electroforese bidimensional em gel.

Moléculas pequenas e ligandos que interagem com 238P1B2 podem ser identificadas através de ensaios de rastreio relacionados. Por exemplo, moléculas pequenas podem ser identificadas que interferem com função de proteína, incluindo moléculas que interferem com capacidade 238P1B2 de mediar a interacção de fosforilação e desf osf orilação, com moléculas de ADN ou ARN como uma indicação de ciclos de regulação de célula, segundo sinalização de mensageiro ou tumorigénese. De maneira similar, moléculas pequenas que modulam canal iónico relacionado a 238P1B2, bomba de proteína, ou funções comunicação de célula são identificadas e utilizadas para tratar pacientes que têm um cancro que expressa 238P1B2 (veja-se, por exemplo, Hille, B., Ionic Channels of Excitable Membranes 2a Ed., Sinauer Assoe., Sunderland, MA, 1992). Além disso, ligandos que regulam a função de 238P1B2 podem ser identificados com base em sua capacidade ligar 238P1B2 e activar uma construção repórter. Métodos típicos são discutidos, por exemplo, na Patente U.S. No. 5.928.868 depositado em 27 de Julho de 1999, e incluem métodos para formar ligandos híbridos em que pelo menos um ligando é uma molécula pequena. Num método ilustrativo, células 74 engenheiradas para expressar uma proteína de fusão de 238P1B2 e uma proteína de ligação a ADN são utilizadas para co-expressa uma proteína de fusão de um ligando híbrido/molécula pequena e uma proteína activadora transcricional de biblioteca de ADNc. As células ainda contêm um gene repórter, cuja expressão é condicionada na proximidade da primeira e segunda proteínas de fusão entre si, um evento que ocorre somente se o ligando híbrido liga-se aos locais alvo em ambas proteínas híbridas. Aquelas células que expressam o gene repórter são seleccionadas e a molécula pequena desconhecida ou o ligando desconhecido é identificado. Este método proporciona um meio de identificação de moduladores que activam ou inibem 238P1B2.

Descreve-se um método de rastreio para uma molécula que interage com uma sequência de aminoácidos de 238P1B2 mostrada na Figura 2 ou a Figura 3, que compreende as etapas de colocar em contacto uma população de moléculas com uma sequência de aminoácidos de 238P1B2, que permite a população de moléculas e a sequência de aminoácidos de 238P1B2 interactuar sob condições que facilitam uma interacção, determinar a presença de uma molécula que interage com a sequência de aminoácidos de 238P1B2, e então separar moléculas que não interactuam com a sequência de aminoácidos de 238P1B2 de moléculas que o fazem. 0 método pode ainda compreender purificar, caracterizar e identificar uma molécula que interage com a sequência de aminoácidos de 238P1B2. A molécula identificada pode ser utilizada para modular uma função realizada por 238P1B2. A sequência de aminoácidos de 238P1B2 pode ser colocada em contacto com um biblioteca de péptidos. VII.) Métodos de Diagnóstico e Prognóstico.

Como é revelado no presente documento, os polinucleótidos de 238P1B2, polipéptidos, células T citotóxicas reactivas (CTL), células T auxiliares reactivas (HTL) e anticorpos anti-polipéptido podem ser utilizados em 75 ensaios de diagnóstico; prognóstico e terapêutico bem conhecidos que examinam as condições associadas a crescimento celular desregulado tal como cancro, em particular os cancros listados no Quadro I (veja-se, por exemplo, tanto seu padrão especifico de expressão em tecido bem como sua sobreexpressão em certos cancros como é descrito, por exemplo, no Exemplo 4). 238P1B2 pode ser comparada a um antigénio de PSA associado a próstata, o marcador arquétipo que tem sido utilizado pelos médicos clínicos durante anos para identificar e monitorizar a presença de cancro de próstata (veja-se, por exemplo, Merrill et al. , J. Urol. 163(2): 503-5120 (2000); Polascik et al. , J. Urol. Aug; 162(2):293-306 (1999) e Fortier et al., J. Nat. Câncer Inst. 91 (19): 1635-1640(1999)). Uma variedade de outros marcadores de diagnóstico são também utilizados em contextos similares incluindo p53 e K-ras (veja-se, por exemplo, Tulchinsky et al., Int J Mol Med 1999 Jul 4(1):99-102 e Minimoto et al., Câncer Detect Prev 2000;24(1): 1-12). Portanto, esta revelação de polinucleótidos de 238P1B2 e polipéptidos (bem como sondas de polinucleótido de 238P1B2 e anticorpos anti-238P1B2 utilizados para identificar a presença destas moléculas) e suas propriedades possibilita que os peritos na especialidade utilizem estas moléculas em métodos que são análogos a aqueles utilizados, por exemplo, numa variedade de ensaios de diagnóstico dirigidos para examinar condições associadas a cancro. Métodos de diagnóstico típicos que utilizam os polinucleótidos de 238P1B2, polipéptidos, células T reactivas e anticorpos são análogos a aqueles métodos de ensaios de diagnóstico bem estabelecidos que utilizam, por exemplo, polinucleótidos de PSA, polipéptidos, células T reactivas e anticorpos. Por exemplo, assim como polinucleótidos de PSA são utilizados como sondas (por exemplo em análise Northern, veja-se, por exemplo, Sharief 76 et al., Biochem. Mol. Biol. Int. 33(3):567-74(1994)) e iniciadores (por exemplo em PCR análise, veja-se, por exemplo, Okegawa et al. , J. Urol. 163(4): 1189-1190 (2000)) para observar a presença e/ou o nivel de ARNm de PSA em métodos de monitorização sobreexpressão de PSA ou a metástase de cancros de próstata, os polinucleótidos de 238P1B2 descritos no presente documento pode ser utilizados do mesmo modo para detectar a sobreexpressão de 238P1B2 ou a metástase de próstata e outros cancros que expressam este gene. Alternativamente, assim como polipéptidos de PSA são utilizados para gerar anticorpos específicos para PSA que pode então ser utilizado para observar a presença e/ou o nível de proteínas de PSA em métodos para monitorizar a sobreexpressão de proteína de PSA (veja-se, por exemplo, Stephan et ai., Urology 55(4):560-3 (2000)) ou a metástase de células de próstata (veja-se, por exemplo, Alanen et ai., Pathol. Res. Pract. 192(3):233-7 (1996)), os polipéptidos 238P1B2 descritos no presente documento podem ser utilizados para gerar anticorpos para utilizar em detectar a sobreexpressão de 238P1B2 ou a metástase de células de próstata e células de outros cancros que expressam este gene.

Especificamente, devido a que metástases envolvem o movimento de células de cancro de um órgão de origem (tal como o pulmão ou glândula prostática etc.) a uma área diferente do corpo (tal como um gânglio linfático), ensaios que examinam uma amostra biológica para a presença de células que expressam polinucleótidos de 238P1B2 e/ou polipéptidos podem ser utilizados para proporcionar evidência de metástase. Por exemplo, quando uma amostra biológica de tecido que normalmente não contém células que expressam 238P1B2 (gânglio linfático) é encontrado que contém células que expressam 238P1B2 tais como a expressão de 238P1B2 vista em LAPC4 e LAPC9, xenoenxertos isolados de gânglio linfático e metástase óssea, respectivamente, este 77 achado é indicativo de metástase.

Alternativamente polinucleótidos e/ou polipéptidos de 238P1B2 podem ser utilizados para proporcionar evidência de cancro, por exemplo, quando células numa amostra biológica que normalmente não expressam 238P1B2 ou expressam 238P1B2 a um nível diferente são encontradas que expressam 238P1B2 ou têm uma expressão aumentada de 238P1B2 (veja-se, por exemplo, a expressão de 238P1B2 nos cancros listados no Quadro I e em amostras de paciente etc. mostrado nas figuras que acompanham) . Em tais ensaios, peritos pode ainda desejar gerar evidência suplementar de metástase testando a amostra biológica para a presença de um segundo marcador restrito de tecido (além de 238P1B2) tal como PSA, PSCA etc. (veja-se, por exemplo, Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996)).

Assim como fragmentos de polinucleótido e polivariantes nucleotidicas de PSA são utilizados pelos peritos na especialidade para utilizar em métodos de monitorização PSA, fragmentos de 238P1B2 de polinucleótido e polivariantes nucleotidicas são utilizadas num maneira análoga. Em particular, polinucleótidos de PSA típicos utilizados em métodos de monitorização PSA são sondas ou iniciadores que consistem em fragmentos da sequência de ADNc de PSA. Ilustrando isto, iniciadores utilizados para amplificar por meio de PCR um polinucleótido de PSA deve incluir menos da sequência de PSA completa para funcionar na reacção em cadeia da polimerase. No contexto de tais reacções de PCR, peritos na especialidade geralmente criam uma variedade de diferente fragmentos de polinucleótido que podem ser utilizados como iniciadores com a finalidade de amplificar diferentes porções de um polinucleótido de interesse ou optimizar as reacções de amplificação (veja-se, por exemplo, Caetano-Anolles, G. Biotechniques 25(3): 472-476, 478-480 (1998); Robertson et al., Methods Mol. Biol. 98:121-154 (1998)). Uma ilustração adicional do uso 78 de tais fragmentos é proporcionado no Exemplo 4, onde um fragmento de polinucleótido de 238P1B2 é utilizado como uma sonda para mostrar a expressão de ARN de 238P1B2 em células de cancro. Além disso, sequências de polinucleótido variantes são tipicamente utilizadas como iniciadores e sondas para o ARNm correspondente em análises de PCR e Northern (veja-se, por exemplo, Sawai et al., Fetal Diagn. Ther. 1996 Νον-Dez 11(6):407-13 e Current Protocols In Molecular Biology, Volume 2, Unidade 2, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995)). Fragmentos de polinucleótido e variantes são úteis neste contexto onde são capazes de se ligar a um alvo sequência de polinucleótido (por exemplo, um polinucleótido de 238P1B2 mostrado na Figura 2 ou variante do mesmo) sob condições de restringência elevada.

Além disso, polipéptidos de PSA que contêm um epítopo que pode ser reconhecido por um anticorpo ou célula T que se liga especificamente a esse epítopo são utilizados em métodos de monitorização PSA. Fragmentos de polipéptido de 238P1B2 e análogos ou variantes de polipéptido podem também ser utilizados numa maneira análoga. Esta prática de utilização de fragmentos de polipéptido ou variantes polipeptídicas para gerar anticorpos (tal como anticorpos anti-PSA ou células T) é típica no estado da técnica com uma ampla variedade de sistemas tais como proteínas de fusão sendo utilizada pelos peritos (veja-se, por exemplo, Current Protocols In Molecular Biology, Volume 2, unidade 16, Frederick M. Ausubel et al. eds., 1995) . Neste contexto, cada epítopo funciona para proporcionar a arquitectura com que um anticorpo ou célula T é reactiva. Tipicamente, peritos na especialidade criam uma variedade de diferentes fragmentos de polipéptido que podem ser utilizados com a finalidade de gerar respostas imunes específicas para porções diferentes de um polipéptido de interesse (veja-se, por exemplo, Patente U.S. No. 5.840.501 e Patente U.S. No. 5.939.533). Por exemplo pode ser 79 preferível utilizar um polipéptido que compreende um dos motivos biológicos de 238P1B2 discutidos no presente documento ou uma subsequência que contém um motivo que é prontamente identificado por um perito na especialidade com base em motivos disponíveis no estado da técnica. Fragmentos de polipéptido, variantes ou análogos são tipicamente úteis neste contexto contanto que compreendam um epítopo capaz de gerar um anticorpo ou célula T especifico para uma sequência de polipéptido alvo (por exemplo, um polipéptido 238P1B2 mostrado na Figura 3).

Como é mostrado no presente documento, os polinucleótidos de 238P1B2 e polipéptidos (bem como as sondas de polinucleótido de 238P1B2 e anticorpos anti-238P1B2 ou células T utilizadas para identificar a presença destas moléculas) exibem propriedades específicas que os tornam úteis em diagnosticar cancros tais como aqueles listados no Quadro I. Ensaios de diagnóstico que medem a presença de produtos de gene de 238P1B2, com a finalidade de avaliar a presença ou surgimento de uma condição patológica descrita no presente documento, tal como cancro de próstata, são utilizados para identificar pacientes para medidas preventivas ou monitorização adicional, como tem sido feito de forma tão bem sucedida com PSA. Além disso, estes materiais satisfazem uma necessidade no estado da técnica para moléculas que tem características similares ou complementares a PSA em situações onde, por exemplo, um diagnóstico definitivo de metástase de origem prostática não podem ser feitos com base num teste para PSA sozinho (veja-se, por exemplo, Alanen et al., Pathol. Res. Pract. 192(3): 233-237 (1996)), e consequentemente, materiais tais como polinucleótidos e polipéptidos de 238P1B2 (bem como as sondas de polinucleótido de 238P1B2 e anticorpos anti-238P1B2 utilizados para identificar a presença destas moléculas) precisam ser utilizados para confirmar uma metástase de origem prostática. 80

Finalmente, além de seu uso em ensaios de diagnóstico, os polinucleótidos de 238P1B2 revelados no presente documento têm um número de outras utilidades tais como seu uso na identificação de anomalias cromossómicas associadas a oncogenética na região cromossómica a qual o gene de 238P1B2 mapeia (veja-se o Exemplo 3 a seguir). Além disso, além de seu uso em ensaios de diagnóstico, as proteínas relacionadas com 238P1B2 e polinucleótidos reveladas no presente documento têm outras utilidades tais como seu uso na análise forense de tecidos de origem desconhecida (veja-se, por exemplo, Takahama K Forensic Sei Int 1996 Jun de 28; 80 (1-2) : 63-9) .

