PT1223813E - Kluyveromyces lactis como iniciador atenuado - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "KLUYVEROMYCES LACTIS COMO INICIADOR ATENUADO" Âmbito da invenção

Esta invenção relaciona-se com um processo para produzir queijo, análogos de queijo e produtos derivados de queijo, e mais especificamente com um método para aumentar a taxa de formação de sabor, aroma e textura e/ou para alargar a gama de sabores, aromas e texturas.

Descrição da técnica anterior

Os hábitos alimentares no Mundo mostram um uso aumentado de queijo e outros produtos de leite fermentado. Existe uma enorme variedade de tipos de queijo, análogos de queijo e produtos derivados de queijo e, consequentemente, de métodos de produção para obter aqueles produtos. A produção de queijo inicia-se com a coagulação do leite, a qual é provocada por uma ação proteolítica especifica da quimosina ou enzimas similares, tais como as encontradas em coalhos de origem animal ou microbiana. As bactérias do ácido láctico (i.e. iniciadores tais como Lactococci) são adicionadas para se obter a acidificação exigida do leite dependendo da tecnologia de queijo envolvida. A coalhada resultante é composta principalmente de caseina em conjunto com as gotas de gordura do leite que são retidas por inclusão. Uma fração substancial do coalho e das bactérias do ácido láctico também acaba na coalhada. Depois de se pressionar o soro de leite para reduzir o teor de água, o queijo novo é sujeito a um processo de maturação, a fim de 2 dar ao queijo final os seus desejados sabor, aroma e textura. A formação de sabor, aroma e textura do queijo, análogos de queijo e produtos derivados de queijo é um processo que envolve reações complexas e bem equilibradas entre a glicólise, proteólise e lipólise dos componentes do leite e degradação adicional de aminoácidos. Os produtos de degradação da gordura e da proteina do leite (péptidos, aminoácidos livres, de monoglicéridos, compostos derivados de aminoácidos e ácidos gordos livres tais como aminas, cetoácidos, aldeídos, cetonas, álcoois, ésteres, ácidos e compostos de enxofre) contribuem todos para as propriedades específicas de sabor, aroma e textura do queijo em questão. A proteólise durante a maturação do queijo pode ser extensa (Fox, 1989). No queijo duro, 25-35% da proteína insolúvel do coalho pode ser convertida em proteína solúvel. Nas variedades moles tais como Brie, Camembert ou Limburger, mais de 80% da proteína insolúvel pode ser convertida em compostos solúveis em água tais como péptidos, aminoácidos e amónia (Foster et al.. 1983). A formação do sabor no queijo, análogos de queijo e produtos derivados de queijo é um processo que envolve uma cascata de reações enzimáticas. Partindo de aminoácidos, os compostos incluindo aminas, cetoácidos, aldeídos, cetonas, álcoois, ésteres, ácidos e compostos de enxofre podem ser formados como produtos intermédios e/ou sabores finais. A descarboxilação dos aminoácidos resulta na formação das aminas correspondentes e é catalisada por várias descarboxilases da classe de enzima EC. 4.1.1. Exemplos específicos são a lisina descarboxilase (EC. 4.1.1.18), arginina descarboxilase (EC. 4.1.1.19), histidina descarboxilase (EC. 4.1.1.22) e várias outras. 3

Subsequentemente, as aminas podem ser convertidas nos aldeídos correspondentes e amónia por desaminação oxidativa envolvendo enzimas tais como amina oxidases (EC. 1.4.3.6). Os aldeídos podem ser adicionalmente oxidados nos ácidos correspondentes pelas aldeído desidrogenases da classe EC. 1.2 (as subclasses são formadas de acordo com o aceitador de eletrão e/ou hidrogénio) ou reduzidos nos correspondentes álcoois pelas álcool desidrogenases (as subclasses EC. 1.1 são formadas de acordo com o dador de eletrão e/ou de hidrogénio). Alternativamente, os aminoácidos podem ser convertidos através de reações de desaminação e transaminação. A desaminação resulta nos correspondentes alfa-cetoácidos e amónia e requere a ação de aminoácido oxidases ou desidrogenases tais como EC. 1.4.1.5 e EC. 1.4.3.2. A transaminação resulta também nos correspondentes alfa-cetoácidos mas o grupo amina é transferido para outro cetoácido aceitador (por exemplo alfa-cetoglutarato ou oxaloacetato) com uma concomitante transferência do grupo oxigénio do cetoácido aceitante para o aminoácido. Neste caso não é libertada amónia. Esta reação requere a ação de várias aminotransferases também chamadas transaminases, de enzimas da classe EC. 2.6.1. Os cetoácidos formados por desaminação e transaminação dos aminoácidos podem ser adicionalmente convertidos em aldeídos por descarboxilação envolvendo várias descarboxilases de enzimas da classe EC.4.1.1.

Em processos normais (i.e. não acelerados), a formação de sabor, aroma e textura é efetuado por enzimas endógenas do leite tais como plasmina e por enzimas exógenas tais como o coalho usado para a coagulação. Mais ainda, as culturas iniciadoras tais como as bactérias do ácido láctico usadas para a acidificação inicial do leite, também contribuem para a maturação do queijo dado que uma fração considerável das bactérias usualmente acaba na coalhada. As suas 4 atividades proteolíticas extracelulares e peptidoliticas intracelular combinadas e as enzimas que degradam ainda mais os aminoácidos nos compostos listados acima, são capazes de quebrar a fração da caserna. As protéases, peptidases, esterases, lipases e as enzimas do catabolismo de aminoácido nas bactérias do ácido láctico têm sido extensivamente estudadas (Urbach, 1995; Gobbetti et al., 1996; Gao et al., 1997; Law e Haandrikman, 1997) . No entanto, as de outros iniciadores, tais como propionibactéria e a flora de superfície, têm sido estudadas muito menos extensivamente.

