PT118115B

PT118115B - Dispositivo, sistema e processo para a produção melhorada de lípidos de manosileritritol (mels) integrando a fermentação e separação do produto a partir do caldo de fermentação por métodos não invasivos

Info

Publication number: PT118115B
Application number: PT118115A
Authority: PT
Inventors: Kekovic Petar; Castelo Alves Ferreira Frederico; Ricardo Torres Faria Nuno; Figueiredo Nascimento Miguel
Original assignee: Inst Superior Tecnico
Priority date: 2022-07-19
Filing date: 2022-07-19
Publication date: 2025-10-15
Also published as: PT118115A; EP4558598A1; WO2024019627A1; US20260028579A1

Abstract

A PRESENTE DIVULGAÇÃO REFERE-SE A UM DISPOSITIVO (1) E A UM SISTEMA DE MACROFILTRAÇÃO. A MACROFILTRAÇÃO PERMITE A RECUPERAÇÃO DE LÍPIDOS DE MANOSILERITRITOL (MELS), EM QUE OS MELS SE APRESENTAM NA FORMA DE PARTÍCULAS. O SISTEMA QUEINCLUI O DISPOSITIVO (1) TAMBÉM É DIVULGADO. O SISTEMA COMPREENDE UMA PRIMEIRA VIA DE COMUNICAÇÃO DE FLUÍDOS (6),EM QUE ESTA PRIMEIRA VIA COMPREENDE UMA PRIMEIRA VÁLVULA (3), UMA PRIMEIRA BOMBA (4), UM BIORREATOR (2) E UMA SEGUNDA VÁLVULA (10), POSICIONADOS SEQUENCIALMENTE ENTRE A PELO MENOS UMA SAÍDA E UMA ENTRADA DO DISPOSITIVO (1). A PRESENTE DIVULGAÇÃO TAMBÉM DESCREVE UM PROCESSO PARA MELHORAR A PRODUÇÃO DE LÍPIDOS DE MANOSILERITRITOL (MELS).

Description

DESCRIÇÃO

DISPOSITIVO, SISTEMA E PROCESSO PARA A PRODUÇÃO MELHORADA DE LÍPIDOS DE MANOSILERITRITOL (MELs) INTEGRANDO A FERMENTAÇÃO E SEPARAÇÃO DO PRODUTO A PARTIR DO CALDO DE FERMENTAÇÃO POR MÉTODOS NÃO INVASIVOS

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente divulgação, em algumas formas de realização, refere-se aos lípidos de manosileritritol (MELs), processos e dispositivos para a sua produção e separação.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os lípidos de manosileritritol (MELs) são um grupo de glicolípidos extracelulares com propriedades tensioativas. Estes têm uma gama de aplicações potenciais em várias áreas (medicina, cosmética, farmacêutica, higiene pessoal, biorremediação e limpeza, etc.) e a sua produção e as estirpes de levedura que os produzem são já conhecidas.

[003] Os MELs são moléculas constituídas por uma parte hidrofílica, composta por manose e eritritol, e uma parte hidrofóbica, composta por cadeias de carbono de ácidos gordos com um tamanho típico que pode ir de 4 a 18 átomos de carbono. O grupo manose dos MELs pode ser acetilado, duplamente acetilado ou sem acetilação. Estas diferentes configurações das suas partes hidrofílica e hidrofóbica conferem aos diferentes MELs diferentes estruturas e propriedades.

[004] Existem várias leveduras conhecidas por produzir MELs, no entanto, as estirpes Moesziomyces antarcticus e M. bullatus são aquelas para as quais estão reportadas quantidades de MELs produzidas mais elevadas, com uma concentração máxima de 165 g MEL bruto/L, em fermentações de M. bullatus, de um produto que se apresenta como uma mistura bruta de MELs (mistura de MELs não purificada com substrato não consumido) e grandes quantidades de óleo de soja (SBO, do inglês soybean oil), óleo de soja este que foi usado como substrato e não consumido completamente durante a fermentação conjunta com glucose, extrato de levedura, e outros componentes do meio.

[005] As fermentações desenvolvidas para a produção de MELs tipicamente começam com uma fase de crescimento celular após a qual a taxa de produção de MELs aumenta significativamente, principalmente na presença de um substrato hidrofóbico (adicionado seguindo estratégias de fermentação descontínua ou de alimentação descontínua por lotes). É relatado que a produção de MELs pode durar até 240-336 horas. O método mais eficiente descrito na literatura utilizado para a separação de MELs do caldo de fermentação inclui o uso de várias extrações líquido-líquido sucessivas, de difícil execução em que são usados vários solventes orgânicos (acetato de etilo, hexano, etanol).

[006] Tipicamente, as produções de MELs que atingem títulos altos usam quantidades elevadas de óleo vegetal (80-240 g/L), nomeadamente óleo de soja, que não é totalmente consumido, tornando-se assim um contaminante do produto. A separação de MELs de triacilgliceróis, o principal componente de óleos vegetais, e de outras impurezas lipídicas por extração com solventes orgânicos que dependa de um único solvente não está descrita na literatura, uma vez que a purificação de MELs requer normalmente a combinação de vários solventes em múltiplas etapas da extração.

[007] A patente JP2008152690A divulga um método de produção de lípidos de manosileritritol através do cultivo de um microrganismo capaz de produzir lípidos de manosileritritol numa solução de cultura contendo um nutriente e uma fonte de carbono, o microrganismo capaz de produzir lípidos de manosileritritol é o Pseudozyma tsukubaensis.

[008] A patente US20220127563A1 divulga um método melhorado para produzir lípidos de manosileritritol (MELs) usando leveduras não conhecidas anteriormente para produzir MELs. Em particular, a Meyerozyma guilliermondii (Pichia guilliermondii) é cultivada num meio nutritivo especialmente desenvolvido para o efeito e em condições de cultivo tais que a levedura produz de forma não natural MELs e/ou moléculas semelhantes a MELs em quantidades maiores e a taxas mais elevadas do que nas condições de produção padrão de MELs com, por exemplo, Pseudozyma aphidis.

[009] No entanto, ainda há necessidade de desenvolver métodos para a produção e recuperação de MELs com maior eficiência, menor tempo de fermentação e diminuir o uso de solventes.

RESUMO DA INVENÇÃO

[010] Num modo de realização da presente divulgação, é descrito um dispositivo (1) de macrofiltração que compreende uma grelha (20), a grelha compreendendo uma pluralidade de canais, cada canal com largura entre 0,3 mm e 10 mm; a grelha separa uma primeira câmara e uma segunda câmara, cada câmara posicionada em lados opostos da grelha (20). O dispositivo compreende pelo menos uma entrada (22) e pelo menos uma saída (24), em que: a pelo menos uma entrada (22) está configurada para fornecer uniformemente um fluido à primeira câmara; e a segunda câmara está configurada para recolher um fluido filtrado; e a pelo menos uma saída (24) está configurada para ligar a segunda câmara a um biorreator (2).

[011] Em algumas formas de realização, a macrofiltração compreende a recuperação de lípidos de manosileritritol (MELs).

[012] Numa outra forma de realização, os MELs estão sob a forma de partículas, sendo as partículas retidas na primeira câmara.

[013] Num outro aspeto desta divulgação, é descrito um sistema que inclui o dispositivo da presente divulgação.

[014] Numa outra forma de realização, o sistema inclui ainda um biorreator (2) .

[015] Numa outra forma de realização, o sistema compreende uma primeira via de comunicação de fluídos (6), em que a primeira via compreende uma primeira válvula (3), uma primeira bomba (4), o biorreator (2) e uma segunda válvula (10), colocados sequencialmente entre a pelo menos uma saída e a pelo menos uma entrada do dispositivo (1).

[016] Numa outra forma de realização, o sistema inclui ainda um reservatório (5).

[017] Numa outra forma de realização, o sistema compreende uma segunda via de comunicação de fluídos (7), na qual esta segunda via compreende uma terceira válvula (12), uma segunda bomba (8), o reservatório (5) e uma quarta válvula (14), colocados sequencialmente entre a pelo menos uma saída e pelo menos uma entrada do dispositivo (1).

[018] Numa outra forma de realização, o sistema compreende: um biorreator (2), um reservatório (5), uma primeira via de comunicação de fluidos (6) e uma segunda via de comunicação de fluidos (7), em que o dispositivo (1) compreende pelo menos uma saída (24) que comunica com a primeira via de comunicação de fluidos (6) e com a segunda via de comunicação de fluidos (7), e pelo menos uma entrada (22) que comunica com a primeira via de comunicação de fluidos (6) e com a segunda via de comunicação de fluidos (7); a primeira via de comunicação de fluidos (6) compreende uma primeira válvula (3), uma primeira bomba (4), o biorreator (2) e uma segunda válvula (10), colocados sequencialmente entre a pelo menos uma saída e pelo menos uma entrada do dispositivo (1); e a segunda via de comunicação de fluidos (7) compreende uma terceira válvula (12), uma segunda bomba (8), o reservatório (5) e uma quarta válvula (14), colocados sequencialmente entre a pelo menos uma saída e a pelo menos uma entrada do dispositivo (1).

[019] Num outro aspeto desta divulgação, é descrito um processo para melhorar a produção de lípidos de manosileritritol (MELs), compreendendo as etapas de: a) contacto entre 1% e 70% de peso por peso (p/p) de um substrato e entre 0,01% e 10% de uma levedura numa solução de meio de cultura em condições de fermentação, produzindo assim MELs num caldo de fermentação, b) separação do MELs do caldo de fermentação; e c) lavagem do MELs com uma segunda solução, em que a proporção da segunda solução relativamente ao caldo de fermentação varia no intervalo 3:10 a 1:50 em volume por volume (v/v); aumentando assim a eficiência da produção de lípidos de manosileritritol (MELs).

[020] Noutra forma de realização, a segunda solução compreende uma solução alcoólica e/ou uma solução aquosa.

[021] Numa outra forma de realização, o processo decorre no dispositivo da presente divulgação ou no sistema da presente divulgação.

[022] Numa outra forma de realização, o processo compreende ainda uma etapa de circulação do caldo de fermentação da etapa b), de volta à etapa a).

[023] Numa outra forma de realização, os MELs têm uma pureza de mais de 60%.

[024] Numa outra forma de realização, os MELs estão sob a forma de partículas.

[025] Numa outra forma de realização, as partículas têm uma dimensão de partícula superior a 1 mm.

[026] Numa outra forma de realização, as partículas têm uma dimensão de partícula entre 1 mm e 50 mm.

[027] Numa outra forma de realização, o substrato compreende uma fonte de carbono hidrofílica, uma fonte de carbono hidrofóbica, ou ambas.

[028] Numa outra forma de realização, a fonte de carbono hidrofílico compreende um açúcar, um álcool, ou qualquer combinação destes.

[029] Numa outra forma de realização, a fonte de carbono hidrofílico compreende um resíduo, um resíduo agrícola ou um resíduo industrial rico em carbono, selecionado do grupo compreendendo: soro de queijo, palha de trigo, resíduos de beterraba sacarina, resíduos de cana de açúcar, glicerol não refinado, ou qualquer combinação dos mesmos.

[030] Numa outra forma de realização, a fonte de carbono hidrofóbica compreende um óleo, rico em triacilgliceróis, selecionado do grupo que compreende: óleo de soja, óleo de colza, resíduos de óleo de fritura, gordura animal, óleo de algas.

[031] Numa outra forma de realização, a fonte de carbono hidrofóbica compreende ácidos gordos livres, monoacilglicerol, diacilglicerol, ou qualquer combinação dos mesmos.

[032] Numa outra forma de realização, a fonte de carbono hidrofóbico é rica em ácidos gordos livres e/ou misturas mono/di acilgliceróis obtidas sem um pré-tratamento dedicado (por exemplo, óleos de bagaço de azeitona) ou obtidas a partir do pré-tratamento dos substratos ricos em triacilgliceróis, após a sua hidrólise ou transesterificação.

[033] Numa outra forma de realização, o uso de fonte de carbono hidrofóbico rico em ácidos gordos livres e/ou misturas de mono/di acilgliceróis aumenta a velocidade de produção de partículas ricas em MELs em pelo menos 2 dias.

[034] Noutra forma de realização, a fonte de carbono hidrofóbica é adicionada na etapa a), ou até 6 dias após a etapa a).

[035] Noutra forma de realização, a fonte de carbono hidrofóbica e a fonte de carbono hidrofílica estão presentes numa proporção situada no intervalo entre 10:1 e 1:1 em peso, respetivamente.

[036] Noutra forma de realização, a solução da etapa b) compreende entre 4 e 150 g/L de MELs.

[037] Noutra forma de realização, o processo inclui ainda uma etapa de remoção de triacilgliceróis por precipitação em metanol, enquanto que os MELs se mantêm solúveis.

[038] Noutra forma de realização, o processo inclui ainda uma etapa de nanofiltração da solução de MELs.

[039] Noutra forma de realização, os MELs têm uma pureza de mais de 90%.

[040] Num outro aspeto da divulgação, é descrita uma composição que compreende uma pluralidade de lípidos de manosileritritol (MELs), em que os MELs se apresentam sob a forma de partículas.

[041] Noutro aspeto da divulgação, é descrita uma utilização do dispositivo da presente divulgação para produção e/ou purificação de lípidos de manosileritritol (MELs).

[042] Num outro aspeto da divulgação, é descrita uma utilização da presente divulgação, para a produção e/ou purificação dos lípidos de manosileritritol (MELs).

[043] Noutra forma de realização, é descrita uma utilização do processo aqui divulgado, para a produção e purificação dos lípidos de manosileritritol (MELs).

[044] Num outro aspeto da divulgação, é fornecida uma utilização da composição aqui divulgada, na agricultura, alimentação, bebidas, produtos de limpeza, biorremediação, indústria do petróleo e gás, indústria de produtos químicos ou bioquímicos finos, cosméticos, indústria farmacêutica, ou qualquer combinação dos mesmos.

[045] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e/ou científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o comummente entendido por alguém com capacidades comuns e conhecimentos gerais na área a que a invenção pertence.

Embora os métodos e materiais aqui descritos sejam semelhantes ou equivalentes aos utilizados na prática ou teste de formas de realização da presente invenção, são descritos abaixo exemplos de métodos e/ou materiais. Em caso de conflito, prevalecem as especificações descritas nesta patente, incluindo as definições aqui descritas. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser necessariamente limitativos.

