ES2315384T3 - Procedimiento para el seguimiento y la modulacion del plegamiento de proteinas. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para el seguimiento funcionalmente correcto del plegamiento o del plegamiento incorrecto de una proteína diana in vivo en un proceso recombinante que comprende la aplicación de un gen marcador, es decir bajo el control del promotor de la proteasa periplasmática DegP, a un sistema de expresión que expresa dicha proteína diana, siendo la producción del producto génico del gen marcador en dicho sistema de expresión una medida del plegamiento incorrecto de la proteína diana.

Description

Procedimiento para el seguimiento y la modulación del plegamiento de proteínas.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un nuevo procedimiento para mejorar la expresión proteica funcional, según el cual es seguido el procedimiento de plegamiento con ayuda de una medida en línea y, en caso necesario, el plegamiento proteico es influenciado mediante la adición de agentes promotores del plegamiento y/o mediante la coexpresión del chaperón periplásmico Skp. A este respecto, la invención ofrece una tecnología para mejorar el rendimiento de las proteínas recombinantes expresadas de manera funcional.

Fundamento de la invención

El resultado de la sobreexpresión de los productos génicos recombinantes en el periplasma de Escherichia coli está asociado frecuentemente con proteína no plegada o con plegamiento incorrecto y puede involucrar la degradación de proteasas celulares. Por otra parte, la permeabilidad o la lisis incontrolada de las células, provocada por el plegamiento incorrecto puede inhibir procesos de fermentación directamente o debido a un rebosamiento de espuma. Por lo tanto, han sido desarrolladas diversas estrategias para mejorar las propiedades de expresión y de plegamiento de las proteínas en el periplasma de Escherichia coli. En primer lugar, una expresión fructífera y un plegamiento fructífero de las proteínas recombinantes están íntimamente relacionados con la elección de las secuencias reguladoras óptimas, por ejemplo la potencia del promotor, los locus de enlace de ribosoma y los péptidos de señal^{1-3}. La aplicación de las estrategias de plegamiento se refiere, en la mayoría de los casos, al aporte de agentes promotores del plegamiento^{4-10}, a la coexpresión de chaperones moleculares y a la adición de catalizadores de plegamiento^{11-15}.

Los agentes promotores del plegamiento, tales como la glicina, la betaína y la hidroxiectoína, son protectores proteicos conocidos en el estado de la técnica^{48-50}. En general, se supone que estos compuestos no refuerzan la conformación proteica mediante enlazamiento específico como ocurría con un substrato o con un inhibidor. El efecto estabilizante de estos compuestos ha sido atribuido, en la mayoría de los casos, a su exclusión en la superficie proteica, lo cual conduce a una "hidratación preferente" de la proteína o a una "exclusión preferente" del aditivo en la superficie proteica. Sin embargo, el fenómeno estabilizante es bastante complejo, y debe indicarse que no existe un mecanismo único responsable de la estabilización sino que existe una multitud de interacciones estabilizantes y desestabilizantes junto al mecanismo de exclusión preferente.

Además del empleo de agentes promotores de plegamiento extrínsecos, la propia proteína puede ser mejorada bien mediante modelado molecular o mediante evolución directa, experimentos llevados a cabo en este caso y en otros han utilizado fragmentos de anticuerpo scFv^{16-19}.

Debe indicarse que ninguna de las estrategias individuales es fructífera, en general, y que, por lo tanto, el plegamiento de las proteínas debe ser mejorado de manera secuencial y caso por caso. Esto requiere tecnologías para llevar a cabo el seguimiento del plegamiento directo, que, de manera ideal, sean independientes de los ensayos funcionales. La presente invención proporciona la solución técnica a este problema.

En contraste con los trabajos recientes^{20,21}, la invención no utiliza la respuesta al estrés natural para llevar a cabo el plegamiento incorrecto de proteínas en el periplasma de Escherichia coli, regulado por dos vías, que se solapan en parte, la respuesta sigmaE y el sistema de transducción de señal Cpx^{24}. El sigmaE es regulado estrechamente por tres genes, rseA, rseB y rseC^{25}. La proteína transmembranal RreA detecta y transmite información al sigmaE, regulado negativamente por la interacción con el RseB periplásmico y positivamente por RseC, respectivamente, localizados en la membrana interna. El sistema de transducción de señal de dos componentes Cpx está constituido por un sensor membranal de histidina cinasa CpxA y por un regulador de la respuesta citoplásmica CpxR. La proteína con plegamiento incorrecto conduce a la autofosforilación de la CpxA seguido de una fosfotransferencia para dar CpxR, que permite que la CpxR funcione como un activador transcripcional^{27-29}. Tanto el sigmaE como la respuesta Cpx inducen a diversos genes relacionados con el plegamiento proteico y con la degradación en el caso del plegamiento incorrecto periplásmico. El sistema de transducción de señal Cpx coordina la activación de DsbA, PpiA y PpiD^{27,30}, mientras que el sigmaE regula la transcripción de, al menos, 10 productos génicos, con inclusión incluso del sigmaE, del sigma 32 y de la fkpA^{31-35}. Únicamente el degP (htrA) es regulado por ambos sistemas, lo que indica que el degP es un elemento central en la gestión del plegamiento incorrecto periplásmico^{36-40}. A este respecto, la invención demuestra, entre otros aspectos, que un sistema marcador basado en el promotor degP es muy adecuado para los estudios cinéticos del plegamiento incorrecto de las proteínas en el periplasma de la Escherichia coli y que permite una utilización efectiva en combinación con diferentes estrategias de plegamiento de proteínas.

Resumen de la invención

La acumulación de proteína no plegada o con plegamiento incorrecto en el periplasma de la Escherichia coli conduce a la inducción de la proteasa periplásmica degP perfectamente conocida, densamente regulada. Se ha desarrollado una tecnología de medición en línea en base al promotor A degP y de un gen marcador de luciferasa, cuya tecnología permite estudios de cinética in vivo del plegamiento incorrecto de las proteínas durante los procesos de fermentación. La tecnología ha sido validada mediante la expresión periplásmica de un minianticuerpo recombinante específico del receptor EGF humano. Mediante la realización de diferentes estrategias de aporte con agentes promotores de plegamiento y la coexpresión de los chaperones periplásmicos Skp, hemos demostrado que la cantidad de proteína funcional es indirectamente proporcional a la señal de luciferasa en línea, que representa la del plegamiento incorrecto. A este respecto, la tecnología ofrece una herramienta sencilla para evaluar y para mejorar el rendimiento de las proteínas funcionalmente expresadas en el periplasma, en función de la estrategia de plegamiento utilizada.

