PT1432402E - Composições para administração de combinações de fármacos - Google Patents

Description

ΕΡ 1 432 402 /PT

DESCRIÇÃO "Composições para administração de combinações de fármacos"

Domínio Técnico O invento refere-se a composições e métodos para uma melhor administração de combinações sinérgicas ou aditivas de agentes terapêuticos. Mais particularmente, o invento refere-se a sistemas de administração que asseguram a manutenção de proporções sinérgicas ou aditivas quando os agentes são administrados a um alvo pretendido proporcionando uma formulação compreendendo veículos de administração.

Arte Anterior 0 avanço de muitas doenças que ameaçam a vida, tais como o cancro, a SIDA, doenças infecciosas, doenças imunológicas e doenças cardiovasculares, é influenciado por mecanismos moleculares múltiplos. Devido a esta complexidade, a obtenção de curas com um único agente tem sido conseguida com sucesso limitado. Deste modo, as combinações de agentes têm sido frequentemente utilizadas para combater as doenças, particularmente, no tratamento de cancros. Parece que existe uma forte correlação entre o número de agentes administrados e as taxas de cura para cancros, tais como a leucemia linfocítica aguda. (Frei, et al., Clin, Câncer Res. (1998) 4: 2027-2037). Ensaios clínicos que utilizam combinações de doxorubicina, ciclofosfamida, vincristina, metotrexato com auxílio de leucovorina e citarabina (ACOMLA) ou ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, prednisona e bleomicina (CHOP-b), têm sido utilizados com sucesso para tratar o linfoma histiocítico (Todd, et al., J. Clin. Oncol. (1984) 2: 986-993) .

Os efeitos das combinações de fármacos são aumentados quando a proporção em que são fornecidos proporciona um efeito sinérgico. Demonstrou-se também que as combinações sinérgicas de agentes reduziam a toxicidade devido aos baixos requisitos de dose, para aumentar as taxas de cura do cancro (Barriere, et al., Pharmacotherapy (1992) 12: 397-402; Schimpff, Support Care Câncer (1993) 1: 5-18), e que reduziam a propagação de 2

ΕΡ 1 432 402 /PT estirpes de microorganismos multirresistentes (Shlaes, et ai., Clin. Infect. Dis. (1993) 17: S527-S536). Ao escolher agentes com diferentes mecanismos de acção, podem ser atacados múltiplos locais em vias bioquímicas, resultando deste modo em sinergia (Shah e Scwartz, Clin. Câncer Res. (2001) 7: 2168- 2181). Combinações, tais como L-canavanina e 5-fluorouracilo (5—FU), têm sido relatadas como exibindo uma maior actividade antineoplásica em modelos de tumores no cólon de ratos do que os efeitos combinados de cada um dos fármacos a sós (Swaffer, et ai. ai., Anti-Cancer Drugs (1995) 6: 586-593). A cisplatina e o etoposido apresentam sinergia no combate ao crescimento de uma linhagem celular de cancro do pulmão de células pequenas humano, SBC-3 (Kanzawa, et ai., Int. J. Câncer (1997) 71 (3): 311-319).

Registos adicionais de efeitos sinérgicos são encontrados para:

Vinblastina e interferão β recombinante (Kuebler, et ai., J. Interferon Res. (1990) 10: 281-291);

Cisplatina e carboplatina (Kobayashi, et ai., Nippon Chryo Gakkai Shi (1990) 25: 2684-2692);

Etildesidroxiesparsomicina e cisplatina ou arabinósido de citosina (AraC) ou metotrexato ou 5-FU ou vincristina (Hofs, et ai. ai., Anticancer Drugs (1994) 5:35-42); Ácido retinóico "todo trans" e ácido butírico ou tributirina (Chen, et ai., Chin. Med. Engl. (1999) 112: 352- 355); e

Cisplatina e paclitaxel (Engblom, et ai., Br. J. Câncer (1999) 79: 286-292).

Nos estudos anteriores foi reconhecida a importância da proporção dos componentes para a sinergia. Por exemplo, verificou-se que o 5-fluorouracilo e L-canavanina eram sinérgicos a uma proporção molar de 1:1, mas antagonísticos a uma proporção de 5:1; a cisplatina e a carboplatina mostraram um efeito sinérgico a uma proporção de área sob a curva (AUC) de 13:1 mas um efeito antagonístico a 19:5. 3

ΕΡ 1 432 402 /PT

Tem sido demonstrado que outras combinações de fármacos apresentam interacções sinérgicas embora a dependência da interacção da proporção da combinação não tenha sido descrita. Esta lista é bastante extensiva e é principalmente composta por relatórios de culturas in vitro embora, ocasionalmente, sejam incluídos estudos in vivo.

Adicionalmente à multiplicidade de relatos, um certo número de combinações tem sido mostrado como sendo eficaz em clínica. Estas são descritas na tabela abaixo. REFERÊNCIA Langer, et ai. (1999) Drugs 58 Supl. 3: 71-75 FDAa (Cancro do cólon ou rectal) FDA (Cancro do cólon ou rectal) FDA (Cancro da mama) FDA (Cancro da mama) FDA (Cancro dos ovários e do pulmão) FDA (Cancro do pulmão) FÁRMACO 1 Cisplatina ou vindesina Leucovorina

Irinotecano

FÁRMACO 2 FÁRMACO 3 + UFT (Tegafur/uracilo) + 5-FU

+ Leucovorina + 5-FU FDA (Cancro do pulmão) FDA (Próstata) FDA (Leucemia não linfocitica aguda) FDA (Leucemia não linfocitica aguda/ Leucemia linfocitica aguda) FDA (Leucemia mielogénica crónica)

Herceptina Xeloda (outros nomes: Capecitabina) Paclitaxel Etoposido Gencitabina Novantrona (cloridrato de mitoxantrona) Novantrona Daunorubicina (DNR, Cerubidina)

+ Paclitaxel + Docetaxel + Cisplatina + Outros agentes quimioterapêuticos aprovados pela FDA + Cisplatina + Corticosteróides + Outros fármacos aprovados pela FDA + Outros fármacos aprovados pela FDA

Busulfex (Busulfano; + Ciclofosfamida 1,4-butanodiol, (Citoxano) dimetanossulfonato; BU, Myleran) FDA: Food and Drug Administration dos Estados Unidos 4

ΕΡ 1 432 402 /PT

Adicionalmente, pode-se postular, a partir de vários relatórios na literatura, que certas outras combinações têm o potencial para exibir efeitos de combinação não antagonistica ou eficácia clínica ou serem aceites como padrões de cuidados em grupos de estudo regionais. Estas são: DOENÇA FARMACO 1 FARMACO 2 (Cancro do cólon) Oxaloplatina + 5-FU (ou FUDR) (Cancro metastático da Taxol + Doxorubicina mama) Adriamicina + Citoxano (doxorubicina) (ciclofosfamida) Metotrexato + 5-FU (ou FUDR) Vinblastina + Doxorubicina (Cancro do pulmão de Carboplatina + Taxol célula não pequena) Cisplatina +Docetaxel (Taxotere®) Vinorelbina + Cisplatina Irinotecano + Cisplatina (Cancro do pulmão de Carboplatina + Taxol célula pequena) Cisplatina + Etoposido (Cancro da próstata) Estramustina + Taxol Estramustina + Mitoxantrona Estramustina + Taxotere (Linfoma de Hodgkin) Bleomicina (como parte de ABDV: Adriamicina, Bleomicina, DTIC, Vinblastina) + Vinblastina (Linfoma não de Hodgkin) Carboplatina (como parte de ICE: Ifosfamida, Carboplatina, Etoposido) + Etoposido (Melanoma) IL-2 + Cisplatina (Leucemia mielóide Daunorubicina + Arabinósido de aguda) citosina Vincristina + Doxorubicina (Cancro da bexiga) Carboplatina + Taxol Carboplatina + Gencitabina Gencitabina + Taxol Vinblastina (como parte de MVAC: Metotrexato, Vinblastina, Adriamicina, Cisplatina) + Doxorubicina (Cancro da cabeça e do pescoço) 5-FU (ou FUDR) + Cisplatina (Cancro do pâncreas) Gencitabina + 5-FU (ou FUDR) Combinações adicionais: Carboplatina + 5-FU (ou FUDR) Carboplatina + Irinotecano Irinotecano + 5-FU (ou FUDR) Vinorelbina + Carboplatina Metotrexato + 5-FU (ou FUDR) Idarubicina + AraC Adriamicina + Vinorelbina Safingol + Fenretinida FARMACO 3 + Leucovorina + Citoxano + Leucovorina 5

ΕΡ 1 432 402 /PT

Apesar das desvantagens atrás mencionadas associadas à utilização de combinações sinérgicas de fármacos, existem vários inconvenientes que limitam a sua utilização terapêutica. Por exemplo, a sinergia depende frequentemente de vários factores, tais como a duração da exposição ao fármaco e a sequência da administração. (Bonner e Koxelsky, Câncer

Chemother. Pharmacol. (1990) 39: 109-112). Estudos utilizando etildesidroxiesparsomicina em combinação com a cisplatina mostram que a sinergia é influenciada pelas proporções de combinação, a duração do tratamento e a sequência do tratamento (Hofs, et al., supra). É deste modo sabido que, de modo a que seja exibida sinergia por uma combinação de agentes, estes agentes têm que estar presentes em quantidades que representam proporções definidas. Na verdade, a mesma combinação de fármacos pode ser antagonistica para algumas proporções, sinérgica para outras e ainda aditiva para outras. É desejável evitar efeitos antagonisticos, de modo a que os fármacos sejam, pelo menos, aditivos. O presente invento reconhece que o resultado obtido para uma proporção individual é também dependente da concentração. Algumas proporções são antagonísticas para uma concentração e não antagonísticas para outra. O invento assegura proporções de componentes na gama sinérgica ou aditiva administrando estes agentes em formulações que mantêm a proporção desejada ou administrada quando a localização alvo no indivíduo é atingida e seleccionando as proporções para serem predominantemente não antagonísticas para uma desejada gama de concentrações, uma vez que a concentração no alvo pode ser diferente da administrada. A publicação do PCT WO 00/51641 descreve a administração de uma combinação de agentes antivirais que se diz ser sinérgica. Testes in vitro foram utilizados para determinar proporções sinérgicas. Contudo, não é ensinado qualquer modo de administração que mantenha esta proporção in vivo. Na verdade, a publicação afirma que os componentes podem ser administrados sequencial ou simultaneamente. A publicação do PCT WO 01/15733 descreve composições putativamente sinérgicas para tratar doenças auto-imunes. 6

ΕΡ 1 432 402 /PT

Novamente, o método de formulação não assegura a manutenção desta proporção após a administração.

Daoud, et al. al., Câncer Chemother. Pharmacol. (1991) 28: 370-376, descreve acções citotóxicas sinérgicas da cisplatina e da valinomicina lipossómica em células do cancro dos ovários humanos. Este artigo descreve um ensaio in vitro em gue a cisplatina que está livre e a valinomicina que está encapsulada em lipossomas são utilizadas para tratar culturas de CaOV-3, uma linhagem de células derivadas de tumores de ovários humanos. Os autores determinaram a gama de concentrações na qual era apresentada sinergia e antagonismo. O encapsulamento em lipossomas foi empregue para solubilizar a valinomicina. Como as experiências são realizadas in vitro, a administração in vivo é irrelevante. A patente U.S. 6 214 821 concedida a 10 de Abril de 2001 a Daoud, descreve composições farmacêuticas contendo inibidores da topoisomerase I e uma estaurosporina. As reivindicações parecem ser baseadas na verificação de que as estaurosporinas possuem a capacidade de anular a retenção na fase S induzida pelo inibidor da topoisomerase I e de aumentar a sua citotoxicidade para células de cancro da mama humano sem função de p53 normal. Não é sugerida uma formulação farmacêutica particular. A patente U.S. 5 000 958 de Fountain, et al.r descreve misturas de agentes antimicrobianos encapsulados em lipossomas que são referidos como exercendo um maior efeito terapêutico in vivo. Proporções adequadas de agentes antimicrobianos são determinadas através de um teste do efeito combinado que testa empiricamente a sinergia in vivo. Não existe discussão em relação a assegurar uma proporção sinérgica ao longo de uma gama de concentrações.

Schiffelers, et al., J. Pharmacol. Exp. Therapeutic (2001) 298: 369-375, descrevem a interacção sinérgica in vivo de gentamicina e ceftazidima co-encapsuladas em lipossomas. As proporções desejadas foram determinadas utilizando um teste do efeito de combinação semelhante ao de Fountain (supra), mas não existe discussão em relação à determinação de uma 7

ΕΡ 1 432 402 /PT proporção em que a sinergia é mantida ao longo de uma gama de concentrações. O presente invento reconhece, em primeiro lugar, que é possível manter uma determinada proporção sinérgica ou aditiva de agentes terapêuticos controlando a farmacocinética da formulação em que são administrados, e, em segundo lugar, que a proporção não antagonística tem que ser exibida ao longo de uma gama de concentrações, uma vez que a concentração de componentes num cocktail de fármacos que atinge o tecido alvo pode não ser a mesma de quando é administrado. O problema de manter a sinergia ou a aditividade é resolvido reconhecendo que quando os agentes terapêuticos estão encapsulados em (i.e. estavelmente associados a) veículos de administração, tais como lipossomas, os veículos de administração determinam a farmacocinética e, deste modo, os agentes que são encapsulados comportar-se-ão de maneira semelhante, e seleccionando proporções que são predominantemente sinérgicas/aditivas ao longo de uma gama de concentrações.

Descrição do Invento O invento refere-se a métodos para administrar proporções não antagonísticas de agentes antineoplásicos, utilizando composições de veículo de administração que encapsulam dois ou mais agentes, em que os agentes estão presentes nos veículos com proporções sinérgicas ou aditivas (i.e. não antagonísticas) ao longo de uma gama de concentrações. Antes do encapsulamento, as proporções de agentes antineoplásicos na combinação são seleccionadas de modo a que a combinação apresente sinergia ou aditividade ao longo da gama de concentrações desejada. O encapsulamento em veículos de administração permite que dois ou mais agentes sejam administrados no local desejado de maneira coordenada, assegurando, deste modo, que os agentes estarão presentes no local desejado com uma proporção não antagonística. Este resultado será conseguido quer os agentes sejam co-encapsulados em veículos de administração, quer sejam separadamente encapsulados em veículos de administração administrados de modo a que as proporções não antagonistas sejam mantidas no local da doença. A farmacocinética (PK) da composição é controlada pelos próprios veículos de 8 ΕΡ 1 432 402 /PT administração de modo a que se atinja uma administração coordenada (desde que as PK dos sistemas de administração sejam comparáveis).

Deste modo, num aspecto, o invento proporciona uma composição de veículo de administração para administração parentérica compreendendo dois ou mais agentes encapsulados na composição de veiculo com uma proporção que é sinérgica ou aditiva ao longo de uma gama de concentrações desejada. A composição de veiculo de administração é preparada através de um processo compreendendo o encapsulamento dos agentes na composição de veiculo de administração com estas proporções. A proporção não antagonistica dos agentes é determinada avaliando a actividade biológica ou os efeitos dos agentes na cultura de células relevante ou nos sistemas sem células ao longo de uma gama de concentrações e, numa concretização, por aplicação de um algoritmo para determinar um "índice de combinação" (IC). Tal como descrito adiante, utilizando algoritmos reconhecidos, pode ser calculado um índice de combinação para cada nível de concentração. São seleccionadas proporções em que o IC representa sinergia ou aditividade ao longo de uma gama de concentrações. Preferencialmente, o IC é sinérgico ao longo de uma larga gama de concentrações. Os agentes são agentes antitumorais. Pode ser utilizado qualquer método que resulte na determinação de uma proporção de agentes que mantenha um efeito não antagonístico ao longo de uma gama desejada de concentrações.

Mais particularmente, o invento refere-se a uma composição farmacêutica para administração parentérica, compreendendo veículos de administração em partículas tendo associados, pelo menos, um primeiro agente antineoplásico e um segundo agente antineoplásico, em que os referidos primeiro e segundo agentes estão numa proporção molar que exibe um efeito não antagonístico citotóxico ou citostático e em que os referidos primeiro e segundo agentes estão associados a veículos de administração para manter uma proporção não antagonística no sangue após administração. Numa concretização, a proporção molar do primeiro agente em relação ao segundo agente exibe um efeito não antagonístico citotóxico ou citostático para células relevantes em cultura ao longo de, pelo menos, 5% da gama de concentrações em que >1% das células são afectadas (fa 9

ΕΡ 1 432 402 /PT >0,01) num ensaio in vitro para o referido efeito citotóxico ou citostático. Por células "relevantes", os requerentes referem-se a, pelo menos, uma cultura de células ou linhagem de células que é adequada para testar o desejado efeito biológico. Por exemplo, se o agente é um agente antineoplásico, uma célula "relevante" seria uma linhagem de células identificada pelo Programa de Desenvolvimento de Terapêuticas (DTP - Development Therapeutics Program) do National Câncer Institute (NCI) /National Institutes of Health (NIH) como sendo úteis no seu programa de identificação de fármacos anticancerosos. Correntemente o DTP utiliza 60 diferentes linhagens de células de tumores humanos. Necessita de ser demonstrada a actividade desejada em, pelo menos, uma destas linhagens.

As composições do invento são utilizadas para administrar uma proporção sinérgica ou aditiva de dois ou mais agentes antineoplásicos a um alvo desejado administrando as composições do invento.

Noutro aspecto, o invento é dirigido a um método para preparar uma composição do invento, método esse que compreende a) a determinação num ensaio de cultura de células relevantes ou num ensaio sem células para a actividade citotóxica ou citostática, de uma proporção molar dos referidos primeiro e segundo agentes, que é não antagonistica ao longo de, pelo menos, 5% da gama de concentrações em que mais do que 1% das células são afectadas (fa >0,01) pela referida proporção de agentes, e b) o encapsulamento com os referidos veículos de administração de uma proporção molar de agentes determinada como sendo não antagonistica no passo a). O método pode compreender o facto de proporcionar um painel de, pelo menos, dois agentes em que o painel compreende, pelo menos um mas, preferencialmente, uma multiplicidade de proporções dos referidos agentes, o teste da capacidade dos membros do painel para exercer um efeito citotóxico ou citostático numa cultura de células relevantes ou num sistema sem células, ao longo de uma gama de concentrações, a selecção de um membro do painel em que a proporção proporciona um efeito sinérgico ou aditivo na referida cultura de células ou sistema sem células, ao longo de uma gama adequada de concentrações; e encapsulamento (i.e. associação estável) da proporção de agentes representada 10

ΕΡ 1 432 402 /PT pelo membro do painel com sucesso nos veículos de administração de fármaco.

Tal como descrito a seguir, numa concretização preferida, ao projectar uma combinação adequada de acordo com o método descrito acima, as proporções não antagonistas são seleccionadas como sendo aquelas que possuem um índice de combinação (IC) de <1,1 ao longo de uma gama de, pelo menos, 5% das doses ou concentrações que afectam mais do que 1% ou mais das células (fa >0,01), preferencialmente entre 20 e 80% das células (fa = 0,2 a 0,8), tal como definido por sistemas de culturas de células relevantes.

Breve Descrição dos Desenhos A FIGURA 1 é um diagrama que representa o método do invento para determinar uma proporção adequada de agentes terapêuticos a incluir em formulações. A FIGURA 2 (A-E) ilustra 5 métodos para apresentar resultados de combinação e sinergia. A FIGURA 3A é um gráfico do índice de combinação (IC) para irinotecano:5-FU com proporções molares de 1:10 (quadrados a cheio) e 1:1 (círculos a cheio) em função da fracção de células HT29 afectadas (fa) . A FIGURA 3B é um gráfico do IC para etoposido:carboplatina com proporções molares de 1:10 (losangos a cheio) e 10:1 (quadrados a cheio) em função da fracção de células MCF-7 afectadas (fa) . A FIGURA 4 é um gráfico do IC para cisplatina:edelfosina com proporções molares de 1:10 (triângulos a cheio) e 10:1 (círculos a cheio) em função da fracção de células H-460 afectadas (fa) . A FIGURA 5A é um gráfico do IC máximo em função de carboplatina:daunorubicina com proporções molares de 10:1, 1:1 e 1:10 em células H460. A inserção é um histograma de IC para carboplatina:daunorubicina com proporções molares de 10:1 e 11 ΕΡ 1 432 402 /PT 1:1 para valores de Dose Efectiva (ED) de 50, 75 e 90 em células MCF-7. A FIGURA 5B é um gráfico do IC para carboplatina:daunorubicina com proporções molares de 1:10 (triângulos a cheio), 1:1 (quadrados a cheio) e 10:1 (círculos a cheio) em função da fracção de células H460 afectadas (fa). A inserção é um histograma do IC para carboplatina:daunorubicina com proporções molares de 1:10, 1:1 e 10:1 a valores de ED de 50, 75 e 90 em células H460. A FIGURA 6 é um gráfico das concentrações de carboplatina (círculos a branco) e daunorubicina (círculos a cheio) em plasma (mmol/ml) em função do tempo após administração intravenosa quando os fármacos são formulados num único lipossoma (DSPC/DSPG, 80:20%mol) com uma proporção não antagonística (10:1). A FIGURA 7 A é um gráfico da proporção molar de carboplatina:daunorubicina em função do tempo após administração intravenosa com três proporções diferentes quando os fármacos são formulados num único lipossoma (DSPC/DSPG, 80:20%mol) a 10:1 (círculos a cheio), 5:1 (círculos a branco) e 1:1 (triângulos a cheio). A FIGURA 7B é um gráfico dos dados de carboplatina:daunorubicina 1:1 da FIGURA 7A novamente registados em função do tempo após administração intravenosa. A FIGURA 8 é um gráfico das concentrações de carboplatina (círculos a cheio) e daunorubicina (círculos a branco) no plasma (mmol/ml) em função do tempo após administração intravenosa quando os fármacos são formulados com uma proporção molar não antagonística (10:1) num único lipossoma (DSPC/esfingomielina/DSPE-PEG2000, 90:5:5%mol). A FIGURA 9 é um gráfico que compara a actividade de um cocktail de carboplatina e daunorubicina (triângulos invertidos a cheio), carboplatina e daunorubicina formulado num único lipossoma (triângulos invertidos a branco) ou 12 ΕΡ 1 432 402 /PT controlo salino (círculos a cheio) dados a ratinhos com o tumor do pulmão humano de células não pequenas H460. A carboplatina e a daunorubicina foram formuladas em lipossomas de DSPC/DSPG (80:20%mol) com uma proporção molar de 1:1. As setas indicam os dias em que as doses são administradas. A FIGURA 10 é um gráfico que compara a actividade de um cocktail de carboplatina e daunorubicina (triângulos a cheio), carboplatina e daunorubicina formuladas num único lipossoma (triângulos a branco) ou controlo salino (círculos a cheio) dados a ratinhos com o tumor do pulmão humano de células não pequenas H460. A carboplatina e a daunorubicina foram formuladas em lipossomas de DSPC/SM/DSPE-PEG2000 (90:5:5%mol) com uma proporção molar de 10:1. As setas ao longo do eixo dos x indicam o programa de dosagem. A FIGURA 11A é um gráfico do IC para cisplatina:daunorubicina com proporções molares de 1:1 (quadrados a cheio) e 10:1 (círculos a cheio) em função da fracção de células H460 afectadas (fa) · A FIGURA 11B é um gráfico do IC máximo em função da cisplatina:daunorubicina com proporções molares de 10:1, 1:1 e 1:10 em relação a células H460. A FIGURA 12 é um gráfico das concentrações de cisplatina (círculos a branco) e daunorubicina (círculos a cheio) no plasma (pmol/ml) em função do tempo após administração intravenosa quando os fármacos são formulados com uma proporção molar não antagonística (10:1) num único lipossoma (DMPC/Chol, 55:45%mol). A FIGURA 13 é um gráfico das concentrações de cisplatina (círculos a cheio) e daunorubicina (círculos a branco) no plasma (pmol/ml) em função do tempo após administração intravenosa quando os fármacos são formulados com uma proporção molar não antagonística (10:1) em dois lipossomas separados (DMPC/Chol, 55:45%mol para a cisplatina e DSPC/DSPE-PEG2000, 95:5%mol para a daunoribicina). 13

ΕΡ 1 432 402 /PT A FIGURA 14 é um gráfico que compara a actividade de um cocktail de cisplatina e daunorubicina (triângulos invertidos a cheio), cisplatina e daunorubicina formuladas em lipossomas separados (triângulos invertidos a branco) ou controlo salino (círculos a cheio) dados a ratinhos com tumor do pulmão humano de células não pequenas H460. A cisplatina foi formulada em lipossomas de DMPC/Chol (55:45% mol) e a daunorubicina foi formulada em lipossomas de DSPC/DSPE-PEG2000 (95:5%mol) e administradas com uma proporção molar não antagonística (10:1) . As setas indicam os dias em que as doses são administradas. A FIGURA 15 é um gráfico que mostra as concentrações da cisplatina (círculos a cheio) e daunorubicina (círculos a branco) remanescentes no plasma (nmol/ml) em vários tempos após a administração intravenosa quando os fármacos foram formulados num único lipossoma (DMPC/Chol, 55:45%mol) com uma proporção molar antagonística de 1:1. A inserção mostra a proporção molar de cisplatina:daunorubicina em vários pontos de tempo após administração. A FIGURA 16 é um gráfico que compara a actividade de um cocktail de cisplatina e daunorubicina (triângulos a cheio), cisplatina e daunorubicina formuladas num único lipossoma (triângulos a branco) ou controlo salino (círculos a cheio) dados a ratinhos que têm o tumor do pulmão humano de células não pequenas H460. Os fármacos foram formulados em lipossomas de DMPC/Chol (55:45% mol) com uma proporção molar antagonística (1:1). As setas indicam os dias em que as doses são administradas. A FIGURA 17A é um gráfico do IC para cisplatina:topotecano com proporções molares de 1:1 (círculos a cheio) e 10:1 (círculos a branco) em função da fracção das células H460 afectadas (fa) . A FIGURA 17B é um gráfico do IC máximo em função da proporção molar de cisplatina:topotecano contra células H460. 14