Uma desvantagem comum na maior parte dos métodos de produção é a do processo de maturação, i.e. um processo de formação de sabor, aroma e textura, muito longo, que se estende de dias até vários meses e em alguns casos anos. Por razões económicas, um menor tempo de maturação é altamente desejável. A aceleração da maturação é mais pertinente para variedades de baixo teor de humidade, de maturação lenta e a maioria dos trabalhos publicados foi feita em cheddar (Fox et al., 1996). Para além disso, existe uma necessidade industrial do aumento da gama de tipos de sabor, aroma e textura dos queijos, análogos de queijo e produtos derivados de queijo. 0 aumento da taxa e da extensão da formação de sabor, aroma e textura e o aumento da gama de sabores, aromas e texturas pode ser atingido tanto através de outras bactérias como por adição de outras enzimas. A alteração do conteúdo das enzimas das bactérias do ácido láctico no queijo afeta diretamente a taxa de referida maturação e do sabor final. Um dos modos mais eficientes para aumentar o conjunto de enzimas bacterianas na coalhada de queijo, sem alterar a iniciação primária e a feitura do 5 queijo, é adicionar todas as bactérias do ácido láctico as quais são capazes de crescer e produzir quantidades siqnificativas de ácido láctico, mas que podem ainda fornecer enzimas de maturação ativas durante a fase de maturação. Estes iniciadores são chamados "atenuados".

Os iniciadores atenuados podem ser preparados através de vários tratamentos tais como aquecimento, congelação, secagem por pulverização, liofilização, fragilização usando lisozimas ou solventes, ou por seleção de tratamento de mutantes negativos de lactose (ver Klein e Lortal para uma revisão recente). Pettersson e Sjõstrõm referiram a primeira preparação e uso de iniciadores atenuados como aditivos em queijo, em 1975. Nessa altura, o seu principal objetivo foi acelerar a proteólise e encurtar o tempo de maturação, o que foi do maior interesse económico. Atualmente, na maioria dos paises desenvolvidos a qualidade higiénica do leite é tão alta que o problema não é só encurtar o tempo de maturação mas também melhorar o seu sabor. Isto é particularmente verdadeiro para novos tipos de queijo tais como os feitos a partir de leite UF ou de baixo teor em gordura, o qual geralmente exibe fraco desenvolvimento de sabor e uma textura aborrachada (EI Soda et al., 1991). Os iniciadores atenuados se foram bem conhecidos e feitos de forma reprodutível, podem melhorar tanto a taxa de maturação como a qualidade do queijo (Fox, 1988; EI Soda e Pandian, 1991).

Enzimas tais como as protéases e lipases são usadas para o fabrico de queijo, análogos de queijo e produtos derivados de queijo nos quais a taxa de formação de sabor, aroma e textura é aumentada e a gama de sabores, aromas e texturas é aumentada significativamente (Conner, 1988; Tye et al. 1988). 0 Pedido de Patente Internacional WO 96/38549 divulga o uso de uma aminopeptidase de Aspergillus e a 6

Especificação da Patente Europeia EP 0167309 divulga o uso de uma lipase fúngica. Em geral, estas enzimas implementadoras de sabor podem ser adicionadas na forma de bactérias atenuadas (ver acima), como uma pasta (Kosikowski, 1988), como soluções (Law, 1980), através de técnicas de encapsulação (Braun e Olson, 1986; Alkhalaf et al., 1988; EI Soda et al., 1989), como enzimas solúveis com sal (Green, 1985) ou como as próprias enzimas. O uso de proteinases de Kluyveromyces lactis para a maturação do queijo é divulgada em Grieve PA et ai., Partial characterization of cheeseo-ripening proteinases produced by the yeast Kluyveromyces lactis, Journal of Dairy Research, vol. 50, no. 4, página 469-480, 1983. A produção de sabor na coalhada de queijo por cocultura com leveduras, tal como por exemplo Kluyveromyces lactis, fungos e bactérias selecionados é divulgada em Martin N et al., Journal of Dairy Science, vol. 82, no. 6, páginas 1072-1080, 1999. O uso de iniciadores atenuados para aceleração da maturação do queijo é divulgado em Fox PF, Food Biotechnology, vol 2, no. 2, páginas 133-185, 1988-1989 e em Bartels HJ, Johnson ME, Olson NF, Milchwissenschaft, Jahrgang 42, Heft 3, páginas 139-144, 1987 .

Sumário da invenção A presente invenção fornece um processo para produzir um queijo, um análogo de queijo ou um produto derivado de queijo o qual processo compreende contatar um queijo; um análogo de queijo ou um produto derivado de queijo ou um precursor de qualquer destes com uma célula de Kluyveromyces lactis como definido nas reivindicações. 7 0 processo da invenção para a produção de um queijo, um análogo de queijo ou um produto derivado de queijo pode resultar numa taxa aumentada de formação de sabor, aroma ou textura e/ou na ampliação da gama de sabores, aromas ou texturas dos produtos produzidos.

Descrição da invenção

Pelo termo queijo entendemos um produto lácteo pertencente a: uma variedade de queijo mole, por exemplo, Camembert, Munster ou Livanot; uma variedade semi-dura tal como Tomme de Savoie, Gouda, Edam ou Mimolette; ou uma variedade de queijo duro tal como Cheddar, Gruyere ou os queijos Suiços ou Parmesão.

Pelo termo análogo de queijo entendemos um produto composto de: (i) proteina de leite, por exemplo caseína ou caseinato, e/ou concentrado proteico de soro coagulado por acidificação ou por tratamento de aquecimento e (ii) agente aromatizante de queijo.

Pelo termo produto derivado de queijo entendemos ou um queijo processado, por exemplo, uma mistura pré-aquecida de queijos, manteiga ou outros materiais gordos, sais de fusão ou qualquer tipo de coalhada de queijo a que são adicionadas enzimas com vista a dar as desejadas propriedades de textura e aroma.

Pelo termo precursor entendemos qualquer substância que está presente no processo da invenção a qual acabará por se tornar um queijo, um análogo de queijo ou um produto derivado de queijo. Assim um precursor pode ser leite, manteiga ou coalhada de queijo por exemplo. As células de levedura alternadas podem ser contatadas com um queijo, um análogo de queijo ou um produto derivado de queijo ou um precursor de qualquer destes em qualquer ponto durante o fabrico de um daqueles produtos. Portanto, as células de levedura podem ser adicionadas ao leite ou em alternativa podem ser adicionadas ao queijo novo durante a maturação.

Pelo termo maturação entendemos a formação de sabor, aroma e textura de um queijo, um análogo de queijo, ou um produto derivado de queijo. A maturação envolve reações complexas e bem equilibradas incluindo glicólise, proteólise e lipólise dos componentes do leite e degradação adicional dos aminoácidos em aminas, cetoácidos, aldeídos, cetonas, álcoois, ésteres, ácido e compostos de enxofre por uma cascada de reações enzimáticas, por exemplo, descarboxilação, transaminação, desaminação, oxidação ou redução.