Descripción detallada de la invención

Constituye una estrategia establecida que un gran número de proteínas eucariotas retenga su actividad biológica completa en una forma no modificada de manera posttranslacional así como su expresión funcional en Escherichia coli. Infelizmente, el plegamiento correcto de las proteínas recombinantes en el periplasma de Escherichia coli está poco discernido y frecuentemente interfiere con la expresión de la proteína funcional. Para paliar este problema, esta invención presenta una nueva tecnología que permite estudios cinéticos in vivo del plegamiento incorrecto de las proteínas. La tecnología ayuda a entender y a seguir cuando y bajo qué condiciones se produce el plegamiento incorrecto permitiendo, de este modo, implementar estrategias para mejorar el plegamiento de la proteína diana.

La tecnología de la invención está basada en el promotor de la proteasa periplásmica DegP perfectamente conocida, que juega un papel clave en la gestión del plegamiento incorrecto de la proteína periplásmica. A este respecto, los trabajos previos sugieren que la respuesta al plegamiento incorrecto de la proteína periplásmica tras un choque térmico de y por encima de 42ºC, es comparable con el estrés provocado por las proteínas recombinantes con plegamiento incorrecto sobreexpresadas^{23,31,45,46}.

El seguimiento en línea durante los procesos de fermentación se realizó mediante la utilización de luciferasa luc^{+} como gen marcador muy sensible como parte de la detección del módulo que permite un análisis en un tiempo total de 90 segundos. Esta elevada resolución de las mediciones requiere una corta semivida del producto del gen marcador. Como consecuencia de la prolongada semivida de la proteína de fluorescencia verde (GFP), esta proteína no puede ser aplicada, sin embargo, de manera inesperada, es especialmente útil la Luc^{+}, en lugar de la anterior. Nosotros hemos determinado una semivida de aproximadamente 5 minutos a nuestra temperatura de fermentación de 26ºC. De este modo, se garantiza una estrecha correlación entre la actividad de la luciferasa y la cantidad del enzima que corresponde a la proteína con plegamiento incorrecto. De manera interesante y no esperada, nuestro resultado indica que la luciferasa puede difundirse a través de la pared celular de la Escherichia coli. De este modo, puede llevarse a cabo una determinación rápida de la actividad sin cualquier tipo de disrupción celular.

El empleo del pOU61, como vector codificante de la caja marcadora de la degP-luciferasa (que resulta en plt1) genera ventajas adicionales^{43,44}. A una temperatura situada por debajo de 30ºC un origen R1, genéticamente modificado, regula densamente el número de copias de una copia por célula, lo que conduce a una dosis génica comparable con el cromosoma de Escherichia coli. El locus par codificado previene contra la pérdida de plásmido durante la división celular. El origen R1 es compatible con el derivado colE1 empleado en un segundo plásmido cotransformado para la expresión de minianticuerpos recombinantes. Por otra parte, la utilización de plt1 en un sistema plásmido dual permite investigaciones similares de proteínas de adición sin cualquier tipo de etapas adicionales de clonación.

Trabajos recientes describen un método para el seguimiento in vivo del plegamiento y un ensayo de plegamiento de proteínas para las proteínas citoplásmicas^{20,21}. Estos métodos están basados en una fusión de una proteína marcadora con la proteína diana. Como proteínas marcadoras pueden ser empleados bien el GFP o el fragmento \alpha de la \beta-galactosidasa (para alcanzar una complementación \alpha con el fragmento \omega mayor). Ambos métodos pueden ser llevados a cabo para diversas proteínas, pero la construcción de la proteína de fusión requiere que sea accesible a la proteína diana el extremo correspondiente. Por otra parte, las propiedades de plegamiento de la proteína diana no deben ser dañadas por la fusión proteica.

A este respecto, la tecnología proporcionada en esta invención, tiene ventajas superiores sobre el arte previo. De manera concreta, el empleo de la respuesta al estrés natural a las proteínas con plegamiento incorrecto permite estudios del plegamiento de la proteína diana durante la expresión recombinante sin cualquier otro factor influenciador adicional. Así mismo puede ser estudiado de una manera cinética el efecto del plegamiento incorrecto de la proteína. De este modo, no solamente pueden ser mejoradas las propiedades de plegamiento de la proteína diana, sino que también pueden optimizarse genéticamente las secuencias reguladoras y pueden adaptarse los parámetros del proceso durante la fermentación. El término "plegamiento funcionalmente correcto" significa, de conformidad con la invención, que una proteína, expresada mediante un proceso recombinante, tiene un plegamiento (estructura terciaria) que permite que la proteína sea completamente activa o esencialmente activa con respecto a su función propuesta.

Se evaluó el seguimiento de la cinética del plegamiento incorrecto mediante la expresión de un minianticuerpo recombinante específico del receptor EGF humano con y sin adición de agentes promotores del plegamiento y coexpresión del chaperón molecular Skp, respectivamente. Estas condiciones parecen interesantes puesto que, trabajos recientes han indicado que el sorbitol y la betaína generan un microambiente periplásmico que soporta el plegamiento de las proteínas a concentraciones elevadas^{5,10}. Frente a esta estrategia, los autores Bothmann y Plückthun, 1998, han descrito para diferentes fragmentos de scFv, que una coexpresión del chaperón periplásmico Skp, mejora claramente sus cantidades funcionales^{47}. Ambas estrategias, que son llevadas a cabo con la presente invención, conducen a un claro incremento del rendimiento funcional del minianticuerpo anti-EGFR. La clara disminución recíproca de la cantidad de la proteína con plegamiento incorrecto ha sido indicada simultáneamente por la señal de luciferasa.

