PT1407052E - Método para a expressão melhorada de proteínas em bactérias por monitorização e modulação da dobragem das proteínas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"MÉTODO PARA A EXPRESSÃO MELHORADA DE PROTEÍNAS EM BACTÉRIAS POR MONITORIZAÇÃO E MODULAÇÃO DA DOBRAGEM DAS PROTEÍNAS"

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a um método novo para melhorar a expressão funcional de proteínas de acordo com o qual o processo de dobragem é monitorizado por medição em linha e, se necessário, a dobragem da proteína é influenciada pela adição de agentes promotores de dobragem e/ou co-expressão da chaperona periplasmática Skp. A este respeito, a invenção oferece uma tecnologia para melhorar o rendimento de proteínas recombinantes funcionalmente expressas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A sobre-expressão de produtos genéticos recombinantes no periplasma de Escherichia coli está frequentemente associada a proteínas não dobradas ou incorrectamente dobradas e podem envolver a degradação por proteases celulares. Além disso, a fuga descontrolada ou lise de células, provocada por dobragem incorrecta pode inibir os processos fermentação directamente ou por um excesso de espuma. Portanto, têm sido desenvolvidas várias estratégias para melhorar as propriedades de expressão e dobragem de proteínas no periplasma de Escherichia coli. Em primeiro lugar, uma expressão e dobragem bem-sucedidas de proteínas recombinantes estão intimamente ligadas à escolha de sequências reguladoras óptimas, por exemplo potência do promotor, sítios de ligação de ribossomas e péptidos sinal1-3. A aplicação de estratégias de dobragem refere-se principalmente ao fornecimento de agentes promotores de 2 dobragem4 10, à co-expressão de chaperonas moleculares e à adição de catalisadores de dobragem11-15.

Os agentes promotores de dobragem tais como glicina, betaina e hidroxiectoína são protectores de proteínas conhecidos na técnica48-50 . Duma maneira geral julga-se que estes compostos não reforçam a conformação da proteína por ligação específica como o faria um substrato ou um inibidor. 0 efeito estabilizador destes compostos tem sido atribuído principalmente à sua exclusão da superfície da proteína, levando desse modo a uma 'hidratação preferencial' da proteína ou 'exclusão preferencial' do aditivo da superfície da proteína. No entanto, o fenómeno de estabilização é muito complexo e, tem sido referido, que não existe um mecanismo único responsável pela estabilização mas uma multiplicidade de interacções de estabilização e desestabilização além do mecanismo de exclusão preferencial.

Além da utilização de agentes promotores de dobragem extrínsecos, a proteína pode ser ela própria melhorada por modelação molecular ou evolução directa, aqui e noutros casos as experiências realizadas utilizaram fragmentos de

, 1C_1Q anticorpo scFv

Tem de se referir que nenhuma das estratégias individuais é geralmente bem sucedida e, por conseguinte, a dobragem de proteínas tem de ser melhorada sequencialmente e numa abordagem caso a caso. Isto requer tecnologias para a monitorização directa da dobragem, as quais são idealmente independentes de ensaios funcionais. A actual invenção fornece a solução técnica para este problema. 3