Adicionalmente, proteínas ou polinucleótidos relacionadas com 238P1B2 descritos no presente documento podem ser utilizados para tratar uma condição patológica caracterizada pela sobre-expressão de 238P1B2. Por exemplo, a sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos da Figura 2 ou a Figura 3, ou fragmentos de ambos, pode ser utilizada para gerar uma resposta imune a um antigénio de 238P1B2. Anticorpos ou outras moléculas que reagem com 238P1B2 podem ser utilizadas para modular a função desta molécula, e deste modo proporcionam um benefício terapêutico. VIII.) Kits

Para utilização no diagnóstico e aplicações terapêuticas descritas no presente documento, são também descritos kits no presente documento. Tais kits podem compreender um portador, pacote ou contentor que é dividido em compartimentos para receber um ou mais contentores tais como frascos, tubos, e similares, cada um do(s) contentor(es) que compreende um dos elementos separados a ser utilizado no método. Por exemplo, o(s) contentor(es) pode(m) compreender uma sonda que é ou pode ser marcada de maneira detectável. Tal sonda pode ser um anticorpo ou polinucleótido específico para uma proteína relacionada com 238P1B2 ou um gene de 238P1B2 ou mensagem, respectivamente. 81

Onde o método utiliza hibridação de ácido nucleico para detectar o ácido nucleico alvo, o kit pode também ter contentores que contêm nucleótido(s) para amplificação de a sequência de ácidos nucleicos alvo e/ou um contentor que compreende um meio de repórter, tal como uma proteína de ligação a biotina, tal como avidina ou estreptavidina, ligado a uma molécula repórter, tal como um marcador enzimático, florescente, ou radioisótopo. o kit pode incluir toda ou parte da sequência de aminoácidos da Figura 2 ou a Figura 3 ou análogos do mesmo, ou uma molécula de ácido nucleico que codifica tais sequências de aminoácidos. 0 kit tipicamente compreenderá o contentor descrito anteriormente e um ou mais outros contentores que compreendem materiais desejáveis desde um ponto de vista comercial e do utilizador, incluindo tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, e folhetos explicativos com instruções para utilizar.

Um marcador pode estar presente no contentor para indicar que a composição é utilizada para uma terapêutica especifica ou aplicação não terapêutica, e pode também indicar direcções para utilização in vivo ou in vitro, tal como aqueles descritos anteriormente. Direcções e ou outra informação pode também ser incluída num folheto explicativo que é incluído com o kit. EXEMPLOS: EXEMPLOS: Vários aspectos da invenção são descritos adicionalmente e ilustrados por meio dos diversos exemplos que seguem, nenhum dos quais têm a intenção de limitar o âmbito da invenção.

Exemplo 1: Isolamento Gerado por SSH de um Fragmento de ADNc do gene de 238P1B2 0 procedimento de Hibridação Subtractiva de Supressão (SSH) utilizando ADNc derivado de tecidos de cancro de paciente é utilizado para isolar genes que são sobre- 82 expressos em cancro. A sequência de ADNc SSH de 238P1B2 foi derivada de um agrupamento de cancro de cólon menos subtracção de ADNc de tecido normal. Incluidos no teste foram ADNc derivados de 10 tecidos normais. O ADNc de 238P1B2 foi identificado como altamente expresso no agrupamento de tecido de cancro de próstata, com expressão restrita detectada em tecidos normais. A sequência de SSH ADN de 210 pb (Figura 1) é nova, mas mostra homologia ao ARNm de receptor olfactivo de ratinho M0R14-10. Um ADNc de 238P1B2, 238PlB2-clone A, de 3754 pb foi isolado de biblioteca de ADNc de próstata, revelando uma ORF de 254 aminoácidos (Figura 2, Figura 3 e Figura 4A).

Materiais e Métodos Tecidos humanos:

Os tecidos normais e de cancro de paciente foram comprados de fontes diferentes tais como o NDRI (Filadélfia, PA) . ARNm para alguns tecidos normais foram comprados de Clontech, Paio Alto, CA.

Isolamento de ARN:

Tecidos foram homogeneizados em reagente Trizol (Life Technologies, Gibco BRL) utilizando 10 ml/ g de ARN total de isolado de tecido. ARN de Poli A foi purificado de ARN total utilizando Mini e Midi kits de ARNm Oligotex de Qiagen. Total e ARNm foram quantificados por análise espectrofotométrica (O.D. 260/280 nm) e analisado por electroforese em gel.

Oligonucleótidos:

Os seguintes oligonucleótidos purificados por HPLC foram utilizados. DPNCDN (iniciador de síntese de ADNc): 5 ' TTTTGATCAAGCTT303 '

Adaptador 1:

5'CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAG3' (SEQ ID NO: 708) 83 3'GGCCCGTCCTAG5'

Adaptador 2: 5'GTAATACGACTCACTATAGGGCAGCGTGGTCGCGGCCGAG3' 3'CGGCTCCTAG3' iniciador de PCR 1; 5'CTAATACGACTCACTATAGGGC3'

Iniciador interno (NP) 1: 5'TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGA3'

Iniciador interno (NP) 2: 5'AGCGTGGTCGCGGCCGAGGA3'

Hibridação Subtractiva de Supressão:

Hibridação Subtractiva de Supressão (SSH) foi utilizada para identificar ADNc correspondente a genes que são expressos diferencialmente em cancro. A reacção de SSH utilizou ADNc de cancro de cólon e tecidos normais. A sequência de gene de 238P1B2 foi derivada de um agrupamento de cancro de cólon menos subtracção de ADNc de tecido normal. A sequência de SSH ADN (Figura 1) foi identificada. 0 ADNc derivado de um agrupamento de tecidos normais foi utilizado como a fonte do ADNc de "teste", enquanto o ADNc de um agrupamento de tecidos de cancro de paciente foi utilizado como a fonte do ADNc de "teste". ADNc de cadeia dupla correspondentes a ADNc de teste e controlo foram sintetizados a partir de 2 pg de poli (A) + ARN isolado do relevante tecido de xenoenxerto, como é descrito acima, utilizando Kit de Subtracção de ADNc de Selecção por PCR de CLONTECH e 1 ng de oligonucleótido DPNCDN como iniciador. Sintese da primeira e da segunda cadeia foi levada a cabo como é descrito no Protocolo de manual de utilizador de kit (Protocolo de CLONTECH N° PT1117-1, Catálogo N° K1804-1). 0 ADNc resultante foi digerido com Dpn II durante 3 hrs a 37 °C. ADNc digerido foi extraído com fenol/clorofórmio (1:1) e etanol precipitado. 84 ADNc de teste foi gerado combinando numa razão 1:1 Dpn II ADNc digerido da relevante fonte de tecido (veja-se acima) com uma mistura de ADNc digerido derivado dos nove tecidos normais: estômago, músculo esquelético, pulmão, cérebro, fígado, rim, pâncreas, intestino delgado, e coração. ADNc de teste foi gerado diluindo 1 μΐ de ADNc digerido por Dpn II da relevante fonte de tecido (veja-se acima) (400 ng) em 5 μΐ de água. 0 ADNc diluído (2 μΐ, 160 ng) foi então ligado a 2 μΐ de Adaptador 1 e Adaptador 2 (10 μΜ), em reacções de ligação separadas, num volume total de 10 μΐ a 16 °C durante a noite, utilizando 400 u de T4 ADN ligase (CLONTECH). A ligação foi terminada com 1 μΐ de 0,2 M EDTA e aquecimento a 72 °C durante 5 min. A primeira hibridação foi realizada por meio da adição de 1,5 μΐ (600 ng) de ADNc de teste a cada um dos dois tubos que contêm 1,5 μΐ (20 ng) de ADNc de teste ligado a Adaptador 1 e Adaptador 2. Num volume final de 4 μΐ, as amostras foram cobertas com óleo mineral, desnaturadas num termociclador de MJ Research a 98 °C durante 1,5 minutos, e então permitiu-se que hibridem durante 8 hrs a 68 °C. As duas hibridações foram então misturadas juntamente com um 1 μΐ adicional de ADNc de teste recentemente desnaturado e permitiu-se que hibridem durante a noite a 68 °C. A segunda hibridação foi então diluída em 200 μΐ de 20 mM de Hepes, pH 8,3, 50 mM de NaCl, 0,2 mM de EDTA, aquecida a 70 °C durante 7 min. e armazenada a -20 °C.

Amplificação por PCR, Clonagem e Sequenciamento de Fragmentos de Gene Gerados a partir de SSH:

Para amplificar fragmentos de gene resultantes de reacções de SSH, duas amplificações por PCR foram realizadas. Na reacção de PCR primária 1 μΐ da mistura de hibridação final diluída foi adicionado a 1 μΐ de iniciador de PCR 1 (10 uM), 0,5 μΐ de mistura de dNTP (10 μΜ), 2,5 μΐ 10 x tampão de reacção (CLONTECH) e 0,5 μΐ 50 x Mistura de 85 ADNc polimerase Advantage (CLONTECH) num volume final de 25 μΐ. PCR 1 foi conduzida utilizando as seguintes condições: 75 °C durante 5 min., 94 °C durante 25 s, então 27 ciclos de 94 °C durante 10 s, 66 °C durante 30 s, 72 °C durante 1,5 min. Cinco reacções de PCR primárias separadas foram realizadas para cada experiência. Os produtos foram agrupados e diluídos 1:10 com água. Para a reacção de PCR secundária, 1 μΐ da reacção de PCR primária agrupada e diluída foi adicionado à mesma mistura de reacção como é utilizado para PCR 1, excepto que iniciadores NP 1 e NP2 (10 μΜ) foram utilizados ao invés de iniciador de PCR 1. PCR 2 foi realizada utilizando 10-12 ciclos de 94 °C durante 10 s, 68 °C durante 30 s, e 72 °C durante 1,5 minutos. Os produtos de PCR foram analisados utilizando 2 % electroforese em gel de agarose.

Os produtos de PCR foram inseridos em pCR2.1 utilizando o kit de clonagem de vector T/A (Invitrogen). E. coli transformadas foram submetidas a selecção de azul/branco e ampicilina. Colónias brancas foram colhidas e arranjadas em placas de 96 poços e foram crescidas em cultura líquida durante a noite. Para identificar inserções, amplificação por PCR foi realizada em 1 ml de cultura bacteriana utilizando as condições de PCR1 e NP1 e NP2 como iniciadores. Os produtos de PCR foram analisados utilizando 2 % de electroforese em gel de agarose.

Clones bacterianos foram armazenados em 20 % glicerol num formato de 96 poços. ADN de plasmídeo foi preparado, sequenciado, e submetido a pesquisas de homologia de ácido nucleico das bases de dados GenBank, dBest, e NCI-CGAP. Análise de Expressão por RT-PCR: ADNc de primeira cadeia pode ser gerado a partir de 1 pg de ARNm com iniciação com oligo (dT)12-18 utilizando o sistema Gibco-BRL Superscript Preamplification. O protocolo do fabricante foi utilizado o qual incluiu uma incubação durante 50 min a 42 °C com transcriptase reversa seguida 86 por tratamento RNAse H a 37 °C durante 20 min. Após completar a reacção, o volume pode ser aumentado a 200 μΐ com água antes de normalização. ADNc de primeira cadeia de 16 tecidos humanos normais diferentes podem ser obtidos de Clontech.

Normalização dos ADNc da primeira cadeia de múltiplos tecidos foi realizada utilizando os iniciadores 5'atatcgccgcgctcgtcgtcgacaa3 ' e 5'agccacacgcagctcattgtagaagg 3' para amplificar β-actina. ADNc de primeira cadeia (5 μΐ) foram amplificados num volume total de 50 μΐ que contêm 0,4 μΜ de iniciadores, 0,2 μΜ de dNTP cada, 1XPCR tampão (Clontech, 10 mM de Tris-HCL, 1,5 mM de MgCl2, 50 mM de KC1, pH8,3) e IX Klentaq ADN polimerase (Clontech). Cinco μΐ da reacção de PCR podem ser retirados a 18, 20, e 22 ciclos e utilizados para electroforese em gel de agarose. PCR foi realizada utilizando um termociclador de MJ Research sob as seguintes condições: Desnaturação inicial pode ser a 94 °C durante 15 sec, seguida por um 18, 20, e 22 ciclos de 94 °C durante 15, 65 °C durante 2 min, 72 °C durante 5 sec. Uma extensão final a 72 °C foi levada a cabo durante 2 min. Após electroforese em gel de agarose, as intensidades de banda das bandas de β-actina de 283 pb de múltiplos tecidos foram comparadas por inspecção visual. Factores de diluição para o ADNc da primeira cadeia foram calculados para ter como resultado intensidades de banda β-actina iguais em todos tecidos após 22 ciclos de PCR. Três rondas de normalização podem ser requeridas para alcançar intensidades de banda iguais em todos os tecidos após 22 ciclos de PCR.

