PT1220830E - Utilização de elastase para abertura de artérias e veias obstruídas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Utilização de elastase para abertura de artérias e veias obstruídas"

Este pedido de patente reivindica o previlégio do Pedido de Patente Provisório dos E.U.A. N.° de Série 60/155938, depositado em 24 de Setembro de 1999, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

Declaração relativa a direitos governamentais O Governo dos E.U.A. tem certos direitos neste invento. Antecedentes do invento 1. Campo do invento O presente invento refere-se à utilização de elastases para alargamento do diâmetro de uma artéria ou veia num sujeito humano dele necessitado. Em particular, o presente invento refere-se à utilização de uma elastase para a fabricação de um medicamento para administração local à parede de uma artéria ou veia para alargar o diâmetro da artéria ou veia num sujeito humano dele necessitado. 2. Antecedentes

As obstruções de condutas biológicas resultam frequentemente de trauma na conduta, o que pode resultar de transplante, enxerto ou outros procedimentos cirúrgicos, onde a matriz extracelular do tecido obstruente compreende maioritariamente colagénio. A angioplastia de balão é um tratamento inicial comum para estenose ou obstrução de estreitamento que produz excelentes resultados iniciais (Pauletto, Clinicai Science, (1994) 87:467-79). Contudo, este método de dilatação não remove o tecido obstruente. Apenas alonga e abre o lume, cujo trauma tem sido associado à libertação de vários factores de crescimento e citoquinas potentes que podem causar uma lesão, o que induz outra ronda de proliferação celular, migração celular no sentido do lume e síntese de mais matriz extracelular. Consequentemente, a angioplastia de balão está associada com restenose em quase todos os pacientes (Pauletto, Clinicai Science, (1994) 2

ΕΡ 1 220 830 /PT 87:467-79). Não existe qualquer tratamento que possa suster a patência a longo prazo. A matriz extracelular, que mantém um tecido coeso, é composta principalmente de colagénio, o principal componente fibroso de tecido conjuntivo extracelular animal (Krane, J. Investigative Dermatology (1982) 79:83s-86s; Shingleton, Biochem. Cell Biol., (1996) 74:759-75). A molécula de colagénio tem uma unidade de base de três cadeias de aminoácidos repetitivos enrolados numa hélice tripla. Estas espirais em hélice tripla são depois tecidas num cabo enrolado para a direita. À medida que o colagénio amadurece, formam-se reticulações entre as cadeias e o colagénio torna-se progressivamente mais insolúvel e resistente à lise. Quando adequadamente formado, o colagénio tem uma resistência à ruptura superior à do aço. Não surpreendentemente, quando o corpo produz novo tecido, o colagénio proporciona uma armação estrutural extracelular pelo que a deposição de colagénio duro na lesão pode resultar na obstrução do canal. O estreitamento biliar benigno resulta em obstrução do fluxo de bílis a partir do fígado e pode resultar em icterícia e disfunção hepática. Se não tratada, a obstrução biliar pode resultar em falência hepática e morte. Os estreitamentos biliares podem formar-se após lesão do canal durante colecistectomia. Podem-se também formar nas anastomoses biliares após transplantação de fígado e doutras cirurgias biliares reconstrutivas (Vitale, Am. J. Surgery (1996) 171:553-7; Lilliemoe, Annals of Surgery (1997) 225).

Historicamente, o estreitamento biliar benigno tem sido tratado cirurgicamente por remoção do segmento do canal doente e religação do vaso topo a topo, ou ligação do canal ao intestino via um laço ("loop") de hepáticojejunostomia (Lilliemoe, Annals of Surgery (1997) 225). Estas cirurgias longas e difíceis têm morbidade e mortalidade significativas devidas a hemorragia, infecção, perda biliar e obstrução biliar recorrente na anastomose. A recuperação pós-operatória demora semanas a meses. Mais recentemente, têm sido utilizados tratamentos minimamente invasivos tais como dilatação por balão percutâneo, proporcionando boas cirurgias de patência biliar inicial (Vitale, Am. J. Surgery (1996) 171:553-7; Lilliemoe, Annals of Surgery (1997) 225). Contudo, a dilatação por balão causa uma lesão localizada, induzindo 3

ΕΡ 1 220 830 /PT uma resposta de cicatrização que frequentemente resulta em restenose (Pauletto, Clinicai Science, (1994) 87:467-79). A colocação de stent de longo prazo no canal biliar comum com cateteres de drenagem biliar flexíveis é outra alternativa minimamente invasiva à cirurgia (Vitale, Am. J. Surgery (1996) 171:553-7). No entanto, estes cateteres de drenagem biliar interiores ficam frequentemente infectados, ou obstruídos com resíduos, e têm de ser mudados frequentemente. Actualmente, o tratamento de longo prazo do estreitamento biliar permanece um problema clínico difícil.