[046] Outras formas de realização e todo o âmbito de aplicabilidade da presente invenção tornar-se-ão evidentes a partir da descrição detalhada dada a seguir. Contudo, deve entender-se que a descrição detalhada e exemplos específicos, embora indicando as realizações preferidas da invenção, são dados apenas a título de ilustração, uma vez que várias alterações e modificações dentro do espírito e âmbito da invenção se tornarão evidentes para aqueles que são competentes na arte a partir desta descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[047] A Figura 1 é um diagrama de blocos de um sistema de produção de MELs integrando um dispositivo não invasivo de separação de produto (1) (também referido apenas como dispositivo), e tubagem integrada para a circulação de fluidos entre biorreator (2) e dispositivo (1), bem como de solvente/água quente entre dispositivo (1) e reservatório (5) ;

[048] A Figura 2 é um gráfico de barras da concentração de MELs presentes em extratos de grânulos ricos em MELs e caldo de fermentação sem grânulos, após cultivo de M. antarcticus em 40 g/L de D-glucose e alimentação de 20 g/L de óleo de soja (SBO, do inglês Soybean Oil), ácido gordo livre (FFA, do inglês Free Fatty Acid) ou ésteres metílicos de ácidos gordos (FAME, do inglês Fatty Acid Methyl Esters) ao dia 4, a 27°C, 250 rpm (rotações por minuto), durante 7 dias;

[049] A Figura 3 é um diagrama do tamanho e cor dos grânulos ricos em MELs obtidas em diferentes períodos de fermentação, em frascos alimentados com vários substratos de base lipídica a diferentes dias de fermentação.

Legenda do Gráfico:

Tamanho do círculo	Diâmetro dos grânulos ricos em MELs
Muito Pequeno	<1 mm
Pequeno	1-3 mm
Médio	3-10 mm
Grande	>10mm

Código de cores:

Cor/padrão do círculo	Cor dos grânulos ricos em MELs para cada dia de fermentação
Branco	verde
Pontilhado	amarelo
Linhas verticais	Laranja claro
Linhas horizontais	Laranja escuro ou castanho

[050] A Figura 4 é um gráfico de barras da concentração total de MELs e lípidos, nos grânulos e no caldo de fermentação, no final de 12 dias de fermentação nos frascos A (em que se usou glucose para a preparação de inóculos) e B (em que se usou glicerol para a preparação de inóculos). As fermentações principais usaram como fonte de carbono uma concentração inicial de 40 g/L de D-glucose e uma mistura de 30 g/L de Dglucose e 40 g/L de óleo de colza adicionada ao dia 4.

[051] A Figura 5 é um diagrama do tamanho e da cor dos grânulos ricos em MELs obtidos em diferentes períodos de fermentação em frascos alimentados com vários substratos.

Tamanho do círculo	Diâmetro dos grânulos ricos em MEL
Muito Pequeno	<1 mm
Pequeno	1-3 mm
Médio	3-10 mm
Grande	>10mm

Cor/padrão do círculo	Cor dos grânulos ricos em MELs
Branco	Verde
Quadriculado	verde escuro
Pontilhado	Amarelo
Linhas verticais	Laranja claro
Linhas horizontais	Laranja escuro ou castanho

A cor/padrão do círculo indica a cor dos grânulos ricos em MELs para cada dia de fermentação. 20 g/L de D-glucose foram alimentados no dia 4.

[052] A Figura 6 é um exemplo de desenho do dispositivo nãoinvasivo de separação de produtos (1) (abreviadamente designado dispositivo (1)). Esquerda: Desenho do dispositivo (1) de separação de grânulos ricos em MELs (tampa superior removida para visibilidade do interior). Direita: Desenho de projeção lateral do dispositivo (1), indicando a direção do fluxo do caldo de fermentação através do dispositivo (1), que compreende pelo menos uma entrada (22), uma grelha (20) que separa duas câmaras e pelo menos uma saída (24);

[053] A Figura 7 representa uma secção do diagrama de blocos de um sistema de produção de MELs que integra biorreator (2) e dispositivo não-invasivo de separação de produto (1), representando o circuito de transporte de fluido contendo as células viáveis (ver figura 1 para um circuito incluindo a recuperação dos MELs) 1- dispositivo (para separação de produto); 2- biorreator; 3,10- válvulas; 4- primeira bomba (bomba peristáltica); e 6 - primeira via (fluxo de caldo fermentativo);

[054] A Figura 8 é um gráfico da performance da nanofiltração após uso de 2, 4 e 6 diavolumes usando membranas de nanofiltração preparadas a partir de 22, 24 e 26% de soluções de polibenzimidazol (PBI). A pureza inicial de MELs submetido a nanofiltração foi de 82%.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[055] De acordo com outras formas de realização, a presente divulgação fornece um dispositivo e um sistema para realizar uma macrofiltração. Em algumas formas de realização, a macrofiltração compreende a recuperação de lípidos de manosileritritol (MELs).

[056] A presente divulgação baseia-se, em parte, num dispositivo e sistema de macrofiltração que permitem a recuperação do produto [por exemplo, lípidos de manosileritritol (MELs)], sem interrupção da fermentação. Esta característica é especialmente importante para reduzir os efeitos adversos de altas concentrações de MELs e substratos no caldo de fermentação (tais como a redução do coeficiente de transferência de oxigénio líquido/gasoso, kLa, ou seja, o aumento da resistência à transferência de massa, devido à baixa interface ar/líquido e à alta/média viscosidade, com consequentes limitações em oxigénio e redução da homogeneidade do meio).

[057] Em algumas realizações, a remoção de MELs do caldo de fermentação, aumenta a produção de MELs.

[058] De acordo com algumas realizações, a presente divulgação fornece um processo para melhorar a produção de lípidos de manosileritritol (MELs).

[059] A presente divulgação baseia-se, em parte, num processo que permite reduzir o volume total de solvente, bem como o número dos diferentes solventes orgânicos utilizados para separação de MELs quando comparado com os métodos convencionais conhecidos no estado da técnica (tais como a extração líquido-líquido de todo o caldo de fermentação com solventes orgânicos).

[060] A presente divulgação baseia-se, em parte, na constatação de que a utilização de substratos com uma elevada proporção de derivados lipídicos aumenta a formação de partículas mais estáveis em condições de fermentação. Em particular, o uso de substratos de lípidos parcialmente hidrolisados (contendo frações significativas de ácidos gordos livres e monoacilgliceróis) ou trans-esterificados em ésteres alquílicos de cadeia única promovem a formação mais rápida e mais eficiente de partículas ricas em MELs com uma qualidade superior em termos de características físicas (por exemplo, firmeza, tamanho, densidade) e pureza.

[061] Como aqui utilizado, lípidos de manosileritritol (MELs) refere-se a uma classe de biosurfactantes glicolipídicos produzidos por uma variedade de leveduras e estirpes fúngicas. MELs são biosurfactantes contendo 4-O-pD-manopiranosil-meso-eritritol como o grupo hidrofílico e um ácido gordo e/ou um grupo acetil como a fração hidrofóbica. Existem várias variantes estruturais dos MELs. Estas variantes surgem devido às seguintes razões: 1) número e posição do grupo acetil na manose ou eritritol ou ambos; 2) número de acilação na manose; 3) comprimento da cadeia de ácido gordo e a sua saturação. Os grupos acilo nos MELs podem variar de C7 a C14 e as suas proporções variam dependendo da fonte de carbono utilizada.

[062] De acordo com algumas formas de realização, a presente divulgação descreve um dispositivo (1) para macrofiltração. Em algumas formas de realização, o dispositivo compreende uma grelha (20), a grelha compreende uma pluralidade de canais, tendo cada canal uma largura entre 0,3 mm e 10 mm.

Em algumas formas de realização, cada canal tem uma largura entre 0,3 mm e 10 mm, entre 0,4 mm e 10 mm, entre 0,5 mm e 10 mm, entre 0,6 mm e 10 mm, entre 0,7 mm e 10 mm, entre 0,8 mm e 10 mm, , entre 0,3 mm e 8 mm, entre 0,4 mm e 8 mm, entre 0,5 mm e 8 mm, entre 0,6 mm e 8 mm, entre 0,7 mm e 8 mm, entre 0,8 mm e 8 mm, entre 0,3 mm e 5 mm, entre 0,4 mm e 5 mm, entre 0,5 mm e 5 mm, entre 0,6 mm e 5 mm, entre 0,7 mm e 5 mm, entre 0,8 mm e 5 mm, entre 0,3 mm e 2 mm, entre 0,4 mm e 2 mm, entre 0,5 mm e 2 mm, entre 0,6 mm e 2 mm, entre 0,7 mm e 2 mm, , entre 0,8 mm e 2 mm, entre 0,3 mm e 1 mm, entre 0,4 mm e 1 mm, entre 0,5 mm e 1 mm, entre 0,6 mm e 1 mm, entre 0,7 mm e 1 mm, ou entre 0,8 mm e 1 mm, incluindo qualquer intervalo entre eles. Cada possibilidade representa uma forma de realização separada da presente divulgação. De acordo com a presente invenção, a distância entre os canais (largura) é selecionada para ser suficientemente grande para não apresentar tensão de corte substancial para as células quando a solução de caldo de fermentação contendo estas células atravessam o espaçamento de canais entre grelhas, mas suficientemente pequena para reter os grânulos ricos em MELs dentro do dispositivo.

[063] Em algumas formas de realização, o dispositivo (1) compreende uma grelha (20), a grelha separando uma primeira câmara e uma segunda câmara, cada câmara posicionada num lado oposto da grelha (20) ao longo do seu eixo longitudinal. O dispositivo (1) compreende ainda pelo menos uma entrada (22) e pelo menos uma saída (24), em que: a pelo menos uma entrada (22) é configurada para fornecer uniformemente um fluido à primeira câmara; a segunda câmara é configurada para recolher um fluido filtrado; e pelo menos uma saída (24) é configurada para ligar a segunda câmara a um biorreator (2).

[064] Em algumas formas de realização, a macrofiltração compreende a recuperação de lípidos de manosileritritol (MELs). Em algumas formas de realização, MELs estão na forma de partículas. Em algumas formas de realização, as partículas são retidas na primeira câmara.

[065] Em algumas formas de realização, um dispositivo de acordo com a presente invenção, é configurado para recolher o produto (partículas ricas em MEL) in situ, enquanto recicla o caldo de fermentação (solução de fermentação), contendo células e partículas ricas em MELs não maduras, de volta para um fermentador (por exemplo, um biorreator) a fluxos elevados e tempos de residência baixos, tendendo para zero, mas sem danificar significativamente as células. Em algumas formas de realização, a morte celular é inferior a 2%.

[066] O termo partícula, é usado na presente invenção, para se referir a um pequeno pedaço de matéria ao qual podem ser atribuídas várias propriedades físicas ou químicas, tais como volume, densidade ou massa. Uma partícula pode ter geralmente a forma de uma esfera, uma esfera incompleta, uma haste, um cilindro, uma fita, uma esponja e qualquer outra forma, ou pode ter a forma de um aglomerado de qualquer uma destas formas, ou pode compreender uma mistura de uma ou mais formas. Em algumas formas de realização, uma partícula de acordo com a presente divulgação refere-se a um grânulo. De acordo com a presente invenção, os termos partícula e grânulo são equivalentes e utilizados de forma intermutável.

[067] Em algumas formas de realização, o tamanho das partículas aqui descritas representa um tamanho médio ou mediano de uma pluralidade de partículas.

[068] Como aqui utilizado, os termos tamanho médio ou mediano referem-se a um diâmetro das partículas.

[069] Em algumas formas de realização, a dimensão média ou mediana de pelo menos, por exemplo, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou 95% das partículas, é: entre 1 mm e 50 mm, entre 3 mm e 50 mm, entre 5 mm e 50 mm, entre 10 mm e 50 mm, entre 15 mm e 50 mm, entre 1 mm e 40 m, entre 3 mm e 40 mm, entre 5 mm e 40 mm, entre 10 mm e 40 mm, ou entre 15 mm e 40 mm, incluindo qualquer intervalo entre eles. Cada possibilidade representa uma forma de realização separada na presente divulgação.

[070] Em algumas formas de realização, uma pluralidade das partículas tem um tamanho uniforme, quando presentes no caldo de fermentação.

[071] Por uniforme ou homogéneo entende-se a distribuição de tamanho que varia dentro de um intervalo inferior a, por exemplo, ±60%, ±50 %, ±40%, ±30%, ±20%, ou ±10%, incluindo qualquer valor entre eles. Cada possibilidade representa uma forma de realização separada na presente divulgação.

[072] Em algumas formas de realização, um dispositivo de acordo com a presente invenção é utilizado para separar partículas ricas em MELs de uma solução de fermentação. Em algumas formas de realização, o dispositivo retém as partículas ricas em MELs dentro do dispositivo e a solução de fermentação sai do dispositivo através de pelo menos uma saída (24).

[073] De acordo com algumas formas de realização, a presente divulgação descreve uma utilização do dispositivo descrito acima, para produção e/ou purificação de MELs.

[074] De acordo com algumas formas de realização, a presente divulgação descreve um sistema de macrofiltração, compreendendo o dispositivo (1) da presente divulgação. Em algumas formas de realização, o sistema inclui ainda um biorreator (2).

[075] Em algumas formas de realização, o sistema compreende uma primeira via de comunicação de fluídos (6), em que a primeira via compreende sequencialmente uma primeira válvula (3), uma primeira bomba (4), o biorreator (2) e uma segunda válvula (10), posicionada entre o biorreator e o dispositivo (1) e em que o dispositivo compreende pelo menos uma saída e entrada.

[076] Em algumas formas de realização, o biorreator (2) compreende uma solução de caldo de fermentação em condições para a formação de partículas ricas em MELs.

[077] Em algumas formas de realização, o dispositivo de macrofiltração e o sistema estão configurados para funcionar em condições estéreis, e sem interrupção da fermentação e/ou de forma intermitente.

[078] Em algumas formas de realização, o dispositivo de macrofiltração retém as partículas ricas em MELs dentro do dispositivo, enquanto que o filtrado (solução de caldo de fermentação) é devolvido ao biorreator. Em algumas formas de realização, o sistema permite a continuidade da fermentação, sem perdas de substrato.

[079] Em algumas formas de realização, a solução de caldo de fermentação compreende um meio de cultura, nutrientes, células, e partículas de MELs mais pequenas e de qualidade inferior (leves, ricas em lípidos, facilmente desagregadas). [080] É feita referência à Figura 1, que ilustra uma representação esquemática de um sistema de acordo com a presente divulgação. Em algumas formas de realização, o dispositivo (1) é utilizado para a recuperação de partículas ricas em MELs e é ligado ao biorreator (2) por um circuito fechado de tubos (primeira via, 6). Em algumas realizações, o sistema inclui uma primeira bomba (4), para fazer circular o caldo de fermentação contendo os grânulos ricos em MELs através do dispositivo (1), que retém os grânulos. O caldo de fermentação, após remoção de grânulos ricos em MELs, é devolvido ao biorreator (2), onde a fermentação pode continuar e/ou mais substrato pode ser adicionado para bioconversão em MELs.

