JP2004533261A - タンパク質の折りたたみを監視および調節することにより細菌におけるタンパク質の発現を改善する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、オンライン測定により折りたたみ過程を監視し、折りたたみ促進剤の添加および／またはペリプラズムシャペロン(Skp)の同時発現によって、必要に応じてタンパク質の折りたたみに影響を与えることによる機能性タンパク質の発現を改善するための新規方法に関する。この点において、本発明は機能的に発現される組み換えタンパク質の収量を改善するための技術を提供する。
Description
【技術分野】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、オンライン測定により折りたたみ過程を監視し、必要に応じて折りたたみ促進剤を添加することおよび／またはペリプラズムシャペロンSkpの同時発現によってタンパク質の折りたたみに影響を与えることによる機能性タンパク質の発現を改善する新規方法に関する。この点において、本発明は、機能的に発現される組み換えタンパク質の収量を改善するための技術を提供する。
【０００２】
（発明の背景）
大腸菌のペリプラズムにおける組み換え遺伝子産物の過剰発現は折りたたまれていないタンパク質または誤って折りたたまれたタンパク質を伴うことが多く、細胞性プロテアーゼによる分解を伴うことがある。さらに、無統制な漏出または細胞の溶解が誤った折りたたみにより引き起こされ、発酵過程を直接または泡の溢れによって妨げる可能性がある。したがって、大腸菌のペリプラズムにおけるタンパク質の発現および折りたたみ特性を改善するためにいくつかの方策が開発されてきた。まず、組み換えタンパク質の発現および折りたたみの成功は、最適な制御配列、たとえばプロモーター長、リボソーム結合部位およびシグナルペプチドの選択と密接な関係がある1〜3。折りたたみ方法の応用例は、主に折りたたみ促進剤を供給すること4〜10、分子シャペロンの同時発現および折りたたみ触媒を添加すること11〜15に言及している。
【０００３】
グリシン、ベタインおよびヒドロキシエクトイン(hydroxyectoine)などの折りたたみ促進剤は、当技術分野で知られているタンパク質保護剤である48〜50。一般に、これらの化合物は、基質または阻害剤と同様に特異的結合によってタンパク質の高次構造を強化することはないと考えられている。これらの化合物の安定化効果は、主にタンパク質表面からのそれら化合物の排除によるもので、タンパク質の「優先的水和」またはタンパク質表面からの添加剤の「優先的排除」をもたらすとされている。しかしながら、安定化現象はかなり複雑な現象であり、安定化を担う単一の機序が存在するのではなく、優先的排除機構のほかに多くの安定化および不安定化相互作用が存在することが指摘されている。
【０００４】
外因性の折りたたみ促進剤を用いるほかに、分子モデリングあるいは定方向進化によってタンパク質自体を改良することができ、本明細書および他の特許ではｓｃＦｖ抗体断片を用いて実験が行われてきた16〜19。
【０００５】
個々の方策が一般にすべて成功するものではないため、タンパク質の折りたたみを経時的におよびその場その場で改善しなければならないことが指摘されている。それには折りたたみを直接監視する技術が必要であり、機能アッセイと独立しているのが理想的である。本発明は、この問題に対する技術的解答を提供する。最近の研究20、21と対照的に、本発明は、２つの部分的に重複する経路、シグマＥ反応およびＣｐｘシグナル伝達系24によって制御される大腸菌のペリプラズムにおける誤って折りたたまれたタンパク質に対する自然なストレス反応を用いている。シグマＥは、３つの遺伝子ｒｓｅＡ、ｒｓｅＢおよびｒｓｅＣ25によって厳重に調節されている。膜貫通型タンパク質ＲｓｅＡはシグマＥへの情報を感知および伝達し、内膜に存在するペリプラズムＲｓｅＢとの相互作用によって負に、ＲｓｅＣによって正にそれぞれ制御されている。Ｃｐｘ二成分シグナル伝達系は、膜センサーヒスチジンキナーゼＣｐｘＡおよび細胞質反応制御因子ＣｐｘＲからなる。誤って折りたたまれたタンパク質はＣｐｘＡの自己リン酸化と、続くＣｐｘＲへのリン酸基転移(phosphotransfer)をもたらし、ＣｐｘＲを転写活性化因子27〜29として機能させる。シグマＥとＣｐｘ反応は共に、ペリプラズムにおける誤った折りたたみの場合にタンパク質の折りたたみおよび分解に関与するいくつかの遺伝子を誘導する。Ｃｐｘシグナル形質導入システムは、ＤｓｂＡ、ＰｐｉＡおよびＰｐｉＤ27、30の活性化を調整し、一方シグマＥは、シグマＥ、シグマ32およびｆｋｐＡ31〜35さえも含む少なくとも10個の遺伝子産物の転写を制御する。両方の系で制御されるのはdegP(htrA)のみであり、degPがペリプラズムにおける誤った折りたたみの取扱いにおける中心要素であることを示している36〜40。この点において、とりわけ本発明の態様は、大腸菌のペリプラズムにおけるタンパク質の誤った折りたたみの速度論的研究には、degPプロモーターをベースとするリポーター系が極めて適しており、さまざまなタンパク質折りたたみ方法との効果的併用を可能にすることを明らかにしている。
【０００６】
（発明の開示）
大腸菌のペリプラズムにおける折りたたまれていないタンパク質または誤って折りたたまれたタンパク質の蓄積は、よく知られている厳重に制御されたペリプラズムプロテアーゼdegPの誘導につながる。DegPプロモーターおよびルシフェラーゼリポーター遺伝子をベースとしてオンライン測定技術を開発し、発酵過程中のタンパク質の誤った折りたたみのin vivoにおける速度論的研究を可能にした。この技術は、ヒトＥＧＦ受容体に特異的な組み換えミニ抗体(miniantibody)のペリプラズムにおける発現によって実証した。折りたたみ促進剤によるさまざまな供給方法およびペリプラズムシャペロンSkpの同時発現を実施し、機能性タンパク質の量が、誤って折りたたまれたタンパク質を意味するオンラインのルシフェラーゼシグナルと間接的に比例することを立証した。この点において、本技術は、用いた折りたたみ方法に応じ、ペリプラズムにおいて機能的に発現されたタンパク質の収量を評価および改善するための簡単なツールを提供する。
【０００７】
（発明の詳細な説明）
多くの真核タンパク質は翻訳後の非修飾体で完全な生物活性を保持しているため、大腸菌における機能性発現は確立された方法である。残念なことに、大腸菌のペリプラズムにおける組み換えタンパク質の正確な折りたたみは不明なところが多く、機能性タンパク質の発現を妨害することが多い。この問題に取り組むため、本発明は、タンパク質の誤った折りたたみのin vivoにおける速度論的研究を可能にする新たな技術を提示している。この技術は、誤った折りたたみが何時およびどんな条件で生じるかを理解および監視し、標的タンパク質の折りたたみを改善するための方法を実施するのに役立つ。
【０００８】
本発明の技術は、ペリプラズムにおけるタンパク質の誤った折りたたみの取扱いに重要な役割を果たしているよく知られているペリプラズムプロテアーゼDegPのプロモーターをベースとしている。この点において、従来の研究は、42℃以上の熱ショック後の誤って折りたたまれたペリプラズムにおけるタンパク質に対する反応が、過剰発現された誤って折りたたまれた組み換えタンパク質23、31、45、46によって引き起こされるストレスに匹敵することを暗示している。
【０００９】
