PT108994A - Nanossistema de ouro com revestimento biopolimérico e gama de absorção no infravermelho próximo e método para a sua preparação - Google Patents

Nanossistema de ouro com revestimento biopolimérico e gama de absorção no infravermelho próximo e método para a sua preparação Download PDF

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Dias De Mendonça Rijo Patrícia
Miguel Pinto Coelho João
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Abstract

NANOSSISTEMA COMPOSTO POR NANOPARTÍCULAS DE OURO PRODUZIDAS ATRAVÉS DE UM EXTRATO DE PLANTA (4) COMO AGENTE REDUTOR ADSORVIDO À SUPERFÍCIE DE UM NÚCLEO METÁLICO DE OURO (1) E UM REVESTIMENTO POLIMÉRICO (2) E PEPTÍDICO (3), DE FORMA ESSENCIALMENTE ESFÉRICA E COM GAMA DE ABSORÇÃO NO INFRAVERMELHO PRÓXIMO, E MÉTODO PARA A SUA PREPARAÇÃO A PARTIR DE ÁCIDO HIALURÓNICO (5) E ÁCIDO OLEICO (6). O NANOSSISTEMA APRESENTA ATIVIDADE TERAPÊUTICA EM TUMORES SUPERFICIAIS, NOMEADAMENTE LOCALIZADOS A PROFUNDIDADE INFERIOR A 5 CENTÍMETROS, E PROFUNDOS, NOMEADAMENTE LOCALIZADOS A PROFUNDIDADE SUPERIOR A 5 CENTÍMETROS, E EM PATOLOGIAS DERMATOLÓGICAS QUANDO ATIVADO POR HIPERTERMIA ATRAVÉS DA INCIDÊNCIA DE UM LASER OU DE UMA FONTE DE LUZ DE APLICAÇÃO SIMILAR.

Description

DESCRIÇÃO
NANOSSISTEMA DE OURO COM REVESTIMENTO BIOPOLIMÉRICO E GAMA DE ABSORÇÃO NO INFRAVERMELHO PRÓXIMO E MÉTODO PARA A SUA
PREPARAÇÃO
DOMÍNIO TÉCNICO DA INVENÇÃO A presente invenção pertence ao domínio das nanopartículas com atividade farmacêutica para uso terapêutico. A presente invenção diz respeito a um nanossistema desenvolvido para aplicação em fototerapia, que consiste em nanopartículas de ouro produzidas através de um agente redutor à base de extrato de planta que poderá encontrar-se adsorvido à superfície, com revestimento polimérico e peptidico e com gama de absorção no infravermelho próximo. As nanopartículas da invenção possuem um extrato de planta como agente redutor do ouro, adsorvido à superfície do núcleo de ouro, bem como um revestimento polimérico e peptidico que confere ao nanossistema estabilidade e o direciona para o local do ação. 0 nanossistema da invenção apresenta um comprimento de onda na gama ótima de terapia, designadamente no infravermelho próximo, e adquire atividade terapêutica quando exposto à incidência de um laser ou de uma fonte de luz de aplicação similar. A invenção compreende também um método de preparação do nanossistema de ouro, que consiste nos passos de redução de ácido cloroáurico (HAuCl4) com o extrato aquoso de uma planta, com elevada concentração de compostos antioxidantes, adição de nitrato de prata e L-ácido ascórbico e revestimento das nanopartículas assim obtidas com uma solução polimérica e peptídica, que confere um aumento da estabilidade e vectorizaçao das nanopartículas de ouro para o local do tumor, ou de forma generalizada, para o local de ação.
Quando aplicável, este nanossistema poderá ser associado a fármacos citostáticos e aplicado como sistema de veiculação para administração direcionada no local do tumor, sendo igualmente, ativado por hipertermia através da incidência de um laser ou de uma fonte de luz de aplicação similar.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A versatilidade de aplicações farmacológicas, a facilidade de produção, as propriedades ópticas e a escala compatível com a difusão celular fazem com que as nanopartículas sejam uma das áreas de maior interesse na biologia molecular e na medicina. Em particular, as nanopartículas têm merecido atenção como sistemas dispensadores de fármacos. 0 pedido de patente internacional WO 2011/116963 A2, por exemplo, apresenta um sistema nanoparticulado baseado numa camada de encapsulamento lipídica. O composto activo é encapsulado num revestimento polimérico de natureza lipídica. Já o pedido de patente internacional WO 2012/038061 A2 divulga nanocápsulas poliméricas contendo microemulsões de óleo em água, sem recorrer a reagentes orgânicos, que podem ser aplicadas como sistemas de veiculação de compostos farmacêuticos, alimentares e/ou cosméticos.
Apesar da facilidade de difusão, estes sistemas de camada de revestimento polimérica apresentam o inconveniente de não serem muito específicos quanto ao local de administração. Frequentemente, a camada lipídica dissolve-se antes de atingir o alvo o que reduz o tratamento da terapia.
Procuraram-se assim outras nanopartículas que oferecessem maior estabilidade, biocompatibilidade e especificidade.
Neste domínio, um dos tipos de nanopartículas que tem merecido mais atenção são as nanopartículas com núcleo metálico e em particular as de ouro. Uma vez que o ouro é um metal nobre, reagindo com um número limitado de espécies químicas, e tem a capacidade de formar complexos coordenados estáveis com uma diversidade de compostos, as nanopartículas de ouro apresentam-se actualmente como particularmente promissoras no desenvolvimento de métodos de diagnóstico e terapias antitumorais. Em particular, a atividade ótica das nanopartículas de ouro tornam-nas especialmente adequadas para a fototerapia.
