PT1420830E - Diagnóstico ocular da doença de alzheimer - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "DIAGNÓSTICO OCULAR DA DOENÇA DE ALZHEIMER"

AREA TÉCNICA

Esta invenção refere-se a uma doença neurodegenerativa.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A doença de Alzheimer (AD) é uma doença degenerativa progressiva crónica do envelhecimento e é um dos principais contribuintes para a morbidez e mortalidade nos idosos. A AD é actualmente responsável por cerca de 70% de todos os casos de demência e afecta cerca de 2-4 milhões de americanos. Tantos como 9 milhões de americanos podem ter AD até ao ano 2050. Estudos epidemiológicos calcularam que se a AD pudesse ser adiada por 5 anos, a incidência e prevalência da AD seria reduzida a metade. O desenvolvimento e realização de futuras terapêuticas para a AD vai depender do diagnóstico sensível e precoce da doença. Embora se conheça muito sobre a doença, não estão actualmente disponíveis meios de diagnóstico precoce ou tratamento eficaz.

Os meios actualmente disponíveis para o diagnóstico da doença de Alzheimer são póstumos, baseando-se na detecção de proteínas amilóides em tecido cerebral. Klunk, W. E. et al.,

Life Sciences, Pergamon Press, Oxford, GB, vol. 69, N° 13, 17 de

Agosto de 2001, páginas 1471-1484, é dirigido a derivados de 1 tioflavina não carregados que se demonstrou que se ligam a proteínas amilóides em tecido cerebral.

Skovronsky Daniel M. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, National Academy of Science, Washington, DC, US, vol. 97, N° 13, 30 de Junho de 2000, páginas 7609-7614, é dirigido a um radioligando, BSB, que se demonstrou que se liga a placas amilóides num modelo de murganho da doença de Alzheimer e que se demonstrou ser capaz de ligação a depósitos de Αβ no seio do tecido cerebral. O documento US-Bl-6168776 descreve derivados não azo de crisamina G capazes de se ligarem a proteínas amilóides em parênquima cerebral. O documento WO 99/08695 descreve péptidos Αβ amilóides agregantes que estão ligados covalentemente (por exemplo, num resíduo de aminoácido cisteína) a um marcador fluorescente. O documento US 5837473 descreve um péptido β-amilóide marcado ou um fragmento activo marcado de um péptido β-amilóide e métodos de utilização dos péptidos marcados para rastreio de agentes que afectam a deposição do péptido marcado em placas amilóides em amostras de tecidos evidenciando a presença de amiloidose de Alzheimer.

SUMARIO A invenção proporciona compostos para utilização num método não invasivo para detecção precoce e fiável de AD ou um estado neurodegenerativo pré-mórbido. O método de diagnóstico é 2 realizado fazendo contactar um tecido ocular de um mamífero, e. g., um humano, com um composto marcado de forma detectável que se liga a uma proteína amilóide, por exemplo, β-amilóide (Αβ) . Por "proteína amilóide" entende-se uma proteína ou péptido que está associado a uma placa senil neurítica de AD. De um modo preferido, a proteína amilóide é a proteína precursora de amilóide (APP) ou um produto de clivagem proteolítica de ocorrência natural. Os produtos de clivagem da APP incluem Αβ1-40, Αβ2-40, Αβ1-42, bem como Αβ oxidada ou reticulada. Os compostos ligam-se a variantes de APP e Αβ de ocorrência natural, incluindo variantes polimórficas de um único nucleótido (SNP). Um aumento da ligação do composto a um tecido ocular, e. g., um compartimento intracelular de uma célula do cristalino, em comparação com um nível de ligação de controlo normal indica que o mamífero está a sofrer ou está em risco de desenvolver AD. De um modo preferido, o composto liga-se a Αβ1-42 ou outro fragmento de uma proteína precursora de amilóide (APP). Os compostos ligam-se, de um modo preferido, a proteínas amilóides em comparação com outras proteínas contendo folhas pregueadas β. De um modo preferido, o composto marcado detectável contém uma sonda fluorescente. Por exemplo, a sonda fluorescente ou fluoróforo é um composto de Crisamina ou derivado de Crisamina, tal como {(trans, trans)-l-bromo-2,5-bis(3-hidroxicarbonil-4-hidroxi)estirilbenzeno (BSB)}.