Pacientes com falência renal crónica de fase terminal podem requerer substituição da sua função renal de modo a sobreviverem. Nos Estados Unidos, a hemodiálise de longo prazo é o método de tratamento mais comum para a falência renal crónica de fase terminal nos E.U.A.. Em 1993, mais de 130 000 pacientes foram submetidos a hemodiálise de longo prazo (Gaylord, J. Vascular and Interventional Radiology (1993) 4:103-7). Mais de 80% destes pacientes implementam a hemodiálise através da utilização de um enxerto arteriovenoso sintético (Windus, Am. J. Kidney Diseases (1993) 21:457-71). Na maioria destes pacientes, o enxerto consiste de um tubo Gore-Tex de 6 mm que é implantado cirurgicamente entre uma artéria e uma veia, usualmente no antebraço ou parte superior do braço. Esta conduta de fluxo elevado pode depois ser acedida com agulhas para as sessões de hemodiálise.

Quase todos os enxertos de hemodiálise falham, usualmente no prazo de dois anos, e um novo enxerto tem de ser criado cirurgicamente para manter a hemodiálise. Estes pacientes enfrentam a repetida interrupção da hemodiálise, e múltiplas hospitalizações para procedimentos radiológicos e cirúrgicos. Uma vez que cada revisão do enxerto cirúrgico consume mais veia disponível, estes pacientes estão eventualmente em risco de mortalidade por falta de locais para acesso da hemodiálise. Uma estimativa estabeleceu o custo de colocação de enxerto, hemodiálise, tratamento de complicações, colocação de cateteres venosos, custos de hospitalização e tempo de ausência ao trabalho, em cerca de 500 milhões de USD, apenas em 1990 (Windus, Am. J. Kidney Diseases (1993) 21:457-71). A causa mais frequente de falência do enxerto de hemodiálise é a trombose, que é frequentemente devida ao 4

ΕΡ 1 220 830 /PT desenvolvimento de uma estenose na veia imediatamente a jusante da anastomose da veia de enxerto (Safa, Radiology (1996) 199:653-7). A análise histológica da estenose revela uma lesão firme, pálida, relativamente homogénea, interposta as camadas intima e média da veia, que torna mais espessa a parede do vaso e estreita o lume (Swedberg, Circulation (1989) 80:1726-36). Esta lesão, a que foi dado o nome de hiperplasia da intima, é composta de células de músculo liso vascular rodeadas por uma extensa matriz de colagénio extracelular (Swedberg, Circulation (1989) 80:1726-36; Trerotola, J. Vascular and Interventional Radiology (1995) 6:387-96). A angioplastia de balão é o tratamento inicial mais comum para a estenose de enxertos de hemodiálise e produz excelentes resultados de patência inicial (Safa, Radiology (1996) 199:653-7). Contudo, este método puramente mecânico de abertura da estenose por alongamento causa uma lesão que induz outra ronda de proliferação celular, migração celular no sentido do lume e síntese de mais matriz extracelular. Consequentemente, a angioplastia de balão está associada a restenose em quase todos os pacientes (Safa, Radiology (1996) 199:653-7). Não existe actualmente qualquer tratamento que possa suster a longo prazo a patência de enxertos de hemodiálise arteriovenosos sintéticos. A investigação sobre a hiperplasia da íntima tem focado principalmente o componente celular da lesão. A utilização de radiação e de agentes farmacêuticos para inibir a proliferação e a migração celulares são áreas activas de investigação (Hirai, ACTA Radiologica (1996) 37:229-33; Reimers, J. Invasive Cardiology (1998) 10:323-31; Choi, J. Vascular Surgery (1994) 19:125-34). Até à data, os resultados destes estudos têm sido equívocos, e nenhum destes novos tratamentos tem ganho ampla aceitação clínica. Esta matriz é composta predominantemente de colagénio e trabalho anterior em animais tem demonstrado que a inibição sistémica da síntese de colagénio diminui a produção de hiperplasia da íntima (Choi, Archives of Surgery (1995) 130:257-261).

