PT115260B

PT115260B - Processo de produção de um biofertilizante e biofertilizante por ele obtido

Info

Publication number: PT115260B
Application number: PT115260A
Authority: PT
Inventors: Alexandra Drumonde Melo Catarina
Original assignee: Alexandra Drumonde Melo Catarina
Priority date: 2019-01-11
Filing date: 2019-01-11
Publication date: 2024-11-28
Also published as: PT115260A; WO2020145834A1

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO DIZ RESPEITO A UM PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM BIOFERTILIZANTE QUE COMPREENDE PELO MENOS 4 ETAPAS, CONCRETAMENTE A ETAPA I) PRODUÇÃO DE CULTURAS PURAS OU CULTURAS-MÃES DE PELO MENOS UMA DAS ESPÉCIES DE FUNGOS MICORRÍZICOS ARBUSCULARES (FMA); A ETAPA II) PREPARAÇÃO DE UM BIOFERTILIZANTE QUE INCLUI APENAS UMA DAS RESPETIVAS CULTURAS PURAS OU CULTURAS-MÃES DE CADA UMA DAS ESPÉCIES DE FMA, PRODUZIDAS NA ETAPA I); A ETAPA III) PRODUÇÃO DE CULTURAS MULTI-ESPOROS DE CADA UMA DAS ESPÉCIES DE FMA ESTABELECIDAS A PARTIR DE CADA UMA DAS RESPECTIVAS CULTURAS PURAS OU CULTURAS-MÃES, PREPARADAS NA ETAPA ANTERIOR; E A ETAPA IV) PREPARAÇÃO DE UM BIOFERTILIZANTE QUE INCLUI, APENAS UMA OU A MISTURA EM PARTES IGUAIS DE CADA UMA, DAS RESPETIVAS CULTURAS MULTI-ESPOROS DAS ESPÉCIES DE FMA, PRODUZIDAS NA ETAPA ANTERIOR. SUBSEQUENTEMENTE ÀS REFERIDAS 4 ETAPAS, O PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM BIOFERTILIZANTE PODE AINDA COMPREENDER 2 ETAPAS, CONCRETAMENTE, A ETAPA V) PRODUÇÃO DE CULTURAS DE MULTI-ESPOROS DE CADA UMA DAS ESPÉCIES DE FMA ESTABELECIDAS A PARTIR DE CADA UMA DAS RESPETIVAS CULTURAS MULTI-ESPOROS, PREPARADAS NA ETAPA ANTERIOR; E A ETAPA VI) PREPARAÇÃO DE UM BIOFERTILIZANTE QUE INCLUI APENAS UMA OU A MISTURA EM PARTES IGUAIS DE CADA UMA DAS RESPETIVAS CULTURAS MULTI-ESPOROS DAS ESPÉCIES DE FMA, PRODUZIDAS NA ETAPA ANTERIOR. AS ETAPAS II), III), IV), V) E VI) SÃO REPETIDAS TANTAS AS VEZES, QUANTAS AS PRETENDIDAS.

Description

DESCRIÇÃO

PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM BIOFERTILIZANTE E BIOFERTILIZANTE POR ELE OBTIDO

ÂMBITO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a um processo de produção de um biofertilizante e biofertilizante por ele obtido.

citado biofertilizante é apresentado sob a forma de substrato sólido e/ou gel semi-sólido e compreende 5 espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA), doravante também designados por FMA, nomeadamente:

- Cetraspora sp.;

- Claroideogloinus etunicatum;

- Funneliformis mosseae;

- Rhizophagus sp.; e

- Gigaspora sp.

cujas diferentes estruturas propagativas, concretamente (esporos, hifas, vesículas e arbúsculos) se encontram envolvidas num material de suporte esterilizado de origem local, comercialmente designado por areia de bagacina (escórias vulcânicas) e/ou num gel semi-sólido.

A concentração de propágulos infetivos por grama é superior a 85 propágulos infetivos/g, o número de esporos viáveis por grama é superior a 80 esporos viáveis/g e, o conteúdo de raízes com uma percentagem de colonização micorrízica superior a 7 0%, de 2 gramas por quilograma de matéria fertilizante.

As Micorrizas são associações simbióticas que envolvem uma grande diversidade de plantas (> 80%) e certos fungos do solo, entre os quais, com maior interesse agronómico, os fungos micorrizicos arbusculares (FMA), doravante também só designados por FMA.

O fungo coloniza o tecido cortical de raízes de plantas micotróficas, formando estruturas intracelulares típicas denominadas de arbúsculos, vesículas, hifas e, ocasionalmente esporos, desenvolvendo posteriormente um micélio extrarradicular, conforme representado na figura 6.

Este micélio extrarradicular é composto por um conjunto de filamentos (hifas) que constituem a parte vegetativa dos FMA, e pelos esporos.

Este micélio é capaz de adquirir água e nutrientes (especialmente fósforo) do solo com eficiência, aumentando a tolerância das plantas a stresses bióticos e abióticos incluindo patogénicos (Fiorilli et al., 2012), seca (Birhane et al., 2012) e poluentes ambientais (Babu & Reddy, 2011).

Os nutrientes são transferidos para as raízes micorrizadas em troca de açúcares através de transportadores de membrana específicos (Smith & Read, 2008) .

A importância da aplicação de FMA tem sido amplamente demonstrada em várias culturas, tais como: a papaia, o ananás, o abacate, a banana (Jaizme-Vega & Azcón, 1995; Rodríguez-Romero et al., 2011), a alcachofra (Campanelli et al., 2013), o gengibre (Santos et al.,

2010), a alface (Baslam et al., 2015), o tomate (Tahat et al., 2008), o pimento (Goicoechea et al., 2010) entre outras.

No sentido de potenciar os benefícios da aplicação dos FMA em diferentes culturas, para o desenvolvimento da presente invenção foi desenvolvido um estudo de caracterização das comunidades de FMA em explorações em Modo de Produção Biológico - MPB nos Açores, com a finalidade de criar um inoculo a partir da diversidade micorrízica local, perfeitamente adaptada às condições edáfo-climáticas do território nacional.

Recolheram-se amostras de solo rizosférico em diferentes épocas do ano, ao longo de três anos em sete explorações em MPB, nomeadamente duas na ilha Terceira, três na ilha de São Miguel e duas na ilha do Faial.

A aplicação do biofertilizante descrito na presente invenção tem como principal efeito uma melhoria no desenvolvimento da planta, o qual se reflete num aumento da sua produtividade.

