PT107018A - Síntese e uso de ciclamas com atividade antibacteriana - Google Patents

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE A SAIS DE CICLAMAS N-SUBSTITUÍDAS (I), SEU PROCESSO DE PREPARAÇÃO E SUA UTILIZAÇÃO COMO AGENTES ANTIBACTERIANOS. ESTES SAIS DE CICLAMAS N-SUBSTITUÍDAS (I) CONSTITUEM UMA NOVA FAMÍLIA DE COMPOSTOS COM PROPRIEDADES ANTIBACTERIANAS BASEADOS EM CICLAMAS N-SUBSTITUÍDAS QUE SÃO FACILMENTE SINTETIZADOS, COM RENDIMENTOS ELEVADOS. AS SUAS APLICAÇÕES POTENCIAIS ESTENDEM-SE DESDE A ÁREA DE SAÚDE HUMANA OU ANIMAL, COMO POR EXEMPLO, COMPONENTES DE SOLUÇÕES DESINFETANTES OU ANTIBIÓTICOS, PASSÍVEIS DE ADMINISTRAÇÃO ORAL, INTRAVENOSA OU INTRAMUSCULAR, INCLUINDO POTENCIAIS APLICAÇÕES NAS INDÚSTRIAS ALIMENTAR E COSMÉTICA, COMO POR EXEMPLO, SOLUÇÕES DESINFETANTES DE SUPERFÍCIES, COMPONENTES DE PRODUTOS DE HIGIENE PESSOAL, ENTRE OUTROS.

Description

DESCRIÇÃO

SÍNTESE E USO DE ClCLAMAS COM ATIVIDADE ANTIBACTERIANA

Campo da invenção

Campo técnico em que a invenção se insere A presente invenção diz respeito a sais de ciclamas N- substituídas (I) seu processo de preparação e sua utilização como agentes antibacterianos. Estes sais de ciclamas N-substituídas (I) constituem uma nova família de compostos com propriedades antibacterianas baseados em ciclamas N-substituídas, que são facilmente sintetizados, com rendimentos elevados. As suas aplicações potenciais estendem-se desde a área de saúde humana ou animal, como por exemplo, componentes de soluções desinfetantes ou antibióticos, passíveis de administração oral, intravenosa ou intramuscular, incluindo potenciais aplicações nas indústrias alimentar e cosmética, como por exemplo, soluções desinfetantes de superfícies, componentes de produtos de higiene pessoal, entre outros.

Estado da técnica

Os derivados das ciclamas apresentam propriedades antivirais, tendo merecido particular relevo as suas possíveis aplicações como agentes antivirais potencialmente efetivos no bloqueamento de centros ativos do vírus da imunodeficiência humana, HIV.[1]

Foram também descritas aplicações de compostos derivados de ciclama no tratamento de doenças neurológicas, cardiovasculares, endócrinas e noutras perturbações em mamíferos, mais especificamente doenças de Parkinson, Alzheimer, Lou Gehrig e Binswanger, degeneração olivo-l pontino cerebelar, corpos de Lewy, diabetes, acidentes cerebrais vasculares, arteriosclerose, isquemias, cardiomiopatias, nefropatias, glaucoma, presbiacusia, cancros, osteoporose, artrite reumatoide, inflamações intestinais, esclerose múltipla e antídotos à exposição a toxinas. [2] Não se encontra descrita na literatura qualquer aplicação para as ciclamas e seus derivados (sob a forma de sais) como agentes antibacterianos. Os agentes antibacterianos comercialmente disponíveis, vulgarmente designados por antibióticos, são por definição, compostos produzidos por seres vivos, geralmente bactérias e fungos.[3] 0 nome antibiótico é também usado vulgarmente para designar compostos que são derivados dos antibióticos por introdução de grupos funcionais por síntese química - os antibióticos semi-sintéticos, sendo a denominação também muitas vezes usada para designar compostos obtidos exclusivamente por síntese química - os designados antibióticos sintéticos.