Durante o crescimento e remodelação do tecido normal, as matrizes de colagénio existentes têm de ser removidas ou modificadas. Esta remodelação do colagénio é realizada por macrófagos e fibroblastos, dois tipos de células que segregam uma classe distinta de proteases denominada "colagenases" (Swedberg, Circulation (1989) 80:1726-36; Trerotola, J. 5

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Vascular and Interventional Radiology (1995) 6:387-96; Hirai, ACTA Radiologica (1996) 37:229-33). Estas colagenases degradam rapidamente as fibrilas de colagénio insolúveis em pequenos fragmentos de péptido solúveis, que são retirados do local pelo fluxo de sangue e linfa.

Ver também patentes U.S. 5981568; 5409926; e 6074659.

Adicionalmente, em US-A-5922322 revela-se um método de degradação de fibrina(ógenio), que compreende pôr em contacto a referida fibrina(ogénio) com uma quantidade de metaloproteinase de matriz fibrinolitica, eficaz para clivar a fibrina(ogénio), onde a referida metaloproteinase de matriz fibrinolitica cliva a fibrina(ogénio) na ligação de péptido YGly404-Ala405.

Em US-A-5116615 ensina-se um método de tratamento da hipertrofia prostática num mamífero vivo compreendendo a injecção intraprostática directa de uma composição compreendendo uma concentração terapeuticamente eficaz de colagenase e pelo menos uma enzima seleccionada de entre o grupo consistindo de hialuronidase, elastase, tripsina, quimotripsina, pronase, DNase I, bromelina, clostripaina, termolisina, neuraminidase, fosfolipase, colesterolesterase, dispase, subtilisina, papaína, quimopapaína, activador de plasminogénio, plasmina, estreptoquinase, uroquinase, fibrinolisina, serratiopeptidase, pancreatina, amilase, lisozima, catepsina-G e as serina-proteases de leucócito PMN; onde a referida composição provoca a dissolução e a regressão de tecido prostático hipertrofiado proporcionando desse modo alívio dos sintomas obstrutivos associados com a hipertrofia prostática.

Seria assim desejável proporcionar novos métodos para aliviar obstruções que bloqueiam o fluxo através de condutas biológicas.

Sumário do invento O presente invento é baseado no estabelecimento de novos métodos e sistemas para aliviar uma obstrução numa conduta biológica, e.g. vasculatura de mamífero. Os referidos métodos do invento incluem a administração a um local de obstrução de um agente terapêutico que preferivelmente possa degradar (in 6

ΕΡ 1 220 830 /PT vivo) a matriz extracelular do tecido obstruente, particularmente colagénio e/ou elastina. Métodos preferidos incluem a administração a uma obstrução de uma enzima ou de uma mistura de enzimas que seja capaz de degradar componentes chave da matriz extracelular (incluindo colagénio e/ou elastina) resultando na solubilização ou noutra remoção do tecido obstruente.

Os referidos métodos e sistemas podem ser aplicados a uma variedade de terapias especificas. Por exemplo, os referidos métodos incluem tratamento do estreitamento biliar com a utilização de colagenase, elastase ou outro agente exógeno, pelo qual uma composição de enzima compreendendo colagenase, elastase ou outro agente é directamente administrada à parede ou ao interior da parede (tal como por injecção de cateter) da lesão ou doutra obstrução. A(s) enzima(s) dissolve(m) o colagénio e/ou a elastina na matriz extracelular, resultando na solubilização de tecido fibroso a partir da parede do canal na proximidade do lume, e num regresso do fluxo ou da abertura do canal.

Preferivelmente, o agente terapêutico é entregue na proximidade de um local pretendido, e.g. por injecção, entrega por cateter ou similar. O presente invento proporciona a utilização de uma elastase para a fabricação de um medicamento para administração local à parede de uma artéria ou veia para alargar o diâmetro da artéria ou veia num sujeito humano dele necessitado. O presente invento proporciona a utilização de uma elastase para a fabricação de um medicamento para administração local à parede de uma artéria ou veia para alargar o diâmetro da artéria ou veia num sujeito humano dele necessitado, onde a artéria ou veia está ligada a um enxerto arteriovenoso para hemodiálise no sujeito humano. O presente invento proporciona a utilização de uma elastase para a fabricação de um medicamento para administração local à parede de uma artéria ou veia para alargar o diâmetro da artéria ou veia num sujeito humano dele necessitado, onde o medicamento é para administração local à parede de uma veia para utilização em hemodiálise. Em certas 7