Os nanossistemas formados pela associação de nanopartículas a outros compostos, designadamente ligandos, adquirem uma função no diagnóstico de tumores, quando os ligandos são biomarcadores para as células tumorais, ou terapêutica, quando os ligandos são compostos activos que o nanossistema veicula até à célula ou células alvo. A conjugação das nanopartículas de ouro com ligandos específicos representa neste momento o maior desafio científico. Por um lado os nanossistemas constituídos pelas nanopartículas e pelos ligandos têm de ser estáveis e específicos para a função a desempenhar, seja ela a marcação das células tumorais ou a administração de fármacos, por outro têm de ser biocompatíveis ou seja, a difusão do nanossistema pelas membranas celulares até à célula tumoral tem de ser possível.
Acontece que frequentemente a natureza do ligando deforma a estrutura do nanossistema. Assim, em vez de uma forma esférica que promove e facilita a difusão celular, os nanossistemas apresentam-se frequentemente com formas cilíndricas, alongadas ou triangulares. Desta forma, continua a procurar-se um nanossistema com núcleo de ouro que seja simultaneamente estável, biocompatível e eficaz. 0 pedido de patente internacional WO 2012/039685 AI descreve um sistema coloidal contendo nanopartícuias de ouro revestidas por polietilenoglicol que se liga ao composto farmacologicamente ativo para a sua veiculação ao local de administração. Verifica-se no entanto que frequentemente as partículas adquirem uma forma oblonga ou trilobada, o que dificulta a difusão celular. Além disso, a gama de absorção do sistema situa-se nos 530 nanómetros, uma gama de absorção que não é a mais adequada em fototerapia já que tem uma maior absorção e um maior potencial para danificar os tecidos saudáveis. A patente americana US 8057682 B2 diz respeito a nanopartículas metálicas, entre elas de ouro, e a um método para a sua preparação, envolvendo um extrato natural de uma planta. A partícula envolve ainda o uso de um agente redutor sintético, de elevada reatividade e toxicidade. A nanoparticula é assim usada para captação e remoção de contaminantes presentes em água para abastecimento, água residual e solos contaminados, demonstrando ser inadequada para aplicações farmacêuticas. O pedido de patente americano US 2009/0117045 AI divulga também nanopartículas com base num extrato natural de uma planta e respetivo método de produção. O composto natural é proveniente de uma planta da família Fabaceae, em particular soja ou lentilha dando origem a um nanossistema com gama de absorção na ordem dos 535 nanómetros. A presente invenção vem dar resposta às dificuldades enumeradas, com um nanossistema de ouro constituído por nanopartícuias (maior área de superfície de contacto) de ouro com um revestimento à base de extrato de planta natural, revestida por um polímero e vetorizada com um péptido. 0 extrato de planta natural é da família Lamiaceae o que confere ao nanossistema propriedades químicas antioxidantes, contrariamente aos nanossistemas do estado da técnica que recorrem a agentes redutores com efeitos tóxicos.
As nanopartículas de ouro da invenção são preparadas a partir da redução do ácido cloroáurico como fonte de ouro. 0 nanossistema é formando por adição às nanopartículas de polímeros e péptidos com afinidade para recetores específicos em células tumorais. 0 nanossistema assim preparado apresenta uma forma essencialmente esférica, o que favorece a difusão celular e o torna particularmente adequado para a veiculação de fármacos.
Com vista à administração farmacêutica, as nanopartículas de ouro são formuladas em nanossistemas à base de polímeros, vetorizados com péptidos, adquirindo desta forma a capacidade de veicular fármacos.
Verifica-se ainda que o nanossistema da invenção apresenta um comprimento de onda de absorção das nanopartículas de ouro na gama do infravermelho próximo, entre os 650 e os 900 nanómetros, a gama considerada óptima para fototerapia uma vez que a pele tolera a radiação sem sofrer alterações morfológicas. Em particular, verifica-se que na gama do infravermelho próximo, entre os 650 e os 900 nanómetros, os tecidos apresentam uma menor absorção da radiaçao, minimizando a possibilidade de alterações morfológicas.
As nanoparticulas de ouro aqui divulgadas, quando expostas a radiação no infravermelho próximo (650 - 900 nanómetros), absorvem essa radiação sob a forma de energia, sobreaquecendo e promovendo a destruição dos tecidos (necrose), por hipertermia. A ativação e ação hipertérmicas das nanoparticulas ocorrem após a sua ligação por via dos vetores específicos (péptidos) conjugados à superfície das nanoparticulas de ouro. A presente invenção fornece assim um nanossistema de elevada estabilidade, seguro, biocompatível e com elevada especificidade para os recetores alvo.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a um nanossistema para fototerapia de tumores e patologias dermatológicas, administrado localmente e ativado por hipertermia através da incidência de um laser ou de uma fonte de luz de aplicação similar. A invenção aqui divulgada compreende nanoparticulas de ouro, com um extrato de planta como agente redutor adsorvido à sua superfície, com um revestimento polimérico e peptídico e apresenta um comprimento de onda na ordem dos 650 a 900 nanómetros, na gama de infravermelho próximo. O nanossistema apresentando atividade terapêutica, quando exposto à incidência de um laser ou de uma fonte de luz de aplicação similar, por hipertermia. Trata-se de um produto, com atividade multifuncional, na medida em que é adaptável a diversos tumores, e vetorizado, na medida em que possui especificidade para se ligar a diferentes recetores, sobreexpressos nas células tumorais. A invenção diz ainda respeito ao um método de preparação do nanossistema com três fases distintas: 1. Redução de ácido cloroáurico (HAuCl4) com o extrato aquoso de uma planta com elevada concentração de compostos antioxidantes; 2. Adição de nitrato de prata e L-ácido ascórbico; 3. Revestimento das nanoparticulas com uma solução polimérica e peptídica, que confere um aumento da estabilidade e vectorização do nanossistema de ouro para o local do tumor.