Na presente invenção, a palavra antibiótico é usada no sentido lato do termo, independentemente da sua origem biológica ou sintética. Os antibióticos têm como grandes áreas de aplicação a saúde humana e animal. 0 seu uso é predominantemente terapêutico, para combater e erradicar infeções, embora existam várias situações de aplicação profilática. Um composto é considerado um antibiótico quando concentrações da ordem dos mg/1 são suficientes para observar o seu efeito.

Os antibióticos atualmente disponíveis comercialmente podem ser agrupados em classes, com base na sua estrutura química. Assim, são atualmente conhecidos e comercializados 2 antibióticos de origem natural, semi-sintéticos ou de síntese química, pertencentes às seguintes classes: sulfonamidas, beta-lactâmicos, policétidos, aminoglicósidos, macrólidos, glicopétidos, quinolonas, estreptograminas, oxazolidinonas e lipopéptidos.[3]

Apesar da diversidade estrutural dos antibióticos comercialmente disponíveis, é descrito o isolamento de um número crescente de microrganismos resistentes a múltiplos antibióticos, quer de origem hospitalar quer da comunidade, o que torna cada vez mais limitada a eficácia dos antibióticos no tratamento de infeções microbianas. Acresce que o desenvolvimento de resistências torna muitas vezes o agente infecioso resistente não só ao antibiótico específico, mas a todos os antibióticos da mesma classe. Os casos mais graves prendem-se com o fenómeno de desenvolvimento ou aquisição de resistência a múltiplos antibióticos, como é o caso das estirpes de Staphylococcus aureus resistentes a meticilina e a todos os antibióticos beta-lactâmicos, conhecidas por Staphylococcus aureus resistentes a meticilinas (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus - MRSA).[4] São vários os mecanismos conhecidos envolvidos na resistência dos microrganismos aos antibióticos. [5] De uma forma geral estes podem envolver: 1) destruição do antibiótico por ação de enzimas produzidas pelo microrganismo, tornando-o resistente ao antibiótico, 2) ocorrência de mutações que levam à alteração da molécula alvo a que o antibiótico se liga para exercer a sua atividade antimicrobiana, 3) alterações ao nível da composição da parede ou membrana celulares que resultam na 3 incapacidade do composto para difundir para dentro das células e exercer a sua função inibitória.

Contudo, os casos mais complicados de desenvolvimento de resistência a antibióticos consistem na ativação de mecanismos que permitem a expulsão ativa dos antibióticos do interior das células. Este fenómeno, conhecido por resistência a múltiplas drogas, é o responsável pela resistência de alguns microrganismos a antibióticos não relacionados estruturalmente, tornando ineficazes muitos dos antibióticos disponíveis comercialmente.[6] Além disso tem-se ainda verificado nos últimos anos o crescente desinvestimento das companhias farmacêuticas no desenvolvimento de novos antibióticos.[7]

Assim, a descoberta de novas moléculas com atividade antimicrobiana, que constituam uma alternativa aos desinfetantes e/ou antibióticos comercialmente disponíveis, reveste-se de enorme importância.

Neste contexto, os sais derivados de ciclamas N-substituídas (I), objeto da presente invenção, diferem do ponto de vista estrutural das várias classes de antibióticos disponíveis comercialmente. Constituem assim uma nova classe de antibióticos. As suas aplicações potenciais estendem-se desde a área de saúde humana e animal (e.g. componentes de soluções desinfetantes ou antibióticos, passíveis de administração oral, intravenosa ou intramuscular), incluindo potenciais aplicações nas indústrias alimentar e cosmética (sob a forma de soluções desinfetantes de superfícies, componentes de produtos de higiene pessoal, entre outras) . Os sais de ciclamas N-substituídas (I) podem assim ser utilizados no fabrico de soluções, ou géis, ou suspensões, ou sólidos ou pós para o 4 combate ou prevenção de infeções bacterianas causadas por bactérias Gram-positivas e/ou Gram-negativas. Podem também ser utilizados no fabrico de composições farmacêuticas contendo um ou mais sais de ciclamas N-substituidas (I), podendo essas formulações compreender igualmente outro antibiótico. Podem ainda ser usadas em composições de limpeza ou cosméticas contendo um ou mais sais de ciclamas N-substituidas (I) , em formulações contendo tensioativos, ou perfumes, ou corantes ou combinações de gualguer um destes agentes. Os sais de ciclamas N-substituidas (I) objeto da presente invenção podem ser utilizados em composições farmacêuticas contendo um ou mais sais de ciclamas N-substituidas (I), contendo um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, ou compreender igualmente um anti-inflamatório, ou um analgésico ou a combinação de qualquer um destes agentes, para uso em aplicações terapêuticas em medicina humana ou veterinária.