ΕΡ 1 220 830 /PT concretizações, o medicamento é para administração à parede da veia para utilização na formação de um enxerto arteriovenoso. O presente invento proporciona a utilização de uma elastase para a fabricação de um medicamento para administração local à parede de uma artéria ou veia para alargar o diâmetro da artéria ou veia num sujeito humano dele necessitado, onde a artéria ou veia está obstruída, por exemplo por hiperplasia da intima ou por estenose (por exemplo onde a estenose permite a passagem de um volume insuficiente de sangue antes do tratamento).

Em certos aspectos de qualquer das concretizações anteriores, o sujeito padece de obstrução coronária.

Em certos aspectos de qualquer das concretizações anteriores, o medicamento é administrado por um cateter. Em aspectos específicos de qualquer das concretizações anteriores, o medicamento é administrado directamente no interior da parede da artéria ou veia.

Num aspecto preferido de qualquer das concretizações anteriores, o medicamento compreende uma elastase pancreática.

Noutro aspecto preferido de qualquer das concretizações anteriores, o medicamento não compreende uma colagenase.

Num aspecto especifico de qualquer das reivindicações precedentes, o medicamento provoca alargamento do diâmetro da artéria ou veia por proteólise de elastina na parede da artéria ou veia de fora para dentro.

Outros aspectos do invento são revelados infra.

Breve descrição dos desenhos A FIG. 1 mostra um canal biliar comum num cão com um grau elevado de estreitamento; A FIG. 2 mostra um canal biliar comum num cão com um grau elevado de estreitamento após tratamento; 8

ΕΡ 1 220 830 /PT A FIG. 3 é uma fotografia de histologia de um canal biliar comum normal de um cão; e A FIG. 4 é uma fotografia de histologia de um estreitamento de canal biliar comum de um cão com um grau elevado de estreitamento antes do tratamento.

Descrição detalhada do invento O invento proporciona a introdução de um agente terapêutico que é capaz de degradar componentes da matriz extracelular para desse modo facilitar a reabertura de uma conduta biológica constringida. Em particular, o invento proporciona a introdução, numa conduta biológica obstruída, de um agente terapêutico que degrada colagénio e/ou elastina. A utilização do presente invento proporciona adicionalmente métodos para dilatação de uma conduta biológica por introdução de um agente terapêutico compreendendo uma elastase no interior de uma conduta biológica, preferivelmente um segmento isolado da conduta.

Numa concretização do presente invento, a degradação de um estreitamento, lesão ou outra obstrução é realizada por introdução de um ou mais agentes terapêuticos que são capazes de degradar um ou mais componentes da matriz extracelular facilitando desse modo a reabertura do segmento constringido da conduta. Os principais componentes estruturais da matriz extracelular incluem colagénio e elastina.

Agentes terapêuticos preferidos para utilização de acordo com o invento são capazes de interactuar com e de degradar qualquer um de colagénio e elastina ou ambos.

Como acima descrito, pode-se utilizar uma variedade de composições nos métodos e sistemas do invento. Composições terapêuticas preferidas compreendem um ou mais agentes que podem solubilizar ou de outro modo degradar colagénio ou elastina in vivo.

Agentes terapêuticos apropriados podem compreender pelo menos uma e frequentemente várias enzimas tal que o agente terapêutico seja capaz de degradar ambos os componentes significativos da matriz da obstrução de tecido. Um agente terapêutico particularmente preferível compreenderá uma 9

ΕΡ 1 220 830 /PT elastase, particularmente elastase pancreática, uma enzima capaz de degradar elastina.

Num aspecto adicional do presente invento, os métodos incluem ainda meios para prevenir danos em tecido que não está associado à obstrução da conduta.

De acordo com o invento, podem-se também administrar fragmentos de agentes terapêuticos a um paciente. Por exemplo, podem-se administrar a um paciente fragmentos das elastases acima mencionadas desde que tais fragmentos proporcionem o efeito terapêutico desejado, i.e. degradação da obstrução de uma conduta biológica. Conforme aqui referido, uma elastase inclui fragmentos de elastase terapeuticamente eficazes.

