PT1204420E - Trealose que produz células procarióticas utilizadas em vacinas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

Trealose que produz células procarióticas utilizadas em vacinas

Esta invenção refere-se ao campo das vacinas. Mais especificamente, refere-se a métodos de produção de vacinas de trealose que contêm células procarióticas e as composições para obter as mesmas.

Antecedentes da invenção

As células procarióticas, em particular as bactérias, são amplamente e cada vez mais usadas nas aplicações médicas, agrícolas e industriais. As aplicações agrícolas ou ambientais incluem pesticidas biológicos e mediação biológica. As aplicações médicas incluem o uso de bactérias nas vacinas assim como para a produção de produtos farmacêuticos para outros tratamentos.

Para as células procarióticas serem eficazmente usadas, ambas em termos de resultados desejados e custo, as células devem ser capazes de ser armazenadas por períodos significantes de tempo enquanto preservam a sua viabilidade. 0 termo viabilidade é aqui usado para denotar que as células manifestam os aspectos do funcionamento de um organismo vivo, tal como o metabolismo e divisão da célula. Métodos para preservar as células procarióticas vivas sofrem de vários inconvenientes sérios, tais como sendo de energia intensiva e requerendo uma armazenagem no frio. Deste modo a secagem por congelamento é muitas vezes usada para a preservação e armazenagem de células procarióticas. Contudo, tem a característica indesejável de reduzir 1/14 significativamente a viabilidade das células, assim como sendo tempo e de energia intensiva e deste modo dispendioso. 0 PCT W098/24882 descreve um processo de estabilização das células procarióticas através de indução de sintese de trealose e a secagem das células resultantes numa matriz vitrea de hidrato de carbono. Este processo concebe células estabilizadas que podem ser armazenadas a temperaturas ambiente sem perder a sua viabilidade. A trealose, (a-D-glicopiranosil- α-D-glicopiranoside), é um disacarideo não-redutor que ocorre naturalmente, que foi inicialmente descoberto ser associado com a prevenção de danos por dessecação em certas plantas e animais que pode ser seco sem danificar e pode reviver quando rehidratado. A trealose tem mostrado ser útil na prevenção de desnaturalização de proteínas, virus e géneros alimentícios durante a dessecação, ver Patentes U.S. n°s4,891,319; 5,149,653; 5,026,566; Colaço et al. (1992) Bio/Tech. 10:10007-1011. A síntese da trealose nas células procarióticas é induzida por um número de métodos que inclui o choque osmótico o qual induz a produção endógena da trealose, Welsh e tal. (1991) J.Gen. Microbiol. 137:745-750. A publicação PCT n° WO 95/03395 descreve um processo de melhoramento da viabilidade de células bacterianas secas através de indução de síntese de trealose por limitação de nutriente, choque de aquecimento ou osmoadaptação. A publicação PCT n° WO 98/24882 descreve um método para a preservação de células procarióticas ao secar as células numa matriz de hidrato de carbono após a indução de síntese de trealose. A última invenção fornece composições de células secas que podem ser armazenadas nas temperaturas ambiente e deste modo permitindo um número de aplicações industriais. 2/14

Surpreendentemente, não foi descoberto que as células procarióticas secas e estabilizadas produzidas pelos métodos acima, são mais imunogénicas que as células vivas frescas e como consequência têm um valor particular como o componente activo determinante nas composições de vacinas. Além disso, também foi descoberto que esta imunogenicidade crescente das células procarióticas estabilizadas não está dependente do processo de secagem considerado essencial nos processos de estabilização acima, mas resulta de uma indução de síntese de trealose. Se bem que mais pronunciado com células secas, esta imunogenicidade crescente é também vista nas células induzidas para produzir trealose mas as quais não foram sujeitas ao processo de secagem.

Sumário da invenção A presente invenção provê desta forma um método para aumentar a imunogenicidade de uma composição de vacina que compreende células procarióticas como o componente activo determinante imunogénico, o qual compreende os passos de: a. Tratar as células procarióticas in vitro sob condições tal como um aumento da concentração de trealose dentro das células procarióticas é induzido pela síntese da trealose dentro da célula; b. Usando as células induzidas que contém trealose como determinante imunogénico na produção de uma composição de vacina.