[081] De acordo com algumas formas de realização, a presente divulgação descreve um sistema de macrofiltração compreendendo o dispositivo (1) da presente divulgação. Em algumas formas de realização, o sistema inclui ainda um reservatório (5).

[082] Em algumas formas de realização, o sistema compreende uma separação integrada de produtos, através de reservatório (5).

[083] Em algumas formas de realização, o sistema compreende uma segunda via de comunicação de fluídos (7), em que a segunda via compreende uma terceira válvula (12), uma segunda bomba (8), o reservatório (5) e uma quarta válvula (14) colocados sequencialmente entre a saída e a entrada do dispositivo (1).

[084] Em algumas formas de realização, o dispositivo (1) está ligado a um circuito fechado separado (segunda via 7) ligado a um reservatório (5). Em algumas formas de realização o reservatório (5) compreende um agente solubilizante que pode ser recirculado através do dispositivo (1) para dissolver e recuperar os grânulos ricos em MELs. Os fluxos do caldo fermentativo e do agente solubilizante são regulados através do sistema usando as válvulas (3, 10, 12 e 14).

[085] De acordo com algumas formas de realização, a presente divulgação descreve uma utilização do sistema aqui descrito para a produção e/ou purificação de MELs.

[086] De acordo com algumas formas de realização, a presente divulgação descreve um processo para melhorar a produção de lípidos de manosileritritol (MELs). Em algumas formas de realização, o processo compreende as etapas de: a) contacto entre 1% e 70% de peso por peso (p/p) de um substrato e entre 0.01% e 10% de uma levedura numa solução de meio de cultura em condições de fermentação, produzindo assim MELs na solução de caldo de fermentação; b) separação de MELs da solução de caldo de fermentação, e c) lavagem de MELs com uma segunda solução, em que a relação entre a segunda solução e a solução de caldo de fermentação está entre 3:10 e 1:50 volume por volume (v/v); aumentando assim a eficiência da produção de lípidos de manosileritritol (MELs).

[087] Em algumas formas de realização o processo compreende o contacto entre 1% e 70%, entre 2% e 70%, entre 5% e 70%, entre 10% e 70%, entre 15% e 70%, entre 20% e 70%, entre 30% e 70%, entre 1% e 50%, entre 2% e 50%, entre 5% e 50%, entre 10% e 50%, entre 10% e 50%, entre 15% e 50%, entre 20% e 50%, entre 30% e 50%, entre 1% e 40%, entre 2% e 40%, entre 5% e 40%, entre 10% e 40%, entre 15% e 40%, entre 15% e 40%, ou entre 20% e 40%, peso por peso (p/p) de um substrato, incluindo qualquer intervalo entre eles e entre 0,01% a 10%, entre 0,05% e 10%, entre 0,09% e 10%, entre 0,1% e 10%, entre 0,5% e 10%, entre 1% e 10%, entre 1% e 10%, entre 2% e 10%, entre 0,01% e 5%, entre 0,05% e 5%, entre 0,09% e 5%, entre 0,1% e 5%, entre 0,5% e 5%, ou entre 1% e 5%, de uma levedura numa solução de meio de cultura, incluindo qualquer intervalo entre elas, em condições de fermentação, produzindo assim MELs na solução de caldo de fermentação. Cada possibilidade representa uma forma de realização separada da presente divulgação.

[088] Em algumas formas de realização, o meio de cultura basal compreende NaNOa, KH2PO4, MgSO4.7H2O, e um extrato de levedura ou outro suplemento complexo ou um suplemento bioquímico definido. Em algumas formas de realização, a solução de caldo de fermentação compreende estripes de M. bullatus ou de M. antarcticus.

[089] Em algumas formas de realização, o processo compreende na etapa c) a lavagem de MELs com uma segunda solução, em que a relação volumétrica (abreviadamente indicada v/v) entre a segunda solução e a solução de caldo de fermentação está entre 3:10 e 1:50 v/v, entre 3:10 e 1:40 v/v, entre 3:10 e 1:30 v/v, entre 3:10 e 1:20 v/v, incluindo qualquer intervalo entre eles; aumentando assim a produção de lípidos de manosileritritol (MELs). Cada possibilidade representa uma forma de realização separada da presente divulgação.

[090] Em algumas formas de realização, a segunda solução compreende uma solução alcoólica e/ou uma solução aquosa. Em algumas formas de realização, a segunda solução é constituída por metanol.

[091] Em algumas formas de realização, o processo de recuperação é realizado no dispositivo ou no sistema aqui descrito.

[092] Em algumas formas de realização, a etapa b) de separação de MELs da solução de caldo de fermentação é realizada no dispositivo (1). Em algumas formas de realização, a etapa c) de lavagem de MELs com uma segunda solução, em que a proporção volumétrica da segunda solução para a solução de caldo de fermentação está entre 3:10 a 1:50, melhorando assim a eficiência do processo de recuperação dos lípidos de manosileritritol (MELs), é realizada no dispositivo (1).

[093] Em algumas formas de realização, a etapa c) de lavagem de MELs com uma segunda solução, em que a relação volumétrica entre a segunda solução e a solução de caldo de fermentação está entre 3:10 a 1:50; aumentando assim a eficiência do processo de recuperação de lípidos de manosileritritol (MELs), é realizada no dispositivo (1), no reservatório (5), ou em ambos.

[094] Em algumas formas de realização, a etapa a) de contacto entre 1% e 70% de peso por peso (p/p) de um substrato e entre 0,01% e 10% de uma levedura numa solução de meio de cultura em condições de fermentação, produzindo assim MELs na solução de caldo de fermentação, é realizado no biorreator (2), no dispositivo (1), ou em ambos.

[095] Em algumas formas de realização, o processo divulgado compreende também uma etapa de circulação da solução de caldo de fermentação da etapa b), de volta à etapa a).

[096] Em algumas formas de realização, os MELs obtidos tem uma pureza de mais de 60%, mais de 65%, mais de 69%, mais de 70%, ou mais de 75% p/p, incluindo qualquer valor entre elas. Cada possibilidade representa uma forma de realização separada da presente divulgação.

[097] Em algumas formas de realização, os MELs estão sob a forma de partículas.

[098] Em algumas formas de realização, as partículas têm dimensão superior a 1 mm, mais de 2 mm, mais de 3 mm, mais de 5 mm, ou mais de 10 mm, incluindo qualquer valor entre elas. Cada possibilidade representa uma formas de realização separada da presente divulgação.

[099] Em algumas formas de realização, as partículas têm uma dimensão de partículas entre 1 mm e 50 mm, entre 3 mm e 50 mm, entre 5 mm e 50 mm, entre 10 mm e 50 mm, entre 15 mm e 50 mm, entre 1 mm e 40 m, entre 3 mm e 40 mm, entre 5 mm e 40 mm, entre 10 mm e 40 mm, ou entre 15 mm e 40 mm, incluindo qualquer intervalo entre elas. Cada possibilidade representa uma forma de realização separada da presente divulgação.

[0100] Em algumas formas de realização, o substrato compreende uma fonte de carbono hidrofílica, uma fonte de carbono hidrofóbica, ou ambas.

[0101] Em algumas formas de realização, a fonte de carbono hidrofílico compreende um álcool, um açúcar, ou qualquer combinação destes. Exemplos não limitantes de álcoois de acordo com a presente invenção incluem glicerol, eritritol, metanol, etanol, propanol, butanol, pentanol, hexanol, isobutanol, e suas combinações. Exemplos não limitantes de açúcares (hidratos de carbono) de acordo com a presente invenção incluem glucose, xilose, sacarose, lactose, galactose, frutose, trealose, manose, manitol e/ou maltose, e suas combinações.

[0102] Numa outra forma de realização, a fonte de carbono hidrofílico compreende um resíduo ou resíduo agrícola ou industrial rico em carbono, como soro de queijo, palha de trigo, resíduos de beterraba sacarina, resíduos de cana-deaçúcar e glicerol não refinado.

[0103] Em algumas formas de realização, a fonte hidrofóbica de carbono compreende um óleo rico em triacilgliceróis. Exemplos não limitantes de fonte de carbono hidrofóbico de acordo com a presente invenção incluem óleo de soja, óleo de colza, óleo de coco, óleo de canola, óleo de cártamo (ou açafrão-bastardo), óleo de farelo de arroz, azeite, óleo de milho, óleo de sésamo, óleo de linhaça, óleo alimentar usado (ex. resíduo de fritura), gordura animal, óleo de algas, e suas combinações.

[0104] Em algumas formas de realização, a fonte hidrofóbica de carbono compreende ácidos gordos livres, monoacilgliceróis, diacilgliceróis, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0105] A presente invenção, baseia-se em parte, na utilização de substratos compostos por uma elevada proporção de derivados lipídicos melhorando assim a formação de partículas mais estáveis em condições de fermentação. Em particular, o fornecimento de lípidos parcialmente hidrolisados (contendo frações significativas de ácidos gordos livres e monoacilgliceróis) ou trans-esterificados em ésteres alquílicos de cadeia única promovem a formação mais rápida e mais eficiente de partículas com uma qualidade superior em termos de características físicas (por exemplo, firmeza, tamanho, densidade) e pureza. A utilização de tais substratos permite uma produção mais eficiente (por exemplo, mais rápida e com maior qualidade) de partículas (grânulos). Sem seguir uma teoria particular, a presença de triacilgliceróis, quando em quantidades significativas, pode inibir a qualidade e a formação de partículas. Portanto, utilizando estratégias onde os triacilgliceróis estão ausentes, em baixas quantidades ou são decompostos no início da fermentação, permite a produção de partículas ricas em MELs de maior qualidade, obtendo-se no fim da fermentação uma menor quantidade de derivados lipídicos no caldo de fermentação.

[0106] Em algumas formas de realização, a fonte hidrofóbica de carbono compreende (i) substratos ricos em óleo vegetal, ricos em triacilgliceróis, que foram submetidos a uma etapa de pré-tratamento, (por exemplo, utilizando lipases, enzimas semelhantes ou catálise química), para hidrolisar os triacilgliceróis em monoacilgliceróis e ácidos gordos livres ou, na presença de um álcool, promover a sua transesterificação em ésteres alquílicos de cadeia única, (ii) substratos lipídicos, tais como óleos de bagaço de azeitona ou resíduos de produção de biodiesel (tais como glicerol não refinado rico em ácidos gordos livres e monoacilgliceróis), que pela sua natureza têm composições com menor teor de triacilgliceróis e são ricos em ácidos gordos livres ou monoacilgliceróis, ou qualquer combinação de (i) e (ii).

[0107] Em algumas formas de realização, a hidrólise da fonte de carbono hidrofóbica (por exemplo óleo vegetal) é feita misturando sobrenadante rico em lípidos com 80 g/L de óleo vegetal, e incubado a 27°C durante 48h. Para a geração de ésteres metílicos, o óleo vegetal é misturado com metanol numa proporção 1:4 molar (óleo vegetal/metanol) e incubado de forma semelhante. Em algumas formas de realização, foi utilizado CAL-B (lípase B de Candida antarctica) imobilizada, enzima que se encontra disponível comercialmente.

[0108] Em algumas formas de realização, a fonte de carbono hidrofóbica compreende menos de 60% em triacilgliceróis, menos de 50% em triacilgliceróis, menos de 40% em triacilgliceróis, menos de 30% em triacilgliceróis, ou menos de 20% em triacilgliceróis, incluindo qualquer valor entre eles. Cada possibilidade representa uma forma de realização separada da presente divulgação.

[0109] Em algumas formas de realização, a utilização de substratos contendo uma elevada proporção de derivados lipídicos adianta a formação de partículas mais estáveis em condições de fermentação em pelo menos 1 dia, pelo menos 2 dias, pelo menos 3 dias, pelo menos 4 dias, ou pelo menos 5 dias. Cada possibilidade representa uma forma de realização separada da presente divulgação.

[0110] Em algumas formas de realização, o uso de uma fonte de carbono hidrofóbico rico em ácidos gordos livres e/ou misturas de mono/di acilgliceróis aumenta a produção de partículas ricas em MELs em pelo menos 2 dias, pelo menos 3 dias, pelo menos 4 dias, ou pelo menos 5 dias. Cada possibilidade representa uma encarnação separada da presente revelação. Em algumas formas de realização, a melhoria refere-se à redução do tempo de formação de MELs e/ou aumento da qualidade das partículas de MELs formadas.

[0111] Em algumas formas de realização, a fonte de carbono hidrofóbico é adicionada no início da etapa a) , ou até 6 dias após início de etapa a).

[0112] Em algumas formas de realização, a fonte de carbono hidrofóbica e a fonte de carbono hidrofílica estão presentes numa proporção em peso, que vai de 10:1 a 1:1, 9:1 a 1:1, 8:1 a 1:1, 7:1 a 1:1, 6:1 a 1:1, 5:1 a 1:1, 10:1 a 9:1, 9:1 a 6:1, 8:1 a 5:1, 7:1 a 5:1, 6:1 a 2:1, ou 5:1 a 1:1, respetivamente, incluindo qualquer intervalo entre elas. Cada possibilidade representa uma forma de realização, separada da presente divulgação.

[0113] Em algumas formas de realização, a solução na etapa b) compreende de 4 a 150 g/L, 5 a 150 g/L, , 10 a 150 g/L, 20 a 150 g/L, 40 a 150 g/L, 50 a 150 g/L, 100 a 150 g/L, 4 a 120 g/L, 5 a 120 g/L, , 10 a 120 g/L, 20 a 120 g/L, 40 a 120 g/L, 50 a 120 g/L, 100 a 120 g/L, 4 a 100 g/L, 5 a 100 g/L, , 10 a 100 g/L, 20 a 100 g/L, 40 a 100 g/L, 50 a 100 g/L, ou 100 a 150 g/L, em MELs, incluindo qualquer intervalo entre elas. Cada possibilidade representa uma forma de realização, separada da presente divulgação.

[0114] Em algumas formas de realização, o processo inclui ainda uma etapa de remoção de triacilicéridos pela sua precipitação em metanol. Em algumas formas de realização, os MELs permanecem solúveis na solução de metanol. Em algumas formas de realização, a etapa de remoção de tryacilgliceróis repete-se pelo menos 1 vez, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, ou pelo menos 5 vezes. Cada possibilidade representa uma forma de realização separada da presente divulgação.

[0115] Em algumas formas de realização, a etapa de remoção de triacilgliceróis pela sua precipitação em metanol, permite a remoção de quaisquer triacilgliceróis residuais presentes nas partículas. Em algumas formas de realização, o conteúdo de triacilgliceróis nas misturas brutas de MELs é inferior a 45%, 40%, 30%, 20%, 10%, menos de 7%, ou menos de 5%. Cada possibilidade representa uma forma de realização separada da presente divulgação.