Ao contrário de trabalhos recentes 20,21 a invenção utiliza a resposta de stress natural à proteína incorrectamente dobrada no periplasma de Escherichia coli, regulada por duas vias parcialmente sobrepostas, a resposta sigma E e o sistema de transdução de sinal Cpx24. A Sigma E está fortemente regulada por três genes, rseA, rseB e rseC25. A proteína transmembranar RreA detecta e transmite informação para a sigma E, regulada negativamente pela interacção com a RseB periplasmática e positivamente pela RseC, respectivamente, localizadas na membrana interior. 0 sistema de transdução de sinal de dois componentes Cpx consiste de uma histidina-cinase de sensor de membrana CpxA e um regulador de resposta citoplasmático CpxR. A proteína incorrectamente dobrada leva à autofosforilação de CpxA seguida de uma fototransferência para o CpxR, permitindo que o CpxR funcione como um activador de transcrição27-29. A resposta da sigma E e do Cpx induz vários genes envolvidos na dobragem e degradação de proteínas no caso de dobragem periplasmática incorrecta. 0 sistema de transdução de sinal Cpx coordena a activação de DsbA, PpiA e PpiD27'30, enquanto a sigma E regula a transcrição de pelo menos 10 produtos genéticos, incluindo sete sigma E, sigma 32 e fkpA31~33. Apenas a degP (htrA) é regulada por ambos os sistemas, indicando que a degP é um elemento central na gestão da dobragem periplasmática incorrecta36-40 . A este respeito, a invenção demonstra, entre outros aspectos, que um sistema repórter baseado no promotor de degP é muito adequado para estudos cinéticos de dobragem incorrecta de proteínas no periplasma de Escherichia coli e permite uma utilização eficaz em combinação com estratégias de dobragem de proteínas diferentes. 4

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A acumulação de proteína não dobrada ou incorrectamente dobrada no periplasma de Escherichia coli leva à indução da protease periplasmática fortemente regulada degP, bem conhecida. Com base no promotor A de degP e num gene repórter de luciferase foi desenvolvida uma tecnologia de medição em linha, que permite estudos cinéticos in vivo de dobragem incorrecta de proteína durante processos de fermentação. A tecnologia foi validada por expressão periplasmática de um minianticorpo recombinante específico para o receptor de EGF humano. Através da realização de várias estratégias de alimentação com agentes promotores de dobragem e co-expressão da chaperona periplasmática Skp, nós demonstramos que a quantidade de proteína funcional é indirectamente proporcional ao sinal em linha da luciferase, que representa a proteína incorrectamente dobrada. A este respeito, a tecnologia oferece uma ferramenta simples para avaliar e melhorar o rendimento de proteínas funcionalmente expressadas no periplasma, dependendo da estratégia de dobragem utilizada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Uma vez que muitas proteínas eucariotas também retêm a sua actividade biológica intacta numa forma pós-tradução não modificada, a sua expressão funcional em Escherichia coli é uma estratégia estabelecida. Infelizmente, a dobragem correcta de proteínas recombinantes no periplasma de Escherichia coli é mal compreendida e interfere frequentemente com a expressão de proteína funcional. Para atacar este problema, esta invenção apresenta uma nova tecnologia que permite estudos cinéticos in vivo de dobragem incorrecta de proteína. A tecnologia ajuda a compreender e a monitorizar quando e sob que condições 5 ocorre a dobragem incorrecta, permitindo desse modo implementar estratégias para melhorar a dobragem da proteína alvo. A tecnologia da invenção baseia-se no promotor da protease periplasmática DegP bem conhecida, a qual desempenha uma função chave na gestão da dobragem incorrecta de proteínas periplasmáticas. A este respeito, trabalhos antecedentes implicam que a resposta a proteínas periplasmáticas incorrectamente dobradas após um choque térmico e acima de 42 °C seja comparável ao stress provocado por proteínas recombinantes incorrectamente dobradas sobre-expressadas23, 31,45,46 A monitorização em linha durante os processos de fermentação foi realizada utilizando luciferase luc+ como um gene repórter muito sensível como parte de um módulo de detecção que permite uma análise num tempo total de 90 s. Esta resolução elevada das medições requer um tempo de semivida curto do produto do gene repórter. Devido à semivida longa da proteína de fluorescência verde (GFP), esta proteína não é aplicável, no entanto constatou-se, de um modo inesperado, que a Luc+ é especialmente útil. Nós determinados uma semivida de cerca de 5 minutos à nossa temperatura da fermentação de 26° C. Deste modo é garantida uma correlação próxima entre a actividade da luciferase e a quantidade da enzima correspondente à proteína incorrectamente dobrada. De modo interessante e inesperado, o nosso resultado indica que a luciferase pode difundir através da parede celular da Escherichia coli. Assim pode realizar-se uma determinação rápida da actividade sem qualquer ruptura da célula. 6 A utilização de pOUôl como vector de codificação da cassete repórter degP-luciferase (que resulta em pltl) origina vantagens adicionais43'44. A uma temperatura inferior a 30 °C uma origem RI geneticamente modificada regula fortemente o número de cópias a uma cópia por célula, levando a uma dose de gene comparável à do cromossoma de Escherichia coli. O local par codificado impede a perda de plasmideo durante a divisão celular. A origem RI é compatível com o derivado colEl utilizado num segundo plasmideo co-transformado para a expressão de minianticorpos recombinantes. Além disso, a utilização de pltl num sistema plasmideo duplo permite investigações semelhantes de proteínas adicionais sem quaisquer passos de clonagem adicionais.