De preferência, o tratamento de células procarióticas é realizado para atingir a concentração de trealose dentro das células de pelo menos 10 mM.

De preferência, as células induzidas que contêm a trealose são secas antes mesmo do seu uso na produção da composição da 3/14 vacina, nomeadamente na presença de um hidrato de carbono não redutor tal como trealose para prover um determinante imunogénico de armazenamento estável mas viável para armazenar antes do uso na composição na vacina. A invenção também providencia um método para imunizar um animal o qual compreende a administração de uma quantidade farmacologicamente efectiva de uma composição de vacina da invenção a um animal suficiente para fazer surgir uma resposta imune no animal.

De preferência, a composição da vacina contêm um adjuvante para o determinante imunogénico, apresentado num meio de transporte aquoso e é administrado através de injecção.

As células procarióticas para o uso na presente invenção são aquelas que são capazes de sintetizar a trealose. Esta capacidade pode ser nata ou pode ser conferida pelas técnicas recombinantes. A capacidade de uma célula procariótica em sintese da trealose, pode ser determinada ao medir a concentração de trealose como acima descrito. 0 termo procariótico é aqui usado para denotar as células que exibem caracteristicas de procarióticas, que são organismos tipicamente unicelulares, defeito nas organelos (tal como mitocôndria, cloroplastos e aparelho Golgi), defeito no citoesqueleto e defeito no núcleo discreto. Exemplos de células procarióticas para o uso presente incluem bactérias, tais como eubacteria, cianobacteria e proclorofitos; archaebacteria e outros microrganismos tais como rickettsias, micoplasmas, espiroplasmas e clamidias. As células procarióticas para o uso presente são as bactérias.

Em geral, qualquer célula procariótica ou mistura de células, particularmente bactérias, que contém genes de sintase de 4/14 trealose, devem ser capazes de sintetizar a trealose. As bactérias têm dois genes envolvidos em síntese de trealose (isto é, síntase T-Fosfato e fosfatase T-P)), enquanto que as leveduras têm pelo menos três genes e as combinações desses genes podem ser usadas para permitir a síntese de trealose. Exemplos de bactérias que contém a o gene da síntase de trealose incluem, mas não são limitados a, Enterobacteríaceae, tal como Salmonella e Escherichia (por exemplo, S. typhimurium e E.coli); bactérias halofílicas e halotolerante, tais como Ectothriorhodospira (por exemplo, E. halochloris); micrococcocaceae tal como Micrococcus (por exemplo, M. luteus); espécies Rhizobium tal como R. japonicum e R. leguminosarum bv phaseoli; Cianobacteria; espécies de Micobactérias tais como M. tuberculosis, M.bovis e M. smegmatis.

As células procarióticas podem ser induzidas para síntese de trealose ao cultivar as células in vitro sob condições stressantes, por exemplo, choque osmótico, limitação de calor ou oxigénio (choque), privação de carbono/nitrogénio, ou outra combinação dos já referidos acima. As condições adequadas incluem aquelas com choque térmico e outras condições descritas, por exemplo, nas publicações PCT n°s WO95/03395 e W098/24882.

Alternativamente, o uso de inibidores, tais como validomicina, de enzima(s) tais como trahalase envolvida na degradação da trealose pode também resultar num aumento de concentração de trealose dentro das células. Alternativamente, a estrutura genética do organismo procariótico pode ser modificado para remover ou inibir que a porção da estrutura genética que inibe ou restringe a síntese da trealose dentro da célula para que a célula constitua síntese de trealose à medida em que são cultivados sem a necessidade de aplicar um estímulo externo. Tal modificação 5/14 genética pode ser atingida usando qualquer técnica adequada. Por conveniência, a invenção vai ser descrita daqui por diante em termos do uso do estimulo externo para induzir a produção de trealose dentro da célula, em vez do uso de uma célula procariótica que teve a sua estrutura genética modificada. 0 termo choque osmótico é aqui usado para denotar que a concentração soluto no crescimento médio no qual as células são cultivadas está acima do nivel no qual a célula existe e/ou cresce no seu ambiente natural. A soluto pode ser uma mistura de sais e a concentração está por norma entre 0.2 e 0.5 moles acima do nivel no qual a célula é normalmente cultivada.