Para determinar níveis de expressão do gene de 238P1B2, 5 μΐ de ADNc da primeira cadeia normalizado foram analisados por meio de PCR utilizando 26, e 30 ciclos de amplificação. Análise de expressão semi-quantitativa pode ser alcançada por meio da comparação dos produtos de PCR nos números de ciclo que dão intensidades de banda de luz. 87

Os iniciadores utilizados para RT-PCR foram desenhados utilizando a sequência de 238P1B2 SSH e são listados a seguir: 238P1B2.1 5'- TTGCAGAATATCACCTCCACTTCC -3' 238P1B2.2 5'- GATCAGGCTGTTTCCCAAGAGAG -3'

Uma análise de expressão de RT-PCR tipica é mostrada na Figura 14. A análise de expressão de RT-PCR foi realizada em ADNc da primeira cadeia gerados utilizando agrupamentos de tecidos de múltiplas amostras. Os ADNc mostraram ser normalizados utilizando beta-actina PCR. Os resultados mostram forte expressão de 238P1B2 em agrupamento de cancro de próstata, mas não em agrupamento vital 1 e agrupamento vital 2.

Exemplo 2: Clonagem de Comprimento Completo de 238P1B2 A sequência de ADNc SSH de 238P1B2 foi derivada de um agrupamento de cancro de cólon menos subtracção de ADNc de tecido normal. A Sequência de SSH ADNc (Figura 1) foi denominada 238P1B2. A sequência de SSH ADN de 210 pb (Figura 1) é nova e mostra 91 % de identidade ao ARNm de receptor olfactivo de ratinho MOR14-10.

Um ADNc de comprimento completo (238PlB2-clone A) de 3754 pb foi isolado de biblioteca de próstata, revelando uma ORF de 254 aminoácidos (Figuras 2 e 3) . O ADNc mostra homologia mais alta aos receptores olfactivos de ratinho MOR-14-1 e MOR14-10, com identidades de 85 % em 912 nucleótidos e 83 % em 906 nucleótidos respectivamente (Figura 4). A sequência de proteína revela 7 domínios transmembrana e tem homologia a receptores acoplados a proteína G (GPCR) envolvidos em olfacção (Raming et al., 1993, Nature 361: 353; Malnic et al. , 1999, Cell 96:713).

Proteínas que são membros desta família de receptores 88 exibem um terminal amino extracelular, três voltas extracelulares adicionais, três voltas intracelulares e um terminal carboxilo intracelular. A sequência mais homóloga a 238P1B2 é proteína de ratinho M0R14-1. As duas proteínas partilham 83 % de identidade numa região de 253 aminoácidos. 0 alinhamento das duas proteínas é mostrado na Figura 4. 238P1B2 também mostra homologia significativa ao GPCR especifico a próstata, PHOR-1. As duas proteínas partilham 48 % de identidade numa região de 250 aminoácidos (Figura 4) . O comprimento completo ADNc de 238P1B2 (238PlB2-clone A) foi depositado com a Colecção Americana de Cultura Celular em 7 de Março de 2002, e atribuído número de acesso PTA-4124. A sequência de proteína 238P1B2 v.lA codifica uma proteína transmembrana de seis. A extensão da proteína no terminal amino adiciona outra 62 aminoácidos a 238P1B2 v.lA o que leva a 238P1B2 v.lB. Esta terminal de 62 aminoácidos de 238P1B2 v.lB codifica uma região transmembrana adicional, e tornando deste modo 238P1B2 v.l B uma proteína transmembrana de sete. Além disso, este terminal amino mostra 84 % de identidade ao receptor de proteína acoplada a G MOR14-10 de ratinho, indicando que esta porção amino-terminal é codificada em natureza. A expressão natural de 238P1B2 v.lB pode ocorrer se o local de parada a montante da extensão de 62 aminoácidos é modificado por substituição de ácido nucleico único o que leva a conversão do codão de terminação em um aminoácido codificante. Polimorfismos pode existir dentro de tecidos diferentes, ou entre indivíduos diferentes que mutam o codão de terminação, e permitindo portanto a tradução apropriada da região amino-terminal de 62 aminoácidos de 238P1B2 v.lB. Tal variação pode adicionar uma metionina de iniciação directamente, ou estender a região codificante 89 238Ρ1Β2 ν.ΙΒ para uns 16 aminoácidos adicionais até alcançar uma metionina de iniciação na posição de ácido nucleico 1896.

Exemplo 3: Mapeamento Cromossómico do gene de 238P1B2

Localização cromossómica pode implicar genes na patogénese da doença. Diversas abordagens de mapeamento de cromossomas estão disponíveis incluindo hibridação in situ com fluorescência (FISH), painéis híbridos de radiação (RH) em seres humanos/hamster (Walter et al., 1994; Nature Genetics 7:22; Research Genetics, Huntsville Al), tais como painéis híbridos de célula somática de roedor-seres humanos estão disponíveis do Coriell Institute (Camden, New Jersey), e visualizadores genómicos utilizando homologias de BLAST a clones genómicos mapeados e sequenciados (NCBI, Betesda, Maryland).

Utilizando sequência de 238P1B2 e a ferramenta NCBI BLAST: (veja-se World Wide Web URL www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/page.cgi?F=HsBlast.html&&OR G=Hs), colocou 238P1B2 a cromossoma 11 pl5,5, uma região rica em GPCR.

Por causa do gene de 238P1B2 humano mapeia o cromossoma llpl5.5, os polinucleótidos que codificam regiões diferentes da proteína 238P1B2 podem ser utilizados para caracterizar anormalidades citogenéticas no cromossoma 11, banda pl5.5 que foram identificadas como sendo associadas a vários cancros. Em particular, uma variedade de anormalidades cromossómicas em llpl5.5 foi identificada como anormalidades citogenéticas frequentes num número de cancros diferentes (veja-se, por exemplo, Lai et al. , 2000, Clin. Câncer Res. 6(8):3172-6; Oya e Schulz, 2000, Br. J. Câncer 83(5) :626-31; Svaren et al., Sept. 12, 2000, J. Biol. Chem.). Consequentemente, os polinucleótidos que codificam regiões específicas da proteína 238P1B2 proporcionam novas ferramentas que podem ser utilizadas para delinear, com maior exactidão que era possível 90 anteriormente, a natureza específica das anormalidades citogenéticas nesta região de cromossoma 11 que contribuem ao fenótipo maligno. Neste contexto, estes polinucleótidos satisfazem uma necessidade no estado da técnica de expandir a sensibilidade de rastreio cromossómico com a finalidade de identificar mais anormalidades cromossómicas mais subtis e menos comuns (veja-se, por exemplo, Evans et al. , 1994, Am J. Obstet. Gynecol. 171(4):1055-1057).

Exemplo 4: Análise de expressão de 238P1B2 em Tecidos normais e Espécimes de Paciente A análise de expressão por meio de RT-PCR demonstrou que 238P1B2 é fortemente expressa em espécimes de paciente com cancro de próstata (Figura 14). ADNc de primeira cadeia foi preparado a partir do agrupamento vital 1 (figado, pulmão e rim), agrupamento vital 2 (pâncreas, cólon e estômago) e agrupamento de cancro de próstata. A normalização foi realizada por meio de PCR utilizando iniciadores para actina e GAPDH. PCR semi-quantitativa, utilizando iniciadores para 238P1B2, foi realizada a 26 e 30 ciclos de amplificação. Os resultados mostram forte expressão de 238P1B2 em agrupamento de cancro de próstata, mas não em agrupamento vital 1 e agrupamento vital 2.

Análise de Northern blot de 238P1B2 em 16 tecidos humanos normais é mostrada na Figura 15. Os resultados mostram ausência de expressão de 238P1B2 em todos 16 tecidos normais testados. Análise extensa de expressão de 238P1B2 em 76 tecidos humanos mostra expressão restrita de 238P1B2 em placenta (Figura 16).

Expressão de 238P1B2 em espécimes de cancro do paciente e tecidos humanos normais é mostrada na Figura 17. ARN foi extraído de um agrupamento de três cancros de próstata, bem como de próstata normal (NP), bexiga normal (NB), rim normal (NK), cólon normal (NC), pulmão normal (NL) mama normal (NBr) e ovário normal (NO) . Northern blot com 10 ug de ARN total/pista foi sondado com sequência de 91 238Ρ1Β2. Os resultados mostram expressão de um transcrito de aproximadamente 4,5kb de 238P1B2 no agrupamento de cancro de próstata e ovário, mas não nos outros tecidos normais testados. Análise de espécimes de paciente individual mostra forte expressão de 238P1B2 em tecidos de cancro de próstata (Figura 18). A expressão para 238P1B2 detectada em tumores de Gleason pontuação 7 é significativamente mais forte que a expressão detectada em tumores de Gleason pontuação 5. Este resultado indica que 238P1B2 pode ser utilizado como um marcador de prognóstico para cancro de próstata. A expressão restrita de 238P1B2 em tecidos normais e a expressão detectada em cancro de próstata sugerem que 238P1B2 é um alvo terapêutico potencial e um marcador de diagnóstico para cancros humanos.

Exemplo 5: Variantes de transcrito de 238P1B2 As variantes de transcrito são variantes de ARNm maduro do mesmo gene por transcrição alternativa ou splicing alternativo. Os transcritos alternativos são transcritos do mesmo gene que começa a transcrição em pontos diferentes. As variantes de splicing são variantes de ARNm com splicing diferente do mesmo transcrito em eucariotas, quando se transcreve um gene multiexónico de ADN genómico, o ARN inicial é submetido a splicing para produzir ARNm funcional, que somente tem exões e é utilizado para tradução numa sequência de aminoácidos. Em consequência, um dado gene pode ter de zero a muitos transcritos alternativos e cada transcrito pode ter de zero a muitas variantes de splicing. Cada variante de transcrito tem uma composição exónica única e pode ter diferentes partes codificantes e/ou não codificantes (extremidade 5' ou 3'), do transcrito original. As variantes de transcrito podem codificar proteínas similares ou diferentes com a mesma ou similar função ou podem codificar proteínas com diferentes funções e podem expressar-se no mesmo tecido ao mesmo tempo 92 ou em diferentes tecidos ao mesmo tempo ou no mesmo tecido a diferentes tempos ou em diferentes tecidos a diferentes tempos. As proteínas codificadas por variantes de transcrito podem ter localizações celulares ou extracelulares similares ou diferentes, por exemplo, secretada versus intracelular.

Identificam-se variantes de transcrito por uma diversidade de métodos aceitados na técnica. Por exemplo, identificam-se transcritos alternativos e variantes de splicing por experimentos de clonagem de comprimento completo ou por meio da utilização de sequências de EST e transcrito de comprimento completo. Em primeiro lugar, todas as EST humanas foram agrupadas em agrupamentos que mostram identidade directa ou indirecta entre si. Em segundo lugar, as EST no mesmo agrupamento agrupam-se adicionalmente em sub-agrupamentos e ordenaram-se numa sequência consenso. A sequência do gene original é comparada com a sequência ou sequências consenso ou outras sequências de comprimento completo. Cada sequência consenso é uma variante de splicing potencial para esse gene (veja-se, por exemplo, a direcção Web URL www.doubletwist.com/products/cll_agentsOverview.jhtml). Mesmo quando se identifica uma variante que não é um clone de comprimento completo, essa parte da variante é muito útil para a geração de antigénios e para clonagem adicional da variante de splicing de comprimento completo, utilizando técnicas conhecidas na especialidade.

Além disso, estão disponíveis programas de computador na técnica para identificar variantes de transcrito com base em sequências genómicas. Os programas de identificação de variantes de transcrito com base no genoma incluem FgenesH (A. Salamov e V. Solovyev, "Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA", Genome Research. Abril de 2000;10(4) :516-22) ; Grail (direcção Web URL compbio.ornl.gov/Grail-binlEmptyGrailForm) e GenScan 93 (direcção Web URL genes.mit.edu/GENSCAN.html).

Para uma análise geral de protocolos de identificação de variante de splicing veja-se, por exemplo, Southan, C., A genomic perspective on human proteases, FEBS Lett. 8 de Junho de 2001; 498(2-3):214-8; de Souza, S.J., et al. , Identification of human chromosome 22 transcribed sequences with ORF expressed sequence tags, Proc. Natl Acad Sei OU S A. 7 de Novembro de 2000; 97(23):12690-3.