Trabalhos recentes descreveram um método para uma monitorização da dobragem in vivo e um ensaio de dobragem de proteínas para proteínas citoplasmaticas ' . Estes métodos baseiam-se numa fusão de uma proteína repórter à proteína alvo. A GFP ou o fragmento α da β-galactosidase (para se conseguir uma complementação α com o fragmento ω maior) pode ser utilizado como proteínas repórteres. Ambos os métodos são viáveis para proteínas diferentes, mas a construção de proteínas de fusão requer que a extremidade correspondente da proteína alvo esteja acessível. Além disso as propriedades de dobragem da proteína alvo não podem ser diminuídas pela fusão da proteína. A este respeito a tecnologia proporcionada nesta invenção tem vantagens importantes em relação à técnica antecedente. Nomeadamente, a utilização da resposta de stress nativa para proteínas incorrectamente dobradas permite estudos da dobragem de uma proteína alvo durante a expressão 7 recombinante sem quaisquer factores de influência adicional. Além disso o efeito da dobragem incorrecta de proteínas pode ser estudado de um modo cinético. Deste modo não só podem ser melhoradas as propriedades de dobragem da proteína alvo, como podem ser geneticamente optimizadas as sequências reguladoras e adaptados os parâmetros de processo durante a fermentação. 0 termo "dobragem funcionalmente correcta" significa, de acordo com a invenção, que a proteína expressada por um processo recombinante tem uma dobragem (estrutura terciária) que permite que a proteína esteja completa ou essencialmente activa em relação à sua função proposta. A monitorização da cinética de dobragem incorrecta foi avaliada expressando um minianticorpo recombinante específico para o receptor de EGF humano com e sem a adição de agentes promotores de dobragem e co-expressão da chaperona molecular Skp, respectivamente. Estas condições pareceram interessantes porque trabalhos recentes referiram que o sorbitol e betaína geram um microambiente periplasmático que suporta a dobragem de proteínas a concentrações mais elevadas5'10. Em contraste com esta estratégia, Bothmann e Pliickthun, 1998, demonstraram para vários fragmentos scFv, que uma co-expressão da chaperona periplasmática Skp melhora claramente as suas quantidades funcionais47. Ambas as estratégias realizadas na presente invenção levaram a um aumento claro do rendimento funcional do minianticorpo anti-EGFR. A diminuição recíproca nítida na quantidade de proteína incorrectamente dobrada foi simultaneamente indicada pelo sinal da luciferase.

Além do mais, nós observamos uma correlação directa entre o aumento do sinal da luciferase 2h após indução do minianticorpo e a cinética do produto dependendo da estratégia de alimentação utilizada e da co-expressão de Skp, respectivamente. De modo interessante, existe um aumento menor no sinal da luciferase se for co-expressada Skp. Isto pode ser explicado pelo funcionamento da Skp como uma chaperona periplasmática, porque a co-expressão de Skp é regulada pelas suas próprias sequências reguladoras caracterizadas por um sitio de ligação putativo para o factor CpxR41. 0 CpxR é conhecido como um activador da transcrição do sistema de transdução de sinal de dois componentes Cpx que participa na resposta de stress periplasmático27~29. Observou-se um forte aumento do sinal da luciferase se a Skp não fosse expressada. Por outro lado, uma alimentação de agentes promotores de dobragem dentro de um intervalo de tempo curto de 30 min, directamente após o aumento do sinal da luciferase cessou aumentos posteriores do sinal da luciferase, seguindo-se-lhe um nivel constante durante o resto do processo de fermentação. Isto implica que o fornecimento de agentes promotores de dobragem conduz a um melhoramento rápido da dobragem da proteína, enquanto a Skp melhora a dobragem independente da quantidade de proteína incorrectamente dobrada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1:

Sequência do promotor de degP de acordo com Wurgler e

Richardson32. Para se obter o sítio iVcol para a clonagem de luc+ a A próximo do códão de partida foi substituída por uma C (indicada com um asterisco). A parte inferior mostra o iniciador para a amplificação da degP por PCR. 9

Figura 2: Módulo de detecção para uma monitorização em linha da actividade da luciferase.

Figura 3:

Os níveis basal e máximo do sistema repórter, que determinam a actividade da luciferase sob condições de não indução e de indução, respectivamente.

Figura 4: A influência de estratégias de alimentação diferentes na dobragem da proteína, utilizando uma solução de alimentação que resulta numa concentração no meio de 6% de sorbitol e 2,5 mM de betaína.

Figura 5: A influência de uma co-expressão da chaperona periplasmática Skp na dobragem da proteína.

Figura 6:

Cinética de formação de minianticorpos funcionais dependendo da estratégia de alimentação utilizada e da co-expressão de Skp.

Figura 7

Plasmídeo repórter de DegP-luciferase pltl e plasmídeo de expressão pTAKFEC, pTAKFECU e pTAKFECTU. Os plasmídeos de expressão diferem em sequências lac P/0 modificadas.

Figura 8

Variantes do promotor do plasmídeo de expressão pTAKFEC (Piac_c) r pTAKFECU (Piac_cu) e pTAKFECTU (Piac_cTu) em comparação com a sequência nativa do Promotor lac (Piac_nativ) · 10

Figura 9 A luminescência correlaciona com a força promotora dos plasmídeos de expressão utilizados.

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Os Exemplos seguintes descrevem a invenção em mais pormenor sem a limitar.

Exemplo 1

Construções de vector. O vector de expressão do minianticorpo pTAKFECU é derivado dos vectores de expressão anteriormente descritos p41FEGlT3 e ρΑΚΙΟΟ3. O vector pTAKFECU contém o gene de resistência ao cloranfenicol (cat) de ρΑΚΙΟΟ e o promotor forte de lacUV5, introduzidos por mutagénese direccionada por meio do estojo de fagemideo Muta-Gene™ (BioRad Laboratories, Richmond, E.U.A.). O plasmídeo que co-expressa Skp pHBFECU foi derivado inserindo o fragmento MluI-HindlII do pTAKFECU que codifica o promotor de lacUV5 e o minianticorpo anti-EGFR no ρΗΒΙΙΟ47. O gene da luciferase de pSG-luc+ (Promega GmbH, Alemanha) foi inserido no pTrc99A (Amersham Pharmacia Biotech, Alemanha) através dos sítios de restrição Ncol e XbaI resultando em pTrc-luc+. Para construir o plasmídeo repórter da degP-luciferase pltl, inseriu-se um poliligador sintético possuindo os sítios de clonagem para o telómero 17 tHP (ΚρηΙ, Nsi I)42, ο promotor de degP (Nsi I, Nco I) e o gene repórter de luciferase luc+ (NcoI, XbaI) nos sítios FcoRI e HindIII do pUC18, resultando em pUC18PL. 0 telómero tHP foi obtido de pTAKFECU. 0 promotor de degP foi clonado após amplificação por PCR do ADN genómico de Escherichia coli MG1655 (N° ATCC 47076) (os iniciadores são representados na Fig. 1). 0 produto de PCR inclui a sequência de ADN completa desde o códão de paragem do gene dGTPase (dgt) localizado a montante da degP até ao códão de arranque de degP (Fig. 1) . O gene da luciferase luc+ foi obtido de pSGluc+. A cassete repórter de luciferase resultante foi clonada em pOU6141 através dos sítios de restrição únicos FcoRI e BamRI, originando o vector repórter de degP-luciferase pltl.