Num aspecto preferido do invento, um agente terapêutico compreendendo pelo menos uma enzima capaz de degradar elastina, colagénio ou ambos é entregue ao local de obstrução pretendido com um cateter. Cateteres preferidos são capazes de localizar directamente um agente terapêutico directamente para o interior da matriz extracelular da obstrução. Cateteres particularmente preferíveis são capazes de entregar doses exactas de agente terapêutico com uma distribuição uniforme através de toda a área obstruída da conduta. Um exemplo particularmente preferido de um cateter para utilização no método do presente invento é o cateter Infiltrator® produzido pela interVentional Technologies Corporation (IVT) (San Diego, CA), que entrega uma dosagem controlada de um fármaco, com exactidão, directamente ao interior de um segmento seleccionado da parede do vaso (Figura 1) (Reimers, J. Invasive Cardiology (1998) 10:323-331; Barath, Catherterization and Cardiovascular Diagnosis (1997) 41:333-41; Woessner, Biochem. Cell Biol. (1996) 74:777-84). Utilizando este cateter preferido, um agente terapêutico pode ser entregue a baixa pressão através de uma série de portas de injector miniaturizadas montadas sobre a superfície do balão. Quando o balão de posicionamento é insuflado, as portas de injector alongam-se e entram na parede do vaso sobre a superfície 360 de um segmento de vaso de 15 mm. Cada porta de injector tem um tamanho inferior a 0,0035 polegadas. A entrega de fármaco pode ser realizada em menos de 10 segundos, com a precisão de microlitros e espalhamento imediato mínimo do fármaco. O fármaco injectado 10

ΕΡ 1 220 830 /PT é entregue de modo homogéneo na parede do vaso ou canal (Figura 2) . O desenho de triplo lume proporciona canais independentes para avanço do fio-guia, insuflação do balão e entrega do fármaco. O trauma associado com a penetração da porta do injector é mínimo e os efeitos histológicos a longo prazo são negligenciáveis (Woessner, Biochem. Cell Biol. (1996) 74:777-84). Para além disso, o dispositivo foi concebido tal que as portas de injector estão recuadas quando se manobra dentro do vaso. Adicionalmente, o cateter Infiltrator® é capaz de dilatar o balão com força suficiente para aplicações de angioplastia. O excelente controlo de entrega de droga observado com o Infiltrator® pode ser significativo, uma vez que agentes terapêuticos preferidos do presente invento podem degradar potencialmente colagénio e/ou elastina em praticamente todas as formas de tecido de um modo não específico.

Ainda noutra concretização do presente invento, utiliza-se uma dose terapêutica que restaurará o fluxo na conduta, mantendo ao mesmo tempo a integridade da parede da conduta. É necessário definir vários parâmetros para maximizar a eficiência do método, incluindo a quantidade de enzima a ser entregue, o volume de solução de enzima a ser injectado tal que a reabertura da conduta ocorra com um protocolo de dose única. Idealmente, a dosagem repetida ou múltipla está apenas reservada para pacientes que têm uma resposta incompleta à injecção inicial.

Em relação ao volume entregue de solução de agente terapêutico, preferivelmente, a parede da conduta não está completamente saturada, uma vez que tal pode conduzir a digestão transmural e a ruptura da conduta. Em vez disso, a dose óptima é determinada pela espessura da parede (de fora para dentro) que necessita de ser removida de modo a restaurar o fluxo adequado, ao mesmo tempo que a parede permanece intacta. Uma solução excessivamente diluída será ineficaz para a lise de colagénio enquanto que uma solução excessivamente concentrada terá um gradiente de difusão mais elevado para os tecidos circundantes, aumentando desse modo o risco de digestão transmural e de ruptura.

Será de notar que as quantidades de dosagem preferidas reais de agentes terapêuticos numa dada terapia variarão de acordo com e.g. o composto específico que está a ser 11

ΕΡ 1 220 830 /PT utilizado, a composição particular formulada, o modo de administração e caracteristicas do sujeito, e.g. a espécie, sexo, peso, saúde geral e idade do sujeito. Doses para administração óptimas para um dado protocolo de administração podem ser facilmente estabelecidas pelos peritos na especialidade utilizando testes de determinação da dosagem, incluindo os descritos acima e nos exemplos que se seguem.

Agentes terapêuticos do invento são adequadamente administrados como uma composição farmacêutica com um ou mais transportadores adequados. Agentes terapêuticos do invento são tipicamente formulados numa forma injectável, e.g. com o agente terapêutico dissolvido num transportador fluido adequado. Ver os exemplos que se seguem para composições preferidas.