Acredita-se que a indução da síntese de trealose sob condições stressantes possa também induzir a síntese ou acumulação de outras moléculas que possam ser benéficas para a preservação, tais como betaína e chaperoninas ou que aumentam a acção da vacina das células induzidas.

Para as bactérias, em particular a Escherichia, a síntese da trealose são preferivelmente induzidas pelo crescimento da(s) célula (s) nas condições de alta osmolaridade, isto é, concentrações de sal suficiente para estimular a produção da trealose. Para induzir a síntese da trealose por choque osmótico, a concentração total de sal (is) no meio, deve ser pelo menos cerca de 0.2M, preferivelmente de pelo menos de 0.4M, mais preferencialmente pelo menos cerca de 0.5M. A concentração total de sal(is) não deve exceder os 0.6M, visto que este nível de síntese de trealose diminui em E.coli. As concentrações de sal correspondem às osmolaridades de pelo menos cerca de 350 mOsmoles para cerca de 1.5 OSmoles, preferencialmente pelo menos cerca de 400MOsmoles para 1 Osmole, mais preferencialmente 250 mOsmoles para 500 6/14 mOsmoles. Em geral, uma osmolaridade mínima de cerca de 200 mOsmoles é requerida como isto será normalmente provido uma maior concentração de soluto do que aquele abaixo, nos quais as células são normalmente cultivadas. O soluto necessário pode ser provido pelo uso de um único sal, por exemplo, 200mM NaCI KCI e/ou CaCI2- Também pode ser usado o (NH4)2S04, contudo, só cerca de metade da quantidade de trealose é produzida comparada com o produzido na presença de KCI, NaCI e/ou CaCL2. Também pode ser usada uma mistura de sais. Adicionalmente, quando usado para aumentar a osmolaridade do meio, o soluto não-penetrante tal como o sorbitol e/ou glucose, pode contribuir para o estímulo de síntese da trealose. A concentração de sal (isto é, osmolaridade) requerida para estimular e/ou induzir a síntese da trealose, vai depender do género, espécies, e/ou estirpe da célula procariótica usada. De preferência, a(s) célula(s) crescem num meio mínimo que contém solutos e media comercialmente minimamente disponíveis podem ser fornecidos com sais desejados e/ou outros solutos. O uso de um meio mínimo não é essencial e os media definidos também podem ser usados. O tempo requerido para iniciar e atingir o nível desejado de concentração de trealose dentro das células, vai variar dependendo do nível de osmolaridade assim como o género, espécies e/ou estirpe de células procarióticas usadas. A síntese da trealose vai em geral começar numa hora da colocação das células em condições designadas para estimular a produção de trealose. Geralmente, em E. coli, a síntese da trealose atinge um máximo de cerca de 15-20 horas. A síntese da trealose pode também ser estimulada usando métodos recombinantes os quais são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, as células procarióticas podem ser transfectadas 7/14 com um plasmídeo de DNA que compreende uma sequência de DNA que codifica o gene adequado de sintase de trealose. O gene por sua vez, é ligado operativamente a um promotor adequado, o qual pode ser constitutivo ou indutivel. São descritas técnicas recombinantes adequadas, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrook e al., 1989). A concentração da trealose sintetizada dentro das células procarióticas pode ser medidas usando qualquer ensaio técnico adequado, ou exemplo através de cromatografia liquida de alta pressão (CLAP), acoplado com detecção electroquímica e ensaio de glucose (ensaio Trinder usando Trealose) para determinação enzimática quantitativa de trealose. A cromatografia de camada fina pode ser usada como um método qualitativo para a separação de hidratos de carbono diferentes. A detecção de indice de refracção provê outros meios de detecção de açúcares quantitativamente.

Na medição de trealose através de CLAP, as células são dilaceradas e a trealose é preferencialmente solubilizada em 70% de etanol, seguido por remoção de triacilglicerol por extracção de clorofórmio. A concentração de trealose é determinada por multiplicar a concentração de trealose (como determinado por uma curva Standard) por fracção de volume final de super-flutuante dividido por partículas de volume. Uma descrição mais detalhada deste ensaio, é provida no exemplo 1.