Este efeito deve-se principalmente à maior capacidade que as plantas têm para absorver água e nutrientes, principalmente daqueles que existem em pequenas quantidades no solo, na presença de FMA, ou seja, há uma melhoria no estado nutricional da planta. Deste modo podemos dizer, que a aplicação deste biofertilizante proporciona um melhor aproveitamento dos nutrientes presentes no solo, permitindo uma redução do número de fertilizações.

Além disso, como se trata de um biofertilizante constituído por fungos que atuam ao nível da raiz, a aplicação deste produto promove o sistema radicular das plantas proporcionando-lhes um incremento da sua tolerância a condições de stress. Como efeitos secundários resultantes da aplicação deste biofertilizante, podemos salientar o aumento da tolerância a pragas (Melo et al., 2008) e a doenças causadas por outros fungos do solo (Ismail & Hijri, 2012).

Vários mecanismos poderão estar envolvidos neste efeito protetor dos FMA, nomeadamente: 1) competição direta - os FMA ao ocuparem o nicho ecológico de outros fungos patogénicos, a competição pelo mesmo espaço poderá levar à irradicação do fungo patogénico, daí a importância da inoculação com FMA nos primeiros estádios do ciclo de vida das plantas; 2) alterações no crescimento, nutrição e morfologia da planta e 3) alterações bioquímicas e moleculares nas plantas micorrizadas que induzem resistência aos agentes patogénicos (Azcón - Aguilar et al., 2002; Vierheilig et al., 2008).

ESTADO DA TÉCNICA.

No estado da técnica são conhecidos outros biofertilizantes, como é o caso entre outros do biofertilizante descrito no pedido de patente n.° CN107586755 e nos restantes 4 documentos abaixo indicados, que também descrevem outros biofertilizantes.

Porém conforme abaixo patente n.° CN107586755 e nem descrevem e/ou reivindicam as descrito, nem o pedido de os citados 4 documentos, características técnicas descritas e reivindicadas na presente invenção em apreço.

pedido de patente n.° CN107586755 diz respeito também a um processo de propagação de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA) por meio de vaso, porém o mesmo não apresenta as caracteristicas técnicas descritas e reivindicadas na presente invenção em apreço.

Por outro lado, no pedido de patente CN107586755, o método descrito para a propagação de cada espécie de FMA não é suficientemente explicito, concretamente no que diz respeito, a saber se a propagação é feita através de culturas puras (planta hospedeira inoculada apenas por um único esporo de uma espécie de FMA), conforme o método descrito e reivindicado na presente invenção, ou por culturas multi-esporos (inoculação da planta hospedeira por mais do que um esporo de uma ou várias espécies de FMA).

Este aspeto é de particular importância na conservação da hereditariedade parental, devido ao facto dos FMA se reproduzirem assexuadamente a partir de esporos multinucleados, ou seja, de esporos com núcleos geneticamente diferentes que origina uma variabilidade genética surpreendentemente alta dentro de cada espécie.

Consequentemente estas caracteristicas técnicas podem levar à variação genética dentro da população, causando diferenças na fisiologia e na função simbiótica das populações de FMA, uma consequência que tem sido largamente negligenciada.

Estes resultados têm fortes implicações para o desenvolvimento de um inoculo comercial, na medida em que a sua diversidade funcional e genética pode ser alterada de acordo com o número de esporos isolados usados para iniciar um inoculo.

Isto porque, usando vários esporos isolados aumenta-se a probabilidade de trocas genéticas com a população de FMA local.

Deste modo, as culturas originadas a partir da inoculação por um único esporo mantém-se em condições geneticamente estáveis durante vários anos.

Por este motivo, a caracterização molecular de cada uma das espécies que compõem o biofertilizante descrito e reivindicado na presente invenção, foi realizada a partir da extração de ADN de um único esporo de cada espécie de FMA estabelecida em cultura pura

Por outro lado, na presente invenção em apreço as diferentes culturas de FMA são estabelecidas em monoculturas de Zea may L. (Milho).

Enquanto que, no pedido de patente CN107586755 as espécies de FMA são propagadas por consociação de culturas (3 espécies vegetais diferentes por vaso);

1) 0 método de propagação do pedido de patente CN107586755 aplica-se na propagação de apenas duas espécies de FMA: Glomus of Moses (filogeneticamente designada, atualmente, por Funneliformis mosseae) e/ou Glomus intraracellularis (filogeneticamente designada, atualmente, por Rhizophagus intraradices/irregularis) , enquanto na presente invenção em apreço apresenta um método de propagação para, pelo menos, cinco espécies de FMA, sendo apenas uma delas comum ao referido documento {Funneliformis mosseae);

2) 0 pedido de patente CN107586755 apresenta um substrato de propagação de FMA com caraterísticas físico-químicas diferentes do substrato da presente invenção em apreço, trata-se de um substrato inorgânico à base de escórias vulcânicas (material piroclástico) com elevada porosidade e, baixo teor de nutrientes que proporcionam as condições ideais para o desenvolvimento do micélio extrarradicular assim como a propagação dos esporos. Além disso, em virtude da sua baixa densidade também é utilizado com material de suporte para aplicação na agricultura.

3) De realçar ainda que o biofertilizante descrito e reivindicado na presente invenção, por ser efetivamente um fertilizante biológico, no seu processo de fabrico não poderão ser aplicadas substâncias nutritivas como a solução de Hoagland nem hormonas sintéticas como a GR24, as quais são utilizadas na propagação dos FMA do referido documento.

documento Jansa et al., Root colonization of bait plants by indigenous arbuscular mycorrhizal fungai communities is not a suitable indicator of agricultural land-use legacy, Agriculture, Ecosystems and Environment, vol. 231, pp.310-319, 2016, de ora em avante designado por D2, também diz respeito a um biofertilizante, porém o mesmo não apresenta as características técnicas descritas e reivindicadas na presente invenção, concretamente:

1) O estudo desenvolvido por Jansa et al. (2016), o documento D2, teve como objetivo avaliar o efeito de diferentes sistemas de uso do solo na percentagem de colonização de diferentes estruturas micorrizas, contrariamente à presente invenção em apreço que descreve e reivindica os resultados de uma investigação sobre a diversidade micorrízica em sistemas de produção biológicos com o objetivo de elaborar um biofertilizante com FMA nativos do arquipélago dos Açores, os quais conferem novidade e também atividade inventiva ao processo de produção de um biofertilizante e biofertilizante por ele obtido, o qual é descrito e reivindicado na presente invenção;

2) No documento D2 a caraterização e identificação das espécies de FMA é feita através de raízes de plantas de Alliuia porrum L. (Alho-francês) estabelecidas em culturas armadilha (trap cultures), ou seja, de raízes colonizadas simultaneamente por diferentes espécies de FMA.