[0116] Em algumas formas de realização, o processo inclui ainda uma etapa de nanofiltração da solução de MELs. Em algumas formas de realização, as partículas ricas em MELs após nanofiltração têm uma pureza de mais de 90%, mais de 92%, mais de 95%, mais de 96%, ou mais de 98%, incluindo qualquer valor entre elas. Cada possibilidade representa uma forma de realização separada da presente divulgação. Em algumas formas de realização, a etapa de nanofiltração permite a remoção de quaisquer contaminantes lipídicos residuais de menor dimensão que os MELs. Em algumas formas de realização, o processo compreende ainda uma etapa de evaporação da solução.

[0117] Em algumas formas de realização, a nanofiltração refere-se à diafiltração.

[0118] Em algumas formas de realização, a etapa de nanofiltração compreende pelo menos 2 diavolumes (DV), pelo menos 3 DV, pelo menos 4 DV, pelo menos 5 DV, ou pelo menos 6 DV. Cada possibilidade representa uma formas de realização separada da presente divulgação.

[0119] Quando aqui utilizado, o termo diavolume (DV) refere-se à quantidade, em volume, de solvente fresco (por exemplo metanol) que é igual à quantidade, em volume, de solução inicial submetida a uma diafiltração.

[0120] Em algumas formas de realização, de acordo com a presente invenção, os contaminantes lipídicos removidos podem ser reutilizados como substrato para fermentações subsequentes após a recuperação da maior parte do metanol. Em algumas formas de realização, a presente invenção baseiase, em parte, na utilização de pequenas quantidades de metanol evitando assim os efeitos inibidores sobre os microrganismos.

[0121] De acordo com algumas formas de realização, a presente divulgação providencia uma utilização do processo aqui descrito para a produção e purificação de lípidos de manosileritritol (MELs).

[0122] De acordo com algumas formas de realização, a presente divulgação fornece uma composição compreendendo uma pluralidade de lípidos de manosileritritol (MELs), em que os MELs se apresentam sob a forma de partículas.

[0123] De acordo com algumas realizações, a presente divulgação proporciona uma utilização da composição aqui divulgada: na agricultura, na alimentação, em bebidas, em produtos de limpeza, na biorremediação, na indústria do petróleo e gás, de produtos químicos ou bioquímicos finos, cosméticos, indústria farmacêutica, ou qualquer combinação dos mesmos.

[0124] Como aqui utilizado, o termo cerca refere-se a ± 10 %.

[0125] Os termos compreende, compreendendo, inclui, incluindo, tendo e os seus conjugados significam incluindo, mas não limitado a.

[0126] O termo consistindo em significa incluindo e limitado a.

[0127] O termo constituído essencialmente por significa que a composição, método ou estrutura pode incluir ingredientes, etapas e/ou partes adicionais, mas apenas se os ingredientes, etapas e/ou partes adicionais não alterarem materialmente as características básicas e novas da composição, método ou estrutura reivindicada.

[0128] A palavra exemplar é aqui utilizada para significar servir de exemplo, instância ou ilustração. Qualquer realização descrita como exemplar não deve necessariamente ser interpretada como preferencial ou vantajosa em relação a outras realizações e/ou excluir a incorporação de características de outras realizações.

[0129] A palavra opcionalmente é aqui utilizada para significar é fornecida em algumas divulgações e não é fornecido noutras divulgações. Qualquer forma de realização particular da divulgação pode incluir uma pluralidade de características opcionais, a menos que tais características entrem em conflito.

[0130] Tal como aqui utilizado, as formas singular o, a um e uma incluem referências plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Por exemplo, o termo uma válvula ou pelo menos uma válvula pode incluir uma pluralidade de válvulas, incluindo as suas misturas.

[0131] Ao longo da apresentação da presente divulgação, várias formas de realização da mesma podem ser apresentadas na forma de intervalo. Deve entender-se que a descrição em formato de intervalo é meramente por conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível do âmbito da divulgação. Consequentemente, a descrição de uma gama deve ser considerada como tendo divulgado especificamente todos os subgrupos possíveis, bem como os valores numéricos individuais dentro dessa gama. Por exemplo, a descrição de um intervalo como de 1 a 6 deve ser considerada como tendo divulgado especificamente subintervalos como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., bem como números individuais dentro desse intervalo, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, e 6. Isto aplica-se independentemente da amplitude do intervalo de variação.

[0132] Sempre que um intervalo numérico é aqui indicado, pretende-se incluir qualquer numeral citado (fracionário ou integral) dentro do intervalo indicado. As frases intervalo entre um primeiro número e um segundo número e intervalo de um primeiro número até um segundo número (p.ex. intervalo entre 2 a 4 ou intervalo de 2 a 4) são aqui utilizadas indiferentemente e destinam-se a incluir o primeiro e segundo números indicados e todos os numerais fracionários e integrais entre eles.

[0133] Salienta-se que certas características da divulgação, que são, para maior clareza, descritas no contexto de formas de realização separadas, também podem ser proporcionadas em combinação numa única forma de realização. Pelo contrário, várias características da divulgação, que são, por brevidade, descritas no contexto de uma única forma de realização, também podem ser fornecidas separadamente ou em qualquer subcombinação adequada ou como adequadas em qualquer outra forma de realização descrita da divulgação. Certas características descritas no contexto de várias formas de realização da divulgação não devem ser consideradas características essenciais dessas formas de realização, a menos que a forma de realização seja inoperante sem esses elementos.

EXEMPLOS

[0134] Faz-se agora referência aos seguintes exemplos, que juntamente com as descrições acima referidas ilustram algumas formas de realização da invenção de uma forma não limitativa.

EXEMPLO 1

EXPERIÊNCIAS PRELIMINARES

Formação de grânulos ricos em MELs.

[0135] Um método de acordo com a presente divulgação inclui uma fase de fermentação, com um primeiro passo para alcançar a fase de crescimento celular e um segundo passo que compreende uma fase estacionária, caracterizada por uma produção elevada de MELs. Para esta fermentação, podem ser utilizados substratos hidrofílicos (por exemplo, D-glucose, D-xilose, glicerol), juntamente com substratos hidrofóbicos (óleos vegetais, acilgliceróis, alcanos, ésteres metílicos, ácidos carboxílicos), ou a sua mistura. Enquanto a formação de grânulos ricos em MELs é descrita na literatura para fermentações em frasco; o aparecimento de tais grânulos é intermitente ou inexistente nas fermentações que ocorrem no biorreator, muito provavelmente como consequência do uso de agitação elevada e arejamento nas etapas de crescimento celular e produção de MEL.

[0136] O óleo de soja, um óleo vegetal rico em triacilgliceróis, é, segundo a literatura, o substrato de referência utilizado para a produção de MELs. Portanto, seguindo as melhores práticas descritas na literatura para produzir quantidades grandes de MELs em biorreator, o óleo de soja (SBO) foi o substrato inicialmente utilizado. Este substrato foi alimentado às fermentações, como recebido do fornecedor, em quantidades de 40 g/L no dia 0 e 40 g/L no dia 4; tais concentrações são calculadas com base no peso do substrato alimentado à fermentação por volume total do caldo de fermentação. A produção de grânulos contendo MELs só foi observada após 9 dias, e o substrato alimentado à fermentação e não consumido acumulou no caldo fermentativo até concentrações do substrato acima de 40 g/L. Ainda assim, os grânulos produzidos eram de qualidade inferior (ou seja, macios, gelatinosos, de baixa densidade, fáceis de desagregar, com elevado teor de lípidos, com conteúdos altos de biomassa e água, e fáceis de quebrar sob agitação). Estes grânulos não podiam ser facilmente recuperados utilizando a macrofiltração.

[0137] A abordagem inicial para melhorar a produtividade e pureza dos MELs foi reduzir o óleo vegetal alimentado como substrato e complementar a alimentação inicial de fonte de carbono com um substrato hidrofílico, tal como D-glucose, Dxilose ou glicerol. Vários substratos foram utilizados com o objetivo de melhorar a produtividade MEL, com vários resultados, mas sem melhorias significativas em termos de velocidade na formação de grânulos ou da sua qualidade. Num estudo à parte, os inventores colocaram a hipótese de que a limitação metabólica à síntese dos MELs a partir de substratos ricos em triacilgliceróis se devia à lenta atividade catalítica das lípases produzidas pela levedura. Portanto, os inventores realizaram fermentações de leveduras para a produção dos MELs com alimentos lipídicos parcialmente hidrolisados, ou seja, ricos em ácidos gordos livres e monoacilgliceróis. Surpreendentemente, quando esses lípidos parcialmente hidrolisados foram alimentados à fermentação em quantidades menores, quando comparadas com as quantidades anteriormente utilizadas de óleos vegetais, observou-se que a formação de grânulos ricos em MELs era melhorada.

[0138] A mesma melhoria na qualidade dos grânulos e na sua velocidade de formação pode ser obtida utilizando como substrato (i) óleos vegetais ricos em triacilgliceróis, submetidos a um pré-tratamento com lipases, enzimas semelhantes ou catálise química, de modo a hidrolisar os triacilgliceróis em monoacilgliceróis e ácidos gordos livres ou, na presença de um álcool, tenham sido trans-esterificados em ésteres alquílicos de cadeia simples, ou (ii) substratos lipídicos, tais como bagaço de azeitona ou resíduos de produção de biodiesel (tais como glicerol não refinado rico em ácidos gordos livres e monoacilgliceróis), que pela sua natureza têm composições com menor teor de triacilgliceróis e são ricos em ácidos gordos livres ou monoacilgliceróis. No presente documento, os ácidos gordos livres e monoacilgliceróis ou ésteres alquílicos de cadeia simples anteriormente mencionados, obtidos a partir de triacilgliceróis, são designados por derivados lipídicos.

[0139] Portanto, a presente invenção divulga que a utilização de substratos com uma proporção elevada de derivados lipídicos aumenta a formação de grânulos de produto mais estáveis, durante a fermentação. Em particular, o uso de substratos lipídios parcialmente hidrolisados (contendo frações significativas de ácidos gordos livres e monoacilgliceróis) ou transesterificados em ésteres alquílicos de cadeia simples promovem a formação mais rápida e mais eficiente de grânulos com qualidade superior em termos de características físicas (firmeza, tamanho, densidade) e pureza. A utilização de tais substratos permite uma produção mais eficiente de grânulos, provavelmente porque a presença de triacilgliceróis, quando em quantidades significativas, inibe a formação de grânulos de qualidade superior. Portanto, a utilização de estratégias onde os triacilgliceróis estão ausentes, presentes em pequenas quantidades ou são decompostos no início da fermentação, permite a produção de grânulos ricos em MELs de maior qualidade e a presença de uma quantidade menor de derivados lipídicos no caldo de fermentação.

[0140] Várias características distintas de grânulos ricos em MELs podem ser usadas como indicadores da sua qualidade, estas relacionam principalmente com o conteúdo em MELs presente nos grânulos. A flutuabilidade dos grânulos está relacionada com o conteúdo em triacilgliceróis. Grânulos com uma concentração não negligenciável de triacilgliceróis flutuam no caldo de fermentação não agitado, enquanto que os grânulos que não contêm triacilgliceróis tendem a não flutuar. Ainda assim, a sedimentação de grânulos ricos em MELs não ocorre a um nível que possa ser utilizado para as recuperar eficazmente do caldo de fermentação, uma vez que estas não coalescem de forma a fazer uma fase coesa que permita a sua separação. Além disso, a presença de triacilgliceróis nos grânulos torna-os macios e gelatinosos e impede a sua recuperação através de macrofiltração ou outros métodos físicos. Por outro lado, os grânulos com conteúdos mais elevados de MELs (>55%) e quantidades insignificantes de triacilgliceróis (<5%) tornam-se firmes, permitindo uma recuperação eficiente. O tamanho dos grânulos depende do regime de mistura e do sistema de agitação usado (por exemplo, os grânulos são de maior dimensão em culturas em frascos submetidas a agitador orbital e de menor dimensão em culturas em bioreator agitadas com recurso a turbina). O tamanho dos grânulos é também outro indicador da sua qualidade. Em frascos, sob agitação orbital, os grânulos ricos em MELs com um diâmetro relativo <1 mm tinham <40% de pureza, entre 1-3 mm tinham 40-50% de pureza, entre 3 e 10 mm tinham 50-60% de pureza, enquanto os grânulos de pureza superior a 60% tinham um diâmetro superior a 10 mm. Uma relação entre pureza (em termos de conteúdo de MELs) e tamanho foi também observada para fermentações em biorreatores, onde uma fermentação agitada por uma turbina Rushton (a 400 rpm) gerou grânulos de 1-3 mm, com uma pureza de 65-70%. Finalmente, a coloração dos grânulos pode ser um indicador da sua pureza, enquanto os grânulos transparentes com uma cor relativamente mais escura têm uma pureza mais elevada, e os grânulos contendo frações maiores de lípidos permanecem opacos e de cor mais clara. A coloração dos grânulos depende da composição do meio, principalmente do substrato hidrofóbico utilizado, e para os óleos vegetais varia entre o verde amarelado para grânulos mais impuros (com 35-50% de pureza) e o laranja escuro e castanho para grânulos com maior conteúdo em MELs (com uma pureza > 65%). Os grânulos ricos em MELs, designados neste documento como sendo de qualidade superior, são firmes, grandes, densos e robustos.

[0141] Seguindo as estratégias de alimentação de substrato aqui divulgadas, foi possível formarem-se grânulos ricos em MEL, em condições em que os valores de título em MELs eram mais baixos em comparação com fermentações onde foram usados substratos lipídicos não hidrolizados ou transesterificados normais. Num exemplo, o uso de óleo de soja parcialmente hidrolisado permitiu (i) a formação de grânulos de qualidade superior dois dias mais cedo do que o observado em fermentações em que se usou óleo de soja não processado e (ii) permitiu a formação de grânulos em fermentações onde as concentrações de MELs eram tão baixas quanto 5 g/L. Esta constatação contradiz o estado da arte anterior que relaciona o aparecimento de grânulos em fermentações onde é atingido um nível de concentração de MELs elevado. Neste sentido, óleos parcialmente hidrolisados, misturas de lípidos com alto grau de acidez, ou resíduos agroindustriais com elevados níveis de lípidos hidrolisados podem promover a formação de grânulos ricos em MELs (por exemplo, os inventores confirmaram que tal é o caso com o óleo de bagaço de azeitona e com o azeite de baixa qualidade). A mesma observação é válida para resíduos industriais ricos em lípidos transesterificados, tais como os obtidos a partir da produção de biodiesel.