ΕΡ 1 432 402 /PT A FIGURA 18 é um gráfico que mostra as concentrações da cisplatina (círculos a cheio) e topotecano (círculos a branco) remanescentes no plasma (pmol/ml) para vários tempos após administração intravenosa quando os fármacos são formulados em lipossomas separados (DMPC/Chol, 55:45%mol para a cisplatina e DSPC/Chol, 55:45%mol para o topotecano). A inserção mostra a proporção molar de cisplatina em relação ao topotecano para vários pontos de tempo após administração. A FIGURA 19 é um gráfico que compara a actividade de um cocktail de cisplatina e topotecano (triângulos a cheio), cisplatina e topotecano formulados em lipossomas separados (triângulos a branco) ou controlo salino (círculos cheios) dados a ratinhos que têm tumor do pulmão humano de células não pequenas H460. A cisplatina foi formulada em lipossomas de DMPC/Chol (55:45%mol) e o topotecano foi formulado em lipossomas de DSPC/Chol (55:45%mol) e foram administrados numa proporção molar não antagonística (10:1). As setas indicam os dias em que as doses são administradas. A FIGURA 20A é um gráfico do IC para cisplatina:irinotecano com proporções molares de 1:1 (quadrados), 10:1 (círculos), 1:5 (triângulos) e 1:10 (losangos) em função da fracção das células H460 afectadas (fa) · A FIGURA 20B é um gráfico do IC máximo em função da proporção molar de cisplatina:irinotecano contra células H460. A FIGURA 21 é um gráfico que mostra as concentrações da cisplatina (círculos a cheio) e irinotecano (círculos a branco) remanescentes no plasma (nmol/ml) em vários pontos de tempo após administração intravenosa quando os fármacos foram co-carregados num único lipossoma (DSPC/DSPG, 80:20%mol). A FIGURA 22 é um gráfico que mostra as concentrações da cisplatina (círculos a cheio) e irinotecano (círculos a branco) remanescente no plasma (nmol/ml) em vários pontos de tempo após administração intravenosa quando os fármacos são formulados em lipossomas separados (DMPC/Chol, 55:45% mol para 15 ΕΡ 1 432 402 /PT a cisplatina e DSPC/DSPE-PEG2 0 0 0, 95:5%mol para o irinotecano). A FIGURA 23 é um gráfico que compara a actividade de um cocktail de cisplatina e irinotecano (quadrados a cheio), cisplatina e irinotecano formulados em lipossomas separados e administrados em doses diferentes (símbolos a branco) ou controlo salino (círculos a cheio) dados a ratinhos que têm o tumor do pulmão humano de células não pequenas H460. A cisplatina formulada em lipossomas de DMPC/Chol (55:45%mol) e o irinotecano formulado em lipossomas de DSPC/DSPE-PEG2000 (95:5%mol) foram administrados numa proporção molar não antagonística (1:5). As setas indicam os dias em que as doses são administradas. A FIGURA 24 é um gráfico do IC para a vinorelbina em combinação com POPS (triângulos invertidos), DPPS (triângulos), PLPS (círculos), DSPS (losangos) ou DOPS (quadrados) em função das células H460 afectadas (fa) em proporções molares de vinorelbina:PS de 1:1. A FIGURA 25A é um gráfico da concentração da vinorelbina no plasma em função do tempo após administração intravenosa a ratinhos SCID/rag2 de vinorelbina livre (círculos a cheio) ou encapsulada em lipossomas de SM/Chol/DPPS/DSPE-PEG2000, 35:45:10:10%mol (círculos a branco) numa proporção molar de vinorelbina:PS de 1:1. A FIGURA 25B é um histograma que mostra a área sob a curva (AUC) da concentração no plasma para vinorelbina (barra preta) ou encapsulada em SM/Chol/DPPS/DSPE-PEG2000, 35:45:10:10%mol (barra cinzenta) após administração intravenosa a ratinhos SCID/rag2, utilizando os dados da FIGURA 25A. A FIGURA 26 é um gráfico que compara a actividade da vinorelbina livre (círculos a branco), vinorelbina encapsulada em lipossomas de DSPC/Chol/DPPS/DSPE-PEG2000, 35:45:10:10%mol (triângulos invertidos a cheio), vinorelbina encapsulada em lipossomas de SM/Chol/DPPS/DSPE-PEG2000, 35:45:10:10%mol (triângulos a branco), ou controlo salino (círculos a cheio) 16

ΕΡ 1 432 402 /PT dados a ratinhos com o tumor do pulmão de células não pequenas H460. A vinorelbina e a fosfatidilserina (DPPS) foram formuladas numa proporção molar não antagonística (1:1). As setas indicam os dias em que as doses foram administradas. A FIGURA 27 mostra o efeito do controlo salino (círculos a cheio); vinorelbina livre (círculos a branco); vinorelbina encapsulada em lipossomas de: SM/Chol/DPPS/DSPE-PEG2000, 35:45:10:10 (triângulos invertidos a cheio), DAPC/Chol/DPPS/DSPE-PEG2 000, 35:45:10:10%mol (triângulos a branco) e PSPC/Chol/DSPS/DSPE-PEG2000, 35:45:10:10%mol (quadrados a cheio) dados a ratinhos com o tumor do pulmão de células não pequenas H460. A vinorelbina e a fosfatidilserina (DPPS ou DSPS) foram formuladas numa proporção molar não antagonística (1:1). As setas indicam os dias em que as doses foram administradas. A FIGURA 28 mostra o efeito do controlo salino (triângulos a branco); vinorelbina livre (círculos a cheio); e vinorelbina encapsulada em lipossomas de SM/Chol/DPPS/DSPE-PEG2000, 35:45:10:10%mol (triângulos invertidos a cheio), sobre a percentagem de sobrevivência de ratinhos com leucemia murina P388. A vinorelbina e a fosfatidilserina foram formuladas numa proporção molar não antagonística (1:1). A seta ao longo do eixo dos x indica o dia em que as doses foram administradas. A FIGURA 29 mostra uma representação de IC em função da fracção de células HT-29 afectadas por combinações de FUDR:CPT-11 em várias proporções: 10:1 (quadrados a cheio); 5:1 (círculos a cheio); 1:1 (triângulos a cheio); 1:5 (triângulos invertidos a cheio); e 1:10 (círculos a branco). A FIGURA 30 é um gráfico dos níveis de concentração no plasma de FUDR (círculos a cheio) e CPT-11 (círculos a branco) em função do tempo após administração intravenosa.

A FIGURA 31 é um gráfico do volume do tumor versus tempo após a inoculação de células de tumor para controlos salinos (círculos a cheio), injecção de um cocktail de CPT-ll/FUDR 17 ΕΡ 1 432 402 /PT (triângulos invertidos a branco) e de formulação lipossómica de CPT-ll/FUDR (triângulos invertidos a cheio).

Modos de Concretizar o Invento1 O invento envolve a determinação de uma proporção de agentes antineoplásicos que não é antagonistica ao longo de uma gama de concentrações desejada in vitro e o fornecimento desta proporção não antagonistica de uma maneira que assegure que a proporção é mantida no local da actividade desejada. A proporção sinérgica ou aditiva é determinada por aplicação de ferramentas analíticas correntes aos resultados obtidos quando, pelo menos, uma proporção de dois ou mais agentes é testada in vitro ao longo de uma gama de concentrações em 1

Abreviaturas São utilizadas as seguintes abreviaturas: PE: fosfatidiletanolamina; PS: fosfatidilserina; DPPS: dipalmitoilfosfatidilserina; DSPS: diestearoilfosfatidilserina; DLPS: dilauroilfosfatidilserina; DOPS: dioleoilfosfatidilserina; POPS: palmitoiloleoilfosfatidilserina; PC: fosfatidilcolina; SM: esfingomielina; PG: fosfatidilglicerol; PI: fosfatidilinositol; PA: ácido fosfatídico; DSPC: diestearoilfosfatidilcolina; DMPC: dimiristoilfosfatidilcolina; DSPG: diestearoilfosfatidilglicerol; DSPE: diestearoilfosfatidiletanolamina; Chol: colesterol; CH ou CHE: éter hexadecilcolesterilico; PEG: polietilenoglicol; DSPE-PEG: diestearoilfosfatidiletanolamino-N-[polietilenoglicol]; quando o PEG é seguido por um número, o número é o peso molecular do PEG em Daltons; DSPE-PEG2000: diestearoilfosfatidiletanolamino-N-[polietilenoglicol 2000] ; SUV: vesícula unilamelar pequena; LUV: vesícula unilamelar grande; MLV: vesícula multilamelar; MTT: brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-2H-tetrazólio; DMSO: sulfóxido de dimetilo; DO: densidade óptica; OGP: N-octil-beta-D-glucopiranósido; EDTA; ácido etilenodiaminotetra-acético; HEPES: N-[2-hidroxietil]piperazino-N-[ácido 2-etanossulfónico]; HBS: solução salina tamponada com HEPES (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4); SHE: sacarose 300 mM; HEPES 20 mM, EDTA 30 mM; ED50, ED75 e ED90; dose eficaz requerida para afectar 50, 75 e 90% das células em cultura; LD50: dose requerida para provocar 50% de mortalidade das células em cultura; IC: índice de combinação; IC Max ou IC máximo: valor de IC tomado para um único valor fa (entre 0,2 e 0,8) em que é observada a maior diferença de valores de IC para os fármacos em diferentes proporções; fa: fracção afectada; TEA: trietanolamina; FDA: Food and Drug Administration dos Estados Unidos; NCI: National Câncer Institute. 18

ΕΡ 1 432 402 /PT relação a culturas de células ou sistemas sem células relevantes. A título de ilustração, agentes individuais e várias combinações destes são testados em relação ao seu efeito citotóxico ou citostático sobre a cultura de células ou um sistema sem células, i.e. a sua capacidade de provocar a morte das células ou inibir o crescimento das células, para vários níveis de concentração. Os níveis de concentração das proporções pré-ajustadas são registados em junção da percentagem de sobrevivência de células para obter uma correlação que pode ser manipulada através de técnicas matemáticas conhecidas e estabelecidas para calcular um "índice de combinação" (IC). A matemática é tal que um IC de 1 (i.e., 0,9-1,1) descreve um efeito aditivo dos fármacos; um IC >1 (i.e. >1,1) representa um efeito antagonista; e um IC <1 (i.e. <0,9) representa um efeito sinérgico.

Uma abordagem geral é mostrada na Figura 1. Tal como mostrado, os agentes A e B são testados individualmente e em conjunto, em duas proporções diferentes, relativamente à sua capacidade de provocar a morte das células ou a estase das células, avaliadas pelo ensaio de MTT descrito abaixo. Inicialmente, as correlações entre as concentrações dos fármacos A, B e as duas proporções de combinação diferentes (Y:Z e X:Y) são representadas em relação à citotoxicidade, calculadas como percentagem com base na sobrevivência das células de controlo não tratadas. Tal como esperado, existe um efeito dependente da dose na sobrevivência das células quer para os fármacos individuais quer para as combinações. Uma vez esta correlação estabelecida, a sobrevivência das células ou a fracção afectada (fa) podem ser utilizadas como substitutos da concentração no cálculo do IC.

Os resultados do cálculo do IC são também mostrados na

Figura 1; este índice é calculado em função da fracção das células afectadas de acordo com o procedimento de Chou e

Talalay, Advance Enz. Regul. (1985) 22: 27-55. Nesta situação hipotética, a primeira proporção (X:Y) dos fármacos A e B é não antagonística para todas as concentrações enquanto que a combinação na segunda proporção (Y:Z) é antagonística. Deste modo, é possível proporcionar uma proporção de fármacos A mais B (proporção 1) que seja não antagonística sem olhar à 19

ΕΡ 1 432 402 /PT concentração ao longo de uma larga gama. É esta proporção que é desejável incluir nas composições do invento.

Os presentes inventores apresentam também uma ilustração alternativa do efeito da proporção e da concentração na sinergia calculando um "IC máximo" para várias proporções de combinações de agentes. O "IC máximo" é definido como o valor de IC para um único valor de fa (entre 0,2 e 0,8) em que se observou a maior diferença nos valores de IC para os fármacos em diferentes proporções. Isto é ilustrado nas Figuras 2A e 2B; tal como mostrado, quando a proporção de irinotecano/carboplatina é de 1:10; os seus IC diferem sobretudo dos das proporções remanescentes em que o valor da fracção afectada é de 0,2. O valor de IC para esta proporção a fa 0,2 é, tal como mostrado, aproximadamente de 2,0.

Embora a determinação in vitro das proporções não antagonisticas tenha sido ilustrada para uma combinação de apenas dois fármacos, a aplicação das mesmas técnicas a combinações de três ou mais fármacos proporciona um valor de IC ao longo da gama de concentrações de maneira semelhante. A proporção obtida deste modo é mantida na composição farmacêutica por encapsulamento dos agentes numa proporção pré-determinada em lipossomas ou noutras formas em partículas que assegurem que a proporção não antagonística será mantida. As composições, deste modo, contêm veículos de administração que estão sob a forma de partículas e que contêm a proporção desejada de agentes terapêuticos.

Embora seja preferido co-encapsular os agentes de modo a que ambos estejam contidos no mesmo veículo de administração, isto não é necessário. Uma vez que os transportadores sob a forma de partículas podem partilhar farmacocinéticas semelhantes, as substâncias activas experimentam uma administração coordenada a partir da formulação mesmo se encapsuladas separadamente.

Por "encapsulamento" entenda-se uma associação estável com o veículo de administração. Deste modo, não é necessário ao veículo envolver o agente ou os agentes desde que o agente ou os agentes esteja/estejam estavelmente associados aos veículos 20

ΕΡ 1 432 402 /PT quando administrados in vivo. Deste modo, "estavelmente associado a" e "encapsulado em" ou "encapsulado com" ou "co-encapsulado em ou com" pretendem-se termos sinónimos. Estes são utilizados indiferentemente nesta descrição. A associação estável pode ser efectuada através de uma variedade de meios, incluindo ligação covalente com o veiculo de administração, preferencialmente com uma ligação clivável, ligação não covalente, e retenção do agente no interior do veiculo de administração e outros do género. A associação deve ser suficientemente estável de modo a que os agentes permaneçam associados ao veiculo de administração numa proporção não antagonística até serem entregues no local alvo no indivíduo tratado.

Os veículos de administração podem incluir transportadores lipídicos, lipossomas, micelas lipídicas, micelas de lipoproteínas, emulsões estabilizadas com lípidos, ciclodextrinas, nanopartícuias poliméricas, micropartículas poliméricas, micelas de copolímeros de blocos, sistemas híbridos polímero-lípido, polímeros de cadeia simples derivatizada, e outros do género. Os lipossomas podem ser preparados tal como descrito em Liposomes: Rational Design (A.S. Janoff ed., Mareei Dekker, Inc, N.Y.), ou através de técnicas adicionais conhecidas pelos especialistas na matéria. Os lipossomas para utilização neste invento podem ser preparados como sendo de "baixo teor de colesterol". Tais lipossomas são "sem colesterol" ou "substancialmente sem colesterol", ou "essencialmente sem colesterol". O termo "sem colesterol", aqui utilizado com referência a um lipossoma, significa que um lipossoma é preparado na ausência de colesterol. O termo "substancialmente sem colesterol" permite a presença de uma quantidade de colesterol que é insuficiente para alterar significativamente as características de transição de fase do lipossoma (tipicamente inferior a 20% mol de colesterol). A incorporação de menos de 20% mol de colesterol em lipossomas pode permitir a retenção de fármacos nao optimamente retidos quando os lipossomas são preparados com mais de 2 0% mol de colesterol. Adicionalmente, os lipossomas preparados com menos de 20% mol de colesterol apresentam estreitas temperaturas de transiçao de fase, uma propriedade que pode ser explorada para a preparaçao de lipossomas que libertam agentes encapsulados devido à 21 ΕΡ 1 432 402 /PT aplicação de calor (lipossomas termossensíveis). Os lipossomas do invento podem também conter lipidos terapêuticos, que incluem lipidos de éter, ácidos fosfatidicos, fosfonatos, ceramida e análogos da ceramida, esfingosina e análogos da esfingosina e lipidos contendo serina. Os lipossomas podem também ser preparados com conjugados polímero-lípido hidrófilos estabilizantes de superfície, tais como polietilenoglicol-DSPE, para aumentar a longevidade da circulação. A incorporação de lipidos carregados negativamente, tais como fosfatidilglicerol (PG) e fosfatidilinositol (PI), pode também ser adicionada a formulações de lipossomas para aumentar a longevidade da circulação do transportador. Estes lipidos podem ser empregues para substituir conjugados polímero-lípido hidrófilos como agentes de estabilização de superfície. As concretizações do presente invento podem utilizar lipossomas sem colesterol contendo PG ou PI para evitar a agregação aumentando deste modo o tempo de residência no sangue do transportador.

As micelas são partículas que se auto-agregam compostas por lipidos anfipáticos ou componentes poliméricos que são utilizados para a administração de agentes escassamente solúveis presentes no núcleo hidrófobo. Vários meios de preparação dos veículos de administração micelares estão disponíveis e podem ser concretizados com facilidade por um especialista na matéria. Por exemplo, as micelas lipídicas podem ser preparadas, tal como descrito em Perkins, et ai., Int. J. Pharm. (2000) 200(1): 27-29 (aqui incorporado como referência). As micelas de lipoproteínas podem ser preparadas a partir de lipoproteínas naturais ou artificiais, incluindo lipoproteínas de baixa e alta densidade e quilomicra. As emulsões estabilizadas com lipidos são micelas preparadas de modo a compreenderem um núcleo cheio de óleo estabilizado por um componente de emulsionante, tal como lipidos em monocamada ou bicamada. O núcleo pode compreender ésteres de ácido gordo, tais como triacilglicerol (óleo de milho) . A monocamada ou a bicamada podem compreender um conjugado de polímero-lípido hidrófilo, tal como DSPE-PEG. Estes veículos de administração podem ser preparados por homogeneização do óleo na presença do conjugado polímero-lípido. Agentes que são incorporados em emulsões estabilizadas com lipidos são geralmente fracamente solúveis em água. Análogos de polímeros sintéticos que 22

ΕΡ 1 432 402 /PT apresentam propriedades semelhantes às lipoproteínas, tais como as micelas de ésteres de ácido esteárico ou poli(óxido de etileno) em blocos-poli(hidroxietil-L-aspartamida) e poli(óxido de etileno) em blocos-poli(hidroxi-hexil-L-aspartamida) podem ser também utilizados na prática deste invento (Lavasanif ar, et al., J. Biomed. Mater. Res. (2000) 52: 831-835).

As ciclodextrinas compreendem oligossacáridos que formam cavidades, solúveis em água, que podem acomodar fármacos insolúveis em água nas suas cavidades. Os agentes podem ser encapsulados em ciclodextrinas utilizando procedimentos conhecidos pelos especialistas na matéria. Por exemplo, ver Ateood, et al., Eds., "Inclusion Compounds", Vols. 2 & 3,

Academic Press, NY (1984); Benter et al., "Cyclodextrin Chemistry", Springer-Verlag, Berlim (1978); Szeitli, et al., "Cyclodexrtrins and Their Inclusion Complexes", Akademiai Kiado, Budapeste, Hungria (1982) e o documento WO 00/40962.

As nanoparticulas e microparticulas podem compreender um núcleo concentrado de fármaco que está envolvido num invólucro polimérico (nanocápsulas) ou como um sólido ou liquido disperso ao longo da matriz polimérica (nanoesferas). Os métodos gerais de preparação das nanoparticulas e microparticulas são descritos por Soppimath, et al. (J.

Control. Release (2001) 70(1-1):1-20) cuja referência é aqui incorporada. Outros veículos de administração poliméricos que podem ser utilizados incluem micelas de copolímeros em bloco que compreendem um fármaco contendo um núcleo hidrófobo envolvido por um invólucro hidrófilo; estes são geralmente utilizados para fármacos hidrófobos e podem ser preparados tal como referido em Allen, et al., Colloids and Surfaces B: biointerfaces (1999) Nov 16 (1-4): 3-27. Os sistemas híbridos polímero-lípido consistem de nanoparticulas poliméricas envolvidas por uma monocamada lipídica. As partículas poliméricas servem como espaço de carga para a incorporação de fármacos hidrófobos ao mesmo tempo que a monocamada lipídica proporciona uma interferência estabilizante entre o núcleo hidrófobo e o ambiente aquoso externo. Polímeros, tais como policaprolactona e poli(d,1-láctido) podem ser utilizados enquanto a monocamada lipídica é tipicamente composta por uma mistura de lípidos. Métodos adequados de preparação são 23

ΕΡ 1 432 402 /PT semelhantes aos referenciados acima para as nanopartículas. Os polímeros de cadeia única derivatizados são polímeros adaptados para ligação covalente a um agente biologicamente activo para formar um conjugado polímero-fármaco. Numerosos polímeros têm sido propostos para síntese de conjugados polímero-fármaco incluindo poliaminoácidos, polissacáridos, tais como a dextrina ou dextrano, e polímeros sintéticos, tais como o copolímero de N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HPMA). Métodos adequados de preparação são detalhados em Veronese e Morpurgo. IL Framaco (1999) 54(8): 497-516 e são aqui incorporados como referência.

Os veículos de administração são, deste modo, proporcionados de modo a que se atinja uma administração consistente da proporção administrada dos componentes terapêuticos. Deste modo, a proporção pode ser mantida através de simples co-encapsulamento dos agentes nos veículos que compreendem a composição dos agentes ou ser encapsulada em veículos separados se os veículos controlam a farmacocinética da composição para manter as proporções de fármacos não antagonísticas da mesma maneira.

As composições do invento são utilizadas para administrar composições de agentes antitumorais que não antagonísticos. A descrição detalhada seguinte apresenta a maneira como as proporções de agentes terapêuticos são determinadas e métodos para encapsular as proporções desejadas em sistemas de administração do invento.

Resumidamente, num cenário, primeiro, os agentes individuais são analisados separadamente numa variedade de ensaios in vitro ou in vivo para determinar as suas actividades individuais. Então, pares de agentes são combinados e avaliados no mesmo método de análise. Nesta análise inicial, as proporções de agentes são as proporções molares das concentrações que possuem uma actividade de 50% (valor IC50) previamente identificado. Alternativamente, outras proporções fixadas (tipicamente proporções molares de 1:10, 1:1 e 10:1) são escolhidas com base nas considerações para fins de formulação. Os valores médios, calculados com base nos efeitos do agente na sobrevivência das células, e as doses de fármaco são introduzidas no programa de computador 24

ΕΡ 1 432 402 /PT

CalcuSyn e os dados obtidos são avaliados para definir um valor de índice de Combinação (IC) em função da fracção das células afectadas (fa) . O método CalcuSyn tem sido aplicado com sucesso para testar vários agentes, tais como fármacos antitumorais, imunossupressores para o transplante de órgãos, purga combinada de células leucémicas para o transplante autólogo de medula óssea, insecticidas, modificadores de resposta biológica, inibidores de resistência múltipla a fármacos, agentes antimicrobianos, agentes anti-VIH, agentes anti-herpéticos e outros agentes antivirais.

Combinações de agentes que apresentam um comportamento de interacção semelhando ao de cisplatinardaunorubicina com uma proporção molar de 1:2 na Figura 11A, i.e., são antagonísticas e não são utilizadas. Combinações de compostos possuindo interacções não antagonísticas ao longo de gamas substanciais (preferencialmente, pelo menos, cerca de 20%) com valores de fa superiores a fa > 0,01 (ie., irinotecano:carboplatina com proporções molares de 1:1 e 10:1; Figura 2A) são reavaliados neste ensaio in vitro para uma variedade de diferentes proporções de fármaco/fármaco para definir a(s) proporção(ões) óptima(s) para melhorar a resistência da interacção não antagonística (i.e. valores de IC inferiores) e aumentar a gama de fa ao longo da qual se observa a sinergia.

As combinações de fármacos não antagonísticas optimizadas identificadas deste modo, definem uma composição para formulação num veículo de administração como uma composição de duplo agente e/ou podem ser utilizadas numa unidade farmacêutica única para determinar interacções sinérgicas ou aditivas com um terceiro agente.

Determinação in vitro de Proporções Não Antagonísticas

De modo a preparar as composições do invento, a proporção desejada de agentes contidos nos veículos de administração deve ser primeiro determinada. Desejavelmente, a proporção será aquela em que sinergia ou aditividade é exibida pela combinação ao longo da gama de concentrações. Tais proporções 25

ΕΡ 1 432 402 /PT podem ser determinadas em culturas de células in vitro ou sistemas sem células utilizando vários modelos matemáticos. A determinação das proporções de agentes que apresentam efeitos de combinação sinérgicos ou aditivos ao longo das gamas de concentração pode ser realizada utilizando vários algoritmos, com base nos tipos de dados experimentais descritos abaixo. Estes métodos incluem métodos de isobolograma (Loewe, et al., Arzneim-Forsch (1953) 3: 285-290; Steel, et al., Int. J. Radiol. Oncol. Biol. Phys. (1979) 5:27- 55) , o método do produto fraccional (Webb, Enzyme and Metabolic Inhibitors (1963) Vol. 1, p. 1-5. New York: Academic Press), o método de simulação de Monte Cario, CombiTool, ComboStat e o método do efeito mediano de Chou-Talalay com base numa equação descrita em Chou, J. Theor. Biol. (1976) 30:253-76; e Chou, Mol. Pharmacol. (1974) 10:235-247).

Alternativas incluem a fracção de sobrevivência (Zoli, et al., Int. J. Câncer (1999) 80: 413-416), a percentagem de resposta a unidades de formação de colónias de granulócitos/macrófagos em comparação com controlos (Pannacciulli, et al. Anticancer Res. (1999) 19:409-412) e outros (Berenbaum, Pharmacol. Rev. (1989) 41:93-141; Greco, et al., Pharmacol. Rev. (1995) 47:331-385). 0 método do efeito mediano de Chou-Talalay é o preferido. A análise utiliza uma equação em que a dose que provoca um efeito particular, fa, é dada por: D = Dm[fa/(l-fa) ]1/m em que D é a dose do fármaco utilizado, fa é a fracção de células afectadas por essa dose, Dm é a dose para o efeito mediano que significa a potência e m é um coeficiente que representa a forma da curva do efeito da dose (m é 1 para reacções de primeira ordem).