Os compostos são úteis em métodos para o rastreio farmacológico in vivo para identificar compostos que inibem a acumulação de Αβ no olho e cérebro, para estadiamento da gravidade da AD pré-mórbida, diagnóstico, prognóstico e monitorização das respostas do doente à terapêutica da AD com fármacos. 0 grau de agregação de Αβ na região cortical do olho é directamente proporcional a depósitos neuropatológicos de Αβ no 3 cérebro.

Um tecido ocular de um indivíduo de teste é contactado com o composto, deixado penetrar em células na região do cristalino do olho e a fluorescência é medida. A região cortical do olho é avaliada por varrimento de fluorescência. Alternativamente, o humor aquoso, i. e., o líquido transparente entre a córnea e o cristalino do olho é submetido a varrimento. Um aumento de, pelo menos, 10% em relação à fluorescência do cristalino de um indivíduo do controlo normal (após a administração por sonda) indica AD ou predisposição para ela. Um valor de controlo normal tipicamente corresponde a pouca ou nenhuma ligação da sonda no tecido do cristalino. O nível normal de fluorescência do cristalino é o nível de fluorescência detectado após fazer contactar o olho de um indivíduo (ou população de indivíduos) normal sem AD com o composto marcado detectável que se liga a Αβ. O valor é opcionalmente obtido por determinação da média ou de uma média dos valores derivados de um conjunto de indivíduos conhecidos por estarem livres de AD (bem como sem história familiar ou sem predisposição genética conhecida para a mesma). Se a sonda utilizada emitir luz na gama de autofluorescência do cristalino humano normal (gama azul-verde), o nível de autofluorescência é calculado na leitura. Por exemplo, um aumento de 10% da fluorescência (após administração da sonda), comparado com o nível na ausência da sonda (autofluorescência) indica um estado patológico ou uma predisposição para o desenvolvimento de um estado neuropatológico. De um modo preferido, para cada indivíduo é estabelecida a autofluorescência na linha de base (antes da administração da sonda). 4

Um nível de diagnóstico de fluorescência é, de um modo preferido, pelo menos, 25%, de um modo mais preferido, pelo menos, 50%, de um modo mais preferido, pelo menos, 100% superior a um valor de controlo normal. Por exemplo, a detecção de fluorescência da sonda específica de Αβ, que é superior 2 vezes ou mais a um valor de controlo normal, indica um estado patológico. Uma vez que o tecido do cristalino humano normal autofluoresce na gama azul-verde (495 nm/520 nm), de um modo preferido, a sonda emite um comprimento de onda de luz fora do espectro azul-verde. Por exemplo, a sonda fluorescente emite um comprimento de onda de luz superior a 520 nm, e. g., fluorescência na gama do vermelho, vermelho-alaranjado ou infravermelho. Alternativamente, a sonda emite um comprimento de onda inferior a 450 nm, e. g., na gama do violeta ou ultravioleta (UV).

Um método para o prognóstico da Doença de Alzheimer inclui os passos de (a) fazer contactar tecido ocular de um mamífero com um composto que se liga a um polipéptido amilóide; (b) quantificar a ligação do compostos ao tecido ocular; e (c) comparar o nível de ligação com um nivel de controlo normal de ligação. Os níveis aumentados de ligação ao longo do tempo indicam um prognóstico adverso. O teste de fluorescência do cristalino do doente após a administração da sonda é comparado com a autofluorescência endógena de um indivíduo (ou população de indivíduos) sem AD ou com o nível de fluorescência de um indivíduo sem AD (ou população de indivíduos sem AD) após administração da sonda. Os métodos também são utilizados para estadiamento de gravidade da doença, monitorizar as respostas ao tratamento com fármacos e fazer o rastreio de fármacos quanto à capacidade para inibir a acumulação de Αβ. Um nível de fluorescência aumentado (indicador de acumulação cortical de Αβ 5 no cristalino) indica um estádio mais avançado de AD. Uma redução do nivel de fluorescência (indicador de acumulação cortical de Αβ no cristalino) ao longo do tempo indica que um determinado fármaco inibe a acumulação de Αβ e indica uma resposta clinica positiva ao tratamento com fármaco.