Exemplo 2 A concepção do vector repórter de degP-luciferase pltl baseia-se no plasmídeo pOU6141. A sua origem RI geneticamente modificada é compatível com o derivado colE 1 utilizado no segundo plasmídeo transformado para a expressão de proteína recombinante. A cassete de luciferase contém o promotor de degP (sequência de ADN completa desde o códão de paragem do gene de dGTPase (dgt) localizado a montante de degP até ao códão de arranque da degP) e a jusante seguido do gene repórter de luciferase luc+ (Fig. 1). Além disso nós inserimos um telómero tHP (diminui a leitura de transcrição de genes localizados a montante em ate cinco vezes ) a montante da degP. A cassete degP-luciferase resultante foi clonada em pOU61, obtendo-se desse modo o vector pltl.

Exemplo 3 18

Determinação da actividade da luciferase em suspensões celulares de Escherichia coli. Nós construímos o plasmídeo pTrc-luc+, permitindo uma indução da luciferase com IPTG, para desenvolver um ensaio funcional para a determinação da actividade luciferase em Escherichia coli. Foram feitas várias abordagens para determinar a actividade da luciferase, incluindo a ruptura de células por ultra-sons e tratamento com várias concentrações de tolueno para tornar a parede celular mais permeável à luciferina. Afortunadamente, as células não tratadas apresentam uma actividade da luciferase comparável às células rompidas. Isto indica que a luciferina pode difundir através da parede celular da Escherichia coli. A este respeito, nós determinamos a actividade da luciferase em ensaios subsequentes adicionando directamente solução tamponada de luciferina à suspensão das células. 0 sinal de luciferase medido foi referido como unidades relativas de luciferase (RLU).

Exemplo 4

Dispositivo de detecção para monitorização em linha da actividade da luciferase. 0 sistema de amostragem baseia-se numa derivação do fermentador ligada a uma bomba peristáltica. A amostragem foi iniciada com uma pré-diluição contínua da sonda do fermentador utilizando NaCl a 0,9%. Várias experiências indicaram uma proporção de pré-diluição óptima de 1:50, dependendo da densidade de células no ponto de partida das medições (no nosso caso OD55o=90). É necessária uma diluição adicional que proporcione uma OD55o=0,4 constante e exacta para a monitorização em linha da actividade da luciferase. Isto foi conseguido desenvolvendo um controlador de OD consistindo de um fotómetro de caudal para determinar a OD efectiva da pré- 19 diluição e um computador portátil para calcular a velocidade da bomba de amostragem e da bomba de diluição. A amostra diluída foi misturada com uma solução tamponada de luciferina utilizando uma outra bomba com uma velocidade constante e injectada num luminómetro de caudal para determinar a actividade da luciferase. 0 tempo total de uma análise foi de 90 s (Fig. 2).

Exemplo 5 A cultura de elevada densidade celular (HCDC) foi realizada num biorreactor de 10L sob agitação de acordo com Horn et al.1 utilizando um meio de glucose e sal mineral. Todas as fermentações foram realizadas nas mesmas condições incluindo uma temperatura de 26 °C, uma OD55o=0,2 de partida e a adição de IPTG a OD55o=90. Além disso, as pré-culturas foram inoculadas com reservas da mesma cultura-mãe em glicerol. O fornecimento de glucose foi realizado utilizando uma análise de injecção de caudal de glucose permitindo um crescimento não restringido das células durante toda a fermentação para evitar qualquer stress adicional. Após um período de cultura de 29 h, incluindo um período de indução de 5 h, nós alcançamos densidades celulares finais numa gama de OD55o=110 correspondentes a biomassas secas de 25gL~1 (Fig. 3-5) .