Preferivelmente, a síntese é realizada para prover uma concentração de trealose dentro das células de pelo menos cerca de 10mM, por exemplo pelo menos cerca de 30 mM, 8/14 preferivelmente pelo menos cerca de 50mM, nomeadamente pelo menos cerca de lOOmM.

Deste modo, num aspecto preferido, a invenção inclui cultivar as células procarióticas sob condições que estimulam a produção intracelular de trealose, em que a concentração intracelular de trealose atinge pelo menos cerca de lOmM, preferivelmente pelo menos cerca de 30mM, mais preferivelmente pelo menos cerca de 50mM, nomeadamente pelo menos cerca de lOOmM. É particularmente preferido que a concentração seja pelo menos cerca de 150mM. O tempo requerido para estimular a síntese de trealose depende, entre outras coisas, da natureza das células procarióticas (incluindo género, espécies, e/ou. estirpe) e as condições soo as quais ocorre a indução da trealose (isto é, se por choque osmòtico, privação de oxigénio, etc). Por indução da trealose por choque osmòtico, o tempo requerido para a concentração máxima de trealose, depende por sua vez do grau de osraolaridade assim como os sais em particulares usados. As condições óptimas para a síntese de trealose podem ser prontamente determinadas por simples testes de ensaio e erros,

As celuras procarióticas cultivadas que contém, a trealose intracelular podem depois ser congeladas por armazenamento antes de uso como uma vacina. 0 armazenamento alternativo da vacina pode ser efectuado ao cultivar as células procarióticas sob condições que aumenta a concentração de trealose a um nivei efectivo para aumentar a estabilidade do armazenamento, misturando as células com uma solução seca que contem um agente de estabilidade, e seca as células sob condições tais como um vidro é produzido com menos de 5% de humidade residual. Se uma vacina morta em vez de uma vacina viva e requerida, as células podem ser mortas por qualquer 9/14 método adequado, por exemplo fixação química e radiação anterior ao processamento do armazenamento. Apesar das células procaríóticas poderem ser usadas como único ingrediente: activo determinante imunogenico na vacina, um adjuvante pode ser adicionado numa quantidade suficiente para intensificar a resposta imune à vacina prooariótica. 0 adjuvante pode ser adicionado às células prooanóticas antes da secagem, por exemplo, a subunidade da toxina da cólera B pode ser seca em simultâneo com V, cholera. Aiternativamente, o adjuvante pode ser obtido e seco separadamente, e reconstituído ao longo com as células procarióticas .

Os adjuvantes adequados incluem, mas não estão limitados a, alumínio, hidróxido, alúmen, QS-21 (Patente U.S. n°5,057,540) , DREA. (Patentes U.S. n°s 5,407,684 e 5,077 , 284) e os seus derivados (incluindo sais) e precursores (por exemplo, DHEA-S), beta-2, microglobulina (WO 91/16924), dipeptídeos de muramyJ, tripeptideos de muramyl (Patente U.S. n° 5,171,568), llpido de monofosforil A (Patente U.S. n° 4,436,728; WO 92/16231) e os seus derivados (por exemplo, Detox™), e BCG (Patente U.S. n° 4,726, 947) . Outros adjuvantes adequados incluem sais de alumínio, misturas de esqualeno (SAF-1), péptido de muramyl, derivados de saponina, preparações de parede de micobactèrias, derivados de ácido micólico, surfactantes de copolímero em bloco não iónico, Qu.il Ά, sub unidade da toxina da Cólera B, polifosfazeno e derivados e complexos imunoestimuladores (ISCGMs) tais como aqueles descritos por Takahashi e tal. (1990) Natures 344: 873-875. A escolha de um adjuvante vai depender na parte da estabilidade da vacina na presença do adjuvante, o trajecto de administração, e a aceitabilidade reguladora do adjuvante, particularmente quando está destinado para o uso humano. Por exemplo, o alúmen é aprovado pela Administração de Alimentos e Fármacos dos Estados Unidos (AAF) para ser usado com adjuvante nos humanos. 10/14 A invenção também provê um método para tratar um animal com uma vacina da invenção ao administrar uma quantidade farmacologícamente aceitável da vacina da invenção, opcionalmente em combinação com um adjuvante, suficiente para fazer surgir uma resposta imune no animai. 0 animai é por norma um humano. Contudo, a invenção também pode ser aplicada ao tratamento de outros mamíferos tais como cavalos, gado, cabras, ovelhas ou porcos, e ao tratamento de aves, nomeadamente domésticas tais como galinhas ou perus.