Esta equação pode ser ainda manipulada para calcular um índice de combinação (IC) com base na equação do efeito de múltiplos fármacos, tal como descrito por Chou e Talalay, Adv. Enzyme Reg. (1984) 22:27-55; e por Chou, et al., em: Synerqism and Antagonism in Chemotherapy, Choui e Rideout, eds.,

Academic Press:

New York 1991: 223-244. Um programa de 26

ΕΡ 1 432 402 /PT computador para este cálculo (CalcuSyn) é encontrado em Chou, Dose-effect analysis with microcomputers: quantitation of ED50, LD50, synergism, antagonism, low-dose risk, receptor ligand binding and enzyme kinetics (CalcuSyn Manual and Software; Cambridge: Biosoft 1987). A equação do índice de combinação é baseada na equação de efeito de fármaco múltiplo de Chou-Talalay derivada a partir de modelos cinéticos enzimáticos. Uma equação determina apenas o efeito aditivo em vez de sinergismo e antagonismo. Contudo, de acordo com o programa CalcuSyn, o sinergismo é definido como um efeito aditivo maior do que esperado, e o antagonismo é um efeito aditivo menor do que o esperado. Chou e Talalay em 1983 propôs a designação de IC = 1 como o efeito aditivo, e deste modo a partir da equação do efeito do fármaco múltiplo de dois fármacos, obtém-se: IC =(D)i/(Dx)1+(D)2/(Dx)2 [Eq. 1] para fármacos mutuamente exclusivos que possuem os mesmos ou semelhantes modos de acção, e é ainda proposto que IC =(D)1/(Dx)i+(D)2/(Dx)2+(Di) (D2)/(Dx)i(Dx)2 [Eq. 1] para fármacos não mutuamente exclusivos que possuem modos de acção totalmente independentes. IC <1, =1, e >1 indicam sinergismo, efeito aditivo e antagonismo, respectivamente. A equação 1 ou equação 2 dita que o fármaco 1, (D)lf e fármaco 2, (D)2, (nos numeradores) em combinação inibem x% na experiência actual. Deste modo, a inibição de x% experimentalmente observada pode não ser um número inteiro, mas, mais frequentemente, é uma fracção decimal. (Dx)! e (Dx)2 (nos denominadores) da equações 1 e 2 são as doses de fármaco 1 e de fármaco 2 sós, respectivamente, que inibem x%.

Por simplicidade, assume-se usualmente exclusividade mútua quando mais do que dois fármacos estão envolvidos em combinações (CalcuSyn Manual and Software; Cambridge: Biosoft 1987).

Os dados experimentais subjacentes são geralmente determinados in vitro utilizando células em cultura ou 27 ΕΡ 1 432 402 /PT sistemas sem células. Preferencialmente, o índice de combinação (IC) é registado em função da fracção de células afectadas (fa) , tal como mostrado na Figura 1 que, tal como explicado acima, é um parâmetro substituto da gama de concentrações. Combinações preferidas de agentes são aquelas que apresentam sinergia ou aditividade ao longo de uma gama substancial de valores de fa. São seleccionadas as combinações de agentes que apresentam sinergia ao longo de, pelo menos 5% da gama de concentrações em que mais do que 1% das células são afectadas, i.e. uma gama de fa superior a 0,01. Preferencialmente, uma porção maior da concentração global exibe um IC favorável; por exemplo, 5% de uma gama de fa de 0,2-0,8. Mais preferencialmente, 10% desta gama exibe um IC favorável. Ainda mais preferencialmente, 20% da gama fa, preferencialmente acima de 50% e muito preferencialmente acima de, pelo menos, 70% da gama de fa de 0,2 a 0,8 é utilizado nas composições. As combinações que apresentam sinergia ao longo de uma gama substancial de valores de fa podem ser reavaliadas para uma variedade de proporções de agentes para definir a proporção óptima para melhorar a resistência da interacção não antagoní st ica e aumentar a gama de fa ao longo da qual a sinergia é observada.

Embora seja desejável possuir sinergia ao longo de toda a gama de concentrações ao longo da qual as células são afectadas, observou-se que em muitas circunstâncias, os resultados são consideravelmente mais fiáveis numa gama fa de 0,2-0,8. Deste modo, embora a sinergia apresentada pelas combinações do invento exista dentro da gama larga de 0,01 ou superior, é preferível que a sinergia seja estabelecida na gama fa de 0,2-0,8. A proporção de combinação óptima pode ser ainda utilizada como uma unidade farmacêutica única para determinar interacções sinérgicas ou aditivas com um terceiro agente. Adicionalmente, uma combinação de três agentes pode ser utilizada como uma unidade para determinar interacções não antagonísticas com um quarto agente e assim por diante.

Tal como apresentado acima, os estudos in vitro em culturas de células serão conduzidos com células "relevantes". A escolha das células dependerá da utilização terapêutica 28

ΕΡ 1 432 402 /PT pretendida do agente. Apenas uma linha de células ou tipo de cultura de células relevante necessita apresentar o requerido efeito não antagonistico de modo a proporcionar uma base para as composições ficarem dentro do domínio do invento.

Por exemplo, a combinação de agentes é destinada a terapia anticancerosa. Escolhas apropriadas das células a testar e da natureza do teste serão então feitas. Em particular, linhas de células tumorais são adequadas e a quantificação das células mortas ou da estase das células é um ponto final (teste clínico) apropriado. Tal como será ainda discutido abaixo, no contexto de tentar encontrar combinações não antagonísticas adequadas para outras indicações, outras células alvo e outros critérios para além da citoxicidade ou da estase das células podem ser empregues.

Para determinações envolvendo agentes antitumorais, podem ser obtidas linhas de células a partir de repositórios de linhas de células padrão (NCI ou ATCC, por exemplo) , de instituições académicas ou outras organizações incluindo fontes comerciais. As linhas de células preferidas incluirão uma ou mais das linhas de células identificadas pelo Developmental Therapeutics Program do NCI/NIH. O rastreio das linhas de células tumorais utilizado por este programa identifica correntemente 60 diferentes linhas de células tumorais representando leucemia, melanoma e cancros do pulmão, cólon, cérebro, ovários, mama, próstata e rim. O requerido efeito não antagonistico ao longo de uma gama de concentrações desejada necessita de ser mostrada apenas com um único tipo de célula; contudo, é preferível que, pelo menos, duas linhas de células exibam este efeito, mais preferencialmente, três linhas de células, mais preferencialmente, cinco linhas de células e mais preferencialmente 10 linhas de células. As linhas de células podem ser linhas de células tumorais estabelecidas ou culturas primárias obtidas a partir de amostras de doentes. As linhas de células podem ser de qualquer espécie mas a fonte preferida será de mamíferos e em particular de seres humanos. As linhas de células podem ser geneticamente alteradas por selecção sob várias condições laboratoriais, e/ou por adição ou eliminação de material genético exógeno. As linhas de células podem ser tranfectadas através de qualquer técnica de transferência de genes, 29

ΕΡ 1 432 402 /PT incluindo mas não limitada a, métodos de transfecção virai ou baseada em plasmídeos. As modificações podem incluir a transferência de ADNc que codifica a expressão de uma proteína ou péptido específicos, um elemento regulador, tal como uma sequência promotora ou potenciadora ou ADN ou ARN anti-sentido. Linhas de células de culturas de tecidos geneticamente manipuladas podem incluir linhas com e sem genes supressores de tumores, ou seja, genes tais como p53, pTEN e pl6; e linhas criadas através da utilização de métodos negativos dominantes, métodos de inserção de genes e outros métodos de selecção. As linhas de células de cultura de tecidos preferidas que podem ser utilizadas para quantificar a viabilidade das células, e.g. para testar agentes antitumorais, incluem, mas não estão limitados a, H460, MCF-7, SF-268, HT29, HCT-116, LS180, B16-F10, A549, Capan pancreático, CAOV-3, IGROV1, PC-3, MX-1 e MDA-MB-231.

Numa concretização preferida, o efeito dado (fa) refere-se à morte das células ou à estase das células, após aplicação de um agente citotóxico a uma cultura de células. A morte ou a viabilidade das células pode ser medida, por exemplo, utilizando os métodos seguintes:

ENSAIO CITOTOXICO

Ensaio MTT

Exclusão com corante azul de tripano

Incorporação de trítio radioactivo por (3H)-timidina ou ensaio de intercalação de ADN Ensaio de libertação de crómio 51 radioactivo Perda de enzimas glutamatopiruvato-transaminase, creatina-fosfoquinase e lactato-desidrogenase

Assimilação de vermelho neutro Actividade da fosfatase alcalina Coloração com iodeto de propídio

REFERÊNCIA

Mosmann, J. Immunol. Methods (1983) 64(1-2):55-63 Bhuyan, et al., Experimental Cell Research (1976) 97:275-280 Senik, et al., Int. J. Câncer (1975) 16(6): 946-959

Brunner, et al., Immunology (1968) 14: 181-196

Mitchell, et al., J. of Tissue Culture Methods (1980) 6(3&4): 113-116

Borenfreund e Puerner, Toxicol. Lett. (1985) 39: 119-124 Kyle, et al., J. Toxicol. Environ. Health (1983) 12: 99-117 Nieminen, et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. (1992) 115: 147-155 30

ΕΡ 1 432 402 /PT

Retenção de biscarboxietil-carboxifluoresceina (BCECF) Potencial da membrana mitocondrial Ensaios clonogénicos

Ensaio de viabilidade/ citotoxicidade VIVO/MORTO Ensaios de Sulfo-rodamina B (SRB)

Kolber, et al., J. Immunol.

Methods (1988) 108:255-264 Johnson, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1980) 77: 990-994 Puck, et al., J. of Experimental Medicine (1956) 103: 273-283 Morris, Biotechniques (1990) 9: 296-308

Rubinstein, et ai., J. Natl. Câncer Instit. (1990) 82: 1113-1118 O ensaio MTT é o preferido.

As proporções não antagonísticas de dois ou mais agentes podem ser determinadas para indicações de doenças que não o cancro e esta informação pode ser utilizada para preparar formulações terapêuticas de dois ou mais fármacos para tratamento destas doenças. No que respeita a ensaios in vitro, podem ser seleccionados muitos pontos finais mensuráveis para definir a sinergia do fármaco, desde que aqueles pontos finais sejam terapeuticamente relevantes para a doença especifica.

Deste modo, por exemplo, um especialista na matéria será capaz de definir proporções não antagonisticas de dois ou mais agentes seleccionados para o tratamento de doenças inflamatórias medindo, in vitro, a supressão de citocinas pró-inflamatórias, tais como IL-1, IL-18, COX-2, TNF ou interferão-gama. Outros sinais inflamatórios incluem, mas não estão limitados a, inibição da prostaglandina E2 e tromboxano B2. Em particular, a activação de macrófagos mediada por endotoxinas proporciona um ensaio in vitro adequado para medir os efeitos anti-inflamatórios de um agente ou combinações de agentes adicionados e é correntemente utilizada na arte. Num tal ensaio, os macrófagos que se desenvolvem em grandes quantidades são activados pela adição de uma endotoxina, tal como lipopolissacárido. Por activação, a secreção por macrófagos das citocinas, tais como o IL-1 e TNF é mensurável assim como a activação de COX-2. Os fármacos anti-inflamatórios candidatos são adicionados e avaliados com base na sua capacidade de suprimir IL-1, TNF e COX-2. A titulação com dexametasona 1 x 1CT7 M é tipicamente utilizada 31 ΕΡ 1 432 402 /PT como controlo positivo. Será evidente para um especialista na matéria que os ensaios que envolvem a activação dos macrófagos são adequados para um rastreio amplo de combinações de fármacos e que a supressão de IL-1, TNF e COX-2 são pontos finais adequados para definir a sinergia. Em adição à medição de sinais inflamatórios, os investigadores podem considerar a utilização de modelos in vitro que medem o efeito de dois ou mais agentes sobre as funções dos leucócitos. Os testes funcionais podem envolver, mas não estão limitados a, inibição da desgranulação, geração de superóxido e migração de leucócitos.

De modo semelhante ao cancro, a proliferação é um evento chave no desenvolvimento da arteriosclerose, restenose ou outras doenças cardiovasculares, com atributos vasculoproliferativos. Deste modo, um especialista na matéria pode encontrar proporções não antagonisticas de dois ou mais agentes avaliando a sinergia dos fármacos através dos métodos aqui apresentados, aplicados a populações de células proliferativas relevantes dos vasos sanguíneos. Em particular, a restenose, tal como a restenose das artérias coronárias e periféricas que resulta tipicamente no seguimento de angioplastia, é atribuível à proliferação do músculo liso e das células endoteliais (Fuster, Arch Mal Coeur Vaiss (1997) 90 Spec No 6:41-47). Utilizando métodos correntes, tal como aqui apresentados, um especialista na matéria pode medir se dois ou mais agentes actuam de modo não antagonístico para inibir a proliferação das células endoteliais ou de células do músculo liso. Estes ensaios podem ser realizados utilizando linhas de células imortalizadas ou, preferencialmente, utilizando linhas de células primárias. Estas linhas de células podem ser obtidas a partir de fontes comerciais (e.g. Clonetics, Califórnia) ou a partir de tecido fresco (e.g. veias umbilicais, artérias, cérebro) e devem ser mantidas em factores de crescimento apropriados que promovem a proliferação das células. Semelhantes a ensaios de medição da sinergia de dois ou mais agentes em células cancerosas, estes ensaios podem incluir, mas não estão limitados a, pontos finais de inibição da proliferação e migração. Os pontos finais de proliferação podem basear-se em ensaios morto/vivo, tal como o ensaio MTT descrito neste pedido de patente, medições da proliferação que se baseiam na incorporação de 32

ΕΡ 1 432 402 /PT

[3Η]-timidina, ou outros ensaios semelhantes. Também semelhante à divisão das células cancerosas, a proliferação de células endoteliais e das células do músculo liso é regulada por pontos de verificação no ciclo celular e os ensaios que medem a inibição do ciclo celular podem ser utilizados para definir proporções não antagonisticas de dois ou mais agentes seleccionados para tratamento de doenças vasculoproliferativas.

As combinações não antagonisticas de agentes podem ser também identificadas através da sua actividade contra infecções microbianas ou virais. Como um primeiro passo na identificação de agentes antimicrobianos, a concentração inibidora mínima (MIC) de um agente pode ser determinada através dos ensaios antimicrobianos clássicos de diluição em caldo de microtitulação ou de diluição em ágar, conhecidos pelos especialistas na matéria. Estes ensaios são regulados pelo National Committee of Laboratory Safety and Standards (NCLSS). Os ensaios Standard de diluição em caldo estão publicados em Amsterdam (1996) Susceptibility Testing of Antimicrobials in Liquid Media em "Antibiotics in Laboratory Medicine", Lorian, V, 4a Edição, páginas 52-111, Williams e Wilkins, Baltimore. A MIC é definida como a concentração mais baixa de um antibiótico que inibirá o crescimento in vitro de um organismo infeccioso. Nos ensaios acima mencionados, a MIC pode ser determinada plaqueando um inoculo de micróbios num pequeno ponto (com, por exemplo, 104 unidades de formação de colónias [CFU] por ponto) num meio de crescimento (por exemplo, ágar) possuindo diferentes concentrações do fármaco. Alternativamente, podem ser inoculados micróbios numa suspensão de meio de crescimento que contém diferentes concentrações do fármaco. Adicionalmente, os micróbios podem ser tratados como acima ou podem ser residentes na forma de infecções intracelulares numa população de células específicas (i.e. um macrófago). Neste último caso, células de mamíferos desenvolvidas em cultura através de métodos correntes são infectadas com infecções microbianas intracelulares por breve exposição a uma baixa concentração de micróbios. Após um período de tempo para permitir a replicação intracelular dos micróbios, as células e os seus micróbios intracelulares são tratadas com um fármaco do mesmo modo que foi descrito para testes de citotoxicidade com células de mamíferos. Após um 33

ΕΡ 1 432 402 /PT período apropriado de tempo, suficiente para o fármaco inibir o crescimento microbiano quando administrado com concentrações eficazes, o crescimento bacteriano pode ser determinado através de uma variedade de meios incluindo: (i) determinação da ausência ou presença (e dimensão, se apropriado) do ponto do inoculo; (ii) plaqueamento e diluição em série de volumes conhecidos da suspensão de bactérias tratadas sobre placas de ágar de crescimento para permitir o cálculo do número de micróbios que sobreviveram ao tratamento; (iii) determinação macroscópica (a olho nu); (iv) curvas de mortalidade-tempo em que os micróbios na fase logarítmica de crescimento são suspensos num meio de crescimento contendo um fármaco(s) e, para vários tempos após inoculação, são removidos volumes conhecidos e diluídos em série em ágar de crescimento para contagem dos micróbios sobreviventes; (v) outros métodos espectrocópicos, analíticos, in vitro ou in vivo conhecidos pelos especialistas na matéria para permitir a contagem dos micróbios viáveis. A eficácia de um fármaco, ou de combinações de fármacos, para eliminar infecções residentes intracelulares é tipicamente avaliada após as células hospedeiras serem lisadas com detergentes (tais como Triton X-100 a 1% mais dodecilssulfato de sódio a 0,1%) para libertar os micróbios, e então os lisados são diluídos em série em placas de ágar de crescimento para contagem dos números de micróbios sobreviventes.

Combinações de agentes eficazes são avaliadas em relação à sua actividade antagonística, aditiva ou sinérgica, utilizando os meios descritos acima. Especificamente, são aplicados pares de compostos às bactérias com proporções fixas que podem ser equimolares, ou a proporção dos valores de MIC ou outras proporções fixas, e as bactérias tratadas com uma variedade de concentrações do par de compostos. A actividade é determinada tal como descrito acima. O antagonismo, a aditividade ou a sinergia são determinados a partir de uma variedade de tratamentos matemáticos, por exemplo, através de isobologramas, IC, e outros do género.

Um rastreio extensivo dos agentes ou combinações de agentes com actividade antiviral pode ser realizada através de um certo número de ensaios in vitro, tipicamente ensaios de inibição de efeitos citopáticos (CPE) e redução de placas 34 ΕΡ 1 432 402 /PT fágicas, que são bem conhecidos dos especialistas na matéria. Estes ensaios são capazes de medir directamente a extensão em que um fármaco ou fármacos antivirais inibem os efeitos da infecção virai em culturas de tecidos. O ensaio de redução de placas fágicas é preferido para combinações de linhas de células e virus que produzem uma placa fágica bem definida. Michaelis, et al., demonstraram a utilização de ensaios de redução de placas fágicas combinados com o método de Chou-Talalay para a determinação de efeitos antivirais não antagonisticos de afidicolina e seus derivados num certo número de virus para várias proporções molares (Michaelis, et al., Arzneimittelforschung (2002) 52(5): 393-399). Se não se puder produzir uma placa fágica bem definida para um virus e combinações de linhas de células particulares, são preferidos os ensaios de inibição de CPE. Métodos adicionais para uma identificação rápida e conveniente de combinações não antagonisticas de agentes antivirais incluem, mas não estão limitados a, ensaios de viabilidade celular, rendimento de virus, infecções por VIH agudas ou crónicas. A viabilidade das células é utilizada para medir a capacidade de um agente antiviral ou de uma combinação de agentes para aumentar a viabilidade das células e pode ser conseguida utilizando ensaios quantitativos, tais como o ensaio MTT previamente descrito. Alternativamente, o ensaio de rendimento de virus e os ensaios de infecção aguda por VIH avaliam a capacidade de um agente de reduzir o rendimento de virus permitindo medições directas de actividade antiviral. Será evidente para os especialistas na matéria que os ensaios atrás mencionados são adequados para analisar combinações de fármacos antivirais relativamente a efeitos sinérgicos, aditivos ou antagonisticos in vitro.

Combinações Preferidas de Agentes

Verificou-se que várias combinações de agentes terapêuticos que satisfazem os critérios de efeitos não antagonisticos apresentados acima, são então proporcionados sob a forma de formulações de veículos de administração de fármacos. Um "agente terapêutico" é um composto que por si só, ou em combinação com outros compostos, possui um efeito desejável num indivíduo afectado por uma condição ou doença indesejável. 35

ΕΡ 1 432 402 /PT

Certos agentes terapêuticos são favorecidos para utilização em combinação quando a doença ou condição alvo é o cancro. Exemplos são: "Inibidores de transdução de sinal" que interferem com, ou evitam, sinais que provocam a propagação ou a divisão de células cancerígenas; "Agentes citotóxicos"; "Inibidores do ciclo celular" ou "inibidores do controlo do ciclo celular" que interferem com a progressão de uma célula ao longo de ciclo celular normal, o tempo de vida de uma célula, desde a mitose que é a sua origem até aos eventos que se seguem à mitose que a dividem em células filhas; "Inibidores de pontos de verificação" que interferem com a função normal dos pontos de verificação dos ciclos celulares, e.g. o ponto de verificação S/G2, o ponto de verificação G2/M e o ponto de verificação Gl/S; "Inibidores de topoisomerase", tais como as camptotecinas, que interferem com a actividade da topoisomerase I ou II, enzimas necessárias para a replicação e transcrição do ADN; "Inibidores de tirosina-quinases receptoras" que interferem com a actividade de receptores de factores de crescimento que possuem actividade de tirosina-quinase; "Agentes de indução da apoptose" que promovem a morte celular; "Antimetabolitos", tais como a Gencitabina ou a Hidroxiureia, que se parecem muito com um metabolito essencial e por isso interferem com as reacções fisiológicas que os envolvem; "Inibidores de telomerase" que interferem com a actividade de uma telomerase, uma enzima que prolonga o comprimento do telómero e prolonga o tempo de vida da célula e a sua capacidade replicativa; 36

ΕΡ 1 432 402 /PT "Inibidores de quinase dependente de ciclina" que interferem com as quinases dependentes da ciclina que controlam os principais passos entre as diferentes fases do ciclo celular através da fosforilação de proteínas das células, tais como histonas, proteínas citoesqueléticas, factores de transcrição, genes supressores de tumores e outros do género; “Agentes danificadores do ADN"; “Agentes da reparação do ADN"; “Agentes antiangiogénicos" que interferem na geração de novos vasos sanguíneos ou no crescimento dos vasos sanguíneos existentes que ocorrem durante o crescimento tumoral; e “Venenos mitocondriais" que directa ou indirectamente interrompem a função da cadeia respiratória mitocondrial.

Combinações especialmente preferidas para o tratamento de tumores são as combinações clinicamente aprovadas aqui apresentadas atrás. Dado que estas combinações foram já aprovadas para utilização em seres humanos, a reformulação para assegurar uma administração apropriada é especialmente importante.

Os agentes preferidos que podem ser utilizados em combinação incluem agentes danificadores do ADN, tais como a carboplatina, cisplatina, ciclofosfamida, doxorubicina, daunorubicina, epirubicina, mitomicina C, mitoxantrona; iniciadores de reparação do ADN, incluindo o 5-fluorouracilo (5-FU) ou FUDR, gencitabina e metotrexato; inibidores da topoisomerase I, tais como a camptotecina, irinotecano e topotecano; inibidores de pontos de verificação S/G2 ou G2/M, tais como a bleomicina, docetaxel, doxorubicina, etoposido, paclitaxel, vinblastina, vincristina, vindesina e vinorelbina; inibidores dos pontos de verificação Gl/S-precoce; inibidores do ponto de verificação G2/M; inibidores de tirosina-quinases receptoras, tais como genisteína, trastuzumab, ZD1839; agentes citotóxicos, agentes de indução da apoptose e inibidores do controlo do ciclo celular. 37

ΕΡ 1 432 402 /PT Ο mecanismo de acção de um ou mais dos agentes pode não ser conhecido ou ser incorrectamente identificado. Todas as combinações sinérgicas ou aditivas de agentes antineoplásicos estão dentro do domínio do presente invento. Preferencialmente, para o tratamento de um neoplasma, combinações que inibem mais do que um mecanismo que conduza a uma proliferação descontrolada de células, são escolhidas para utilização de acordo com este invento. Por exemplo, o presente invento inclui a selecção de combinações que afectam pontos específicos dentro do ciclo celular resultando, deste modo, em efeitos não antagonísticos. Por exemplo, os fármacos que provocam danos no ADN podem ser emparelhados com os que inibem a reparação do ADN, tal como antimetabolitos. O presente invento inclui também a selecção de combinações que bloqueiam vias múltiplas que de outro modo resultariam em proliferação das células.

As combinações particularmente preferidas são agentes danificadores do ADN em combinação com os inibidores de reparação do ADN, agentes danificadores do ADN em combinação com inibidores da topoisomerase I ou topoisomerase II, inibidores da topoisomerase I em combinação com inibidores do ponto de verificação S/G2 ou G2/M, inibidores do ponto de verificação do Gl/S ou inibidores CDK em combinação com inibidores do ponto de verificação G2/M, inibidores de tirosina-quinases receptoras em combinação com agentes citotóxicos, agentes indutores de apoptose em combinação com agentes citotóxicos, agentes indutores de apoptose em combinação com inibidores do controlo do ciclo celular, inibidores dos pontos de verificação Gl/S ou G2/M em combinação com agentes citotóxicos, inibidores da topoisomerase I ou II em combinação com agentes reparadores de ADN, inibidores da topoisomerase I ou II ou inibidores da telomerase em combinação com inibidores do controlo do ciclo celular, inibidores da topoisomerase I em combinação com inibidores da topoisomerase II, e dois agentes citotóxicos em combinação.

Os agentes específicos que podem ser utilizados em combinação incluem cisplatina (ou carboplatina) e 5-FU (ou FUDR), cisplatina (ou carboplatina) e irinotecano, irinotecano e 5-FU (ou FUDR), vinorelbina e cisplatina (ou carboplatina), 38 ΕΡ 1 432 402 /PT metotrexato e 5-FU (ou FUDR), idarubicina e araC, cisplatina (ou carboplatina) e taxol, cisplatina (ou carboplatina) e etoposido, cisplatina (ou carboplatina) e topotecano, cisplatina (ou carboplatina) e daunorubicina, cisplatina (ou carboplatina) e doxorubicina, cisplatina (ou carboplatina) e gencitabina, oxaliplatina e 5-FU (ou FUDR), gencitabina e 5-FU (ou FUDR), adriamicina e vinorelbina, taxol e doxorubicina, flavopuridol e doxorubicina, UCN01 e doxorubicina, bleomicina e triclorperazina, vinorelvina e edelfosina, vonorelbina e esfingosina (e análogos da esfingosina), vinorelbina e fosfatidilserina, vinorelbina e camptotecina, cisplatina (ou carboplatina) e esfingosina (e análogos da esfingosina), esfingosina (e análogos da esfingosina) e daunorubicina e esfingosina (e análogos da esfingosina) e doxorubicina.