Exemplo 6 A monitorização em linha de proteína incorrectamente dobrada foi analisada por expressão de um minianticorpo recombinante específico para o receptor de EGF humano. O minianticorpo consiste do fragmento scFv com uma charneira fundida na extremidade C seguida de um motivo hélice-volta-hélice, o qual homodimeriza in vivo. O minianticorpo é codificado pelo plasmídeo pTAKFECU derivado dos nossos 20 vectores de expressão p41FEGlT e pAKlOO anteriormente descritos3. A expressão foi realizada em Escherichia coli RV308 (N° ATCC 31608). Esta estirpe é especialmente adequada para HCDC devido à sua velocidade de formação de acetato marcadamente reduzida. Escherichia coli RV308 foi co-transformado com pTAKFECU e o vector repórter de degP-luciferase pltl como um sistema de plasmídeo duplo para avaliar a proporção de minoanticorpos incorrectamente dobrados.

Os níveis basal e máximo de actividade da luciferase foram determinados para avaliar a gama de trabalho do nosso sistema. Para este efeito, uma primeira fermentação sob condições não indutoras foi comparado com uma expressão induzida por IPTG do minianticorpo. As actividades da luciferase foram determinadas a cada 15 minutos. As medições foram começadas a uma densidade celular de OD550=75 para ambas as fermentações, mas a indução do minianticorpo na segunda fermentação começou 30 minutos depois a uma OD55o=90. Para a cultura não induzida foi determinado apenas um baixo nível basal de cerca de 40 unidades relativas de luminescência (RLU) durante toda a fermentação. Na primeira fase após indução do minianticorpo, o sinal de luciferase era comparável à da cultura não induzida. Em contraste, nós obtivemos um aumento forte no sinal da luciferase 2 h após indução, correspondendo à cinética de formação do produto do minianticorpo funcional (Fig. 3, Fig. 6). Nós testamos três estratégias de alimentação diferentes, utilizando uma solução de alimentação que resulta numa concentração no meio de 6% de sorbitol e 2,5 mM de betaína para determinar a influência de agentes promotores de dobragem na proporção de minianticorpo incorrectamente 21 dobrado. 0 sinal da luciferase atingiu apenas o nível basal quando a alimentação ocorreu no início da fermentação ou simultaneamente à indução. No entanto, quando a solução de alimentação foi adicionada 2 h após a indução, correspondendo ao início da formação de produto houve um aumento no sinal da luciferase comparável ao da cultura induzida sem qualquer alimentação, seguido de um nível constante de cerca de 170 RLU durante o resto da cultura (Fig. 4).

Além disto, nós analisamos a influência a co-expressão da chaperona periplasmática Skp na expressão do minianticorpo. Para este efeito, a sequência de ADN do minianticorpo incluindo a região promotora lacUV5 e a sequência sinal pelB foi clonada no pHBUO que codifica a Skp. O plasmídeo pHBFECU resultante foi co-transformado com pltl na Escherichia coli RV308. De modo semelhante a ambos a cultura sem e com fornecimento de agentes promotores de dobragem no início da formação de produto, nós obtivemos o aumento no sinal da luciferase 2 h após a indução. Em contraste com estas culturas, na co-expressão de Skp o aumento obtido no gradiente foi menor e atingiu um máximo de 230 RLU comparável apenas com o fornecimento de solução promotora de dobragem no início da formação de produto (Fig. 5).