Também estão incluídos na invenção os compostos de ligação a Αβ marcados detectáveis que emitem luz fora da gama do azul-verde. Por exemplo, os compostos de ligação são sondas fluorescentes que emitem luz a comprimentos de onda entre 550-700 nm. Os compostos contêm vermelho Texas ou um seu derivado.

Os compostos, e. g., ligandos polipeptidicos, compostos orgânicos ou compostos inorgânicos, são isolados ou purificados. Uma composição "isolada" ou "purificada" está substancialmente isenta de material celular ou de outras proteínas contaminantes da fonte de células ou tecidos dos quais é derivada, ou substancialmente isenta de precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizados quimicamente. De um modo preferido, uma preparação de um composto, e. g., um composto de ligação a Αβ fluorescente é, pelo menos, 75%, de um modo mais preferido, 80%, de um modo mais preferido, 85%, de um modo mais preferido, 90%, de um modo mais preferido, 95%, de um modo mais preferido, de 98% e, de um modo muito preferido, 99 ou 100% do peso seco da preparação. "Fluorescência" é o fenómeno em que energia luminosa ("luz excitante") é absorvida por uma molécula, resultando em que a molécula fica "excitada". Após um intervalo predeterminado, tal como 1 minuto a 24 horas, a energia da luz absorvida é emitida pela molécula excitada. O comprimento de onda da luz emitida é 6 tipicamente a um comprimento de onda mais longo do que o da luz excitante. Esta luz emitida é referida como luz fluorescente. Uma molécula que apresenta fluorescência é referida como um "fluoróforo". A relação entre os comprimentos de onda da luz e o grau de excitação de um determinado fluoróforo a esse comprimento de onda é descrita pelo "espectro de excitação" do fluoróforo. 0 espectro de excitação também é chamado gama de comprimento de onda de excitação. A relação entre o comprimento de onda da luz e da intensidade da emissão de fluorescência a esse comprimento de onda é descrita pelo espectro de emissão ou espectro de fluorescência do fluoróforo. 0 espectro de emissão também é chamado a gama de comprimento de onda emitido. 0 máximo de excitação é o comprimento de onda da luz excitante ao qual a fluorescência do fluoróforo atinge intensidade máxima. 0 máximo de emissão é o comprimento de onda da luz emitida pelo fluoróforo excitado quando a sua fluorescência está na intensidade máxima. A maioria dos fluoróforos excitados por luz visível e que emitem luz visível têm um espectro de emissão sobreposto ao seu espectro de excitação, embora o máximo de cada um seja diferente. A distância em nanometros entre o máximo do espectro de excitação e o máximo do espectro de emissão é conhecida como o "desvio de Stokes". Os fluoróforos com desvios de Stokes grandes na gama do visível funcionam melhor nesta invenção. Por exemplo, é preferido um fluoróforo com um máximo de excitação de 400 nm e um máximo de emissão de 700 nm com pouca ou nenhuma sobreposição entre os espectros.

Os métodos aqui descritos oferecem várias vantagens em relação a abordagens existentes para o diagnóstico da AD. Em primeiro lugar, o método é realizado ante-mortem e identifica 7 com exactidão e fiabilidade a acumulação de Αβ em tecidos vivos. Antes da invenção, a detecção fiável de depósitos era feita a partir do estudo de amostras de autópsia dos cérebros de doentes com AD. Em segundo lugar, o método é não invasivo; não é necessária biópsia de tecido. 0 método utiliza sondas fisiologicamente compatíveis. Além disso, o próprio processo de varrimento leva apenas alguns segundos, e. g., 30 segundos a minutos. Finalmente, a especificidade e sensibilidade de detecção é elevada devido ao padrão anatómico único da acumulação de Αβ, i. e., a região cortical do cristalino num estado não doente é caracterizada por pouca ou nenhuma acumulação/agregação de proteínas. Mesmo pequenas quantidades de acumulação de proteína Αβ é estável e facilmente detectável nesta região do olho.