Por otra parte, hemos observado una correlación directa entre el incremento de la señal de luciferasa 2 horas tras la inducción del minianticuerpo y la cinética del producto en función de la estrategia de aporte utilizada y de la coexpresión de Skp, respectivamente. De manera interesante, existe un menor incremento de la señal de luciferasa si Skp es coexpresado. Esto puede ser explicado mediante la función del Skp como un chaperón periplásmico, puesto que la coexpresión del Skp está regulada por sus propias secuencias reguladoras caracterizadas por un locus de enlace putativo para el factor CpxR^{47}. El CpxR es conocido como activador transcripcional del sistema de transducción de señal de dos componentes Cpx que participa en la respuesta al estrés periplásmico^{27-29}. Se ha observado un fuerte incremento de la señal de luciferasa cuando no es expresado el Skp. Por otra parte, un aporte de agentes promotores del plegamiento durante un corto período de tiempo de 20 minutos, directamente tras el incremento de la señal de luciferasa, detiene un aumento adicional de la señal de la luciferasa, seguido de un nivel constante durante el resto del proceso de fermentación. Esto supone que el aporte de los agentes promotores del plegamiento conduce a una rápida mejora del plegamiento de la proteína, mientras que el Skp mejora el plegamiento independientemente de la cantidad de proteína con plegamiento incorrecto.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1

Secuencia del promotor degP de conformidad con los autores Wurgler y Richardson ^{32}. Para obtener el locus NcoI para la clonación de la luc^{+}, el A próximo al codón de iniciación ha sido reemplazado por un C (indicado con un asterisco). La parte inferior muestra el cebador para la amplificación mediante reacción en cadena de polimerasa (RCP) del degP.

Figura 2

Detección del modulo para un seguimiento en línea de la actividad de la luciferasa.

Figura 3

El nivel fundamental y máximo del sistema marcador, que determina la actividad de la luciferasa bajo condiciones no inductoras y bajo condiciones inductoras, respectivamente.

Figura 4

La influencia de las diferentes estrategias de aporte sobre el plegamiento de las proteínas, empleándose una solución de aporte que resulta de una concentración del medio de un 6% de sorbitol y de 2,5 mM de betaína.

Figura 5

La influencia de una coexpresión del chaperón periplásmico Skp sobre el plegamiento de las proteínas.

Figura 6

La cinética de la formación de los minianticuerpos funcionales en función de la estrategia de aporte empleada y de la coexpresión del Skp.

Figura 7

El plásmido marcador plt1 de la DegP-luciferasa y los plásmidos de expresión pTAKFEC, pTAKFECU y pTAKFECTU. Los plásmidos de expresión se diferencian en las secuencias modificadas lac P/O.

Figura 8

Variantes del promotor de los plásmidos de expresión pTAKFEC (P_{lac\_C}), pTAKFECU (P_{lac\_CU}) y pTAKFECTU (P_{lac\_CTU}) en comparación con la secuencia del promotor natural lac (P_{lac\_natural}).

Figura 9

La luminiscencia en relación con la potencia del promotor para los plásmidos de expresión empleados.

Referencias citadas

1. Horn U. et al. High volumetric yields of functional dimeric miniantibodies in Escherichia coli using an optimized expression vector and high cell density fermentation under non-limiting growth conditions (Elevados rendimientos volumétricos de minianticuerpos dímeros funcionales en Escherichia coli con empleo de un vector de expresión optimizado y fermentación con elevada densidad celular bajo condiciones de crecimiento no limitadoras). Appl. Microbiol. Biotechnol. 46, 524-532 (1996)

2. Makrides S.C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. (Estrategias para conseguir expresión de alto nivel de genes en Escherichia coli). Microbiol. Rev. 60, 512-538 (1996)

3. Plückthun A. et al. Producing andibodies in Escherichia coli: From PCR to fermentation, in "Antibody Engineering, A practical approach" (Producción de anticuerpos en Escherichia coli: desde la RCP hasta la fermentación, en "Ingeniería de los anticuerpos, Un enfoque práctico"), IRL press, 203-252 (1996)

4. Blackwell J.R. & Horgan R. A novel strategy for production of a highly expressed recombinant protein in an active form (Una nueva estrategia para la producción de una proteína recombinante altamente expresada en una forma activa). FEBS: Lett. 295, 10-12 (1991)

5. Lippert K. & Galinski E.A. Enzym stabilization by ectoine-type compatible solutes: protection against heating, freezing and drying (Estabilización de enzimas en solutos compatibles de tipo ectoina: protección contra el calentamiento, la congelación y el secado). Appl. Microbiol. Biotechnol. 37, 61-65 (1992)

6. Kets E.P., Galinski E.A., de Wit M., de Bont J.A. & Heipieper H.J. Mannitol, a novel bacterial compatible solute in Pseudomonas putida S 12 (Manitol, un nuevo soluto compatible bacteriano en Pseudomonas putida S 12). J. Bacteriol. 178, 6665-6670 (1996)

7. Louis P. & Galinski E.A. Characterization of genes for the biosynthesis of the compatible solute ectoine from Marinococcus halophilus and osmoregulated expression in Escherichia coli (Caracterización de genes para la biosíntesis del soluto ectoina compatible procedente de Marinococcus halophilus y expresión regulada por osmosis en Escherichia coli). Microbiology 143, 1141-1149 (1997)

8. Wimmer H. et al. Towards a molecular level understanding of protein stabilization: the interaction between lysozyme and sorbitol (Aproximación a una comprensión a nivel molecular de la estabilización de proteínas: la interacción entre lisozima y sorbitol). J. Biotechnol. 55, 85-100 (1997)

9. Xie G. & Timasheff S.N. Mechanism of the stabilization of ribonuclease A by sorbitol: preferential hydration is greater for the denatured then for the native protein (Mecanismo de la estabilización de la ribonucleasa A con sorbitol: la hidratación preferentes es mayor en el caso de la proteína desnaturalizada que en el caso de la proteína natural). Protein Sci. 6, 211-221 (1997)

10. Barth S. et al. Compatible-solute-supported periplasmicexpression of functional recombinant proteins under stress conditions (Expresión de periplasma de ratones soportada por soluto compatible de proteínas funcionales recombinantes bajo condiciones de estrés). Appl. Environ. Microbiol. 66, 1572-1579 (2000)

11. Missiakas D. & Raina S. Protein folding in the bacterial periplasm (Plegamiento de proteínas en el plasma bacteriano). J. Bacteriol. 179, 2465-71 (1997)

12. Missiakas D., Betton J.M. & Raina S. New components of protein folding in extracytoplasmic compartments of Escherichia coli SurA, FkpA and Skp/OmpH (Nuevos componentes del plegamiento de proteínas en compartimentos extracitoplásmicos de Escherichia coli SurA, FkpA y Skp/OmpH). Mol. Microbiol. 21, 871-884 (1996)