Pelo termo levedura entendemos uma categoria não taxonómica de fungos que é definida em termos de critérios morfológicos e fisiológicos (P. Singleton, 1994). Kluyveromyces lactis é uma saprótrofa unicelular a qual pode metabolisar hidratos de carbono por fermentação e nas quais a reprodução assexuada ocorre por gemulação.

Pelo termo célula de levedura atenuada, entendemos uma célula de levedura, que foi tratada de modo a que pelo menos 80%, preferencialmente mais que 90% e mais preferencialmente 99% das células são mortas mas não lisadas enquanto que mais de 50%, mais preferencialmente mais de 90% da atividade de enzima intracelular da célula, compreende as enzimas de maturação protéases, peptidases, lipases, esterases, descarboxilases, aldeído desidrogenases, amino oxidases, álcool desidrogenases, aminoácido desidrogenases, aminoácido oxidases, amino transferases e/ou transaminases, é mantida. A atividade da aminopeptidase pode ser usada para determinar a quantidade 9 da atividade da enzima que é mantida. A viabilidade das células pode ser medida em CFU/mL plaqueando uma diluição das células atenuadas em placas de aqar YEG adequado. Tipicamente, no método da invenção para a produção de queijo, um análoqo de queijo ou um produto derivado de queijo, o queijo, o análoqo de queijo ou o produto derivado de queijo são contatados com uma população de células, a qual população de células compreende células atenuadas. Tipicamente a população de células compreende pelo menos 80%, preferencialmente 90% e mais preferencialmente pelo menos 99% de células atenuadas.

Pelo termo protéases entendemos enzimas que hidrolisam um substrato de proteína de uma forma endo e que são classificadas pelo Comité de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular como EC. 3.4.21 (serina endopeptidases) , EC. 3.4.22 (cisterna endopeptidases) , EC. 3.4.23 (endopeptidases aspárticas) , EC. 3.4.24 (metaloendopeptidases) ou EC. 3.4.99 (endopeptidases de mecanismo catalítico desconhecido).

Pelo termo peptidases entendemos enzimas que hidrolisam um substrato de proteína ou péptido num modo exo, i.e. a partir tanto do lado N-terminal (por exemplo aminopeptidases) como do lado C-terminal (por exemplo carboxipeptidases) do substrato e que são classificadas pelo Comité de Nomenclatura da União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular como EC. 3.4.11 (aminopeptidases), EC. 3.4.13 (dipeptidases), EC. 3.4.14 (dipeptidil- e tripeptidil-peptidases) , EC. 3.4.15 (peptidilpeptidases), EC. 3.4.16 (carboxipeptidases tipo serina), EC. 3.4.17 (metalocarboxipeptidases), EC. 3.4.18 (carboxipeptidases tipo cisteína) ou EC. 3.4.19 (peptidases ómega). 10

Pelo termo lipase ou esterase entendemos enzimas que pertencem à classe de enzimas E.C. 3.1.1.

Pelo termo descarboxilases entendemos enzimas que pertencem à classe de enzimas EC. 4.1.1 e que convertem aminoácidos nas suas correspondentes aminas e C02 ou que convertem alfa-cetoácidos nos seus correspondentes aldeidos e C02.

Pelo termo amina oxidases entendemos enzimas que pertencem à classe EC. 1.4.3 e que convertem as aminas primárias nos seus correspondentes aldeidos e amónia por desaminação oxidativa.

Pelo termo aldeido desidrogenase entendemos enzimas que pertencem à classe de enzimas EC. 1.2 e que convertem aldeidos nos seus ácidos correspondentes na presença de um aceitador de eletrão e/ou hidrogénio tal com NAD+ ou NADP+ (EC1.2.1), um citocromo (EC1.2.2), oxigénio (EC1.2.3) e um dissulfureto (EC1.2.4).

Pelo termo álcool desidrogenase entendemos enzimas que pertencem à classe de enzimas EC.1.1 e que converte aldeidos no seu álcool correspondente na presença de dador de eletrão e/ou hidrogénio tal como NADH+ ou NADPH+ (EC1.1.1) e um citocromo (EC1.1.2).

Com os termos aminoácido desidrogenase e aminoácido oxidase entendemos enzimas que pertencem à classe de enzimas EC. 1.4 e que convertem aminoácidos nos seus correspondentes alfa-cetoácidos e amónia na presença de um aceitador de eletrão e/ou hidrogénio tal como NADH+ ou NADPH+ (EC.1.4.1 desidrogenases), um citocromo (EC. 1.4.2-desidrogenases) e oxigénio (EC1.4.3-oxidases). 11

Com o termo aminotransferase ou transaminase, entendemos enzimas que pertencem à classe de enzimas EC. 2.6.1 e que convertem aminoácidos nos seus correspondentes alfa-cetoácidos, na presença de outra amina aceitando e oxo-doando alfa-cetoácido tal como alfa-glutarato ou oxaloacetato.

Verificou-se agora, surpreendentemente, que enzimas Kluyveromyces lactis, como parte de células de K. lactis atenuadas, são muito eficientes na degradação das proteínas do leite em péptidos e aminoácidos simples assim como a subsequente conversão de aminoácidos simples em moléculas de aromas tais como aminas, cetoácidos, aldeídos, cetonas, álcoois, ésteres, ácido ou compostos de enxofre.

Por enzimas de levedura entendemos enzimas autóctones, ou seja enzimas que naturalmente estão presentes nas células de levedura e cumprir uma função natural, por exemplo função metabólica na célula de levedura.

Além disso, verificamos que as células de Kluyveromyces lactis atenuadas podem ser vantajosamente usadas para aumentar substancialmente a taxa de formação de sabor, aroma e textura do queijo, análogos de queijo ou produtos derivados de queijo e/ou para alargar a gama de sabores, aromas e texturas do queijo, análogos de queijo ou produtos derivados de queijo. Verificamos que no processo de produção de queijo, podem ser usadas células de K. lactis atenuadas.

Num aspeto a invenção fornece um processo para produzir queijo, análogos de queijo ou produtos derivados de queijo, o qual método compreende contatar um queijo, um análogo de queijo e/ou um produto derivado de queijo ou um precursor 12 destes com células de Kluyveromyces lactis conforme definido nas reivindicações. Preferencialmente, o passo de contatar do método da invenção é realizado sob condições adequadas para que a maturação ocorra.

As células de Kluyveromyces lactis adequadas para uso num processo da invenção são atenuadas preferencialmente por um tratamento de microondas.