As nanoparticulas de ouro aqui descritas apresentam uma morfologia essencialmente esférica, com uma população monodispersa, com um tamanho médio de 100 nanómetros, índice de polidispersão de 0,2 e carga superficial média negativa (-19 mV) . O facto do nanossistema apresentar uma morfologia maioritariamente esférica é crucial para executar o objeto da invenção, uma vez que o nanossistema de ouro ocupa um pequeno volume e, consequentemente, apresenta uma maior área de superfície de contacto com as células alvo.
Contrariamente aos métodos de preparação de nanoparticulas de ouro convencionais, em que habitualmente se recorre a agentes redutores sintéticos, o método da presente invenção recorre à utilização de um extrato aquoso de uma planta da família Lamiaceae, com elevada concentração de compostos antioxidantes, que são responsáveis pela redução do composto de ouro existente nas nanoparticulas de ouro. Ou seja, o extrato da planta funciona como agente redutor maioritário das nanopartículas de ouro aqui descritas.
Os compostos com atividade antioxidante usados na invenção são por exemplo os polifenóis, mais precisamente o ácido rosmarinico, ácido cafeico e ácido clorogénico. Estes compostos estão naturalmente presentes nas plantas da familia Lamiaceae e permitem evitar a utilização de compostos sintéticos, como é o caso do brometo de hexadeciltrimetilamónio, que é um agente redutor e/ou estabilizador com efeitos tóxicos.
As nanopartículas de ouro compreendem também a sua funcionalização com um péptido, o fator de crescimento epidérmico (EGF), à superfície das próprias nanopartículas que conduz à vetorização da formulação para as células alvo. Por exemplo, no caso de um tratamento para o cancro, considerando que as células tumorais sobreexpressam um recetor específico para o péptido, o fator de crescimento epidérmico, o nanossistema de ouro liga-se às células tumorais. Deste modo o nanossistema é direcionado para as células tumorais. Este tipo de direcionamento do nanossistema de ouro permite que os tecidos não-alvo (isto é, as células saudáveis nas regiões circundantes da zona do tumor) não sejam expostos ao tratamento antitumoral, diminuindo possíveis efeitos secundários adversos. A presente invenção referente a um nanossistema de ouro apresenta vantagens sobre outros nanossistemas do estado da técnica com o mesmo objetivo, nomeadamente: a) Aumento da viabilidade de células não tumorais (devido à utilização de compostos naturais para redução do ouro, ao revestimento com polímeros biocompatíveis e biodegradáveis e à vetorização eficaz do nanossistema de ouro multifuncional, especificamente para as células tumorais); b) Eficácia na vetorização do nanossistema de ouro para as células tumorais, devido à presença de um péptido, designadamente o fator de crescimento epidérmico (EGF), na superfície da própria nanopartícuia, que se liga aos recetores do fator de crescimento epidérmico (EGFR) sobreexpressos em células tumorais, que se torna específico e dirigido para o local do tumor; c) Especificidade do nanossistema de ouro para as células tumorais, não afetando as células não tumorais localizadas na região do tumor, o que permite um tratamento com menores efeitos secundários; d) Ativação do nanossistema de ouro por um processo exógeno e não invasivo ao organismo, através da hipertermia tecidual por um laser ou por uma fonte de luz de aplicação similar, na gama de absorção da proximidade aos infravermelhos, na ordem de 650 a 900 nanómetros; e) Permite a utilização de diversas técnicas de fototerapia que apenas eliminam células tumorais, após concentração do nanossistema de ouro nessa região, por mecanismos de ativação fotónica; f) Adaptabilidade do nanossistema de ouro modificado para diferentes tumores e outras patologias dermatológicas, bem como para associação com fármacos citostáticos.
Na presente invenção é utilizada uma planta da família Lamiaceae para preparação do extrato natural e obtenção de compostos com atividade antioxidante que são adsorvidos à superfície das nanopartícuias de ouro. O extrato das plantas da família Lamiaceae apresenta uma elevada concentração de antioxidantes, sendo eficaz na redução do ouro, sem comprometer a biocompatibilidade das nanopartículas de ouro quando administradas no local de ação. A presente invenção é útil no tratamento de tumores, sejam estes superficiais ou profundos, e de outras patologias dermatológicas, como por exemplo a psoriase, a rosácea, a queratose, ou outras patologias. Alguns exemplos dos tumores para os quais esta invenção é aplicável e apresenta efeitos positivos na redução de células tumorais, são os carcinomas da pele, carcinoma do pulmão, tumor da mama, entre outros tumores, quer estes sejam tumores superficiais, até 5 centímetros de profundidade, quer sejam tumores profundos, com mais de 5 centímetros de profundidade. Sobre os tumores é utilizado um laser ou uma fonte de luz de aplicação similar, que ativa o nanossistema de ouro por hipertermia tecidual. 0 nanossistema de ouro liga-se às células tumorais, ao ser ativada por hipertermia pela incidência de um laser ou de uma fonte de luz de aplicação similar, promove o aquecimento local do tumor e, consequente, provoca a morte celular (efeito antitumoral hipertérmico).
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 consiste numa representação esquemática da disposição dos componentes do nanossistema e do seu processo de produção por intermédio dos agentes redutores naturais. Na figura pode observar-se o núcleo de nanopartícuia de ouro (1), o revestimento polimérico (2), os vetores péptidicos (3), o extrato de planta da família Lamiaceae (4), o ácido hialurónico (5) e o ácido oleico (6). A Figura 2 representa o espetro de absorção ótica com o comprimento de onda em nanómetros no eixo das abscissas e a absorvância no eixo das ordenadas de: A) nanoparticulas esféricas comerciais (pico de absorvância máxima: 530 nm)(linha interrompida); B) nanoparticulas de ouro produzidas com o extrato aquoso de planta da família Lamiaceae, com um comprimento de onda de absorção máxima na gama ótima de terapia, isto é, no infravermelho próximo (650 - 900 nanómetro) (linha contínua). A Figura 3 é uma imagem microscópica de transmissão electrónica onde se observa a forma essencialmente esférica do nanossistema da invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a um nanossistema desenvolvido para a fototerapia que contém nanoparticulas de ouro com atividade multifuncional, funcionalizadas com polímeros e péptidos.