Neste contexto, as ciclamas e seus derivados sob a forma de sais, constituem uma nova classe de compostos antibacterianos para a qual necessariamente não se encontram descritas resistências.

Resumo da invenção 0 objeto da presente invenção refere-se a sais de ciclamas N-substituidas (I), seu processo de preparação e sua utilização como agentes antibacterianos. Estes sais de ciclamas N-substituidas (I) são preparados por reação dos derivados de ciclama correspondentes com ácidos orgânicos, inorgânicos ou sais de amónio, ou por troca de aniões a partir de sais de ciclamas N-substituidas (I) com outros sais inorgânicos ou orgânicos, e ao seu uso como agentes antibacterianos no combate a bactérias Gram-positivas e 5

Gram-negativas em formulações várias com aplicações desde a terapêutica humana e animal, à cosmética e a produtos de higiene e de limpeza e desinfeção. Assim, estes novos compostos são obtidos através de procedimentos sintéticos muito simples relativamente aos processos de síntese e purificação dos antibióticos disponíveis comercialmente. Os sais de ciclamas N-substituídas (I) objeto da presente invenção podem, deste modo, ser preparados com vantagens económicas sobre os antibióticos disponíveis comercialmente.

Os resultados obtidos indicam uma baixa toxicidade no modelo eucarionte multicelular Caenorhabd.it is elegans (C. elegans), o que revela o seu potencial uso terapêutico.

Descrição detalhada da invenção 0 objeto da presente invenção refere-se a sais de ciclamas N-substituídas (I) com a fórmula geral [HaHbHcHd{ (RR'R' ' R" ' ) Ciclama} ] Xe. (Y) f, onde: i) R, R', R'' e R''' são iguais ou diferentes e representam um átomo de hidrogénio ou um grupo funcional, contendo pelo menos um átomo de carbono até um máximo de 50 átomos de carbono ligados ao átomo de azoto através de ligações simples; ii) a, b, c e d tomam valores de 0 e 1, em que pelo menos a ou b ou c ou d é 1; iii) X representa um anião halogeneto ou qualquer outro anião orgânico, contendo pelo menos um átomo de carbono, ou inorgânico, contendo pelo menos um átomo de enxofre, ou oxigénio, ou fósforo, ou azoto ou boro; iv) e toma valores de 1, 2, 3, ou 4: 1 quando a + b + c + d é 1 e X um monoanião, 1 ou 2 se X for dianião 6 ou monoanião, respetivamente, quando a+b+c+dé 2, 1 ou 3 se X for trianião ou monoanião, respetivamente, quando a+b+c+dé 3, 2 ou 4 se X for dianião ou monoanião, respetivamente, quando a+b+c+dé 4; v) Y representa uma molécula de co-cristalização, tal como água, dimetilsulfóxido, dimetilformamida, alcoóis, cetonas, nitrilos, éteres, ésteres, ácidos, halogenetos de alquilo ou arilo; vi) f toma valores de 0 a 3.

De acordo com a presente invenção , 0 processo para a preparação dos sais de ciclamas N-substituídas (I) é vantajoso, uma vez que permite obter produtos puros partindo de ciclama ou dos seus derivados mono-, di -, tri- ou tetra-N-substituídos, os quais podem ser sintetizados a partir de procedimentos bem estabelecidos na literatura.[8]

Os sais de ciclamas N-substituidas (I), objeto da presente invenção, são preparados por reação dos derivados de ciclama correspondentes com ácidos orgânicos, inorgânicos ou sais de amónio, ou por troca de aniões a partir de sais de ciclamas N-substituidas (I) com outros sais inorgânicos ou orgânicos.