As combinações preferidas em geral incluem as que foram aqui apresentadas atrás, já mostradas como sendo eficazes em clinica reconhecida pela FDA e aquelas que são ainda sugeridas com base na literatura. Embora os agentes candidatos para utilização no método do invento não estejam limitados a estas combinações especificas, aquelas que foram apresentadas aqui atrás foram descritas como terapias de combinação adequadas, e são, deste modo, preferidas para utilização nos métodos e composições do presente invento.

Alguns lípidos são "lípidos terapêuticos" que são capazes de exercer efeitos terapêuticos, tais como a indução da apoptose. Incluído nesta definição estão lípidos, tais como os éter lípidos, ácido fosfatídico, fosfonatos, ceramida e análogos de ceramida, di-hidroxiceramida, fitoceramida, esfingosina, análogos da esfingosina, esfingomielina, lípidos contendo serina e esfinganina. O termo "fosfolípido contendo serina" ou "lípido contendo serina", tal como aqui definido é um fosfolípido em que o grupo terminal polar compreende um grupo fosfato covalentemente junto numa extremidade a uma serina e na outra extremidade a esqueleto de três átomos de carbono ligado a uma porção hidrófoba através de uma ligação éter, éster ou amida. Incluídos nesta classe estão os fosfolípidos, tais como a fosfatidilserina (PS) que possuem duas cadeias hidrocarbonadas na porção hidrófoba que têm entre 5-23 átomos de carbono de comprimento e possuem variados graus de saturação. O termo porção hidrófoba com referência a um 39

ΕΡ 1 432 402 /PT fosfolípido contendo serina ou um lípido contendo serina refere-se a grupos apoiares, tais como cadeias hidrocarbonadas alifáticas saturadas ou insaturadas, opcionalmente substituído com um ou mais grupo(s) aromáticos, alicíclicos ou heterocíclicos.

Combinações de lípidos terapêuticos e outros agentes podem ser também utilizadas para conseguir efeitos sinérgicos ou aditivos (ver Exemplos 17-21) .

Rastreio de Alto Rendimento para Determinar as Proporções Que Apresentam Efeitos de Combinação Não Antagonística

As bases de dados químicas de agentes podem ser comparadas umas com as outras em diferentes proporções para identificar novas combinações de fármacos não antagonísticas. As bases de dados químicas podem compreender agentes novos ou convencionais. Adicionalmente, para o rastreio de combinações de dois agentes, combinações de três ou quatro agentes podem ser também rastreadas relativamente a efeitos de combinação não antagonística. Preferencialmente, a metodologia de análise de dados empregue para determinar a sinergia de fármacos é a Análise do Efeito Mediano atrás mencionada. De acordo com este método, as bases de dados dos agentes são testadas individualmente e em combinação em diferentes proporções. Os índices de combinação são então calculados utilizando o método atrás mencionado desenvolvido por Chou e Talalay. As combinações de fármacos que apresentam efeitos não antagonísticos para proporções específicas são encapsuladas em veículos de administração para numa proporção não antagonística.

Os sistemas de rastreio de alto rendimento estão comercialmente disponíveis (ver, e.g. Zymark Corp., Hopkinton, Mass.; Air Technical Industries, Mentor, Ohio; Beckman Instruments, Inc. Fullerton, Calif.; Precision Systems, Inc., Natick, Mass., etc.). Estes sistemas automatizam tipicamente procedimentos completos incluindo todas as amostras e a pipetagem dos reagentes, a deposição do líquido, incubações temporizadas e leituras finais das microplacas em detector(es) apropriado(s) para o ensaio. Estes sistemas configuráveis proporcionam um alto rendimento e um rápido arranque, assim 40

ΕΡ 1 432 402 /PT como um alto grau de flexibilidade e de adaptação. Os fabricantes de tais sistemas proporcionam protocolos detalhados para vários métodos de rastreio de alto rendimento.

Preparação de Composições Não Antagonísticas

Quando as proporções apropriadas de agentes foram determinadas, tal como descrito atrás, os agentes com a proporção apropriada são colocados numa composição de veiculo de administração em que um ou mais veículos de administração encapsulam dois ou mais agentes. Nem todos os veículos de administração na composição necessitam ser idênticos. Os veículos de administração nas composições são partículas com dimensões que dependem da sua via de administração, que pode ser em suspensão, em meio aquoso ou noutro solvente e são capazes de encapsular os agentes do invento. Tais veículos incluem, por exemplo, transportadores lipídicos, lipossomas, ciclodextrinas, nanopartícuias poliméricas e micropartículas poliméricas, incluindo nanocápsulas e nanoesferas, micelas de copolímeros de blocos, emulsões estabilizadas com lípidos, cadeias únicas poliméricas derivatizadas, sistemas híbridos lípido-polímero, micelas de lípidos, micelas de lipoproteínas tal como mencionado previamente. Para administração intravenosa, os veículos de administração têm tipicamente cerca de 4-6000 nm de diâmetro. Os diâmetros preferidos são de cerca de 5-500 nm de diâmetro, mais preferencialmente 5-200 nm de diâmetro. Para inalação, administração intratecal, intra-articular, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea, os veículos de administração têm tipicamente de 4 pm até um excesso de 50 pm. As composições de veículo de administração projectadas para administração intra-ocular são geralmente mais pequenas.

Os agentes terapêuticos são “encapsulados" em veículos de administração. "Encapsulamento", tal como previamente descrito, inclui associação covalente ou não covalente de um agente com o veículo de administração. Por exemplo, esta pode ser a interacção do agente com a camada ou camadas externas do veículo de administração ou a retenção de um agente dentro do veículo de administração, sendo o equilíbrio atingido entre diferentes porções do veículo de administração. Por exemplo, para lipossomas, o encapsulamento de um agente pode ser por 41

ΕΡ 1 432 402 /PT associação do agente por interacção com a bicamada de lipossomas através de interacção covalente ou não covalente com os componentes lípidos ou a retenção no interior aquoso do lipossoma, ou em equilíbrio entre a fase aquosa interna e a bicamada. Para veículos de administração à base de polímeros, o encapsulamento pode referir-se à ligação covalente de um agente a um polímero linear ou não linear. Além disso, exemplos não limitativos incluem a dispersão do agente na matriz polimérica, ou a concentração do fármaco no núcleo de uma nanocápsula, uma micela de copolímero em bloco ou um sistema híbrido polímero-lípido. "Carregamento" refere-se ao acto do encapsulamento de um ou mais agentes num veículo de administração. 0 encapsulamento da combinação desejada pode ser conseguido quer através do encapsulamento em veículos de administração separados quer dentro do mesmo veículo de administração. Quando é desejado o encapsulamento em veículos de administração separados, tais como lipossomas, a composição de lípidos de cada lipossoma pode ser bastante diferente para permitir uma farmacocinética coordenada. Ao alterar a composição do veículo, as taxas de libertação dos fármacos encapsulados podem ser feitas corresponder para permitir que proporções não antagonísticas de fármacos sejam administradas no local do tumor. Os meios para alterar as taxas de libertação incluem o aumento do comprimento da cadeia de acilo dos lípidos que formam a vesícula para melhorar a retenção do fármaco, controlando a mudança dos polímeros hidrófilos enxertados, tais como PEG da membrana do lipossoma e incorporando agentes para tornarem a membrana rígida, tais como os esteróis ou a esf ingomielina na membrana. Deve ser evidente para os especialistas na matéria que se for desejado administrar um primeiro e um segundo fármaco com uma proporção de fármaco específica e se o segundo fármaco está fracamente retido dentro da composição de lipossoma do primeiro fármaco (e.g., DMPC/Chol), essa farmacocinética melhorada pode ser conseguida por encapsulamento do segundo fármaco numa composição de lipossoma com lípidos com um comprimento da cadeia de acilo aumentado (e.g., DSPC/Chol). Alternativamente, dois ou mais agentes podem ser encapsulados dentro do mesmo veículo de administração. 42

ΕΡ 1 432 402 /PT

As técnicas de encapsulamento são dependentes da natureza dos veículos de administração. Por exemplo, os agentes terapêuticos podem ser carregados em lipossomas utilizando métodos de carregamento passivos e activos.

Os métodos passivos de encapsulamento de agentes envolvem o encapsulamento do agente durante a preparação dos lipossomas. Neste método, o fármaco pode ser associado à membrana ou encapsulado dentro de um espaço aquoso retido. Este inclui um método de retenção passivo descrito por Bangham, et al., J. Mol. Biol. (1965) 12:238, em que a fase aquosa contendo o agente de interesse é colocado em contacto com um filme de lípidos de formação de vesículas secas depositados nas paredes de um vaso reaccional. Por agitação através de meios mecânicos, o inchamento dos lípidos ocorrerá e formar-se-ão vesículas multilamelares (MLV). Utilizando extrusão, as MLV podem ser convertidas em vesículas multilamelares grandes (LUV) ou vesículas unilamelares pequenas (SUV). Outro método de carregamento passivo que pode ser utilizado inclui o descrito por Deamer e Bangham, Biochem. Biophys. Acta (1976) 443: 629. Este método envolve a dissolução de lípidos formadores de vesículas em éter e, em vez de evaporar primeiro o éter para formar um filme fino na superfície, este filme é depois colocado em contacto com uma fase aquosa para ser encapsulada, a solução de éter é directamente injectada na referida fase aquosa e o éter é evaporado depois, com o que se obtêm os lipossomas com agentes encapsulados. Um outro método que pode ser empregue é o método da Evaporação de Fase Reversa (REV) descrito por Szoka e Papahadjopoulos, P.N.A.S. (1978) 75: 4194, em que uma solução de lípidos num solvente orgânico insolúvel em água é emulsionada numa fase portadora aquosa e o solvente orgânico é subsequentemente removido sob pressão reduzida.

Outros métodos de retenção passiva que podem ser utilizados incluem a sujeição dos lipossomas a tratamentos sucessivos de desidratação e de re-hidratação, ou congelamento e descongelamento. A desidratação é realizada por evaporação ou congelamento-descongelamento. Esta técnica é descrita por Kirby, et al., Biotechnology (1984) 979-984. Shew e Deamer (Biochem. et Biophys. Acta (1985) 816: 1-8) também descrevem um método em que os lipossomas preparados por utilização de 43

ΕΡ 1 432 402 /PT ultra-sons são misturados em solução aquosa com o soluto a ser encapsulado, e a mistura é seca sob atmosfera de azoto num balão rotativo. Após re-hidratação, são produzidos grandes lipossomas em que uma fracção significativa do soluto foi encapsulada. 0 encapsulamento passivo de dois ou mais agentes é possível para muitas combinações de fármacos. Esta aproximação é limitada pela solubilidade dos fármacos em soluções tampão aquosas e a grande percentagem de fármaco que não está retida dentro do sistema de administração. O carregamento pode ser melhorado por co-liofilização dos fármacos com a amostra de lípido e re-hidratação no volume mínimo permitido para solubilizar os fármacos. A solubilidade pode ser melhorada variando o pH do tampão, aumentando a temperatura ou por adição ou remoção de sais do tampão.

Podem ser também utilizados métodos activos de encapsulamento. Por exemplo, os lipossomas podem ser carregados de acordo com uma técnica de carregamento de complexação com metal ou de gradiente de pH. Com um carregamento com gradiente de pH, formam-se os lipossomas que encapsulam uma fase aquosa com um pH seleccionado. Os lipossomas hidratados são colocados num ambiente aquoso com um pH diferente para remover ou minimizar uma carga de fármaco ou outro agente a ser encapsulado. Uma vez que o fármaco se movimenta dentro do lipossoma, o pH do interior resulta num estado de fármaco carregado, que evita que o fármaco seja permeado na bicamada de lípido, retendo deste modo o fármaco no lipossoma.

Para criar um gradiente de pH, o meio externo original pode ser substituído por um novo meio externo possuindo uma concentração diferente de protões. A substituição do meio externo pode ser conseguida através de várias técnicas, tais como, passando a preparação de vesícula de lípido através de uma coluna de filtração em gel, e.g., uma coluna Sephadex G-50, que foi equilibrada com o novo meio (tal como apresentado nos exemplos abaixo), ou por centrifugação, diálise ou técnicas relacionadas. O meio interno pode ser quer ácido quer básico no que respeita ao meio externo. 44

ΕΡ 1 432 402 /PT

Após o estabelecimento de um gradiente de pH, um agente carregável com gradiente de pH é adicionado à mistura e ocorre o encapsulamento do agente no lipossoma, tal como descrito atrás. O carregamento utilizando um gradiente de pH pode ser realizado de acordo com os métodos descritos nas patentes U.S. Nos. 5 616 342, 5 736 155 e 5 785 987 aqui incorporados como referência. Um método preferido de carregamento com gradiente de pH é o método de carregamento com base em citrato utilizando citrato como tampão interno para um pH de 2-6 e um tampão externo neutro. Vários métodos podem ser empregues para estabelecer e manter um gradiente de pH através de um lipossoma, estando todos aqui incorporados como referência. Estes podem envolver a utilização de ionóforos que podem ser inseridos na membrana de lipossoma e transportar os iões através das membranas em permuta com protões (ver, por exemplo, a patente U.S. N°. 5 837 282). Podem ser também utilizados compostos encapsulados no interior do lipossoma que são capazes de enviar protões através da membrana lipossómica e, deste modo, fazer um gradiente de pH (ver, por exemplo, a patente U.S. N°. 5 837 282). Estes compostos compreendem uma porção ionizável que é neutra quando desprotonada e carregada quando protonada. A forma desprotonada neutra (que está em equilíbrio com a forma protonada) é capaz de atravessar a membrana de lipossoma e, deste modo, deixar um protão para trás no interior do lipossoma e provocando, deste modo, uma diminuição do pH no interior. Exemplos de tais compostos incluem cloreto de metilamónio, sulfato de metilamónio, sulfato de etilenodiamónio (ver a patente U.S. N° . 5 785 987) e sulfato de amónio. Tampões de carregamento internos que são capazes de estabelecer um pH interno básico, podem ser também utilizados. Neste caso, a forma neutra é protonada de forma a que os protões são enviados para fora do interior do lipossoma para estabelecer um interior básico. Um exemplo de um tal composto é o acetato de cálcio (ver a patente U.S. N°. 5 939 096).

Dois ou mais agentes podem ser carregados num lipossoma utilizando os mesmos métodos de carregamento activo ou podem envolver a utilização de diferentes métodos de carregamento 45 ΕΡ 1 432 402 /PT activo. Por exemplo, o carregamento com complexação de metal pode ser utilizado para carregar activamente agentes múltiplos ou pode ser acoplado a outra técnica de carregamento activo, tal como o carregamento com gradiente de pH. O carregamento activo com base em metais utiliza tipicamente lipossomas com iões metálicos encapsulados passivamente (com ou sem agentes terapêuticos carregados passivamente). São utilizados vários sais de iões metálicos, presumindo que o sal é farmaceuticamente aceitável e solúvel em soluções aquosas. Agentes carregados activamente são seleccionados com base na sua capacidade de formar um complexo com um ião metálico e, deste modo, ser retido quando assim complexado dentro do lipossoma, e ainda capaz de ser carregado para um lipossoma quando não complexado com iões metálicos. Os agentes que são capazes de se coordenarem com um metal compreendem, tipicamente, locais de coordenação, tais como aminas, grupos carbonilo, éteres, cetonas, grupos acilo, acetilenos, olefinas, tióis, grupos hidroxilo ou halogeneto ou outros grupos adequados capazes de doarem electrões ao ião metálico e formando assim um complexo com o ião metálico. Exemplos de agentes activos que se ligam com metais incluem, mas não estão limitados a, quinolonas, tais como fluoroquinolonas; quinolonas, tais como o ácido nalidíxico; antraciclinas, tais como a doxorubicina, daunorubicina e idarubicina; aminoglicósidos, tais como a canamicina; e outros antibióticos, tais como a bleomicina, a mitomicina C e a tetraciclina; e mostardas azóticas, tais como a ciclofosfamida, a tio-semicarbazonas, a indometacina e o nitroprussieto; camptotecinas, tais como o topotecano, o irinotecano, o lurtotecano, a 9-aminocamptotecina, a 9-nitricamptotecina e a 10-hidroxicamptotecina; e podofilotoxinas, tais como o etoposido. A assimilação de um agente pode ser estabelecida por incubação da mistura a uma temperatura adequada após adição do agente ao meio externo. Dependendo da composição do lipossoma, a temperatura e o pH do meio interno, e a natureza química do agente, a assimilação do agente pode ocorrer ao longo de um período de tempo de minutos ou horas. Os métodos para a determinação de qual a coordenação que ocorre entre um agente e um metal dentro de um lipossoma inclui análise espectrofotométrica e outras técnicas convencionais bem conhecidas pelos especialistas na matéria. 46

ΕΡ 1 432 402 /PT

Para além disso, a eficiência de carregamento e as propriedades de retenção de lipossomas utilizando procedimentos com base em metais realizados na ausência de um ionóforo no lipossoma são dependentes do metal empregue e da composição do lipido do lipossoma. Ao seleccionar a composição do lipido e um metal, as propriedades de carregamento ou de retenção podem ser feitas à medida para conseguir um carregamento ou uma libertação desejados de um agente seleccionado de um lipossoma.

Os métodos de carregamento passivos e activos podem ser sequencialmente combinados de modo a carregar fardos múltiplos para um veiculo de administração. Como exemplo, lipossomas contendo um fármaco de platina passivamente retido tal como a cisplatina na presença de MnCl2 pode ser subsequentemente utilizado para encapsular activamente uma antraciclina, tal como a doxorubicina no interior do lipossoma. Este método pode ser aplicável a numerosos fármacos que são encapsulados em lipossomas através de encapsulamento passivo.

Utilizações Terapêuticas de Administração de Composições de Veículos de Administração Encapsulando Múltiplos Agentes

Estas composições de veículos de administração podem ser utilizadas para tratar uma variedade de doenças de animais de sangue quente e espécies aviárias. Deste modo, os indivíduos adequados para tratamento de acordo com os métodos e composições do invento incluem humanos, mamíferos tais como gado ou animais domésticos, aves domesticadas tais como galinhas e patos, e animais de laboratório para utilização em pesquisas. Exemplos de utilizações médicas das composições aqui descritas, incluem o tratamento do cancro, o tratamento de doenças cardiovasculares, tais como a hipertensão, arritmia cardíaca e restenose, o tratamento de infecções bacterianas, virais, fúngicas ou parasíticas, o tratamento ou a prevenção de doenças por utilização das composições aqui descritas como vacinas, tratamento da inflamação ou tratamento de doenças auto-imunes.

As composições de veículos de administração de acordo com este invento são utilizadas para tratar neoplasmas. A administração de fármacos formulados a um local de um tumor é 47 ΕΡ 1 432 402 /PT conseguida por administração de lipossomas ou outros sistemas de administração sob a forma de partículas. Preferencialmente, os lipossomas possuem um diâmetro inferior a 200 nm. A vasculatura do tumor é geralmente mais aberta do gue a vasculatura normal devido a fenestrações ou falhas nos endotélios. Isto permite gue os veículos de administração com 200 nm ou menos de diâmetro penetrem na camada celular endotelial descontínua e subjacente à membrana base que envolve os vasos que fornecem o sangue ao tumor. A acumulação selectiva dos veículos de administração nos locais dos tumores a seguir ao derramamento conduz a uma melhor administração do fármaco e eficácia terapêutica. Dado que os transportadores saem para fora, pode ser assumido que a proporção de fármaco em relação a fármaco do transportador determinada no sangue será comparável à proporção de fármaco em relação a fármaco do transportador no espaço extravascular.

Administração de Composições de Veículos de Administração

Tal como mencionado acima, as composições de veículos de administração do presente invento podem ser administradas a animais de sangue quente, incluindo humanos assim como espécies aviárias domésticas. Para tratamentos de doenças humanas, um médico qualificado determina como é que as composições do presente invento devem ser utilizadas e, no que respeita à dose, a toma e a via de administração utilizando protocolos estabelecidos. Tais aplicações podem também utilizar um escalonamento da dose se os agentes encapsulados nas composições de veículo de administração do presente invento apresentarem toxicidade reduzida para os tecidos saudáveis do indivíduo.

Preferencialmente, as composições farmacêuticas do presente invento são administradas parentericamente, i.e. intra-arterialmente, intravenosamente, intraperitonealmente, subcutaneamente ou intramuscularmente. Mais preferencialmente, as composições farmacêuticas são administradas intravenosamente ou intraperitonealmente por injecção bolus. Por exemplo, ver Rahman, et al., patente U.S. N° . 3 993 754; Sears, patente U.S. N° . 4 145 410; Papahad j opoulos, et al., patente U.S. N°. 4 235 871; Schneider, patente U.S. N°. 48

ΕΡ 1 432 402 /PT 4 224 179; Lenk, et al., patente U.S. N°. 4 522 803; e

Fountain, et al., patente U.S. N°. 4 588 578.

Noutros métodos, as preparações farmacêuticas do presente invento podem ser feitas contactar com o tecido alvo através de aplicação directa da preparação ao tecido. A aplicação pode ser através de procedimentos tópicos, “abertos" ou "fechados". Por "tópico" pretende significar-se a aplicação directa da preparação farmacêutica a um tecido exposto ao ambiente, tal como a pele, orofaringe, canal auditivo externo e outros do género. Procedimentos "abertos" são aqueles procedimentos que incluem a incisão da pele de um doente e a visualização directa do tecido subjacente em que são aplicadas as preparações farmacêuticas. Isto é geralmente conseguido através de um procedimento cirúrgico, tal como a toracotomia para analisar os pulmões, laparotomia abdominal para avaliar as visceras abdominais ou outra aproximação cirúrgica directa ao tecido alvo. Procedimentos "fechados" são procedimentos invasivos em que os tecidos alvo internos não são directamente visualizados, mas avaliados através de instrumentos inseridos através de pequenas feridas na pele. Por exemplo, as preparações podem ser administradas ao peritóneo através de lavagem com agulha. Do mesmo modo, as preparações farmacêuticas podem ser administradas nas meninges ou na espinal medula por infusão durante uma punção lombar seguida do posicionamento apropriado do doente, tal como correntemente praticado na anestesia espinal ou na imagiologia com metrazamida da espinal medula. Alternativamente, as preparações podem ser administradas através de dispositivos endoscópicos.

As composições farmacêuticas que compreendem os veículos de administração do presente invento são preparadas de acordo com técnicas correntes e podem compreender água, água tamponada, solução salina a 0,9%, glicina a 0,3%, dextrose a 5% e outros do género, incluindo glicoproteínas para uma melhor estabilidade, tal como albumina, lipoproteína, globulina e outros do género. Estas composições podem ser esterilizadas através de técnicas de esterilização convencionais, bem conhecidas. As soluções aquosas resultantes podem ser embaladas para utilização ou filtradas sob condições assépticas e liofilizadas, sendo a preparação liofilizada 49 ΕΡ 1 432 402 /PT combinada com uma solução aquosa estéril antes da administração. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, tais como requerido para aproximação às condições fisiológicas, tais como o ajuste de pH e agentes tampão, agentes de ajuste da tonicidade e outros do género, por exemplo, acetato de sódio, lactato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio e outros do género. Adicionalmente, a suspensão de veículos de administração pode incluir agentes protectores de lípidos que protegem os lípidos contra os radicais livres e danos peroxidativos dos lípidos em armazenamento. Os eliminadores de radicais livres lipófilos, tais como o alfa-tocoferol e agentes quelantes específicos de ferro solúveis em água, tais como ferroxamina, são adequados. A concentração dos veículos administrados nas formulações farmacêuticas podem variar grandemente, tal como de menos do que cerca de 0,05%, usualmente a, ou pelo menos, cerca de 2-5% até tanto como 10 ou 30% em peso e será principalmente seleccionada pelos volumes de fluido, viscosidades e outros do género, de acordo com um modo particular de administração seleccionada. Por exemplo, a concentração pode ser aumentada para baixar a carga de fluido associada ao tratamento. Alternativamente, os veículos de administração compostos por lípidos irritantes podem ser diluídos até baixas concentrações para diminuir a inflamação no local da administração. Para diagnóstico a quantidade de veículos de administração administrada dependerá da marca particular utilizada, do estado da doença a ser diagnosticada e da avaliação do médico.

Preferencialmente, as composições farmacêuticas do presente invento são administradas intravenosamente. A dosagem das formulações de veículo de administração dependerá da proporção de fármaco em relação ao lípido e da opinião do médico que está a administrar, com base na idade, peso e condição do doente.

Adicionalmente a composições farmacêuticas, formulações adequadas para utilização veterinária podem ser preparadas e administradas de modo adequado ao indivíduo. Indivíduos veterinários preferidos incluem espécies mamíferas, por exemplo, primatas não humanos, cães, gatos, gado, cavalos, 50 ΕΡ 1 432 402 /PT ovelhas e aves domesticadas. Os indivíduos podem também incluir animais de laboratório, por exemplo, em particular, ratos, coelhos, ratinhos e cobaias.

Avaliação da Actividade Terapêutica In Vivo A actividade terapêutica das composições de veículo de administração compreendendo dois ou mais agentes encapsulados pode ser medida após administração num modelo animal. Preferencialmente, o modelo animal compreende um tumor embora as composições de veículos de administração possam ser administradas a modelos animais para outras doenças. Podem ser utilizadas espécies de roedores, tais como ratinhos e ratos de origem consanguínea, exogâmica ou híbrida incluindo modelos imunocompetentes e imunocomprometidos, assim como "knockout" ou transgénico.