[0142] Outro aspeto benéfico para melhorar a formação de grânulos ricos em MELs é aqui divulgado. O racional para usar duas fontes de carbono foi, em primeiro lugar, facilitar o crescimento da biomassa e a produção de enzimas usando um substrato hidrofílico e facilmente metabolizável, como a Dglucose; e depois introduzir o substrato hidrofóbico, óleos vegetais ou os seus derivados lipídicos, para promover a formação de MELs, um metabolito secundário. No entanto, um aspeto surpreendente foi a observação de que quando o protocolo não foi seguido, e as duas fontes de carbono foram adicionadas em conjunto no início da fermentação, os grânulos ricos em MELs apareceram mais rapidamente. Isto foi bastante inesperado, uma vez que tipicamente é assumido que é benéfica uma abordagem gradual para evitar uma eventual repressão catabólica ao utilizar dois substratos simultaneamente.

[0143] Finalmente, quando o glicerol, que é normalmente utilizado como crio-preservante para armazenamento das culturas de leveduras, foi usado durante a fase de preparação do inóculo como fonte de carbono, observou-se a produção de grânulos com melhor qualidade e em quantidades mais elevadas (em relação à quantidade total de MELs presentes no caldo); esta observação verificou-se independentemente da fonte hidrofílica de carbono utilizada na fermentação principal.

Processos a jusante da fermentação: inversão do papel da filtração.

[0144] Normalmente, quando se combinam filtrações com fermentações, as células são retidas pelo filtro e o produto é recolhido no filtrado. Uma das desvantagens de tais configurações é a potencial remoção de substratos não consumidos, de forma que para garantir concentrações de substrato adequadas obriga ao uso de taxas de fluxo mais baixas (ou seja, tempos residenciais mais altos). Quando esta configuração foi testada usando membranas de ultra e microfiltração, surpreendentemente verificou-se que a concentração de MELs no filtrado era muito baixa. Depois, com o aparecimento de grânulos de MELs grandes, densos e robustos, utilizando esta configuração convencional de membrana, o produto foi definitivamente retido pelas membranas juntamente com as células, tornando inútil o acoplamento da fermentação e das membranas. Numa experiência falhada, onde inadvertidamente se usou uma membrana danificada por pequenos furos de alfinete, foi observada retenção de grânulos ricos em MEL, mas uma fuga com as células a aparecerem no filtrado.

[0145] As observações acima descritas levaram à invenção atual, na qual a presença de grânulos de qualidade superior (firmes, grandes, densos e robustos) permitiu um conceito não óbvio e novo, na qual uma macrofiltração é utilizada em condições estéreis, in situ, sem interrupção da fermentação e de forma intermitente. Nesta operação, em vez de reter as células, a separação da macrofiltração retém os grânulos maiores dentro do dispositivo (1), enquanto o filtrado, composto pelo meio de cultura, nutrientes, células, e grânulos pequenos e de qualidade inferior (mais leves, com maior conteúdo lipídico e facilmente desagregáveis), é devolvido ao biorreator, permitindo a continuidade da fermentação, sem perdas de substrato. Em geral, os grânulos que são moles, pequenos, e não podem ser retidos na grelha de macrofiltração, dentro do dispositivo (1), são considerados de qualidade inferior e têm um conteúdo de MELs <55% e tamanho < 3 mm ou 1 mm, respetivamente para grânulos ricos em MELs produzidos em frascos sob agitação orbital ou bioreatores sob agitação com turbina. Esta configuração permite operar o sistema num sistema fechado e, o que é importante, utilizar um tempo residencial tendendo para zero, ou seja, um fluxo de recirculação rápido. Contudo, considerando os efeitos de tensão de corte sobre as células, o desenho do separador de macrofiltração e a seleção dos caudais não foi trivial. Foi selecionada uma configuração modificada com fluxo tangencial, e o tamanho do tubo e o espaçamento de canais entre as grelhas foram selecionados para serem suficientemente grandes para evitar valores de tensão de corte que possam afetar as células bem como a retenção de caldo dentro do dispositivo.

[0146] O sistema aqui descrito pode ser utilizado de forma contínua ou descontínua, sendo o seu uso ativado pela presença de grânulos de produto no caldo de fermentação no biorreator. Esta configuração permite que, após remoção dos grânulos do caldo de fermentação, o sistema acoplado ao biorreator seja desligado, e novo substrato possa ser adicionado ao biorreator. Este procedimento evita a contaminação do produto com substrato, o que a acontecer dificultará os passos seguintes de purificação.

[0147] Os MELs acumulados no dispositivo podem ser removidos usando um agente solubilizante que os remove do sistema (por exemplo, solvente alcoólico). Em alternativa, o produto acumulado no dispositivo pode ser recuperado por remoção mecânica dos grânulos retidos no dispositivo de macrofiltração, ou por lavagem com água aquecida, nestes casos obtendo-se um produto livre de solventes. O desenho do dispositivo é apresentado na secção de exemplos.

Processos a jusante da fermentação: substituição do uso de vários solventes e etapas de extração pelo uso de um único solvente em quantidades baixas.

[0148] Convencionalmente, os processos de separação de MELs, a jusante da fermentação, começam com a extração liquido-liquido do caldo de fermentação com um solvente orgânico, usando múltiplas etapas de extração e volumes elevados de acetato de etilo ou éter etil-ter-butílico. Para um litro de caldo de fermentação, são necessários 2-3 litros de solvente orgânico (proporção volumétrica de 2:1 a 3:1 de solvente para caldo de fermentação) nesta etapa inicial do processo de recuperação de MELs. Contudo, o uso do dispositivo (1) permite recuperar os MELs do caldo de fermentação usando uma pequena quantidade de agente solubilizante, por exemplo metanol (entre 100mL para 1L a 100mL para 5L, ou seja, em proporções volumétricas de 1:10 a 1:50 de agente solubilizante para caldo de fermentação, respetivamente). A utilização do método proposto reduz também as necessidades energéticas para a remoção do solvente. Sendo a etapa inicial da via convencional de recuperação de MEls, uma extração de um líquido aquoso por um solvente orgânico, requer que o solvente orgânico selecionado seja imiscível com água. Isto limita a possibilidade de utilização de solventes polares neste processo de separação.

[0149] A maioria dos solventes não polares não são sustentáveis e são de origem petroquímica (hexano, clorofórmio, etc.). Portanto, nos processos convencionais de separação a jusante da fermentação, etapas adicionais para purificação de MELs exigem o uso de solventes polares. Mas, o uso de solventes polares miscíveis com água (por exemplo, solventes alcoólicos) só é possível em combinação com solvente não-polar, na extração com solvente bifásico, ou trocando o solvente onde a mistura bruta de MELs se encontra dissolvido, por evaporação do solvente não-polar inicialmente usado na etapa de extração, e posterior dissolução da mistura bruta de MELs no solvente polar (processo que gasta solventes, energia e pode danificar o produto). No nosso novo sistema, os grânulos ricos em MELs são retidos no recipiente de separação juntamente com uma fração muito pequena de água, insignificante em comparação com o volume total do caldo de fermentação. Portanto, MELs podem ser transferidos diretamente do dispositivo para um gama alargada de solventes, incluindo solventes polares sustentáveis, como álcoois. Isto implica a capacidade surpreendente de usar solventes miscíveis com água para a extração dos MELs do caldo de fermentação, o que seria impossível numa configuração convencional do processo de separação de MELs a jusante da fermentação. Em alternativa, existe a possibilidade de obter um produto sem solventes, com a utilização de água aquecida como agente solubilizante usado para lavar os grânulos recolhidos no novo dispositivo (1) .

Processos a jusante da fermentação: os benefícios surpreendentes da utilização de metanol.

[0150] Em alguns casos em que se usou o novo dispositivo (1) não-invasivo de separação de produtos para recuperar os grânulos de MELs, os inventores observaram um fenómeno estranho em processos de separação de MELs proveniente de fermentações em que se usaram maiores quantidades de substratos lipídicos, ricos em triacilgliceróis, e em que estes não foram totalmente consumidos, acabando em quantidades mensuráveis em conjunto com os MELs. Em tais ensaios, quando o metanol foi utilizado para a remoção dos grânulos ricos em MELs do dispositivo (1) e a solução resultante não foi imediatamente processada, mas foi deixada em repouso durante a noite, os inventores foram surpreendidos pela observação, no dia seguinte, da formação de uma segunda fase no fundo do recipiente. Uma investigação mais aprofundada desta camada inferior e da fase líquida superior do metanol permitiu estabelecer que os triacilgliceróis estavam a ser separados na fase inferior, mas praticamente toda a fração de MELs permanecem na fase superior, dissolvidos no metanol. Depois os inventores estabeleceram que esta etapa pode ser repetida várias vezes e permite a remoção dos triacilgliceróis até que o seu conteúdo na mistura bruta de MELs seja inferior a 5%. Esta etapa permite a remoção de quaisquer triacilgliceróis residuais.

[0151] Enquanto as descobertas anteriores permitiram remover os triacilgliceróis, a remoção de quaisquer monoacilgliceróis ou ácidos gordos livres ou alquil ésteres de cadeia simples foi conseguida submetendo a solução da mistura bruta de MELs a uma etapa de nanofiltração, onde os MELs foram retidos pela membrana, mas os ácidos gordos livres, os alquil ésteres de cadeia simples e os monoacilgliceróis foram no filtrado através da membrana. A solução de permeado pode ser concentrada com recuperação do metanol para posterior utilização e a fase inferior não destilada, rica em substratos lipídicos, reciclado de volta à fermentação. Um elemento surpreendente neste procedimento é que o metanol presente nesta corrente reciclada para o biorreator não comprometeu a fermentação. Nomeadamente, a nossa experiência mostra que o metanol, por exemplo decorrente da hidrólise dos ésteres metílicos, desaparece do caldo de fermentação, provavelmente devido ao facto de ser metabolizado pelas células.

EXEMPLO 2

PRODUÇÃO DE MELs COM FORMAÇÃO DE GRÂNULOS RICOS EM MEL .A. Pré-cultura para o crescimento celular

[0152] Meio de cultura com fonte de carbono:

[0153] D-glucose, 40 g/L;

[0154] NaNO3, 3,0 g/L;

[0155] KH2PO4,0,3 g/L;

[0156] MgSO4.7H2O, 0,3 g/L;

[0157] Extrato de levedura, 1,0 g/L;

[0158] Foram preparadas soluções concentradas dos compostos mencionadas acima. Essas soluções foram autoclavados a 121°C durante 20 minutos, e após arrefecidas, adicionadas com água desmineralizada estéril, em condições estéreis, num Erlenmeyer estéril nos volumes necessários para obter uma solução final com as concentrações descritas acima. O meio foi inoculado com M. antarcticus ou M. bullatus, e incubado durante 2 dias em condições aeróbias e agitação constante a uma temperatura de fermentação de 27°C.

1.B. Processo de fermentação para produção de lipase e prétratamento do substrato

[0159] Meio de cultura com fonte de carbono:

[0160] D-glucose, 40 g/L;

[0161] NaNO3, 3 g/L;

[0162] KH2PO4, 0,3 g/L;

[0163] MgSO4.7H2O, 0,3 g/L;

[0164] Extrato de levedura, 1 g/L;

[0165] As condições de cultura descritas aqui foram implementadas com o objetivo de produzir lipases por M. antarcticus: o meio de cultura para o processo de fermentação foi preparado em água estéril, com pH inicial igual a 6. O meio de cultura foi inoculado com 10% v/v de pré-cultura preparada como descrito em 1.A. usando M. antarcticus, e incubado num frasco de Erlenmeyer sob condições aeróbias e agitação constante a uma temperatura de 27°C. Relativamente à fonte de carbono, esta fermentação começou usando 40 g/L de D-glucose presente no meio e 40 g/L de glucose foram depois adicionados ao dia 4 de cultura. Após 7 dias, o conteúdo do frasco foi centrifugado durante 8 min a 8000 rpm, e o sobrenadante rico em lipase foi recolhido e utilizado para hidrólise de óleo vegetal rico em triacilgliceróis.

[0166] A hidrólise do óleo vegetal teve lugar num frasco separado, onde o sobrenadante rico em lipase foi misturado com 80 g/L de óleo vegetal, e incubado a 27°C durante 48h. [0167] Os ésteres metílicos foram obtidos por reação do óleo vegetal com metanol, misturados na proporção 1:4 molar (óleo vegetal:metanol) e incubados de forma semelhante. No entanto, em vez dos sobrenadantes, foi utilizado CAL-B imobilizado comercialmente disponível.

[0168] As soluções obtidas com os derivados lipídicos eram constituídas por cerca de 51,65% e 25,71% dos produtos de reação, respetivamente, ácido gordo livre (FFA) e ésteres metílicos de ácidos gordos (FAME). As composições destas soluções de derivados lipídicos são apresentadas na Tabela 1. Para efeitos desta divulgação, um FFA Enriquecido ou um FAME enriquecido são substratos que contêm menos de 60% em triacilgliceróis.

Tabela 1. Composição do óleo vegetal utilizado como substrato nas culturas de Moesziomyces antarcticus para produção de MELs .

Componente (%)	SOB	FFA	FAME
Ácidos gordos livres	0.4	51.6	26.5
Monoacilgliceróis	0.0	1.6	25.7
Diacilgliceróis	0.6	13.7	6.3
Triacilgliceróis	99.0	33.1	15.8
Ésteres	/	/	25.7

1.C. Exemplo detalhado de processos de fermentação para a produção de grânulos ricos em MEL

[0169] Meio de cultura com fonte de carbono:

[0170] Fonte de carbono (variável)

[0171] KH2PO4, 0,3 g/L;

[0172] MgSO4.7H2O, 0,3 g/L;

[0173] Extrato de levedura, 1,0 g/L;

[0174] O meio de cultura para o processo de fermentação foi preparado em água estéril, com pH inicial igual a 6. O meio de cultura foi inoculado com 10% v/v de pré-cultura preparada em 1.A., e incubado em condições aeróbicas e agitação constante a uma temperatura de 27°C.

[0175] Relativamente às fontes de carbono utilizadas, esta fermentação iniciou-se 40 g/L de D-glucose, uma fonte hidrofílica de carbono, presente no meio, para suporte da primeira fase de crescimento e adaptação celular. Posteriormente, uma fonte de carbono hidrofóbico foi alimentada no dia 4 de cultura. Esta fonte de carbono consistiu em 20 g/L de óleo vegetal utilizado como recebido do fornecedor, ou pré-tratado enzimaticamente, de forma a reduzir o seu conteúdo em triacilgliceróis a valores abaixo de 50% e aumentar o conteúdo do substrato em (i) FFA ou (ii) FAME.

[017 6] A produção de MELs foi avaliada após a adição do substrato hidrofóbico. Os MELs começaram a organizar-se no caldo de fermentação sob a forma de grânulos firmes e consistentes, ricos em MELs. Para efeitos desta invenção, foi utilizada a formação de grânulos ricos em MELs, como medida de produção de MELs durante a fermentação.