As reações destes compostos com ácidos orgânicos, inorgânicos ou sais de amónio dão origem a espécies catiónicas por reação com o(s) átomo(s) de azoto do macrociclo, apresentando como contra-iões os aniões provenientes dos ácidos. Sais de ciclama ou dos seus derivados são também obtidos a partir de outros previamente preparados por troca de aniões. Os rendimentos de síntese dos sais de ciclama e seus derivados são muito elevados ou 7 quantitativos. Os sais de ciclamas N-substituidas (I) obtidos são suficientemente solúveis em água ou noutros solventes polares contendo um ou mais átomos de carbono permitindo a sua utilização em solução aquosa. A estabilidade dos sais de ciclamas N-substituidas (I) permite uma fácil manipulação, facilitando a sua formulação para o fabrico de soluções, ou géis, ou suspensões, ou sólidos ou pós para o combate ou prevenção de infeções bacterianas Gram-positivas e/ou Gram-negativas com aplicação em produtos de limpeza e/ou cosméticos e/ou farmacêuticos para uso humano e/ou veterinário. Estas formulações podem compreender igualmente um tensioativo, um perfume, um corante, um anti-inflamatório, um analgésico, um antibiótico ou a combinação de qualquer um destes agentes, bem como excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Os sais de ciclamas N-substituidas (I) podem ser obtidos por evaporação do solvente, ou através de técnicas de cristalização simples nas suas formas solvatada ou não-solvatada apresentando formas cristalinas contendo ou não moléculas de co-cristalização, tais como, água, dimetilsulfóxido, dimetilformamida, alcoóis, cetonas, nitrilos, éteres, ésteres, ácidos, halogenetos de alquilo ou arilo.

As técnicas de solvente, adição sementeira ou a anteriores. cristalização incluem evaporação do de um não solvente, adição de uma combinação de quaisquer das técnicas A forma cristalina do sal de ciclama N-substituída (I) , aqui designado a titulo de exemplo, por [H2{H2(4" CF3Bn) 2Ciclama} ] (CH3C00) 2 · (CH3COOH) 2 cristaliza no grupo espacial P-l do sistema triclinico com os parâmetros de malha a = 8.5975(8) Â, b = 9.6029(8) À, c = 11.6367(10) Â, oí = 74.165(4)2, β = 86.798(5) 2, Y = 86.611(4)2. A forma cristalina do sal de ciclama N-substituida (I), aqui designado a titulo de exemplo, por [H{H2(4~

Bn) 2Ciclama}]Br cristaliza no grupo espacial P-l do sistema triclinico com os parâmetros de malha a = 9.1256(7) Â, b = 15.234(1) Â, c = 21.110(2) Â, oí = 75.007 (4) 2, β = 84.435 (4) 2, γ = 81.024 (4)2. A forma cristalina do sal de ciclama N-substituida (I) , aqui designado a titulo de exemplo, por [H{H2(3,5~ MeBn)2Ciclama}]Br cristaliza no grupo espacial Έΐχ/η do sistema monoclínico com os parâmetros de malha a = 7.6293(8) Â, b = 14.578(1) Â, c = 24.648(2) Â, oí = 902, β = 90.975 (3) 2, γ = 902 . A resolução das estruturas moleculares dos sais de ciclama foi efetuada através de dados de difração de raios-X em monocristal (DRXMC). Os dados foram recolhidos a 150K num difratómetro Bruker-AXS ΚΑΡΡΑ ΑΡΕΧ II com radiação monocromática de molibdénio (Kcx, λ = 0.71069 Â) . O gerador de raios-X foi operado a 50 kV e 30 mA e a recolha de dados foi monitorizada pelo programa SMART. Todos os dados foram corrigidos para minimizar os efeitos de polarização, absorção e de Lorentz, utilizando os programas utilizados correntemente no tratamento e refinamento de dados estruturais de difração de raios-X, SAINT e SADABS. A resolução das estruturas foi efetuada através dos programas SIR e o seu refinamento foi baseado no método da 9 matriz dos mínimos quadrados em F2 por intermédio do programa SHELX-97.