As composições de vacina da presente invenção podem ser administradas por quaisquer meios adequados, tais como por via oral, inalação, transdérmica ou por injecçâo e em qualquer meio de transporte adequado. Contudo, é preferível administrar a vacina como uma composição aquosa por injecçâo usando qualquer aqulba adequada ou técnica sem agulha.

As vacinas da invenção podem conter qualquer concentração adequada das células procarióticas induzidas. E preferível que as células sejam administradas em doses na extensão de 10-600 tg, preferivelmente 10-100 ug, ainda mais preferível 25 yg, por KG de peso corporal do animai que é tratado. Será apreciado que a vacina da invenção possa ser aplicada como um tratamento inicial seguido por um ou vários tratamentos subsequentes com a mesma taxa ou taxa de dosagem diferente num intervalo de 1 a 26 semanas entre cada tratamento para prover imunidade prolongada contra o patogénio.

Os exemplos seguintes são providos para ilustrar mas não limitar a invenção.

Exemplo 1: indução de trealose num choque osmótico E.coli: E. coli (NCIMB estirpe 9484) foi cultivado em meio Evans (pí-í 7.0) que contém 5mM de cloreto de amónio. Após uma incubação 11/14 durante a noite a 37°C no meio Evans inicial, uma cultura cie 4ral de E.coli crescido no meio Evans sob limitação de nitrogénio, foi usado para inocular uma cultura de 20Gral de meio Evans modificado para induzir o choque osmótico ao aumentar a concentração de sai (KC1) para 0.5M. A concentração de treaicse foi medida através de uma análise de cromatcgrafia líquida de alta pressão (CLAP) e aumento significante de concentrações de trealose foram observadas entre 15-17 horas após a iniciação do choque osmótico, cora valores de pico de pelo menos 20 horas.

Exemplo 2: Indução de síntese de trealose na Salrnonella: A Salrnonella typhimurium (1344) cresceu durante a noite a 37°c em meio M9 (mínimo) com ou sem 0.5M NaCi, As células foram colhidas por centrifugação e analisadas através de concentração de trealose através de análise de CLAP como descrito no Exemplo 1. G crescimento num meio de nivel alto de sal. mostrado de 4 a 5 pregas de indução de síntese de trealose como comparado com o meio com nível baixo de sal.

Exemplo 3: secagem de células procarióticas após indução de síntese de trealose E, ccli e Salrnonella typhimurium cresceram durante a noite a 37°C num meio M9 (mínimo) com ou sem 0.5M NaCl e síntese de trealose induzido como descrito nos exemplos 1 e 2. As bactérias induzidas foram colhidas por centrifugação a 10.000 rpm durante 10 minutos e as partículas da célula em ressuspensâo numa solução seca que contém 45% de trealose, 0.1% cmc (celulose de sódio carboximetií, Bianose 7HF, Aqualon) para uma típica densidade de células 0.5-1.2 x 109 CFU/rnl, 300 yg e 500 ug aiíquotas foram dispensadas em 3ml de ampolas farmacêuticas e secas através de vácuo sem congelar, 12/14 durante a noite à temperatura ambiente e uma pressão de vácuo de 3Cmi Torr. Alternatívamente, os alíquotas podem ser secos por congeiamento usando o protocolo seguinte: rampa a 2.5°C/min para uma temperatura de duração inicial de -40°C; foi executada para uma secagem primária a uma pressão de vácuo de 30 minutos a -4Q°C e mantida durante 40 horas; por rampa de secagem secundária a 0.05°C/min de -40 a 30°C e mantida durante 12 horas.