発酵過程中のオンライン監視は、合計時間90秒の分析を可能にする検出モジュールの一部に極めて感度の良いリポーター遺伝子としてルシフェラーゼｌｕｃ+を用いることによって実現された。測定のこの高分解能には、半減期の短いリポーター遺伝子産物が必要である。緑色蛍光タンパク質(GFP)は半減期が長いために適用しないが、思いがけなくＬｕｃ+が特に有用であることが判明した。我々の測定した半減期は26℃の発酵温度で約５分であった。したがって、ルシフェラーゼ活性と誤って折りたたまれたタンパク質に対応する酵素の量との間の密接な相関関係が保証される。興味深くかつ予想に反して、我々の結果は、ルシフェラーゼが大腸菌の細胞壁を通って拡散できることを示している。したがって、細胞を一切破壊することなく迅速に活性の測定を行うことができる。DegP−ルシフェラーゼリポーターカセット(ｐｌｔ１となる)のコーディングベクターとしてｐＯＵ61を用いるとさらに利点が生まれる43、44。30℃未満の温度では、遺伝子組み換えされたＲ１複製起点は１細胞当たり１回のコピーにおけるコピー数を厳重に制御し、大腸菌染色体に匹敵する遺伝子量をもたらす。コードされたpar遺伝子座は、細胞分裂の間にプラスミド損失を防ぐ。Ｒ１複製起点は、組み換えミニ抗体の発現のために同時形質転換される第２のプラスミド中で用いられるｃｏｌＥ１誘導体と互換性がある。さらに、二重プラスミド系でｐｌｔ１を用いると、クローニングステップを一切追加することなく別のタンパク質を同様に検討することができる。
【００１０】
最近の研究には、in vivoにおいて折りたたみを監視する方法および細胞質タンパク質のタンパク質折りたたみアッセイが記載された20、21。これらの方法はリポータータンパク質と標的タンパク質の融合物をベースにしている。ＧＦＰまたはβ−ガラクトシダーゼのα−断片を(より大きなω−断片によるα−相補作用を達成するため)リポータータンパク質として使用してもよい。両方法はさまざまなタンパク質について実施可能であるが、標的タンパク質の対応する末端に接近可能である融合タンパク質の構築が必要となる。さらに標的タンパク質の折りたたみ特性がタンパク融合によって損なわれてはならない。
【００１１】
この点において、本発明において提供される技術は、従来技術を上回る大きな利点を有している。すなわち、誤って折りたたまれたタンパク質に対する自然なストレス反応の利用により、他の影響要素を一切加えることなく組み換え発現中の標的タンパク質の折りたたみについての研究を可能にする。さらに、タンパク質の誤った折りたたみの影響を速度論的に研究することができる。したがって、標的タンパク質の折りたたみ特性を改善できるばかりでなく、制御配列を遺伝的に最適化し発酵中のプロセスパラメータを適合させることができる。用語「機能的に正確な折りたたみ」は、本発明によれば、組み換え過程によって発現されるタンパク質が、その予定機能に関してタンパク質を完全にまたは本質的に活性にすることが可能な折りたたみ(三次構造)を有することを意味する。
【００１２】
誤った折りたたみの速度の監視は、それぞれ折りたたみ促進剤を添加するか添加せず、および分子シャペロンSkpを同時発現させるか同時発現させずにヒトＥＧＦ受容体に特異的な組み換えミニ抗体を発現することによって評価した。これらの条件が興味深く思えたのは、最近の研究で高濃度のソルビトールおよびベタインがタンパク質の折りたたみを支える微小環境をペリプラズムに生じると報告されたためである5、10。この方策と対照的に、BothmannおよびPluckthunは1998年に、さまざまなｓｃＦｖ断片について、ペリプラズムシャペロンSkpの同時発現がそれらの機能的量をはっきりと改善することを示した47。本発明で行った両方策は、抗ＥＧＦＲミニ抗体の機能的収量にはっきりとした増加をもたらした。誤って折りたたまれたタンパク質量の相反する明確な減少は、ルシフェラーゼシグナルによって同時に示された。
【００１３】
さらに、発明者らは、ミニ抗体の誘導から２時間後のルシフェラーゼシグナルの増加と、それぞれ用いた供給方策およびSkpの同時発現に応じた産物の速度との直接的相関関係を観察した。興味深いことに、Skpが同時発現された場合にはルシフェラーゼシグナルの増加は少ない。このことはSkpのペリプラズムシャペロンとしての機能によって説明できる。なぜなら、Skpの同時発現は、因子ＣｐｘＲ47の推定(putitative)結合部位に特徴的な自分自身の制御配列によって制御されるためである。ＣｐｘＲは、ペリプラズムのストレス反応に関与するＣｐｘ二成分シグナル伝達系の転写活性化因子として知られている27〜29。Skpが発現されない場合にはルシフェラーゼシグナルの強い増加が観察された。一方、ルシフェラーゼシグナルの増加直後から30分以内に折りたたみ促進剤を供給するとルシフェラーゼシグナルの増加が停止し、発酵過程の残りは一定レベルであった。このことは、折りたたみ促進剤の供給はタンパク質の折りたたみの迅速な改善につながるが、Skpは、誤って折りたたまれたタンパク質の量とは関係なく折りたたみを改善することを意味している。
【００１４】
（図面の簡単な説明）
図１：WurglerおよびRichardson32によるdegPプロモーターの配列を示す図である。Ｌｕｃ+のクローニング用にＮｃｏＩ部位を得るため、開始コドンに近いＡをＣで置き換えた(アスタリスクで示す)。下部は、degPのPCR増幅用のプライマーを示す。
【００１５】
図２：ルシフェラーゼ活性のオンライン監視用検出モジュールを示す図である。
【００１６】
図３：非還元条件および還元条件下でそれぞれルシフェラーゼ活性を測定するリポーター系の基礎レベルおよび最大レベルを示すグラフである。
【００１７】
図４：６％ソルビトールおよび2.5 mMベタインの培地濃度となる供給液を用いるタンパク質の折りたたみに対するさまざまな供給方法の影響を示すグラフである。
【００１８】
図５：タンパク質の折りたたみに対するペリプラズムシャペロンSkpの同時発現の影響を示すグラフである。
【００１９】
図６：用いた供給方法およびSkpの同時発現に応じた機能性ミニ抗体の生成速度を示すグラフである。
【００２０】
図７：DegP−ルシフェラーゼリポータープラスミドｐｌｔ１および発現プラスミドｐＴＡＫＦＥＣ、ｐＴＡＫＦＥＣＵおよびｐＴＡＫＦＥＣＴＵ。発現プラスミドは修飾したｌａｃ Ｐ／Ｏ配列が異なることを示す図である。
【００２１】
図８：発現プラスミドｐＴＡＫＦＥＣ(Ｐlac#C)、ｐＴＡＫＦＥＣＵ(Ｐlac#CU)およびｐＴＡＫＦＥＣＴＵ(Ｐlac#CTU)のプロモーター変異体と天然のｌａｃプロモーター(Ｐlac#nativ)配列の比較である。
【００２２】
図９：用いた発現プラスミドのプロモーター強度と相関関係のあるルミネセンスを示すグラフである。
【００２３】
引用文献
【００２４】
【表１】
【００２５】
【表２】
【００２６】
【表３】
【００２７】
【表４】
【００２８】
【表５】
【００２９】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に述べるが、本発明を限定するものではない。
【００３０】
（実施例１）