Além da planta hospedeira, descrita no documento D2, utilizada na propagação dos FMA ser diferente da utilizada na presente invenção em apreço (Z. mays/ P. coronopus), a identificação das espécies de FMA, no documento D2 ou na presente invenção, não foi feita a partir de um único esporo extraído de uma cultura pura, com as implicações genéticas anteriormente referidas;

3) 0 documento D2 apenas identificou uma espécie comum à presente invenção concretamente a Funneliformis mosseae.

documento Malusá et al., Capítulo 12 Biofertilizers: A Resource for Sustainable Plant

Nutrition,pp. 282-319 in Fertilizer Technology I:

Synthesis, 2015, de ora avante designado por D3, diz respeito a uma síntese de diferentes tipos de biofertilizantes existentes tendo em conta:

1) O tipo de microrganismo utilizado de acordo com o seu principal efeito no estado nutricional da planta: Bactérias fixadoras de Azoto (Bactérias-N), rizobactérias promotoras de crescimento (PGPR), bactérias solubilizadoras de Fósforo (PSB) e fungos micorrízicos arbusculares (FMA), salientando a importância dos biofertilizantes cuja composição apresente mais do que um deste tipo de microrganismos, dados os benefícios da co-inoculação nas plantas. Apesar dos diferentes efeitos no estado nutritivo das plantas originados pelos diferentes grupos funcionais, os FMA são o grupo de microrganismos que não só desenvolve uma maior percentagem de associações simbióticas com um maior número de plantas (aproximadamente 80%), como também promove a atividade de outros grupos funcionais como é o caso das Bactérias-N e das PGPR. Por este motivo, a presente invenção apresenta um biofertilizante que contém apenas FMA.

2) O tipo de material de suporte utilizado na produção: orgânico, inorgânico e sintético. A presente invenção apresenta um material inorgânico de origem local, constituído por escórias vulcânicas (material piroclástico) que se revela adequado para a propagação, conservação e aplicação dos FMA, enquanto que o documento D2 apresenta vermiculite, perlite e argila como materiais de suporte inorgânicos;

3) A tecnologia de fabrico utilizada na propagação dos FMA, designadamente na produção em vasos ou in vitro, na presente invenção, no caso da produção em vaso, o substrato e o método utilizados na propagação dos FMA diferem dos mencionados pelo documento D3. Por outro lado, na produção in vitro descrita na presente invenção, além das raízes transformadas de Daucus carota L. (cenoura) são também utilizadas raízes transformadas de Trifolium pratense (trevo-vermelho).

O documento Sadhana B., Arbuscular Mycorrhizal Fungi (AMF) as a Biofertilizer- a Review, International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, vol. 3, n.° 4, pp. 384-400, 2014, diz respeito a uma revisão bibliográfica sobre biofertilizantes à base de FMA, que aborda a produção em vaso como o método mais utilizado na produção de um biofertilizante micorrizico. No entanto, menciona substratos de produção de FMA (areia, vermiculite, perlite, argila, turfa) diferentes e, apenas refere uma planta hospedeira comum (Zea mays L.) utilizada na propagação de FMA.

O documento Séry et al., Selecting Native Arbuscular Mycorrhizal Fungi to Promote Cassava Growth and Increase Yield under Field Conditions, Frontiers in Microbiology, vol. 7, 2016, difere da presente invenção devido a diferentes caracteristicas técnicas, entre ambos, algumas delas já mencionadas e discutidas anteriormente, designadamente:

1) O substrato de produção é composto por uma mistura de solo nativo e areia esterilizados, contrariamente ao apresentado presente invenção em apreço.

2) Utiliza como planta hospedeira na propagação de FMA Yavo variedade Tropical Manihot Esculenta (TME), uma variedade de mandioca, em vez de Zea mays (Milho) ou P. coronopus (Diabelha);

3) Isolamento de cada morfo-tipo extraído do solo nativo através do estabelecimento de culturas multiesporos e, não através de culturas puras como descrito e reivindicado na presente invenção;

4) A identificação molecular foi realizada a partir da extração de ADN de 10 esporos da cultura multiesporos e, não a partir do DNA de um único esporo de uma cultura pura como descrito e reivindicado na presente invenção;

5) 0 inoculo micorrizico é constituído basicamente por duas espécies da família Acaulosporaceae: Acaulospora colombiana e Acaulospora apendicula, enquanto que a presente invenção em apreço, apresente cinco espécies de FMA pertencentes a três famílias diferentes do filo Glomeromycota.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A descrição que se apresenta a seguir é realizada com referência aos desenhos anexos que são apresentados apenas a título de referência, sem qualquer carácter limitativo, e em que:

Figura 1 - diagrama do processo de produção do biofertilizante e as respetivas etapas;

Figura 2 - diagrama do processo de produção do biofertilizante e as respetivas etapas;

Figura 3 - diagrama resumido do processo de produção do biofertilizante;

Figura 4 - diagrama resumido do processo de produção do biofertilizante e as respetivas etapas;

Figura 5 - diagrama com as etapas do processo de produção do biofertilizante; e

Figura 6 - estruturas propagativas dos fungos micorrizicos arbusculares (FMA).

Lista de sinais de referência:

A - Culturas puras ou culturas-mães B - Culturas filhas da l^ageração C - Culturas filhas da 2^ageração D - Culturas filhas da 3^ageração BF - Biofertilizante

E - Embalagem

F - Replicação de cultura pura

G - Arbúsculo

H - Cilindro Vascular

I - Endoderme

J - Córtex interno

K - Córtex externo

L - Epiderme

M - Hifopódio

N - Esporo

- Hifa

P - Hifa runner

Q - Hifa absorvente ou hifa de absorção

R - Hifa distributiva

S - Vesícula

T - Micélio extraradical

U - raiz da planta i - produção de culturas puras ou culturas-mães de pelo menos uma das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA) ii - preparação de um biofertilizante (BF) que inclui apenas uma das respetivas culturas puras ou culturas-mães de cada uma das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA), produzidas na etapa i) iii - produção de culturas multi-esporos de cada uma das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA) estabelecidas a partir de cada uma das respectivas culturas puras ou culturas-mães, preparadas na etapa anterior iv - preparação de um biofertilizante que inclui:

- apenas uma ou

- a mistura em partes iguais de cada uma das respetivas culturas multi-esporos das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA) produzidas na etapa anterior ν - produção de culturas de multi-esporos de cada uma das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA) estabelecidas a partir de cada uma das respetivas culturas multi-esporos, preparadas na etapa anterior vi - preparação de um biofertilizante que inclui: - apenas uma ou

- a mistura em partes iguais de cada uma das respetivas culturas multi-esporos das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA), produzidas na etapa anterior

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

- Processo de produção de um biofertilizante

Conforme representada na figura 1, a presente invenção diz respeito a um processo de produção de um biofertilizante, que compreende pelo menos 4 etapas:

i) produção de culturas puras ou culturas-mães (A) de pelo menos uma das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA);

ii) preparação de um biofertilizante (BF) que inclui apenas uma das respetivas culturas puras ou culturasmães de cada uma das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA), produzidas na etapa i), denominadas culturas filhas da l^ageração (B);

iii) Preparação de um biofertilizante (BF) a partir da produção de culturas multi-esporos de cada uma das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA), denominadas culturas filhas da 2^ageração (C), estabelecidas a partir de cada uma das respectivas culturas puras ou culturas-mães, preparadas na etapa anterior;

iv) preparação de um biofertilizante (BF) que inclui: - apenas uma ou - a mistura em partes iguais de cada uma das respetivas culturas multi-esporos das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA), denominadas culturas filhas da 3^ageração (D) estabelecidas a partir de cada uma das respectivas culturas puras ou culturas-mães produzidas na etapa anterior.

Conforme ilustrado na figura 5, de acordo com o modelo de realização da presente invenção o referido processo de produção de um biofertilizante pode ainda compreender 2 etapas subsequentes:

v) produção de culturas de multi-esporos de cada uma das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA) estabelecidas a partir de cada uma das respetivas culturas multi-esporos, preparadas na etapa anterior; e vi) preparação de um biofertilizante que inclui:

- apenas uma ou

- a mistura em partes iguais de cada uma das respetivas culturas multi-esporos das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA), produzidas na etapa anterior.

Como ilustrado nas figuras 2, 4 e 5, as etapas ii), iii), iv), v) e vi), também de acordo com o modelo de realização da presente invenção, são repetidas tantas as vezes, quantas as pretendidas.

Na etapa i), são produzidas em separado as culturas puras ou culturas-mães de cada uma das 5 espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA) necessárias de acordo com as do especificidades biofertilizante a produzir.

Na etapa i), são também produzidas em separado as culturas puras ou culturas-mães de cada uma das 5 espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA) que incluem raízes colonizadas por micélio intra e extrarradicular de cada uma das seguintes espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares - FMA:

- Cetraspora sp.;

- Claroideoglomus etunicatum;

- Funneliformis mosseae;

- Gigaspora sp.; e

- Rhizophagus sp.

citado micélio de cada uma das 5 referidas espécies de FMA:

- está envolvido num material inerte esterilizado à base de escórias vulcânicas de origem dos Açores, comercialmente designado por areia de bagacina; e

- inclui as seguintes diferentes estruturas propagativas:

- esporos;

- hifas;

- vesículas; e

- arbúsculos.

Na etapa i) , a produção de uma cultura pura ou cultura-mãe de cada uma das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares - FMA, é realizada num vaso, conforme representado nas figuras 2 a 4, que compreende:

- um substrato sólido que inclui areia de bagacina esterilizada;

- uma plântula de uma espécie de planta hospedeira, que é plantada no citado substrato sólido; e

- um esporo de uma das respetivas espécies de FMA que irá inocular a raiz da citada plântula. Aplicando-se este procedimento para cada espécie de FMA.

Na etapa i) , a produção de uma cultura pura ou cultura-mãe de cada uma das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares - FMA, é realizada num vaso de 5L.

Na citada etapa i) o substrato sólido compreende por cada vaso de 5L, 4000g de biofertilizante que inclui apenas uma das respetivas culturas puras ou culturas-mães de uma das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA), preparado na etapa i) , são misturados com lOOOg de areia de bagacina esterilizada.

Nas etapas iii) e v) e respetivamente nas subsequentes repetições da etapa v), tantas as vezes quantas as pretendidas, a produção de culturas multiesporos de cada uma das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares - FMA, é realizada num vaso que compreende:

- um substrato sólido que inclui:

- areia de bagacina esterilizada, que é misturada com uma cultura que inclui raízes colonizadas por micélio intra e extrarradicular de uma das respetivas espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares - FMA, produzida na etapa anterior; e - uma plântula de uma espécie de planta hospedeira, que é plantada no citado substrato sólido.

Nas etapas i) , iii) , v) e respetivamente nas subsequentes repetições da etapa v), tantas as vezes quantas as pretendidas, é utilizado por vaso uma única plântula hospedeira de:

- Zea mays L., variedade tradicional/ regional de milho dos Açores), preferencialmente; ou

- Plantago coronopus L., Diabelha-dos-Açores.

Especificação do processo de produção de um biofertilizante

Na etapa i) por cada vaso de 5L são produzidos 5000g de culturas puras ou culturas-mães.

Na etapa ii) são retirados 1 OOOg de cada vaso de cada uma das respetivas culturas puras ou culturas-mães de cada espécie de FMA produzidas na etapa i.

Na etapa iii) são distribuídos em cada um dos 10 vasos de 5L de capacidade, contendo cada um aproximadamente 4900g de areia de bagacina esterilizada, lOOg de uma das respetivas culturas puras ou culturas-mães que inclui raízes colonizadas por micélio intra e extrarradicular de uma das respetivas espécies de Fungos Micorrízicos Arbusculares - FMA, preparadas na etapa ii).

Na etapa iv) , são retirados 900g de cada uma das respetivas culturas multi-esporos que inclui raízes colonizadas por micélio intra e extrarradicular de uma das respetivas espécies de Fungos Micorrízicos Arbusculares FMA, produzidas na etapa iii).

- Sub etapas da i) e da ii)

Na etapa i) produção de uma cultura pura ou cultura-mãe de pelo menos uma das espécies de Fungos Micorrízicos Arbusculares (FMA, é realizada a sub-etapa i.i) que compreende:

- regar com água esterilizada a cada dois dias, ou sempre que se justifique de acordo com as necessidades hídricas da planta hospedeira;

- aplicar na planta hospedeira uma solução nutritiva ecológica (o mesmo que fertilizante ecológico) um mês após a inoculação ou início da etapa i) , e posteriormente repetir essa operação uma vez por mês até 3 meses após a inoculação; e deixar de regar a planta hospedeira com água esterilizada a cada dois dias, aproximadamente 4 meses após a inoculação ou inicio da etapa i) , para que a planta hospedeira seque completamente a fim de estimular a produção de esporos.