Os modelos podem consistir de tumores sólidos ou não sólidos implantados como suspensões de células, massas ou fragmentos de tumor nas regiões subcutânea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intratecal ou ortopédica. Os tumores podem ser também estabelecidos através da aplicação ou administração de agentes tumorigénicos/carcinogénicos ou pode ser deixados a desenvolverem-se espontaneamente em modelos animais geneticamente modificados adequados. Os tipos de tumores podem consistir de tumores de origem ectodérmica, mesodérmica ou endodérmica, tais como carcinomas, sarcomas, melanomas, gliomas, leucemias e linfornas.

Numa forma de concretização preferida, são empregues modelos em ratinho de tumores. Os tumores sólidos xenoenxertados humanos desenvolvem-se em ratinhos imunocomprometidos que podem ser utilizados e seleccionados com base de genética e atributos de crescimento definidos. As células tumorais utilizadas nestas experiências podem ser geneticamente manipuladas ou seleccionadas para expressarem propriedades preferidas e são injectadas nos ratinhos.

Uma vez que os tumores se tenham desenvolvido até uma dimensão palpável (mensurável), podem ser administradas composições de veículos de administração, preferencialmente, intravenosamente, e os seus efeitos no crescimento do tumor 51

ΕΡ 1 432 402 /PT são monitorizados. Os tratamentos terapêuticos pretendidos podem consistir num único bolus ou administrações numa única injecção ou administrações múltiplas ou continuas ao longo de vários dias ou semanas e através de qualquer via adequada, tal como a via oral, nasal, subcutânea, intravenosa, intraperitoneal, intratecal, intratumoral, utilizando seringas, comprimidos, líquidos e bombas (tal como osmótica). A dependência da dose e periodicidade pode ser avaliada de modo a determinar a actividade antitumoral máxima que se pode conseguir.

Podem ser utilizados vários métodos para determinar a actividade terapêutica em modelos animais compreendendo um tumor. Estes incluem métodos de avaliação de modelos de tumores sólidos e métodos de avaliação de modelos de tumores não sólidos.

Os métodos de avaliação de modelos de tumores sólidos incluem a medição do volume do tumor (massa) , a inibição do peso do tumor (TWI%), o atraso no crescimento do tumor (T-C), a regressão do tumor, a morte das células e ensaios clonogénicos.

As medições do volume do tumor são determinadas a partir de medições de uma craveira do comprimento e largura perpendiculares (frequentemente podem também ser obtidas medições de altura). O volume do tumor (ml) ou a massa (g) são calculados a partir de: Volume = (comprimento x largura2/2; ou volume = n/6 x (comprimento x largura x altura). Os dados são registados em função do tempo. A inibição do peso do tumor (TWI%) é determinada pela medição do peso do tumor médio de um grupo tratado dividido pelo peso do tumor médio de um grupo de controlo, menos lx 100 num tempo definido. O atraso no crescimento do tumor (T-C) é medido como o tempo médio em dias para um grupo tratado (T) para alcançar uma determinada dimensão do tumor arbitrária (por exemplo, 300 mg) menos o tempo médio em dias para o grupo de controlo atingir a mesma dimensão de tumor. 52

ΕΡ 1 432 402 /PT A regressão do tumor como resultado do tratamento pode também ser utilizada como um meio para avaliar um modelo de tumor. Os resultados são expressos como as reduções em dimensão do tumor (massa) ao longo do tempo.

Os métodos de eliminação das células de avaliação do modelo de tumor sólido podem envolver a medição repetida de tumores com craveiras até todos excederem uma dimensão pré-determinada (e.g., 200 mg). O crescimento do tumor e o tempo para o tumor atingir o dobro podem ser avaliados. Os parâmetros do logio da eliminação das células podem ser calculados através de: logio da eliminação das células/dose = (T-C)/((3,32 ) (Td) (N° . de doses)) logio da eliminação das células (total) = (T-C) / ( (3,32 ) (Td) ) logio da eliminação das células/dose (liquido) = ((T-C)- (duração de Rx) ) / ( (3,32 (Td) ) em que: (T-C) = atraso do crescimento do tumor

Td = tempo para o tumor atingir o dobro

Os ensaios da clonogenicidade expressam a eficácia da terapia. Estes ensaios incluem ensaios de excisão e de caracterização das suspensões de células de tumores sólidos.

Os ensaios de excisão, utilizados para avaliar que fracção de células, numa suspensão preparada a partir de tumores, possui um ilimitado potencial proliferativo (i.e. são clonogénicos). Os três tipos de ensaios de excisão são: i) TD50, ou ensaios de diluição finais: determinam o número de células requeridas para produzir um tumor obtido de inóculos in vivo. ii) Ensaio de colónia in vivo: avalia a capacidade das células individuais de formarem nódulos (colónias), por exemplo, no pulmão. iii) Ensaio de colónia in vivo, testa a capacidade de células individuais crescerem quer em colónias quer em meio liquido, quando se formam colónias na superfície de 53

ΕΡ 1 432 402 /PT plástico ou de vidro de placas de cultura, ou em meio semi-sólido, tal como ágar, em que as colónias se formam em suspensão. A caracterização de suspensões de células obtidas a partir de tumores sólidos é requerida para ensaios clonogénicos in vivo e in vitro, medições de fluxo citométrico e para numerosas análises bioquímicas e moleculares realizadas numa base por célula. A preparação é efectuada através de um certo número de métodos, tais como enzimático, mecânico, químico, combinações destes e agentes de activação superficial. As avaliações podem incluir, o rendimento celular, a morfologia celular, a clonogenicidade das células tumorais, a retenção de características bioquímicas ou moleculares.

Os métodos de avaliação de modelos de tumores não sólidos incluem a medição do aumento do tempo de vida (ILS%), atraso do crescimento tumoral (T-C), e a sobrevivência a longo prazo (curas). O aumento do tempo de visa (ILS%) mede o aumento em percentagem do tempo de vida de grupos tratados versus grupos de controlo ou não tratados. O atraso do crescimento tumoral (T-C) mede o tempo médio, em dias, de sobrevivência do grupo tratado (T) menos o tempo médio, em dias, de sobrevivência do grupo de controlo (C) . A sobrevivência a longo prazo (curas) mede os grupos tratados que sobrevivem até e para lá de 3 vezes os tempos de sobrevivência de grupos não tratados ou de controlo.

Os métodos para determinar a actividade terapêutica em humanos com cancro incluem medições de sobrevivência e pontos finais substitutos (testes clínicos). O tempo em que a sobrevivência é razoavelmente avaliada depende do tumor em questão. Como exemplo, as taxas de sobrevivência para doentes com linfomas de baixo grau podem ser examinadas 5 ou 10 anos após o diagnóstico, enquanto que a sobrevivência de doentes possuindo doenças agressivas, tal como o cancro do pulmão de célula pequena, podem ser melhor avaliados a 6 ou 12 meses após o diagnóstico. 54

ΕΡ 1 432 402 /PT

Os métodos para determinar a actividade terapêutica utilizando pontos finais substitutos (testes clínicos) incluem a medição da resposta completa (CR), resposta parcial (PR) , sobrevivência livre de progressão (PFS), tempo para progressão (TTP) ou duração da resposta (DOR) , plasma e marcadores de urina, inibição de enzimas e/ou do estado do receptor, alterações na expressão dos genes e qualidade de vida (QOL).

Uma resposta completa significa o desaparecimento de todos os locais conhecidos de doença sem o desenvolvimento de qualquer doença nova durante um período de tempo apropriado para o tipo de tumor a ser tratado. As avaliações são baseadas numa variedade de exames, tais como os mencionados acima. A resposta parcial é de, pelo menos, uma diminuição de 50% na soma dos produtos de medição bidimensional de todas as lesões sem o aparecimento de nova doença durante um período de tempo apropriado ao tipo de tumor a ser tratado. As avaliações são baseadas numa variedade de exames (análise CT, MRI, ultra-sons, análise PET, análise dos ossos, exame físico) dos doentes.

Sobrevivência livre de progressão (PFS): Duração a partir do tratamento em que um doente sobrevive e não há crescimento do tumor existente nem aparência de novas massas tumorais. A PFS pode ser expressa quer como a duração de tempo quer como a proporção de doentes que sobrevivem e sem progressão num dado tempo após o diagnóstico.

Tempo para progressão (TTP) ou duração da resposta (DOR), refere-se à duração de tempo do tratamento até uma progressão do crescimento do tumor, medido quer como um aumento em tamanho das massas tumorais existentes quer como o aparecimento de novas massas tumorais.

Os marcadores de plasma e urina incluem marcadores de medição tais como, mas não limitados aos seguintes marcadores; antigénio específico da próstata (PSA) e antigénio carcinoembrionário (CEA).

Inibição de enzimas e/ou estado do receptor. Receptores do factor de crescimento tais como, mas não limitados a, 55

ΕΡ 1 432 402 /PT tirosina-quinases receptoras, receptor de EGF, receptor de PDGF, e receptores Her-1 e Her-2. Enzimas tais como, mas não limitadas a quinases ligadas a integrina, proteína-quinases e outros do género.

Alterações na expressão dos genes incluem análises em série da expressão do gene (genómica) e alterações na expressão de proteínas (proteómica). A qualidade de vida (QOL) inclui métodos tais como o método de classificação EORTC QLQ-C30 que avalia as classificações para cinco escalas funcionais (física, de desempenho, cognitiva, social e emocional), três escalas de sintomas (náusea, dor e fadiga) e uma escala global de saúde e de qualidade de vida. A medição também dá origem a classificações de item único de sintomas adicionais correntemente relatados por doentes de cancro (dispneia, perda de apetite, perturbações do sono, prisão de ventre e diarreia) assim como o impacto financeiro devido à doença e ao seu tratamento.

Os exemplos seguintes são dados para fins de ilustração e não são uma via de limitação do domínio do invento.

EXEMPLOS

Os exemplos abaixo empregam os métodos seguintes para determinação da citoxicidade e para avaliação dos efeitos não antagonísticos.

Ensaio de Citotoxicidade

Nos exemplos seguintes foi utilizado o protocolo de ensaio de citotoxicidade MTT colorimétrico com base em tetrazólio corrente (Mosmann, et ai., J. Immunol. Methods (1983) 65 (1- 2): 55-63) para determinar a leitura da fracção de células afectadas. Resumidamente, as células viáveis reduzem o sal tetrazólio, brometo de 3-(4,5-dietiltiazoil-2-il)-2,5-dif eniltetrazólio (MTT) num azul de formazano que pode ser lido espectrofotometricamente. Células, tais como as células de carcinoma de pulmão humano de célula não pequena H460 (NSCLC) que se desenvolvem em placas de 25 cm2 são passadas 56

ΕΡ 1 432 402 /PT (número de passagem <20), ressuspensas em meio de cultura de células RPMI e adicionadas a placas de cultura com 96 poços com uma concentração de 1000 células por poço em 100 μΐ por poço. As células são então deixadas a incubar durante 24 horas a 37°C, 5% de CO2. No dia seguinte são preparadas diluições de fármacos em série em placas de cultura de células de 12 poços. Os agentes previamente preparados em várias soluções, são diluídos num meio de cultura de células RPMI. Os agentes são administrados nos poços apropriados ou especificados para agentes únicos (20 μΐ) e com proporções fixas específicas de combinações de agentes duplas (incrementos de 20 μΐ) utilizando um desenho de quadrado latino ou um método de diluição "tabuleiro de xadrez". O volume total dos poços é preenchido até 200 μΐ com meio fresco. A exposição ao fármaco tem uma duração de 72 horas. A seguir à exposição ao fármaco, o reagente MTT (1 mg/ml em RPMI) é adicionado a cada poço com um volume de 50 μΐ por poço e incuba-se durante 3-4 horas. Os conteúdos dos poços são então aspirados e adiciona-se 150 μΐ de sulfóxido de dimetilo (DMSO) a cada poço para desintegrar as células e para solubilizar o precipitado de formazano dentro das células. As placas de 96 poços são agitadas num agitador de placas, e lidas num espectrómetro de microplacas ajustado para um comprimento de onda de 570 nm. As leituras de densidade óptica (DO) são registadas e os valores de DO dos poços de branco (apenas contendo meio) são subtraídos de todos os poços contendo células. A sobrevivência das células a seguir à exposição aos agentes é baseada como a percentagem dos poços de controlo (células não expostas ao fármaco). Todos os poços são feitos em triplicado e os valores médios são calculados.

Análise do Efeito Mediano para Combinações de Fármacos

Para a análise de combinação de fármacos foi utilizado o programa informático CalcuSyn (Biosoft, Ferguson, MO, EUA) com base no princípio do efeito mediano de Chou e Talalay. As proporções fixadas para as combinações de agente duplo são inicialmente derivadas das proporções IC5o:IC5o a partir dos perfis de citoxicidade do agente único. Subsequentemente, as proporções fixadas mais relevantes (e.g. variando de 10:1 a 1:10, proporções molares) são escolhidas com base nas 57 ΕΡ 1 432 402 /PT considerações para fins de formulação. Dos valores médios calculados com base nos efeitos do agente na sobrevivência das células, as doses e os respectivos valores do efeito fraccional são introduzidos no programa informático CalcuSyn. O programa determina então se as combinações de fármacos são sinérgicas, aditivas ou antagonisticas com base nos valores do índice de combinação (IC).

Exemplo 1

Representação Múltipla da Análise do Efeito da Dose A análise quantitativa da relação entre uma quantidade (dose ou concentração) de fármaco e do seu efeito biológico assim como o efeito conjunto de combinações de fármacos podem ser avaliados e registados de várias maneiras. A Figura 2 ilustra 5 de tais métodos utilizando, como exemplo, uma combinação de irinotecano e carboplatina.

Com base na teoria da análise do efeito de dose de Chou e Talalay, foi utilizada uma "equação do efeito mediano" para calcular um certo número de equações bioquímicas que são extensivamente utilizadas na arte. As derivações desta equação têm dado origem a equações de ordem superior, tais como as utilizadas para calcular o índice de Combinação (IC). Tal como previamente mencionado, o IC pode ser utilizado para determinar se as combinações de mais de um fármaco e de várias proporções de cada combinação são antagonísticas, aditivas ou sinérgicas. Os registos de IC são tipicamente ilustrados com o IC a representar o eixo dos y versus a proporção de células afectadas, ou a fracção afectada (farmaceuticamente aceitável), no eixo dos x. A Figura 2A demonstra que uma proporção molar de 1:10 de irinotecano/carboplatina é antagonistica (IC > 1,1), enquanto que com 1:1 e 10:1 possui efeito sinérgico (IC < 0,9).

Os presentes inventores projectaram um método alternativo para representar a dependência do IC nas proporções de fármaco utilizado. O valor de IC máximo é registado em relação a cada proporção para ilustrar melhor as tendências com os efeitos específicos da proporção para uma combinação particular, tal como visto na Figura 2B. 0 IC máximo é o valor de IC tomado para um único valor de fa (entre 0,2 e 0,8) onde se observou a 58

ΕΡ 1 432 402 /PT maior diferença nos valores de IC para os fármacos para diferentes proporções.

Dado que as concentrações dos fármacos utilizados para desempenharem um papel individual na determinação do efeito (i.e., sinergismo ou antagonismo), pode ser também importante medir o IC para várias concentrações. Estas concentrações, também referidas como "Doses Eficazes" (ED) por Chou-Talalay, são a as concentrações de fármaco requeridas para afectar uma designada percentagem de células num ensaio in vitro, i.e., ED5o é a concentração de fármaco requerida para afectar 50% das células em relação a um controlo ou uma população de células não tratadas. Tal como mostrado na Figura 2C, as tendências no efeito da concentração são rapidamente distinguidas para várias proporções. As barras de erro apresentadas representam um desvio padrão em relação a uma média e são determinadas directamente pelo programa CalcuSyn.

Uma interacção sinérgica entre dois ou mais fármacos possui o benefício de poder baixar a quantidade de cada fármaco requerido de modo a resultar num efeito positivo, conhecido como "redução de dose". O "índice de redução de dose" (DRI) de Chou e Talalay é uma medida de quanto é que a dose de cada fármaco em combinação sinérgica pode ser reduzida para um dado nível de efeito em comparação com as doses de cada fármaco só. O DRI tem sido importante em situações clínicas, em que a redução de dose conduz a toxicidade reduzida para o hospedeiro ao mesmo tempo que matem a eficácia terapêutica. O registo na Figura 2D mostra que as concentrações de irinotecano e de carboplatina requeridas para se conseguir 90% da morte das células por si só é significativamente superior às suas concentrações individuais requeridas quando estes estão combinados com proporções não antagonísticas.

Para além disso os dados atrás mencionados podem ser representados num isobolograma clássico (Figura 2E) . Os isobologramas possuem o benefício de poderem ser gerados com diferentes valores de ED; contudo estes tornam-se mais difíceis de ler à medida que mais níveis de efeitos são seleccionados para interpretação. Por esta proporção, os dados 59 ΕΡ 1 432 402 /PT nos exemplos abaixo são geralmente apresentados de acordo com os tipos de registos mostrados nas Figuras 2A e 2B.

Exemplo 2 IC é Dependente das Concentrações

As combinações de fármacos de irinotecano e 5-fluorouracilo (5-FU) com proporções molares de 1:1 e 1:10 e etoposido e carboplatina com proporções molares de 10:1 e 1:10 foram testadas em relação a efeitos aditivos, sinérgicos ou antagonísticos, utilizando o ensaio corrente de citotoxicidade MTT colorimétrico com base em tetrazólio e a análise do efeito mediano, tal como descrito nas secções do exemplo prévio. Células HT29 MCF-7 foram expostas a agentes únicos assim como a agentes em combinação com proporções definidas. Foram utilizadas oito concentrações de fármaco para agentes únicos e combinações. Os valores de densidade óptica foram obtidos a partir do ensaio de MTT, convertidos numa percentagem do controlo, foram feitas as médias e então convertidos em valores de fracção afectada. Os valores de dose e de fracção afectada foram introduzidos no CalcuSyn que deu origem ao gráfico de IC versus fa, mostrado na Figura 3. A Figura 3A mostra que o irinotecano e o 5-FU com uma proporção molar de 1:1 eram não antagonísticos ao longo de toda a gama de concentrações, tal como medido pela dose afectada pela fracção. Em contraste, com uma proporção molar de 1:10, os mesmos dois fármacos eram não antagonísticos para baixas concentrações mas antagonísticos para mais altas concentrações. Tal como visto na Figura 3B, o etoposido e a carboplatina foram antagonísticos para uma proporção molar de 10:1 ao longo de toda a gama de concentrações. Em contraste, para uma proporção molar de 1:10, o etoposido e a carboplatina foram antagonísticos para baixas concentrações mas não antagonísticos para mais altas concentrações.

Foi também mostrado que a cisplatina e a edelfosina com proporções molares de 10:1 e 1:1 apresentava efeitos de combinação distintos em células H460, tal como sumariado ao registar IC versus fa. Tal como mostrado na Figura 4, a combinação com uma proporção molar 10:1 era não antagonística para aproximadamente 50% da gama de fracção afectada para 60

ΕΡ 1 432 402 /PT baixas concentrações e antagonística para concentrações mais altas, enquanto que uma proporção molar de 1:1 demonstrou sinergia ao longo de toda a gama de concentrações.

Estes resultados demonstram, deste modo, que a sinergia é altamente dependente de não apenas a proporção de agentes um em relação ao outro mas também das suas concentrações.

Exemplo 3

Determinação do IC para Várias Combinações de Dois Fármacos

As várias combinações de fármacos apresentadas na tabela abaixo foram testadas relativamente aos efeitos aditivos, sinérgicos ou antagonísticos utilizando o protocolo de ensaio de citotoxicidade MTT e o procedimento de análise do efeito mediano descrito acima. Os resultados do gráfico de IC versus fa são tabelados abaixo. A percentagem aproximada da gama de fa que exibiu um efeito não antagonístico é registado entre parêntesis a seguir à proporção. As medições foram efectuadas entre os valores de fa de 0,2 e 0, 8 e a percentagem dessa gama de fa que apresenta efeito sinérgico ou aditivo (não antagonístico) foi calculada determinando a percentagem da curva por baixo do valor de IC de 1,1. Os dados são derivados de, pelo menos, uma experiência realizada em triplicado. COMBINAÇÃO DE FÁRMACOS LINHA DE PROPORÇÃO MOLAR [%sinérgica ou CÉLULAS aditiva3] Irinotecano:5-FU H460 1:10 [ 83%], 1:1 [ 17 %], 10:1 [100% ] Irinotecano:5-FU MCF-7 1:10 [48% aditivo13], 1:1 [58%], 10:1 [ 9 0 % ] Irinotecano:5-FU HT29 1:10 [75%], 1:1 [100%] FUDR:irinotecano HCT-116 1:10 [0%] , 1:5 [ 92%], 1:1 [100% ], 5:1 [100%], 10:1 [100%] FUDR:irinotecano HT2 9 1:10 [ 40%], 1:5 [ 73 %], 1:1 [100% ], 5:1 [100%], 10:1 [ 95%] 5-FU:carboplatina H46 0 1:10 [ 48%], 1:1 [100%], 10:1 [100% ] FUDR:carboplatina H46 0 1:10 [ 3 7 % ] , 1:5 [100%], 1:1 [100% ], 5:1 [100% aditivo13], 10:1 [100% aditivo13] Irinotecano:carboplatina H46 0 1:10 [ 0%], 1 : 1 [ 13 %], 10:1 [100% aditivo13] 61

ΕΡ 1 432 402 /PT

Irinotecano:carboplatina A549 1:10 [0%], 1:1 [100%], 10:1 Cisplatina:irinotecano H460 [100% 1:10 ] [100%], 1:1 [ 5 6 %], 10:1 Cisplatina:irinotecano MCF-7 [100% 1:10 aditivob] [100%], 1:1 [ 92%], 10:1 Etoposido:carboplatina H460 [ 5 0 % ] 1:10 [ 55%], 1:1 [76% Etoposido:carboplatina MCF-7 aditivob] , 10:1 [0%] 1:10 [65%], 1:1 [30%], 10:1 Carboplatina:taxol H46 0 [0%] 1:10 [0%] 1:10 [0%] 1:5 [ [100%], 1:1 [100%], 10:1 Carboplatina:taxol MCF-7 [100%], 1:1 [ 43%], 10:1 Taxol:doxorubicina H46 0 52%] , 1:1 [37% aditivob] , Taxol:doxorubicina MCF-7 1:10 1:5 [ [22% ] 70%], 1:1 [100%], 1:10 Camptotecina:taxol H460 [ 6 3 % ] 1:1 [ 0%], 1:10 [100%] Doxorubicina:vinorelbina H460 20:1 [0%], 1:1 [100%] Cisplatina:etoposido H460 50:1 [0%], 1:1 [100%] Cisplatina:etoposido MCF-7 25:1 [0%], 1:1 [100%] Sumarina:vinorelbina H460 10:1 [0%], 20000:1 [72%] Cisplatina:edelfosina H46 0 10:1 [ 72%], 1:1 [100%] Cisplatina:safingol H46 0 1:1 [ 0%], 0,1:1 [100%] Cisplatina:safingol MCF7 1:1 [ 58%], 0,1:1 [100%] Cisplatina:β-sitosterol H46 0 10 :1 [0%], 0,1:1 [100%] Cisplatina:β-sitosterol MCF-7 10 :1 [ 3 4%], 0,1:1 [100%] Cisplatina:sumarina H46 0 1:100 [ 3 7%], 1:40 [0%] Vinorelbina:cisplatina H46 0 1:500 [0%], 1:200 [8% aditivo Vinorelbina:edelfosina H46 0 1:10 [0%], 1:1 [0%] Doxorubicina:arabinósido H46 0 1:0,45 [0 %] de citosina Doxorubicina:tetotrexato H46 0 1:0,36 [0 %] â "% sinérgica ou aditiva" é calculada como a percentagem da gama de fa que não cai na gama antagonistica (valores de IC > 1,1 são antagonísticos) num registo de IC.vs.fracção afectada (fa), com base no Método de Chou-Talalay entre os valores de fa de 0,2 a 0,8. O IC foi medido introduzindo os valores de dose e de fa no CalcuSyn b O ajuste dos dados para esta proporção estava na gama "aditiva" (IC entre 0,9 e 1,1). 62

ΕΡ 1 432 402 /PT

Exemplo 4

Sinergismo da Carboplatina e Daunorubicina O procedimento apresentado atrás para medir efeitos aditivos, sinérgicos ou antagonísticos foi repetido utilizando carboplatina/daunorubicina com proporções molares de 10:1, 1:1 e 1:10 em células H460 e com proporções de 10:1 e 1:1 em células MCF-7. Um índice de combinação foi determinado para cada dose produzindo curvas de IC versus fa, tal como descrito atrás e determinando então os valores de IC e de fa de 0,50, 0,75 e 0,90 (para originar valores de IC respectivamente para ED50, ED75 e ED90). Os desvios padrão foram calculados pelo programa CalcuSyn. Tal como mostrado na inserção da Figura 5A, a carboplatina e a daunorubicina para uma proporção molar de 10:1 apresentam interacção sinérgica para os valores de ED50, ED75 e ED90 em células MCF-7. Tal como ainda mostrado na inserção da Figura 5A, a carboplatina e a daunorubicina para uma proporção molar de 1:1 apresentam interacção sinérgica, tal como considerado pelos valores médios de IC para ED75 e ED90 enquanto era aditiva para ED50. Nas células H460, um registo do IC máximo versus a proporção molar de carboplatina/daunorubicina revela que para uma proporção molar de 10:1 os fármacos são sinérgicos enquanto que para uma proporção molar de 1:1, é observado um efeito ligeiramente antagonístico. Em contraste, um efeito fortemente antagonístico é exibido com uma proporção de 1:10 (Figura 5A) . Os dados foram também registados na Figura 5B como IC versus a fracção de células H460 afectadas para melhor ilustrar o efeito da concentração na sinergia. Uma proporção molar de 1:1 de carboplatina/daunorubicina é não antagonística para valores de fracção afectada até 0,42. Para uma proporção de 10:1, é observada sinergia ao longo de uma gama substancial de valores de fa (superiores a 0,2) e para uma proporção de 1:10 é antagonística para todos os valores de fa. A inserção da Figura 5B mostra que para uma proporção de 10:1 em células H460, observa-se sinergia (verificado pelos valores médios de IC) para ED50, 75 e 90 e para uma proporção de 1:1, é indicada aditividade para ED50. Para uma proporção de 1:10, a carboplatina/daunorubicina é fortemente antagonística para valores de ED50, 75 e 90. Com base nestes resultados, a carboplatina e a daunorubicina com uma proporção molar de 1:10 não serão em consequência seleccionados para mais formulação e 63 ΕΡ 1 432 402 /PT estudos in vivo, dado que é observado antagonismo para todos os valores de ED medidos e ao longo de toda a gama de fa nos registos de IC versus fa. Proporções molares de 10:1 e 1:1 de carboplatina:daunorubicina são seleccionadas para formulação e estudos de eficácia dado que para cada uma dessas proporções os fármacos demonstraram efeitos sinérgicos ao longo de, pelo menos, 5% da gama de fa (em que mais de 1% das células são afectadas).