13. Horowitz P.M. Ironing out the protein folding problem? (¿Resolución del problema del plegamiento de proteínas?) Nat. Biotechnol. 17, 136-137, (1999)

14. Georgiou G. & Valax P. Expression of correctly folded proteins in Escherichia coli (Expresión de proteínas correctamente plegadas en Escherichia coli). Curr. Opin. Biotechnol. 7, 190-197 (1996)

15. Nieba-Axmann S.E. & Pluckthun A. Chaperone-mediated protein holding (Preservación de proteínas por medio de chaperones). BIOforum international 1, 20-25 (1997)

16. Jung S. & Plückthun A. Improving in vivo folding and stability of a single-chain Fv antibody fragment by loop grafting (Mejora in vivo del plegamiento y de la estabilidad de un fragmento de anticuerpo de hebra sencilla Fv por injerto en bucle). Prot. Eng. 10, 959-966 (1997)

17. Plückthun A. Studying Protein Structure and Function by Directed Evolution: Examples with Engineered Antibodies, Protein dynamics, function and design (Estudio de la estructura y de la función de proteínas por evolución dirigida: Ejemplos con cuerpos sometidos a ingeniería genética, dinámicas, función y diseño de proteínas). (O. Jardetzky and J. F. LeFevre, eds), NATO ASI series, Series A (Life Sciences Vol. 301), Plenum Press, New York (1998)

18. Proba K., Wörn A. Honegger A. & Plückthun A. Antibody fragments without disulfide bonds, made by molecular evolution (Fragmentos de anticuerpos sin enlaces de disulfuro, realizados por evolución molecular). J. Mol. Biol. 275, 245-253 (1998)

19. Wörn A. & Plückthun A. Mutual stabilization of VL and VH in single-chain antibody fragments, investigated with mutants engineered for stability (Estabilización mutua de VL y de VH en fragmentos de anticuerpos de cadena sencilla, investigada con mutantes sometidos a ingeniería genética para su estabilidad). Biochemistry 37, 13120-13127 (1998)

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20. Waldo G.S., Standish B.M., Berendzen J. & Terwilliger T.C. Rapid protein-folding assay using green fluorescent protein (Ensayo rápido de plegamiento de proteínas con empleo de proteína fluorescente verde). Nat. Biotechnol. 17, 691-695 (1999)

21. Wigley W.C., Stidham R.D., Smith N.M., Hunt J.F. & Thomas P.J. Protein solubility and folding monitored in vivo by structural complementation of a genetic marker protein (Seguimiento in vivo de la solubilidad y del plegamientos de proteínas con complementación estructural de una proteína marcadora genética). Nat. Biotechnol. 19, 131-136 (2001)

22. Connelly L., De Las Penas A., Alba B.M. & Gross C.A. The response to extracytoplasmic stress in Escherichia coli is controlled by partially overlapping pathways (La respuesta al estrés extracitoplásmico en Escherichia coli está controlada por vías que se solapan parcialmente). Genes Dev. 11, 2012-2021 (1997)

23. Danese P.N. & Silhavy T.J. The sigma(E) and the Cpx signal transduction systems control the synthesis of periplasmic protein-folding enzymes in Escherichia coli (Los sistemas de transducción de sigma(E) y de la señal Cpx controlan la síntesis de los enzimas de plegamiento de proteínas periplasmico en Escherichia coli). Genes Dev. 11, 1183-1193 (1997)

24. Raivio T.L. & Silhavy T.J. The sigmaE and Cpx regulatory pathways: overlapping but distinct envelope stress responses (Las vías de regulación de sigmaE y Cpx: respuestas al estrés solapadas pero con distinta envoltura). Curr. Opin. Microbiol. 2, 159-165 (1999)

25. Missiakas D., Mayer M.P., Lemaire M., Georgopoulos C. & Raina S. Modulation of the Escherichia coli sigmaE (RpoE) heat-shock transcription-factor activity by the RseA, RseB and RseC proteins (Modulación de la actividad del factor de transcripción de choque térmico sigmaE (RpoE) de la Escherichia coli por las proteínas RseA, RseB y RseC). Mol. Microbiol. 24, 355-371 (1997)

26. De Las Penas A., Connolly L. & Gross CA. The sigmaE-mediated response to extracytoplasmic stress in Escherichia coli is transduced by RseA and RseB, two negative regulators of sigamE (La respuesta sigmaE-dependiente al estrés extracitoplásmico en Escherichia coli es traducida por by RseA y por RseB, dos reguladores negativos de sigamE). Mol. Microbiol. 24, 373-385 (1997)

27. Pogliano J., Lynch A.S., Belin D., Lin E.C. & Beckwith J. Regulation of Escherichia coli cell envelope proteins involved in protein folding and degradation by the Cpx two-component system (Regulación de proteínas de la envoltura celular de Escherichia coli que intervienen en el plegamiento y en la degradación de proteínas por el sistema de dos componentes Cpx). Genes Dev. 11, 1169-1182 (1997)

28. Raivio T.L. & Silhavy T.J. Transduction of envelope stress in Escherichia coli by the Cpx two-component system (Transducción del estrés de envoltura en Escherichia coli por el sistema de dos componentes Cpx). J. Bacteriol. 179, 7724-7733 (1997)

29. Raivio T.L., Popkin D.L. & Silhavy T.J. The Cpx envelope stress response is controlled by amplification and feedback inhibition (La respuesta al estrés de envoltura Cpx está controlada por la amplificación y por la inhibición de la retroalimentación). J. Bacteriol. 181, 5263-5272 (1999)

30. Dartigalongue C. & Raina S. A new heat-shock gene, ppiD, encodes a peptidyl-prolyl isomerase required for folding of outer membrane proteins in Escherichia coli (Un nuevo gen de choque térmico, ppiD, que codifica una peptidil-prolil isomerasa necesaria para el plegamiento de las proteínas de la membrana externa en Escherichia coli). EMBO J. 17, 3968-3980 (1998)

31. Erickson J.W. & Gross C.A. Identification of the sigmaE subunit of Escherichia coli RNA polymerase: a second alternate sigma factor involved in high-temperature gene expresión (Identificación de la subunidad sigmaE de Escherichia coli ARN polimerasa: un segundo factor sigma alternante, que interviene en la expresión génica a temperatura elevada). Genes Dev. 3, 1462-1471 (1989)

32. Wurgler S.M. & Richardson C.C. Structure and regulation of the gene for dGTP triphosphohydrolase from Escherichia coli (Estructura y regulación del gen para la dGTP trifosfohidrolasa procedente de Escherichia coli). Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 87, 2740-2744 (1990)