Na etapa ii) , preparação de um biofertilizante que inclui apenas uma das respetivas culturas puras ou culturas-mães de uma das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA), quando a planta hospedeira estiver seca, é realizada a sub-etapa ii.i) que compreende:

- dispor o substrato sólido de cada um dos respetivos vasos num tabuleiro, aproximadamente cinco meses após o início da etapa i);

r emover a planta hospedeira do substrato sólido constituído por areia de bagacina;

- controle de qualidade através da extração de esporos e, recolha de raízes a partir da colheita de lOOg de cada cultura pura ou cultura-mãe, para averiguar se os esporos se encontram parasitados ou se as raízes estão infetadas por algum fungo patogénico;

descartar a cultura pura ou cultura-mãe caso se confirme a presença de algum agente nocivo; e

- cortar a raiz da cultura pura ou cultura-mãe em pequenos fragmentos e, retirar uma mistura da mesma, para iniciar a produção de culturas multi-esporos, caso não se verifique a presença de nenhum agente estranho;

replicar cada cultura pura ou cultura-mãe, que consiste em adicionar aos restantes 4000g de cada cultura pura ou cultura-mãe lOOOg de areia de bagacina esterilizada. Esta mistura é colocada num novo vaso de 5L de capacidade, ao qual se adiciona uma nova plântula de Zea mays L. ou de Plantago coronopus L..

- Sub etapas da iii) e vi) produção de culturas multiesporos.

Na etapa iii), produção das culturas de multiesporos de cada uma das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA) estabelecidas a partir de cada uma das respectivas culturas puras ou culturas-mães, é realizada uma sub-etapa iii.i) que compreende:

- regar com água esterilizada a cada dois dias, ou sempre que se justifique de acordo com as necessidades hídricas da planta;

- aplicar uma solução nutritiva ecológica um mês após a inoculação ou início da etapa iii), e posteriormente repetir essa operação uma vez por mês até 3 meses após a inoculação; e

- deixar de regar com água esterilizada a cada dois dias, aproximadamente 4 meses após a inoculação ou início da etapa iii) para que a planta hospedeira seque completamente a fim de estimular a produção de esporos.

Na etapa iv) preparação de um biofertilizante, quando a planta hospedeira está seca, é realizada a subetapa iv.i) que compreende:

- dispor o substrato sólido de cada um dos respetivos vasos num tabuleiro, aproximadamente cinco meses após o início da etapa iii);

remover a planta hospedeira do substrato sólido constituído por areia de bagacina;

- controle de qualidade através da extração de esporos e, recolha de raízes a partir da colheita de lOOg de cultura multi-esporos, para averiguar se os esporos se encontram parasitados ou se as raízes estão infetadas por algum fungo patogénico;

- descartar a cultura multi-esporos caso se confirme a presença de algum agente nocivo; e

- cortar a raiz da cultura multi-esporos em pequenos fragmentos e, retirar uma mistura da mesma, para iniciar a produção de culturas multi-esporos, caso não se verifique a presença de nenhum agente estranho.

Na etapa iv) preparação de um biofertilizante que inclui apenas uma das respetivas culturas multi-esporos de cada uma das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA), produzidas na etapa anterior, compreende:

a separação da cultura multi-esporos, produzida respetivamente na etapa iii), para a subsequente etapa v) seguinte; e a separação da cultura multi-esporos, produzida respetivamente na etapa iii), para a comercialização da me sma.

- Repetições das etapas v) e vi)

Na etapa v) e respetivamente nas subsequentes repetições da etapa v) , tantas as vezes quantas as pretendidas, são distribuídos em cada um dos 4 vasos de 5 L de capacidade, contendo cada um aproximadamente 4 8 00g de areia de bagacina esterilizada, 225g de uma das respetivas culturas multi-esporos que inclui raízes colonizadas por micélio intra e extrarradicular de uma das respetivas espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares - FMA, preparadas na etapa anterior. Este procedimento repete-se para cada cultura multi-esporos de cada espécie de FMA, estabelecida na etapa anterior.

Na etapa v) e respetivamente nas subsequentes repetições da etapa v), tantas as vezes quantas as pretendidas, nas quais vão ser realizadas a produção de culturas multi-esporos das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA) estabelecidas a partir de cada uma das respetivas culturas de multi-esporos, produzidas na etapa anterior, é realizada uma sub-etapa que compreende:

- aplicar uma solução nutritiva ecológica uma vez por mês após a inoculação ou início da etapa da produção de culturas multi-esporos das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA) estabelecidas a partir de cada uma das respetivas culturas de multi-esporos, produzidas na etapa anterior, e posteriormente repetir essa operação uma vez por mês até 3 meses após a inoculação; e

- deixar de regar com água esterilizada a cada dois dias aproximadamente 4 meses após a inoculação ou início da produção de culturas multi-esporos das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA) estabelecidas a partir de cada uma das respetivas culturas multi-esporos, produzidas na etapa anterior, para que a planta hospedeira seque completamente a fim de estimular a produção de esporos.

Na etapa vi) e respetivamente nas subsequentes repetições da etapa vi), tantas as vezes quantas as pretendidas, nas quais vão ser realizadas a preparação de um biofertilizante, quando a planta hospedeira está seca, é realizada uma sub-etapa que compreende:

- dispor o substrato sólido de cada um dos respectivos vasos num tabuleiro, aproximadamente cinco meses após o início da etapa de produção de culturas multi-esporos de cada uma das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA) estabelecidas a partir de cada uma das respetivas culturas multi-esporos, produzidas na etapa anterior; remover a planta hospedeira do substrato sólido constituído por areia de bagacina;

- controle de qualidade através da extração de esporos e, recolha de raízes a partir da colheita de lOOg de cada cultura multi-esporos, para averiguar se os esporos se encontram parasitados ou se as raízes estão infetadas por algum fungo patogénico;

- cortar a raiz da cultura multi-esporos em pequenos fragmentos e, retirar uma mistura da mesma, para iniciar a produção de novas culturas multi-esporos, caso não se verifique a presença de nenhum agente estranho.

Na etapa vi) e respetivamente nas repetições, tantas vezes quantas as necessárias, da etapa vi) , nas quais vão ser realizadas a preparação do biofertilizante, através da mistura em partes iguais das culturas multiesporos de cada uma das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA) produzidos na etapa anterior, compreende:

a separação da cultura multi-esporos, produzida respetivamente na etapa anterior, para a subsequente etapa; e a separação da cultura multi-esporos, produzida respetivamente na etapa anterior, para a comercialização da mesma.