Todos os átomos, excluindo os hidrogénios, foram refinados anisotropicamente. Os átomos de hidrogénio foram acrescentados em posições calculadas e refinados com base na geometria dos seus átomos hospedeiros, exceto os hidrogénios pertencentes aos átomos de azoto que foram encontrados no mapa de densidade eletrónica. Através desta análise são conhecidos as distâncias e os ângulos de ligação das moléculas, bem como as respetivas conformações.

Os testes biológicos foram efetuados usando procedimentos previamente descritos na literatura.[ 9] De entre os compostos alvo da presente invenção selecionou-se [H2{H2(4~ CF3Bn) 2Ciclama} ] (CH3COO)2 para ilustrar as propriedades antimicrobianas. Os resultados mostram atividade antibacteriana para Escherichia coli (E.coli) e Bacillus subtilis (B. subtilis) como exemplo de uma bactéria Gram-negativa e de uma Gram-positiva, respetivamente. Estes resultados estão representados na Figura 2.

Os resultados evidenciam o efeito da concentração do sal de ciclama [H2 {H2 (4~CF3Bn) 2Ciclama} ] (CH3COO) 2 na densidade ótica das culturas, obtidos ao fim de 20h. 0 efeito antibacteriano foi ainda confirmado determinando o número de unidades formadoras de colónias (UFC), por espalhamento na superfície de placas de Petri contendo meio de cultura, de alíquotas de 100 microlitros das culturas efetuadas durante 20 h na presença de diferentes concentrações do sal de ciclama. Os resultados obtidos, mostrados na Figura 3, evidenciam uma elevada atividade antibacteriana para concentrações da ordem dos 50 mg/1, concentração da mesma 10 ordem de grandeza da utilizada para os antibióticos disponíveis comercialmente. A toxicidade foi analisada usando como modelo de toxicidade o nemátodo Caenorhabditis elegans. Este nemátodo é um organismo multicelular largamente usado como modelo de toxicidade.[10] Os resultados obtidos, apresentados na Figura 4, mostram que o sal de ciclama [H2{H2(4_ CF3Bn) 2Ciclama} ] (CH3COO)2 não afeta a capacidade reprodutiva do nemátodo Caenorhabditis elegans quando presente em concentrações até 50 mg/1. Apenas para concentrações iguais ou superiores a 100 mg/1 foram observados efeitos negativos na reprodução do nemátodo Caenorhabditis elegans, o que demonstra a sua baixa toxicidade para concentrações até 50 mg/1.

Os sais de ciclamas N-substituídas (I), objeto da presente invenção, podem assim ter aplicações terapêuticas em medicina humana ou veterinária, para o combate de infeções, causadas por bactérias Gram-positivas e bactérias Gram-negativas. Os sais de ciclamas N-substituídas (I) podem ser utilizados no fabrico de soluções, ou géis, ou suspensões, ou sólidos ou pós para uso no tratamento ou prevenção de infeções bacterianas. Podem ser usados em composições de soluções de limpeza ou cosméticas contendo um ou mais sais de ciclamas N-substituídas (I) , em soluções contendo igualmente um tensioativo, ou um perfume, ou um corante ou a combinação de qualquer um destes agentes. Podem ainda ser usados em composições farmacêuticas contendo um ou mais sais de ciclamas N-substituídas (I), em conjunto com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, como os que são utilizados em geral na técnica. Podem também ser usados em composições farmacêuticas contendo um ou mais sais de 11 ciclamas N-substituídas (I), igualmente um anti-inflamatório, ou um analgésico ou a combinação de qualquer um destes agentes. Podem ainda ser utilizados no fabrico de medicamentos para o tratamento ou prevenção de infeções bacterianas, em composições farmacêuticas contendo um ou mais sais de ciclamas N-substituidas (I), e igualmente um outro antibiótico.