33. Rouviere P.E. et al. rpoE, the gene encoding the second heat-shock sigma factor, sigmaE, in Escherichia coli (rpoE, el gen que codifica el segundo factor sigma de estrés térmico, sigmaE, en Escherichia coli). EMBO J. 14, 1032-1042 (1995)

34. Raina S., Missiakas D. & Georgopoulos C. The rpoE gene encoding the sigmaE (sigma 24) heat shock sigma factor of Escherichia coli (El gen rpoE que codifica el factor sigma de choque térmica sigmaE (sigma 24) de Escherichia coli). EMBO J. 14, 1043-1055 (1995)

\global\parskip1.000000\baselineskip

35. De Las Penas A., Connolly L. & Gross C.A. Sigma E is an essential sigma factor in Escherichia coli (Sigma E es un factor sigma esencial en Escherichia coli). J. Bacteriol. 179, 6862-6864 (1997)

36. Lipinska B., Sharma S. & Georgopoulos C. Sequence analysis and regulation of the htrA gene of Escherichia coli: a sigma 32-independent mechanism of heat-inducible transcription (Análisis y regulación secuencial del gen htrA de Escherichia coli: un mecanismo independiente de sigma 32 de la transcripción termoinducible). Nucleic Acids Res. 16, 10053-10067 (1988)

37. Lipinska B., Fayet O., Baird L. & Georgopoulos C. Identification, characterization, and mapping of the Escherichia coli htrA gene, whose product is essential for bacterial growth only at elevated temperatures (Identificación, caracterización, y mapeo del gen htrA Escherichia coli, cuyo producto es esencial para el crecimiento bacteriano solamente a temperaturas elevadas). J. Bacteriol. 171, 1574-1584 (1989)

38. Strauch K.L., Johnson K. & Beckwith J. Characterization of degP, a gene required for proteolysis in the cell envelope and essential for growth of Escherichia coli at high temperature (Caracterización del degP, un gen necesario para la proteolisis en el desarrollo celular y esencial para el crecimiento de Escherichia coli a temperatura elevada). J. Bacteriol. 171, 2689-2696 (1989)

39. Lipinska B., Zylicz M. & Georgopoulos C. The HtrA (DegP) protein, essential for Escherichia coli survival at high temperatures, is an endopeptidase (La proteína HtrA (DegP), que esencial para la supervivencia de Escherichia coli a temperaturas elevadas, es una endopeptidasa). J. Bacteriol. 172, 1791-1797 (1990)

40. Danese P.N., Snyder W.B., Cosma C.L., Davis L.J. & Silhavy T.J. The Cpx two-component signal transduction pathway of Escherichia coli regulates transcription of the gene specifying the stress-inducible periplasmic protease, DegP (La vía de transducción de señal dos componentes Cpx de Escherichia coli regula la transcripción del gen que especifica la proteasa periplásmica inducible por estrés, DegP). Genes Dev. 9, 387-398 (1995)

41. Larsen J.E.L., Gerdes K., Light J. & Molin S. Low-copy-number plasmid-cloning vectors amplifiable by derepression of an inserted forgein promotor (Vectores para la clonación de plásmidos con un bajo número de copias amplificable por derepresión de uno xenopromotor insertado). Gene 28, 45-54 (1984)

42. Krebber A., Burmester J. & Pluckthun A. Inclusion of an upstream transcriptional terminator in phage display vectors abolishes background expression of toxic fusions with coat protein g3p (La inclusión de un terminador transcripcional en el sentido ascendente en vectores para la representación de fagos elimina la retroexpresión de las fusiones tóxicas con la proteína de la cápside g3p). Gene 178, 71-74 (1996)

43. Nordström K., Molin S. & Aagaard-Hansen H. Partitioning of plasmid R1 in Escherichia coli. I. Kinetics of loss of plasmid derivatives deleted of the par region (Segregación del plásmido R1 en Escherichia coli. I. Cinéticas de pérdida de derivados plásmidos suprimidos de la región par). Plasmid 4, 215-227 (1980)

44. Nordström K., Molin S. & Aagaard-Hansen H. Partitioning of plasmid R1 in Escherichia coli. II. Incompatibility properties of the partitioning system (Segregación del plásmido R1 en Escherichia coli. II. Propiedades de incompatibilidad del sistema de segregación). Plasmid 4, 332-339 (1980)

45. Danese P.N. & Silhavy T.J. CpxP, a stress-combative member of the Cpx regulon (CpxP, un miembro que combate el estrés del regulón Cpx). J Bacteriol 180, 831-839 (1998)

46. Ades S.E., Connolly L.E., Alba B.M. & Gross C.A. The Escherichia coli sigma(E)-dependent extracytoplasmic stress response is controlled by the regulated proteolysis of an anti-sigma factor (La respuesta al estrés extracitoplásmico dependiente de sigma(E) de Escherichia coli está controlada por la proteolisis regulada de un factor anti-sigma. Genes Dev. 13, 2449-2461 (1999)

47. Bothmann H. & Pluckthun A. Selection for a periplasmic factor improving phage display and functional periplasmic expresión (Selección de un factor periplásmico que mejora la fagorrepresentación y la expresión periplásmica funcional). Nat Biotechnol. 16, 376-380 (1998)

48. S. Barth, M. Huhn, B. Matthey, A. Klimka, E. A. Galinski and A. Engert: "Compatible-Solute-Supported Periplasmic Expression of Functional Recombinant Proteins under Stress Conditions" ("Expresión periplásmica soportada por soluto compatible de proteínas recombinantes funcionales bajo condiciones de estrés") Appl. Env. Microbiol., 66, 1572-1579, (2000)

49. Wimmer H, Olsson M, Petersen MT, Hatti-Kaul R, Peterson SB, Muller N.; Towards a molecular level understanding of protein stabilization: the interaction between lysozyme and sorbitol (Aproximación a una comprensión a nivel molecular de la estabilización de proteínas: la interacción entre lisozima y sorbitol). J. Biotechnol. 55:85-100, (1997)

50. Xie G, Timasheff SN. Mechanism of the stabilization of ribonuclease A by sorbitol: preferential hydration is greater for the denatured then for the native protein (Mecanismo de la estabilización de la ribonucleasa A por sorbitol: la hidratación preferente es mayor en el caso de la proteína desnaturalizada que en el caso de la proteína natural). Protein Sci. 1, 211-21, (1997)

Los ejemplos siguientes describen la invención con mayor detalle sin limitarla.