ベクター構築。ミニ抗体発現ベクターｐＴＡＫＦＥＣＵは、以前に報告した発現ベクターｐ４１ＦＥＧ１Ｔ3およびｐＡＫ1003に由来する。ベクターｐＴＡＫＦＥＣＵは、MutaGene(商標)ファージミドキット(BioRad Laboratories、Richmond、U.S.A.)を使って部位特異的突然変異誘発により導入されたｐＡＫ100のクロラムフェニコール耐性遺伝子(cat)および強力なｌａｃＵＶ５プロモーターを含む。プラスミドｐＨＢＦＥＣＵを同時発現するSkpは、ｌａｃＵＶ５プロモーターおよび抗ＥＧＦＲミニ抗体をコードするｐＴＡＫＦＥＣＵのMluI−HindIII断片をｐＨＢ11047中に挿入することによって得た。制限部位ＮｃｏＩおよびＸｂａＩを介してｐＴｒｃ99Ａ(Amersham Pharmacia Biotech、Germany)中にｐＳＧ−ｌｕｃ+(Promega GmbH、Germany)のルシフェラーゼ遺伝子を挿入すると、ｐＴｒｃ−ｌｕｃ+が得られた。DegP−ルシフェラーゼリポータープラスミドｐｌｔ１を構築するために、ｔＨＰ−ターミネーター(ＫｐｎＩ、ＮｓｉＩ)42のクローニング部位を含む合成ポリリンカー、degP−プロモーター(ＮｓｉＩ、ＮｃｏＩ)およびルシフェラーゼリポーター遺伝子ｌｕｃ+(ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ)をｐＵＣ18のEcoRIおよびHindIII部位に挿入すると、ｐＵＣ18ＰＬが得られた。ｔＨＰ−ターミネーターはｐＴＡＫＦＥＣＵから得た。大腸菌ＭＧ1655(ＡＴＣＣｎｏ.47076)のゲノムDNAからのPCR増幅により(プライマーを図１に示す)degP−プロモーターをクローニングした。PCR産物には、degPから上流に位置するｄＧＴＰアーゼ遺伝子(dgt)の終止コドンからdegPの開始コドンまでの完全DNA配列が含まれる(図１)。ルシフェラーゼ遺伝子ｌｕｃ+は、ｐＳＧ−ｌｕｃ+から得た。得られたルシフェラーゼリポーターカセットを、独自の制限部位EcoRIおよびBamHIを介してｐＯＵ6141中にクローニングすると、degP−ルシフェラーゼリポーターベクターｐｌｔ１が得られた。
（実施例２）
degP−ルシフェラーゼリポーターベクターｐｌｔ１の設計は、プラスミドｐＯＵ6141をベースとしている。その遺伝子組み換えＲ１複製起点は、組み換えタンパク質の発現のために同時形質転換される第２のプラスミド中で用いられるcolE一誘導体と互換性がある。ルシフェラーゼカセットは、degP−プロモーター(degPから上流に位置するｄＧＴＰアーゼ遺伝子(dgt)の終止コドンからdegPの開始コドンまでの完全DNA配列)および下流に続くリポーター遺伝子ルシフェラーゼｌｕｃ+を含む(図１)。この他に、発明者らは、degPの上流にｔＨＰターミネーター(上流に位置する遺伝子の転写読み合わせを５分の１まで減少させる42)を挿入した。得られたdegP−ルシフェラーゼカセットをｐＯＵ61中にクローニングするとベクターｐｌｔ１が得られた。
【００３１】
（実施例３）
大腸菌の細胞懸濁液中のルシフェラーゼ活性の測定。発明者らは、ＩＰＴＧによるルシフェラーゼの誘導を可能にするプラスミドｐＴｒｃ−ｌｕｃ+を構築し、大腸菌におけるルシフェラーゼ活性を測定するための機能アッセイを開発した。ルシフェラーゼ活性を測定するため、超音波処理による細胞破壊および細胞壁をルシフェリンに対してより透過性にするためのさまざまなトルエン濃度による処理を含むいくつかのアプローチを行った。幸いにも、未処理の細胞が破壊細胞に匹敵するルシフェラーゼ活性を示す。このことは、ルシフェリンが大腸菌の細胞壁を通して拡散できることを示している。この点において、発明者らは、細胞懸濁液に緩衝化したルシフェリン溶液を直接添加することにより続くアッセイでルシフェラーゼ活性を測定した。実測されたルシフェラーゼシグナルを相対ルシフェラーゼ単位(RLU)と呼んだ。
【００３２】
（実施例４）
ルシフェラーゼ活性をオンラインで監視するための検出装置。試料採取系は、蠕動ポンプに連結した発酵槽バイパスをベースとしている。試料採取は、0.9％ NaClを用いる発酵槽プローブの連続的前希釈から開始した。いくつかの実験から、測定の開始点における細胞密度(我々の場合はＯＤ550＝90)にもよるが、最適な前希釈比は1:50であることが分かった。ルシフェラーゼ活性をオンラインで監視するためには一定かつ正確なＯＤ550＝0.4が得られる希釈がさらに必要である。これは、前希釈のＯＤを正確に測定するためのフロースルー型光度計ならびに試料ポンプおよび希釈ポンプの速度を算出するためのラップトップ型コンピュータからなるＯＤコントローラーを開発することによって実現した。一定速度の別のポンプを用い、希釈試料を緩衝化したルシフェリン溶液と混ぜ、フロースルー型ルミノメーターに注入してルシフェラーゼ活性を測定した。１回のアッセイの合計時間は90秒であった(図2)。
【００３３】
（実施例５）
高細胞密度培養(HCDC)は、グルコース無機塩培地を用い、Horn他1に従って10 Lの撹拌型バイオリアクター中で行った。すべての発酵は、26℃の温度、開始ＯＤ550＝0.2およびＯＤ550＝90におけるＩＰＴＧの添加を含む同一条件の下で行った。さらに、前培養液(preculture)を同一ストックのグリセロール保存品とともに接種した。グルコースの供給はグルコースのフローインジェクション分析を用いて行い、一切の付加的ストレスを避けるため発酵の間中細胞を無制限に増殖させた。５時間の誘導期を含む29時間の培養時間後、発明者らは、乾燥バイオマス25gL-1に相当するＯＤ550＝110の最終細胞密度を得た(図３〜５)。
【００３４】
（実施例６）
誤って折りたたまれたタンパク質のオンライン監視は、ヒトＥＧＦ受容体に特異的な組み換えミニ抗体の発現によって分析した。ミニ抗体は、Ｃ末端で融合したヒンジと続くヘリックスターンヘリックスモチーフを含むｓｃＦｖ断片からなり、in vivoではホモ二量体化している。このミニ抗体は、我々が以前に報告した発現ベクターｐ41ＦＥＧ１ＴおよびｐＡＫ1003に由来するプラスミドｐＴＡＫＦＥＣＵによってコードされている。発現は大腸菌ＲＶ308(ＡＴＣＣｎｏ.31608)中で行った。この菌株は、酢酸の生成速度が劇的に低下しているためＨＣＤＣに特に適している。二重プラスミド系としてｐＴＡＫＦＥＣＵおよびdegP−ルシフェラーゼリポーターベクターｐｌｔ１により大腸菌ＲＶ308を同時形質転換し、誤って折りたたまれたミニ抗体の比を評価した。
【００３５】
ルシフェラーゼ活性の基礎レベルおよび最大レベルを測定し、発明者らの系の動作範囲を評価した。この目的のため、非還元条件における第１の発酵をミニ抗体のＩＰＴＧ誘発性発現と比較した。ルシフェラーゼ活性は15分ごとに測定した。どちらの発酵についても細胞密度ＯＤ550＝75で測定を開始したが、第２の発酵におけるミニ抗体の誘導はＯＤ550＝90である30分後に開始した。非誘導培養については、発酵の間中約40の相対ルミネセンス単位(RLU)という低い基礎レベルが測定されたに過ぎなかった。ミニ抗体の誘導後の第一相では、ルシフェラーゼシグナルは非誘導培養液に匹敵していた。これとは対照的に、発明者らは、機能性ミニ抗体の産物生成速度に対応するルシフェラーゼシグナルの強い増加を誘導の２時間後に得た(図３、図６)。
【００３６】
発明者らは、６％ソルビトールおよび2.5 mMベタインの培地濃度の得られる供給液を用いて３つの異なる供給方法を試験し、誤って折りたたまれたミニ抗体の比に対する折りたたみ促進剤の影響を測定した。発酵開始時あるいは誘導と同時に供給した場合にはルシフェラーゼシグナルは基礎レベルに達したに過ぎなかった。しかしながら、産物生成の開始に相当する誘導から２時間後に供給液を添加した場合には、供給が一切ない誘導培養に匹敵するルシフェラーゼシグナルの増加があり、培養の残りの時間は約170RLUの一定レベルであった(図４)。
【００３７】
この他に、発明者らは、ミニ抗体発現に対するペリプラズムシャペロンSkpの同時発現の影響を分析した。この目的では、ｌａｃＵＶ５プロモーター領域を含むミニ抗体のDNA配列およびｐｅｌＢシグナル配列を、SkpをコードするｐＨＢ110中にクローニングした。得られたプラスミドｐＨＢＦＥＣＵをｐｌｔ１と共に大腸菌ＲＶ308中に同時形質転換した。産物生成の開始点で折りたたみ促進剤を供給する、および供給しない両培養と同様に、発明者らは、誘導から２時間後にルシフェラーゼシグナルの増加を得た。これらの培養とは対照的に、Skp同時発現では得られた勾配の増加は少なく、産物生成の開始点で折りたたみ促進液を供給する培養にのみ匹敵する230RLUの最大に達した(図５)。
【００３８】
（実施例７）