Descrição das figuras A Figura 1 representa os sais de ciclamas N-substituídas (I) com a fórmula geral [HaHbHcHd{ (RR'R' ' R' ' ' ) Ciclama} ] Xe. (Y)f, onde i) R, R', R" e R' '' são iguais ou diferentes e representam um átomo de hidrogénio ou um grupo funcional, contendo pelo menos um átomo de carbono até um máximo de 50 átomos de carbono ligados ao átomo de azoto através de ligações simples; ii) a, b, c e d tomam valores de 0 e 1, em que pelo menos a ou b ou c ou d é 1; iii) X representa um anião halogeneto ou qualquer outro anião orgânico, contendo pelo menos um átomo de carbono, ou inorgânico, contendo pelo menos um átomo de enxofre, ou oxigénio, ou fósforo, ou azoto ou boro; iv) e toma valores de 1, 2, 3, ou 4: 1 quando a+b+c+déle X um monoanião, 1 ou 2 se X for dianião ou monoanião, respetivamente, quando a+b+c+dé2, lou3seX for trianião ou monoanião, respetivamente, quando a + b + c + d é 3, 2 ou 4 se X for dianião ou monoanião, respetivamente, quando a+b+c+dé4; v) Y representa uma molécula de co-cristalização, tal como água, dimetilsulfóxido, dimetilformamida, alcoóis, cetonas, nitrilos, éteres, ésteres, ácidos, halogenetos de alquilo ou arilo; vi) f toma valores de 0 a 3. 12 A Figura 2 representa o valor da densidade ótica de culturas de Escherichia coli e Bacillus subtilis após 20h de crescimento a uma temperatura de 372C com agitação em meio mínimo BM2 (Basic Médium 2, contendo 62 mM fosfato de potássio, pH 7,4, 0,5 mM MgS04, 0,5 mM casaminoácidos e 0,4% (p/v) glucose) na presença das concentrações indicadas do sal de ciclama [H2 {H2 (4_CF3Bn) 2Ciclama} ] (CH3COO)2. O eixo das ordenadas refere-se a valores de densidade ótica (DO) medidos ao comprimento de onda (c.d.o.) de 640 nm, e o eixo das abcissas refere-se à concentração do sal de ciclama [H2{H2 (4^CF3Bn) 2Ciclama} ] (CH3COO)2, expressa em pg/ml. A Figura 3 mostra o efeito da concentração de sal de ciclama [H2 {H2 (4 CF3Bn) 2Ciclama} ] (CH3COO) 2 no número de unidades formadoras de colónias (CFU) de culturas de Escherichia coli e Bacillus subtilis após 2 Oh de cultura a uma temperatura de 372C na presença das concentrações indicadas do sal de ciclama. O eixo das ordenadas refere-se ao número de unidades formadoras de colónias por mililitro, expressa em CFU/ml e o eixo das abcissas refere-se à concentração do sal de ciclama [H2 {H2 (4 CF3Bn) 2Ciclama} ] (CH3COO)2, expressa em pg/ml. A Figura 4 mostra a percentagem de nemátodos sobreviventes após cultivo durante 4 dias na presença das concentrações indicadas do sal de ciclama [H2{H2(4“ CF3Bn) 2Ciclama} ] (CH3COO)2. O eixo das ordenadas refere-se à percentagem de nemátodos sobreviventes para diversas concentrações de [H2 {H2 (4_CF3Bn) 2Ciclama} ] (CH3COO) 2, expressa em %. O eixo das abcissas refere-se ao tempo, expresso em dias. 13

As Figuras 5, 6, 7 e 8 mostram as estruturas moleculares de [H2{H2 (4~CF3Bn) 2Ciclama} ] (CH3COO)2, [H{H2 (4~CF3Bn) 2Ciclama} ] Br e [H{H2 (3,5_MeBn) 2Ciclama} ] Br, [H (H2Bn2Ciclama) ] Cl, respetivamente.