As nanoparticulas de ouro produzida através de um extrato de uma planta da família Lamiaceae como agente redutor do ouro, bem como um revestimento polimérico (2) e peptídico (3) que, por sua vez, confere estabilidade ao nanossistema e o direciona para o local do ação. O nanossistema de ouro da invenção tem como particularidade apresentar um comprimento de onda na gama ótima de terapia, isto é, em infravermelho próximo, e apresentar atividade antitumoral quando exposta à incidência de um laser ou de uma fonte de luz de aplicação similar.
Os seguintes termos usados até aqui têm o seguinte significado: "Água purificada" refere-se a água deonizada e bi-destilada, seguida por um processo de esterilização por raios ultravioleta. "Biopolímero" entende-se como um material polimérico, de origem natural e fonte de carbono, estruturalmente classificado como polissacárido, poliéster ou poliamida. "Compostos antioxidantes" compreendem moléculas capazes de inibir a oxidação de outras moléculas e, consequentemente, são moléculas com um potencial ação como agentes de redução. "Diterpenóide" ou "diterpeno" consistem em metabolitos secundários da classe dos terpenos constituídos por 20 átomos de carbono, correspondendo a quatro unidades de isopreno. "Gama ótima de terapia" compreende o intervalo de comprimentos de onda no infravermelho próximo (650 - 900 nanómetros), para o qual está descrito que os tecidos têm uma absorção muito reduzida da energia. "Laser" refere-se a um dispositivo que produz radiação eletromagnética resultante da ampliação de luz por emissão estimulada de radiação.
Por "fonte de luz de aplicação similar" a laser entende-se qualquer dispositivo de amplificação de luz por emissão estimulada de radiação como por exemplo led superluminescente. "Polifenol" consiste num composto antioxidante que possui uma ou mais grupos hidroxilos ligados a um anel aromático, podendo apresentar um ou mais grupos hidroxilo e mais de um anel aromático. São substâncias naturais encontradas em plantas, tais como flavonóides, taninos, lignanas, derivados do ácido cafeico, entre outras. A designação genérica "nano" refere-se a uma estrutura cujo diâmetro está compreendido entre 1 e 1000 nanómetros. "Nanopartícula de ouro" refere-se ao núcleo metálico de ouro (D · "Nanossistema" refere-se à estrutura formada por nanopartículas e por um ou mais componentes depositados na sua superfície. "Nanossistema de ouro" refere-se à estrutura formada pelo núcleo metálico de ouro (1), pelo extrato natural de planta (4) e pelo revestimento polimérico (2) e peptídico (3). "Revestimento polimérico" (2) refere-se ao polímero que está adsorvido à superfície do núcleo metálico de ouro (1), formado por redução do extrato de planta (4) , cobrindo-o uniformemente. "Revestimento peptídico" refere-se aos vectores peptídicos (3) que se liqam em lugares específicos ao revestimento polimérico (2) . "Vetorização" entende-se como o direcionamento de uma nanopartícula (ou outro sistema de veiculação de fármaco) para um local de ação específico, onde atua por ligação a recetores específicos, para os quais possui alta afinidade. A presente invenção diz respeito a um nanossistema de ouro composto por nanopartículas de ouro com extrato de planta (4) da família Lamiaceae adsorvido à superfície como agente redutor, com revestimento polimérico (2) e peptídico (3) e que apresenta um comprimento de onda gama de infravermelho próximo, na ordem dos 650 a 900 nanómetros. O nanossistema da invenção apresenta atividade antitumoral quando exposto à incidência de um laser ou de uma fonte de luz de aplicação similar. Trata-se de um produto, baseado em nanopartículas de ouro com atividade multifuncional, na medida em que é adaptável a diversos tumores, e vetorizada, na medida em que possui especificidade para ligar-se aos recetores sobreexpressos nas células tumorais. A invenção diz ainda respeito a um método de preparação do nanossistema, em três fases: 1. Redução de ácido cloroáurico (HAUCI4) com o extrato aquoso de uma planta com elevada concentração de compostos antioxidantes (como por exemplo, ácido rosmarinico, ácido cafeico e ácido clorogénico); 2. Adição de nitrato de prata e L-ácido ascórbico; 3. Revestimento das nanopartículas com uma solução polimérica e peptídica, que confere vectorização das nanopartículas de ouro para o local do tumor. A presente invenção recorre à utilização do extrato aquoso de uma planta da família Lamiaceae que funciona como agente redutor por ação dos compostos antioxidantes presentes na planta, nomeadamente os polifenóis e os diterpenóides. Em particular, as plantas desta família são ricas em compostos antioxidantes polifenólicos, mais precisamente, ácido rosmarinico, ácido cafeico e ácido clorogénico. As plantas da família Lamiaceae são endémicas das regiões mediterrânicas, embora possam também encontrar-se noutras regiões. São habitualmente plantas de flor aromática devido aos óleos essenciais, com caules quadrangulares e folhas simples, opostas, pecioladas ou sésseis. Exemplos de plantas da família Lamiceae são as plantas da subfamília Salvia, espécie Acanthomintha, Achyrospermum, Acinos, Acrocephalus, Acrotome, Acrymia, Adelosa, Aegiphila , Aeollanthus , Agastache, Ajuga, Ajugoides, Alajja, Alvesia, Amasonia, Amethystea, Anisochilus, Anisomeles, Antonina , Aphanochilus, Archboldia, Ascocarydion, Asterohyptis, Atelandra, Audibertia, Ballota, Basilicum, Becium, Benguellia, Betonica, Blephilia, Bostrychanthera, Bovonia, Brachystemum, Brazoria,