ルシフェラーゼ活性のオンライン監視。ルシフェラーゼ活性のオンライン監視に用いられる試料採取系を図２に示す。発酵槽バイパスは、蠕動ポンプ(504U、Watson Marlow、Falmouth、England)と、続く４チャンネル蠕動ポンプMS-CA4/840(Ismatec GmbH、Wertheim−Mondfeld、Germany)を用いて0.9％ NaClにより発酵槽試料を1:50の比に連続的に前希釈することによって行った。ＯＤコントローラーは、前希釈のＯＤを正確に測定するためのフロースルー型光度計(VIS Jenway6300、Jenway Inc.、Princeton、U.S.A.)ならびに試料および希釈ポンプ(蠕動ポンプISM Reglo 12/100、Ismatec GmbH、Wertheim‐Mondfeld、Germany)の速度を算出するためのラップトップ型コンピュータをベースとしている。値はソフトウエアDasylab(GBMmbH、Monchengladbach、Germany)を用いて算出した。一定ＯＤ550nm＝0.4の発酵槽試料を1:1の比でルシフェリン溶液と混ぜた。この目的のため、Ｄ−ルシフェリンナトリウム塩５mgをＨ2Ｏ 1250μlに溶かした。この溶液100μlを、pH 7.8において25ｍＭトリシン、15ｍＭ MgCl2、５ｍＭ ATP、７ｍＭメルカプトエタノールおよび５ｍｇ BSAを含有するルシフェリン緩衝液9.9 mlに加えた。１回の分析にルシフェリン溶液0.5 mlが必要である。ルシフェラーゼ活性は、フロースルー型ルミネセンス検出器LEO(Wallac GmbH、Freiburg、Germany)で測定し、ソフトウエアDasylab(GBMmbH、Monchengladbach、Germany)を用いて算出した。実測されたルシフェラーゼシグナルを相対ルシフェラーゼ単位(RLU)と呼んだ。
【００３９】
（実施例８）
平行タンパク質発現を最適化するための小型アッセイおよびタンパク質折りたたみの監視。タンパク質の監視および最適化について述べた基本原理をマイクロ容積に適合させ、マイクロタイタープレート以下の大きさのフォーマットに原理をあてはめた。試験系は抗ＥＧＦＲ−ミニ抗体を含んでいた。前述のように、プラスミドｐＴＡＫＦＥＣ、ｐＴＡＫＦＥＣＵおよびｐＴＡＫＦＥＣＴＵを含むリポータープラスミドｐｌｔ１を用いて大腸菌Ｋ12ＲＶ308を同時形質転換した。このプラスミドはｌａｃプロモーターの変異体を含むため、図７および８に示すようにミニ抗体の差次的発現が可能である。リポータータンパク質ｐｌｔ１のルシフェラーゼ活性を測定すると、図９に示すように、誤って折りたたまれたタンパク質の部分は用いた個々のプロモーターと相関関係があることが判明した。したがって、プラスミドにコードされたｐｌｔ１リポーター系は、選択すべき個々のプロモーターに関して発現を最適化するのに有用である。
【００４０】
マイクロタイタープレート中の培養は、加熱可能なマイクロタイタープレート振盪機−Thermostar (Fa. DMG Medizintechnik GmbH、Offenburg、Germany)を用い26℃の温度において無機塩培地(Horn他、1996) 100μl中で行った。マスタープレートの接種は、個々の菌株のグリセロール原液10μlを用いて行った。結果を(図３)に示す。３回繰り返した。ルシフェラーゼ活性の推定は、ルシフェリン溶液100μlを添加後に測定し、Chemolumineszenzreader Victor1420 Multilabel Counter(Fa. Wallac GmbH、Freiburg、Germany)で測定した。図９に示す速度を測定するため、所定の時点における平行培養でルシフェラーゼ活性を評価した。
【００４１】
（実施例９）
ルシフェラーゼシグナルと機能性ミニ抗体の比との相関関係。ヒトＥＧＦ受容体の細胞外ドメインに基づき、ELISAを用いて機能性ミニ抗体の量を測定した。産物速度を得るため、０時間、1.5時間、3.0時間および4.5時間にミニ抗体を発現する細胞の試料を分析した。用いた折りたたみ促進剤の供給方法にもよるが、結果は、機能性ミニ抗体の収率が明らかに改善したことを示している(図６)。このことは、誤って折りたたまれたミニ抗体について測定されたルシフェラーゼシグナルは、機能性ミニ抗体の量と間接的に比例することを示している。
【００４２】
（実施例10）
ミニ抗体の機能的量の定量的測定。機能性抗ＥＧＦＲミニ抗体の量は、ヒトＥＧＦＲ(Merck KgaA、Darmstadt、Germany)の細胞質外(extracytoplasmic)ドメインを用い、Horn他1に従って機能性酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)によって測定した。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】WurglerおよびRichardson32によるdegPプロモーターの配列を示す図である。Ｌｕｃ+のクローニング用にＮｃｏＩ部位を得るため、開始コドンに近いＡをＣで置き換えた(アスタリスクで示す)。下部は、degPのPCR増幅用のプライマーを示す。
【図２】ルシフェラーゼ活性のオンライン監視用検出モジュールを示す図である。
【図３】非還元条件および還元条件下でそれぞれルシフェラーゼ活性を測定するリポーター系の基礎レベルおよび最大レベルを示すグラフである。
【図４】６％ソルビトールおよび2.5mMベタインの培地濃度となる供給液を用いるタンパク質の折りたたみに対するさまざまな供給戦略の影響を示すグラフである。
【図５】タンパク質の折りたたみに対するペリプラズムシャペロンSkpの同時発現の影響を示すグラフである。
【図６】用いた供給方法およびSkpの同時発現に応じた機能性ミニ抗体の生成速度を示すグラフである。
【図７】DegP−ルシフェラーゼリポータープラスミドｐｌｔ１および発現プラスミドｐＴＡＫＦＥＣ、ｐＴＡＫＦＥＣＵおよびｐＴＡＫＦＥＣＴＵ。発現プラスミドは修飾したｌａｃ Ｐ／Ｏ配列が異なることを示す図である。
【図８】発現プラスミドｐＴＡＫＦＥＣ(Ｐlac#C)、ｐＴＡＫＦＥＣＵ(Ｐlac#CU)およびｐＴＡＫＦＥＣＴＵ(Ｐlac#CTU)のプロモーター変異体と天然のｌａｃプロモーター(Ｐlac#nativ)配列の比較である。
【図９】用いた発現プラスミドのプロモーター強度と相関関係のあるルミネセンスを示すグラフである。
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、オンライン測定により折りたたみ過程を監視し、必要に応じて折りたたみ促進剤を添加することおよび／またはペリプラズムシャペロンSkpの同時発現によってタンパク質の折りたたみに影響を与えることによる機能性タンパク質の発現を改善する新規方法に関する。この点において、本発明は、機能的に発現される組み換えタンパク質の収量を改善するための技術を提供する。
【０００２】
（発明の背景）
大腸菌のペリプラズムにおける組み換え遺伝子産物の過剰発現は折りたたまれていないタンパク質または誤って折りたたまれたタンパク質を伴うことが多く、細胞性プロテアーゼによる分解を伴うことがある。さらに、無統制な漏出または細胞の溶解が誤った折りたたみにより引き起こされ、発酵過程を直接または泡の溢れによって妨げる可能性がある。したがって、大腸菌のペリプラズムにおけるタンパク質の発現および折りたたみ特性を改善するためにいくつかの方策が開発されてきた。まず、組み換えタンパク質の発現および折りたたみの成功は、最適な制御配列、たとえばプロモーター長、リボソーム結合部位およびシグナルペプチドの選択と密接な関係がある1〜3。折りたたみ方法の応用例は、主に折りたたみ促進剤を供給すること4〜10、分子シャペロンの同時発現および折りたたみ触媒を添加すること11〜15に言及している。
【０００３】