Para confirmar adicionalmente os parâmetros de uma variante de transcrito, está disponível uma diversidade de técnicas na especialidade, tais como clonagem de comprimento completo, validação proteómica, validação com base em PCR e validação de RACE 5', etc. (veja-se por exemplo, Proteomic Validation: Brennan, S.O., et al., Albumin banks península: a new termination variant characterized by electrospray mass spectrometry, Biochem Biophys Acta. 17 de Agosto de 1999; 1433(1-2):321-6; Ferranti P, et al., Differential splicing of premessenger RNA produces multiple forms of mature caprine alpha(sl)-casein, Eur J Biochem. 1 de Outubro de 1997;249(1):1-7. Para validação à base de PCR: Wellmann S, et al, Specific reverse transcription-PCR quantification of vascular endothelial growth factor (VEGF) splice variants by LightCycler technology, Clin Chem. Abril de 2 0 01; 47 ( 4) : 6 54-6 0 ; Jia, H.P., et al, Discovery of new human beta-defensins using a genomies-based approach, Gene. 24 de Janeiro de 2001; 263(1-2):211-8. Para validação de RACE 5' e com base em PCR: Brigle, K.E., et al, Organization of the murine reduced folate carrier gene and Identification of variant splice forms, Biochem Biophys Acta. 7 de Agosto de 1997; 1353(2): 191-8).

Sabe-se na técnica que as regiões genómicas estão moduladas nos cancros. Quando a região genómica em que se mapeia um gene está modulada num cancro particular, as variantes de splicing ou transcritos alternativos do gene são modulados também. Revela-se no presente documento que 238P1B2 tem um 94 perfil de expressão particular. As variantes de transcritos e splicing alternativos de 238P1B2 podem partilhar este padrão de expressão, servindo deste modo como marcadores/antigénios associados a tumor. A composição exónica de transcrito original, designado como 238P1B2 v.l, é mostrada no Quadro XXIII. Nenhuma variante de transcrito foi identificada pelos métodos anteriores. Exemplo 6: Polimorfismos de nucleótido único de 238P1B2

Um polimorfismo de nucleótido único (SNP) é uma variação de par de bases único numa sequência de nucleótidos numa localização especifica. Em qualquer dado ponto do genoma, existem quatro possíveis pares de bases de nucleótidos: A/T, C/G, G/C e T/A. 0 genotipo refere-se à sequência de pares de bases específica de uma ou mais localizações no genoma de um indivíduo. 0 halotipo refere-se à sequência de pares de bases de mais de uma localização na mesma molécula de ADN (ou o mesmo cromossoma em organismos superiores), com frequência no contexto de um gene ou no contexto de vários genes ligados firmemente. Os SNP que são produzidos num ADNc denominam-se cSNP. Estes cSNP podem cambiar aminoácidos da proteína codificada pelo gene e mudar deste modo as funções da proteína. Alguns SNP provocam doenças herdadas; outros contribuem a variações quantitativas no fenotipo e reacções a factores ambientais incluindo dieta e fármacos entre os indivíduos. Portanto, os SNP e/ou combinações de alelos (denominados haplotipos) têm muitas aplicações, incluindo diagnóstico de doenças herdadas, determinação de reacções a fármacos e dosagem, identificação de genes responsáveis de doenças e análise da relação genética entre os indivíduos (P. Nowotny, J. M. Kwon e A. M. Goate, " SNP analyse to dissect human traits," Curr . Opin. Neurobiol. Outubro de 2001; 11(5) :637-641; M.

Pirmohamed e B. K. Park, "Genetic susceptibility to adverse drug reactions," Trends Pharmacol. Sei. Junho de 2001; 22(6):298-305; J. H. Riley, C. J. Allan, E. Lai e A. Roses, 95 " The use of single nucleotide polymorphisms in the isolation of common disease genes," Pharmacogenomics. Fevereiro de 2000; l(l):39-47; R. Judson, J. C. Stephens e A. Windemuth, "The predictive power of haplotypes in clinicai response," Pharmacogenomics. Fevereiro de 2000; 1(1):15-26) .

Os SNP identificam-se por uma diversidade de métodos aceitados na técnica (P. Bean, "The promising voyage of SNP target discovery," Am. Clin. Lab. Outubro-Novembro de 2001; 20(9): 18-20; K. M. Weiss, "In search of human variation," Genome Res. Julho de 1998; 8(7) :691-697; Μ. M. She, "Enabling large-scale pharmacogenetic studies by high-throughput mutation detection and genotyping technologies," Clin. Chem. Fevereiro de 2001; 47(2):164-172). Por exemplo, identificam-se SNP sequenciando fragmentos de ADN que mostram polimorfismo por métodos à base de gel tais como polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) e electroforese em gel de gradiente desnaturalizante (DGGE). Podem também ser descobertos por sequenciamento directo de amostras de ADN agrupadas de diferentes indivíduos ou comparando sequências de diferentes amostras de ADN. Com a rápida acumulação de dados de sequências nas bases de dados públicas e privadas, pode descobrir-se SNP comparando sequências utilizando programas de computador (Z. Gu, L. Hillier e P. E. Kwok, "Single nucleotide polymorphism hunting in cyberspace" Hum. Mutat 1998; 12(4) :221-225) . Os SNP podem ser verificados e o genotipo ou haplotipo de um indivíduo determinados por uma diversidade de métodos incluindo sequenciamento directo e microséries de alto rendimento (P. E. Kwok, "Methods for genotyping single nucleotide polymorphisms," Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 2001; 2:235-258; M. Kokoris, K. Dix, K. Moynihan, J. Mathis, B. Erwin, P. Grass, B. Hines e A. Duesterhoeft, "High-throughput SNP genotyping with the Masscode system," Mol. Diagn. Dezembro de 2000; 5(4):329- 340) . 96

Identificam-se SNP de 238P1B2 por sequenciamento directo dos clones de ADNc e por comparação dessas sequências com sequências públicas e patenteadas. Comparando as sequências com sequências públicas ou patenteadas de alta qualidade (por exemplo, NCBI/GenBank, acessíveis na direcção Web URL www.ncbi.nlm.nih.gov), identificaram-se cinco SNP de 238P1B2 nas posições de nucleótidos 274 (T/C), 1268 (T/G), 1299 (T/G), 2806 (T/C) e 3025 (T/C). Os transcritos ou proteínas com alelos alternativos designaram-se como variantes de 238P1B2 v.2, v.3, v.4, v.5 e v.6. A Figura 10 mostra o alinhamento esquemático das variantes de nucleótidos. A Figura 11 mostra o alinhamento esquemático de variantes de proteína, correspondentes a variantes de nucleótidos. As variantes de nucleótidos que codificam a mesma sequência de aminoácidos como variante 1 não são mostradas na Figura 11. Estes alelos dos SNP, embora sejam mostrados aqui de forma separada, podem aparecer em diferentes combinações (haplotipos).

Exemplo 7: Produção de 238P1B2 recombinante em sistemas procariotas

Para expressar 238P1B2 recombinante em células procariotas, clonam-se as sequências de ADNc de comprimento parcial ou completa de 238P1B2 variante la, variante lb e variante 2 em qualquer uma de uma diversidade de vectores de expressão conhecidos na técnica. Uma ou mais das seguintes regiões de variantes de 238P1B2 expressam-se nestas construções: aminoácidos 1 a 254 da variante la; aminoácidos 1 a 316 da variante lb e aminoácidos 1-254 da variante 2 ou qualquer 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, , 45, 46, 47, 48, 49, 50 ou mais aminoácidos contíguos de 238P1B2, variantes ou análogos da mesma. A. Construções de transcrição e tradução in vitro: 97 pCRII: para gerar sondas de ARN senso e anti-senso de 238P1B2 para investigações de ARN in situ, geram-se construções de pCRII (Invitrogen, Carlsbad CA) codificando todo ou fragmentos do ADNc de 238P1B2. 0 vector pCRII tem os promotores Sp6 e T7 flangueando a inserção para conduzir a transcrição de ARN de 238P1B2 para a sua utilização como sondas em experimentos de hibridação de ARN in situ. Estas sondas são utilizadas para analisar a expressão celular e tissular de 238P1B2 ao nível de ARN. É utilizado ARN de 238P1B2 transcrito que representa a região codificante de aminoácidos de ADN do gene de 238P1B2 em sistemas de tradução in vitro tais como o sistema de retículo lisado acoplado TnT™ (Promega, Corp., Madison, WI) para sintetizar proteína 238P1B2. B. Construções Bacterianas

Construções de pGEX: para gerar proteínas 238P1B2 recombinantes em bactérias que se fusionam com a proteína glutation S-transferase (GST); fusionam-se toda ou partes da sequência codificante de proteína de ADNc de 238P1B2 com o gene de GST clonando em pGEX-6P-l ou qualquer outro vector de fusão de GST da família pGEX (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Estas construções permitem a expressão controlada de sequências proteicas de 238P1B2 recombinantes com GST fusionada na extremidade amino terminal e um epítopo de seis histidinas (6X His) na extremidade carboxilo terminal. Os marcadores de GST e 6X His permitem a purificação da proteína de fusão recombinante de bactérias induzidas com a matriz de afinidade apropriada e permitem o reconhecimento da proteína de fusão com anticorpos anti-GST e anti-His. 0 marcador de 6X His gera-se adicionando 6 codões de histidina ao iniciador de clonagem na extremidade 3', por exemplo, da grelha de leitura aberta (ORF). Pode utilizar-se um local de excisão proteolítica, tal como o local de reconhecimento de PreScission™ em pGEX-6P-l, para permitir 98 a excisão do marcador de GST de proteína relacionada com 238P1B2. 0 gene de resistência a ampicilina e origem de pBR322 permite a selecção e manutenção dos plasmídeos pGEX em E. coli.

Construções de pMAL: para gerar, em bactérias, proteínas 238P1B2 recombinantes que se fusionam com proteína de união a maltose (MBP), toda ou partes da sequência codificante de proteína de ADNc de 238P1B2 são fusionadas com o gene de MBP clonando nos vectores pMAL-c2X e pMAL-p2X (New England Biolabs, Beverly, MA) . Estas construções permitem a expressão controlada de sequências proteicas de 238P1B2 recombinantes com MBP fusionada na extremidade amino terminal e um marcador epitópico de 6X His na extremidade carboxilo terminal. Os marcadores MBP e 6X His permitem a purificação da proteína recombinante de bactérias induzidas com a matriz de afinidade apropriada e permitem o reconhecimento da proteína de fusão com anticorpos anti-BMP e anti-His. 0 marcador epitópico de 6X His gera-se adicionando 6 codões de histidina ao iniciador de clonagem 3'. Um local de reconhecimento de factor Xa permite a excisão do marcador de pMAL de 238P1B2. Os vectores pMAL-c2X e pMAL-p2X se optimizan para expressar a proteína recombinante no citoplasma ou periplasma respectivamente. A expressão do periplasma potência a dobragem de proteínas com ligações dissulfureto.

Construções de pET: para expressar 238P1B2 em células bacterianas, toda ou partes da sequência codificante de proteínas de ADNc de 238P1B2 clona-se na família de pET de vectores (Novagen, Madison, WI). Estes vectores permitem expressão firmemente controlada de proteína 238P1B2 recombinante em bactérias com e sem fusão com proteínas que potencializam a solubilidade, tais como NusA e tioredoxina (Trx), e marcadores epitópicos, tais como 6X His e S-Tag™ que ajudam à purificação e detecção da proteína recombinante. Por exemplo, realizam-se construções 99 utilizando o sistema de fusão de pET NusA 4 3,1 de modo que se expressam regiões da proteina 238P1B2 como fusões amino terminais com NusA. Expressou-se uma proteina de fusão ANusA que abrange os aminoácidos 412-254 de 238P1B2 com ou marcador 6x His C-terminal em E. Coli, purificou-se por cromatografia de afinidade de quelato metálico e utilizou-se como um imunogénio para a geração de anticorpos. C. Construções de levedura:

Construções de pESC: para expressar 238P1B2 na espécie de levedura Saccharomyces cerevisiae para a geração de proteina recombinante e estudos funcionais, toda ou partes da sequência codificante de proteina de ADNc de 238P1B2 clona-se na familia de pESC de vectores cada um dos quais contém 1 de 4 marcadores seleccionáveis, HIS3, TRPl, LEU2 e URA3 (Stratagene, A Jolla, CA) . Estes vectores permitem a expressão controlada do mesmo plasmideo de até 2 genes diferentes ou sequências clonadas que contêm marcadores epitópicos Flag™ ou Myc na mesma célula de levedura. Este sistema é útil para confirmar interacções proteína-proteína de 238P1B2. Além disso, a expressão o levedura produz modificações pós-traducionais similares, tais como glicosilações e fosforilações, que são encontradas quando se expressam em células eucariotas.