As células de levedura para uso num método da invenção podem ser uma levedura modificada de modo a que preferencialmente sobre expresse uma protease, uma peptidase, uma lipase, uma esterase ou uma enzima que converta um aminoácido num composto com aroma da invenção. Uma célula modificada para uso num processo da invenção pode ser uma célula qeneticamente modificada, por exemplo uma célula recombinante ou uma célula identificada através de uma de triagem de mutagénese aleatória. As enzimas derivadas de uma célula modificada podem ser usadas no processo da invenção.

Breve descrição das figuras A Figura 1 mostra a libertação de grupos amina livres durante uma degradação cinética da beta-caseina. Para os pormenores ver Exemplo 4. A Figura 2 mostra a melhoria da proteólise nos queijos contendo a levedura atenuada. 13 EXEMPLO 1

Cultura de Kluyveromyces lactis

Kluyveromyces lactis foi crescida num meio YEG líquido (10 g/L de extrato de Levedura, 20 g/L de Bactopeptona e 20 g/L de dextrose), pH=6,5 a 30°C. A cultura dá-se em 3 passos.

Passo 1 - Preparação de material de inoculação congelado

Num primeiro passo, suspensões muito densas de células foram preparadas com vista a serem usadas como material de inoculação em fermentações posteriores. Três frascos de 500 mL, cada contendo 330 mL de meio YEG foram inoculados com uma colónia de leveduras provenientes de uma placa de YPD (Levedura Peptona Dextrose). Os frascos foram incubados num agitador rotativo a 220 rpm durante 48 h a 30°C. Adicionou-se depois Glicerol a uma concentração final de 15% após o que a suspensão de célula foi guardada a -80°C.

Passo 2 - Pré-cultura

Foram realizadas três subculturas a 2% em intervalos de 12 horas. As primeiras duas subculturas foram realizadas em tubos de 10 mL de meio YEG e a última foi realizada num frasco de 250 mL contendo 50 mL de meio YEG.

Passo 3 - Cultura em larga escala

Três garrafas de 500 mL contendo cada 330 mL de meio YEG foram usadas para a cultura. Cinco mililitros da pré-cultura (passo 2 - i.e. 1,5%) foram usadas para cada frasco. Às 12 horas, a cultura estava numa fase de crescimento inicial exponencial e a DO a 650 nm foi 1,5 até 14 2. As células foram recolhidas por centrifugação a 18,900 g durante 20 minutos a 4°C e lavadas duas vezes com água destilada esterilizada fria. Os sedimentos de células foram armazenados a 20°C. EXEMPLO 2

Preparação de um extrato sem células de Kluyveromyces lactis

Os sedimentos de células congelados, preparados de acordo com o Exemplo 1 foram descongelados num leito de gelo e ressuspendidos em 50 mL de água destilada esterilizada fria (DO a 650nm= 30-40) e em seguida rompidas a 1000 Bars numa compressor de células French refrigerado. As células não rompidas e os restos das células foram removidos por centrifugação a 39,200 g durante 20 minutos a 4°C e o sobrenadante recolhido foi esterilizado por filtração (0,45 micron depois 0,20 micron), distribuídos por tubos Eppendorf estéreis e armazenadas a -20°C até serem usadas. 0 conteúdo em proteína do extrato sem células foi determinado de acordo com o método de Lowry usando albumina sérica de bovino como padrão (Lowry et al. 1951). Tipicamente, o extrato sem células tinha um conteúdo em proteína de 2-4 mg/mL dependendo da estirpe. EXEMPLO 3

Preparação de beta-caseína

Para determinar a atividade peptidase do extrato sem células de K. lactis e/ou bactérias do ácido láctico, a beta-caseína foi escolhida como substrato dado ser um 15 substrato de queijo representativo e também a fração de caserna mais hidrolisada em queijos semi-duros maturados (Ferranti et al. 1997 e Gouldsworthy et al. 1996). A beta-caseina foi purificada a partir de leite como descrito em Le Magnen e Maugas (1992). Em seguida foi parcialmente hidrolizada usando as endoproteases tripsina (EC. 3.4.21.4) e quimiotripsina (EC. 3.4.21.1) com vista a gerar pequenos péptidos que são substratos mais adequados para as peptidases no extrato sem células descrito no Exemplo 2 acima. A tripsina foi escolhida porque tem a mesma especificidade que a enzima plasmina endógena do leite (EC. 3.4.21.7).

Uma solução de beta-caseina, a 10 mg/mL em água destilada estéril, foi hidrolisada com uma mistura de tripsina (5000K, New Industry A/S, Copenhagen, Denmark) e quimiotripsina (Sigma) , ambas numa proporção enzima/substrato de 1/1 000 (p/p) , durante 3 h a 37°C e a pH 7,2 que foi mantida constante adicionando 0,5 M NaOH. Após o tempo indicado, as enzimas foram inativadas por aquecimento da solução durante 20 minutos a 80°C. A solução foi liofilizada e armazenada a 4°C até ser usada, (Lemee et al., 1998), Lait, 78, 227-240). O grau final de hidrólise foi 16% como deduzido a partir da determinação dos grupos amina livres usando o método colorimétrico de nihidrina modificado para o ensaio de peptidase como descrito por Doi et al. (1981) . A mistura de péptido foi caracterizada por espetrometria de massa e continha 34 péptidos diferentes com pesos moleculares variando desde 373-3864. 16 EXEMPLO 4

Degradação Proteolítica da beta-caselna por um extrato sem células de Kluyveromyces lactis e algumas bactérias do ácido láctico

Um mililitro de uma solução contendo 24,8 M preparado de acordo com exemplo 3, foi incubado com 125 μρ de proteina citoplásmica de Kluyveromyces lactis ou de bactérias do ácido láctico e incubado a 24°C num tampão de fosfato de sódio 50 mM a pH 5,7. Aa amostras em duplicado foram tomadas ao tempo zero e às 2, 5, 10, 24, 48, 120 e 168 horas. A reação enzimática foi parada por aquecimento das amostras num banho de água a 100°C durante 20 minutos. Em seguida, as amostras foram precipitadas com 10 vezes um volume de etanol. A atividade proteolitica do extrato sem células foi determinada por análise do aumento dos grupos amina livres de acordo com o método de Doi et al. (1981), usando metionina como padrão. O grau de proteólise correspondeu à diferença entre os grupos amina livres a um determinado tempo e ao tempo zero e foi expresso em mmoles de equivalentes de metionina. A prolina livre não foi quantificada com este método porque carece de um grupo amina livre. O extrato sem células tratado por calor foi usado como um controlo.