グリシン、ベタインおよびヒドロキシエクトイン(hydroxyectoine)などの折りたたみ促進剤は、当技術分野で知られているタンパク質保護剤である48〜50。一般に、これらの化合物は、基質または阻害剤と同様に特異的結合によってタンパク質の高次構造を強化することはないと考えられている。これらの化合物の安定化効果は、主にタンパク質表面からのそれら化合物の排除によるもので、タンパク質の「優先的水和」またはタンパク質表面からの添加剤の「優先的排除」をもたらすとされている。しかしながら、安定化現象はかなり複雑な現象であり、安定化を担う単一の機序が存在するのではなく、優先的排除機構のほかに多くの安定化および不安定化相互作用が存在することが指摘されている。
【０００４】
外因性の折りたたみ促進剤を用いるほかに、分子モデリングあるいは定方向進化によってタンパク質自体を改良することができ、本明細書および他の特許ではｓｃＦｖ抗体断片を用いて実験が行われてきた16〜19。
【０００５】
個々の方策が一般にすべて成功するものではないため、タンパク質の折りたたみを経時的におよびその場その場で改善しなければならないことが指摘されている。それには折りたたみを直接監視する技術が必要であり、機能アッセイと独立しているのが理想的である。本発明は、この問題に対する技術的解答を提供する。最近の研究20、21と対照的に、本発明は、２つの部分的に重複する経路、シグマＥ反応およびＣｐｘシグナル伝達系24によって制御される大腸菌のペリプラズムにおける誤って折りたたまれたタンパク質に対する自然なストレス反応を用いている。シグマＥは、３つの遺伝子ｒｓｅＡ、ｒｓｅＢおよびｒｓｅＣ25によって厳重に調節されている。膜貫通型タンパク質ＲｓｅＡはシグマＥへの情報を感知および伝達し、内膜に存在するペリプラズムＲｓｅＢとの相互作用によって負に、ＲｓｅＣによって正にそれぞれ制御されている。Ｃｐｘ二成分シグナル伝達系は、膜センサーヒスチジンキナーゼＣｐｘＡおよび細胞質反応制御因子ＣｐｘＲからなる。誤って折りたたまれたタンパク質はＣｐｘＡの自己リン酸化と、続くＣｐｘＲへのリン酸基転移(phosphotransfer)をもたらし、ＣｐｘＲを転写活性化因子27〜29として機能させる。シグマＥとＣｐｘ反応は共に、ペリプラズムにおける誤った折りたたみの場合にタンパク質の折りたたみおよび分解に関与するいくつかの遺伝子を誘導する。Ｃｐｘシグナル形質導入システムは、ＤｓｂＡ、ＰｐｉＡおよびＰｐｉＤ27、30の活性化を調整し、一方シグマＥは、シグマＥ、シグマ32およびｆｋｐＡ31〜35さえも含む少なくとも10個の遺伝子産物の転写を制御する。両方の系で制御されるのはdegP(htrA)のみであり、degPがペリプラズムにおける誤った折りたたみの取扱いにおける中心要素であることを示している36〜40。この点において、とりわけ本発明の態様は、大腸菌のペリプラズムにおけるタンパク質の誤った折りたたみの速度論的研究には、degPプロモーターをベースとするリポーター系が極めて適しており、さまざまなタンパク質折りたたみ方法との効果的併用を可能にすることを明らかにしている。
【０００６】
（発明の開示）
大腸菌のペリプラズムにおける折りたたまれていないタンパク質または誤って折りたたまれたタンパク質の蓄積は、よく知られている厳重に制御されたペリプラズムプロテアーゼdegPの誘導につながる。DegPプロモーターおよびルシフェラーゼリポーター遺伝子をベースとしてオンライン測定技術を開発し、発酵過程中のタンパク質の誤った折りたたみのin vivoにおける速度論的研究を可能にした。この技術は、ヒトＥＧＦ受容体に特異的な組み換えミニ抗体(miniantibody)のペリプラズムにおける発現によって実証した。折りたたみ促進剤によるさまざまな供給方法およびペリプラズムシャペロンSkpの同時発現を実施し、機能性タンパク質の量が、誤って折りたたまれたタンパク質を意味するオンラインのルシフェラーゼシグナルと間接的に比例することを立証した。この点において、本技術は、用いた折りたたみ方法に応じ、ペリプラズムにおいて機能的に発現されたタンパク質の収量を評価および改善するための簡単なツールを提供する。
【０００７】
（発明の詳細な説明）
多くの真核タンパク質は翻訳後の非修飾体で完全な生物活性を保持しているため、大腸菌における機能性発現は確立された方法である。残念なことに、大腸菌のペリプラズムにおける組み換えタンパク質の正確な折りたたみは不明なところが多く、機能性タンパク質の発現を妨害することが多い。この問題に取り組むため、本発明は、タンパク質の誤った折りたたみのin vivoにおける速度論的研究を可能にする新たな技術を提示している。この技術は、誤った折りたたみが何時およびどんな条件で生じるかを理解および監視し、標的タンパク質の折りたたみを改善するための方法を実施するのに役立つ。
【０００８】
本発明の技術は、ペリプラズムにおけるタンパク質の誤った折りたたみの取扱いに重要な役割を果たしているよく知られているペリプラズムプロテアーゼDegPのプロモーターをベースとしている。この点において、従来の研究は、42℃以上の熱ショック後の誤って折りたたまれたペリプラズムにおけるタンパク質に対する反応が、過剰発現された誤って折りたたまれた組み換えタンパク質23、31、45、46によって引き起こされるストレスに匹敵することを暗示している。
【０００９】
発酵過程中のオンライン監視は、合計時間90秒の分析を可能にする検出モジュールの一部に極めて感度の良いリポーター遺伝子としてルシフェラーゼｌｕｃ+を用いることによって実現された。測定のこの高分解能には、半減期の短いリポーター遺伝子産物が必要である。緑色蛍光タンパク質(GFP)は半減期が長いために適用しないが、思いがけなくＬｕｃ+が特に有用であることが判明した。我々の測定した半減期は26℃の発酵温度で約５分であった。したがって、ルシフェラーゼ活性と誤って折りたたまれたタンパク質に対応する酵素の量との間の密接な相関関係が保証される。興味深くかつ予想に反して、我々の結果は、ルシフェラーゼが大腸菌の細胞壁を通って拡散できることを示している。したがって、細胞を一切破壊することなく迅速に活性の測定を行うことができる。DegP−ルシフェラーゼリポーターカセット(ｐｌｔ１となる)のコーディングベクターとしてｐＯＵ61を用いるとさらに利点が生まれる43、44。30℃未満の温度では、遺伝子組み換えされたＲ１複製起点は１細胞当たり１回のコピーにおけるコピー数を厳重に制御し、大腸菌染色体に匹敵する遺伝子量をもたらす。コードされたpar遺伝子座は、細胞分裂の間にプラスミド損失を防ぐ。Ｒ１複製起点は、組み換えミニ抗体の発現のために同時形質転換される第２のプラスミド中で用いられるｃｏｌＥ１誘導体と互換性がある。さらに、二重プラスミド系でｐｌｔ１を用いると、クローニングステップを一切追加することなく別のタンパク質を同様に検討することができる。
【００１０】
最近の研究には、in vivoにおいて折りたたみを監視する方法および細胞質タンパク質のタンパク質折りたたみアッセイが記載された20、21。これらの方法はリポータータンパク質と標的タンパク質の融合物をベースにしている。ＧＦＰまたはβ−ガラクトシダーゼのα−断片を(より大きなω−断片によるα−相補作用を達成するため)リポータータンパク質として使用してもよい。両方法はさまざまなタンパク質について実施可能であるが、標的タンパク質の対応する末端に接近可能である融合タンパク質の構築が必要となる。さらに標的タンパク質の折りたたみ特性がタンパク融合によって損なわれてはならない。
【００１１】