Outras características, objectivos e vantagens da invenção serão evidentes a partir da descrição e desenhos.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA

Os compostos para utilização nos métodos de diagnóstico ocular aqui descritos facilitam o diagnóstico, prognóstico e monitorização da AD e distúrbios neurodegenerativos relacionados, que são mediados pela acumulação de proteínas amilóides. O processo da doença envolve a acumulação patogénica de péptidos Αβ em regiões vulneráveis do cérebro. A invenção baseia-se na constatação de que estes mesmos péptidos Αβ se acumulam como microagregados nas células oculares e, em particular, dentro da região cortical do cristalino em doentes com AD. Além da acumulação no córtex do olho, a Αβ acumula-se no humor aquoso do olho, e. g., na câmara anterior. A progressão da doença leva à morte celular e acumulação de péptidos Αβ extracelulares. A agregação de proteínas pode progredir para o desenvolvimento de uma catarata relativamente rara (catarata "supranuclear" ou cortical profunda). Essas cataratas supranucleares foram detectadas num modelo de murganho transgénico da ad e em cristalinos post-mortem de doentes humanos com confirmação neuropatológica da AD. Os compostos para utilização nos métodos da invenção são ferramentas para monitorizar a agregação e acumulação de Αβ no cristalino como um biomarcador para eventos semelhantes que ocorrem em compartimentos cerebrais muito menos acessíveis. A crisamina G e os seus derivados são conhecidos na técnica (e. g., patentes U.S. N° 6133259; 6168776; 6114175). Estes compostos ligam-se a péptidos Αβ, mas não são fluorescentes. Os métodos de diagnóstico utilizam um derivado de crisamina G que se liga a amilóides, altamente lipófilo e fluorescente, para detectar os péptidos Αβ no olho. Após contactar o tecido ocular com uma sonda específica de Αβ, o varrimento não invasivo utilizando técnicas fluorométricas oculares revela o grau de ligação. Os fluorímetros oculares e outros dispositivos de imagiologia do olho são conhecidos na técnica (e. g., patentes U.S. N° 6198532 e 6013034) .

Os métodos tiram partido de sondas fluorescentes lipófilas biodisponíveis. Esses fluoróforos e sondas estão disponíveis comercialmente, e. g., de Molecular Probes, Inc., Eugene, OR. Alguns corantes, e. g., X-34 ou {(trans, trans)-l-bromo-2,5-bis(3-hidroxicarbonil-4-hidroxi)estirilbenzeno (BSB)} (Styren et al., 2000, J. Histochem. 48: 1223-1232; Link et al., 2001 Neurobiol. Aging 22: 217-226, e Skrovonsky et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97: 7609-7614) foram utilizados para 9 analisar o tecido cerebral (mas não o tecido ocular). Estas sondas emitem luz na gama do azul-verde, por isso o nivel de fluorescência, o que é relevante para o diagnóstico, excede a quantidade da autofluorescência do cristalino humano na gama do azul-verde.