Exemplo 5

Manutenção do Sinergismo da Carboplatina e da Daunorubicina

In Vivo A carboplatina e a daunorubicina foram co-carregadas para um lipossoma único sem colesterol para proporções molares de 10:1, 5:1 e 1:1 (carboplatina/daunorubicina). DSPC foi dissolvido em clorofórmio e DSPG foi dissolvido em clorofórmio/metanol/água (50:10:1 vol/vol) com traços de 14C-CHE. As soluções foram combinadas com uma proporção molar de 80:20 (DSPC/DSPG). O solvente foi removido sob uma corrente de N2 gasoso ao mesmo tempo que se mantém a temperatura a mais de 60°C. O filme de lipido foi então colocado numa bomba de vácuo durante 2 minutos e subsequentemente redissolvido apenas em clorofórmio. O clorofórmio foi então removido, tal como atrás. Os filmes de lipido resultantes foram deixados sob vácuo durante a noite para remover qualquer solvente residual seguido por re-hidratação em CUSO4 150 mM, pH 7,4 (pH ajustado com trietanolamina) contendo 80 mg/ml de carboplatina com 4% (v/v) de DMSO para aumentar a solubilidade da carboplatina. As vesículas multilamelares resultantes (MLV) foram extrudidas, a 70°C, através de dois filtros empilhados com uma dimensão de poro de 80 e 100 nm, durante um total de dez passagens. As amostras foram mudadas para uma solução salina e então para sacarose 300 mM, HEPES 20 mM, EDTA 30 mM, pH 7,4 (SHE) utilizando diálise de fluxo tangencial. A daunorubicina (com traços de 3H-daunorubicina) foi carregada para lipossomas incubando a 60°C, durante 5 minutos, para proporções de fármaco em relação ao lipido para se conseguirem proporções molares de carboplatina/daunorubicina de 10:1, 5:1 e 1:1. Subsequentemente, cada amostra permutada de tampão para uma solução salina por fluxo tangencial. Para determinar a quantidade de carga de fármaco para vários tempos, durante a 64

ΕΡ 1 432 402 /PT preparação da formulação co-carregada, os níveis de daunorubicina e de lípido foram medidos por contagem por cintilação líquida. As concentrações de carboplatina foram medidas por espectrometria de absorção atómica. Ratinhos Balb/c foram intravenosamente administrados com 8 mg/kg de carboplatina e a daunorubicina foi doseada a 1,2 mg/kg, 6 mg/kg e 12 mg/kg para proporções molares de 10:1, 5:1 e 1:1 de carboplatina/daunorubicina, respectivamente na formulação co-carregada. Nos pontos de tempo indicados (3 ratinhos por ponto de tempo), o sangue foi recolhido por punção cardíaca e colocado em tubos Microtainer revestidos com EDTA. As amostras foram centrifugadas e o plasma foi cuidadosamente transferida para outro tubo. A contagem por cintilação líquida foi utilizada para quantificar a daunorubicina no plasma e os níveis de lípido; os níveis de carboplatina no plasma foram determinados por espectrometria de absorção atómica. Para quantificação por espectrometria de absorção atómica, as amostras foram diluídas em ácido nítrico 0,1% para estar dentro da gama linear de uma curva padrão.

Os resultados na Figura 6, em que a concentração média de fármaco no plasma (+/- desvio padrão, DP) é registada para tempos especificados, indicam que as formulações lipossómicas co-carregadas contendo carboplatina e daunorubicina com uma proporção molar de 10:1 mantinha a proporção dos fármacos após administração intravenosa dado que as concentrações molares no plasma da carboplatina estavam presentes a dez vezes mais do que as da daunorubicina. Os resultados nas Figuras 7A e 7B demonstram que as proporções molares de 10:1, 5:1 e 1:1 de carboplatina em relação à daunorubicina formuladas em lipossomas de DSPC/DSPG foram mantidas no compartimento do sangue ao longo de 24 horas (3 ratinhos por ponto de tempo) após administração intravenosa de formulações preparadas com estas proporções (a Figura 7B evidencia mais claramente os resultados obtidos a seguir à administração da formulação de 1:1 de carboplatina/daunorubicina). Estes resultados demonstram assim que pode ser alcançada a cinética de libertação coordenada de dois fármacos para uma variedade de proporções molares. A carboplatina e a daunorubicina foram também co-formuladas em lipossomas DSPC/SM/DSPE-PEG2000 (90:5:5%mol) de 65 ΕΡ 1 432 402 /PT modo a determinar se a libertação coordenada dos fármacos in vivo pode ser alcançada utilizando também esta formulação. Foi seleccionada uma proporção molar de 10:1 como sendo sinérgica no Exemplo 4.

Os filmes de lipido (com traços de 14C-CHE) foram preparados, tal como descrito atrás, solubilizando os lípidos em clorofórmio, removendo o clorofórmio sob N2 gasoso e colocando as amostras numa bomba de vácuo durante a noite. Os filmes de lipido resultantes foram hidratados em CuS04 150 mM, histidina 20 mM, pH 7,4 (pH ajustado com trietanolamina) contendo carboplatina 40 mg/ml. Os MLV foram extrudidos, a 70°C, através de dois filtros empilhados com dimensão de poro de 100 nm, durante um total de dez passagens. As amostras foram então permutadas em sacarose 300 mM, HEPES 20 mM, pH 7,4 através de diálise de fluxo tangencial para remover a solução metálica não encapsulada (ou carboplatina). O carregamento da daunorubicina (com traços de 3H-daunorubicina) foi realizado, a 60°C, durante 5 minutos, com uma concentração de fármaco para se conseguir uma proporção molar de 10:1 de carboplatina/daunorubicina. Para determinar a guantidade de carga do fármaco, a daunorubicina e os níveis de lipido foram medidos por contagem de cintilação líquida; os níveis de carboplatina foram determinados por espectrometria de absorção atómica. Ratinhos SCID/rag2 machos foram administrados com 2,25 mg/kg de daunorubicina e 15 mg/kg de carboplatina intravenosamente com a combinação co-carregada em lipossomas de DSPC/SM/DSPE-PEG2000 . Nos pontos de tempo indicados (3 ratinhos por ponto de tempo), o sangue foi recolhido por punção cardíaca e colocado em tubos Microtainer revestidos com EDTA. As amostras foram centrifugadas e o plasma foi cuidadosamente transferido para outro tubo. Os níveis de carboplatina e de daunorubicina no plasma foram determinados por espectrometria de absorção atómica e contagem de cintilação líquida, respectivamente.

Os resultados apresentados na Figura 8, em que a concentração média de fármaco no plasma (+/- desvio padrão DP) é registada nos tempos indicados, revelam que a carboplatina e a daunorubicina foram eliminadas do compartimento do plasma com a mesma velocidade a seguir à administração intravenosa quando formulados em lipossomas DSPC/SM/DSPE-PEG2000. A 66 ΕΡ 1 432 402 /PT carboplatina e a daunorubicina foram, deste modo, mantidas com uma proporção molar de 10:1 dado que a concentração de carboplatina no plasma (nmol/ml) estava presente em mais ou menos dez vezes a da daunorubicina (nmol/ml) durante o decurso do tempo. Estes resultados ilustram que pode ser utilizada uma variedade de formulações para coordenar a farmacocinética dos dois fármacos encapsulados num único lipossoma de modo a que se consigam farmacocinéticas semelhantes dos perfis de libertação.

Exemplo 6

Eficácia da Carboplatina e Daunorubicina Lipossómica

Lipossomas de DSPC/DSPG (80:20%mol) co-encapsulados com daunorubicina e carboplatina com uma proporção molar de 1:1 (que foi seleccionada para formulação no Exemplo 4) foram preparados tal como descrito no Exemplo 5 excepto que os filmes de lípido foram hidratados em CuSCh 150 mM, pH 7,4 (pH ajustado com trietanolamina), solução contendo 25 mg/ml de carboplatina. Os filmes de lipido foram também redissolvidos após terem sido secos em clorofórmio para remover metanol ou água e então o solvente foi removido, tal como previamente descrito.

Tal como no método do Exemplo 26, foram realizados estudos de eficácia, inoculando primeiro células H460 (1 x 106 células) subcutaneamente no flanco de ratinhos SCID/rag2 fêmeas. Os tumores foram deixados a desenvolver até cerca de 50 mg (0,05 cm3) de tamanho, tempo em que (dia 12) as formulações foram injectadas na veia da cauda. Os animais (4 ratinhos por grupo) foram tratados com três injecções, com as injecções a serem injectadas a cada 4 dias (programa de 4 dias, nos dias 12, 16 e 20) . O crescimento do tumor foi determinado por medições directas com uma craveira. Os ratinhos foram tratados com uma solução salina, cocktail sem fármacos com uma proporção molar de 1:1 ou uma formulação lipossómica de carboplatina/daunorubicina com uma proporção molar de 1:1. Para ambos os tratamentos, sem fármaco e formulado em lipossoma, as doses foram de 6,6 mg/kg de carboplatina e de 10 mg/kg de daunorubicina. As doses de lípido foram de 260 mg/kg de lípido para amostras formuladas em lipossomas. 67

ΕΡ 1 432 402 /PT

Os resultados expressos na Figura 9 (representando os pontos a dimensão média do tumor +/- erro padrão da média (SEM) determinado no dia especificado) mostra que a administração de carboplatina e de daunorubicina lipossómica com uma proporção molar de 1:1 aumentava a eficácia em relação a controlos de cocktail sem fármacos e soluções salinas. A eficácia foi também examinada em lipossomas contendo esfingomielina co-carregada com carboplatina e daunorubicina com uma proporção molar de 10:1 (determinada como sendo sinérgica no Exemplo 4) para examinar se as grandes melhorias de eficácia observadas para os lipossomas DSPC/DSPG podem ser conseguidas utilizando também esta formulação. A carboplatina e daunorubicina foram co-formuladas em lipossomas de DSPC/SM/DSPE-PEG2000 (90:5:5%mol) de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 5 excepto que os lipossomas foram extrudidos dez vezes através de um filtro com a dimensão de poros de 80 nm e 100 nm. As amostras foram também permutadas de tampão para um tampão SHE antes de serem carregadas com daunorubicina através de um volume fixo de diálise em vez de diálise de fluxo tangencial. Tal como detalhado no Exemplo 26, a ratinhos SCID/rag2 fêmeas tendo o tumor H460 (4 ratinhos por grupo) foram administrados 15 mg/kg de carboplatina e 2,25 mg/kg de daunorubicina para fármaco formulado em lipossoma e um cocktail sem fármaco nos dias 14, 18 e 22. O fármaco lipossómico foi administrado com uma dose de lípido de 375 mg/kg.

Os resultados apresentados na Figura 10 (os pontos representam a dimensão média do tumor +/- SEM determinada no dia especificado) mostram que a carboplatina e a daunorubicina lipossómicas encapsuladas com uma proporção molar não antagonistica de 10:1 em lipossomas contendo esfingomielina exibem uma eficácia substancialmente aumentada em relação aos controlos consistindo de soluções em fármaco e salinas.

Exemplo 7

Sinergismo de Cisplatina e Daunorubicina

As combinações de cisplatina/daunorubicina foram testadas relativamente aos efeitos aditivos, sinérgicos ou antagonisticos utilizando os métodos descritos acima. Os 68

ΕΡ 1 432 402 /PT resultados são sumariados na Figura 11. Tal como mostrado na Figura 11A, observou-se sinergia para uma proporção molar de cisplatina/daunorubicina de 10:1 ao longo de toda a gama de fa enquanto que as proporções molares de 1:1 apresentavam antagonismo ao longo da gama de fa completa. A Figura 11B, um registo de IC máximo (IC max) vs. proporção de cisplatina-daunorubicina, ilustra ainda a dependência da proporção da combinação de dois agentes no indice de combinação. Estes resultados mostram que para uma proporção molar de 10:1, o valor de IC Max é sinérgico enquanto que para proporções molares de 1:1 e 1:10 o valor de IC Max é antagonistico.

Exemplo 8

Manutenção de Sinergismo de Cisplatina e Daunorubicina In Vivo A cisplatina e a daunorubicina foram co-carregadas para lipossomas DMPC/Chol (55:45%mol) com uma proporção molar de 10:1 identificada no Exemplo 7 como sendo não antagonistica. A cisplatina foi passivamente encerrada em lipossomas solubilizando primeiro o fármaco (com 40 mg/ml) numa solução consistindo de CuCl2 150 mM, histidina 20 mM (pH 7,4, pH ajustado com trietanolamina) mais DMSO a 4% (v/v) e aquecimento da solução resultante, a 80°C, para aumentar a solubilidade da cisplatina. A solução de cisplatina foi então adicionada a 8 0°C a um filme de lípido composto por DMPC e colesterol com traços de 14C-CHE. Os filmes de lípido hidratado foram extrudidos, a 80°C, através de dois filtros de 100 nm e os lipossomas foram arrefecidos até à temperatura ambiente. Após arrefecimento, as amostras foram centrifugadas numa centrífuga de bancada a 2000 x g, durante 5 minutos, para formar um pelete com qualquer cisplatina não encapsulada, e recolheu-se o sobrenadante. A remoção dos iões metálicos em excesso foi realizada por passagem através de uma coluna de filtração em gel Sephadex G-50 e recolha da fracção de lipossoma.

Os lipossomas carregados com cisplatina foram ainda carregados com daunorubicina (marcada com traços de 3H-daunorubicina) para uma proporção molar de cisplatina/daunorubicina de 10:1 por incubação dos lipossomas com o fármaco, a 60°C, durante 15 minutos. De modo a 69

ΕΡ 1 432 402 /PT determinar a extensão da carga de fármaco, os níveis de cisplatina foram medidos por espectrometria de absorção atómica e a 3H-daunorubicina e níveis de lípido foram medidos por contagem de cintilação líguida.

De modo a determinar se foi conseguida uma libertação coordenada através desta formulação, os lipossomas carregados foram injectados na veia da cauda de ratinhos SCID/rag2 machos com cisplatina a 5,0 mg/kg e daunorubicina a 1,0 mg/kg por ratinho. Nos pontos de tempo indicados (3 ratinhos por ponto de tempo), o sangue foi recolhido por punção cardíaca e colocada em tubos Microtainer revestidos com EDTA. As amostras foram centrifugadas e o plasma foi cuidadosamente transferido para outro tubo. Os níveis de lípido lipossómico e de daunorubicina no plasma foram ambos determinados por contagem de cintilação líguida e os níveis de cisplatina foram medidos por espectrometria de absorção atómica.

Os resultados apresentados na Figura 12 (os pontos representam a concentração média de fármaco no plasma +/- DP determinada no tempo especificado) indicam gue a libertação coordenada da daunorubicina e da cisplatina foi conseguida dado que as concentrações no plasma (pmol/ml) foram mantidas com uma proporção molar de 10:1 nos pontos de tempo medidos.

Embora os lipossomas possam ser co-carregados com cisplatina e daunorubicina através do método descrito atrás, podem ser empregues outras técnicas para carregar os fármacos para um único lipossoma. Um método alternativo emprega a utilização de um gradiente de pH para carregar a daunorubicina após encerrar passivamente a cisplatina com citrato, pH 4,0, e impondo um gradiente de pH através da membrana por permuta de tampão. Esta técnica pode ser realizada como se segue:

Filmes de lípido consistindo de DSPC/Chol (55:45%mol) são preparados, tal como descrito atrás, com traços de 3H-CHE. Uma solução de cisplatina é preparada por dissolução de pó de cisplatina em NaCl 150 mM e citrato de 150 mM (pH 4) . Para maximizar a solubilidade da cisplatina no tampão, a solução é aquecida a 65°C e adicionada aos filmes de lípido. Os MLV resultantes são extrudidos, a 65°C, através de filtros com uma dimensão de poro de 100 nm, num total de 10 passagens. A 70

ΕΡ 1 432 402 /PT cisplatina não encapsulada é então removida da formulação por centrifugação da solução a 2000 x g durante 10 minutos. O sobrenadante resultante contendo cisplatina lipossómica é passada numa coluna de Sephadex G-50 que é pré-equilibrada em NaCl 150 mM e HEPES 20 mM (pH 7,4) para remover qualquer cisplatina não retida residual e para estabelecer um gradiente de pH através da bicamada. A daunorubicina é subsequentemente carregada para os lipossomas incubando primeiro os lipossomas, a 60°C, durante 5 minutos, para se conseguir um equilíbrio térmico e então adicionando daunorubicina à formulação de lípido com uma proporção molar de 0,1:1 de fármaco/lípido enquanto se agita. Para determinar a extensão de uma carga de fármaco em vários tempos, a concentração de daunorubicina é determinada solubilizando os lipossomas com OGP e medindo a absorvância da daunorubicina a 480 nm. A concentração de cisplatina na formulação é medida utilizando espectrometria de absorção atómica. As concentrações de lípido são medidas por contagem de cintilação líquida.

Um meio alternativo para a coordenação das cinéticas de libertação de dois fármacos pode ser conseguido formulando cada fármaco em transportadores separados. Isto foi demonstrado formulando cisplatina em lipossomas de DMPC/colesterol e daunorubicina em lipossomas de DSPC/DSPE-PEG2000 e administrando-os intravenosamente a ratinhos com uma proporção molar de 10:1. A cisplatina lipossómica foi preparada dissolvendo primeiro cisplatina (8,5 mg/ml) em NaCl 150 mM, a 80°C. A solução foi em seguida adicionada a um filme de lípido de DMPC/colesterol (55:45%mol) contendo traços de 3H-CHE e deixou-se a hidratar. Os MLV resultantes foram extrudidos, a 80°C, através de filtros com uma dimensão de poros de 100 nm e os lipossomas foram subsequentemente permutados para HEPES 20 mM, NaCl 150 mM (pH 7,4) (HBS) através de diálise de fluxo tangencial para remover iões metálicos em excesso. Os lipossomas foram centrifugados para transformar em pelete qualquer cisplatina não encapsulada após extrusão. A concentração de cisplatina foi determinada por espectrometria 71

ΕΡ 1 432 402 /PT de absorção atómica e os níveis de lípido foram determinados por contagem de cintilação líquida. A daunorubicina lipossómica foi preparada por hidratação de um filme de lípido composto por DSPC/DSPE-PEG2000 (95:5%mol) e traços de 14C-CHE com uma solução de CUSO4 300 mM. Os MLV resultantes foram extrudidos por dez passagens através de dois filtros empilhados com uma dimensão de poros de 100 nm, a 70°C. Após extrusão os lipossomas foram permutados para HBS (pH 7,4) através de diálise de fluxo tangencial. O carregamento de daunorubicina (com traços de 3H-daunorubicina) foi iniciado por adição de daunorubicina com uma proporção em peso de fármaco/lípido final de 0,1 e mantendo a solução a 60°C, durante 10 minutos. A extensão da carga de fármaco foi medida por contagem de cintilação líquida para medir os níveis de 3H-daunorubicina e 14C-CHE.

Ratinhos SCID/rag2 machos foram injectados intravenosamente com cisplatina lipossómica com uma dose de fármaco de 2 mg/kg e daunorubicina lipossómica com uma dose de fármaco de 0,375 mg/kg. Nos pontos de tempo indicados (3 ratinhos por ponto de tempo), o sangue foi recolhido por punção cardíaca e colocado em tubos Microtainer revestidos com EDTA. As amostras foram centrifugadas e o plasma foi cuidadosamente transferido para outro tubo. Os niveis de cisplatina no plasma foram determinados por espectrometria de absorção atómica e os níveis de daunorubicina foram determinados por contagem de cintilação líquida.

Os resultados na Figura 13 (os pontos representam as concentrações médias de fármaco determinadas no plasma +/- DP nos pontos de tempo especificados) revelam que a cisplatina e a daunorubicina formuladas em lipossomas separados eram mantidos com uma proporção molar de 10:1 para vários pontos de tempo após administração intravenosa.

Exemplo 9

Eficácia da Cisplatina e Daunorubicina Lipossómica A eficácia da cisplatina e da daunorubicina formuladas em lipossomas separados foi determinada em ratinhos SCID/rag2 (modelo de xenoenxerto H460) tal como detalhado no Exemplo 26. 72

ΕΡ 1 432 402 /PT

Os ratinhos com tumores H460 (4 ratinhos por grupo) foram tratados com solução salina ou com cisplatina/daunorubicina com uma proporção molar de 10:1 que foi identificada in vitro no Exemplo 7 como sendo não antagonistica. A cisplatina e a daunorubicina foram formuladas respectivamente em lipossomas DMPC/Chol (55:4 5%mol) e DSPC/DSPE-PEG20 0 0 (95:5%mol), tal como referido no Exemplo 8, excepto que os lipossomas DMPC/Chol foram dialisados com HBS após extrusão. Os animais tratados com a combinação de fármaco receberam os agentes quer como um cocktail sem agentes (cocktail; 10:1, proporção molar) quer por co-administração de daunorubicina lipossómica e cisplatina lipossómica (formulação de lipossoma; proporção molar de 10:1) nos dias 14, 17 e 21. Para ambos os tratamentos, sem fármaco e formulado, as doses foram de 2,0 mg/kg de cisplatina e 0,375 mg/kg daunorubicina. As doses de lípido foram de 400 mg/kg para a cisplatina lipossómica e de 3,75 mg/kg para a daunorubicina lipossómica. A Figura 14 mostra os resultados, em que cada ponto de dados representa a dimensão média do tumor +/- SEM determinada no dia especificado. O controlo salino (círculos a cheio) não inibiu o crescimento do tumor; similarmente, o cocktail sem fármaco (triângulos invertidos a cheio) mostrou apenas um ligeiro efeito no crescimento do tumor. Em comparação, a formulação lipossómica (triângulos a branco) inibiu o crescimento do tumor ao longo de um período de, pelo menos, 32 dias.

Exemplo 10

Efeito da Administração Lipossómica de uma Combinação de Fármaco com uma Proporção Molar Antagonística A cisplatina e a daunorubicina foram co-carregadas para lipossomas de DMPC/Chol (55:45%mol) com uma proporção molar de 1:1 que foi determinada no Exemplo 7 como sendo antagonística. A cisplatina foi passivamente retida e a daunorubicina foi activamente retida para se conseguir uma proporção molar de cisplatina/daunorubicina de 1:1. Foi empregue o procedimento descrito no Exemplo 8 para carregar os fármacos num único lipossoma. 73

ΕΡ 1 432 402 /PT

De modo a determinar se foi conseguida a libertação coordenada pela formulação em lipossomas DMPC/Chol, os lipossomas carregados foram injectados na veia da cauda de ratinhos Balb/c com 2 mg/kg de cisplatina e 3,75 mg/kg de daunorubicina. Nos pontos de tempo indicados (3 ratinhos por ponto de tempo) o sangue foi recolhido por punção cardíaca e colocado em tubos Microtainer revestidos com EDTA. As amostras foram centrifugadas e o plasma foi cuidadosamente transferido para outro tubo. Os níveis de lípido e de daunorubicina no plasma foram ambos determinados por contagem de cintilação líquida e os níveis de cisplatina foram medidos por espectrometria de absorção atómica. Os resultados sumariados na Figura 15 (os pontos de dados representam as concentrações médias de fármaco determinadas no plasma +/- DP nos pontos de tempo especificados) mostram que a daunorubicina e a cisplatina foram eliminadas do plasma com a mesma velocidade e, deste modo, as concentrações no plasma (nmol/ml) foram mantidas com uma proporção molar de 1:1 (ver a inserção na Figura 15).

Foram realizados estudos de eficácia tal, como descrito no Exemplo 26, em que ratinhos SCID/rag2 fêmeas com um tumor H460 foram doseados com 2,5 mg/kg de cisplatina, 4,7 mg/kg de daunorubicina quer em cocktail quer em formulação lipossómica e 52,83 mg/kg de lípido nos dias 11, 15 e 19.

Os resultados de eficácia na Figura 16 (os pontos de dados representam a dimensão média do tumor +/- SEM determinada no dia especificado) mostram que o tratamento com a daunorubicina e a cisplatina com uma proporção antagonística é ineficaz na redução do crescimento do tumor quando comparado com resultados para uma proporção não antagonística (proporção molar de 10:1) dos agentes em que o crescimento do tumor era substancialmente inibido (ver Figura 14) . Estes resultados sublinham a importância de seleccionar as combinações de fármacos com proporções que apresentam efeitos não antagonísticos ao longo de uma gama de concentrações in vitro. Deve notar-se que as doses de fármaco utilizadas na Figura 16 (2,5 mg/kg de cisplatina e 4,7 mg/kg de daunorubicina) são, na verdade, mais altas do que as utilizadas na Figura 14 (2 mg/kg de cisplatina, 0,375 mg/kg de daunorubicina). 74

ΕΡ 1 432 402 /PT

Exemplo 11

Sinergismo da Cisplatina e Topotecano O procedimento referido atrás (ver Exemplo 1) para determinar efeitos sinérgicos, aditivos ou antagonisticos foi repetido utilizando cisplatina/topotecano, quer com uma proporção molar de 10:1 quer com uma proporção molar de 1:1. Tal como mostrado na Figura 17A, a cisplatina/topotecano com uma proporção molar de 10:1 possui uma interacção não antagonistica ao longo de uma larga gama de doses que afectam 5% a 99% das células (fa = 0,05 a fa = 0,99). Em contraste, cisplatina/topotecano com uma proporção molar de 1:1 era fortemente antagonistico ao longo da mesma gama de fa (Figura 17A).