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Ejemplo 1

Construcciones vectoriales. El vector de expresión del minianticuerpo pTAKFECU se deriva de los vectores de expresión, que han sido descritos previamente, p41FEG1T^{3} y pAK100^{3}. El vector pTAKFECU contiene el gen de resistencia al cloroanfenicol (cat) de pAK100 y el potente promotor lacUV5, introducido mediante mutagénesis localmente dirigida por medio del estuche fagémido Muta-Gene^{TM} (BioRad Laboratories, Richmond, U.S.A.). Se derivó el plásmido pHBFECU, que coexpresa el Skp, mediante la inserción del fragmento MluI-HindIII del pTAKFECU que codifica el promotor lacUV5 y el minianticuerpo antiEGFR en pHB 110^{47}. Se insertó el gen de luciferasa de pSG-luc^{+} (Promega GmbH, Alemania) en el pTrc99A (Amersham Pharmacia Biotech, Alemania) a través de los locus de restricción NcoI y XbaI lo que da como resultado la pTrc-luc^{+}. Se insertó el constructo del plásmido plt1, marcador de la degP-luciferasa, que es un polienlazador sintético con los locus de clonación para el terminador tHP (KpnI, NsiI)^{42},
el promotor degP (NsiI, NcoI) y el gen marcador de luciferasa luc^{+} (NcoI, XbaI) en los locus EcoRI y HindIII de pUC18, lo que da como resultado pUC18PL. El terminador tHP se obtuvo a través del pTAKFECU. El promotor degP se clonó siguiéndose una amplificación mediante RCP a partir de ADN genómico de la Escherichia coli MG1655 (ATCCno. 47076) (los cebadores están representados en la figura 1). El producto de la RCP incluye la secuencia de ADN completa procedente del codón de terminación del gen dGTPasa (dgt), que está localizado en el sentido ascendente (3'-hacia-5') a partir del degP hacia el codón de iniciación de degP (figura 1). El gen de luciferasa luc^{+} se obtuvo a partir de la pSG-luc^{+}. La caja marcadora de luciferasa resultante se clonó en pOU61^{41} a través de locus de restricción único EcoRI y BamHI, dando por resultado el vector plt1 marcador de la degP.

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Ejemplo 2

El diseño del vector plt1 marcador de la degP-luciferasa está basado en el plásmido pOU61^{41}. Su origen R1, genéticamente modificado, es compatible con el derivado colE1 utilizado en el segundo plásmido cotransformado para la expresión de la proteína recombinante. La caja de luciferasa contiene al promotor degP (secuencia de ADN completa procedente del codón de terminación del gen dGTPasa (dgt) localizado en sentido ascendente (3'-hacia-5') a desde el degP hacia el codón de iniciación de degP) y en sentido descendente (5'-hacia-3') seguido por el gen marcador de luciferasa luc^{+} (figura 1). Además de esto, hemos insertado en sentido ascendente (3'-hacia-5') desde degP, un terminador tHP (que reduce la lectura transcripcional a través de los genes localizados en sentido ascendente (3'-hacia-5') hasta en un múltiplo de cinco^{42}). La caja de degP-luciferasa resultante se clonó en pOU61, con lo que se obtuvo el vector plt1.

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Ejemplo 3

Determinación de la actividad de luciferasa en suspensiones celulares de Escherichia coli. Hemos construido el plásmido pTrc-luc^{+}, que permite una inducción de la luciferasa con IPTG, para desarrollar un ensayo funcional para la determinación de la actividad de la luciferasa en la Escherichia coli. Se han realizado varios intentos para la determinación de la actividad de la luciferasa, que incluyen la disrupción celular mediante aplicación de ultrasonidos y tratamiento con diferentes concentraciones de tolueno para que la pared celular sea más permeable a la luciferina. Afortunadamente, las células no tratadas muestran una actividad de luciferasa comparable a la de las células sometidas a disrupción. Esto indica que la luciferina puede difundirse a través de la pared celular de la Escherichia coli. A este respecto hemos determinado la actividad de la luciferasa en ensayos subsecuentes mediante la adición de solución tamponada de luciferina directamente a la suspensión celular. La señal de luciferasa medida se indicó como unidades relativas de luciferasa (RLU).

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Ejemplo 4

Dispositivo para la detección para el seguimiento en línea de la actividad de la luciferasa. El sistema de muestreo está basado en un fermentador bypass acoplado con una bomba peristáltica. El muestreo se inició con una dilución previa continua de la muestra del fermentador empleándose NaCl al 0,9%. Diversos experimentos indican una proporción óptima de dilución previa de 1 : 50, en función de la densidad celular en el momento de iniciación de las mediciones (en nuestro caso OD_{550} = 90). Es necesaria otra dilución que proporcione una OD_{550} = 0,4 constante y exacta para el seguimiento en línea de la actividad de la luciferasa. Esto se consiguió mediante el desarrollo de un controlador de la OD, que consiste en un flujo a través de un fotómetro para determinar la OD real de la dilución previa y un ordenador portátil para calcular la velocidad de una bomba de muestra y de una bomba de dilución. La muestra diluida se mezcló con una solución tamponada de luciferina mediante el empleo de otra bomba con una velocidad constante y se inyectó en una corriente a través de un luminómetro para determinar la actividad de la luciferasa. El tiempo total necesario para un análisis fue de 90 segundos (figura 2).

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Ejemplo 5

Se llevó a cabo un cultivo celular de alta densidad (HCDC) en un biorreactor agitado de 10 litros de conformidad con la publicación de los autores Horn et al.^{1}, empleándose un medio de sal mineral con glucosa. Todas las fermentaciones se llevaron a cabo bajo las mismas condiciones que incluyen una temperatura de 26ºC, una OD_{550} = 0,2 inicial y la adición de IPTG hasta una OD_{550} = 90. Por otra parte, los cultivos previos se inocularon con conservas de glicerol de la misma cepa. El aporte de glucosa se llevó a cabo mediante el empleo de un análisis de la inyección del flujo de glucosa que permite un crecimiento ilimitado de las células durante toda la fermentación con el fin de evitar cualquier estrés adicional. Al cabo de un tiempo de 29 horas, que incluye un período de inducción de 5 horas, se alcanzaron densidades celulares finales con un rango de OD_{550} = 110 que corresponde a 25 gL^{-1} (figuras 3-5) de biomasas secas.