As etapas i, iii, v e respetivamente nas repetições, tantas vezes quantas as necessárias, da etapa v) , são produzidas em estufa.

Numa outra forma de realização da presente invenção, as etapas i, iii, v e respetivamente nas repetições, tantas vezes quantas as necessárias, da etapa v), são produzidas ao ar livre.

As etapas i, iii, v e respetivamente nas repetições, tantas vezes quantas as necessárias, da etapa v) , são produzidas em cultura in vitro.

A cultura in vitro de fungos micorrizicos tem a capacidade de fornecer inóculos de FMA de alta qualidade e isento de contaminantes, constituindo um sistema eficiente para a produção em massa de biofertilizantes.

Este sistema de cultivo envolve o desenvolvimento de culturas monoaxénicas de FMA em raízes transformadas com Rhizobium rhizogenes, doravante também designado por R. rhizogenes.

R. rhizogenes provoca um fenótipo particular nos tecidos infectados, que se manifesta pela formação de um grande número de raízes muito finas, alongadas com crescimento plagiotrópico e por vezes muito ramificadas chamadas hairy roots.

Estas raízes têm a vantagem de não necessitarem de exposição às auxinas, visto que o mecanismo de infeção leva à inserção de genes que controlam a síntese de auxinas no genoma das células infectadas o que conduz à sua proliferação contínua num meio de cultura através da subcultura dos ápices radiculares.

Além disso, as hairy roots são muito estáveis em cultura quer do ponto de vista fenotípico como genotípico, ao contrário do que se verifica com as raízes obtidas por tratamentos químicos com auxinas.

A cultura in vitro de cada uma das cinco espécies de FMA que compõem este biofertilizante desenvolve-se em 3 etapas:

a) preparação de inoculo bacteriano e transformação de raízes;

b) análise através da técnica de reação em cadeia da polimerase, RCP ou Polymerase Chain Reaction - PCR, de raízes transformadas; e

c) estabelecimento de culturas in vitro das cinco espécies de FMA.

a) Preparação de inoculo bacteriano e transformação de raízes

Para induzir a transformação de Daucus carota L. (cenoura) e de Trifolium pratense (trevo-vermelho) utilizase estirpes de R. rhizogenes.

Uma suspensão destas bactérias é preparada inoculando-se uma colónia em meio líquido usado para crescimento de bactérias (Nutrient Broth - NB), a qual vai a incubar durante a noite num agitador a 180 rpm a 26°C.

Posteriormente, suspende-se a cultura em meio NB para permitir o seu crescimento até atingir a densidade óptica de 1 a 600 nm e, centrifuga-se para preparar o inoculo em meio NB (mantendo a densidade de 1).

De seguida, procede-se à desinfecção das sementes de Trifolium pratense e da raiz de Daucus carota L. com lixívia a 100% e Tween 20 por 20 minutos, lavando-se depois com água desionizada estéril.

Sob condições assépticas a cenoura, concretamente Daucus carota L., é cortada em discos de 3-5 mm, os quais são posteriormente transferidos para caixas de petri contendo meio de cultura água-agar (pH 5,7) suplementado com 250 pg/ml de cefotaxima, sendo posteriormente infectados com inoculo de R. rhizogenes preparado na etapa anterior.

O mesmo procedimento é realizado em relação às sementes de Trifolium pratense.

As raízes emergentes das extremidades são excisadas e transferidas para o meio WM (Meio Branco White Médium) modificado (Bécard & Fortin 1988), pH 5,7, suplementado com 250 pg/ml de cefotaxima.

Após três subculturas em meio WM com antibióticos, as raízes transformadas são libertadas com sucesso das bactérias e, depois mantidas em meio M (meio médio - M médium) (Bécard & Fortin, 1988) ou em meio MSR (meio modificado de Strullu-Romand - MSR médium) (Diop 1995 modificado de Strullu & Romand 1986, in Declerck et al., 1996), ambos com pH ajustado a 5,5 e incubadas a 26°C em posição invertida no escuro.

b) análise de PCR de raízes transformadas

A transformação das raízes é confirmada através da técnica de reação em cadeia da polimerase (RCP ou Polymerase Chain Reaction - PCR).

Para o efeito extrai-se o ácido desoxirribonucleico (ADN) total de 100 mg de amostras de raízes putativamente transformadas com o DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante.

A integração do Ri T-DNA é verificada por PCR como descrito por Choi et al. (2004) com os primers para o gene rolB (5'-CTTATGACAAACTCATAGATAAAGGTT-3'e 5'TCGTAACTATCCAACTCACATCAC-3') e o gene rolC (5'CAACCTGTTTCCTACTTTGTTAAC-3'e 5'-AAACAAGTGACACACTCAGCTTCT3'). Primers para detectar o gene virC (5'GGCTTCGCCAACCAATTTGGAGAT-3'e 5'-TTTTGCTCCTTCAAGGGAGGTGCC3') fora do T-DNA do plasmideo Ri também são usados para eliminar a possibilidade de contaminação por R. rhizogenes das raízes recém-formadas. Após a confirmação da transformação das raízes pela técnica de PCR, procede-se à inoculação das raízes transformadas com cada espécie de FMA isoladamente.

c) estabelecimento de culturas in vitro das cinco espécies de FMA

De cada cultura pura ou cultura-mãe estabelecida em areia de bagacina extraem-se raízes e, esporos através do método de peneiramento e decantação em gradiente de sacarose de Walker (1992).

Posteriormente procede-se à esterilização das raízes e dos esporos através de ultra-sons durante 30 segundos, sendo estas estruturas propagativas depois colocadas numa solução contendo 1% de cloramina T e 50 mg/mL de estreptomicina durante 10 min.

De seguida, os esporos e as raízes são lavados várias vezes com água Mili Q. A viabilidade dos esporos é visualmente verificada, com auxílio de uma lupa, pela sua cor clara e, pelo enchimento globular.

Apenas os esporos viáveis são colhidos colocados perto de um segmento apical de cada raiz transformada (3-7 cm) em caixas petri de 9 cm de diâmetro contendo meio de cultura M (meio médio - M médium) ou MSR (meio modificado de Strullu-Romand - MSR médium), pH 5,5.

Posteriormente, as placas são incubadas no escuro a 28 °C e, semanalmente monitorizadas quanto à formação de estruturas micorrizicas.

Este procedimento é também realizado em relação às raízes.