Construções de pESP: para expressar 238P1B2 na espécie de leveduras Saccharomyces pombe, toda ou partes da sequência codificante de proteína de ADNc de 238P1B2 clona-se na família pESP de vectores. Estes vectores permitem alto nível de expressão controlada de uma sequência proteica de 238P1B2 que se fusiona na extremidade amino terminal ou na extremidade carboxilo terminal com GST que ayuda à purificação da proteína recombinante. Um marcador epitópico Flag™ permite a detecção da proteína recombinante com um anticorpo anti-Flag™.

Exemplo 8: Produção de 238P1B2 recombinante em sistemas eucariotas 100 A. Construções de mamíferos

Para expressar 238P1B2 recombinante em células eucariotas, as sequências de comprimento completo ou parcial de ADNc de 238P1B2 podem clonar-se em qualquer uma de uma diversidade de vectores de expressão conhecidos na técnica. Expressa-se uma ou mais das seguintes regiões de 238P1B2 nestas construções: aminoácidos 1 a 254 de variante IA ou variante aminoácidos 1 a 316 de variante 1B, ou qualquer 8 , 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 , 49, 50 ou mais aminoácidos contíguos de 238P1B2, variantes, ou análogos da mesma. Expressa-se uma região de uma variante específica de 238P1B2 que codifica um aminoácido em posição específica que difere o aminoácido de qualquer outra variante encontrada nessa posição. Como alternativa, expressa-se uma região de uma variante de 238P1B2 que se situa parcialmente ou completamente dentro de uma sequência que é única dessa variante.

As construções podem transfectar-se em qualquer uma de uma diversidade de células de mamífero tais como células 293T. Os lisados de células 293T transfectadas podem ser sondados com o soro policlonal anti-238PlB2, descrito no presente documento.

Construções de pcDNA4/HisMax: para expressar 238P1B2 em células de mamífero, clona-se uma ORF de 238P1B2, ou partes da mesma, de 238P1B2 em pcDNA4/HisMax Versão A (Invitrogen, Carlsbad, CA) . A expressão proteica é conduzida desde o promotor de citomegalovírus (CMV) e o potencializador traducional SP16. A proteína recombinante tem epítopos Xpress™ e seis histidinas (6X His) fusionadas com a extremidade amino terminal. 0 vector pcDNA4/HisMax também contém o sinal de poliadenilação e sequência de terminação da transcrição da hormona do crescimento bovina (BGH) para potenciar a estabilidade de ARNm junto com a origem de SV40 101 para replicação epissomal e resgate de vector único em linhas celulares que expressam o antigénio T grande. 0 gene de resistência a zeocina permite a selecção de células de mamífero que expressam a proteína e o gene de resistência a ampicilina e a origem ColEl permite a selecção e manutenção do plasmídeo em E. coli.

Construções de pcDNA 3,1/MycHis: para expressar 238P1B2 em células de mamífero, clona-se uma ORF de 238P1B2, ou partes da mesma, de 238P1B2 com um local de inicio da tradução de Kozak consenso em pcDNA 3,1/MycHis Versão A (Invitrogen, Carlsbad, CA) . A expressão proteica é conduzida desde o promotor de citomegalovírus (CMV). As proteínas recombinantes têm o epítopo myc e o epítopo 6X His fusionados na extremidade carboxilo terminal. 0 vector pcDNA 3,1/MycHis também contém o sinal de poliadenilação e sequência de terminação da transcrição da hormona de crescimento bovina (BGH) para potenciar a estabilidade de ARNm, junto com a origem de SV40 para replicação epissomal e resgate de vector único em linhas celulares que expressam o antigénio T grande. 0 gene de resistência a neomicina pode ser utilizado, uma vez que permite a selecção de células de mamífero que expressam a proteína e o gene de resistência a ampicilina e a origem ColEl permite a selecção e manutenção do plasmídeo em E. coli.

Construção pcDNA 3,1/CT-GFP-TOPO: para expressar 238P1B2 em células de mamífero e permitir a detecção das proteínas recombinantes utilizando fluorescência, uma ORF 238P1B2, ou partes da mesma, com um local de inicio da tradução de Kozak consenso clonam-se em pcDNA 3,1/CT-GFP-TOPO (Invitrogen, CA). A expressão proteica é conduzida desde o promotor de citomegalovírus (CMV). As proteínas recombinantes têm a proteína verde fluorescente (GFP) fusionada com a extremidade carboxilo terminal que facilita a detecção não invasiva in vivo e estudos de biologia celular. 0 vector pcDNA 3,1CT-GFP-T0P0 também contém o 102 sinal de poliadenilação e sequência de terminação da transcrição da hormona de crescimento bovina (BGH) para potenciar a estabilidade de ARNm junto com a origem de SV40 para replicação epissomal e resgate de vector único em linhas celulares que expressam o antigénio T grande. 0 gene de resistência a neomicina permite a selecção de células de mamífero que expressam a proteína e o gene de resistência a ampicilina e origem ColEl permitem a selecção e manutenção do plasmídeo em E. coli. Realizam-se construções adicionais com uma fusão de GFP amino terminal em pcDNA 3,1/NT-GFP-TOPO que abarca a comprimento complete de uma proteína 238P1B2. PAPtag: uma ORF de 238P1B2, ou partes da mesma, clona-se em pAPtag-5 (GenHunter Cop. Nashville, TN). Esta construção gera uma fusão de fosfatase alcalina na extremidade carboxilo terminal da proteína 238P1B2 fusionando à vez a sequência sinal de IgGk com a extremidade amino terminal. Também geram-se construções nas que se fusiona fosfatase alcalina com uma sequência sinal de IgGK amino terminal com a extremidade amino terminal de uma proteína 238P1B2. As proteínas 238P1B2 recombinantes resultantes são optimizadas para secreção ao meio de células de mamífero transfectadas e podem ser utilizadas para identificar proteínas tais como ligandos ou receptores que interagem com proteínas 238P1B2. A expressão de proteínas é conduzida desde o promotor de CMV e as proteínas recombinantes também contêm epítopos myc e 6X His fusionados na extremidade carboxilo terminal que facilitam a detecção e purificação. 0 gene de resistência a zeocina presente no vector permite a selecção de células de mamífero que expressam a proteína recombinante e o gene de resistência a ampicilina permite a selecção do plasmídeo em E. coli. ptag5: Uma ORF 238P1B2, ou partes da mesma, clona-se em pTag-5. Este vector é similar a pAPtag mas sem a fusão de fosfatase alcalina. Esta construção gera proteína 238P1B2 103 com uma sequência sinal de IgGK amino terminal e marcadores epitópicos myc e 6X His na extremidade carboxilo terminal que facilitam a detecção e purificação de afinidade. A proteína 238P1B2 recombinante resultante se optimiza para secreção ao meio de células de mamífero transfectadas e é utilizado como imunogénio ou ligando para identificar proteínas tais como ligandos ou receptores que interagem com as proteínas 238P1B2. A expressão proteica é conduzida desde o promotor de CMV. 0 gene de resistência a zeocina presente no vector permite a selecção de células de mamífero que expressam a proteína e o gene de resistência a ampicilina permite a selecção do plasmídeo em E. coli. PsecFc: Uma ORF de 238P1B2, ou partes da mesma, também clona-se em psecFc. 0 vector psecFc foi montado clonando o Fc de imunoglobulina G1 (IgG) humana (regiões de dobradiça, CH2, CH3) em pSecTag2 (Invitrogen, Califórnia). Esta construção gera uma fusão de Fc de IgGl na extremidade carboxilo terminal das proteínas 238P1B2, fusionando à vez a sequência sinal de IgGK na extremidade N-terminal. Também são utilizadas fusões de 238P1B2 que utilizam a região Fc de IgGl murina. As proteínas 238P1B2 recombinantes resultantes são optimizadas para secreção ao meio de células de mamífero transfectadas e podem ser utilizadas como imunogénios ou para identificar proteínas tais como ligandos ou receptores que interagem com proteína 238P1B2. A expressão proteica é conduzida desde o promotor de CMV. 0 gene de resistência a higromicina presente no vector permite a selecção de células de mamifero que expressam a proteína recombinante e o gene de resistência a ampicilina permite a selecção do plasmídeo em E. coli.

Construções de pSRa: para gerar linhas celulares de mamífero que expressem 238P1B2 de forma constitutiva, clonaram-se ORF de 238P1B2, ou partes da mesma de 238P1B2 em construções pSRa. Geram-se retrovírus amfotrópicos e ecotrópicos por transfecção de construções pSRa na linha 104 de empacotamento 293T-10A1 ou co-transfecção de pSRCC e um plasmídeo auxiliar (que contém sequências de empacotamento suprimidas) nas células 293, respectivamente. 0 retrovirus é utilizado para infectar uma diversidade de linhas celulares de mamífero, dando como resultado a integração do gene clonado, 238P1B2, nas linhas celulares hospedeiras. A expressão proteica é conduzida desde uma repetição terminal larga (LTR). 0 gene de resistência a neomicina presente no vector permite a selecção de células de mamífero que expressam a proteína e o gene de resistência a ampicilina e origem ColEl permitem a selecção e manutenção do plasmídeo em E. coli. Os vectores retrovirais podem ser utilizados a seguir para infecção e geração de diversas linhas celulares utilizando, por exemplo, células PC3, NIH 3T3, TsuPrl, 293 ou rat-1.

Realizam-se construções pSRa adicionais que fusionam um marcador epitópico tal como o marcador FLAG™ com a extremidade carboxilo terminal de sequências de 238P1B2 para permitir a detecção utilizando anticorpo anti-Flag. Por exemplo, adiciona-se a sequência de FLAG™ 5' gat tac aaggat gac gac gat aag 3' ao iniciador de clonagem na extremidade 3' da ORF. Realizam-se construções pSRCC adicionais para produzir proteínas de fusão com GFP e myc/6X His tanto amino terminais como carboxilo terminais das proteínas de comprimento completo 238P1B2.

Vectores virais adicionais : Realizam-se construções adicionais para administração mediada por vírus e expressão de 238P1B2. Consegue-se alta titulação virai que conduz a alto nível de expressão de 238P1B2 em sistemas de administração virais tais como vectores adenovirais e vectores de amplicão de herpes. Uma sequência codificante de 238P1B2 ou fragmentos da mesma amplifica-se por PCR e subclona-se no vector transportador AdEasy (Stratagene). Realizam-se recombinação e empacotamento de vírus de acordo com as instruções do fabricante para gerar vectores 105 adenovirais. Como alternativa, as sequências codificantes de 238P1B2 ou fragmentos das mesmas clonam-se no vector HSV-1 (Imgenex) para gerar vectores virais de herpes. Os vectores virais são utilizados a seguir para infecção de diversas linhas celulares tais como células PC3, NIH 3T3, 293 ou rat-1.

Sistemas de expressão regulados: para controlar a expressão de 238P1B2 em células de mamífero, clonam-se sequências codificantes de 238P1B2, ou partes das mesmas, em sistemas de expressão de mamíferos regulados tais como o sistema T-Rex (Invitrogen), o sistema GeneSwitch (Invitrogen) e o sistema firmemente regulado Ecdysone (Sratagene). Estes sistemas permitem o estudo dos efeitos dependentes de concentração e temporais de 238P1B2 recombinante. Estes vectores são utilizados a seguir para controlar a expressão de 238P1B2 em diversas linhas celulares tais como células PC3, NIH 3T3, 293 ou rat-1. B. Sistemas de expressão de baculovírus

Para gerar proteínas 238P1B2 recombinantes num sistema de expressão de baculovírus, clonam-se ORF de 238P1B2 OF, ou partes da mesma, no vector de transferência de baculovírus pBlueBac 4,5 (Invitrogen), que proporciona um marcador His na extremidade N-terminal. Especificamente, pBlueBac-238P1B2 é co-transfectado com o plasmídeo auxiliar pBac-N-Blue (Invitrogen) em células de insecto SF9 (Spodoptera frugiperda) para gerar baculovírus recombinante (veja-se o manual de instruções de Invitrogen para detalhes). Colhe-se depois baculovírus do sobrenadante celular e purifica-se por ensaio em placa.

Gera-se depois proteína 238P1B2 recombinante por infecção de células de insecto HighFive (Invitrogen) com baculovírus purificado. Pode detectar-se proteína 238P1B2 recombinante utilizando anticorpo anti-238PlB2 ou anti marcador His-tag. A proteína 238P1B2 pode purificar-se e ser utilizado em diversos ensaios à base de células ou como imunogénio para 106 gerar anticorpos policlonais e monoclonais específicos para 238P1B2.