Os aminoácidos livres foram identificados e quantificados como se segue: a pontos de tempo indicados, as amostras fervidas foram tomadas e precipitadas com ácido sulfosalicilico de acordo com o método de Mondino et al., (1972). O sobrenadante foi analisado por cromatografia de troca iónica onde foram detetados aminoácidos livres por 17 derivatização pós coluna usando nihidrina, essencialmente como descrito por Mondino et al. (1972). A Figura 1 mostra o aumento nos grupos amina livres como função do tempo para o extrato sem células de K. lactis e várias bactérias do ácido láctico. A figura mostra claramente que K. lactis é muito mais ativo que as bactérias do ácido láctico. A Tabela 1 sumariza a libração de aminoácidos individuais após 168 horas expressa como percentagem da quantidade total de cada aminoácido presente na beta-caseina. A quantidade adicionada do extrato sem células de proteína foi a mesma em todas as incubações. K. lactis é a mais ativa das estirpes testadas na libertação de tirosina (112%), fenilalanina (94%), metionina (89%), leucina (91), isoleucina (79%), valina (90%) e a quantidade total de aminoácidos livres (88%) . Somente no caso de prolina Lactobacillus helveticus foi mais eficiente (74%) que K. lactis (55%), a qual foi ainda mais ativa que as outras 4 estirpes. 18

Tabela 1. Aminoácidos livres após 168 horas de hidrólise de beta-caseina pelo extrato sem células dos microrganismos indicados. Expressos como percentagem da quantidade total de cada amínoácido presente na beta-caseina. Os valores que são sublinhados e a negrito são os mais altos para um determinado aminoácido.

Aminoácido Kluyvemyces lactís CBS 2353 Lactobacillus helveticus CMZ-32 Pedíococcus pentosaceus 559 Bifidobacterm bifidrn CIP567 Leuconostos lactís (Ml 091 Brevlbacteriaiíi linens 550 Prolina 55 74 0 38 3 17 Tirosina 100 83 33 52 33 57 Fenilalanina 94 79 31 46 17 64 Metionína 89 72 52 54 42 28 Leucina 91 80 45 41 34 38 Isoleucina 79 72 50 38 31 18 Valina 90 79 46 41 24 18 Aminoácidos totais 88 75 36 43 28 22 19 EXEMPLO 5

Formação de compostos com aroma por extratos sem células de Kluyveromyces lactis e várias bactérias do ácido láctico A formação de compostos com aroma a partir de aminoácidos foi medida incubando uma mistura de aminoácidos com extrato sem células dos microorganismos indicados. Os aminoácidos foram selecionados na base em que a sua degradação é conhecida para resultar nos aromas típicos do queijo. A composição de mistura de incubação foi como mostrado na Tabela 2.

Tabela 2. Formação de componentes de aroma de queijo; composição das misturas de incubação.

Composto Concentrações L-Metionina 3, 7 mM L-Isoleucina 7,9 mM L-Leucina 13,6 mM L-Valina 13,4 mM L-Fenilalanina 5,2 mM L-Tirosina 2, 9 mM Ácido a-cetoglutárico 95,4 mM Fosfato piridoxal 50 μΜ Pirofosfato de Tiamina 50 μΜ 125 μρ de proteína/mL Extrato sem células 5 0 mM Tampão de fosfato de sódio 5, 7 PH Ácido α-cetoglutárico foi adicionado para reações de transaminase. Os cofatores fosfato piridoxal e pirofosfato de tiamina foram adicionados como cofatores para reações de transaminação e reações de descarboxilação.

As misturas foram incubadas a 24°C e amostras de 5 mL foram tomadas às 0, 24 e 168 horas e seguidamente analisada por HPLC e GC-MS de Espaço de Cabeça; ver Tabela 3 para uma visão geral do método analítico usado. 20

As amostras foram também sujeitas a um teste de olfato que consiste numa avaliação semi-quantitativa e descrição qualitativa dos aromas e misturas. Isto foi realizado por um painel de 14 pessoas usando 4 mL de cada mistura de incubação por pessoa.

Tabela 3. Métodos analíticos usados para a separação e a deteção dos possíveis compostos presentes nas amostras.

Compostos Separação Deteção Limiar de Deteção (μg/g) a-cetoácidos HPLC UV 3 a-hidroxiácidos HPLC UV 30 Outros ácidos HPLC UV 30 Álcoois CG MS 0,002 Aldeídos CG MS 0,001

Análise de HPLC

Foi usado HPLC para a análise quantitativa de cetoácidos não voláteis, hidroxiácidos e outros ácidos que foram derivados dos aminoácidos (entre parêntesis) por transaminação: ácido α-fenilpirúvico (Phe), ácido parahidroxifenilpirúvico (Tyr) , ácido a-cetoisocapróico (leu) , ácido a-ceto-p-metilvalérico (Ile) e ácido a-cetoisovalérico (Vai). O consumo de ácido a-cetoglutárico devido a estas reações de transaminação foi também medido por HPLC.

Mesmo antes da análise, as amostras foram descongelados, homogeneizadas e diluídas 10 vezes com o eluente de HPLC (0,01 N H2SO4) e centrifugado. As injeções foram feitas usando um coletor de frações controlado automaticamente. O volume de ciclo foi de cerca 20 μΑ e os ensaios foram feitos num ciclo completo. O volume de injeção foi 40 μΑ. O volume de descarga foi 30 μΑ. A separação e as condições de 21 deteção foram como se segue: as amostras foram injetadas numa coluna Aminex A6 (300x7,5 mm, Biorad, Richmond, USA) de fase reversa a qual foi operada sob condições isocráticas a uma taxa de fluxo de 1 mL/min (bomba Beckman) e uma temperatura de forno de 55 °C. A deteção UV foi realizada a 210 nm usando um detetor Beckman. Todos os dados foram analisados com o sistema de gestão de dados Gold versão 8,1 também fornecidos pelo Beckman. A coluna foi calibrada para cada um dos compostos listados na Tabela 4. No presente documento, várias concentrações dos compostos foram aplicadas ao HPLC e foi determinado o seu "coeficiente de resposta", igualando o declive da linha de regressão linear obtida após plotar a concentração do composto padrão versus a superfície do pico.