Brittonastrum Bystropogon, Calamintha, Calapodium,
Callicarpa, Capitanopsis, Capitanya, Caryopteris, Catoferia, Cedronella, Ceratanthus, Ceratominthe, Chaiturus, Chamaesphacos, Chaunostoma, Chelonopsis, Chloanthes, Cleonia, Clerodendranthus, Clerodendrum, Clinopodium, Colebrookea, Collinsonia, Colobandra, Colquhounia, Comanthosphace, Congea, Conradina, Coridothymus, Cornutia, Craniotome, Cruzia, Cuminia, Cunila, Cyanostegia, Cyclonema, Cyclotrichium, Cymaria, Dauphinea, Dentidia, Dicerandra, Dicrastylis, Dorystaechas, Dracocephalum, Drepanocaryum, Dysophylla, Eichlerago, Elsholtzia, Endostemon, Englerastrum, Epimeredi, Eremostachys, Eriope, Eriophyton, Eriopidion, Eriothymus, Erythrochlamys, Euhesperida, Eurysolen, Eusteralis, Faradaya, Fuerstia, Galeobdolon, Galeopsis, Gardoquia, Garrettia, Geniosporum, Germanea, Geunsia, Glecoma, Glechon, Glossocarya, Gmelina, Gomphostemma, Gontscharovia, Hanceola, Haplostachys, Harlanlewisia: Haumaniastrum, Hedeoma, Hemiandra, Hemigenia, Hemiphora, Hemizygia, Hesperozygis, Heterolamium, Hoehnea, Holmskioldia, Holocheila, Holostylon, Horminum, Hosea, Hoslundia, Hosta (botânica), Huxleya, Hymenocrater, Hymenopyramis, Hypenia, Hypogomphia, Hyptidendron, Hyptis, Hyssopus, Iboza, Isanthus, Isodictyophorus, Isodon , Isoleucas, Karomia, Keiskea, Kinostemon, Koellia, Kudrjaschevia, Kurzamra, Lachnostachys, Lagochilus, Lagopsis, Lallemantia, Lamiastrum, Lamiophlomis, Lamium, Lavandula, Leocus, Leonotis, Leonurus, Lepechinia, Leucas, Leucosceptrum, Leucophae, Limniboza, Lophanthus, Loxocalyx, Lycopus, Macbridea, Majorana, Mahya, Mallophora, Marmoritis, Marrubium, Marsypianthes, Meehania, Melissa, Melittis, Mentha, Meriandra, Mesona, Metastachydium, Microcorys, Micromeria, Microtoena, Minthostachys, Moldavica, Moluccella, Monarda, Monardella, Monochilus, Moschosma, Mosla, Neoeplingia, Neohyptis, Neomuellera, Neorapinia, Nepeta , Newcastelia, Nosema, Notochaete, Ocimum , Octomeron,
Ombrocharis, Oncinocalyx, Oreosphacus, Origanum , Orthodon, Orthosiphon, Otostegia, Oxera, Panzerina, Paraeremostachys, Paralamium, Paraphlomis, Paravitex, Peltodon, Pentapleura, Perilla, Perillula, Perilomia, Peronema, Perovskia, Perrierastrum, Petitia, Petraeovitex, Phlomidoschema, Phlomis, Phlomoides, Phyllostegia, Physoleucas, Physopsis, Physostegia, Piloblephis, Pitardia, Pityrodia, Platostoma, Plectranthastrum, Plectranthus, Pogogyne, Pogostemon, Poliomintha, Porphyra, Prasium, Premna, Prostanthera, Prunella, Pseuderemostachys, Pseudocarpidium, Pseudochamaesphacos, Pseudomarrubium, Pulegium, Puntia, Pycnanthemum, Pycnostachys, Rabdosiella, Renschia, Rhabdocaulon, Rabdosia, Rhaphiodon, Rhododon, Rosmarinus, Rostrinucula, Rotheca, Roylea, Rubiteucris, Sabaudia, Saccocalyx, Salazaria, Salvia, Salviastrum, Satureja, Schizonepeta, Schnabelia, Scutellaria, Sideritis, Siphonanthus, Siphocranion, Skapanthus, Solenostemon, Spartothamnella, Sphacele, Sphenodesme, Stachydeoma, Stachyopsis, Stachys, Stenogyne, Stiptanthus, Sulaimania, Suzukia, Symphorema, Symphostemon, Synandra, Syncolostemon, Taligalea, Tectona, Teijsmanniodendron, Tetraclea, Tetradenia, Teucridium, Teucrium, Thorncroftia, Thuspeinanta, Thymbra, Thymus, Tinnea, Trichostema, Tsoongia, Tullia, Vitex, Viticipremna, Volkameria, Wenchengia, Westringia, Wiedemannia, Wrixonia, Xenopoma, Zappania, Zataria, Zhumeria, Ziziphora. Em particular, as plantas preferidas da família Lamiaceae são as plantas da espécie Plectranthus ornatus, Plectranthus ecklonii, Plectranthus barbatus, Plectranthus saccatus, Lavandula stoechas ssp. luisieri, Lavandula pedunculata, Salvia officinalis e Rosmarinus officinalis.
Exemplo 1
Preparação do extrato aquoso a partir de uma planta da espécie Plectranthus saccatus A planta é seca e cortada em pequenos fragmentos. A extração é obtida quando os fragmentos são expostos ao microondas, com uma frequência a 2,45 Ghz., e liofilizados. Um miligrama de planta seca origina 5,9% ácido rosmarinico, 0,026% ácido cafeico e 0,042% ácido clorogénico. A fase da preparação do nanossistema de ouro consiste na preparação das nanoparticulas de ouro e mistura do extrato de planta (4) da familia Lamiaceae para adsorção do composto redutor à superfície do núcleo de ouro (1).