Conforme acima descrito, os métodos e sistemas do invento podem ser utilizados para tratar (incluindo tratamento profiláctico) uma variedade de doenças e desordens. Em particular, os métodos e sistemas do invento podem ser utilizados para aliviar ou de outro modo tratar uma variedade de lesões e outras obstruções encontradas em canais biliares ou sistemas vasculares comuns. Métodos do invento são também úteis para aliviar lesões e outras obstruções noutras condutas biológicas incluindo e.g. uretra, canal pancreático, brônquios, coronária e outros. O invento inclui também tratamento do tipo profiláctico, e.g. métodos para dilatar uma conduta biológica pelos quais um diâmetro de conduta aumentado obvia o potencial de formação de obstrução dentro de uma conduta. A degradação temporária e parcial do componente de elastina de uma parede de conduta reduz a elasticidade da conduta facilitando desse modo modificações do tamanho e da forma da conduta. A introdução de uma dose de agente terapêutico de acordo com o invento, no interior do lume de uma conduta isolada ou nalguma sua secção, resulta na difusão completa ou parcial do agente terapêutico no interior da parede da conduta isolada durante um período de tempo especificado. A pressurização subsequente da região tratada, quer enquanto a região está ainda isolada, quer após remoção dos meios de isolamento, aumenta o diâmetro do lume por dilatação. A regeneração da estrutura de elastina da conduta resulta numa conduta com um diâmetro do lume mais largo e sem comprometer a integridade 12

ΕΡ 1 220 830 /PT estrutural do enxerto. Frequentemente, o diâmetro luminal do fluxo venoso é mais pequeno do que o diâmetro luminal do enxerto. O desenvolvimento de uma estenose devido a hiperplasia da intima pode adicionalmente reduzir o diâmetro luminal do fluxo venoso tal que um volume insuficiente de sangue passa através do fluxo venoso. Para prevenir hiperplasia da íntima e formação de estenose, a dilatação da veia do fluxo venoso, utilizando o método acima descrito de degradar parcialmente o componente de elastina da parede vascular a jusante do local de implantação do enxerto, tal que o diâmetro luminal do fluxo venoso seja similar a ou maior do que o diâmetro do enxerto em laço interposto, reduz a probabilidade de formação de uma estenose devida a hiperplasia da íntima. A dilatação venosa pode ser realizada, quer antes, quer após interposição de um enxerto entre a artéria e a veia.

Todos os documentos aqui mencionados são aqui incorporados por referência. O presente invento é adicionalmente ilustrado pelos exemplos não limitativos seguintes.

Exemplo 1: Análise de digestão de tecido O protocolo do exemplo seguinte é uma descrição detalhada de um "ensaio padrão de digestão de tecido in vitro" conforme aqui designado.

Determinou-se a velocidade de digestão de tecido, que é composto principalmente de colagénio, por uma mistura de colagenase e elastase, enzimas proteolíticas com actividade, respectivamente, contra colagénio e elastina. Adicionou-se inibidor de tripsina para anular o efeito de qualquer actividade de tripsina residual. Resumidamente, excisou-se tendão fresco de porco, aparou-se, lavou-se, enxugou-se e pesou-se. Suspenderam-se bocados individuais de tendão em tampão HEPES 3,58 mg/ml a pH neutro e adicionaram-se várias concentrações de enzimas. Adicionou-se contraste radiográfico iodado em várias concentrações a algumas das soluções de enzimas. A digestão de tecido foi realizada num banho de água a 37°C. Em vários instantes de tempo, removeram-se os bocados de tendão da solução de enzima, lavaram-se, enxugaram-se e pesaram-se. O valor para cada instante de tempo foi obtido a partir da média de três amostras. Estudou-se o efeito da concentração de enzima nas velocidades de digestão de tecido. Como esperado, o aumento da concentração de enzimas in vitro aumentou a velocidade de digestão de tecido (Figura 3) . O tampão sozinho não teve qualquer efeito sobre o tecido. A 13

ΕΡ 1 220 830 /PT extrapolação das velocidades de digestão in vitro para uma situação in vivo tem provado ser difícil. Para doenças de Dupuytren, a dose eficaz para seccionamento transversal de cordões fibrosos in vitro era 500 ABC. Contudo, a dose eficaz in vivo era 10 000 unidades ABC.