As sondas utilizadas nos métodos de diagnóstico ligam-se especificamente a Αβ e proteínas associadas a Αβ em relação a outras proteínas ou polipéptidos contendo folhas β. As sondas são aplicadas no olho em forma líquida ou de pomada. A lipofilia dos compostos facilita a penetração das estruturas intervenientes. Os compostos ligam-se com grande avidez a acumulações de Αβ dentro do cristalino e outras estruturas oculares. Por exemplo, os compostos são formulados numa solução com um excipiente, e. g., DMSO, para melhorar a penetração nos tecidos e células do composto fluorescente de ligação a Αβ. Após contacto do olho com o composto, o composto é deixado penetrar nos tecidos oculares durante um período de tempo, e. g., 1 minuto a 5 horas, antes do varrimento fluorescente do olho. De um modo preferido, o olho é contactado com o composto durante, pelo menos, uma hora antes do varrimento fluorométrico. 0 olho pode ser contactado com a sonda durante até um dia ou mais antes do varrimento. Análises raciométricas e outras de sinais fluorofotométricos antes e depois da aplicação ocular e distribuição das sondas fluorescentes dentro de subregiões específicas das estruturas oculares revelam quantitativamente o grau e localização de acumulações de Αβ. associadas ao estado de doença AD. Um aumento da quantidade de péptidos Αβ acumulados comparado com um valor normal de controlo indica um estado neurodegenerativo, tal como a AD. A região do cristalino em que se forma a catarata 10 supranuclear associada à AD não está predisposta a formar agregados de peso molecular elevado em comparação com a região nuclear do cristalino. Além disso, as proteínas do cristalino, uma vez formadas, são excepcionalmente estáveis durante períodos de tempo longos. Assim, as proteínas e péptidos no cristalino não são prontamente eliminados e tendem a acumular-se, ao passo que no cérebro estão envolvidos vários mecanismos na eliminação de péptidos Αβ nocivos. Assim, a situação única dos Αβ do cristalino promove a acumulação precoce relativamente ao cérebro. Esta propriedade do cristalino aumenta a exactidão e fiabilidade de detecção da agregação e acumulação mediada por Αβ. muito cedo no decurso da doença (e. g., antes do aparecimento de sintomas cognitivos ou neurológicos evidentes).

Proteínas amilóides A AD é caracterizada por lesões oxidativas graves e acumulação patológica de proteína insolúvel em regiões vulneráveis do cérebro. Os péptidos Αβ amilóides tóxicos são geralmente considerados como os principais participantes patogénicos na AD. Estes vários péptidos são gerados por clivagem de uma proteína maior chamada a proteína precursora β-amilóide (APP) (Selkoe et al., 2000, Annal. of N. Y. Acad. Sei. 924: 17-25). As proteínas chamadas presenilinas (PSl, PS2) podem mediar a clivagem. Outras proteínas associadas a placas neuríticas incluem as enzimas β-amilóide secretase I e II (BASE I e II) que se associam às proteínas amilóides. Alguns dos péptidos Αβ. resultantes são mais tóxicos do que outros. Crê-se que a elevação de péptidos Αβ. específicos no cérebro está causalmente associada a todas as formas conhecidas da AD. Esta "hipótese Αβ" genericamente aceite afirma que a geração, 11 deposição e/ou acumulação de Αβ. no cérebro é uma importante via comum final que está subjacente ao processo da doença neste distúrbio neurológico devastador.

As proteínas amilóides (Αβ, APP, PS1, PS2) também são expressas no cristalino de mamíferos. A agregação de Αβ. ocorre no interior e no exterior das células, dependendo do estado de progressão da doença neurodegenerativa. A Αβ é capaz de interactuar de forma aberrante com proteínas do cristalino, tais como as α-cristalinas de longa duração. Os métodos de diagnóstico aqui descritos são baseados nas seguintes observações: i) os péptidos Αβ. acumulam-se em subregiões específicas do cristalino, ii) os péptidos Αβ. promovem de forma potente a agregação das proteínas do cristalino, e iii) uma catarata zonular supranuclear profunda distintiva está associada à sobreexpressão de Αβ. num modelo animal bem caracterizado de AD, o murganho transgénico Tg2576 mutante de APP com formação de placas amilóides e em cristalinos post-mortem derivados de doentes humanos que foram diagnosticados independentemente e neuropatologicamente com AD.

Detecção fluorescente de acumulação de proteína associada a AD no olho

Os dados aqui descritos indicam que o exame in vivo de proteínas do cristalino dá informações relevantes de diagnóstico sobre a acumulação de Αβ, que não podem ser obtidos de órgãos menos acessíveis, tal como o cérebro. Uma vantagem significativa destes métodos é que são não invasivos. Os métodos não invasivos são úteis no rastreio de fármacos in vivo, diagnóstico, prognóstico e monitorização de respostas dos doentes com AD para 12 intervenção terapêutica. A técnica tira partido de uma sonda de ligação a Αβ de alta afinidade lipófila fluorescente, tal como {(trans, trans)-l-bromo-2, 5-bis-(3-hidroxicarbonil-4-hidroxi) estirilbenzeno (BSB)}. Este composto (assim como os derivados de ligação a Αβ..fluorescentes lipófilos) é aplicado no olho e deixado distribuir-se no cristalino.