Exemplo 9 perfis de antigenicidade e estrutura secundária

Figura 5A,B, Figura 6 A,B, Figura 7 A,B, Figura 8 A,B, e Figura 9 A,B representam graficamente cinco perfis de aminoácidos da sequência de aminoácidos de 238P1B2 variante la (SA-9a) e variante lb (5B-9B), cada avaliação disponível acedendo ao local web de ProtScale (URL www.expasy.ch/cgi-ben/protscale.pl) no servidor de biologia molecular ExPasy. Estes perfis: Figura 5, hidrofilia (Ηορρ T.P., Woods K.R., 1981. Proc. Natl. Acad. Sei. OU.S.A. 78: 3824-3828); Figura 6, hidropático, (Kyte J., Doolittle R.F., 1982. J. Mol. Biol. 157:105-132); Figura 7, percentagem de resíduos acessíveis (Janen J., 1979 Nature 277:491-492); Figura 8, flexibilidade média (Bhaskaran R., e Ponnuswamy P.K., 1988.

Ent. J. Pept. Proteen Res. 32:242-255); Figura 9, folha beta (Deleage, G., Roux B. 1987 Proteen Engeneereng 1:289-294); e opcionalmente outros disponíveis na técnica, tais como no local web de ProtScale, utilizaram-se para identificar regiões antigénicas da proteína 238P1B2. Cada um dos perfis aminoacídicos anteriores de 238P1B2 foram gerados utilizando os seguintes parâmetros de ProtScale para análise: 1) um tamanho de janela de 9; 2) 100% de peso das bordas de janela em comparação com o centro de janela; e 3) valores do perfil de aminoácidos normalizado para quedar entre 0 e 1.

Utilizaram-se perfis de hidrofilia (Figura 5), hidropático (Figura 6) e percentagem de resíduos acessíveis (Figura 7) para determinar segmentos de aminoácidos hidrófilos (isto é, valores maiores de 0,5 no perfil de hidrofilia e percentagem de resíduos acessíveis e valores menores de 0,5 no perfil hidropático). Tais regiões provavelmente expõem-se ao ambiente aquoso, estão presentes na superfície da proteína e portanto estão disponíveis para reconhecimento imune, tal como por anticorpos. 107

Os perfis de flexibilidade média (Figura 8) e folha beta (Figura 9) determinam segmentos de aminoácidos (isto é valores maiores de 0,5 no perfil de folha beta e o perfil de flexibilidade média) que não se restringem em estruturas secundárias tais como folhas beta e hélices alfa. Tais regiões também se expõem mais provavelmente na proteína e são portanto acessíveis para reconhecimento imune, tal como pró-anticorpos. São utilizadas sequências antigénicas da proteína 238P1B2 variante la e variante lb indicadas, por exemplo, pelos perfis expostos na Figura 5 A,B, Figura 6 A,B, Figura 7 A,B, Figura 8 A,B, e/ou Figura 9 A,B para preparar imunogénios, péptidos ou ácidos nucleicos que os codificam, para gerar anticorpos anti-238PlB2 terapêuticos e de diagnóstico. 0 imunogénio pode ser qualquer de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais de 50 aminoácidos contíguos ou os ácidos nucleicos correspondentes que os codificam, das proteínas variantes de 238P1B2. Em particular, os imunogénios peptídicos para 238P1B2 variante la podem compreender uma região peptídica de pelo menos 5 aminoácidos da Figura 2 em qualquer incremento de número inteiro até 254 que inclua uma posição de aminoácidos que tenha um valor maior de 0,5 no perfil de hidrofilia na Figura 5A; uma região peptídica de pelo menos 5 aminoácidos da Figura 2 em qualquer aumento de número inteiro até 254 que inclui uma posição de aminoácidos que tenha um valor menor de 0,5 no perfil hidropático da Figura 6A; uma região peptídica de pelo menos 5 aminoácidos da Figura 2 em qualquer incremento do número inteiro até 254 que inclua uma posição de aminoácidos que tenha um valor maior de 0,5 no perfil de percentagem de resíduos acessíveis da Figura 7A, uma região peptídica de pelo menos 5 aminoácidos da Figura 2 em qualquer incremento de número inteiro até 254 que inclua uma posição de aminoácidos que tenha um valor 108 maior de 0,5 no perfil de flexibilidade média na Figura 8A; e, uma região peptídica de pelo menos 5 aminoácidos da Figura 2 em qualquer incremento de número inteiro até 254 que inclua uma posição de aminoácidos que tenha um valor maior de 0,5 no perfil de folha beta da Figura 9A.

Além disso, os imunogénios peptídicos para 238P1B2 variante lb podem compreender uma região peptídica de pelo menos 5 aminoácidos da Figura 2 em qualquer incremento de número inteiro até 316 que inclua uma posição de aminoácidos que tenha um valor maior de 0,5 no perfil de hidrofilia da Figura 5B; uma região peptídica de pelo menos 5 aminoácidos da Figura 2 em qualquer incremento de número inteiro até 316 que inclua uma posição de aminoácidos que tenha um valor menor de 0,5 no perfil hidropático da Figura 6B; uma região peptídica de pelo menos 5 aminoácidos da Figura 2 em qualquer incremento do número inteiro até 316 que inclua uma posição de aminoácidos que tenha um valor maior de 0,5 no perfil de percentagem de resíduos acessíveis da Figura 7B; uma região peptídica de pelo menos 5 aminoácidos da Figura 2 em qualquer incremento de número inteiro até 316 que inclua uma posição de aminoácidos que tenha um valor maior de 0,5 no perfil de flexibilidade média na Figura 8B; e uma região peptídica de pelo menos 5 aminoácidos da Figura 2 em qualquer incremento no número inteiro até 316 que inclua uma posição de aminoácidos que tenha um valor maior de 0,5 no perfil de folha beta da Figura 9B. Os imunogénios também podem compreender ácidos nucleicos que codifiquem qualquer dos péptidos anteriores.

Todos os imunogénios descritos no presente documento, sejam péptidos ou ácidos nucleicos, podem incorporar-se numa forma de dose unitária humana, ou estar compreendida por uma composição que inclua um excipiente farmacêutico compatível com a fisiologia humana. A estrutura secundária de 238P1B2, concretamente a presença e localização preditas de hélices alfa, cadeias estendidas 109 e espirais aleatórios, é predita a partir da sequência de aminoácidos primaria utilizando o método de red neural hierárquica - HNN (Guermeur, 1997, direcção web pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa automat.pl?page npsa nn.html), à que se acede desde o servidor de biologia molecular ExPasy (direcção web www.expasy.ch/tools/). A análise indica que 238P1B2 variante la está composta de hélice alfa 66,54%, cadeia estendida 6,69% e espiral aleatória 26,77% (Figura 12A). A análise indica que 238P1B2 variante lb está composta de alfa hélice 61,71%, cadeia estendida 8,86% e espiral aleatória 29,43% (Figura 12B).

Levou-se a cabo a análise com respeito à presença potencial de domínios transmembrana em 238P1B2 utilizando uma diversidade de algoritmos de predição transmembrana aos que se acede desde o servidor de biologia molecular ExPasy (direcção web www.expasy.ch/tools/). Os programas predizem a presença de múltiplos domínios transmembrana em 238P1B2 variante la e variante lb. A maior probabilidade de topologia para a variante la é a de uma proteína de superfície celular com 6 domínios transmembrana. A maior probabilidade de topologia para a variante lb é a de uma porte de superfície celular com 7 domínios transmembrana, que é coerente com a de um receptor acoplado a proteína G. São mostradas graficamente na Figura 12C e Figura 12D os resultados da análise de 238P1B2 variante la utilizando os programas de predição TMpred (Figura 12C) e TMHMM (Figura 12D) que apresentam a localização e topologia dos 6 domínios transmembrana. São mostradas na Figura 12E e Figura 12F os resultados dos programas de predição para 238P1B2 variante lb que mostram a localização e topologia dos 7 domínios transmembrana. Os resultados de cada programa, concretamente os aminoácidos que codificam o domínio transmembrana, são resumidos no Quadro XXII.

Exemplo 10: comparação de homologia de 238P1B2 com sequências conhecidas 110 O gene de 238P1B2 é homólogo de um gene clonado e sequenciado, concretamente o receptor olfactivo de ratinho M0R14-1 (gi 18479244) (Zhang X, Firestein S. Nat Neurosci. 2002, 5:124), que mostra 83% de identidade e 90% de homologia com esse produto génico (Figura 4A; Figura 4C) . A proteína 238P1B2 mostra 78% de identidade e 87% de homologia com outro receptor olfactivo de ratinho, concretamente MOR14-10 (gi 18480766). O homólogo humano mais próximo a 238P1B2 é o receptor olfactivo humano 5BETA12 (5112, gi 17456801), com 61% de identidade e 79% de homologia (Figura 4E) . A comparação de 238P1B2 com outro membro da família do receptor olfactivo humano, concretamente 101P3A11 (patente de referência AGS), a proteína 238P1B2 mostra 48% de identidade e 70% de homologia com 101P3A11, alinhando-se o primeiro aminoácido de 238P1B2 com o aminoácido 62 de 101P3A11. A proteína 238P1B2 variante IA consiste em 254 aminoácidos, com um peso molecular calculado de 28,5kDa e pi de 9,2. 238P1B2 é uma proteína de superfície celular com algo de localização na mitocôndria e retículo endoplasmático. Identificaram-se três formas da proteína 238P1B2, contendo a variante 238P1B2 V2 uma mutação pontual de isoleucina a treonina no aminoácido 225 e contendo a variante 238P1B2 V1B 62 aminoácidos adicionais na sua extremidade amino terminal. (Figura 4F) . Embora tenha sido projectado que 238P1B2 VIA tenha 6 domínios transmembrana, 238P1B2 V1B contém 7 domínios transmembrana, com a extremidade N-terminal orientada extracelularmente e sendo a extremidade C-terminal intracelular (Quadro XXII, Figura 13). 0 análise de motivos revelou a presença de vários motivos conhecidos, incluindo um motivo de GPCR de receptor olfactivo de sete transmembranas e uma repetição de tipo III de fibronectina. As proteínas que são membros da família do receptor acoplado a proteína G mostram uma extremidade amino terminal extracelular, três espirais 111 extracelulares, três espirais intracelulares e uma extremidade carboxilo terminal intracelular. Os receptores acoplados a proteína G são receptores de sete transmembranas que são estimulados por hormonas polipeptídicas, neurotransmisores, quimiocinas e fosfolípidos (Civelli 0 et al, Trends Neurosci. 2001, 24:230; Vrecl M et al., Mol Endocrinol. 1998, 12:1818) . A união de ligandos se produz tradicionalmente entre o primeiro e segundo espirais extracelulares do GPCR. Após a união de ligando os GPCR transduzem sinais através da membrana de superfície celular associando-se a proteínas G triméricas. Seus sinais são transmitidos por meio de proteínas de união a nucleótido de guanina triméricas (proteínas G) a receptor de superfície celular, enzimas efectoras ou canais iónicos (Simon et ai., 1991, Science 252: 802). A transdução de sinal e saída biológica mediada por GPCR pode modular-se através de diversos mecanismos incluindo miméticos peptídicos, moléculas pequenas inibidoras e quinases de GPCR ou GRK (Pitcher JA et ai, J Biol Chem. 1999, 3;274:34531; Fawzi AB, et al. 2001, Mol. Pharmacol., 59:30).

Recentemente, também foi mostrado que os GPCR unem-se a vias de sinalização mitogénicas de tirosina quinases (Luttrell et al. , 1999, Science 283: 655; Luttrell et al., 1999 Curr Opin Cell Biol 11: 177). Os GPCR regulam-se por fosforilação mediada por GPCR quinases (GRK), que por sua vez se activam indirectamente pelos GPCR (Pitcher et al., 1998, Ann. Rev. Biochem. 67: 653). Os GPCR olfactivos transmitem seus sinais activando a via de AMPc por meio de adenilato ciclase tendo como resultado a sinalização a jusante de proteína quinase A e activando a via de fosfolipase C gerando inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3) e diacil-glicerol (DAG) (Breer, 1993, Ciba Found Symp 179: 97; Bruch, 1996, Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 113:451). IP3 tem como resultado um aumento do cálcio 112 intracelular, enquanto que DAG activa a proteína quinase C. Estudos recentes têm associado os GPCR com a transformação celular. Em particular, descobriu-se que o receptor acoplado a proteína G KSHV transforma células NIH 3T3 in vitro e induz lesões de tipo KS multifocais em ratinhos transgénicos KSHV-GPCR (Schwarz M, Murphy PM. J Immunol 2001, 167:505). KSHV-GPCR foi capaz de produzir seu efeito em células endoteliais e fibroblastos activando vias de sinalização definidas, incluindo a via de sobrevivência AKT (Montaner S et al, Câncer Res 2001, 61:2641). Além disso, KSHV-GPCR induziu a activação de vias mitogénicas tais como AP-1 e NFkB, tendo como resultado a expressão pró-inflamatórios (Schwarz M, Murphy PM. J Immunol 2001, 167:505). Outros GPCR associados a formação de tumores incluem G2A e PAR-1, que foi descoberto que induzem a transformação de células NIH 3T3 (Whitehead IP et al, Oncogene 2001, 20:1547).