Tabela 4. compostos não voláteis analisados por HPLC

Composto Proveniente de Ácido a-cetoglutárico — Ácido a-cetoisovalérico Valina Ácido a-ceto-D-metilvalérico Isoleucina Ácido a-cetoisocapróico Leucina Ácido α-fenilpirúvico Fenilalanina Ácido Para- Tirosina hidroxifenilpirúvico Ácido sobutírico Valina Ácido a-hidroxiisovalérico Valina Ácido a-hidroxiisocapróico Leucina α-hidroxi-j 3-metilvalérico Isoleucina Ácido Isovalérico Leucina

Compostos derivados de metionina com aroma não poderam ser determinadas por este método de HPLC. 22

GC-MS

Com o GC-MS foram detetados os seguintes compostos voláteis: benzaldeido (a partir de Phe via transaminação, descarboxilação, redução e outras reações) -2-metilbutanal (de Ile via transaminação, descarboxilação), -3-metilbutanal (de Leu via transaminação e descarboxilação), -2-metilpropanal (de Vai via transaminação/desaminação e descarboxilação), -2-metilpropanol (de Vai via transaminação/desaminação, descarboxilação e redução), -2-metilbutanol (de Ile via transaminação/desaminação, descarboxilação e redução).

Os compostos voláteis do espaço de cabeça das amostras foram isolados e analisados por um analisador de espaço de cabeça dinâmico Tekmar 3000 (Tekmar Inc., Cincinnati, OH, USA) acoplada a um cromatógrafo de gás HP5890A (Hewlett Packard, Avondale, PA, USA) .

As amostras foram descongelados mesmo antes da análise, homogeneizadas e diluídas dez vezes em água milli-Q fervida. 3 g da diluição foram pesadas num aspersor não poroso de 35mL. Todas as amostras foram purgadas com 35mL/min de gás de hélio ultrapuro a 65°C durante 15 min para isolar os voláteis do espaço de cabeça os quais foram adsorvidos numa trap Vocarb 3000 (tubo de aço inoxidável embalado com 10 cm de carbopack B, 6 cm carboxeno 1000, 1 cm Carboxen 1001, Supelco, Bella Fonta, Pa USA). Os compostos aprisionados foram dessorvido termicamente a 250°C durante 4 min e criofocado a -100°C antes de serem injetadas por aquecimento a 270°C. Foram separados numa 23 coluna capilar HP5 (60m x 0,32 mm x 1,0 μπι de espessura de filme) sob as seguintes condições: - gás transportador: hélio, 29 cm/s a 35°C; - programa de temperatura: 35°C durante 5 min - taxa de aquecimento: 5°C/min até 140°C depois 15°C/min até 250°C.

As outras condições operativas foram: "módulo de controlo da humidade": 200°C; válvulas e linhas de transferência: 200°C; limpeza da trap por cozimento a 260°C durante 8 min para remover compostos residuais. A coluna de GC foi conetada sem separação da fonte de ião de um espetrómetro de massa quádruplo HP7972A (linha de interface 280°C), operando no modo de varrimento dentro de um intervalo de massas de 25-300 m/z a 2,5 varrimentos/s. A ionização foi realizada por impacto electrónico a 70 eV; a calibração foi realizada por auto restruturação. A quantificação foi realizada por integração das áreas dos picos dos cromatogramas iónicos totais (TIC) usando o software Hewlett Packard Chemstation. Os compostos foram identificados por tentativas por harmonização em computador dos dados espetrais de massa com os da Base de Dados do Espetro de Massa NIST 75K Hewlett Packard Chemstation e por comparação dos seus espetros de massa e tempos de retenção com os dos compostos padrão. 24

Tabela 5. Formação de compostos com aroma após 168 horas a partir da mistura de aminoácidos pelo extrato sem células de Kluyeromyces lactís (K.lac), Lactobacillus helveticus (L.hel) e

Brevibacterm linens (B.lin) ou uma mistura (mix) de L.hel e K.lac (cada 125[ig/mL) versus uma incubação de branco (= mistura de aminoácidos com água em vez de extrato sem células).

Estirpe Composto K.lac K.lac L.hel L.hel B.lin B.lin Mix Branco 106 2166 735 CMRZ-32 550 100 Ácido α-cetoglutárico (consumo em mM) 11,7 14,3 21,5 15,8 8,9 14,4 15,1 -1,4 W Ácido p-fenilpirúvico(mM) 0,3 0,1 1,4 6,7 3,1 0,2 7,3 0,0 H 0 4J Ácido Para-hidroxifenilpirúvico(mM) 0,1 0,04 2,0 1,7 0,9 0,1 1,9 0,0 4 rl 0 > 0 ír) Ácido α-cetoisocapróico (mM) 1,1 0,5 6,2 5,2 0,9 0,3 6,1 0,0 Ácido α-ceto-p-metilvalérico (mM) 1,1 0,5 1,8 1,8 1,1 0,2 2,2 0,0 % Ácido α-cetoisovalérico (mM) 0,2 0,0 0,7 0,9 0,2 0,0 0,6 0,0 2-metilpropanal (μΜ) ys 1,6 0,0 0,1 0,1 0,0 4,1 0,0 2-metilpropanol-l (μΜ) 0,1 0,0 y y ?? ?? 0,3 0,1 0) rl (I) 3-metilbutanal (μΜ) 3y 1M 0,0 0,1 0,1 0,1 91,2 0,0 P 4 pI 2-metilbutanal (μΜ) 27^ 6J 0,0 0,1 0,0 0,0 18,1 0,0 0 > 2-metilbutanol-l (μΜ) 0,01 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Dimetilsulfeto (μΜ) 0,1 0,2 0,2 0,3 Í1 hl 0,4 0,0 Benzaldeido (μΜ) 0,9 0,8 3U 44J. 2,6 1,4 32 0,0 Produção Total 25

Tabela 6. Resultados do testes de olfato das incubações de aiinoácidos com extratos sem células (Tabela 5). De cada mistura de incubação estavam presentes dois tubos nas séries: um para ser analisado após 24 horas, o segundo após 168 horas. A análise foi realizada de modo cego e os tubos foram colocados por uma ordem aleatória. Os dados quantitativos representam o número de pessoas que deram o valor indicado (baixo, médio ou alto nível de odor ou nenhum).