Exemplo Λ e uso de células procarióticas induzidas como vacinas

As células E. coli e Salmonella typhimurium foram induzidas par a a síntese de trealose como nos exemplos 1 e 2 e foram usa· dos para imuni zar ratos e coelhos. A trtin Lacao das bactérias mostrou que uma prega 100 a 1000 com baixo titulo de bactérias induzidas para a síntese de trealose foi requerida para produzir uma resposta de anticorpos equivalente nos animais comparados ao uso de bactérias não induzidas. As preparações secas formam geralmente 2-50 pregas mais eficazes numa base numérica de células na fazer surgir imunidade protectora nos animais imunizados do que as preparações não secas.

Exemplo 5: uso de células procarióticas induzidas como vacinas; síntese de trealose induzida por calor cru

Salmonellã typhimurium (estirpes como nos exemplo' 37°C no meio LB, e 2) cresceram durante a norte alíquotas das culturas estacionarias foram usados para inocular 200ml do meio LB num frasco cónico de 2 litros e as culturas cresceram durante 3 horas a 30°C. As culturas de fase log foram então elevadas para 40°C e cresceram adicionalmente durante 3 horas antes que as bactérias fossem colhidas através de centrifugação a 10.000 rpm durante 10 13/14 minutos. Foi usado uai protocolo similar para o crescimento e indução de Mycobacterivm Bovis e Vaccae (NCTC 11659) que cresceram durante 2 dias num meio Sauton antes da diluição para ooter as cunuras cie fase de j.ocj para indução o.e calor. As partículas de célula foram postas em ressuspensão numa solução lise com 0.5% de Tween e a concentração de trealose foi medida através de uma análise da cromatografia líquida de alta pressão (CLAr) . Por norma, 3-5 pregas que aumentam nas concentrações de trealose, foram observadas como comparado só com o crescimento das células a 30°C.

As células bacterianas induzidas à síntese de trealose como descrito acima foram mortas através de ciclos repetidos de congelamento-descongelamento e usados nos coelhos imunes, Os títulos de anticorpos nos animais imunizados foram ensaiados por diluições em série de 10 pregas usando um ensaio dot-bloL num lisatos de célula total comparado como descrito para a análise de trealose acima mencionada. Os animais vacinados com as bactérias induzidas mostraram uma prega de titulo de anticorpo 10 a 100 maior que aqueles imunizados com bactérias não induzidas.

Lisboa, 10 de Julho de 200' 14/14

Claims (9)

1. Keivindicacoes Ura método para aumentar a imunogeni vacina que compreende células componente imunogénico determinante pelo facto de que o método compreende de cidade de procarió activas, os passos uma composição ticas como o caracterizado de: a. Tratar as células procarióticas para induzir um aumento da concentração de trealose dentro das células procarióticas pela síntese da trealose dentro da célula; b. Usando as células procarióticas tratadas como o determinante imunogénico na produção de uma composição de vacina.
2. 2. Um método como reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de que o tratamento de células procarióticas é realizado para atingir a concentração de trealose dentro das células procarióticas de pelo menos 10 mM.
3. 3. Um método como reivindicado na reivindicação 1 ou reivindicação 2, caracterizado pelo facto de que a condição que provoca a síntese de trealose dentro das células é aquecida, o choque osmótico, supressão da degradação de trealose, ou geneticamente modificadas constitutivas da síntese de trealose dentro das células.
4. 4. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo facto de que as células induzidas que contêm a trealose, são secas antes mesmo do seu uso na produção da composição da vacina. 1/2
5. 5. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo facto de que as células procarióticas são bactérias.
6. 6. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo facto de que as células procarióticas são tratadas ao cultivá-las num meio que contém um ou vários solutos e tendo uma osmolaridade de pelo menos 350 mOsmoles.
7. 7. Um método como reivindicado na reivindicação 6, caracterizado pelo facto de que o soluto é seleccionado de um sal de sódio, potássio, cálcio e/ou amónio.
8. 8. Um método como reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de que o tratamento de células procarióticas é realizado para atingir a concentração de trealose dentro das células de pelo menos 10 mM.
9. 9. Um método como reivindicado em qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo facto de que as células procarióticas que contêm a trealose induzida são mortas antes de serem usadas na composição da vacina. Lisboa, 10 de Julho de 2007 2/2