As regiões de repetições de fibronectina são motivos que medeiam a união a uma diversidade de substâncias tais como receptores de fibronectina, heparina, colágeno e fibrina em superfícies celulares. Devido à sua capacidade de união as fibronectinas estão implicadas em adesão celular, diferenciação celular, proliferação, migração e metástase tumoral (Nykvist P et al, J Biol Chem 2001, 276:38673; Danen EH, Yamada KM. J Cell Physiol 2001, 189:1; Nabeshima K et al, Histol Histopathol 1999, 14:1183). Além disso, a fibronectina potencializa a angiogénese e formação de vasos sanguíneos de novo regulando a migração de células endoteliais, que constituem componentes essenciais dos vasos sanguíneos (Urbich C et al, Arterioscler Thromb Vasc Biol 2002, 22:69), potencializando deste modo o crescimento e sobrevivência tumoral.

Esta informação indica que 238P1B2 desempenha um papel na transformação de células de mamífero, induz respostas mitogénicas incluindo a activação de diversas vias de 113 sinalização e regula a transcrição génica transmitindo sinais de superfície celular ao núcleo. Em consequência, quando 238P1B2 actua como um regulador da transformação celular, formação de tumores ou como um modulador da transcrição implicado na activação de genes associados a inflamação, tumorogénese ou proliferação, 238P1B2 é utilizado para propósitos terapêuticos, de diagnóstico, de prognóstico e/ou preventivos. Além disso, quando uma molécula, tal como uma variante ou polimorfismo de 238P1B2 expressa-se em tecidos cancerosos, é utilizado para propósitos terapêuticos, de diagnóstico, de prognóstico e/ou preventivos.

Exemplo 11: Identificação e confirmação de vias de transdução de sinais potenciais

Indicou-se que muitas proteínas de mamífero interagem com moléculas de sinalização e participam na regulação de vias de sinalização (J Neurochem 2001; 76:217-223). Em particular, indicou-se que os GPCR activam cascatas de MAK assim como proteínas G e têm sido associados com a via EGFR em células epiteliais (Naor, Z., et al, Trends Endocrinol Metab. 2000, 11:91; Vacca F et al, Câncer Res. 2000, 60:5310; Delia Rocca GJ et al, J Biol Chem. 1999,274:13978). Utilizando técnicas de imunoprecipitação e transferência de Western, identificam-se proteínas que se associam a 238P1B2 e medeiam em acontecimentos de sinalização. Podem regular-se várias vias que se sabe que desempenham um papel na biologia do cancro por 238P1B2, incluindo vias de fosfolípidos tais como PI3K, AKT, etc.; vias de adesão e migração, incluindo FAK, Rho, Rac-1, etc.; e cascatas de sobrevivência/mitogénicas tais como ERK, p38, etc. (Cell Growth Differ. 2000,11:279; J BiolChem 1999, 274:801; Oncogene. 2000, 19:3003, J. Cell Biol. 1997, 138:913).

Foi mostrado que vários GPCR transactivam tirosina quinases receptoras associadas à membrana celular, tais como o 114 receptor de EGF (EGFR) (Pierce KL et al, J Biol Chem. 2001, 276:23155; Nath D et al, J Cell Sei. 2001, 114: 1213). Para determinar se a sinalização de 238P1B2 tem como resultado a activação de EGFR, deixam-se crescer células em meio somente ou em presença do inibidor de EGFR AG1517. A fosforilação de EGFR é comparada em células tratadas e de controlo. De forma similar, investiga-se a comunicação entre as vias de 238P1B2 e EGFR.

Para confirmar que 238P1B2 activa directa ou indirectamente vias de transdução de sinal conhecidas nas células, levam-se a cabo ensaios indicadores transcricionais à base de luciferase (luc) em células que expressam genes individuais. Estes indicadores transcricionais contêm locais de união a consenso para factores de transcrição conhecidos que estão situados a jusante de vias de transdução de sinal bem caracterizadas. Os indicadores e exemplos destes factores de transcrição associados, vias de transdução de sinal e estimulos de activação são enumerados a seguir 1. NFkB-luc, NFkB/Rel; Ik-quinase/SAPK; crescimento/apoptose/tensão 2. SRE-luc, SRF/TCF/ELK1; MAPK/SAPK; crescimento/diferenciação 3. AP-l-luc, FOS/JUN; MAPK/SAPK/PKC; crescimento/apoptose/tensão 4. ARE-luc, receptor de andrógenos, esteróides/MAPK; crescimento/diferenciação/apoptose 5. p53-luc, p53; SAPK; crescimento/diferenciação/apoptose 6. CRE-luc, CREB/ATF2; PKA/p38; crescimento/apoptose/tensão Os efeitos mediados por gene podem ensaiar-se em células que mostram expressão de ARNm. Podem produzir-se plasmideos indicadores de luciferase por transfecção mediada por lipidos (TFX-50, Promega). A actividade luciferase, um indicador de actividade transcricional relativa, é medida por incubação de extractos celulares com substrato de 115 luciferina e a luminescência da reacçao é controlada num luminómetro.

As vias de sinalização activadas por 238P1B2 são mapeadas e são utilizadas para identificação e validação de alvos terapêuticos. Quando 238P1B2 está implicada na sinalização celular, é utilizado como alvo para propósitos de diagnóstico, de prognóstico, preventivos e/ou terapêuticos. Exemplo 12: 238P1B2 actua como um GPCR A análise de sequência e homologia de 238P1B2 indica que a proteína 238P1B2 é um membro da família de receptores olfactivos de GPCR. Sabe-se que os receptores olfactivos regulam respostas biológicas activando adenilato ciclase. Para confirmar que 238P1B2 actua como GPCR e média na activação de adenilato ciclase, comprova-se a acumulação de AMPc em células PC3 e PC3-238P1B2 em células cultivadas em presença ou ausência de soro bovino fetal (FBS). As células são lisadas e a concentração intracelular de AMPc é medida utilizando um imunoensaio enzimático (EIA) disponível no mercado. Os cálculos de concentrações de AMPc são baseados em DO450 da curva padrão. De forma similar, o mesmo ensaio pode ser utilizado para determinar se a indução de acumulação de AMPc por 238P1B2 é inibida por inibidores de GPCR tais como toxina pertussis. analisadas com

Os GPCR transmitem seu sinal activando proteínas G triméricas. Uma vez que os GPCR tenham sido activados, a subunidade Ga associada une-se a GTP, dissocia-se do receptor e participa em acontecimentos de sinalização a jusante (Schild D e Restrepo D. Physiol Rev. 1998, 78:429-66). Para determinar que a inibição das subunidades Ga tem um efeito no crescimento celular mediado por 238P1B2, investiga-se o efeito dos inibidores de Ga na proliferação de células 3T3-238P1B2 e PC3-238P1B2. As células de controlo e que expressam 238P1B2 são crescidas em presença ou ausência de suramina ou seu derivado NF 449 (Sigma). As células são analisadas com respeito a proliferação 116 utilizando um ensaio de tipo MTT.

Quando 238P1B2 actua como um GPCR, é utilizado como alvo para propósitos de diagnóstico, prognóstico, preventivos e/ou terapêuticos.

Exemplo 13: Implicação na progressão tumoral 0 gene 238P1B2 pode contribuir ao crescimento de células cancerosas. 0 papel de 238P1B2 no crescimento tumoral é confirmado numa diversidade de linhas celulares primárias e transfectadas incluindo próstata assim como células NIH 3T3 modificadas por engenharia genética para expressar de forma estável 238P1B2. Avaliam-se células parentais sem 238P1B2 e células que expressam 238P1B2 com respeito a crescimento celular utilizando um ensaio de proliferação bem documentado (Fraser SP, Grimes JA, Djamgoz MB. Prostate. 2000;44:61, Johnson DE, Ochieng J, Evans SL. Anticancer

Drugs. 1996, 7:288) . Para confirmar que 238P1B2 medeia na proliferação potencializada por meio da sua actividade GPCR, deixam-se crescer células de controlo e células que expressam 238P1B2 em presença ou ausência de toxina pertussis e avaliam-se com respeito à sua capacidade proliferativa utilizando o mesmo ensaio descrito anteriormente. de 238P1B2 nos ensaios Comparam-se no processo de de formação de células NIH-3T3

Para confirmar o papel transformação, seu efeito colónias é investigado. parentais sem 238P1B2 com células NIH-3T3 que expressam 238P1B2, utilizando um ensaio de agar mole em condições restringentes e mais permissivas (Song Z. et al., Câncer Res. (2000) 60:6730.

Para confirmar o papel de 238P1B2 na invasão e metástase de células cancerosas, é utilizado um ensaio bem estabelecido, por exemplo, um ensaio de sistema de inserção Transwell (Becton Dickinson) (Câncer Res. 1999; 59:6010). Comparam-se células de controlo, incluindo linhas celulares de próstata e fibroblastos sem 238P1B2 com células que expressam 117 238Ρ1Β2. As células são carregadas com o corante fluorescente, calceína, e são semeadas em placas no poço superior da inserção Transwell revestida com um análogo de membrana basal. A invasão é determinada por fluorescência de células na câmara inferior em relação com a fluorescência da população celular completa. 238P1B2 também pode desempenhar um papel no ciclo celular e apoptose. As células parentais e células que expressam 238P1B2 comparam-se com respeito a diferenças na regulação do ciclo celular utilizando um ensaio BrdU bem estabelecido (Abdel-Malek ZA. J Cell Physiol. 1988, 136:247). Em resumo, as células cultivadas em condições tanto óptimas (soro completo) como limitativas (soro baixo) marcam-se com BrdU e coram-se com Ab anti-BrdU e iodeto de propídio. As células são analisadas com respeito a entrada nas fases Gl, S e G2M do ciclo celular. Como alternativa, o efeito de tensão na apoptose avalia-se em células parentais de controlo e células que expressam 238P1B2, incluindo células de próstata normais e tumorais. As células modificadas por engenharia genética e as parentais são tratadas com diversos agentes quimioterapêuticos, tais como etopósido, flutamida, etc, e inibidores de síntese proteica tais como cicloheximida. As células coram-se com anexina V-FITC e a morte celular é medida por análise de FACS. A modulação de morte celular por 238P1B2 pode desempenhar um papel crítico na regulação de progressão tumoral e carga tumoral.

Quando 238P1B2 desempenha um papel no crescimento celular, transformação, invasão ou apoptose, é utilizado como um alvo para propósitos de diagnóstico, prognóstico, preventivo e/ou terapêutico.

Exemplo 14: implicação em angiogénese A angiogénese ou formação de novos vasos sanguíneos capilares é necessária para o crescimento tumoral (Hanahan D, Folkman J. Cell. 1996, 86:353; Folkman J. Endocrinology. 1998 139:441). Com base no efeito dos inibidores de 118 fosfodiesterase em células endoteliais, 238P1B2 desempenha um papel na angiogénese (DeFouw L et al, Microvasc Res 2001, 62:263) . Têm sido desenvolvidos vários ensaios para medir a angiogénese in vitro e in vivo, tais como os ensaios de cultura tissular de formação de tubo celular endotelial e proliferação de células endoteliais. Utilizando estes ensaios assim como neovascularização in vitro, é confirmado o papel de 238P1B2 em angiogénese, potencialização ou inibição.

Por exemplo, as células endotelilais modificadas por engenharia genética para expressar 238P1B2 avaliam-se utilizando ensaios de formação de tubos e proliferação. O efeito de 238P1B2 também é confirmado em modelos animais in vivo. Por exemplo, as células que expressam ou não possuem 238P1B2 são implantadas de forma subcutânea em ratinhos imunocomprometidos. A migração celular endotelial e angiogénese avaliam-se em 5-15 dias depois utilizando técnicas de imunohistoquímica: 238P1B2 afecta à angiogénese e é utilizado como um alvo para propósitos de diagnóstico, prognóstico, preventivo e/ou terapêutico.

Exemplo 15: Regulação da transcrição A localização de superfície celular de 238P1B2 e as suas similaridades com GPCR indica que 238P1B2 é utilizado eficazmente como um modulador da regulação transcricional de genes eucariotas. A regulação da expressão génica é confirmada, por exemplo, estudando a expressão génica em células que expressam ou não possuem 238P1B2. Para este propósito, realizam-se dois tipos de experimentos.

No primeiro conjunto de experiências, extrai-se ARN de células parentais e que expressam 238P1B2 e hibrida-se com séries génicas disponíveis no mercado (Clontech) (Smid-Koopman E et al. Br J Câncer. 2000. 83:246). Comparam-se células em repouso assim como células tratadas com FBS ou androgénio. Identificam-se genes expressos diferencialmente de acordo com métodos conhecidos na técnica. Os genes 119 expressos diferencialmente são mapeados depois em vias biológicas (Chen K et ai. Thyroid. 2001. 11:41.).