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Ejemplo 6

Se analizó el seguimiento en línea de la proteína con plegamiento incorrecto mediante la expresión de un minianticuerpo recombinante específico del receptor EGF humano. El minianticuerpo está constituido por un fragmento scFv con una bisagra fusionada en posición C-terminal seguida de un motivo de hélice-giro-hélice, que produce la homodimerización in vivo. El minianticuerpo es codificado por el plásmido pTAKFECU, derivado de nuestros vectores de expresión, que han sido descritos precedentemente, p41FEG1T y pAK100^{3}. La expresión se llevó a cabo en Escherichia coli RV308 (ATCC no. 31608). Esta hebra es especialmente adecuada para HCDC debido a su velocidad drásticamente disminuida para la formación de acetato. La Escherichia coli RV308 se sometió a una cotransformación con pTAKFECU y con el vector plt1 marcador de la degP-luciferasa en forma de un sistema plásmido dual para evaluar la proporción de minianticuerpos plegados de manera incorrecta.

Se determinaron los nivel fundamental y máximo de la actividad de la luciferasa para evaluar el rango de trabajo de nuestro sistema. Con esta finalidad se comparó una primera fermentación, bajo condiciones no inductoras, con una expresión inducida de IPTG del minianticuerpo. Se determinaron las actividades de la luciferasa cada 15 minutos. Las mediciones se iniciaron con una densidad celular de OD_{550} = 75 para ambas fermentaciones, pero la inducción del minianticuerpo de la segunda fermentación se inició 30 minutos más tarde con una OD_{550} = 90. Para el cultivo no inducido se determinó únicamente un bajo nivel fundamental de aproximadamente 40 unidades de luminiscencia relativa (RLU) durante toda la fermentación. En la primera fase, tras inducción del minianticuerpo, la señal de la luciferasa era comparable con la del cultivo no inducido. En contraste con lo anterior, hemos obtenido un fuerte incremento de la señal de la luciferasa 2 horas tras inducción correspondiente a la cinética de formación del producto del minianticuerpo funcional (figura 3, figura 6).

Hemos ensayado tres estrategias de aporte diferentes, empleándose una solución de aporte que da como resultado una concentración del medio del 6% de sorbitol y de 2,5 mM de betaína, para determinar la influencia de los agentes promotores del plegamiento sobre la proporción de minianticuerpo con plegamiento incorrecto. La señal de luciferasa alcanza únicamente el nivel fundamental en el caso del aporte bien al inicio de la fermentación o simultáneamente con la inducción. Sin embargo, cuando la solución de aporte fue añadida 2 horas tras la inducción correspondiente al inicio de la formación del producto se produjo un incremento de la señal de la luciferasa comparable con la del cultivo inducido sin cualquier aporte, seguido de un nivel constante de aproximadamente 170 RLU durante el resto del cultivo (figura 4).

Además de esto, hemos analizado la influencia de una coexpresión del chaperón periplásmico Skp sobre una expresión de minianticuerpo. Con esta finalidad se clonó en pHB 110, que codifica al Skp, la secuencia de ADN del minianticuerpo con inclusión de la región promotora lacUV5 y la secuencia de señal pelB. El plásmido resultante pHBFECU se sometió a una cotransformación con el plt1 en Escherichia coli RV308. De manera similar, tanto al cultivo sin aporte y con aporte de agentes promotores del plegamiento en el punto de iniciación de la formación del producto, hemos obtenido el incremento de la señal de la luciferasa al cabo de 2 horas tras la inducción. En contraste con estos cultivos en la coexpresión de Skp, el incremento obtenido para el gradiente fue más bajo y alcanzó un máximo de 230 RLU, únicamente comparable con la de aquellas con aporte de solución promotora del plegamiento en el punto de partida de la formación del producto (figura 5).

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Ejemplo 7

Seguimiento en línea de la actividad de la luciferasa. El sistema de muestreo empleado para el seguimiento en línea de la actividad de la luciferasa está ilustrado en la figura 2. El fermentador de bypass estaba realizado con una bomba peristáltica (504U, Watson Marlow, Falmouth, Inglaterra) seguido por una dilución previa continua de la muestra del fermentador con NaCl al 0,9% en una relación de 1 : 50 empleándose una bomba peristáltica de cuatro canales MS-CA4/840 (Ismatec GmbH, Wertheim-Mondfeld, Alemania). El controlador de la OD está basado en un fotómetro de flujo continuo (VIS Jenway 6300, Jenway Inc., Princeton, U.S.A.) para determinar la OD real de la dilución previa y un ordenador portátil para calcular la velocidad de la muestra y de la bomba de dilución (bomba peristáltica ISM Reglo 12/100, Ismatec GmbH, Wertheim-Mondfeld, Alemania). Los valores fueron calculados mediante el empleo del programa informático Dasylab (GBMmbH, Mönchengladbach, Alemania). Se mezcló una muestra de fermentador con una OD_{550 \ nm} = 0,4 constante con una solución de luciferina en una proporción de 1 : 1. Con esta finalidad se disolvieron 5 mg de la sal de sodio de la D-luciferina en 1,250 \mul de H_{2}O. Se añadieron 100 \mul de esta solución a 9,9 ml de tampón de luciferina, que contenía tricina 25 mM, MgCl_{2} 15 mM, ATP 5 mM, mercaptoetanol 7 mM y 5 mg de BSA, a pH 7,8. Se necesitan 0,5 ml de la solución de luciferina para un análisis. Se midió la actividad de la luciferasa con un detector luminiscente de flujo continuo LEO (Wallac GmbH, Freiburg, Alemania) y se calculó empleándose el programa informático Dasylab (GBMmbH, Mönchengladbach, Alemania). La señal de luciferasa medida se indicó como unidades de luciferasa relativas (RLU).