Exemplo 2
Redução do ácido cloroáurico (HAUCI4) através do extrato aquoso de planta e formação das nanoparticulas de ouro
As nanoparticulas de ouro são preparadas por redução do ácido cloroáurico (HAuC14) com o extrato aquoso de planta preparado no Exemplo 1. São adicionados 9 mL de uma solução de ácido cloroáurico (HAUCI4) com a concentração de 1 mM. Em seguida adicionam-se sequencialmente os compostos seguintes: a) solução aquosa de nitrato de prata (10 mM; 5 pL); b) solução aquosa de L-ácido ascórbico (20 mM; 500 pL); c) solução aquosa de extrato de planta (10 mg/mL; 100 - 1000 pL) preparado no Exemplo 1
Consoante a espécie de planta usada também o conteúdo em compostos antioxidantes varia e deste modo, a razão molar do extrato aquoso da planta para as nanoparticulas de ouro altera-se. Regra geral, a razão molar do extrato aquoso da planta para as nanoparticulas de ouro varia entre 2:1 a 1:20, conforme a massa molar do composto antioxidante maioritário presente na planta e a concentração do ouro nas nanopartículas de ouro. Habitualmente, as plantas da família Lamiaceae contêm ácido rosmarínico como composto antioxidante maioritário. A concentração da solução de ácido cloroáurico usada na redução pode variar entre os 0,2 e 1 mM e o tempo de reação pode variar entre 15 minutos a 24 horas, com uma agitação entre as 200 e as 1000 rotações por minuto, para um pH compreendido entre os 7 e os 10 e uma temperatura entre os 25°C e os 35°C. A adição de agentes moduladores e co-adjuvantes no processo de redução do ouro, nomeadamente nitrato de prata, em concentrações entre o 1 e os 10 mM, e L-ácido ascórbico, em concentrações entre os 2 e os 20 mM é vantajosa para o rendimento da reação.
Após obtenção das nanopartículas de ouro com o agente redutor adsorvido à superfície, aplica-se o revestimento polimérico (2) e peptídico (3) sobre as nanopartículas para obtenção do nanossistema de ouro.
Exemplo 3
Revestimento das nanopartículas de ouro com uma solução polimérica e peptídica A preparação do nanossistema de ouro compreende os passos seguintes: a) Adição de ácido hialurónico (5) e ácido oleico (HAOA) (6) (1:1, v/v) , à concentração de 1 mg/mL para cada composto, que são incubados numa solução aquosa, com pH = 10 (NaOH 1M, 0,3%, v/v), durante 24 horas a 60°C, à solução contendo as nanopartícuias de ouro preparada no Exemplo 2; b) Adição do péptido fator de crescimento epidérmico (EGF), à concentração de 2,5 μΜ (em tampão fosfato salino pH 7.4), à solução de nanoparticulas de ouro, ácido hialurónico (5) e ácido oleico (6) (1:1:1, v/v/v), sob agitação a 800 rotações por minuto, durante 30 minutos, à temperatura ambiente e, posteriormente, em repouso a 4 °C; c) Centrifugação de l,820g a 7,200g da mistura obtida nos passos a) e b) , durante 15 minutos e conservação das nanoparticulas de ouro, em água purificada ou tampão fosfato salino. O nanossistema de ouro da invenção e produzido de acordo com o método descrito, foi caracterizado em termos de: a) Tamanho médio das partículas e índice de polidispersão (PI)
As nanoparticulas de ouro aqui descritas apresentam uma morfologia essencialmente esférica, com uma população monodispersa, com um tamanho médio de 100 nanómetros, índice de polidispersão de 0,2 e carga superficial média negativa (-19 mV). b) Comprimento de onda para a absorvância máxima da amostra ( λ-máx )
Foi obtido o espetro de absorção ótica da Figura 2 onde se pode observar um pico de absorção na gama ótima de terapia, ou seja, no infravermelho próximo (650 - 900 nanómetro). c) Morfologia e superfície das nanopartículas, por microscopia eletrónica de transmissão e analisados com uma tensão de aceleração de 10-20kV.
Foi obtida a imagem microscópica de transmissão electrónica da Figura 3, onde se observa a forma essencialmente esférica do nanossistema da invenção.
As nanopartículas de ouro que apresentam estruturas anisotrópicas não são favoráveis em termos de termodinâmica; contudo, quando associadas a agentes estabilizantes como, por exemplo, as biomoléculas presentes nos extratos de plantas, apresentam uma banda de absorção na região do infravermelho próximo na ordem dos 650 a 900 nanómetros.
As partículas preparadas segundo a invenção apresentam morfologia essencialmente esférica. Esta característica é relevante para cumprir o objetivo terapêutico da invenção. Se por um lado a morfologia esférica facilita a difusão celular do nanossistema, por outro, o facto de ocupar um pequeno volume faz com que o nanossistema tenha uma maior área de superfície de contacto com as células alvo. A atividade terapêutica do nanossistema de ouro da invenção é confirmada através de diversos ensaios, nomeadamente:
Ensaio de vectorização para a célula alvo, após a conjugação das nanopartículas de ouro com diferentes péptidos (Exemplo 4); - Teste de inocuidade das células não alvo através de ensaios de viabilidade celular sobre linhas celulares "normais"/ células não tumorais (Exemplo 5);
Ensaio de eficácia do nanossistema por análise da internalização celular em linhas celulares tumorais (Exemplo 6).
Exemplo 4
Comprovação da vectorização para a célula alvo
Para comprovar a vectorização do nanossistema para uma célula ou células alvo, são aqui apresentados dois ensaios das nanoparticulas de ouro conjugada com dois modelos de proteina/péptido, de cargas distintas. São feitos ensaios, um com fator de crescimento epidérmico (EGF - "epidermal growth factor") e outro com lisozima. A fim de preparar as nanopartículas de ouro conjugadas com os dois péptidos de diferentes cargas superficiais e massas moleculares, tanto o fator de crescimento epidérmico EGF como a lisozima, foram reconstituídos em tampão fosfato 20 mM (pH 7,4) a 10 μΜ e 2,5 μΜ, respetivamente. Em seguida, as três soluções (proteína/péptido, nanopartículas de ouro e solução polimérica) foram misturadas numa proporção de 1:1:1 (v/v/v) e deixou-se interagir durante 30 minutos à temperatura ambiente e 24 horas a 4°C, sem agitação. A solução foi centrifugada para remover péptidos não ligados e o nanossistema de ouro foram resuspensas em tampão fosfato pH 7,4.