この点において、本発明において提供される技術は、従来技術を上回る大きな利点を有している。すなわち、誤って折りたたまれたタンパク質に対する自然なストレス反応の利用により、他の影響要素を一切加えることなく組み換え発現中の標的タンパク質の折りたたみについての研究を可能にする。さらに、タンパク質の誤った折りたたみの影響を速度論的に研究することができる。したがって、標的タンパク質の折りたたみ特性を改善できるばかりでなく、制御配列を遺伝的に最適化し発酵中のプロセスパラメータを適合させることができる。用語「機能的に正確な折りたたみ」は、本発明によれば、組み換え過程によって発現されるタンパク質が、その予定機能に関してタンパク質を完全にまたは本質的に活性にすることが可能な折りたたみ(三次構造)を有することを意味する。
【００１２】
誤った折りたたみの速度の監視は、それぞれ折りたたみ促進剤を添加するか添加せず、および分子シャペロンSkpを同時発現させるか同時発現させずにヒトＥＧＦ受容体に特異的な組み換えミニ抗体を発現することによって評価した。これらの条件が興味深く思えたのは、最近の研究で高濃度のソルビトールおよびベタインがタンパク質の折りたたみを支える微小環境をペリプラズムに生じると報告されたためである5、10。この方策と対照的に、BothmannおよびPluckthunは1998年に、さまざまなｓｃＦｖ断片について、ペリプラズムシャペロンSkpの同時発現がそれらの機能的量をはっきりと改善することを示した47。本発明で行った両方策は、抗ＥＧＦＲミニ抗体の機能的収量にはっきりとした増加をもたらした。誤って折りたたまれたタンパク質量の相反する明確な減少は、ルシフェラーゼシグナルによって同時に示された。
【００１３】
さらに、発明者らは、ミニ抗体の誘導から２時間後のルシフェラーゼシグナルの増加と、それぞれ用いた供給方策およびSkpの同時発現に応じた産物の速度との直接的相関関係を観察した。興味深いことに、Skpが同時発現された場合にはルシフェラーゼシグナルの増加は少ない。このことはSkpのペリプラズムシャペロンとしての機能によって説明できる。なぜなら、Skpの同時発現は、因子ＣｐｘＲ47の推定(putitative)結合部位に特徴的な自分自身の制御配列によって制御されるためである。ＣｐｘＲは、ペリプラズムのストレス反応に関与するＣｐｘ二成分シグナル伝達系の転写活性化因子として知られている27〜29。Skpが発現されない場合にはルシフェラーゼシグナルの強い増加が観察された。一方、ルシフェラーゼシグナルの増加直後から30分以内に折りたたみ促進剤を供給するとルシフェラーゼシグナルの増加が停止し、発酵過程の残りは一定レベルであった。このことは、折りたたみ促進剤の供給はタンパク質の折りたたみの迅速な改善につながるが、Skpは、誤って折りたたまれたタンパク質の量とは関係なく折りたたみを改善することを意味している。
【００１４】
（図面の簡単な説明）
図１：WurglerおよびRichardson32によるdegPプロモーターの配列を示す図である。Ｌｕｃ+のクローニング用にＮｃｏＩ部位を得るため、開始コドンに近いＡをＣで置き換えた(アスタリスクで示す)。下部は、degPのPCR増幅用のプライマーを示す。
【００１５】
図２：ルシフェラーゼ活性のオンライン監視用検出モジュールを示す図である。
【００１６】
図３：非還元条件および還元条件下でそれぞれルシフェラーゼ活性を測定するリポーター系の基礎レベルおよび最大レベルを示すグラフである。
【００１７】
図４：６％ソルビトールおよび2.5 mMベタインの培地濃度となる供給液を用いるタンパク質の折りたたみに対するさまざまな供給方法の影響を示すグラフである。
【００１８】
図５：タンパク質の折りたたみに対するペリプラズムシャペロンSkpの同時発現の影響を示すグラフである。
【００１９】
図６：用いた供給方法およびSkpの同時発現に応じた機能性ミニ抗体の生成速度を示すグラフである。
【００２０】
図７：DegP−ルシフェラーゼリポータープラスミドｐｌｔ１および発現プラスミドｐＴＡＫＦＥＣ、ｐＴＡＫＦＥＣＵおよびｐＴＡＫＦＥＣＴＵ。発現プラスミドは修飾したｌａｃ Ｐ／Ｏ配列が異なることを示す図である。
【００２１】
図８：発現プラスミドｐＴＡＫＦＥＣ(Ｐlac#C)、ｐＴＡＫＦＥＣＵ(Ｐlac#CU)およびｐＴＡＫＦＥＣＴＵ(Ｐlac#CTU)のプロモーター変異体と天然のｌａｃプロモーター(Ｐlac#nativ)配列の比較である。
【００２２】
図９：用いた発現プラスミドのプロモーター強度と相関関係のあるルミネセンスを示すグラフである。
【００２３】
引用文献
【００２４】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に述べるが、本発明を限定するものではない。
【００３０】
（実施例１）
ベクター構築。ミニ抗体発現ベクターｐＴＡＫＦＥＣＵは、以前に報告した発現ベクターｐ４１ＦＥＧ１Ｔ3およびｐＡＫ1003に由来する。ベクターｐＴＡＫＦＥＣＵは、MutaGene(商標)ファージミドキット(BioRad Laboratories、Richmond、U.S.A.)を使って部位特異的突然変異誘発により導入されたｐＡＫ100のクロラムフェニコール耐性遺伝子(cat)および強力なｌａｃＵＶ５プロモーターを含む。プラスミドｐＨＢＦＥＣＵを同時発現するSkpは、ｌａｃＵＶ５プロモーターおよび抗ＥＧＦＲミニ抗体をコードするｐＴＡＫＦＥＣＵのMluI−HindIII断片をｐＨＢ11047中に挿入することによって得た。制限部位ＮｃｏＩおよびＸｂａＩを介してｐＴｒｃ99Ａ(Amersham Pharmacia Biotech、Germany)中にｐＳＧ−ｌｕｃ+(Promega GmbH、Germany)のルシフェラーゼ遺伝子を挿入すると、ｐＴｒｃ−ｌｕｃ+が得られた。DegP−ルシフェラーゼリポータープラスミドｐｌｔ１を構築するために、ｔＨＰ−ターミネーター(ＫｐｎＩ、ＮｓｉＩ)42のクローニング部位を含む合成ポリリンカー、degP−プロモーター(ＮｓｉＩ、ＮｃｏＩ)およびルシフェラーゼリポーター遺伝子ｌｕｃ+(ＮｃｏＩ、ＸｂａＩ)をｐＵＣ18のEcoRIおよびHindIII部位に挿入すると、ｐＵＣ18ＰＬが得られた。ｔＨＰ−ターミネーターはｐＴＡＫＦＥＣＵから得た。大腸菌ＭＧ1655(ＡＴＣＣｎｏ.47076)のゲノムDNAからのPCR増幅により(プライマーを図１に示す)degP−プロモーターをクローニングした。PCR産物には、degPから上流に位置するｄＧＴＰアーゼ遺伝子(dgt)の終止コドンからdegPの開始コドンまでの完全DNA配列が含まれる(図１)。ルシフェラーゼ遺伝子ｌｕｃ+は、ｐＳＧ−ｌｕｃ+から得た。得られたルシフェラーゼリポーターカセットを、独自の制限部位EcoRIおよびBamHIを介してｐＯＵ6141中にクローニングすると、degP−ルシフェラーゼリポーターベクターｐｌｔ１が得られた。
（実施例２）
degP−ルシフェラーゼリポーターベクターｐｌｔ１の設計は、プラスミドｐＯＵ6141をベースとしている。その遺伝子組み換えＲ１複製起点は、組み換えタンパク質の発現のために同時形質転換される第２のプラスミド中で用いられるcolE一誘導体と互換性がある。ルシフェラーゼカセットは、degP−プロモーター(degPから上流に位置するｄＧＴＰアーゼ遺伝子(dgt)の終止コドンからdegPの開始コドンまでの完全DNA配列)および下流に続くリポーター遺伝子ルシフェラーゼｌｕｃ+を含む(図１)。この他に、発明者らは、degPの上流にｔＨＰターミネーター(上流に位置する遺伝子の転写読み合わせを５分の１まで減少させる42)を挿入した。得られたdegP−ルシフェラーゼカセットをｐＯＵ61中にクローニングするとベクターｐｌｔ１が得られた。
【００３１】
（実施例３）