Exemplo 7

Monitorização em linha da actividade da luciferase. O sistema de amostragem utilizado para a monitorização em linha da actividade da luciferase está ilustrado na Fig.2. A derivação a partir do fermentador foi realizada por uma bomba peristáltica (504U, Watson Marlow, Falmouth, Inglaterra) seguida de uma pré-diluição contínua da amostra 22 do fermentador com NaCl a 0,9% numa proporção de 1:50 utilizando uma bomba peristáltica de quatro canais MS-CA4/840 (Ismatec GmbH, Wertheim-Mondfeld, Alemanha). O controlador de OD baseia-se num fotómetro de caudal (VIS Jenway 6300, Jenway Inc., Princeton, E.U.A.) para determinar a OD efectiva da pré-diluição e um computador portátil para calcular a velocidade da bomba de amostragem e de diluição (bombas peristálticas ISM Reglo 12/100, Ismatec GmbH, Wertheim-Mondfeld, Alemanha). Os valores foram calculados utilizando o software Dasylab (GBMmbH, Mõnchengladbach, Alemanha). Uma amostra do fermentador com uma OD550nm=0,4 constante foi misturada com uma solução de luciferina numa proporção de 1:1. Para este efeito 5 mg de sal de sódio da D-luciferina foi dissolvido em 1250 μΗ de H2O. 100 μ]1, desta solução foram adicionados a 9,9 mL de tampão de luciferina, contendo Tricina 25 mM, MgCl2 15 mM, ATP 5 mM, Mercaptoetanol 7 mM e 5 mg de BSA a pH 7,8. São necessários 0,5 mL da solução de luciferina para uma análise. A actividade da luciferase foi medida com um detector de luminescência de caudal LEO (Wallac GmbH,

Freiburg, Alemanha) e calculada utilizando o software Dasylab (GBMmbH, Mõnchengladbach, Alemanha). 0 sinal de luciferase medido foi referido como unidades relativas de luciferase (RLU).

Exemplo 8

Ensaio miniaturizado para optimização da correspondente expressão da proteína e monitorização da dobragem da proteína. O princípio básico descrito para monitorizar e optimizar a proteína foi adaptado a microvolumes para o trazer para o formato de uma placa microtítulo ou até mais pequeno. O sistema de ensaio compreendia o minianticorpo anti-EGFR. Como descrito acima o plasmídeo repórter pltl 23 com os plasmídeos pTAKFEC, pTAKFECU e pTAKFECTU foram utilizados para co-transformar Escherichia coli K12 RV308. 0 plasmideo compreendia variantes dos promotores de lac, permitindo desse modo a expressão diferencial do minianticorpo como se mostra na Figura 7 e 8. A medição da actividade luciferase da proteína repórter pltl indicou que a porção de proteína incorrectamente dobrada correlacionava com o promotor individual utilizado como se mostra na Figura 9. Assim o sistema repórter pltl codificado pelo plasmideo é útil para optimizar a expressão relativamente ao promotor individual a ser seleccionado. A cultura das placas microtítulo foi realizada em 100 μΕ de meio de sal mineral (Horn et al., 1996 a uma temperatura de 26 °C utilizando um agitador de placas microtítulo com aquecimento - Thermostar (Fa. DMG Medizintechnik GmbH, Offenburg, Alemanha). A inoculação das placas de reprodução foi realizada utilizando 10 μύ de uma solução-mãe de Glicerol das estirpes individuais. Os resultados são mostrados na (Fig. 3) e foram obtidos de triplicados. A estimativa da actividade da Luciferase foi medida depois de adicionar 100 μΕ de Luciferina-Lõsung e foi medida com um leitor de quimioluminiscência Victor 1420 Multilabel Counter (Fa. Wallac GmbH, Freiburg, Alemanha). Para medir a cinética dada na Figura 9 a actividade da luciferase foi avaliada em culturas paralelas aos pontos no tempo indicados.

Exemplo 9

Correlação do sinal da luciferase com a proporção de minianticorpos funcionais. A quantidade de minianticorpos funcionais foi determinada utilizando um ELISA, com base no 24 domínio extracelular do receptor de EGF humano. Amostras de células que expressam o minianticorpo foram analisadas às 0 h, 1,5 h, 3,0 h e 4,5 h para se obter uma cinética do produto. Os resultados mostram um rendimento claramente melhorado de minianticorpos funcionais, dependendo da estratégia de alimentação utilizada para os agentes promotores de dobragem (Fig. 6). Isto indica que o sinal de luciferase determinado para o minianticorpo incorrectamente dobrado é indirectamente proporcional à quantidade de minianticorpos funcionais.