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Ejemplo 8

Ensayo miniaturizado para la optimización de la expresión proteica en paralelo y el seguimiento del plegamiento de la proteína. Se ha adaptado a microvolúmenes el principio básico descrito para el seguimiento y la optimización de proteínas, para llevarlo al formato de una placa de microtitulación o incluso menor. El sistema de ensayo comprende el minianticuerpo antiEGFR. Como se ha descrito precedentemente, se ha empleado el plásmido marcador plt1 con los plásmidos pTAKFEC, pTAKFECU y pTAKFECTU para la cotransformación de Escherichia coli K12 RV308. El plásmido comprende variantes de los promotores lac, con lo que permite la expresión diferencial del minianticuerpo como se ha mostrado en las figuras 7 y 8. La medida de la actividad de la luciferasa de la proteína plt1 marcadora indica que la porción de la proteína con plegamiento incorrecto está relacionada con el promotor individual usado como se ha mostrado en la figura 9. De este modo, el sistema marcador plt1 codificado por el plásmido es adecuado para la optimización de la expresión con respecto al promotor individual que debe ser seleccionado.

Se realizaron cultivos en placas de microtitulación en 100 \mul de medio de sal mineral (Horn et al., 1996 a una temperatura de 26ºC, empleándose un termostato con aplicación de sacudidas a la placa de microtitulación calentable (firma DMG Medizintechnik GmbH, Offenburg, Alemania)). La inoculación de las placas madre se llevó a cabo empleándose 10 \mul de una solución madre en glicerol de cepas individuales. El resultado ha sido mostrado en (figura 3) y se ha llevado a cabo por triplicado. La estimación de la actividad de la luciferasa ha sido medida tras la adición de 100 \mul de solución de luciferina y se midió con un lector de quimioluminiscencia Victor 1420 Multilabel Counter (firma Wallac GmbH, Freiburg, Alemania). Para medir la cinética, dada en la figura 9, se ha evaluado la actividad de la luciferasa en cultivos paralelos en los instantes indicados.

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Ejemplo 9

Correlación entre la señal de la luciferasa y la proporción de los minianticuerpos funcionales. Se determinó la cantidad de los minianticuerpos funcionales mediante el empleo del ensayo ELISA, basado en el dominio extracelular del receptor EGF humano. Se analizaron muestras de las células que expresan el minianticuerpo a las 0 horas, al cabo de 1,5 horas, al cabo de 3,0 horas y al cabo de 4,5 horas con el fin de obtener una cinética del producto. Los resultados muestran un rendimiento claramente mejorado de los minianticuerpos funcionales, en función de que se utilice la estrategia del aporte de los agentes promotores del plegamiento (figura 6). Esto indica que la señal de la luciferasa, determinada para el minianticuerpo con plegamiento incorrecto, es indirectamente proporcional a la cantidad de los minianticuerpos funcionales.

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Ejemplo 10

Determinación cuantitativa de la cantidad funcional de los minianticuerpos. Las cantidades de los minianticuerpos antiEGFR funcionales se determinaron mediante un enzimoinmunoanálisis de absorción (Enzyme-Linked Immunosorbant Assay ELISA) funcional de acuerdo con los autores Horn et al.^{1} empleándose el dominio extracitoplásmico del EGER humano (Merck KGaA, Darmstadt, Alemania).

Claims (19)

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   1. Un procedimiento para el seguimiento funcionalmente correcto del plegamiento o del plegamiento incorrecto de una proteína diana in vivo en un proceso recombinante que comprende la aplicación de un gen marcador, es decir bajo el control del promotor de la proteasa periplasmática DegP, a un sistema de expresión que expresa dicha proteína diana, siendo la producción del producto génico del gen marcador en dicho sistema de expresión una medida del plegamiento incorrecto de la proteína diana.
2. 2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la secuencia promotora DegP está modificada en las proximidades del codón de iniciación del gen marcador, que está fusionado con el promotor en el sentido descendente.
3. 3. Un procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicho promotor DegP tiene la secuencia indicada en la figura 1.
4. 4. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el gen marcador es el gen de luciferasa (luc^{+}).
5. 5. Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que se utiliza una caja génica DegP - luc^{+} clonada en un vector.
6. 6. Un procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicho vector es el plt1 que comprende las secuencias de ADN como se han indicado en la figura 7.
7. 7. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que se sigue la producción del producto del gen marcador por medio de un procedimiento de medición de la cinética en línea.
8. 8. Un procedimiento para la optimización del plegamiento funcionalmente correcto de una proteína diana en un procedimiento de expresión y de fermentación que comprende (i) el seguimiento del plegamiento de dicha proteína diana de conformidad con el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, (ii) la modulación del plegamiento de la proteína mediante coexpresión del chaperón periplasmático Skp y/o adición de uno o más agentes que promuevan el plegamiento funcionalmente correcto de la proteína y, opcionalmente (iii) la repetición de la etapa (i) y (ii) hasta que se obtenga un óptimo de la proteína plegada funcionalmente correcta.
9. 9. Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que dicho agente promotor del plegamiento es un poliol y/o un derivado de la betaína.
10. 10. Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que dicho agente promotor del plegamiento se elige entre el grupo formado por glicerol, sorbitol, glicina betaína, hidroxiectoína.
11. 11. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que se usa un sistema de expresión bacteriana.
12. 12. Un procedimiento según la reivindicación 11, en el que dicho sistema de expresión bacteriana es E. coli.
13. 13. Un procedimiento según la reivindicación 12, en el que dicha E. coli es RV308 (ATCC 31608).
14. 14. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, en el que se utiliza un sistema plásmido dual constituido por un primer plásmido, que comprende los genes promotores/marcadores y un segundo plásmido, que comprende el gen que codifica la proteína diana debiéndose optimizarse el plegamiento de la misma cuando es expresada.
15. 15. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, en el que el seguimiento y la modulación se llevan a cabo en línea y simultáneamente durante la fase de producción.
16. 16. Un procedimiento para la producción de una proteína diana recombinante que tiene propiedades de plegamiento optimizadas mediante cultivo de células huésped bacterianas en un nutriente y aislamiento y purificación de dicha proteína diana plegada optimizada, comprendido dicho procedimiento un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15.
17. 17. Un procedimiento según la reivindicación 16, en el que dicha proteína diana es una proteína de fusión.
18. 18. Un procedimiento según la reivindicación 17, en el que dicha proteína de fusión es un Fv y/o minianticuerpo de cadena sencilla.
19. 19. Un estuche para la expresión de una proteína diana que tiene propiedades de plegamiento mejoradas en un sistema celular huésped bacteriano, que comprende un primer paquete que comprende un plásmido que contiene el gen de dicha proteína diana, un segundo paquete, que comprende un plásmido, que contiene la caja génica DegP - luc^{+} y un tercer paquete que contiene las células huésped bacterianas, que son transformadas con dichos plásmidos.

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