[0177] Quando se utiliza óleo de soja não processado, rico em triacilgliceróis, a formação de grânulos ricos em MELs foi um processo lento, levando 7 dias para o aparecimento dos primeiros grânulos ricos em MEL, e 10 dias para que os grânulos obtidos tivessem qualidade superior. Os grânulos ricos em MELs variam na sua composição e estão presentes quando os MELs e os lípidos no caldo de fermentação estão em diferentes proporções. Os inventores verificaram que os grânulos ricos em MELs nunca se formam de forma robusta quando existe uma concentração significativa de triacilgliceróis não hidrolisados no caldo de fermentação.

[0178] Nas condições em que os derivados lipídicos, obtidos por pré-tratamento dos óleos vegetais, na forma de (i) FFA enriquecidos ou (ii) FAME enriquecidos, foram fornecidos como fontes de carbono hidrofóbico, a formação de grânulos ricos em MELs teve lugar mais cedo na fermentação, com a formação de um maior número de grânulos ricos em MELs de qualidade superior e de maiores dimensões.

[0179] Independentemente do tipo e da qualidade dos grânulos, estes são sempre difíceis de isolar por sedimentação. Observou-se que, embora os grânulos ricos em MELs venham com diferentes valores de pureza (~50-85%) e sejam formadas quando diferentes proporções de MELs e lípidos estão presentes no caldo de fermentação, nunca são compostas unicamente de MELs (Figura 2). Os inventores divulgam que os ácidos gordos livres e os monoacilgliceróis desempenham um papel importante na formação de grânulos ricos em MELs. Isto explica porque é que os inventores observaram que os grânulos ricos em MEL, após a sua formação, tendem a posteriormente a dissolver-se em fermentações mais longas, uma vez que os derivados lipídicos, mesmo presentes em quantidades baixas, são metabolizados pela levedura. Isto é contra-intuitivo, uma vez que os grânulos ricos em MELs se dissociam, apesar da concentração de MELs aumentar com o progresso da fermentação. Esta observação estabelece que a presença de substratos lipídicos ricos em ácidos gordos livres de cadeia única e monoacilgliceróis afetam positivamente a formação de grânulos ricos em MEL.

[0180] Nos ensaios descritos, além da amostragem padrão para estimativa dos parâmetros de fermentação (Biomassa, consumo de substrato e produção de MELs), foram também registados os tempos de fermentação em que os grânulos ricos em MELs apareceram, bem como as suas caracterizas físicas tamanho e cor. O tamanho e cor destes grânulos foram estimados e são apresentados na Figura 3 para cada tempo de fermentação e condições utilizadas.

[0181] Nestas experiências, a cor dos grânulos fornece uma indicação de quão maduros estão os grânulos, ou seja, quão enriquecidos em MELs eles estão. Os grânulos verdes e amarelos tendem a ter níveis de MELs mais baixos e um teor maior em, respetivamente, triacilgliceróis e ácidos gordos livres, muitas vezes estes grânulos são menos firmes e robustos; enquanto os grânulos laranja escuro são firmes e têm teores mais elevadas de MELs (>80%).

[0182] A utilização dos derivados lipídicos (ou seja, enriquecidos com FFA ou FAME), como substratos, reduziu efetivamente o tempo necessário para o aparecimento de grânulos ricos em MELs em vários dias, e afetou positivamente o tamanho e qualidade desses grânulos, como se pode ver na Figura 3.

1.D. Produção de MELs - uso de glicerol como substrato na preparação de inócuo para promover a formação de grânulos ricos em MELs.

[0183] Meio de cultura de pré-fermentação (inóculo) com fonte de carbono: D-Glucose ou Glicerol, 40 g/L;

[0184] NaNOa, 3 g/L;

[0185] KH2PO4, 0,3 g/L;

[0186] MgSO4.7H2O, 0,3 g/L;

[0187] Extrato de levedura, 1,0 g/L;

[0188] Foram preparadas soluções concentradas dos compostos acima mencionadas. Essas soluções foram autoclavados a 121°C durante 20 minutos e, após arrefecidas, adicionadas com água desmineralizada estéril, em condições estéreis, num Erlenmeyer estéril nos volumes necessários para obter uma solução final com as concentrações acima descritas. O meio foi inoculado com M. antarcticus e incubado durante 2 dias em condições aeróbias e sob agitação orbital constante e temperatura de fermentação de 27°C. A D-glucose e o glicerol foram utilizados como fonte de carbono, respetivamente, para a preparação do inóculo utilizado nas condições A e B das fermentações principais, respetivamente. [0189] Meio de cultura de fermentação principal com fonte de carbono:

[0190] Fonte de carbono: D-Glucose + óleo de colza [0191] KH2PO4, 0,3 g/L;

[0192] MgSO4.7H2O, 0,3 g/L;

[0193] Extrato de levedura, 1,0 g/L;

[0194] O meio de cultura para a fermentação principal foi preparado em água estéril, com pH inicial igual a 6. As fermentações principais foram realizadas em frascos de agitação e iniciadas através da inoculação do meio de cultura com 10% v/v de uma pré-cultura preparada como descrito acima; ou seja, utilizando D-glucose (condição A) ou glicerol (condição B) como fonte de carbono na fase de preparação do inóculo para fermentações principais realizadas na condição A ou B, respetivamente. O meio e a fonte de carbono utilizados em todas as condições principais de fermentação foram semelhantes. Todas as fermentações principais começaram utilizando 40 g/L de D-glucose, presentes no meio e uma mistura de 30 g/L de D-glucose e de 40 g/L de óleo de colza foi depois adicionada ao dia 4 de cultura. O conteúdo de MELs e lípidos nos grânulos, bem como dissolvido no caldo de fermentação, após remoção dos grânulos, estão representados na Figura 4.

[0195] As fermentações principais, cujo inóculo foi preparado com glicerol produziram mais MELs e tiveram menos lípidos residuais no final da fermentação. Além disso, o glicerol utilizado na preparação do inóculo resultou numa maior produção de grânulos ricos em MEL, o que constitui uma oportunidade interessante para recuperar os MELs do caldo de forma mais eficiente no final da fermentação.

1.E. Perspetiva geral sobre vários processos de fermentação e produção de grânulos ricos em MEL

[0196] Meio de cultura com fonte de carbono:

[0197] Fonte de carbono (variável)

[0198] KH2PO4,0,3 g/L;

[0199] MgSO4.7H2O, 0,3 g/L;

[0200] Extrato de levedura, 1,0 g/L;

[0201] O meio de cultura para o processo de fermentação foi preparado em água estéril, com pH inicial igual a 6. O meio de cultura foi inoculado com 10% v/v da pré-cultura preparada em 1.A. usando M. antarcticus ou M. bullatus, e incubado em condições aeróbicas com agitação orbital constante a uma temperatura de 27°C.

[0202] Quanto às fontes de carbono utilizadas, estas fermentações foram conduzidas seguindo uma estratégia de utilização de uma fonte carbono hidrofílica e uma fonte de carbono hidrofóbica. A fonte de carbono hidrofóbica consistiu em 20 g/L de óleo vegetal, rico em triacilgliceróis (por exemplo, óleo de soja, óleo de colza, resíduos de óleo alimentar usado). Este óleo vegetal foi usado tal como recebido do fornecedor, ou pré-tratado enzimaticamente para diminuir o seu conteúdo em triacilgliceróis abaixo de 50% e aumentar o conteúdo do substrato em (i) FFA ou (ii) FAME. Além disso, resíduos industriais alimentares, como o óleo de bagaço de azeitona, foram também utilizados como substratos lipídicos. A D-glucose pode ser utilizada como fonte de carbono hidrofílico. Além disso, outras fontes de carbono hidrofílico podem ser usadas (outros hidratos de carbono, glicerol, etc.), sem impacto negativo na produção de grânulos ricos em MELs durante a fermentação; pelo contrário, a fonte de carbono hidrofóbico usada na fermentação principal, tem um impacto substancial na formação de grânulos ricos em MELs e na sua qualidade. As fontes de carbono hidrofílico e hidrofóbico podem ser adicionadas em conjunto no início da fermentação ou/e por etapas em lotes. A tabela 2. apresenta os valores de MELs obtidos para fermentações que usam diferentes combinações de substratos.

Tabela 2. Estratégias de alimentação do substrato (tipo e concentração do substrato e dia de adição) para várias fermentações e concentrações máximas de MELs alcançadas para

M. antarcticus e M. bullatus.

Fermentação	Microorganismo	Substrato Adicionado (g/L)	Dia de adição	Máximo de MELs (g/L)
Glucose	M. antarcticus	40	0	5,40
M. bullatus	40	0	3,40
Glucose Óleo de soja (SBO)	M. antarcticus	40 20	0 4	11, 64
40 20	0 0	9, 84
M. bullatus	40 20	0 4	10, 04
40	0	13, 12

		20	0
Glucose +	M. antarcticus	40	0	12, 68
Ácidos		20	4
gordos	M. bullatus	40	0	14,98
livres de		20	0
cadeia
única (FFA)
Glucose +	M. antarcticus	40	0	12,26
Ésteres		20	4
metílicos	M. bullatus	40	0	15, 73
(FAME)		20	0
Glucose +	M. antarcticus	40	0	37,54
Óleo de		20	0,2,4,6
bagaço de	M. bullatus	40	0	67,46
azeitona		20	0,2,4,6

[0203] A produção de MELs foi avaliada, após a adição do substrato hidrofóbico. Os MELs produzidos começaram a formar grânulos firmes e consistentes de MEL, que foram caracterizados com base no seu tamanho e cor. Mais uma vez, para todos os ensaios em que o óleo vegetal, rico em triacilgliceróis integrais, foi utilizado como recebido, a formação de grânulos ricos em MELs foi um processo lento. Além disso, enquanto existe uma concentração significativa de triacilgliceróis não hidrolisados no caldo de fermentação, os grânulos nunca se apresentam como estruturas robustas.

[0204] É importante notar que os ensaios descritos na tabela 2 mostram que outras fontes de carbono hidrofílico para além da utilização de D-glucose, podem ser utilizados por estirpes de M. bullatus ou M. antarcticus e mostram que a adição da fonte de carbono hidrofóbica pode ser antecipada para o início da fermentação com melhorias em termos de velocidade para a formação dos grânulos ricos em MELs.

[0205] Além disso, as condições consideradas confirmam que, o uso de derivados lipídicos de óleo vegetal, ou seja, substratos (i) enriquecidos em FFA ou (ii) enriquecidos ou em FAME, promove a formação de grânulos ricos em MELs em maior número, com tamanhos maiores e mais cedo na fermentação. Os resultados obtidos para as concentrações máximas de MELs, bem como para o momento em que os grânulos são formados e a sua caracterização são apresentados na Tabela 2 e na Figura 5. Os resultados obtidos mostram que a qualidade dos grânulos ricos em MELs é drasticamente afetada pela escolha do substrato e não está dependente da concentração de MELs presentes no caldo de fermentação. É importante notar que o período necessário para a formação de grânulos ricos em MELs é encurtado quando o substrato lipídico é adicionado no início da fermentação (no dia 0).

EXEMPLO 3

PRODUÇÃO DE MELs USANDO MÚLTIPLAS ETAPAS PARA A RECUPERAÇÃO DE GRÂNULOS RICOS EM MELs

[0206] Meio de cultura com fonte de carbono:

[0207] Fonte de carbono (variável)

[0208] KH2PO4, 0,3 g/L;

[0209] MgSO4.7H2O, 0,3 g/L;

[0210] Extrato de levedura, 1,0 g/L;

[0211] O meio de cultura para o processo de fermentação foi preparado em água estéril, com pH inicial igual a 6. O meio de cultura foi inoculado com 10% v/v de pré-cultura preparada em 1.A., e incubado em condições aeróbicas e agitação constante a uma temperatura de 27°C. Relativamente às fontes de carbono utilizadas, esta fermentação iniciouse 40 g/L de D-glucose, uma fonte de carbono hidrofílica, presente no meio, para suporte da primeira fase de crescimento e adaptação celular. Posteriormente, uma fonte de carbono hidrofóbico foi alimentada no dia 4 de cultura. Esta fonte de carbono consistiu em 20 g/L de óleo vegetal, rico em triacilgliceróis, utilizado como recebido do fornecedor, ou pré-tratado enzimaticamente, de forma a reduzir o seu conteúdo em triacilgliceróis e aumentar o conteúdo do substrato de (i) FFA ou (ii) FAME.

[0212] Este processo foi avaliado em frascos, sob agitação orbital. Uma vez formados os grânulos ricos em MELs, estes foram recolhidos e foi adicionado ao frasco um novo lote de substrato. Esta operação foi repetida várias vezes, enquanto que se formassem novos grânulos dentro de um período de tempo razoável. As composições dos grânulos foram analisadas através de métodos GC (Cromatografia Gasosa) e HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência).

[0213] O primeiro conjunto de grânulos ricos em MELs só foi obtido após 3 dias da alimentação inicial de lípidos, quer para substratos enriquecidos em FFA ou em FAME. Após a recuperação dos grânulos ricos em MELs, as células em cultura continuaram a consumir o substrato alimentado recentemente e continuaram e a produzir mais MELs. Contudo, para tempos de cultura mais longos, o período de tempo entre a alimentação de novo lote de substrato e a formação de novos grânulos ricos em MELs tornou-se maior. Quando se usaram substratos enriquecidos em FFA, os períodos de tempo para formação de grânulos aumentam dos 3 dias iniciais para 6 dias, e um total de 4 conjuntos de grânulos ricos em MELs foram recuperados. Por outro lado, as culturas alimentadas com o substrato enriquecido com FAME, produziram 5 conjuntos de grânulos (uma réplica produziu apenas 4), e os períodos de tempo entre a recuperação de grânulos ricos em MELs (a partir da alimentação de novos lotes de substratos lipídico) foram de 3, 5, 5, 5, e 7 dias.

[0214] O rendimento de produto por substrato (ou seja, unidade de produto obtido por unidade de substrato adicionada) é um parâmetro importante para avaliar a eficiência do processo. Tais rendimentos foram calculados, para comparar a eficiência das fermentações em que apenas se implementou uma única recuperação de grânulos ricos em MELs com aquelas em que se implementaram múltiplas recuperações de grânulos. Os valores de MELs totais obtidos nos grânulos, usados para estimativa dos rendimentos, foram determinados considerando a massa seca total dos grânulos recolhidos e o respetivo conteúdo em MELs. A comparação de dados da massa dos grânulos recolhidos, rendimentos por unidade de substrato lipídico adicionado, bem como os rendimentos totais, é apresentada no Tabela 3.

Tabela 3. Parâmetros de fermentação e resultados de desempenho na produção de MELs, usando substratos enriquecidos com FFA e FAME, usando apenas uma ou múltiplas recuperações.