As partículas do nanossistema de ouro apresentam um tamanho de cerca de 100-150 nanómetros (PI = 0,2), após análise de caracterização de partículas. 0 comprimento de onda de absorção das partículas foi de aproximadamente 800 - 830 nanómetros.
Após conjugação com o fator de crescimento epidérmico estas apresentaram uma banda de absorção aproximada aos 650 - 900 nanómetros. Após conjugação com fator de crescimento epidérmico, o potencial zeta das nanopartículas manteve-se negativo. A conjugação do fator de crescimento epidérmico às nanoparticulas também foi verificada através da visualização das mesmas através de microscópio confocal. Foi aplicada a técnica de "co-localização" com dois marcadores fluorescentes, cujos espectros de emissão apresentam comprimentos de onda distintos. As partículas do nanossistema de ouro foram marcadas com Coumarina-6, enquanto o fator de crescimento epidérmico utilizado para conjugação nestes estudos foi o fator de crescimento epidérmico marcado com Alexa Fluor 647. A presença de regiões em que há sobreposição de cores permitiu confirmar que o fator de crescimento epidérmico está conjugado ao nanossistema de ouro.
Estudaram-se também as possíveis modificações associadas à proteína lisozima e ao péptido fator de crescimento epidérmico, após exposição à radiação ultravioleta-B (foto-iluminação) , temperatura e após conjugação com as nanoparticulas de ouro. Os resultados obtidos através de ensaios com espectroscopia de fluorescência mostraram a iluminação contínua a 295 nanómetros (radiação utravioleta-B) da proteína lisozima e do péptido fator de crescimento epidérmico, no seu estado livre (ou seja, não conjugadas às nanoparticulas biopoliméricas) conduziu à diminuição da fluorescência dos resíduos aromáticos (espectros de excitação e emissão) e à formação de produtos fotoquímicos oxidativos (por exemplo, di-tirusina, quinurenina, N'-formil-quinurenina), provocando alterações na sua estrutura nativa. Por sua vez, a conjugação com nanopart iculas de ouro não induziu a desnaturação das proteínas. Além disso, as nanoparticulas de ouro promoveram a proteção tanto para a lisozima como para o fator de crescimento epidérmico, reduzindo a cinética de decaimento da fluorescência e, comparativamente, os efeitos de foto-oxidaçao e alteraçao de conformação/estrutura proteicas foram inferiores.
Exemplo 5
Comprovação da inocuidade das células não alvo A inocuidade das células não alvo é aqui comprovada através de ensaios de viabilidade celular sobre linhas celulares "normais"/ células não tumorais. Para tal, foram estudadas em linhas celulares de queratinócitos humanos (modelo HaCaT), através do método colorimétrico de brometo de tetrazolina. Inicialmente, avaliou-se a citotoxicidade do extrato isolado da planta da família Lamiaceae a diferentes concentrações e, posteriormente, das nanopartículas de ouro, com e sem conjugação com fator de crescimento epidérmico. As células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbelcco (DMEM - "Dulbelcco's modified Eagle médium") suplementado com 10% soro fetal bovino e solução de antibióticos (penicilina/estreptomicina, 1%). As células HaCaT foram semeadas em placa de 96 poços a uma densidade de 5000 células/poço. A solução aquosa de extrato da planta da família Lamiaceae foi preparada por diluição em dimetilsufóxido, com as seguintes concentrações finais: 0-500 pg/mL. 0 nanossistema de ouro foi também testado a diferentes concentrações: 0-80 μΜ (a partir da concentração de ouro). As células foram expostas aos diferentes tratamentos durante 24 horas. Após este período, as células foram lavadas com tampão fosfato salino pH 7.4 e incubadas com uma solução de brometo de tetrazolina (0,5 mg/mL em meio de cultura) durante 2,5 horas e a 37°C. Por último, o meio foi removido e as células foram lavadas com tampão fosfato salino pH 7.4. Uma alíquota de 200 pL de dimetilsuf óxido por poço foi adicionada para dissolver os cristais de formazan e a absorvância foi lida a 595 nanómetros. Foram realizados, para cada tratamento, três ensaios independentes, cada um composto por quatro réplicas. 0 extrato da planta usado apresentou valores elevados de viabilidade celular (> 80%, para concentração mais elevada, usada para a produção das nanopartículas de ouro) . Tanto as nanoparticulas de ouro conjugadas com fator de crescimento epidérmico, como as nanopartículas de ouro não conjugadas, demonstraram um valor elevado (> 70%) de viabilidade celular em modelo HaCaT.
Exemplo 6
Comprovação da eficácia do nanossistema de ouro
Para comprovar a eficácia das nanopartículas de ouro, foram realizados ensaios para verificar a internalização celular e ligação do nanossistema de ouro em linhas celulares tumorais. 0 ensaio foi realizado numa linha de células de carcinoma do pulmão (células A549).
Foram usadas nanopartículas de ouro conjugadas com fator de crescimento epidérmico em linhas de células A549, in vitro. Ο ensaio baseia-se na expressão da proteína fluorescente GFP ("green fluorescence protein"), que está acoplada aos recetores membranares da linha celular A549. Quando ocorre internalização, o recetor muda para a cor verde, sendo possível monitorizar in loco este processo.
As células foram cultivadas em poços e após 24 horas foram adicionados, para além do controlo (sem tratamento), as amostras em análise, nomeadamente: - Fator de crescimento epidérmico livre;
Fator de crescimento epidérmico-nanopartículas de ouro (fator de crescimento epidérmico marcado com Alexa Fluor 647) ;
Fator de crescimento epidérmico-nanopartícuias de ouro (duplamente marcadas: Alexa Fluor 647 para o péptido; Coumarina-6 para as nanopartículas de ouro).