No segundo conjunto de experiências, avalia-se a activação de via transcricional especifica utilizando construções indicadoras de luciferase disponíveis no mercado (Stratagene) incluindo: NTkB-luc, SRE-luc, ELKl-luc, ARE-luc, p53-luc e CRE-luc. Estes indicadores trasncripcionais contêm locais de união consenso para factores de transcrição conhecidos que estão situados a jusante das vias de tradução de sinal bem caracterizadas e representam uma boa ferramenta para determinar a activação da via e explorar com respeito a moduladores positivos e negativos da activação da via.

Portanto, 238P1B2 desempenha um papel na regulação génica e é utilizado como um alvo para propósitos de diagnóstico, prognóstico, preventivos e/ou terapêuticos.

Exemplo 16. Implicação em adesão celular. A adesão celular desempenha um papel crítico em colonização tissular e metástase. Com base na presença de uma repetição de fibronectina na sua extremidade C-terminal, 238P1B2 pode participar na organização celular e como consequência afecta à adesão e mobilidade celular. Para confirmar que 238P1B2 regula a adesão celular, comparam-se células de controlo sem 238P1B2 com células que expressam 238P1B2, utilizando técnicas previamente descritas (veja-se, por exemplo, Haier et al, Br. J. Câncer. 1999, 80:1867; Lehr e

Pienta, J. Natl. Câncer Inst. 1998, 90:118). Brevemente, incubam-se células marcadas com um indicador fluorescente, tais como calceína, em poços de cultura tissular revestidos com meio somente ou com proteínas da matriz. As células aderentes são detectadas por análise fluorimétrica e calcula-se a percentagem de adesão. Como alternativa, são analisadas células que não possuem ou expressam 238P1B2 com respeito à sua capacidade para mediar adesão célula-célula utilizando técnicas experimentais similares como foi 120 descrito anteriormente. Ambos estes sistemas experimentais são utilizados para identificar proteinas, anticorpos e/ou moléculas pequenas que modulam a adesão celular a matriz extracelular e interacção célula-célula. A adesão celular desempenha um papel critico no crescimento, progressão e colonização tumoral e 238P1B2 está implicada nestes processos. Portanto, actua como uma modalidade de diagnóstico, prognóstico, preventiva e/ou terapêutica. Exemplo 17: Associação proteína-proteína

Foi mostrado que vários GPCR interagem com outras proteínas, regulando deste modo a transdução de sinais, transcrição génica, transformação e adesão celular (Sexton PM et al, Cell Signal. 2001, 13:73; Turner CE, J Cell Sei. 2000, 23:4139). Utilizando técnicas de imunoprecipitação assim como dois sistemas de híbrido de levedura, são identificadas proteínas que se associam a 238P1B2. Comparam-se imunoprecipitados de células que expressam 238P1B2 e células sem 238P1B2 com respeito a associações proteína-proteína específicas.

Realizam-se estudos para confirmar o alcance da associação de 238P1B2 com moléculas efectoras, tais como proteínas nucleares, factores de transcrição, quinases, fosfatos, etc. Os estudos que comparam células positivas para 238P1B2 e negativas para 238P1B2 assim como estudos que comparam células não estimuladas/em repouso e células tratadas com activadores de células epiteliais, tais como citocinas, factores de crescimento, androgénio e Ab anti-integrina revelam interaeções únicas.

Além disso, confirmam-se as interaeções proteína-proteína utilizando metodologia de dois híbridos de levedura (Curr Opin Chem Biol. 1999, 3:64). Introduz-se um vector que porta uma biblioteca de proteínas fusionadas com o domínio de activação de um factor de transcrição em levedura que expressa uma proteína de fusão de domínio de união ADN-238P1B2 e uma construção indicadora. A interacção proteína- 121 proteína é detectada por actividade indicadora colorimétrica. A associação específica com moléculas efectoras e factores de transcrição dirige a um perito na especialidade ao modo de acção de 238P1B2 e identifica deste modo alvos terapêuticos, de prognóstico, preventivos e/ou de diagnóstico para cancro. Este e outros ensaios similares também são utilizados para identificar e explorar com respeito a moléculas pequenas que interagem com 238P1B2.

Portanto, descobre-se que 238P1B2 se associa a proteína e moléculas pequenas. Em consequência, 238P1B2 e estas proteínas e moléculas pequenas são utilizadas para propósitos de diagnóstico, prognóstico, preventivos e/ou terapêuticos.

QUADROS QUADRO I: Tecidos que expressam 238P1B2 quando são tumorais

Próstata

QUADRO II: ABREVIATURAS DE AMINOÁCIDOS UMA LETRA TRÊS NOME COMPLETO F Phe fenilalanina L Leu leucina s Ser serina E Tyr tirosina C Cys cisteína w Trp triptofano P Pro prolina H His histidina Q Gin qlutamina R Ara arginina I Ile isoleucina M Met metionina T Thr treonina N Asn asparagina K Lys lisina 122 UMA LETRA TRÊS NOME COMPLETO V Vai valina A Ala alanina D Asp ácido E Glu ácido G Gly qlicina

QUADRO III: MATRIZ DE SUBSTITUIÇÃO DE AMINOÁCIDOS

Adaptada da matriz de substituição de aminoácidos de GCG Software 9.0 BLOSUM62 (matriz de substituição em bloco). Quanto maior seja o valor, mais provável é que se encontre uma substituição em proteínas relacionadas naturais. (Veja-se a World Wide Web URL www.ikp.unibe.ch/manual/blosum6 2.html) c D E F G H I K L M N P Q R S T V W E 0 - - -2 0 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 -1 -1 1 0 0 -3 -2 A 2 1 9 - - -2 -3 -3 -1 -3 -1 -1 -3 -3 -3 -3 -1 -1 -1 -2 -2 C 3 4 6 2 -3 -1 -1 -3 -1 -4 -3 1 -1 0 -2 0 -1 -3 -4 -3 D 5 -3 -2 0 -3 1 -3 -2 0 -1 2 0 0 -1 -2 -3 -2 E 6 -3 -1 0 -3 0 0 -3 -4 -3 -3 -2 -2 -1 1 3 F 6 -2 -4 -2 -4 -3 0 -2 -2 -2 0 -2 -3 -2 -3 G 8 -3 -1 -3 -2 1 -2 0 0 -1 -2 -3 -2 2 H 4 -3 2 1 -3 -3 -3 -3 -2 -1 3 -3 -1 I 5 -2 -1 0 1 2 0 -1 -2 -3 -2 K 4 2 -3 -3 -2 -2 -2 -1 1 -2 -1 L 5 -2 -2 0 -1 -1 -1 1 -1 -1 M 6 -2 0 0 1 -3 -4 -2 N 7 -1 -2 -1 -1 -2 -4 -3 P 5 1 0 -1 -2 -2 -1 Q 5 -1 -1 -3 -3 -2 R 4 1 -2 -3 -2 S 5 0 -2 -2 T 4 -3 -1 V 11 2 w 123 7 Ε

Quadro XXI: Motivos e Modificações Pós-traducionais de 238P1B2

Locais de fosforilação de proteína quinase dependente de AMPc e GMPc.

176 - 179 RKeT

Local de fosforilação de proteína quinase C.

235 - 237 SvK

Local de fosforilação de caseina quinase II. 9-12 SatD 50 - 53 TvmE 130 - 133 SctD 172 - 175 SpeC Local de N-miristoilação.

14 - 19 GLsiST

Identificação de família de receptores acoplados a proteína G 1.

52-68 MESsvLlaMAFDRFvaV

Família de receptores acoplados a proteína G 1. 1-234 QUADRO XXII: Características Físicas de 238P1B2

238P1B2 Variante IA Programa Bioinformático URL Resultado ORF ORF finder 3758 pb Comprimento da proteína 254 aa Região transmembraba TM Pred World Wide Web URL www. cli, embnet, or g/ Extremidade N terminal intracelular, 6 TM hélices TM em 3-29, 44-62, 86-110, 144-161, 182-203, 217-236aa HMMTop World Wide Web URL Extremidade N 124 124 www , e nzim, h u / bmmtop/ intracelular, 6TM hélices TM em 6-28, 43-62, 86-105, 136-158, 180-203, 216-235aa 125(continuação)

Sosui World Wide Web URL www.genome.ad. 'jp/SOSui/ Proteína de membrana, 6TM hélices Tm em 6-28, 42-64, 87-109, 144-166, 187-209, 217-23 7aa TMHMM World Wide Web URL wv;w . cbs . dtu . dk/ services/TMH MM Extremidade N terminal intracelular, 6TM hélices TM em 7-29, 44-66, 86-108, 142-164, 185-207, 212-234aa Péptido sinal Signal P World Wide Web URL www.cbs.dtu.dk/services/ Signal P/ local de excisão entre 169-170aa pi pI/MW tool World Wide Web URL wwví . θκρô.sv < cby too.i.s/ pi 9,24 Peso molecular pI/MW tool World Wide Web URL www < exp3.sy < ch./tools/ 28,59 kDa Localização PSORT World Wide Web URL psort.nibb.ac.jp/ 60% membrana plasmática, 42,9% membrana interna mitocôndrial, 40% Golgi, 30% membrana de retículo endoplasmático 126 127 (continuação) PSORT II World Wide Web URL psort.nibb.ac.jp/ 44,4% retículo endoplasmático, 22,2% membrana plasmática Motivos Pf am World Wide Web URL www.sanger.ac.uk/Pfam/ receptor 7TM (família de rodopsina) Prints World Wide Web URL www.biocbemuc!. ac,uk/ Identificação de receptor olfactivo, proteína R de membrana interna do sistema de secreção de Tipo III, identificação de repetição de tipo III de fibronectina Blocks World Wide Web URL www.blocks.fchcrc.orq/ sem motivo significativo 238P1B2 Variante IA Programa Bioinformático URL Resultado 238P1B2 Variante 1B Programa Bioinformático URL Resultado ORF ORF finder 3758 pb Comprimento da proteína 316 aa 128 Região TM Pred transmembrana HMMTop (continuação)

World Wide Web URL www. ch , erabnet. orq / extremidade N terminal extracelular, 8TM hélices TM em 9-27,33-51, 75-91, 98-125, 145-171, 206-226, 249-265,

World Wide Web URL www .enzlrs, hu/hmmt op/ 276-296aa extremidade N terminal extracelular, hélices TM em 7TM 29-

Sosui

World Wide Web URL www.qenome,ad.;j ρ/SOSu 1 / 53, 66-90, 105-124, 148-171, 202-226, 241-265, 278- 2 9 7aa_

Proteína de membrana, 8TM hélices TM em 2-24, 33-55, 67-89, 104-126, 149-171, 206-228,245-267,279-299aa 129(continuação) TMHMM World Wide Web URL chs . drii * dk/ extremidade N terminal services/TMH MM intracelular, 7TM hélices TM em 30-52, 65-87, 102-124,145-167,204-226, 247-269, 274-296aa Péptido sinal Signal P World Wide Web URL ww.cbs, d;; a .dk/se r ri c e s / Signal P/ local de excisão entre aa 26 e 27 pi pI/MW tool World Wide Web URL pi 9,03 Peso molecular pl/MW tool World Wide Web URL 35,34 kDa Localização PSORT World Wide Web URL psort.nibb.ac.jp/ 64% de membrana plasmática, 46% Golgi, 37% membrana do retículo endoplasmático PSORT II World Wide Web URL psort.nibb.ac.jp/ 44,4% retículo endoplasmático, 33,3% membrana plasmática 130 (continuação)

Motivos Pf am World Wide Web URL www.sanger.ac.uk/Pfam/ recpetor de 7TM (família de rodopsina), proteína de biosíntese de polisacáridos Prints World Wide Web URL www.brochem.ucl.ac.uk/ Identificação de receptor olfactivo, proteína R de membrana interna do sistema de secreção de tipo III, identificação de repetição de tipo III de fibronectina Blocks World Wide Web URL www < b 1 ock s < l hcr c . or cj / Sem motivo significativo

Quadro XXIII. Composições Exónicas de 238P1B2 v.l Número de Começo Propósito Exão 1 1 3758 131

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor da presente solicitação de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição wo 0127158 A [0025] wo 0216548 A [0025] EP 1270724 A [0025] WO 9733602 A [0099] US 4640835 A [0108] us 4496689 A [0108] US 4301144 A [0108] us 4670417 A [0108] us 4791192 A [0108] us 4179337 A [0108] us 5428130 A [0109] us 5837501 A [0121] us 5382510 A [0131] us 5952170 A [0131] us 5955280 A [0141] us 5925523 A [0141] us 5846722 A [0141] us 6004746 A [0141] us 5723286 A [0143] us 5733731 A [0143] us 5928868 A [0145] us 5840501 A [0153] us 5939533 A [0153] 132

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Claims (1)

1 REIVINDICAÇÕES detectar de teste, 1. Um método para próstata numa amostra a presença de cancro cujo método compreende: de liga sonda que se Figura 2B; e essa amostra. colocar em contacto a amostra com uma especificamente a um polinucleótido da detectar a ligação do polinucleótido a