Este efeito de concentração foi também evidenciado calculando um IC máximo para várias proporções molares de cisplatina/topotecano. Tal como mostrado na Figura 17B, um efeito antagonista parece maximizado para uma proporção molar de 1:1 e os efeitos não antagonisticos são evidentes quando qualquer fármaco está em excesso.

Exemplo 12

Manutenção do Sinergismo da Cisplatina e Topotecano In Vivo A cisplatina e o topotecano foram formulados respectivamente em lipossomas DMPC/Chol e DSPC/Chol, e injectados intravenosamente em ratinhos com uma proporção molar de 10:1 identificada no Exemplo 11 como sendo sinérgica. A cisplatina lipossómica foi preparada por hidratação de um filme de lipido consistindo de DMPC e colesterol (55:45%mol) com uma solução consistindo de NaCl 150 mM e 8,5 mg/ml de cisplatina. As MLV resultantes foram extrudidas, a 80°C, com dez passagens através de dois filtros empilhados com uma dimensão de poro de 100 nm. Após extrusão, a amostra foi arrefecida e a cisplatina precipitada foi removida por centrifugação. A cisplatina solúvel remanescente que não foi encapsulada nos lipossomas foi removida por diálise com HBS. Após a remoção da cisplatina não encapsulada, a concentração do fármaco foi medida por espectrometria de absorção atómica. 75

ΕΡ 1 432 402 /PT Ο topotecano lipossómico foi preparado por hidratação de um filme de lipido composto por DSPC e colesterol (55:45%mol) com uma solução de MnS04 300 mM. Os MLV resultantes foram extrudidos, a 65°C, através de dez passagens em dois filtros empilhados de 100 nm. Após extrusão os lipossomas foram permutados para tampão SHE (sacarose 300 mM, HEPES 20 mM e EDTA 30 mM, pH 7,4) através de cromatografia de filtração em gel. O carregamento de topotecano foi iniciado por adição de 1 pg de A23187/pmol de lipido (A23187 é um ionóforo catiónico que medeia a permuta de um ião metálico bivalente por dois protões através de uma multicamada) e topotecano até uma proporção final de topotecano/lipido de 0,08 (p/p), mantendo então a solução a 65°C, durante 15 minutos. A extensão da carga de topotecano foi medida por absorvância a 380 nm após separação do fármaco encapsulado e não encapsulado utilizando cromatografia de filtração em gel e solubilização em Triton X-100.

As preparações foram injectadas intravenosamente através da veia da cauda de ratinhos SCID/rag2 fêmeas. As doses de formulações lipossómicas foram de 5 mg/kg de cisplatina e 0,758 mg/kg de topotecano. Nos pontos de tempo indicado (3 ratinhos por ponto de tempo), o sangue foi recolhido por punção cardíaca e colocado em tubos Microtainer revestidos com EDTA. As amostras foram centrifugadas e o plasma foi cuidadosamente transferido para outro tubo. A contagem de cintilação líquida foi utilizada para quantificar o lipido marcado radioactivamente. A cisplatina foi medida utilizando espectrometria de absorção atómica enquanto que o topotecano foi medido por espectroscopia de fluorescência (excitação a 380 nm e emissão a 518 nm) após rotura dos lipossomas com detergente em excesso. A Figura 18 (os pontos de dados representam as concentrações médias de fármaco determinadas no plasma +/- DP nos pontos de tempo especificados) mostra que os níveis de plasma da cisplatina e do topotecano foram mantidos para uma proporção molar de 10:1 dado que os níveis de plasma da cisplatina eram cerca de dez vezes os do topotecano em vários pontos de tempo após administração intravenosa quando estes foram administrados nos lipossomas atrás descritos. Estes resultados demonstram que as características de retenção de 76 ΕΡ 1 432 402 /PT fármaco e de eliminação do lipossoma de dois agentes encapsulados em dois lipossomas diferentes podem ser coordenadas de modo a que aconteçam velocidades coordenadas de eliminação do fármaco. A inserção da Figura 18 mostra que as proporções molares de cisplatina em relação ao topotecano no plasma (+/- DP) presentes no plasma após administração intravenosa variam pouco ao longo do tempo. A cisplatina e o topotecano podem ser também formulados num único lipossoma de modo a assegurar que proporções não antagonisticas são mantidas in vivo. Isto pode ser realizado por encerramento passivo da cisplatina seguido do carregamento do topotecano mediado por ionóforo. Uma solução de cisplatina é primeiro preparada por dissolução de pó de cisplatina numa solução de MnCl2 150 mM. Para maximizar a solubilidade da cisplatina na solução de MnCl2, a solução é aquecida a 65°C. Um filme de lípido composto por DSPC/Chol (55:45%mol) com traços de 3H-CHE é hidratado com uma solução de cisplatina/MnCl2 · Os MLV resultantes são extrudidos, a 65°C, através de dois filtros de 100 nm, num total de dez passagens. A cisplatina insolúvel é então removida da formulação por arrefecimento da formulação até à temperatura ambiente e centrifugação desta solução a 2000x g. O sobrenadante resultante contendo cisplatina lipossómica e solúvel mas encapsulada é dialisada com tampão SHE, sacarose 300 mM, HEPES 20 mM e EDTA 30 mM (pH 7,4) durante a noite à temperatura ambiente. 0 topotecano é subsequentemente carregado nos lipossomas utilizando um gradiente de protões mediado por ionóforo. A Assimilação do fármaco é realizada a 0,08:1 de proporção em peso (p/p) de fármaco:lípido. O ionóforo de catião bivalente A23187 (1 pg ionóforo/pmol lípido) é adicionado aos lipossomas e então a mistura é incubada, a 60°C, durante 15 minutos, para facilitar a incorporação de A23187 na bicamada. Subsequentemente, o topotecano é adicionado e a mistura é incubada, a 60°C, durante 60 minutos, para facilitar a assimilação do fármaco. O topotecano não encapsulado e o A23187 são removidos da preparação por diálise da amostra com sacarose 300 mM. A extensão da carga de topotecano é quantificada medindo a absorvância a 380 nm. Os níveis de 77 ΕΡ 1 432 402 /PT cisplatina sao medidos por espectrometria de absorçao atómica e os níveis de lípido por contagem de cintiliação líquida.

Exemplo 13

Eficácia da Cisplatina e Topotecano Lipossómico A eficácia da cisplatina e do topotecano carregados em lipossomas separados foi investigada formulando os dois fármacos em lipossomas separados e administrando a formulação com uma proporção molar de 10:1 identificada no Exemplo 11 como sendo não antagonística. A cisplatina lipossómica foi passivamente encerrada em lipossomas de DMPC/Chol (55:45%mol) tal como descrito nos procedimentos do Exemplo 12. O topotecano foi formulado em DSPC/Chol (55:45%mol), tal como também no Exemplo 12, excepto que o carregamento do topotecano foi até uma proporção em peso (p/p) final de topotecano/lípido de 0,1. A seguir ao carregamento, o tampão externo foi permutado com HBS.

Os estudos de eficácia foram conduzidos, tal como detalhado no Exemplo 26, em que ratinhos SCID/rag2 fêmeas com tumores H460 (4 ratinhos por grupo) foram tratados intravenosamente (nos dias 13, 17, 21) com solução salina (controlo), cocktail sem fármacos ou uma mistura lipossómica de cisplatina/topotecano com uma proporção molar de 10:1 identificada como não antagonística no Exemplo 11. Para ambos os tratamentos, sem fármacos e formulados com lipossomas, as doses foram de 1,6 mg/kg de cisplatina e de 0,25 mg/kg de topotecano. As doses de lípido foram de 250 mg/kg partindo da formulação de cisplatina mais 2,5 mg/kg das formulações de topotecano. A Figura 19 mostra os resultados (os pontos de dados representam a dimensão média do tumor +/- SEM determinada no dia especificado). O controlo salino (círculos a cheio) e o cocktail de cisplatina/topotecano 10:1 (triângulos a cheio) não controlam eficazmente o volume do tumor. Contudo, a preparação lipossómica de cisplatina/topotecano (triângulos a branco) evitou o aumento do tumor em volume durante um período de, pelo menos, 35 dias. 78

ΕΡ 1 432 402 /PT

Exemplo 14

Sinergismo da Cisplatina e do Irinotecano

Combinações de cisplatina e irinotecano com proporções molares de 1:1, 10:1, 1:5 e 1:10 foram testadas relativamente a sinergia, aditividade ou antagonismo de acordo com os métodos descritos atrás (ver Exemplo 1). Os resultados sumariados na Figura 20A mostram que as proporções molares de 10:1, 1:5 e 1:10 eram não antagonist icas ao longo da gama completa de valores de fa em que uma proporção de 1:1 era antagonistica ao longo de uma gama substancial de valores de fa. A Figura 20B ilustra ainda a dependência da proporção em relação à natureza do efeito de combinação, tal como sumariado ao registar o índice de combinação máximo relativamente à proporção molar de cisplatina e irinotecano.

Exemplo 15

Manutenção do Sinergismo da Cisplatina e do Irinotecano

In Vivo

Cisplatina e irinotecano foram co-carregados para lipossomas de DSPC/DSPG (80:20%mol), que foram preparados tal como descrito no Exemplo 5, excepto que os filmes de lípido foram re-hidratados em cobre 225 mM (CuCl2 75 mM, CuSCg 150 mM, trietanolamina (TEA), pH 6,8), contendo 6,0 mg/ml de cisplatina. A concentração de cisplatina lipossómica após extrusão e remoção de fármaco não encapsulado foi de 0,025 moles de cisplatina/moles de lípido. Os lipossomas resultantes foram dialisados com SHE, pH 6,8, durante a noite. O irinotecano foi então adicionado à preparação e os lipossomas foram incubados a 45°C durante 1,5 horas. Os lipossomas ficaram carregados a 60% do irinotecano adicionado, tal como determinado por HPLC. Os lipossomas foram então permutados de tampão para uma solução salina a 0,9% através de fluxo tangencial. Após o fluxo tangencial, os lipossomas retiveram aproximadamente 80% da cisplatina e do irinotecano original. A análise da cisplatina e do irinotecano, determinada por espectrometria de absorção atómica e análise por HPLC, respectivamente, indicou que a preparação final tinha uma proporção molar de cisplatina em relação ao irinotecano de 1:3. Ratinhos SCID/rag2 foram administrados intravenosamente com 2 mg/kg de cisplatina e 38,6 mg/kg de 79

ΕΡ 1 432 402 /PT irinotecano. Nos pontos de tempo indicados (3 ratinhos por ponto de tempo) o sangue foi recolhido por punção cardíaca e colocado em tubos Microtainer revestidos com EDTA. As amostras foram centrifugadas e o plasma foi cuidadosamente transferido para outro tubo. Os níveis de cisplatina e de irinotecano no plasma foram determinados por HPLC e espectrometria de absorção atómica, respectivamente.

Aos resultados na Figura 21 (os pontos de dados representam concentrações de fármaco médias no plasma +/- DP nos pontos de tempo especificados) mostram que a seguir à injecção intravenosa de formulações contendo cisplatina e irinotecano, co-carregados em lipossomas DSPC/DSPG, as velocidades de eliminação dos fármacos eram comparáveis e que as proporções molares não antagonísticas de fármaco podiam ser mantidas ao longo de 24 horas após administração. A libertação coordenada de cisplatina e de irinotecano lipossómico in vivo foi também conseguida formulando os dois fármacos em veículos de administração separados e administrando os fármacos com uma proporção molar de 1:5 (cisplatina/irinotecano). A cisplatina lipossómica foi preparada de acordo com a técnica de carregamento passivo descrita atrás. Filmes de lípido consistindo de DMPC/Chol (55:45%mol) foram hidratados com uma solução de NaCl 150 mM contendo 8,5 mg/ml de cisplatina, e então extrudiu-se como atrás. Os lipossomas foram recolhidos no sobrenadante após a centrifugação, tal como atrás e então permutados para HBS através de diálise de fluxo tangencial. O irinotecano lipossómico foi preparado hidratando filmes de lípido consistindo de DSPC/DSPE-PEG20 0 0 (95:5%mol) com uma solução consistindo de CuCl2 de 150 mM, histidina 20 mM, pH 6,8 (pH ajustado com TEA). As MLV resultantes foram extrudidos, a 65°C, através de dois filtros empilhados com uma dimensão de poro de 100 nm e permutou-se de tampão com HBS através de fluxo tangencial. Os lipossomas extrudidos foram carregados com irinotecano, a 60°C, durante 1 minuto, com uma proporção em peso de fármaco em relação ao lípido de 0,1:1. A extensão da carga de irinotecano foi determinada por 80

ΕΡ 1 432 402 /PT absorvância a 370 nm após solubilização em Triton X-100; os níveis de lípido foram medidos por contagem de cintilação líquida. A cisplatina lipossómica foi administrada a ratinhos SCID/rag2 machos com uma dose de fármaco de 2,0 mg/kg e o irinotecano lipossómico foi administrado a ratinhos a 20 mg/kg. Nos pontos de tempo indicados (3 ratinhos por ponto de tempo), o sangue foi recolhido por punção cardíaca e colocado em tubos Microtainer revestidos com EDTA. As amostras foram centrifugadas e o plasma foi cuidadosamente transferido para outro tubo. Os níveis de irinotecano no plasma foram medidos por HPLC e a cisplatina foi medida por espectrometria de absorção atómica. A cisplatina e o irinotecano administrados em conjunto nestas formulações lipossómicas com esta proporção sinérgica (proporção molar de 1:5) mantendo esta proporção a 1:5 a seguir a administração intravenosa, tal como evidenciado pelas concentrações de irinotecano no plasma (nmol/ml) sendo mais ou menos cinco vezes as da cisplatina (nmol/ml) em vários pontos de tempo (Figura 22) .

Exemplo 16

Eficácia da Cisplatina e Irinotecano Lipossómico

Foram realizados estudos de eficácia em relação à cisplatina e irinotecano lipossómico formulados em lipossomas separados. A cisplatina foi passivamente encerrada em lipossomas de DMPC/Chol (55:45%mol) e o irinotecano foi carregado em lipossomas de DSPC/DSPE-PEG2000 (95:5%mol) detalhados no Exemplo 15. A cisplatina e o irinotecano lipossómicos foram co-administrados em ratinhos SCID/rag2 com tumores H460 de acordo com os métodos descritos no Exemplo 26 com uma proporção molar de 1:5, determinada como sendo não antagonistica no Exemplo 14. A cisplatina e o irinotecano lipossómicos foram administrados (4 ratinhos por grupo nos dias 14, 18 e 22) com a proporção molar 1:5 não antagonistica com doses de 1 mg/kg de cisplatina, 10 mg/kg de irinotecano e 130 mg/kg de lipido (quadrados a branco); 2,5 mg/kg de cisplatina, 25 mg/kg de irinotecano e 175 mg/kg de lipido (triângulos para cima a branco); ou 5 mg/kg de cisplatina, 81

ΕΡ 1 432 402 /PT 50 mg/kg de irinotecano e 250 mg/kg de lípido (triângulos invertidos a branco). O conjunto cisplatina/irinotecano livre foi doseado com 1 mg/kg de cisplatina e 10 mg/kg de irinotecano que reflecte uma proporção molar de 1:5 (quadrados a cheio). A Figura 23 (os pontos de dados representam a dimensão média do tumor +/- SEM determinada no dia especificado) ilustra que o crescimento do tumor para as preparações lipossómicas foi substancialmente suprimido em relação a ratinhos tratados com cocktail sem fármacos e solução salina.

Exemplo 17

Sinerqismo de Combinações de Fármaco e Lípido

Combinações compreendendo vinorelbina com uma proporção molar de 1:1 com vários lípidos potencialmente terapêuticos incorporados na bicamada lipídica, tal como POPS (triângulos invertidos), DPPS (triângulos para cima), DLPS (círculos), DSPS (losangos) ou DOPS (quadrados), foram testadas relativamente a efeitos aditivos, sinérgicos ou antagonísticos utilizando o método descrito acima (ver Exemplo 1) .

Os resultados na Figura 24 mostram que todas as combinações de vinorelbina e lípidos testadas em células H460 apresentam sinergia ao longo de uma gama substancial de valores de fa. Em particular, as combinações de vinorelbina com DLPS, DSPS e DOPS apresentam sinergia para a maioria dos valores de fa, muito especialmente entre fa = 0,2 a fa = 0,8.

Exemplo 18

Farmacocinética de Vinorelbina e Fosfatidilserina Lipossómica

Lipossomas consistindo de SM/Chol/DPPS/DSPE-PEG2000 (35:45:10:10%mol) foram preparados e carregados com vinorelbina como se segue:

Os lípidos foram dissolvidos em clorofórmio a 100 mg/ml e então combinados nas quantidades apropriadas. A excepção a isto é o DPPS que foi dissolvido a 25 mg/ml utilizando CHCl3/metanol/H20/tampão citrato (20:10,5:1:1 v/v) . Traços de lípido radioactivo 3H-CHE foi adicionado neste ponto para 82

ΕΡ 1 432 402 /PT seguir o lípido ao longo do processo de formulação. O clorofórmio foi removido sob corrente de N2 gasoso até restar muito pouco solvente. Os filmes de lípido resultante foram deixados sob vácuo durante a noite para remover qualquer solvente residual. Os filmes de lípido foram re-hidratados em tampão citrato (300 mM, pH 4,0) e as MLV resultantes foram extrudidas, a 65°C, através de dois filtros com uma dimensão de poros de 100 nm, num total de dez passagens. A vinorelbina foi carregada para estas formulações utilizando o método de carregamento de gradiente de pH titulando até ao pH do tampão externo com a utilização de Na2HP04 0,2 M. Uma quantidade conhecida de lipossomas foi combinada com a quantidade correspondente de vinorelbina (proporção em peso (p/p) de fármaco/lípido de 0,1) e incubou-se a 60°C, durante 15 minutos. De modo a estabelecer um gradiente de pH, Na2HP04 0,2 M foi adicionado a dez vezes o volume do tampão citrato. A vinorelbina foi carregada para lipossomas para se conseguir uma proporção molar de vinorelbina/fosfatidilserina que foi identificada como não antagonística no Exemplo 17. O detergente OGP foi utilizado para solubilizar os lipossomas carregados com vinorelbina; os níveis de fármaco foram medidos por absorvância a 270 nm e contagem de cintilação líquida foi utilizada para quantificar os lípidos.

Os lipossomas carregados com vinorelbina resultantes e a vinorelbina livre foram administrados intravenosamente em ratinhos SCID/rag2 com uma dose de fármaco de 10 mg/kg. Nos pontos de tempo indicados (3 ratinhos por ponto de tempo), o sangue foi recolhido por punção cardíaca e colocado em tubos Microtainer revestidos com EDTA. As amostras foram centrifugadas e o plasma foi cuidadosamente transferido para outro tubo. O sangue foi analisado relativamente ao marcador de 3H-CHE lipossómico remanescente utilizando contagem de cintilação. Os níveis de vinorelbina no plasma foram avaliados por HPLC.

As Figuras 25A e 25B mostram que os lipossomas SM/Chol/DPP/DSPE-PEG2000 que encapsulam vinorelbina apresentam níveis de fármaco no plasma substancialmente aumentados 83 ΕΡ 1 432 402 /PT relativamente à administração com a vinorelbina livre. A área média de vinorelbina livre sob a área da curva (AUC) de 0,112 yg h/ml aumentou para 125,3 yg h/ml através da formulação em lipossomas, representando um aumento de 1120 vezes em AUC médio.

Exemplo 19

Eficácia da Fosfatidilserina e Vinorelbina Lipossómicos no Modelo do Cancro do Pulmão Humano H460

Os lipossomas DSPC/Chol/DSPS/DSPE-PEG2000 (35:45:10:10%mol), SM/Chol/DPP/DSPE-PEG2000 (35:45:10:10%mol) e DAPC/Chol/DPPS/DSPE-PEG2000 (35:45:10:10%mol) foram preparados e carregados com vinorelbina, tal como descrito no Exemplo 18. A fosfatidilserina e a vinorelbina estavam presentes nos lipossomas para proporções molares não antagonisticas (1:1). Estudos de eficácia foram realizados no modelo de cancro do pulmão humano H460 tal como descrito no Exemplo 26. A Figura 26 mostra que, para ratinhos com tumores H460 (4 ratinhos por grupo) a que foi administrado intravenosamente lipossomas consistindo de DSPC/Chol/DPPS/DSPE-PEG2000 e SM/Chol/DPPS/DSPE-PEG2000 e vinorelbina encapsulada, esse tratamento provoca uma diminuição da velocidade do crescimento do tumor em relação às observadas a seguir ao tratamento com vinorelbina e solução salina. A vinorelbina livre foi administrada a 5 mg/kg e a vinorelbina lipossómica foi administrada com uma dose de 5 mg/kg de fármaco e de 50 mg/kg de lípido nos dias 13, 17 e 21 após a inoculação de células tumorais. A Figura 27 (os pontos de dados representam a dimensão de tumor médio +/- SEM determinada no dia especificado) mostra que os lipossomas consistindo de SM/Chol/DPP/DSPE-PEG2000; DAPC/Chol/DPPS/DSPE-PEG2000 e DSPC/Chol/DSPS/DSPE-PEG2000 e vinorelbina encapsulada apresentam uma diminuição do volume do tumor com o tempo em relação à vinorelbina livre e à solução salina. Os ratinhos com tumor (4 por grupo) foram tratados com uma dose de vinorelbina de 5 mg/kg (livre e lipossómica) e uma dose de lipido de 50 mg/kg para o grupo lipossómico. Os ratinhos foram tratados intravenosamente nos dias 13, 17 e 21. 84

ΕΡ 1 432 402 /PT

Exemplo 20

Eficácia da Fosfatidilserina e Vinorelbina Lipossómica no Modelo de Cancro da Leucemia Murina

Os lipossomas consistindo de SM/Chol/DPP/DSPE-PEG2000 (35:45:10:10%mol) foram preparados e carregados com vinorelbina, tal como descrito no Exemplo 18, excepto que os lipossomas foram extrudidos através de um filtro com uma dimensão de poros de 100 nm empilhado num filtro de 80 nm. Células P388/wt foram inoculadas intraperitonealmente em ratinhos BDF-1, tal como descrito no Exemplo 27. Subsequentemente, em ratinhos fêmea BDF1 foram administrados intraperitonealmente um dos seguintes: solução salina; vinorelbina livre (10 mg/kg) e lipossomas SM/Chol/DPP/DSPE-PEG2000 carregados com vinorelbina (10 mg/kg de vinorelbina e 100 mg/kg de lipido). A administração intraperitoneal de vinorelbina livre e lipossómica foi realizada no dia 1 com 4 ratinhos por grupo de tratamento.

As curvas de sobrevivência mostradas na Figura 28 demonstram que a administração da vinorelbina encapsulada em lipossomas consistindo de SM/Chol/DPP/DSPE-PEG2000 resulta num aumento substancial das taxas de sobrevivência em ratinhos BDF-1 em relação a vinorelbina livre e tratamento salino.

Exemplo 21

Co-Formulação de Esfingosina e Doxorubicina

Outros lipidos terapêuticos para além da fosfatidilserina podem ser incorporados nas membranas do lipossoma. Por exemplo, e esfingosina e análogos da esfingosina são líquidos que são acessíveis para formulação em lipossomas e podem ser co-formulados com um agente terapêutico que é encapsulado no interior aquoso (por exemplo, doxorubicina). A preparação de uma tal composição farmacêutica (esfingosina) pode ser realizada como se segue:

Uma formulação lipossómica típica de esfingosina é composta por DSPC/Chol/esfingosina (45:45:10%mol). Os filmes de lipido foram preparados tal como detalhado nos exemplos prévios. Os lipidos de filme foram re-hidratados em tampão 85

ΕΡ 1 432 402 /PT citrato (300 mM, pH 4) e as MLV resultantes são extrudidas, a 65°C, através de filtros de 100 nm, num total de dez passagens. A doxorubicina é subsequentemente carregada nestas formulações utilizando o método de carregamento por gradiente de pH permutando o tampão externo dos lipossomas por passagem numa coluna Sephadex G-50 que é equilibrada com HBS (pH 7,4) para estabelecer um gradiente de pH.

Os lipossomas e a solução de doxorubicina são então incubados em conjunto, a 60°C, para permitir que ocorra o carregamento. Para determinar a extensão do carregamento para vários tempos, é aplicado 100 μΐ de amostra a uma coluna de centrifugação de Sephadex G-50 de 1 ml e então centrifugada. Uma proporção de fármaco em relação ao lípido para o eluente da coluna de centrifugação é gerada utilizando contagem de cintilação liquida para quantificar o lípido e uma absorvância a 480 nm para quantificar a doxorubicina. Para se avaliarem os fármacos os lipossomas são solubilizados por incubação em Triton X-100 antes de serem efectuadas as leituras da absorvância.

Exemplo 22

Sinergismo de Floxuridina (FUDR) e Irinotecano (CPT-11) O procedimento apresentado atrás para medir os efeitos aditivos, sinérgicos ou antagonísticos foi repetido utilizando FUDR/CPT-11 com proporções molares de 10:1, 5:1, 1:1, 1:5 e 1:10 em células H29. Foi determinado um índice de combinação para cada dose produzindo curvas de IC versus fa tal como descrito atrás. Os dados na Figura 29, registados como IC versus a fracção de células H29 afectadas, ilustra claramente o efeito da concentração na sinergia. Com uma proporção molar de 5:1 ou 1:1 observa-se sinergia ao longo de toda a gama da fracção de valores afectados (0,2 a 0,8) enquanto com uma proporção de 10:1 é não antagoní stica para valores de fa abaixo de 0,76 e com uma proporção molar de 1:5 de FUDR/CPT-11 é não antagonística para valores de fa abaixo de 0,62. Uma proporção de 1:10 é antagonística ao longo de uma gama substancial de valores de fa (mais do que 50%) . Com base nestes resultados, foi seleccionada uma proporção molar de FUDR/CPT-11 de 1:1 para formulação e estudos de eficácia dado que esta proporção demonstra efeitos sinérgicos ao longo de 86

ΕΡ 1 432 402 /PT uma gama significativa de valores de fa (pelo menos 20% eram superiores a 1% das células afectadas). As formulações preparadas com a proporção de 5:1 e 10:1 também iriam ao encontro dos requisitos de uma proporção não antagonistica definida ao longo de uma gama substancial de valores de fa.