Ao contrário de outros métodos, que utilizam sondas amilofilicas relativamente não especificas, e. g., Vermelho do Congo ou tioflavina, os presentes métodos utilizam sondas que são altamente especificas para péptidos Αβ. As outras sondas amilofilicas ligam-se a estruturas de proteínas em folha β..presentes no olho, enquanto as sondas à base de Crisamina se ligam especificamente a Αβ e outros fragmentos de APP. A crisamina G e outro derivado de ligação a amilóides de Vermelho do Congo são úteis como a unidade de ligação ao amilóide da sonda; um marcador detectável, e. g., um fluoróforo, está ligado para permitir o varrimento fluorescente. A crisamina e outros derivados de Vermelho do Congo ligam-se a proteínas amilóides através de uma fixação bidentada que abrange várias cadeias peptídicas amilóides. A quantidade de ligação a Αβ ao longo do eixo óptico é monitorizada por técnicas fluorofotométricas de varrimento. A fluorescência ao longo do eixo óptico é medida antes da aplicação da sonda para determinar a linha de base da autofluorescência. A fluorescência é então medida novamente após a aplicação da sonda. A fluorescência é medida na região cortical profunda supranuclear do cristalino anterior e posterior, bem como na região nuclear. A razão de fluorescência cortical para fluorescência nuclear antes da aplicação da sonda é comparada com a razão após a aplicação da sonda. Por exemplo, 13 a razão da fluorescência cortical para a fluorescência nuclear antes da aplicação da sonda é de 2:2; após a aplicação da sonda, a razão é de 10:2. A comparação indica a acumulação de Αβ (e um diagnóstico da AD ou uma predisposição para o desenvolvimento de AD). Um valor normal de controlo minimo ou fluorescência não detectável na região cortical após a administração da sonda. A ligação de uma sonda de ligação a Αβ fluorescente lipófila, como indicado por um sinal fluorescente aumentado na região do cristalino cortical em comparação com a região nuclear, dá uma métrica que está correlacionada com a presença ou ausência da doença. O grau de acumulação de Αβ é maior e mais rápido dentro do cristalino em comparação com outros tecidos. Esta acumulação é indicadora do estádio da doença, í. e., uma maior acumulação está directamente correlacionada com um estádio da AD mais avançado ou um estado neurodegenerativo relacionado. A magnitude da fluorescência acima da autofluorescência da linha de base está correlacionada com a gravidade da doença. Estes dados de ligação servem como um indicador biológico ou biomarcador da deposição de Αβ dentro do cérebro.

As sondas especificas de Αβ são lipófilas e relativamente não carregadas. Em contraste, as sondas de anticorpos ou fragmentos de anticorpos não são adequadas no ensaio, devido à sua grande massa molecular e carga. A natureza lipófila das sondas medeia o acesso eficiente aos tecidos do olho e através da barreira lipófila do olho e das membranas celulares de estruturas oculares. Além disso, a lipofilia facilita o acesso aos compartimentos intracelulares das células na região do cristalino do olho. Este aspecto das sondas é crítico para a detecção precoce da doença, porque nos estádios iniciais da AD, a Αβ acumula-se dentro das células, em vez de extracelularmente. Só à medida que a doença progride e as células morrem, é que as 14 acumulações extracelulares ou placas se tornam evidentes.

Além das sondas descritas acima, que emitem luz na região do azul-verde do espectro da luz, os métodos também utilizam outras sondas que emitem um sinal fluorescente fora (mais longo ou mais curto) da gama da autofluorescência normal do cristalino (495 nm/520 nm) . Vários fluoróforos moleculares pequenos são conjugados a compostos de ligação a amilóides, e. g.,

Crisamina G ou clioquinol, utilizando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, são utilizados fluoróforos de comprimento de onda longo, e. g., Vermelho de Texas e os seus derivados. Esses corantes permitem o varrimento a comprimentos de onda, e. g., na gama do infravermelho longínquo, sem interferência da autofluorescência normal do cristalino.