Substrato	FFA	FAME
Duração da fermentação (dias)	12	24	12	29
Glicose total adicionada (g/L)	40	40	40	40
Lípidos totais adicionados (g/L)	20	80	20	100
Número de recuperações de grânulos	1	4	1	5*
Massa total de MELs em grânulos recuperados (g/L)	4,490	20,857	6, 530	27,572
Produtividade MELs (g de MELs em grânulos/(L. dia) )	0,374	0, 869	0,544	0, 951
Rendimento (massa de MELs em grânulos / massa de lípidos alimentados)	0,224	0,261	0,326	0,276
Rendimento total (massa de MELs em grânulos / massa de substrato adicionado)	0, 075	0, 174	0, 109	0, 197
Nota: Quando os valores são expressos por volume, esse volume corresponde ao volume do caldo de fermentação

EXEMPLO 4

Produção de grânulos ricos em MELs usando óleo de bagaço de azeitona

[0215] Meio de cultura com fonte de carbono:

[0216] Fonte de carbono (variável)

[0217] KH2PO4, 0,3 g/L;

[0218] MgSO4.7H2O, 0,3 g/L;

[0219] Extrato de levedura, 1,0 g/L;

[0220] O meio de cultura para o processo de fermentação foi preparado em água estéril, com pH inicial igual a 6. O meio de cultura foi inoculado com 10% v/v da pré-cultura M. antarcticus ou M. bullatus, preparada como descrito em 1.A. e incubada em biorreator a uma temperatura de 27°C, sob condições aeróbias controladas por um sistema de cascata de agitação por turbina Rushton, estabelecido para manter o oxigénio dissolvido (DO) a um nível de 20%, com agitação entre 150-700 rpm e fluxo de ar filtrado a um valor constante de 1 volume de ar por volume de caldo de fermentação por minuto (VVM).

[0221] Como anteriormente referido, os substratos lipídicos enriquecidos em FFA e FAME aumentaram a velocidade de consumo do substrato pela levedura, bem como a formação de grânulos ricos em MEL. A este respeito, e a fim de aumentar a sustentabilidade do processo descrito, foi decidido avaliar um resíduo industrial alimentar, o óleo de bagaço de azeitona, que é constituído por 35,75% de monoacilgliceróis, 45,28% de ácidos gordos livres, 2,97% de diacilgliceróis e 16% de triacilgliceróis. Este substrato enriquecido com monoacilgliceróis, respeita o limite anterior de conter menos de 60% em triacilgliceróis.

[0222] Estas fermentações começaram com uma mistura de 40 g/L de D-glucose e 20 g/L de óleo de bagaço de azeitona, com alimentação adicional de lotes de 20 g/L de óleo de bagaço de azeitona nos dias 2, 4 e 6 de fermentação. A formação de grânulos ricos em MELs começou no dia 4 da fermentação e continuou até ao dia 8, mostrando que o óleo de bagaço de azeitona é um bom substrato para a produção de grânulos ricos em MELs, atingindo rendimentos elevados no final do processo (> 60 g/L), como resumido no Tabela 4. Neste caso, os grânulos eram verde azeitona potencialmente devido à presença de moléculas específicas transportadas do óleo de bagaço de azeitona para o produto final. Esta cor verde é distinta da observada anteriormente nos grânulos ricos em MELs que contém teores elevados de lípidos residuais e que foram observados em fermentações que usaram como substrato hidrofóbico óleos vegetais, ricos em triacilgliceróis, tais como óleo de soja.

Tabela 4. Parâmetros de fermentação e desempenho da produção de MELs utilizando óleo de bagaço de azeitona como substrato hidrofóbico.

Parâmetros	Óleo de bagaço de azeitona
Dia 9 de fermentação
Estirpes	M. bullatus	M. antarcticus
Biomassa (g/L)	45, 00	43, 00
MELs (g/L)	37,54	67,46
Pureza (%)	55, 38	89,71
Rendimento(g/g)	0,38	0, 67
Produtividade (g/(L.day))	4, 17	6, 75

EXEMPLO 5 DESENHO E PROTOTIPAGEM DO DISPOSITIVO NÃO-INVASIVO DE SEPARAÇÃO DE PRODUTOS

[0223] As características do dispositivo incluem (i) uma grelha com canais, cada canal com largura entre 0,3 mm e 10 mm para processamento de caldos de fermentação, de forma a reter grânulos grandes e ricos em MELs e permitir recirculação do caldo de fermentação com células, com taxas de recirculação altas mas valores de tensão de cortes mínimos evitando quebra celular e outros efeitos negativos na viabilidade celular, bem como para mitigar a fragmentação de grânulos mais pequenos; (ii) uma primeira câmara posicionada na parte superior da grelha, de um tamanho que permite a recuperação do volume total de grânulos formadas em cada ciclo de recuperação, e que pode ter uma tampa transparente; (iii) uma ou várias entradas localizada na parte superior da grelha, para alimentação uniforme do caldo de fermentação com grânulos ricos em MELs à primeira câmara referida; (iv) uma segunda câmara, localizada na parte inferior da grelha para recolher os meios de cultura filtrados com células viáveis, substratos não consumidos e grânulos não maduros e mais pequenos, (v) uma ou várias saídas na câmara na parte inferior da grelha para ligar o dispositivo de volta ao biorreator. Entradas e saídas são também utilizadas para recuperar grânulos ricos em MELs para um reservatório.

[0224] A figura 6 representa um possível desenho do dispositivo não-invasivo de separação de produtos, que pode ser paralelepípedo ou de outras geometrias.

[0225] Os parâmetros geométricos específicos do dispositivo não-invasivo de separação de produtos podem variar bastante sem afetar a sua aplicabilidade. As dimensões do dispositivo podem ser facilmente adaptadas para o dimensionar ao tamanho desejado considerando o volume do caldo de fermentação e a quantidade de MELs produzida. A geometria do dispositivo pode também ser modificada para facilitar a adaptação do biorreator, considerar propriedades hidrodinâmicas adicionais e características da grelha. As dimensões das grelhas, a distância entre elas e consequentemente largura de canais podem ser adaptadas para assegurar a recuperação de grânulos de tamanho suficiente (e, portanto, de qualidade suficiente), e para assegurar um fluxo de caldo sem perturbações através do dispositivo. O dispositivo e a grelha podem ser compostos por uma variedade de materiais - metais, plásticos, etc., desde que permaneçam resistentes à esterilização por diferentes técnicas, e sejam resistentes aos solventes que são eventualmente utilizados para a recuperação dos grânulos. Finalmente, devido à simplicidade do dispositivo, pode-se prever o desenho de um dispositivo descartável, que é descartado aquando da sua utilização e não requer esterilização, uma vez que a reutilização é evitada.

EXEMPLO 6

PRODUÇÃO DE MELS USANDO O DISPOSITIVO NÃO-INVASIVO PARA SEPARAÇÃO DE PRODUTOS PARA RECUPERAÇÃO DOS GRÂNULOS RICOS EM MELS E RECICLAGEM DE CALDO DE FERMENTAÇÃO

[0226] No exemplo de uma fermentação iniciada utilizando como fonte de carbono um substrato hidrofílico, tal como Dglucose, e em que de seguida é alimentado um substrato hidrofóbico, tal com resíduos de óleo de alimentos usados (WFO), um substrato rico em triacilgliceróis, os grânulos aparecem normalmente no dia 7-9 e desaparecem após o dia 1011 da fermentação. Note-se que estas condições não correspondem às que proporcionam maior produtividade em MELs nem maior qualidade de grânulos de MEL, ainda assim este exemplo foi selecionado para mostrar, em condições mais difíceis, a robustez da abordagem usada na recuperação de grânulos ricos em MELs e das outras etapas de purificação propostas, assim como a relevância do uso do dispositivo não-invasivo de separação de produtos num âmbito mais amplo. [0227] Nas abordagens convencionais, a fermentação não é normalmente interrompida quando se formam grânulos ricos em MELs, uma vez que os níveis de lípidos não metabolizados ainda são elevados. Uma abordagem convencional para abordar esta questão, é prolongar a fermentação por mais alguns dias com o objetivo de aumentar a pureza do produto final e obter títulos mais elevados, implicando tipicamente uma maior ocupação do equipamento e sacrifício da produtividade. A utilização do dispositivo não-invasivo de separação do produto permite uma abordagem alternativa para este desafio, uma vez que permite a recuperar os grânulos do caldo de fermentação sem interromper a operação.

[0228] Meio de cultura:

[0229] Fonte de carbono (variável)

[0230] KH2PO4, 0,3 g/L;

[0231] MgSO4.7H2O, 0,3 g/L;

[0232] Extrato de levedura, 1 g/L;

[0233] O meio de cultura para o processo de fermentação foi preparado em água estéril, com pH inicial igual a 6. O meio de cultura foi inoculado com 10% v/v da cultura de précultura M. antarcticus ou de M. Bullatus preparada como descrito eem 1.A., correspondente a aproximadamente 0,6 g/L de peso seco celular (CDW, do inglês cell dry weight), incubado num biorreator a uma temperatura de 27 °C e condições aeróbias controladas por um sistema de cascata de agitação por turbina Rushon estabelecido para manter uma DO a um nível de 20%, variando a agitação entre 150-700 rpm com um fluxo de ar filtrado constante de 1 VVM.

[0234] Quanto às fontes de carbono utilizadas, estas fermentações foram conduzidas usando um meio inicial contendo uma mistura de 40 g/L de D-glucose e 20 g/L de WFO. Posteriormente, 20 g/L de WFO foram alimentados no dia 3 e outros 20 g/L de WFO foram alimentados no dia 7, após a recuperação do primeiro conjunto de grânulos ricos em MELs. Os grânulos apareceram no dia 5, aumentando o seu tamanho nos dias seguintes. Dois conjuntos de grânulos ricos em MELs foram recuperados, o primeiro no dia 7 e um segundo no dia 11.

[0235] O processo com a integração total das várias componentes do sistema é representado na figura 7, incluindo o processo de fermentação, a recuperação de grânulos ricos em MELs do caldo fermentativo usando o dispositivo (1) e respetivo circuito de recirculação do caldo de fermentação entre o dispositivo (1) e o biorreator (2). O caldo de fermentação foi bombeado através do sistema de tubagem externa (primeira via 6) usando uma primeira bomba(4) colocada entre a saída do dispositivo (1) e o biorreator (2), a fim de evitar danificar os grânulos ao passarem pela bomba. Usando apenas este circuito desenhado para circulação de caldo fermentativo e células viáveis, os grânulos ricos em MELs teriam de ser continuamente acumulados no dispositivo até ao fim da fermentação, ou até que a remoção do dispositivo seja necessária para a recolha de MELs. Assim, um segundo sistema de tubagem externa (segunda via 7) foi adicionado ao sistema, como representado na Figura 7, para ligar o dispositivo (1) a um tanque com metanol ou água quente (reservatório 5) e tal solução foi bombeada usando uma primeira bomba (4) para recolher MELs do dispositivo. [0236] O protótipo do dispositivo construído para este exemplo tinha 250 cm³ de volume interno (dimensões de 4x7x9 cm), com tubos de entrada e saída do dispositivo com diâmetro interno de 1 cm. A grelha metálica separou o dispositivo em duas secções, sendo a secção destinada à recuperação de grânulos de cerca de 125 cm³. O caudal foi fixado em 0,5 L/min.

[0237] O primeiro conjunto de grânulos foi recuperado no dia 7, com um rendimento de aproximadamente 12 g/L (bruto) de MELs com pureza de 65%. Estes MELs foram produzidos a partir de 40 g/L de WFO (os 20 g/L de WFO inicialmente presentes no meio de cultura mais os 20 g/L alimentados ao dia 3). O segundo conjunto de grânulos foi recuperado no dia 11 com um rendimento de 8 g/L em MELs (bruto) com 7 0% de pureza. Os MELs obtidos neste segundo conjunto de grânulos foram produzidos a partir dos 20 g/L de WFO alimentados no dia 7. Ambos os conjuntos de grânulos tinham um teor de água semelhante, com valores de 33,4% e 26,33% do peso total, para o primeiro e segundo conjunto de grânulos, respetivamente. Em geral, neste exemplo específico que compreende uma fermentação de 11 dias com duas recuperações de conjunto de grânulos, os MELs (bruto) obtidos nos grânulos foram de cerca de 20 g/L com 67% de MELs puro na forma de grânulos, usando um total 40 g/L de D-glucose e 60 g/L de WFO como fontes de carbono. O rendimento de produto obtido por substrato adicionado foi de 0,134 ggrânulos MELs/gsubstrato.

EXEMPLO 7

MÉTODOS PARA RECOLHA DE MELs DO DISPOSITIVO NÃO-INVASIVO PARA SEPARAÇÃO DE PRODUTOS

[0238] Após o caldo de fermentação ter sido recirculado através da câmara do dispositivo de separação do produto por tempo suficiente, assegurando que a maioria dos grânulos foi recuperada dentro do dispositivo, existem vários métodos para a recolha dos MELs armazenados no interior do dipositivo.

[0239] Primeiro, os grânulos podem ser fisicamente removidos do dispositivo, uma vez que o dispositivo pode ser construído com uma ligeira modificação de tal forma que permita que um dos lados seja uma tampa e possa ser aberta para remoção dos grânulos. Isto é facilitado pelo facto de os grânulos acumulados na grelha tenderem a fundir-se numa estrutura sólida maior. Após a remoção dos grânulos do dispositivo, este pode ser esterilizado e recolocado no sistema fechado. Este método resulta na recolha dos grânulos na sua forma pura, sem adição de água ou solventes.

[0240] Caso contrário, um método alternativo, que simplifica o processo e reduz as hipóteses de contaminação, é incluir um circuito de tubagem separado para a circulação de solventes através do dispositivo, tal como apresentado na Figura 1 (segunda via de comunicação de fluídos (7)). A água quente ou solventes orgânicos podem ser utilizados para permitir a recolha completa dos grânulos, ricos em MELs, que se encontram no dispositivo (1) para um reservatório (5). A quantidade de metanol necessária para recolher os MELs do dispositivo é relativamente pequena (2:1) (v:p), e num exemplo apenas 100 mL de metanol foram utilizados para remover cerca de 50 g de grânulos, obtidos a partir de 1 L de caldo de fermentação, ou seja uma proporção volumétrica de 1:10 de metanol:caldo de fermentação. Quando se utiliza água quente (>50 °C), as proporções de água quente para grânulos ricos em MELs é da ordem de 10:1 e de água quente para caldo de fermentação é da ordem de 1:5, correspondendo assim a volumes maiores de agente solubilizante para recolher os MELs do dispositivo.

[0241] O método para recolher os grânulos ricos em MELs do dispositivo, após a sua recuperação a partir do caldo fermentativo, depende da aplicação a dar aos MELs recolhidos, nomeadamente se é necessário que os MELs estejam isentos de solvente ou não, se vão ser usados na forma sólida ou numa solução aquosa.