Em alguns poços foi também previamente adicionado anticorpo neutralizante anti-EGFR ("primary mouse monoclonal antibody anti-EGFR neutralizer antibody LAI), de modo a avaliar o possível efeito competidor do fator de crescimento epidérmico livre, e o fator de crescimento epidérmico conjugado às nanopartículas de ouro. As células foram expostas aos vários tratamentos durante dois tempos diferentes, a 1,5 horas e a 3 horas, à temperatura de 37°C. Após este período, as células foram lavadas com tampão fosfato salino pH 7.4, para remover resíduos de péptido e partículas não internalizadas e foram analisadas.
Os resultados foram idênticos para ambos os ensaios. Observou-se que tanto o fator de crescimento epidérmico livre, como as nanopartículas de ouro conjugadas com fator de crescimento epidérmico internalizam ao final de l,5h em contacto com a linha celular de carcinoma do pulmão. Nestes ensaios foi igualmente possível verificar que as nanopartículas de ouro conjugadas com fator de crescimento epidérmico são internalizadas pelas células de forma eficiente, uma vez que acrescem nos mecanismos de ativação comparativamente ao fator de crescimento epidérmico isolado e também competem diretamente com o anticorpo anti-EGFR.
Os exemplos de aplicação anteriores visam confirmar a atividade do nanossistema da invenção e o seu importante potencial em terapia antitumoral.
Ao demonstrar através de ensaios a vectorização do nanossistema de ouro da invenção para o local de ação comprova-se que a invenção vem dar resposta à necessidade de nanoparticulas especificas e direcionadas para o desenvolvimento de uma terapêutica contra o cancro ou patologia dermatológica.
Por outro lado, ao confirmar através de ensaios a inocuidade do nanossistema de ouro da invenção para as células não alvo demonstra-se a segurança do nanossistema.
Finalmente, ao confirmar a internalização celular do nanossistema de ouro quando aplicado a uma linha celular de carcinoma humano de pulmão (linha A549), demonstra-se a biocompatibilidade do nanossistema da invenção e a sua adaptabilidade a condições patológicas diversas.
No entanto, os exemplos de aplicação anterior não devem ser interpretados como limitadores da vocação dos nanossistemas de ouro da invenção, podendo surgir aplicações futuras com o aprofundamento da investigação associada a estes compostos.

Claims (12)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Nanossistema de ouro caracterizado pelo facto de ser constituído por um núcleo metálico de ouro (1) com um extrato de planta (4) adsorvido à superfície como agente redutor e por um revestimento de um polímero (2) e de um péptido (3) e por apresentar uma morfologia essencialmente esférica.
  2. 2. Nanossistema de ouro de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo facto de a planta usada no extrato de planta (4) usado como agente redutor pertencer à família Lamiaceae.
  3. 3. Nanossistema de ouro de acordo com a reivindicação 1 e 2 caracterizado pelo facto de o polímero ser seleccionado entre o grupo constituído por polissacáridos, poliésteres ou poliamidas.
  4. 4. Nanossistema de ouro de acordo com a reivindicação 1 a 3 caracterizado pelo facto de o péptido ser seleccionado entre o grupo constituído pelo fator de crescimento epidérmico (EGF) e pela lisozima.
  5. 5. Nanossistema de ouro de acordo com a reivindicação 1 a 4 caracterizado pelo facto da gama de absorção no infravermelho próximo apresentar um máximo na ordem dos 650 a 900 nm.
  6. 6. Nanossistema de ouro de acordo com as reivindicações 1 a 5 para uso na fototerapia de tumores caracterizado pelo facto do nanossistema adquirir atividade terapêutica quando exposto à incidência de um laser ou de uma fonte de luz de aplicação similar por hipertermia.
  7. 7. Nanossistema de ouro de acordo com as reivindicações 1 a 6 para uso na fototerapia de tumores caracterizado pelo facto do nanossistema ser administrado localmente e ativado por hipertermia através da incidência de um laser ou de uma fonte de luz de aplicação similar.
  8. 8. Processo de preparação das nanopartículas de ouro constituintes do nanossistema de ouro das reivindicações 1 a 7, caracterizado por: a) Se dissolver o ácido cloroáurico numa concentração compreendida entre 0,2 e 1 mM durante 15 minutos a 24 horas; b) Se adicionar o extracto aquoso de planta da família Lamiaceae numa razão molar seleccionada entre o grupo 2:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:10 e 1:20; c) Se adicionarem agentes moduladores e co-adjuvantes no processo de redução do ouro.
  9. 9. Nanopartículas de ouro preparadas de acordo com a reivindicação 8 caracterizadas por conterem um núcleo metálico de ouro (1) e um extrato de planta (4) adsorvido à superfície do metal com função redutora.
  10. 10. Processo de preparação do nanossistema de ouro das reivindicações 1 e 7 caracterizado pelo fato de a solução de revestimento das nanopartículas de ouro ser preparada segundo os passos seguintes: a) Adição de uma solução de ácido hialurónico (5) e de ácido oleico (6) numa proporção de 1:1; b) Adição de um péptido seleccionado entre o grupo constituído por Fator de Crescimento Epidérmico (EGF) e Lisozima; c) Obtenção das partículas do nanossistema de ouro por centrifugação.
  11. 11. Nanossistema de ouro de acordo com as reivindicações 1 a 7, para uso na fototerapia de tumores caracterizado por os tumores serem seleccionados entre o grupo constituído por carcinomas da pele e tumor da mama.
  12. 12. Nanossistema de ouro de acordo com as reivindicações 1 a 7 para uso na fototerapia de tumores caracterizado por os tumores estarem localizados a mais de 5 centímetros de profundidade.
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