Exemplo 1: Formação de cataratas associadas à AD A acumulação de Αβ avançada nos tecidos oculares leva à formação de cataratas. Ao contrário do cérebro, a região do cristalino do olho a ser varrida é caracterizada por baixa renovação das proteínas. As proteínas do cristalino são estáveis e não são eliminadas durante décadas. Assim, a produção acrescida de proteínas APP, e. g., péptidos Αβ são detectados logo no início da progressão da doença e permanecem estáveis e detectáveis durante períodos de tempo longos.

A AD é caracterizada pela acumulação cerebral de agregados de proteína constituídos por péptidos Αβ. Antes ou concomitantemente com a acumulação de péptidos Αβ no cérebro, os péptidos são acumulados e detectáveis em tecidos oculares. A 15 formação de cataratas (supranucleares) corticais profundas associada à AD foi agora detectada em cristalinos de humanos doentes de AD post-mortem e murganhos transgénicos Tg2576 com formação de placas amilóides.

Os péptidos Αβ do cristalino foram analisados utilizando fotomicroscopia de lâmpada de fenda, microscopia electrónica (ME) com imunomarcação por ouro de Αβ, transferência de Western quantitativa, co-imunoprecipitação e turbidometria in vitro. Os cristalinos de casos de AD confirmados neuropatologicamente mostram cataratas na região supranuclear do cristalino. Em indivíduos de controlo normais, a formação de cataratas nesta região é rara. A acumulação de Αβ e as cataratas supranucleares foram detectadas post-mortem em tecidos do cristalino de doentes com AD e em murganhos transgénicos Tg2576, um modelo da AD humana reconhecido na técnica. Estudos por ME de cristalinos de humanos com AD mostrou aglomerados de microagregados imunorreactivos de Αβ dentro do citoplasma das células das fibras corticais. A maioria dos Αβ do cristalino está associada a outras proteínas incluindo Αβ-cristalina. Os Αβ promovem de forma potente a agregação de proteínas no cristalino humano através de mecanismos oxidativos dependentes de metais vestigiais.

Estes dados indicam que a agregação intracelular de proteínas Αβ leva à formação de cataratas supranucleares. A acumulação de agregados no cristalino associados a Αβ ocorre no início da AD e permanece in situ. Assim, o cristalino proporciona uma "janela molecular" acessível perifericamente sobre os processos amiloidogénicos cerebrais. As abordagens não invasivas de diagnóstico e monitorização para quantificar Αβ no olho permitem a identificação precoce e fiável da AD, dos 16 doentes com AD subclínica ou que têm predisposição para desenvolver um estado neurodegenerativo como a AD.

Exemplo 2: Perfis amiloidoqénico, citotóxico e redox dos péptidos Αβ

As cataratas relacionadas com a idade (ARC) e a doença de Alzheimer (AD) são caracterizadas por lesão oxidativa e acumulação patológica de proteina agregada. Os péptidos Αβ e as proteínas associadas a AD são expressos no cristalino. As reacções das metaloproteínas estão correlacionadas com os perfis amiloidogénico, citotóxico e redox dos diferentes péptidos Αβ. A contribuição dos péptidos Αβ e química de metaloproteínas para a agregação de proteínas do cristalino foi estudada como se segue. Cristalinos de murganhos transgénicos Tg+ (contra Tg-) com placas amilóides e espécimes humanos foram examinados por fotomicroscopia de lâmpada de fenda e analisados por transferência de Western quantitativa, ME e imuno-histoquímica. Estudos de agregação in vitro foram realizados por incubação da proteína solúvel total (TLP) do cristalino com péptidos Αβ sintéticos, quelantes, captadores de antioxidantes, seguidos pela análise da densidade óptica, transferência de Western e ensaios correntes de amilóides.