EXEMPLO 8

REMOÇÃO DE TRIACILGLICERÓIS POR SUA PRECIPITAÇÃO EM METANOL

[0242] Uma mistura, incluindo 38% de MELs, 38% de óleo vegetal, rico em triacilgliceróis, e 24% de derivados lipídicos mais pequenos tipicamente encontrados em misturas brutas de MELs, foi dissolvida em metanol (6 g de mistura bruta em 20 mL de metanol). A solução foi vigorosamente misturada, e deixada a sedimentar durante 30 minutos, após o que se formou uma segunda fase mais densa, sedimentada no fundo do frasco, sendo esta camada rica no óleo vegetal, isto é triacilgliceróis, enquanto os MELs e derivados lipídicos mais pequenos, isto é ácidos gordos livre de cadeia simples permanecem dissolvidos no metanol, na fase superior. A camada inferior, rica em triacilgliceróis, foi removida.

[0243] As quantidades de MELs, triacilgliceróis e derivados lipídicos na fase do metanol foram determinadas por GC.

[0244] Este método pode ser aplicado, usando vários passos consecutivas de adição de metanol fresco à camada sedimentada para recuperar os MELs que co-precipitam com os triacilgliceróis e reduzir perdas de MELs. Quando o procedimento foi aplicado em três etapas consecutivas, as perdas de MELs foram 10% após a primeira etapa, mas reduzidas para 3,5% em perdas acumuladas após três etapas sucessivas. Globalmente, este método permite remover 89% do óleo vegetal rico em triacilgliceróis numa única etapa.

[0245] O desenvolvimento deste método eficiente e simples de separar os triacilgliceróis do produto final não só permite aumentar o valor do produto, mas também a eficiência da produção, uma vez que, a aplicação deste método permite executar fermentações em que se alimentam quantidades maiores de óleo vegetal, sem sacrifício de pureza do produto final, já que este este método pode ser usado para remover triacilgliceróis residuais não metabolizados no final da fermentação e alimentá-los ao ciclo de fermentação seguinte.

EXEMPLO 9

REMOÇÃO DE CONTAMINANTES LIPÍDICOS MENORES DA SOLUÇÃO DE METANOL UTILIZANDO NANOFILTRAÇÃO

[0246] A presença de triacilgliceróis pode ter um impacto drástico na qualidade do produto final, ainda assim a fermentação pode ser otimizada para evitar a presença de triacilgliceróis no fim da fermentação, promovendo o seu consumo e/ou a sua hidrólise. Neste último caso, os contaminantes lipídicos tipicamente remanescentes no fim da fermentação são ácidos gordos livres e monoacilgliceróis, que são raramente completamente utilizados e muitas vezes permanecem no produto final em diferentes teores. Alternativamente, a utilização da precipitação de metanol, tal como divulgado no exemplo anterior, pode ser utilizada para remover contaminantes de triacilgliceróis de uma mistura bruta de MELs. Também neste caso, os MELs dissolvidos no metanol podem estar contaminados com ácidos gordos livres e monoacilgliceróis.

[0247] Para a remoção destes possíveis contaminantes residuais, pode-se explorar a diferença nos pesos moleculares das moléculas (MELs ~ 588 - 734 g/mol; ácido oleico ~ 282 g/mol; monooleato de glicerilo ~ 356 g/mol). Para este caso, pode-se aplicar nanofiltração com solvente orgânico (OSN, do inglês Organic Solvent Nanofiltration) usando uma membrana OSN com ponto de corte de peso molecular adequado (MWCO, do inglês molecular weight cut-off); onde MWCO é definido como o tamanho molecular do soluto cuja rejeição de membrana é de 90% (Wu et al. 2017). Ainda assim, o intervalo de pesos moleculares de 356 a 588 g/mol é estreito e as tentativas de usar membranas comercialmente disponíveis para fazer esta separação falharam.

[0248] As membranas OSN utilizadas neste exemplo foram produzidas internamente pelos inventores, usando um método de inversão de fase a partir de uma solução de polibenzimidazol (PBI) dissolvido em dimetilacetamida (DMAc). A solução de PBI foi espalhada num filme uniforme usando uma lâmina com uma abertura de 250 micrómetros e os filmes obtidos foram imergidos em água para inversão de fases e depois transferidos para uma solução de isopropanol e finalmente pré-condicionadas com metanol antes de serem utilizadas. Soluções de 22%, 24% e 26% de PBI em DMAc foram usadas para preparação de membranas por inversão de fases, como descrito acima, obtendo-se diferentes membranas com diferentes perfis de rejeições de soluto e avaliadas para a separação de MELs e lípidos. As membranas obtidas foram rotuladas como 22% PBI, 24% PBI e 26% PBI, de acordo com o conteúdo de PBI na solução de moldagem.

[0249] Soluções de misturas brutas de MEls (50 g/L) em metanol, contendo MELs e impurezas lipídicas (FFA e monoacilgliceróis), foram submetidas a diafiltrações num sistema de filtração pressurizado a 15 bar, em que se adiciona metanol ao sistema pressurizado e se recolhe filtrado de forma a manter um volume constante dentro da célula de filtração. A adição de metanol num volume igual ao volume da solução inicialmente adicionado na célula de sistema corresponde a um diavolume (DV). Foi estimada a pureza em MELs e as perdas de MELs para diafiltrações executadas com 2, 4 e 6 diavolumes (DV) e usando as três membranas de PBI mencionadas acima. Estes resultados são apresentados na Figura 8.

[0250] A membrana 22% PBI utilizada nas várias diafiltrações resultou em perdas significativas de MELs que foi eluído para o permeado. Essas perdas não eram esperadas tendo em conta a caracterização inicial destas membranas, já que as rejeições de membrana de 22% PBI foram estimadas para um poliestireno 580 g/mol e corante Rosa Bengala (1017 g/mol) a valores de 91 % e 100%, respetivamente, e os pesos moleculares dos MELs encontram-se nesta gama. Nas diafiltrações em que se usou a membrana 26% PBI, obteve-se uma pureza satisfatória (~92%) com perdas mínimas (~5%) utilizando apenas dois diavolumes. Para as mesmas condições, a membrana de 24% PBI gerou MELs com uma pureza ligeiramente melhor (94%), contudo com perdas em MELs três vezes superiores (15%).

[0251] A remoção de FFA e monoacilgliceróis obtida utilizando a membrana de 26% PBI foi surpreendente, uma vez que estudos anteriores mostram que uma membrana feita a partir de uma solução com 26 wt% PBI apresenta rejeições elevadas, valores de 95%, para a Clorexidina (505 g/mol), e relativamente elevadas, a valores de 50-65% para a 4cloroanilina (127 g/mol), um composto muito mais pequeno do que o FFA ou monoacilgliceróis. Estes resultados não são óbvios, em particular considerando a polidispersidade do tamanho das várias variantes de MELs, diferentes propriedades das variantes moleculares MELs, potenciais interações intermoleculares, e dispersão típica do tamanho dos poros nas membranas de nanofiltração.

[0252] No entanto, considerando o objetivo de fornecer um sistema eficiente de separação de produto, a jusante da fermentação, e sustentável do ponto de vista do uso de solventes, o desempenho da eficiência da membrana 26% PBI usando apenas 2DV é bastante significativo e único, em particular considerando a necessidade de separar moléculas cuja diferença de peso molecular é estreita, calculadas em valores de 182-394 g/mol considerando, respetivamente, a diferença de pesos moleculares entre o monooleato de glicerilo e a variante de MELs de menor peso molecular ou entre o ácido oleico e a variante de MELs de maior peso molecular.

[0253] Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com as suas formas de realização específicas, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão evidentes para aqueles que possuem conhecimentos técnicos na arte. Consequentemente, pretende-se abranger todas essas alternativas, modificações e variações que se enquadram no espírito e no âmbito alargado das reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Dispositivo (1) para macrofiltração, caracterizado por compreender a recuperação de lípidos de manosileritritol (MELs), compreendendo uma grelha (20), a grelha compreendendo uma pluralidade de canais, cada canal com uma largura entre 0,3 mm e 10 mm; a grelha separando uma primeira câmara e uma segunda câmara cada câmara posicionada num lado oposto da referida grelha (20); pelo menos uma entrada (22) e pelo menos uma saída (24), na qual

- a referida pelo menos uma entrada (22) está configurada para fornecer uniformemente um fluido à referida primeira câmara;

- a referida segunda câmara está configurada para recolher um fluido filtrado; e

- a referida pelo menos uma saída (24) está configurada para ligar a segunda câmara a um biorreactor.
2. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, em que os referidos MELs são caracterizados por estar sob a forma de partículas, sendo estas partículas retidas na primeira câmara.
3. Sistema caracterizado por compreender o dispositivo de acordo com as reivindicações anteriores e um biorreator (2).
4. Sistema de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por compreender uma primeira via de comunicação de fluidos (6), em que esta primeira via compreende uma primeira válvula (3), uma primeira bomba (4), o referido biorreator (2) e uma segunda válvula (10), posicionados sequencialmente entre a pelo menos uma saída (24) e a pelo menos uma entrada (22) do dispositivo (1).
5. Sistema de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender ainda um reservatório (5).
6. Sistema de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por compreender uma segunda via de comunicação de fluidos (7), em que essa segunda via compreende sequencialmente uma terceira válvula (12), uma segunda bomba (8), esse reservatório (5) e uma quarta válvula (14), em que essa segunda via (7) está posicionada entre a pelo menos uma saída (24) e a pelo menos uma entrada (22) do dispositivo (1).
7. Sistema de acordo a reivindicação 3, caracterizado por compreender: um biorreator (2), um reservatório (5), uma primeira via de comunicação de fluidos (6) e uma segunda via de comunicação de fluidos (7), no qual

- o referido dispositivo (1) compreende pelo menos uma saída (24) na comunicação de fluídos com a referida primeira via de comunicação de fluidos (6) e a referida segunda via de comunicação de fluidos (7), e pelo menos uma entrada (22) na comunicação de fluídos com a referida primeira via de comunicação de fluidos (6) e a referida segunda via de comunicação de fluidos (7);

- a referida primeira via (6) compreende sequencialmente uma primeira válvula (3), uma primeira bomba (4), o referido biorreator (2) e uma segunda válvula (10), posicionados entre as referidas pelo menos uma saída e entrada do dispositivo; e

- a referida segunda via (7) compreende sequencialmente uma terceira válvula (12), uma segunda bomba (8), o referido reservatório (5) e uma quarta válvula (14), posicionados entre as referidas pelo menos uma dispositivo.

saída e entrada do
8. Processo para melhorar a eficiência de produção de lípidos de manosileritritol (MELs), realizado no dispositivo da reivindicação 1 ou no sistema de qualquer das reivindicações 3 a 7, caracterizado por compreender as etapas de:

a) contacto entre 1% e 70% em peso de um substrato e entre 0,01% e 10% em peso de uma levedura numa solução de meio de cultura em condições de fermentação, produzindo assim macroestruturas à base de MELs com uma largura superior a 1mm num caldo de fermentação;

b) separação dos referidos MELs do caldo de fermentação, e

c) lavagem dos referidos MELs com uma segunda solução, em que a relação volumétrica entre a segunda solução e o caldo de fermentação está entre 3:10 e 1:50 em volume.
9. Processo de acordo com a reivindicação anterior, em que a referida segunda solução é caracterizada por compreender uma solução alcoólica e/ou uma solução aquosa.
10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 9, caracterizado por compreender ainda uma etapa de circulação da referida solução de caldo de fermentação da etapa b), de volta à etapa a).
11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, em que os MELs são caracterizados por terem uma pureza superior a 60%.
12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, em que os MELs são caracterizados por se apresentarem sob a forma de partículas.
13. Processo de acordo com a reivindicação anterior, em que as referidas partículas são caracterizadas por terem uma dimensão de partículas superior a 1 mm.
14. Processo de acordo com a reivindicação 12 ou 13, em que as referidas partículas são caracterizadas por terem uma dimensão de partícula entre 1 mm e 50 mm.
15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 14, em que o referido substrato é caracterizado por compreender uma fonte de carbono hidrofílica, uma fonte de carbono hidrofóbica, ou ambas.
16. Processo de acordo com a reivindicação 15, em que essa fonte de carbono hidrofílico é caracterizada por compreender um álcool, um açúcar ou qualquer combinação dos mesmos.
17. Processo de acordo com a reivindicação 15, em que a referida fonte de carbono hidrofílico é caracterizada por compreender um resíduo agrícola, industrial ou resíduo rico em carbono, selecionado do grupo que compreende: soro de queijo, palha de trigo, resíduos de beterraba açucareira, resíduos de cana de açúcar, glicerol não refinado, ou qualquer combinação dos mesmos.
18. Processo de acordo com a reivindicação 15, em que a referida fonte hidrofóbica de carbono é caracterizada por compreender um óleo rico em triacilgliceróis, selecionado do grupo que compreende: óleo de soja, óleo de colza, resíduos de óleo alimentar, óleo alimentar usado, gordura animal, óleo de algas.
19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 15, 17 ou 18, em que a referida fonte de carbono hidrofóbico é caracterizada por compreender ácidos gordos livres, monoacilgliceróis, diacilgliceróis, ou qualquer combinação dos mesmos.
20. Processo de acordo com a reivindicação 19, em que a referida fonte de carbono hidrofóbico é caracterizada por ser rica em ácidos gordos livres e/ou misturas de mono/di acilgliceróis, obtido sem pré-tratamento dedicado ou obtido a partir do pré-tratamento do triacilgliceróis após a sua hidrólise ou transesterificação.
21. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 20, em que a referida fonte de carbono hidrofóbico é caracterizada por ser adicionada na etapa a) , ou até 6 dias após a etapa a).
22. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 21, em que a referida fonte de carbono hidrofóbica e a referida fonte de carbono hidrofílica são caracterizadas por estarem presentes numa proporção que varia de 10:1 a 1:1 em peso, respetivamente.
23. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 22, em que a solução mencionada na etapa b) é caracterizada por compreender entre 4 e 150 g/L de MELs.
24. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 23, caracterizado por compreender ainda uma etapa de remoção de triacilgliceróis por precipitação em metanol, enquanto que os MELs permanecem solúveis.
25. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 24, caracterizado por compreender ainda uma etapa de nanofiltração da referida solução de MELs.
26. Processo da reivindicação 25, em que os MELs são caracterizados por terem uma pureza superior a 90%.
27. Utilização do dispositivo de qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por permitir a produção e/ou purificação de lípidos de manosileritritol (MELs).
28. Utilização do sistema de qualquer uma das reivindicações 3 a 7, caracterizado por permitir a produção e/ou purificação de lípidos de manosileritritol (MELs).
29. Utilização do processo de qualquer uma das reivindicações 8 a 26, caracterizado por permitir a produção e purificação de lípidos de manosileritritol (MELs).