大腸菌の細胞懸濁液中のルシフェラーゼ活性の測定。発明者らは、ＩＰＴＧによるルシフェラーゼの誘導を可能にするプラスミドｐＴｒｃ−ｌｕｃ+を構築し、大腸菌におけるルシフェラーゼ活性を測定するための機能アッセイを開発した。ルシフェラーゼ活性を測定するため、超音波処理による細胞破壊および細胞壁をルシフェリンに対してより透過性にするためのさまざまなトルエン濃度による処理を含むいくつかのアプローチを行った。幸いにも、未処理の細胞が破壊細胞に匹敵するルシフェラーゼ活性を示す。このことは、ルシフェリンが大腸菌の細胞壁を通して拡散できることを示している。この点において、発明者らは、細胞懸濁液に緩衝化したルシフェリン溶液を直接添加することにより続くアッセイでルシフェラーゼ活性を測定した。実測されたルシフェラーゼシグナルを相対ルシフェラーゼ単位(RLU)と呼んだ。
【００３２】
（実施例４）
ルシフェラーゼ活性をオンラインで監視するための検出装置。試料採取系は、蠕動ポンプに連結した発酵槽バイパスをベースとしている。試料採取は、0.9％ NaClを用いる発酵槽プローブの連続的前希釈から開始した。いくつかの実験から、測定の開始点における細胞密度(我々の場合はＯＤ550＝90)にもよるが、最適な前希釈比は1:50であることが分かった。ルシフェラーゼ活性をオンラインで監視するためには一定かつ正確なＯＤ550＝0.4が得られる希釈がさらに必要である。これは、前希釈のＯＤを正確に測定するためのフロースルー型光度計ならびに試料ポンプおよび希釈ポンプの速度を算出するためのラップトップ型コンピュータからなるＯＤコントローラーを開発することによって実現した。一定速度の別のポンプを用い、希釈試料を緩衝化したルシフェリン溶液と混ぜ、フロースルー型ルミノメーターに注入してルシフェラーゼ活性を測定した。１回のアッセイの合計時間は90秒であった(図2)。
【００３３】
（実施例５）
高細胞密度培養(HCDC)は、グルコース無機塩培地を用い、Horn他1に従って10 Lの撹拌型バイオリアクター中で行った。すべての発酵は、26℃の温度、開始ＯＤ550＝0.2およびＯＤ550＝90におけるＩＰＴＧの添加を含む同一条件の下で行った。さらに、前培養液(preculture)を同一ストックのグリセロール保存品とともに接種した。グルコースの供給はグルコースのフローインジェクション分析を用いて行い、一切の付加的ストレスを避けるため発酵の間中細胞を無制限に増殖させた。５時間の誘導期を含む29時間の培養時間後、発明者らは、乾燥バイオマス25gL-1に相当するＯＤ550＝110の最終細胞密度を得た(図３〜５)。
【００３４】
（実施例６）
誤って折りたたまれたタンパク質のオンライン監視は、ヒトＥＧＦ受容体に特異的な組み換えミニ抗体の発現によって分析した。ミニ抗体は、Ｃ末端で融合したヒンジと続くヘリックスターンヘリックスモチーフを含むｓｃＦｖ断片からなり、in vivoではホモ二量体化している。このミニ抗体は、我々が以前に報告した発現ベクターｐ41ＦＥＧ１ＴおよびｐＡＫ1003に由来するプラスミドｐＴＡＫＦＥＣＵによってコードされている。発現は大腸菌ＲＶ308(ＡＴＣＣｎｏ.31608)中で行った。この菌株は、酢酸の生成速度が劇的に低下しているためＨＣＤＣに特に適している。二重プラスミド系としてｐＴＡＫＦＥＣＵおよびdegP−ルシフェラーゼリポーターベクターｐｌｔ１により大腸菌ＲＶ308を同時形質転換し、誤って折りたたまれたミニ抗体の比を評価した。
【００３５】
ルシフェラーゼ活性の基礎レベルおよび最大レベルを測定し、発明者らの系の動作範囲を評価した。この目的のため、非還元条件における第１の発酵をミニ抗体のＩＰＴＧ誘発性発現と比較した。ルシフェラーゼ活性は15分ごとに測定した。どちらの発酵についても細胞密度ＯＤ550＝75で測定を開始したが、第２の発酵におけるミニ抗体の誘導はＯＤ550＝90である30分後に開始した。非誘導培養については、発酵の間中約40の相対ルミネセンス単位(RLU)という低い基礎レベルが測定されたに過ぎなかった。ミニ抗体の誘導後の第一相では、ルシフェラーゼシグナルは非誘導培養液に匹敵していた。これとは対照的に、発明者らは、機能性ミニ抗体の産物生成速度に対応するルシフェラーゼシグナルの強い増加を誘導の２時間後に得た(図３、図６)。
【００３６】
発明者らは、６％ソルビトールおよび2.5 mMベタインの培地濃度の得られる供給液を用いて３つの異なる供給方法を試験し、誤って折りたたまれたミニ抗体の比に対する折りたたみ促進剤の影響を測定した。発酵開始時あるいは誘導と同時に供給した場合にはルシフェラーゼシグナルは基礎レベルに達したに過ぎなかった。しかしながら、産物生成の開始に相当する誘導から２時間後に供給液を添加した場合には、供給が一切ない誘導培養に匹敵するルシフェラーゼシグナルの増加があり、培養の残りの時間は約170RLUの一定レベルであった(図４)。
【００３７】
この他に、発明者らは、ミニ抗体発現に対するペリプラズムシャペロンSkpの同時発現の影響を分析した。この目的では、ｌａｃＵＶ５プロモーター領域を含むミニ抗体のDNA配列およびｐｅｌＢシグナル配列を、SkpをコードするｐＨＢ110中にクローニングした。得られたプラスミドｐＨＢＦＥＣＵをｐｌｔ１と共に大腸菌ＲＶ308中に同時形質転換した。産物生成の開始点で折りたたみ促進剤を供給する、および供給しない両培養と同様に、発明者らは、誘導から２時間後にルシフェラーゼシグナルの増加を得た。これらの培養とは対照的に、Skp同時発現では得られた勾配の増加は少なく、産物生成の開始点で折りたたみ促進液を供給する培養にのみ匹敵する230RLUの最大に達した(図５)。
【００３８】
（実施例７）
ルシフェラーゼ活性のオンライン監視。ルシフェラーゼ活性のオンライン監視に用いられる試料採取系を図２に示す。発酵槽バイパスは、蠕動ポンプ(504U、Watson Marlow、Falmouth、England)と、続く４チャンネル蠕動ポンプMS-CA4/840(Ismatec GmbH、Wertheim−Mondfeld、Germany)を用いて0.9％ NaClにより発酵槽試料を1:50の比に連続的に前希釈することによって行った。ＯＤコントローラーは、前希釈のＯＤを正確に測定するためのフロースルー型光度計(VIS Jenway6300、Jenway Inc.、Princeton、U.S.A.)ならびに試料および希釈ポンプ(蠕動ポンプISM Reglo 12/100、Ismatec GmbH、Wertheim‐Mondfeld、Germany)の速度を算出するためのラップトップ型コンピュータをベースとしている。値はソフトウエアDasylab(GBMmbH、Monchengladbach、Germany)を用いて算出した。一定ＯＤ550nm＝0.4の発酵槽試料を1:1の比でルシフェリン溶液と混ぜた。この目的のため、Ｄ−ルシフェリンナトリウム塩５mgをＨ2Ｏ 1250μlに溶かした。この溶液100μlを、pH 7.8において25ｍＭトリシン、15ｍＭ MgCl2、５ｍＭ ATP、７ｍＭメルカプトエタノールおよび５ｍｇ BSAを含有するルシフェリン緩衝液9.9 mlに加えた。１回の分析にルシフェリン溶液0.5 mlが必要である。ルシフェラーゼ活性は、フロースルー型ルミネセンス検出器LEO(Wallac GmbH、Freiburg、Germany)で測定し、ソフトウエアDasylab(GBMmbH、Monchengladbach、Germany)を用いて算出した。実測されたルシフェラーゼシグナルを相対ルシフェラーゼ単位(RLU)と呼んだ。
【００３９】
（実施例８）
平行タンパク質発現を最適化するための小型アッセイおよびタンパク質折りたたみの監視。タンパク質の監視および最適化について述べた基本原理をマイクロ容積に適合させ、マイクロタイタープレート以下の大きさのフォーマットに原理をあてはめた。試験系は抗ＥＧＦＲ−ミニ抗体を含んでいた。前述のように、プラスミドｐＴＡＫＦＥＣ、ｐＴＡＫＦＥＣＵおよびｐＴＡＫＦＥＣＴＵを含むリポータープラスミドｐｌｔ１を用いて大腸菌Ｋ12ＲＶ308を同時形質転換した。このプラスミドはｌａｃプロモーターの変異体を含むため、図７および８に示すようにミニ抗体の差次的発現が可能である。リポータータンパク質ｐｌｔ１のルシフェラーゼ活性を測定すると、図９に示すように、誤って折りたたまれたタンパク質の部分は用いた個々のプロモーターと相関関係があることが判明した。したがって、プラスミドにコードされたｐｌｔ１リポーター系は、選択すべき個々のプロモーターに関して発現を最適化するのに有用である。