Exemplo 23

Manutenção de Sinergismo de FUDR e CPT-11 In Vivo FUDR e CPT-11 foram formulados em lipossomas de DSPC/DSPG/Chol (70:20:10%mol) com uma proporção molar de 1:1 identificada no Exemplo A como sendo sinérgica. Os filmes de lipido foram preparados dissolvendo DSPV e colesterol em clorofórmio e DSPG em clorofórmio/metanol/água (16/18/1). As soluções foram combinadas em conjunto de modo a que a proporção molar especificada fosse atingida e foram adicionados traços de 14C-CHE como marcador típico lipossómico. A seguir à remoção de solvente os filmes de lipido resultantes foram hidratados numa solução consistindo de CuS04 250 mM e 25 mg/ml de FUDR (com traços de 3H-FUDR) a 70°C. As MLV resultantes foram extrudidas, a 70°C, por dez passagens através de dois filtros empilhados com uma dimensão de poro de 100 nm. Subsequentemente, os lipossomas foram permutados de tampão para SHE, pH 7,4, através de diálise de fluxo tangencial removendo, deste modo, qualquer FUDR e CuSCq não encapsulados. CPT-11 foi adicionado a estes lipossomas de modo a que a proporção molar de FUDR em relação ao CPT-11 fosse de 1:1. O carregamento de CPT-11 nos lipossomas foi facilitado incubando as amostras a 50°C, durante 5 minutos. Após carregamento, as amostras foram permutadas para HBS, pH 7,4, através de diálise de fluxo tangencial, para remover EDTA ou fármaco não encapsulado. A extensão da carga de CPT-11 foi medida utilizando HPLC. Os níveis de FUDR e de lipido foram medidos utilizando cintilação líquida.

As preparações foram injectadas intravenosamente na veia da cauda de ratinhos Balb/c fêmeas. As doses das formulações lipossómicas foram de 8,38 mg/kg de FUDR e de 20 mg/kg de CPT-11. Nos pontos de tempo indicados (3 ratinhos por ponto de tempo) o sangue foi recolhido por punção cardíaca e colocado 87

ΕΡ 1 432 402 /PT em tubos Microtainer revestidos com EDTA. As amostras foram centrifugadas e o plasma foi transferido para outro tubo. A contagem de cintilação líquida foi utilizada para quantificar o líquido radioactivamente marcado e o FUDR no plasma. Os níveis de CPT-11 no plasma foram quantificados por HPLC. A Figura 30 mostra que os níveis no plasma de FUDR e CPT-11 foram mantidos com uma proporção molar de 1:1 dado que os níveis de FUDR no plasma eram praticamente iguais aos do CPT-11 em vários pontos de tempo após a administração intravenosa quando estes foram administrados nos lipossomas descritos atrás. Os pontos de dados representam as concentrações médias de fármaco (nmol de fármaco/ml de plasma) determinadas no plasma + /- desvio padrão nos pontos de tempo especificados.

Exemplo 24

Eficácia de FUDR e CPT-11 Lipossómicos

Lipossomas de DSPC/DSPG/Chol (70:20:10%mol) co-encapsulados com FUDR e irinotecano com uma proporção molar de 1:1 foram preparados tal como descrito no Exemplo B excepto que após o carregamento o tampão de lipossoma externo foi permutado para NaCl 0,9%.

Utilizando os métodos do Exemplo 26, foram realizados estudos de eficácia com ratinhos SCID/rag2 fêmeas que foram subcutaneamente inoculados no flanco com 2 x 106 células HT-29. Os tumores foram deixados a desenvolver até terem um tamanho de 180 mg (0,18 cm3), tempo em que (dia 21) as formulações indicadas foram injectadas. O crescimento do tumor foi determinado por medições directas com uma craveira. Os ratinhos foram tratados com uma dose única (seta) de solução salina, cocktail de fármaco livre com uma proporção molar de 1:1 ou uma formulação lipossómica de FUDR/CPT-11 com uma proporção molar de 1:1. Para ambos os tratamentos com cocktail e formulação em lipossoma, as doses foram de 9,25 mg/kg de FUDR e de 25 mg/kg de CPT-11. As doses de lípido foram de 278 mg/kg de lípido para amostras formuladas em lipossoma. 88

ΕΡ 1 432 402 /PT

Os resultados apresentados na Figura 31 mostram que a administração de FUDR e CPT-11 encapsulados num único lipossoma com uma proporção molar de 1:1 proporcionaram uma actividade terapêutica significativamente melhor quando em comparação com animais injectados quer com o cocktail sem fármacos quer com a solução salina. Os pontos de dados representam a dimensão média do tumor +/- o erro padrão da média (SEM).

Exemplo 25

Determinação do IC de Várias Combinações de Três Fármacos

Combinações compreendendo topotecano, cisplatina, HB5-5A (um análogo farmaceuticamente aceitável da edelfosina) e esfingosina foram testadas em relação aos efeitos aditivos, sinérgicos ou antagonisticos utilizando os ensaios correntes de citotoxicidade MTT colorimétricos com base em tetrazólio (ver Exemplos - Ensaio de Citotoxicidade). Os efeitos de combinação foram calculados utilizando a análise do efeito mediano descrita nos exemplos precedentes. Os gráficos de IC versus fa foram criados tal como descrito nos exemplos precedentes e os valores de IC correspondentes aos valores de fa de 0,50, 0,75 e 0,90 (representados por ED50, 75 e 90) são registados na tabela abaixo:

AGENTE 1 AGENTE 2 AGENTE 3 PROPORÇÃO ÍNDICE DE FIXADA COMBINAÇÃO3 ED5Qb ED75 ED90 topotecano cisplatina HB5-5A 1:10:1 0.56 0,34 0, 26 topotecano cisplatina HB5-5A 1:10:10 0, 73 0, 53 0, 43 topotecano cisplatina HB5-5A 1:10:100 2,22 1, 78 1, 45 topotecano cisplatina esfingosina 1:10:1 0,23 0, 12 0, 04 topotecano cisplatina esfingosina 1:10:10 0,47 0,34 0, 29 topotecano cisplatina esfingosina 1:10:100 1,22 0, 95 0, 76 a índice de combinação (IC) é utilizado para determinar a sinergia (IC <0,9) ou a aditividade (IC entre 0,9 e 1,1) com base na teoria de Chou-Talalay da análise do efeito de dose. Os valores são calculados utilizando o programa de CalcuSyn. b ED50, ED75, ED90 referem-se à dose do(s) agente (s) que afecta 50, 75 e 90% da resposta medida, respectivamente. 89

ΕΡ 1 432 402 /PT

Exemplo 26

Preparação de Modelos de Tumores, Preparação e Implantação de Células para um Método de Tumor Subcutâneo Sólido

As células do carcinoma do pulmão humano de célula não pequena H460 são obtidas no DCTC Tumor Repository do NCI. As células são mantidas em cultura de tecidos até 20 passagens. Após 20 passagens, as novas células são expandidas a partir de uma massa inicial congelada armazenada em azoto liquido. Quando as células em cultura atingiram uma confluência de 80-90% estas foram enxaguadas com uma Solução Salina Equilibrada de Hanks e as células aderentes são removidas com uma solução de tripsina a 0,25%. As células são contadas num hemocitómetro e diluídas com meio até uma concentração de 20 x 106 células/ml.

Uma camada de pêlo de aproximadamente 2 cm x 2 cm é rapada utilizando uma máquina de tosquia eléctrica na parte traseira inferior de cada ratinho. Utilizando uma agulha 28 g, os ratinhos são inoculados subcutaneamente com 1 x 106 células tumorais no dia 0 (um inóculo/ratinho) num volume de 50 μΐ.

Quando os tumores atingem uma dimensão definida de aproximadamente 0,50 a 0,100 cm3, quer um dia antes do tratamento quer no dia do tratamento (~dia 10-14), todos os tumores são medidos. Após a selecção das dimensões de tumor apropriadas, excluindo os tumores muito pequenos ou grandes, os tumores são distribuídos ao acaso (n = 4) e o volume médio de tumor dos grupos é determinado.

Os ratinhos são organizados em grupos de tratamento apropriados e que consistem em grupos de controlo e de tratamento, tais como controlo de solução salina, controlo de veículo, controlo positivo e várias diluições dos artigos testados.

Os grupos de tratamento sao como se segue: 90

ΕΡ 1 432 402 /PT GRUPO RATINHO/ GRUPO TRATAMENTO DOSE (mg/kg) TOMASa VOLUME DE INJECÇÃO 1 4 Controlo de solução salina N/A q4dx3 10 μΐ/g 2 4 Controlo de veículo 20 q4dx3 10 μΐ/g 3 4 Controlo positivo 10 q4dx3 10 μΐ/g 4 4 Agente de teste (dose baixa) 5 q4dx3 10 μΐ/g 5 4 Agente de teste (dose média) 10 q4dx3 10 μΐ/g 6 4 Agente de teste (dose alta) 20 q4dx3 10 μΐ/g a Programações de doseamento alternativos podem ser considerados tais como dose única ou 3 doses cada 4-7 dias

Os ratinhos foram injectados intravenosamente com o volume requerido de amostra para administrar a dose prescrita (10 μΐ/g, tal como indicado) aos animais com base nos pesos dos ratinhos individuais.

As medições do crescimento dos tumores são monitorizadas utilizando craveiras, com inicio no dia do tratamento. As medições do comprimento dos tumores (mm) são efectuadas no eixo mais longo e as medições da largura (mm) serão perpendiculares a este eixo. Com as medições do comprimento e da largura são calculados os volumes dos tumores (cm3) de acordo com a equação (L X W2/2)/100. O peso dos animais é medido no tempo da medição do tumor.

Os pesos corporais dos ratinhos individuais são registados em vários dias (geralmente intercalados, tais como Segunda-feira, Quarta-feira e Sexta-feira) durante os estudos de eficácia para um período de 14 dias após o último doseamento.

Todos os animais são observados, pelo menos, uma vez por dia, mais se considerado necessário, durante os períodos de pré-tratamento e de tratamento, relativamente à mortalidade e morbidez. Em particular, os sinais de doença são baseados na perda de peso corporal, alterações de apetite, pêlo áspero e desalinhado, alterações comportamentais tais como caminhar 91

ΕΡ 1 432 402 /PT alterado, letargia e grandes manifestações de estresse. Se foram vistos sinais de grave toxicidade ou de doenças relacionadas com o tumor, os animais são eutanizados (asfixia com CO2) e é realizada necropsia para avaliar outros sinais de toxicidade. Os animais moribundos devem ser exterminados por proporções humanitárias e a decisão de os matar estará a cargo do Técnico de Cuidados dos Animais e do Director / Gestor do Estudo. Qualquer um destes acontecimentos será registado e o tempo da morte será considerado como sendo o do dia seguinte.

Os dados são apresentados quer em forma de tabela quer em forma de figura como se segue: 1. Registo dos volumes individuais dos tumores dos ratinhos em relação a cada grupo, antes do inicio do tratamento e depois de agrupamento. 2. Pesos corporais médios de cada grupo em função do tempo. 3. Volumes médios dos tumores de cada grupo em função do tempo 4. Dados incluindo figuras e tabelas são gerados e incluem crescimento do tumor vs. tempo, inibição do crescimento do tumor e atraso do crescimento do tumor. 5. Resumo de observações anormais ou assinaláveis.

Exemplo 27

Preparação de Modelos de Tumores, Preparação e Implantação de Células para um Método de Tumor Intraperitoneal

Os ratinhos foram agrupados de acordo com o peso corporal. Os animais (n= 4) foram inoculados (dia= 0) com 1 x 106 células P388 implantadas na cavidade peritoneal de ratinhos BDF-1 num volume de 500 μΐ com uma agulha 25 g. Células P388 do depósito de tumores ATCC foram mantidas como um fluido ascitico nos ratinhos BDF-1, que são passadas para novos ratinhos semanalmente. Os ratinhos são eutanizados, e as células asciticas removidas através da parede abdominal com uma agulha 20 g. As células utilizadas para experiência são utilizadas na passagem 3-20. Após 20 passagens nos ratinhos, as novas células são trazidas da massa congelada em azoto liquido e os ratinhos são inoculados. Para as experiências as células são enxaguadas com uma Solução de Sal Equilibrada 92

ΕΡ 1 432 402 /PT

Hanks, contadas num hemocitómetro e diluídas com HBSS até uma concentração de 2 x 106 células /ml.

Os grupos de estudo são constituídos ao acaso após terem sido administradas células tumorais a todos os ratinhos. Os grupos requeridos são semelhantes aos utilizados para estudos de tumores sólidos (ver Exemplo 26).

Os ratinhos são injectados intravenosamente ou intraperitonealmente com o volume requerido de amostra para administrar a dose prescrita (10 μΐ/g, tal como indicado) aos animais com base nos pesos individuais dos ratinhos. Com tumores intraperitoneais, as administrações começam geralmente no dia 1 após a inoculação das células tumorais. O bem-estar dos animais é cuidadosamente monitorizado diariamente. Os sinais de falta de saúde e da progressão da morbidez são cuidadosamente monitorizados, tal como descrito no Exemplo 26. Os animais são pesados na altura do exame.

Após a morte de cada um dos ratinhos, são efectuadas necropsias gerais para avaliar a extensão do tumor e/ou alterações fisiologicamente observáveis nas aparências dos órgãos. As observações são registadas.

Os grupos de pesos corporais são registados de Segunda a Sexta-feira durante o estudo de eficácia para um período de 14 dias após o último doseamento.

Todos os animais são observados, pelo menos uma vez por dia, mais se considerado necessário, durante os períodos de pré-tratamento e de tratamento relativamente à mortalidade e à morbidez. Em particular, os sinais de falta de saúde são baseados na perda de peso corporal, alterações de apetite, alterações comportamentais, tais como caminhar alterado, letargia e grandes manifestações de estresse. Se forem vistos sinais de grande toxicidade ou doença relacionada com o tumor, os animais são mortos (asfixia com CO2) e é realizada a necropsia para avaliar os sinais de toxicidade. Os animais moribundos devem ser mortos por proporções humanitárias e a decisão de os matar estará a cargo do técnico de cuidados dos animais e do gestor do estudo. Estes acontecimentos serão 93

ΕΡ 1 432 402 /PT registados e o tempo da morte será considerado como sendo o do dia seguinte.

Os dados são apresentados quer em forma de tabela quer em forma de figura e incluem os pesos corporais médios para cada grupo em função do tempo e do aumento do tempo de vida.

Lisboa,

Claims (29)

1. ΕΡ 1 432 402 /PT 1/8 REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica para administração parentérica, compreendendo veículos de administração sob a forma de partículas tendo associado, pelo menos, um primeiro agente antineoplásico e um segundo agente antineoplásico, em gue os referidos primeiro e segundo agentes estão numa proporção molar que apresenta um efeito citotóxico ou citostático não antagonístico e em que os referidos primeiro e segundo agentes estão associados aos veículos de administração para manter uma proporção não antagonística no sangue após administração.
2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos veículos de administração têm um diâmetro de 4 a 6000 nm.
3. 3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que os referidos veículos de administração têm um diâmetro médio entre 4,5 e 500 nm.
4. 4. Composição de acordo com a reivindicação 3, em que os referidos veículos de administração têm um diâmetro médio inferior a 250 nm.
5. 5. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos veículos de administração têm um diâmetro de 4 pm a 5 0 pm.
6. 6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que os referidos veículos de administração compreendem transportadores lipídicos, e/ou lipossomas, e/ou micelas lipídicas, e/ou micelas de lipoproteínas, e/ou emulsões estabilizadas com lípidos, e/ou ciclodextrinas, e/ou micelas de copolímero de blocos, e/ou micropartícuias poliméricas, e/ou nanopartícuias poliméricas, e/ou sistemas híbridos de lípidos poliméricos, e/ou polímeros de cadeia única derivatizados. ΕΡ 1 432 402 /PT 2/8
7. 7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que os referidos primeiro e segundo agentes são co-encapsulados.
8. 8. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a referida proporção molar do primeiro agente em relação ao segundo agente apresenta um efeito citotóxico ou citostático não antagonistico para células relevantes em cultura ao longo de, pelo menos, 5% da gama de concentrações em que >1% das células são afectadas num ensaio in vitro do referido efeito citotóxico ou citostático.
9. 9. Composição de acordo com a reivindicação 8, em que o referido efeito não antagonistico é apresentado ao longo de, pelo menos, 5% da gama de concentrações de modo a que 10-90% das células são afectadas no referido ensaio in vitro.
10. 10. Composição de acordo com a reivindicação 9, em que o referido efeito não antagonistico é apresentado ao longo de, pelo menos, 5% da gama de concentrações de modo a que 20-80% das células são afectadas no referido ensaio in vitro.
11. 11. Composição de acordo com a reivindicação 10, em que o referido efeito não antagonistico é apresentado ao longo de, pelo menos, 20% da gama de concentrações de modo a que 20-80% das células são afectadas no referido ensaio in vitro.
12. 12. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 que, quando administrada a um indivíduo, proporciona uma actividade terapêutica superior à que é obtida quando os referidos agentes são administrados na mesma proporção mas não associados a veículos de administração.
13. 13. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, em que pelo menos um dos agentes é seleccionado do grupo constituído por um agente danificador do ADN, um inibidor da reparação do ADN, um inibidor da topoisomerase I, um inibidor da topoisomerase II, um inibidor do ponto de verificação da célula, um inibidor de CDK, um inibidor da tirosina-quinase receptora, um agente citotóxico, um agente de indução de apoptose, um antimetabolito, um inibidor do controlo do ciclo celular, um lípido terapêutico, ΕΡ 1 432 402 /PT 3/8 um inibidor de telomerase, um agente antiangiogénico, um veneno mitocondrial, um inibidor da transdução de sinal e um agente imunológico.
14. 14. Composição de acordo com a reivindicação 13, em que o primeiro agente é um agente citotóxico e o segundo agente é um inibidor do ciclo celular, ou em que o primeiro agente é um agente danificador de ADN e o segundo agente é um inibidor da reparação do ADN, ou em que o primeiro agente é um inibidor da toposiomerase I e o segundo agente é um inibidor do ponto de verificação S/G2 ou G2/M, ou em que o primeiro agente é um inibidor do ponto de verificação Gi/S ou um inibidor de quinase dependente da ciclina e o segundo agente é um inibidor do ponto de verificação G2/M, ou em que o primeiro agente é um inibidor de quinase receptora e o segundo agente é um agente citotóxico, ou em que o primeiro agente é um agente indutor da apoptose e o segundo agente é um agente citotóxico, ou em que o primeiro agente é um agente indutor de apoptose e o segundo agente é um agente de controlo do ciclo celular, ou em que o primeiro agente é um inibidor da telomerase e o segundo agente é um inibidor do controlo do ciclo celular, ou em que o primeiro e o segundo agentes são antimetabolitos, ou em que o primeiro e o segundo agentes são agentes citotóxicos, ou em que o primeiro agente é um lípido terapêutico e o segundo agente é um agente citotóxico, ou em que o primeiro agente é um inibidor de topoisomerase I e o segundo agente é um inibidor da reparação do ADN, ou em que o agente indutor da apoptose é um lípido contendo serina.
15. 15. Composição de acordo com a reivindicação 14, em que o primeiro agente é irinotecano e o segundo agente é 5-FU ou FUDR, ou ΕΡ 1 432 402 /PT 4/8 em que o primeiro agente é cisplatina (ou carboplatina) e o segundo agente é 5-FU ou FUDR, ou em que o primeiro agente é idarubicina e o segundo agente é AraC ou FUDR, ou em que o primeiro agente é oxaliplatina e o segundo agente é 5-FU ou FUDR, ou em que o primeiro agente é irinotecano e o segundo agente é cisplatina (ou carboplatina), ou em que o primeiro agente é gencitabina e o segundo agente é cisplatina (ou carboplatina), ou em que o primeiro agente é metotrexato e o segundo agente é 5-FU ou FUDR, ou em que o primeiro agente é paclitaxel e o segundo agente é cisplatina (ou carboplatina), ou em que o primeiro agente é etoposido e o segundo agente é cisplatina (ou carboplatina), ou em que o primeiro agente é docetaxel ou paclitaxel e o segundo agente é doxorubicina, ou em que o primeiro agente é doxorubicina e o segundo agente é vinorelbina, ou em que o primeiro agente é carboplatina e o segundo agente é vinorelbina, ou em que o primeiro agente é 5-FU ou FUDR e o segundo agente é gencitabina.
16. 16. Composição de acordo com a reivindicação 15, em que o primeiro agente é irinotecano e o segundo agente é 5-FU ou FUDR ou em que o primeiro agente é cisplatina (ou carboplatina) e o segundo agente é 5-FU ou FUDR.
17. 17. Método para preparar uma composição de acordo com a reivindicação 1, método esse que compreende a) a determinação, num ensaio de cultura de células relevantes para a actividade citotóxica ou citostática, de uma proporção molar de um primeiro e um segundo agentes que é não antagonistica ao longo de pelo menos 5% da gama de ΕΡ 1 432 402 /PT 5/8 concentrações em que mais do que 1% das células são afectadas pela referida proporção de agentes, e b) o encapsulamento nos referidos veículos de administração de uma proporção molar de agentes determinada como sendo não antagonística no passo a).
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 17 em que o referido efeito não antagonístico é exibido ao longo de pelo menos 5% da gama de concentrações de modo a que 10-90% das células são afectadas no referido ensaio in vitro.
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 18 em que o referido efeito não antagonístico é exibido ao longo de pelo menos 5% da gama de concentrações de modo a que 20-80% das células são afectadas no referido ensaio in vitro.
20. 20. Método de acordo com a reivindicação 19 em que o referido efeito sinérgico é exibido ao longo de pelo menos 20% da gama de concentrações de modo a que 20-80% das células são afectadas no referido ensaio in vitro.
21. 21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, em que a referida determinação emprega o teste de, pelo menos, uma proporção dos referidos agentes com uma multiplicidade de concentrações e aplicando um algoritmo para calcular um efeito sinérgico, aditivo ou antagonístico para a referida proporção ao longo de uma gama de concentrações.
22. 22. Método de acordo com a reivindicação 21 que emprega o teste de uma multiplicidade de proporções e em que o referido algoritmo é o método do efeito mediano de Chou-Talalay.
23. 23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 22, em que pelo menos um dos agentes é seleccionado do grupo constituído por um agente danificador do ADN, um inibidor da reparação do ADN, um inibidor da topoisomerase I, um inibidor da topoisomerase II, um inibidor do ponto de verificação, um inibidor de CDK, um inibidor de tirosina-quinase receptora, um agente citotóxico, um agente de indução de apoptose, um antimetabolito, um inibidor do controlo do ciclo celular, um lípido terapêutico, um inibidor ΕΡ 1 432 402 /PT 6/8 de telomerase, um agente antiangiogénico, um veneno mitocondrial, um inibidor da transdução de sinal e um agente imunológico.
24. 24. Método de acordo com a reivindicação 23 em que o primeiro agente é um agente citotóxico e o segundo agente é um inibidor do ciclo celular, ou em que o primeiro agente é um agente danificador de ADN e o segundo agente é um inibidor da reparação do ADN, ou em que o primeiro agente é um inibidor da toposiomerase I e o segundo agente é um inibidor do ponto de verificação S/G2 ou G2/M, ou em que o primeiro agente é um inibidor do ponto de verificação Gi/S ou um inibidor de quinase dependente da ciclina e o segundo agente é um inibidor do ponto de verificação G2/M, ou em que o primeiro agente é um inibidor de uma quinase receptora e o segundo agente é um agente citotóxico, ou em que o primeiro agente é um agente indutor da apoptose e o segundo agente é um agente citotóxico, ou em que o primeiro agente é um agente indutor de apoptose e o segundo agente é um agente de controlo do ciclo celular, ou em que o primeiro agente é um inibidor da telomerase e o segundo agente é um inibidor do controlo do ciclo celular, ou em que os primeiro e segundo agentes são antimetabolitos, ou em que os primeiro e segundo agentes são agentes citotóxicos, ou em que o primeiro agente é um lípido terapêutico e o segundo agente é um agente citotóxico, ou em que o primeiro agente é um inibidor de topoisomerase I e o segundo agente é um inibidor da reparação do ADN, ou em que o agente indutor da apoptose é um lípido contendo serina.
25. 25. Método de acordo com a reivindicação 24 em que o primeiro agente é irinotecano e o segundo agente é 5-FU ou FUDR, ou ΕΡ 1 432 402 /PT 7/8 em que o primeiro agente é cisplatina e o segundo agente é 5-FU ou FUDR, ou em que o primeiro agente é idarubicina e o segundo agente é AraC, ou em que o primeiro agente é oxaliplatina e o segundo agente é 5-FU ou FUDR, ou em que o primeiro agente é irinotecano e o segundo agente é cisplatina (ou carboplatina), ou em que o primeiro agente é gencitabina e o segundo agente é cisplatina (ou carboplatina), ou em que o primeiro agente é metotrexato e o segundo agente é 5-FU ou FUDR, ou em que o primeiro agente é paclitaxel e o segundo agente é cisplatina (ou carboplatina), ou em que o primeiro agente é etoposido e o segundo agente é cisplatina (ou carboplatina), ou em que o primeiro agente é docetaxel ou paclitaxel e o segundo agente é doxorubicina, ou em que o primeiro agente é adriamicina e o segundo agente é vinorelbina, ou em que o primeiro agente é carboplatina e o segundo agente é vinorelbina, ou em que o primeiro agente é 5-FU ou FUDR e o segundo agente é gencitabina.
26. 26. Método da reivindicação 25 é é em que o primeiro agente é irinotecano e o segundo agente 5-FU ou FUDR, ou em que o primeiro agente é cisplatina e o segundo agente 5-FU ou FUDR.
27. 27. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, para utilização no tratamento de uma condição de doença num indivíduo.
28. 28. Composição de acordo com a reivindicação 27 em que o indivíduo é um ser humano. ΕΡ 1 432 402 /PT 8/8
29. 29. Composição de acordo com a reivindicação 27 em que o indivíduo é um mamífero não humano ou uma ave. Lisboa,