Estirpe Nível de odor após 24/168 horas Número de pessoas : descrição Ê £ c (0 z O r| ffl 0 H X '(D 2 O +J H ri! Agua 14/14 0/0 0/0 0/0 - K.lac 106 0/0 0/0 8/4 6/10 6: Bolacha de aperitivo de queijo - 4: torrada/tostado - 3: agradável, fumado 2: Maltada; desagradável; aldeído; levedura; mel (açúcar cozinhado); a peúga K.lac 2166 0/1 3/4 8/7 3/2 7: Bolacha de aperitivo de queijo - 4: maltado - 3: queijo tostado (Camembert) - 2: fumado; mel (açúcar cozinhado) - 1: agradável; desagradável; a peúga; cultura bacteriana L.hel CNRZ-32 5/1 9/1 0/4 0/2 4: benzaldeído (amargo) - 2: queijo muito leve ácido/iogurte com mel (açúcar cozinhado); levedura - 1: podre, fétido, cultura bacteriana B.lin 550 3/0 10/8 1/6 0/0 9: queijo (intenso, cabra, Camembert) - 3 desagradável (pés) -2: iogurte, cheiro a fermentação, ranço - 1: podre B.lin 100 2/0 3/0 8/7 1/1 10: queijo (velho) (Camembert; Roquefort) - 5: desagradável a pés - 4: podre (couve flor) - 2: ácido patente - 1: Bolacha de aperitivo de queijo; pão; agradável; iogurte; fermentação; humidade; queijo fedorento; enxofre; mofo; esgoto. Branco 10/1 4/9 0/4 0 3: desagradável; queijo - 2: extrato de levedura - 1: couve flor; iogurte; açúcar cozinhado; cultura bacteriana; podre 26 A formação de α-cetoácidos a partir de aminoácidos está resumida na Tabela 5. Somente no caso das duas estirpes Lactobacilli e a estirpe 550 de B. linens houve uma correlação quantitativa entre a formação de α-cetoácidos e o consumo de ácido α-cetoglutárico. No caso de produtos de duas estirpes de K. lactis e B. linens AS100 outras para além das determinadas por análise de HPLC foram aparentemente sendo formadas.

No que diz respeito à formação dos compostos voláteis, foram observadas diferenças notáveis entre K. lactis, L. helveticus e B. linens. Não foram encontradas grandes diferenças qualitativas para as duas estirpes diferentes por tipo de micro-organismo. A Tabela 3 mostra que ambas as estirpes de K. lactis produzem muito eficientemente 2-metilbutanal, 3-metilbutanal, 2-metilpropanal e algum benzaldeido. L. helveticus produziu principalmente benzaldeido e um pouco de 2-metilpropanol, enquanto B. linens produziu algum benzaldeido e compostos de enxofre. No caso da mistura de extrato sem células, foram formados todos os voláteis.

Os resultados da análise sensorial são sumariados na Tabela 6 e mostra que K. lactis foi capaz de produzir niveis de odor médio/alto em comparação com L. helveticus (baixo) e B. linens (baixo/médio). O painel julgou positivamente o aroma desenvolvido por K. lactis e caracterizaram-no predominantemente como aroma a queijo.

Todos os resultados obtidos demonstraram claramente que K. lactis é capaz de formar α-cetoácidos e moléculas de aroma dos aminoácidos e por conseguinte, que pode ser usado no 27 passo de maturação do queijo, análogos de queijo e produtos derivados de queijo. EXEMPLO 6

Fazer queijo à escala piloto 0 fabrico à escala piloto de queijos por pressão foi realizado para validar os nossos resultados anteriores in vitro com extratos sem células.

Passo 1 - Preparação do leite 2 cubas de 26 kg de leite a 28 g/kg de material gorda foram preparadas com leite em pó desnatado levemente aquecido e nata crua comercial.

Em primeiro lugar o leite desnatado foi preparado com pó a baixa temperatura: 10 g de pó em 100 g água. O conteúdo em gordura de uma nata crua comercial foi medido com o Dairy Lab, e uma quantidade determinada de nata foi adicionada ao leite desnatado para produzir 28 g/kg de matéria gorda no leite.

No nosso caso, nós fizemos:

Cada cuba de 2 6 de leite reconstituído Pó a baixa temperatura 2,17 kg Água osmótica 21,68 kg Nata crua comercial (a 333,7 g/kg de matéria gorda) 2,15 kg 28

Passo 2 - Preparação de K. lactis atenuada 13 Frascos de 500 mL contendo cada 400 mL de meio YEG foram usados para a cultura. Os precipitados celulares foram ressuspendidos após a centrifugação final em 260 mL de SDW e distribuídas em 101 2 tubos esterilizados de 10 mL. Todos os tubos foram colocados num banho de água a 20°C. O tratamento por microondas foi realizado em cada um, os quais foram finalmente colocados juntos num frasco estéril e este mantido no frio antes de usar.

Passo 3 - Preparação de queijo 1 • As 2 cubas contendo cada uma 2 6 kg de leite reconstituído foram aquecidas a 34°C com um banho de circulação de água morna. O pH é de 6,65 nas duas cubas. • 5,2 mL de uma solução de 500mg/L de CaCl2 foram adicionados a cada cuba. • Um iniciador lactococci comercial foi adicionado a 4 U/100L, o que representa, no nosso caso, 1,04U em 26 kg de leite. A mistura é agitada e deixada sem agitação até o pH ter alcançado 6,55 após cerca de 80 minutos de incubação. No mesmo momento, na cuba do ensaio, é adicionado o iniciador atenuado a 1% (p/p), o que representa 260 mL de um concentrado tratado por microondas. 2 9,75 mL de um produto de quimosina diluído três vezes (Maxiren-600 de DSM) são adicionados a cada cuba. A incubação prossegue durante 30 minutos numa sala a 28°C até se formar um coagulado firme. • A coalhada formada é cortada duas vezes com o equipamento especial e as partículas cortadas são "curadas" durante 10 minutos e depois agitadas 29 lentamente (velocidade 2 de um total de 5 velocidades) durante 10 minutos. São retirados 20% do soro (5,2 kg) de cada cuba e substituídos pela mesma quantidade de água desmineralizada a 35°C. A mistura é agitada novamente durante 15 minutos à mesma velocidade baixa. • Após a segunda operação de agitação, a fração do soro foi removida e o conteúdo em coalhada de cada cuba é dividido em seis moldes redondos. A temperatura ambiente é fixada a 26°C. • Após 10 minutos, é colocada sobre cada molde uma pressão de 6 g/cm2. Após 15 minutos, os moldes contendo os queijos são virados e a mesma pressão é aplicada novamente durante 15 minutos. Durante 3 horas, a mesma operação é realizada a cada 15 minutos e o queijo atinge pH 5,2. A temperatura ambiente é fixada a 16°C e os queijos dos moldes são condicionadas durante a noite sob a mesma pressão. • Após 14 horas, os queijos são colocados em salmoura numa solução de 15% de NaCl durante 50 minutos, depois drenados durante 5 horas, divididos e embalados em vácuo para serem maturados a 12°C. EXEMPLO 7