Exemplo 10

Determinação quantitativa da quantidade funcional de minianticorpos. As quantidades de minianticorpos anti-EGFR funcionais foram determinadas por um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) funcional de acordo com Horn et al.1 utilizando o domínio extracitoplasmático do EGFR humano (Merck KgaA, Darmstadt, Alemanha).

Lisboa, 25 de Fevereiro de 2009

Claims (19)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para monitorizar a dobragem funcionalmente correcta ou dobragem incorrecta de uma proteína alvo in vivo num processo recombinante compreendendo a aplicação de um gene repórter, que está sob o controlo do promotor da protease DegP periplasmática, a um sistema de expressão que expressa a referida proteína alvo, em que a produção do produto genético do gene repórter no referido sistema de expressão é uma medição da dobragem incorrecta da proteína alvo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência promotora de DegP está modificada na proximidade do códão de arranque do gene repórter o qual está fundido com o promotor na direcção a jusante.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o referido promotor de DegP tem a sequência como indicada na Figura 1.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 3, em que o gene repórter é o gene da luciferase (luc+) .

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que é utilizada uma cassete genética DegP - luc+ clonada num vector. 2

6. Método da reivindicação 5, em que o referido vector é o pltl compreendendo as sequências de ADN como especificado na Figura 7.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 6, em que a produção do produto do gene repórter é monitorizada por um processo de medição cinético em linha.

8. Método para optimizar a dobragem funcionalmente correcta de uma proteína alvo num processo de expressão e fermentação compreendendo (i) monitorização da dobragem da referida proteína alvo de acordo com um método de qualquer uma das reivindicações 1 até 7, (ii) modulação da dobragem da proteína por co-expressão da chaperona Skp periplasmática e/ou adição de um ou mais agentes que promovem a dobragem funcionalmente correcta da proteína, e opcionalmente (iii) repetição dos passos (i) e (ii) até se obter um óptimo de proteína dobrada de um modo funcionalmente correcto.

9. Método da reivindicação 8, em que o referido agente de promoção da dobragem é um poliol e/ou um derivado de betaína.

10. Método da reivindicação 9, em que o referido agente de promoção da dobragem é seleccionado do grupo consistindo de glicerol, sorbitol, glicina betaína, hidroxiectoína. 3

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 até 10, em que é utilizado um sistema de expressão bacteriano.

12. Método da reivindicação 11, em que o referido sistema de expressão bacteriano é E. coli.

13. Método da reivindicação 12, em que a referida E-coli é RV308 (ATCC 31608).

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 até 13, em que é utilizado um sistema plasmídeo duplo consistindo de um primeiro plasmídeo compreendendo os genes promotor / repórter e um segundo plasmídeo compreendendo o gene que codifica a proteína alvo cuja dobragem deverá ser optimizada quando expressada.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 até 14, em que a monitorização e modulação são realizadas em linha e simultaneamente durante a fase de produção.

16. Método de produção de uma proteína alvo recombinante possuindo propriedades de dobragem optimizadas cultivando células hospedeiras bacterianas num nutriente e isolando e purificando a referida proteína alvo dobrada optimizada, em que o referido método compreende um método de qualquer uma das reivindicações 8 até 15.

17. Método da reivindicação 16, em que a referida proteína alvo é uma proteína de fusão. 4

18. Método da reivindicação 17, em que a referida proteína de fusão é um Fv de cadeia simples e/ou minianticorpo.

19. Um estojo para a expressão de uma proteína alvo possuindo propriedades de dobragem melhoradas num sistema de célula hospedeira bacteriana consistindo de uma primeira embalagem compreendendo um plasmídeo contendo o gene da referida proteína alvo, uma segunda embalagem compreendendo um plasmídeo contendo a cassete genética DegP - luc+, e uma terceira embalagem contendo as células hospedeiras bacterianas, as quais são transformadas com os referidos plasmídeos. Lisboa, 25 de Fevereiro de 2009