Estudou-se também o efeito do material de contraste radiográfico iodado nas velocidades de digestão de tecido (Figura 4). Este estudo foi realizado para monitorar a entrega de enzima por mistura desta com contraste antes da injecção. Estes resultados demonstram que o material de contraste iodado Omnipaque 350 inibe a actividade de enzima em concentrações radiograficamente visíveis (35%), mas não em concentrações inferiores (1-5%) (Figura 4). Observaram-se resultados similares com contraste Hypaque 60.

Exemplo 2. Determinação da actividade in vitro dependente da dose de um agente terapêutico incluindo colagenase, elastase e um inibidor de tripsina

Estudou-se o efeito da concentração de enzima nas velocidades de digestão de tecido (Figura 3) . A amostra de tecido "lx" foi tratada com colagenase 156 unidades Mandel/ml + elastase 0,125 mg/ml + inibidor de tripsina 0,38 mg/mg. A amostra "2x" foi tratada com colagenase 312 unidades Mandel/ml + elastase 0,25 mg/ml + inibidor de tripsina 0,76 mg/ml. A amostra "5x" foi tratada com colagenase 780 unidades Mandel/ml + elastase 0,625 mg/ml + inibidor de tripsina 1,9 mg/ml. Todos os volumes de digestão foram de 0,5 ml. O aumento da concentração de enzimas in vitro aumentou a velocidade de digestão de tecido (Figura 3). O tampão sozinho não teve qualquer efeito sobre o tecido. Constatou-se que uma dose eficaz in vivo era de 10 000 unidades ABC.

Exemplo 3. A determinação do efeito do material de contraste radiográfico iodado nas velocidades de digestão de tecido facilita a monitorização da entrega de enzima antes da injecção de um agente terapêutico compreendendo um material de contraste num paciente A amostra de tecido "35% Omnipaque" foi tratada com colagenase 156 unidades Mandel/ml + elastase 0,125 mg/ml + 0,38 de inibidor de tripsina com 35% de contraste OmniPaque 350 (volume:volume). A amostra "5% Omnipaque" foi tratada com colagenase 312 unidades Mandel/ml + elastase 0,25 mg/ml + 0,76 de inibidor de tripsina com 5% de Omnipaque 350 (volume:volume). A amostra "1% Omnipaque" foi tratada com 14

ΕΡ 1 220 830 /PT colagenase 312 unidades Mandel/ml + elastase 0,25 mg/ml + 0,76 de inibidor de tripsina com 1% de Omnipaque 350. Todos os volumes de digestão foram de 0,5 ml. Estes resultados demonstram que o material de contraste iodado Omnipaque 350 inibe a actividade da enzima para concentrações radiograficamente visíveis (35%), mas não para concentrações mais baixas (1-5%) (Figura 4). Observaram-se resultados similares com contraste Hypaque 60. O invento foi descrito em detalhe por referência às suas concretizações preferidas. Contudo, será de notar que os peritos na especialidade, tendo em consideração esta revelação, podem fazer modificações e melhorias dentro do espirito e âmbito do invento conforme apresentado nas reivindicações seguintes.

Lisboa,

Claims (14)

1. ΕΡ 1 220 830 /PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma elastase para o fabrico de um medicamento para administração local à parede de uma artéria ou veia, para alargar o diâmetro da artéria ou veia num sujeito humano dele necessitado.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a artéria ou veia está ligada a um enxerto arteriovenoso para hemodiálise no sujeito humano.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento se destina a administração local à parede de uma veia para utilização em hemodiálise.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 3, em que o medicamento se destina a administração à parede da veia para utilização na formação de um enxerto arteriovenoso.
5. 5. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, em que a artéria ou veia está obstruída.
6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que a artéria ou veia está obstruída por hiperplasia da íntima.
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que a artéria ou veia está obstruída por estenose.
8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 7, em que a estenose permite a passagem de um volume insuficiente de sangue antes do tratamento.
9. 9. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, em que o sujeito está a sofrer de obstrução coronária.
10. 10. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, em que o medicamento é administrado por um cateter.
11. 11. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, em que o medicamento é administrado directamente ao interior da parede da artéria ou veia. ΕΡ 1 220 830 /PT 2/2
12. 12. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, em que o medicamento compreende uma elastase pancreática.
13. 13. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, em que o medicamento não compreende uma colagenase.
14. 14. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, em que o medicamento causa alargamento do diâmetro da artéria ou veia por proteólise de elastina na parede da artéria ou veia de fora para dentro. Lisboa,