Exemplos

Exemplo 1: [H2{H2 (4_CF3Bn) 2Ciclama} ] (CH3COO) 2 0.87 g (1.68 mmol) de H2 (4~CF3Bn) 2Ciclama foram dissolvidos em 20 mL de ácido acético glacial. A solução foi aquecida a refluxo durante a noite. Após evaporação do solvente à secura, o composto [H2 {H2 (4_CF3Bn) 2Ciclama} ] (CH3COO) 2 foi obtido quantitativamente sob a forma de um sólido branco cristalino. A estrutura molecular encontra-se representada na Figura 5. 2H RMN (CDC13, 300.1 MHz, 298K): δ (ppm) 9.38 (d, 2 Jh-h = 41 Hz, 4H, NH2+) , 7.55 (d, 3JH-h = 8 Hz, 4H, Pb), 7.30 (d, 3Jh-h = 8 Hz, 4H, Pb), 3.87 (s, 4H, PhCb2N) , 3.08 (sobreposição, 8H total, 4H, [C3]Cb2N e 4H, [C2]Cb2N), 2.73 (m, 4H, [C2]CH2N), 2.65 (m, 4H, [C3]Cb2N), 1.97 (sobreposição, 10H total, 4H, CH2Cb2CH2 e 6H, CH3C00~) . 13C{1H} RMN (CDCls, 75.5 MHz, 298K): δ (ppm) 176.8 (CH3COO“) , 139.0 (i-PbCH2N), 130.7 (o-PbCH2N), 129.6 (p-PbCH2N, 2JC-F = 31 Hz), 125.2 (m-PbCH2N, 3JC-F = 4 Hz), 125.9 (CF3, 4JC-F = 272 Hz), 53.7 (PhCB2N) , 50.8 ([C3]CH2N), 49.1 ([C2]CH2N), 48.1 ( [ C 3 ] CH2N ou [C2 ] CH2N) , 45.9 ([C3]CH2N ou [C2]CH2N), 23.1 (CH2CH2CH2), 22.7 (CH3COO~). 19F RMN (CDC13, 282.4 MHz, 298K) : δ (ppm) -62.6 (s) . Análise Elementar para C3oH42F 5N4O4. (CH3COOH)2: Téorico: C, 53.96; H, 6.66; N, 7.40. Obtido: C, 54.17; H, 6.50; N, 8.07. Parâmetros da malha: a = 8.5975(8) Â, b = 9.6029(8) Â, c = 11.6367(10) Â, α = 74.165(4)2, β = 86.798 (5) 2, γ = 86.611(4)2. 14

Exemplo 2 : [H{H2 (4_CF3Bn) 2Ciclama} ] Br 0 composto [H{H2 (4_CF3Bn) 2Ciclama} ]Br foi obtido por um procedimento análogo ao que se descreve no Exemplo 1 utilizando uma solução aquosa de brometo de hidrogénio (HBr) em vez de ácido acético. A evaporação lenta da solução levou à formação de cristais cuja estrutura está apresentada na Figura 6. Parâmetros da malha: a = 9.1256(7) Â, b = 15.234(1) Â, c = 21.110(2) Â, α = 75.007(4)2, β = 84.435 (4)2, γ = 81.024 (4)2.

Exemplo 3 : [H{H2 (3,5_MeBn) 2Ciclama} ] Br O composto [H{H2 (3,5_MeBn) 2Ciclama} ] Br foi obtido nas mesmas condições descritas no Exemplo 2. A estrutura molecular do composto está representada na Figura 7. Parâmetros da malha: a = 7.6293(8) Â, b = 14.578(1) Â, c = 24.648(2) Â, α = 902, β = 90.975 (3) 2, γ = 902 .

Exemplo 4 : [H (H2Bn2Ciclama) ] Cl. H20 O composto [H (H2Bn2Ciclama) ] Cl foi preparado de modo análogo ao que se descreve nos Exemplos 2 e 3 utilizando ácido clorídrico (HC1) em vez de HBr. Cristais de [H {H2Bn2Ciclama} ] Cl. H20 foram obtidos por evaporação lenta da solução. A estrutura molecular do composto está representada na Figura 8. Parâmetros da malha: a 7.5367(8) Â, b = 9.221(1) À, c = 17 .938(2) Â, α = 94.925(5) 2, β = 100.772 (5)2, γ = 100.359 (5) a .