Uma vez estabelecida a cultura in vitro de cada espécie de FMA, removem-se pequenos compartimentos contendo esporos, os quais são transferidos para novas caixas de petri para inocular novas raízes transformadas, permitindo, deste modo, o estabelecimento de novas culturas e, consequentemente a produção em massa de cada espécie de FMA.

Três a quatro meses após a subcultura contínua das placas incubadas a 25°C/28°C, e sendo visível a nova esporulação nas placas procede-se à extracção de novos compartimentos para iniciar novas culturas e, à extracção dos esporos para a preparação do biofertilizante sob a forma de gel semi-sólido (biofertilizante líquido), ou sob a forma de substrato, com areia de bagacina (biofertilizante sólido).

- Biofertilizante biofertilizante, produzido de acordo com o processo de produção de um biofertilizante anteriormente descrito, compreende raízes colonizadas por micélio intra e extrarradicular de cada uma das espécies de Fungos

Micorrizicos Arbusculares - FMA, necessárias de acordo com as especificidades do biofertilizante a produzir.

biofertilizante compreende raízes colonizadas por micélio intra e extrarradicular de cada uma das 5 espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares - FMA, nomeadamente:

- Cetraspora sp.;

- Claroideoglonus etunicatun;

- Funnelifornis nosseae;

- Gigaspora sp.; e - Rhizophagus sp..

No biofertilizante o micélio de cada uma das respetivas 5 espécies de FMA está envolvido num material inerte esterilizado à base de escórias vulcânicas de origem local, comercialmente designado por areia de bagacina e/ou num gel semi-sólido e, inclui diferentes estruturas propagativas, concretamente:

- esporos;

- hifas;

- vesículas; e - arbúsculos.

No biofertilizante, os Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA) que constituem o substrato sólido composto por material inerte apresentam:

- 86,67 propágulos infetivos/ cm³;

- 80,00 esporos viáveis/ g de substrato; e raízes, com uma percentagem de colonização micorrízica superior a 70,00%.

No biofertilizante, o substrato sólido composto por material inerte esterilizado que compreende Fungos

Micorrizicos Arbusculares (FMA) é granulado e, constitui não só o substrato de suporte para aplicação do referido biofertilizante, como também o substrato que permite a melhor propagação e conservação das espécies de Fungos Micorrizicos Arbusculares (FMA) que compõem o biofertilizante.

A presente invenção deve apenas ser limitada pelo espírito das reivindicações que se seguem.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo de produção de um biofertilizante, caracterizado por compreender as etapas de:

i) produção de culturas de um único esporo de pelo menos uma das espécies de Fungos Micorrízicos Arbusculares (FMA) selecionadas dentre Cetraspora sp., Claroideoglomus etunicatum, Funneliformis mosseae, Gigaspora sp. e Rhizophagus sp.;

ii) produção em separado de culturas multiesporos de cada uma das espécies de FMA a partir de cada uma das respetivas culturas de um único esporo, produzidas na etapa i);

iii) produção em separado de culturas multiesporos de cada uma das espécies de FMA a partir de cada uma das respetivas culturas multi-esporos, produzidas na etapa ii); e iv) preparação de um biofertilizante que inclui:

- apenas uma cultura multi-esporos de uma espécie de FMA, produzida na etapa ii) ou na etapa iii); ou

- uma mistura em partes iguais de cada uma das respetivas culturas multi-esporos das espécies de FMA, produzidas na etapa ii) ou na etapa iii);

em que as etapas ii), iii) e iv), nesta ordem, são repetidas tantas as vezes, quantas as pretendidas;

em que, na etapa i), as culturas de um único esporo de cada uma das espécies de FMA incluírem raízes colonizadas por micélio intra e extrarradicular, em que o citado micélio está envolvido em areia de bagacina esterilizada, e por incluir as diferentes estruturas propagativas de cada espécie de FMA, selecionadas dentre esporos, hifas, vesículas e arbúsculos; e em que, na etapa i), a produção de cada uma das culturas de um único esporo das espécies de FMA, ser realizada em vasos separados que compreendem:

- um substrato sólido que inclui areia de bagacina esterilizada;

- uma plântula de uma espécie de planta hospedeira selecionada dentre Zea mays L. ou Plantago coronopus L., que é plantada no citado substrato sólido; e

- um esporo de apenas uma das respetivas espécies de FMA que irá inocular a raiz da citada plântula.
2. Processo de produção de um biofertilizante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o substrato sólido compreender 4000g de uma das respetivas culturas de um único esporo de uma das espécies de FMA e 1000g de areia de bagacina esterilizada.
3. Processo de produção de um biofertilizante, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por, na etapa i), ainda serem realizadas as sub-etapas de:

- regar as culturas de um único esporo com água esterilizada a cada dois dias, ou sempre que se justifique de acordo com as necessidades hídricas da planta hospedeira;

- aplicar na planta hospedeira uma solução nutritiva ecológica e / ou um fertilizante ecológico um mês após a inoculação ou início da etapa i), e posteriormente repetir essa operação 1 vez por mês, até 3 meses após a inoculação; e

- deixar de regar a planta hospedeira com água esterilizada a cada dois dias, aproximadamente 4 meses após a inoculação ou início da etapa i), para que a planta hospedeira seque completamente a fim de estimular a produção de esporos.
4. Processo de produção de um biofertilizante, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por, na etapa i), quando a planta hospedeira estiver seca, ainda serem realizadas as sub-etapas de:

- dispor o substrato sólido de cada um dos respetivos vasos num tabuleiro, aproximadamente 5 meses após o início da etapa i);

- remover a planta hospedeira do substrato sólido constituído por areia de bagacina esterilizada;

- realizar o controle de qualidade através da extração de esporos e recolha de raízes a partir da colheita de 100g de cada cultura de um único esporo, para averiguar se os esporos se encontram parasitados ou se as raízes estão infetadas por algum fungo patogénico;

- descartar a cultura de um único esporo caso se confirme a presença de algum agente nocivo;

- cortar a raiz da cultura de um único esporo em pequenos fragmentos e retirar uma mistura da mesma, para iniciar a produção de culturas multi-esporos, caso não se verifique a presença de nenhum agente estranho; e

- replicar cada cultura de um único esporo ao adicionar aos restantes 4000g de cada cultura de um único esporo 1000g de areia de bagacina esterilizada.
5. Processo de produção de um biofertilizante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, na etapa ii) e respetivamente nas subsequentes repetições da mesma, a produção de culturas multi-esporos de cada uma das espécies de FMA ser realizada em vasos separados que compreendem:

- um substrato sólido que inclui 4900 g de areia de bagacina esterilizada misturada com 100g de uma cultura de um único esporo que inclui raízes colonizadas por micélio intra e extrarradicular de uma das respetivas espécies de FMA produzidas na etapa i); e

- uma plântula de uma espécie de planta hospedeira selecionada dentre Zea mays L. ou Plantago coronopus L., que é plantada no citado substrato sólido.
6. Processo de produção de um biofertilizante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 5, earaeterizado por, na etapa ii), ainda serem realizadas as sub-etapas de:

- regar as culturas multi-esporos com água esterilizada a cada dois dias, ou sempre que se justifique de acordo com as necessidades hídricas da planta;

- aplicar na planta hospedeira uma solução nutritiva ecológica e / ou um fertilizante ecológico um mês após a inoculação ou início da etapa ii), e posteriormente repetir essa operação 1 vez por mês, até 3 meses após a inoculação; e

- deixar de regar a planta hospedeira com água esterilizada a cada dois dias, aproximadamente 4 meses após a inoculação ou início da etapa ii) para que a planta hospedeira seque completamente a fim de estimular a produção de esporos.
7. Processo de produção de um biofertilizante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 5 ou 6, earaeterizado por, na etapa ii), quando a planta hospedeira estiver seca, ainda serem realizadas as sub-etapas de:

- dispor o substrato sólido de cada um dos respetivos vasos num tabuleiro, aproximadamente 5 meses após o início da etapa ii);

- remover a planta hospedeira do substrato sólido constituído por areia de bagacina esterilizada;

- realizar o controle de qualidade através da extração de esporos e recolha de raízes a partir da colheita de 100g de cada cultura multi-esporos, para averiguar se os esporos se encontram parasitados ou se as raízes estão infetadas por algum fungo patogénico;

- descartar a cultura multi-esporos caso se confirme a presença de algum agente nocivo;

- cortar a raiz de cada cultura multi-esporos em pequenos fragmentos e retirar uma mistura da mesma, para iniciar a produção de novas culturas multi-esporos, caso não se verifique a presença de nenhum agente estranho ou

- separar a cultura multi-esporos obtida para a comercialização da mesma.
8. Processo de produção de um biofertilizante, de acordo com a reivindicação 1, earaeterizado por, na etapa iii) e respetivamente nas subsequentes repetições da mesma, a produção de culturas multi-esporos das espécies de FMA ser realizada em vasos separados que compreendem:

- um substrato sólido que inclui 4800 g de areia de bagacina esterilizada misturada com 225g de uma cultura multi-esporos que inclui raízes colonizadas por micélio intra e extrarradicular de uma das respetivas espécies de FMA produzidas na etapa ii); e

- uma plântula de uma espécie de planta hospedeira selecionada dentre Zea mays L. ou Plantago coronopus L., que é plantada no citado substrato sólido.
9. Processo de produção de um biofertilizante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 8, earaeterizado por, na etapa iii) e respetivamente nas subsequentes repetições da mesma, ainda serem realizadas as sub-etapas de:

- regar as culturas multi-esporos com água esterilizada a cada dois dias, ou sempre que se justifique de acordo com as necessidades hídricas da planta hospedeira;

- aplicar na planta hospedeira uma solução nutritiva ecológica e / ou um fertilizante ecológico um mês após a inoculação ou início da etapa iii), e posteriormente repetir essa operação 1 vez por mês, até 3 meses após a inoculação; e

- deixar de regar a planta hospedeira com água esterilizada a cada dois dias, aproximadamente 4 meses após a inoculação ou início da etapa iii), para que a planta hospedeira seque completamente a fim de estimular a produção de esporos.
10. Processo de produção de um biofertilizante, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 8 ou 9, caracterizado por, na etapa iii) e respetivamente nas subsequentes repetições da mesma, quando a planta hospedeira estiver seca, ainda serem realizadas as subetapas de:

- dispor o substrato sólido de cada um dos respetivos vasos num tabuleiro, aproximadamente 5 meses após o início da etapa iii);

- remover a planta hospedeira do substrato sólido constituído por areia de bagacina esterilizada;

- realizar o controle de qualidade através da extração de esporos e recolha de raízes a partir da colheita de 100g de cada cultura multi-esporos, para averiguar se os esporos se encontram parasitados ou se as raízes estão infetadas por algum fungo patogénico;

- descartar a cultura multi-esporos caso se confirme a presença de algum agente nocivo;

- cortar a raiz da cultura multi-esporos em pequenos fragmentos e retirar uma mistura da mesma, para iniciar a produção de novas culturas multi-esporos, caso não se verifique a presença de nenhum agente estranho ou

- separar a cultura multi-esporos obtida para a comercialização da mesma.
11. Processo de produção de um biofertilizante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, na etapa iv) e respetivamente nas subsequentes repetições da mesma, a preparação do biofertilizante ser realizada a partir das culturas multi-esporos de cada uma das espécies de FMA produzidas nas etapas ii) ou iii) ou a partir da mistura em partes iguais das culturas multi-esporos de cada uma das espécies de FMA produzidas nas etapas ii) ou iii).
12. Processo de produção de um biofertilizante, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por ser realizado em estufa, ao ar livre ou em cultura in vitro.
13. Processo de produção de um biofertilizante, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a cultura in vitro compreender as etapas de:

a) preparação de inóculo bacteriano e transformação de raízes;

b) análise através da reação em cadeia da polimerase das raízes transformadas; e

c) estabelecimento de culturas in vitro das cinco espécies de FMA.
14. Biofertilizante, obtido pelo processo conforme definido nas reivindicações 1 a 13, caracterizado por compreender raízes colonizadas e micélio de pelo menos uma espécie de FMA, ou uma mistura em partes iguais de raízes colonizadas e micélio de cada uma das espécies de FMA selecionadas dentre Cetraspora sp., Claroideoglomus etunicatum, Funneliformis mosseae, Gigaspora sp. e Rhizophagus sp., de acordo com as especificidades do biofertilizante a produzir, em que as culturas de cada uma das espécies de FMA incluem raízes colonizadas por micélio intra e extrarradicular, em que o citado micélio está envolvido em areia de bagacina esterilizada e por incluir as diferentes estruturas propagativas de cada espécie de FMA, selecionadas dentre esporos, hifas, vesiculas e arbúsculos, em que os FMA compreendem:

- 86,67 propágulos infetivos / cm³;

- 80,00 esporos viáveis / g de substrato; e

- raízes, com uma percentagem de colonização micorrízica superior a 70,00%.