Os dados indicaram que: 1) Αβ e APP são expressos no cristalino; 2) Αβ é encontrado como espécies monoméricas, oligoméricas, reticuladas e agregadas; 3) os murganhos transgénicos Tg2576 mutantes de APP desenvolvem cataratas "zonulares" supranucleares bilaterais; 4) a agregação de TLP in vitro depende de metais vestigiais e de espécies de oxigénio 17 reactivo (ROS) e 5) Αβ, especialmente Αβ1-42 humana altamente amiloidogénica, potência acentuadamente a agregação de TLP de um modo dependente de metais/ROS e especifica dos péptidos. A Αβ1-42 em cristalinos contribui para a cataratogénese e é indicadora de AD ou de uma predisposição para ela. Os dados também sugerem que os processos que contribuem para o desenvolvimento da AD e ARC estão bioquimicamente ligados.

Metais, tais como o cobre, zinco e ferro ficam fortemente associados a Αβ. Os metais colocalizam-se com acumulações ou placas de Αβ. Consequentemente, um agente quelante de metal fluorescente lipófilo, e. g., clioquinol, é útil para detectar depósitos de Αβ na região cortical do cristalino. Os compostos de ligação a metais são utilizados sós (desde que apresentem fluorescência detectável) ou são modificados por fixação de um fluoróforo para conferir ou aumentar a fluorescência. As sondas de ligação a amilóides e de metais aqui descritas podem ser administradas terapeuticamente para evitar a agregação de proteínas.

Outras formas de realização estão dentro das reivindicações anexas.

Lisboa, 13 de Abril de 2011 18

Claims (17)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto lipófilo marcado de forma detectável compreendendo um fluoróforo que se liga a proteína amilóide em tecido ocular para utilização num método de diagnóstico da doença de Alzheimer num mamífero, compreendendo o diagnóstico fazer contactar o tecido ocular com o composto, em que um aumento da ligação do referido composto ao referido tecido ocular em comparação com um nível de ligação normal de controlo indica que o referido mamífero sofre de doença de Alzheimer ou está em risco de desenvolver a mesma.
2. 2. Composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido fluoróforo emite um comprimento de onda de luz fora do espectros azul-verde.
3. 3. Composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido fluoróforo emite um comprimento de onda de luz superior a 520 nm.
4. 4. Composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido fluoróforo emite um comprimento de onda na gama do infravermelho.
5. 5. Composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido fluoróforo emite um comprimento de onda inferior a 450 nm.
6. 6. Composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido fluoróforo é um composto de Crisamina. 1
7. 7. Composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido composto se liga, de um modo preferido, a um polipéptido de β-amilóide .(Αβ)
8. 8. Composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido composto se liga de, modo preferido, a Αβ (1-42).
9. 9. Composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido fluoróforo é {{trans, trans)-l-bromo-2,5-bis-(3-hidroxicarbonil-4- hidroxi)estirilbenzeno (BSB)}.
10. 10. Composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido diagnóstico compreende a imagiologia de uma região cortical de um olho.
11. 11. Composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido diagnóstico compreende a imagiologia de uma região supranuclear de um olho.
12. 12. Composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido diagnóstico compreende a imagiologia de uma região do humor aquoso de um olho.
13. 13. Composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido aumento é, pelo menos, 10% superior ao referido valor de controlo normal.
14. 14. Composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido aumento é, pelo menos, 25% superior ao referido valor de controlo normal. 2
15. 15. Composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido aumento é, pelo menos, 50% superior ao referido valor de controlo normal.
16. 16. Composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido aumento é, pelo menos, 100% superior ao referido valor de controlo normal.
17. 17. Composto lipófilo marcado de forma detectável compreendendo um fluoróforo que se liga a proteina amilóide em tecido ocular, para utilização na determinação do prognóstico da doença de Alzheimer num mamifero, compreendendo a determinação do prognóstico fazer contactar o tecido ocular com o composto, a quantificação da ligação do composto ao tecido ocular e a comparação do nível de ligação com o nível normal de controlo, em que a detecção de um aumento na ligação do composto ao tecido ocular em comparação com um nível de ligação normal de controlo ao longo do tempo indica um prognóstico desfavorável. Lisboa, 13 de Abril de 2011 3