【００４０】
マイクロタイタープレート中の培養は、加熱可能なマイクロタイタープレート振盪機−Thermostar (Fa. DMG Medizintechnik GmbH、Offenburg、Germany)を用い26℃の温度において無機塩培地(Horn他、1996) 100μl中で行った。マスタープレートの接種は、個々の菌株のグリセロール原液10μlを用いて行った。結果を(図３)に示す。３回繰り返した。ルシフェラーゼ活性の推定は、ルシフェリン溶液100μlを添加後に測定し、Chemolumineszenzreader Victor1420 Multilabel Counter(Fa. Wallac GmbH、Freiburg、Germany)で測定した。図９に示す速度を測定するため、所定の時点における平行培養でルシフェラーゼ活性を評価した。
【００４１】
（実施例９）
ルシフェラーゼシグナルと機能性ミニ抗体の比との相関関係。ヒトＥＧＦ受容体の細胞外ドメインに基づき、ELISAを用いて機能性ミニ抗体の量を測定した。産物速度を得るため、０時間、1.5時間、3.0時間および4.5時間にミニ抗体を発現する細胞の試料を分析した。用いた折りたたみ促進剤の供給方法にもよるが、結果は、機能性ミニ抗体の収率が明らかに改善したことを示している(図６)。このことは、誤って折りたたまれたミニ抗体について測定されたルシフェラーゼシグナルは、機能性ミニ抗体の量と間接的に比例することを示している。
【００４２】
（実施例10）
ミニ抗体の機能的量の定量的測定。機能性抗ＥＧＦＲミニ抗体の量は、ヒトＥＧＦＲ(Merck KgaA、Darmstadt、Germany)の細胞質外(extracytoplasmic)ドメインを用い、Horn他1に従って機能性酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)によって測定した。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】WurglerおよびRichardson32によるdegPプロモーターの配列を示す図である。Ｌｕｃ+のクローニング用にＮｃｏＩ部位を得るため、開始コドンに近いＡをＣで置き換えた(アスタリスクで示す)。下部は、degPのPCR増幅用のプライマーを示す。
【図２】ルシフェラーゼ活性のオンライン監視用検出モジュールを示す図である。
【図３】非還元条件および還元条件下でそれぞれルシフェラーゼ活性を測定するリポーター系の基礎レベルおよび最大レベルを示すグラフである。
【図４】６％ソルビトールおよび2.5mMベタインの培地濃度となる供給液を用いるタンパク質の折りたたみに対するさまざまな供給戦略の影響を示すグラフである。
【図５】タンパク質の折りたたみに対するペリプラズムシャペロンSkpの同時発現の影響を示すグラフである。
【図６】用いた供給方法およびSkpの同時発現に応じた機能性ミニ抗体の生成速度を示すグラフである。
【図７】DegP−ルシフェラーゼリポータープラスミドｐｌｔ１および発現プラスミドｐＴＡＫＦＥＣ、ｐＴＡＫＦＥＣＵおよびｐＴＡＫＦＥＣＴＵ。発現プラスミドは修飾したｌａｃ Ｐ／Ｏ配列が異なることを示す図である。
【図８】発現プラスミドｐＴＡＫＦＥＣ(Ｐlac#C)、ｐＴＡＫＦＥＣＵ(Ｐlac#CU)およびｐＴＡＫＦＥＣＴＵ(Ｐlac#CTU)のプロモーター変異体と天然のｌａｃプロモーター(Ｐlac#nativ)配列の比較である。
【図９】用いた発現プラスミドのプロモーター強度と相関関係のあるルミネセンスを示すグラフである。
Claims (19)
- 組み換え過程においてin vivoの標的タンパク質の機能的に正確な折りたたみまたは誤った折りたたみを監視する方法であって、ペリプラズムプロテアーゼＤｅｇＰのプロモーターの制御下にあるリポーター遺伝子を、前記標的タンパク質を発現する発現系に適用することを含み、前記発現系におけるリポーター遺伝子の遺伝子産物の産生が標的タンパク質の正確な折りたたみの尺度である方法。
- ＤｅｇＰプロモーター配列が、下流方向で該プロモーターに融合されているリポーター遺伝子の開始コドンに近接して修飾されている、請求項１に記載の方法。
- 前記ＤｅｇＰプロモーターが図１に示す配列を有する、請求項２に記載の方法。
- 前記リポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子(ｌｕｃ+)である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
- ベクター中にクローニングされたＤｅｇＰ−ｌｕｃ+遺伝子カセットを用いる、請求項４に記載の方法。
- 前記ベクターが図７で指定されるＤＮＡ配列を含むｐｌｔ１である、請求項５に記載の方法。
- リポーター遺伝子産物の産生がオンラインの速度測定法によって監視される、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
- 発現および発酵過程において標的タンパク質の機能的に正確な折りたたみを最適化する方法であって、(i)請求項１から７のいずれかの方法に従って前記標的タンパク質の折りたたみを監視すること、(ii)ペリプラズムシャペロンＳｋｐを同時発現させることおよび／または機能的に正確なタンパク質の折りたたみを促進する１つまたは複数の試剤を添加することによりタンパク質の折りたたみを調節すること、ならびに場合により(iii)機能的に正確に折りたたまれたタンパク質が最適に得られるまでステップ(i)および(ii)を繰り返すことを含む方法。
- 前記折りたたみ促進剤がポリオールおよび／またはベタイン誘導体である、請求項８に記載の方法。
- 前記折りたたみ促進剤がグリセロール、ソルビトール、グリシンベタイン、ヒドロキシエクトインからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
- 細菌の発現系が用いられる、請求項８から10のいずれかに記載の方法。
- 前記細菌発現系が大腸菌である、請求項11に記載の方法。
- 前記大腸菌がＲＶ308(ＡＴＣＣ31608)である、請求項12に記載の方法。
- プロモーター／リポーター遺伝子を含む第１のプラスミドおよび発現した場合に折りたたみが最適化されるべき標的タンパク質をコードする遺伝子を含む第２のプラスミドからなる二重プラスミド系が用いられる、請求項８から13のいずれかに記載の方法。
- 監視および調節が産生段階の間オンラインでかつ同時に行われる、請求項８から14のいずれかに記載の方法。
- 栄養素中で細菌宿主細胞を培養することによって、折りたたみ特性が最適化された組み換え標的タンパク質を産生し、前記の最適に折りたたまれた標的タンパク質を単離および精製するための方法であって、請求項８から15のいずれかに記載の方法を含む方法。
- 前記標的タンパク質が融合タンパク質である、請求項16に記載の方法。
- 前記融合タンパク質が一本鎖Ｆｖおよび／またはミニ抗体である、請求項17に記載の方法。
- 細菌宿主細胞系において折りたたみ特性が改善された標的タンパク質を発現させるためのキットであって、前記標的タンパク質の遺伝子を含有するプラスミドを含む第１のパッケージ、ＤｅｇＰ−ｌｕｃ+遺伝子カセットを含有するプラスミドを含む第２のパッケージ、および前記プラスミドで形質転換された細菌宿主細胞を含む第３のパッケージからなるキット。
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