Atenuação de Kluyveromyces lactis Células de Kluyveromyces lactis foram cultivadas como descrito no exemplo 1 e recolhidas na fase exponencial inicial sob condições estéreis por centrifugação a 18,900 g durante 20 minutos a 4°C. As células foram lavadas duas vezes com água destilada esterilizada (SDW). Os sedimentos celulares foram ressuspendidos em 100 mL de água SDW após a última centrifugação e distribuídas em 10* tubos 30 esterilizados de 10 mL. Todos os tubos foram colocados num banho de água a 20°C. 0 tratamento por microondas foi realizado usando um forno microondas Philips AVM 025 (potência absorvida: 1200 W/230 V) equipado com um temporizador e ajuste de potência variável. Cada tubo esterilizado de 10 mL sofreu um tratamento por microondas de 650W durante 13 segundos. O tratamento por microondas não teve qualquer efeito significativo na atividade peptidase, enquanto que 99% das células foram mortas. EXEMPLO 8

Validação do nosso iniciador atenuado no fabrico de queijo à escala piloto e medição da proteólise e da formação de compostos com aroma

Uma experiência de queijo à escala piloto foi realizada conforme descrito no exemplo 6. A atenuação da Kluyveromyces lactis foi realizada conforme descrito no exemplo 7. 13 frascos de 500 mL contendo cada um 400 mL de meio YEG (5,2 litros de cultura no total) foram usados para a cultura. Os sedimentos celulares após a última centrifugação foram ressuspendidos em 260 mL de SDW e distribuídos por 10 * 10 mL tubos esterilizados. Todos os tubos foram colocados num banho de água a 20°C. O tratamento por microondas foi realizado em cada tubo, os quais foram no final colocados juntos num frasco esterilizado mantidos no frio antes de usar.

As caracteristicas do queijo no dia +1 são descritas na Tabela 8. As diferentes medições foram realizadas duas 31 vezes em metade dos queijos para o branco e para os queijos de ensaio contendo 1 % de K. lactis atenuada.

Tabela 8- Caracteristicas bioquímicas do queijo ao dia +1.

Dia + 1, ensaio 1 Branco Queijo + K.I Peso (g) 261 +/-18 271 +/—11 PH 4, 94 4, 94 Matéria seca (%) 41,25 40,55 Gordura (%) 19.7 19.7 FDM (%) 47,8 48, 6 MFFS (%) 73,2 74 Sal (%) 0,85 0, 95 S/M (%) 1,4 1,6 Lactose residual (g/L) 0,8 0,9 FDM: GORDURA NA MATÉRIA SECA MFFS: HUMIDADE NA SUBSTÂNCIA LIVRE DE GORDURA S/M: Sal-em- humidade

As amostras de queijo foram analisadas aos dias +1, +7, +14, +28 e +55 quanto ao azoto total (TN), Azoto não

Proteico (ácido tricloroacético a 12% (TCA)- N solúvel) e Azoto Não de Caseína (Azoto solúvel a pH 4,6) pelo método de Kjeldahl (IDF, 1993). A evolução dos índices de maturação no controlo e nos queijos de ensaio é apresentada na Figura 2, a qual mostra claramente o aumento da proteólise nos queijos contendo as leveduras atenuadas.

Os índices de maturação foram definidos como:

IE = NCN/TN IP = NPN/TN

Os compostos voláteis neutros foram determinados por CG-MS nos extratos aquosos de queijo nas mesmas condições 32 descritas no exemplo 5. Os resultados são apresentados na Tabela 9.

Tabela 9 - Compostos voláteis neutros presentes ao dia +1 e dia +45 no controlo e nos queijos de ensaio (unidades de área arbitrárias).

Branco dia+1 Ensaio dia+1 Branco dia+45 Ensaio dia+45 Aldeídos Acetaldeido - 38 - 262 3-Metilbutanal 3 10 4 22 Pentanal 3 2 1 4 Benzaldeido 3 1 5 2 Nonanal 1 — 1 1 Álcoois 2- Metilpropanol 3- Metilbutanol-l+ 53 26 132 2-Metilbutanol-l l 602 133 655 1-Hexanol J 2 2 3 Ésteres Acetato de etilo 2 773 373 774 Propanoato de etilo - 1 1 5 Acetato de n-propilo - - 1 6 Butanoato de etilo — 20 8 64 Hexanoato de etilo - 3 2 23 Octanoato de etilo " 6

Os dois álcoois 3-Metilbutanol-l e 2-Metilbutanol-l foram coeluidos, assim na tabela as duas áreas relativas aos dois compostos foram somadas. 33 A Tabela 9 mostra claramente um aumento dos compostos com aroma como aldeídos, álcoois e ésteres nos queijos de ensaio contendo a levedura atenuada. Para alguns compostos o aumento foi também observado no dia 1. É claro que há um efeito positivo na formação de compostos voláteis com aroma no queijo devido à levedura atenuada.

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Lisboa, 06 de Junho de 2013

Claims (6)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para produzir um queijo, um análogo de queijo ou um produto derivado de queijo, cujo processo compreende contatar um queijo, um análogo de queijo ou um produto derivado de queijo ou um precursor destes com uma população de células de Kluyveromyces lactis, a qual população compreende células de Kluyveromyces lactis atenuadas, em que pelo menos 80% das células de Kluyveromyces lactis na população estão mortas mas não lisadas.

2. Um processo de acordo com a reivindicação 1, em que as células atenuadas na população mantiveram mais de 50% da sua atividade enzima intracelular.

3. Um processo de acordo com a reivindicação 2, em que a atividade de enzima intracelular compreende proteases, peptidases, lipases, esterases, descarboxilases, aldeido desidrogenases, amino oxidases, álcool desidrogenases, aminoácido desidrogenases, aminoácido oxidases, amino transferases e/ou transaminases.

4. Um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a célula de Kluyveromyces lactis é modificada de modo a que esta sobreexpresse uma protease, uma peptidase, uma lipase, uma esterase, ou uma enzima que converta um aminoácido num composto aromatizante.

5. Um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que as células de Kluyveromyces lactis são usadas para aumentar a taxa 2 de formação de sabor, aroma, e textura de queijo, análogo de queijo ou produto derivado de queijo, ou para aumentar a taxa de sabores, aromas e texturas de queijo, análogos de queijo ou produtos derivado de queijo, ou ambos.

6. Um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o passo de contato é realizado sob condições adequadas para que a maturação ocorra. Lisboa, 06 de Junho de 2013