Exemplo 5: Testes de avaliação da atividade antimicrobiana

Para a avaliação da atividade antibacteriana dos compostos foram efetuadas culturas de Escherichia coli oí-DH5 e de Bacillus subtilis durante 20 horas, partindo de uma colónia isolada de cada uma das estirpes, que foi transferida para 15 meio líquido de cultura LB (Lennox Broth, Pronadisa, Espanha), e incubada a 37 2C com agitação durante o tempo indicado. Após este procedimento, foram preparadas culturas de cada uma das estirpes em estudo para as quais se ajustou a densidade ótica inicial a 0,1, determinada ao comprimento de onda (c.d.o.) de 640 nm. Foi usado meio mínimo BM2 (Basic Médium 2, contendo 62 mM fosfato de potássio pH 7,4, 0,5 mM MgS04, 0,5 mM casaminoácidos e 0,4% (p/v) glucose) ao qual se adicionaram diferentes concentrações finais (0 -300pg/ml) do sal de ciclama [H2{H2(4_ CF3Bn) 2Ciclama} ] (CH3COO)2. Seguiu-se a evolução da densidade ótica como medida da concentração de células ao longo do tempo, usando microplacas de 96 poços (placas de poliestireno, Greiner Bio-One, volume total por poço 200 microlitros). As microplacas foram incubadas a 372C durante 20h com agitação orbital (250 rpm). A concentração celular foi determinada indiretamente medindo a densidade ótica das culturas ao c.d.o. de 640 nm usando um leitor de microplacas VERSAmax (VERSAmax tunable microplate reader).

Exemplo 6: Testes de toxicidade

Nos testes de toxicidade foi usada a estirpe selvagem C. elegans Bristol N2. Os nemátodos foram transferidos para uma placa de Petri contendo meio de crescimento de nemátodos (NGM) onde se tinham inoculado previamente uma cultura de E. coli OP50, e foram mantidos a 202C até se observar na superfície da placa um elevado número de ovos depositados pelos nemátodos (cerca de 3-4 dias). Os vermes e os ovos foram então recolhidos e tratados com uma solução contendo hipoclorito de sódio e soda caustica de modo a sincronizar os vermes, de acordo com procedimentos descritos na literatura.[9-a] As suspensões de ovos obtidas foram espalhadas em placas de Petri contendo meio de 16 cultura NGM (Nematode Growth Médium) e E. coli OP50 previamente crescidas durante 24 horas, de modo a permitir o eclodir sincronizado dos nemátodos e o seu desenvolvimento até à fase larvar L4 (que ocorre cerca de 42h após a eclosão e cultura a 202C) . [10-b] Os meios de cultura em que se avaliou o efeito do sal de ciclama [H2{H2 (4 CF;3Bn) 2Ciclama} ] (CH3COO) 2 na sobrevivência e reprodução dos vermes foram preparados como se descreve: sumariamente, alíquotas de 100 μΐ de uma cultura de E. coli OP50 crescida durante uma noite e morta por autoclavagem a 1212C durante 15 minutos foram diluídas de modo a obter uma suspensão com densidade ótica de 2.0, a qual foi espalhada na superfície de placas de Petri de 35 mm de diâmetro contendo 4 ml de meio de crescimento de nemátodos II (NGMII) e cinco concentrações do sal de ciclama (0, 25, 50, 100 e 200 yg/ml). Aproximadamente 20 nemátodos na fase larvar L4 (que corresponde à fase de desenvolvimento larvar em que os nemátodos se encontram após eclosão e cultura a 202C por 42 horas) de C. elegans Bristol N2, sincronizados como descrito atrás, foram colocados em cada placa e incubados a 2 02C. O número de nemátodos vivos foi determinado usando uma lupa Stemi 2000-C (Zeiss), com uma ampliação de 50x. Os nemátodos foram considerados mortos após se ter verificado ausência de resposta ao toque. Após 4 dias a capacidade de reprodução foi avaliada por contagem dos nemátodos totais. Os valores obtidos para o número de nemátodos totais contados após 4 dias de cultura na presença de diferentes concentrações do sal de ciclama [H2{H2 (4_CF3Bn) 2Ciclama} ] (CH3COO) 2 foram divididos pelo número total de nemátodos contados para o respetivo controlo em meio sem adição do sal de ciclama. Foi efetuado um número mínimo de 10 repetições para cada condição experimental. 17

Os sais derivados de ciclamas N-substituidas (I), objeto da presente invenção, constituem assim uma nova classe de antibióticos. As suas aplicações potenciais estendem-se desde a área de saúde humana e animal (e.g. componentes de soluções desinfetantes ou antibióticos, passíveis de administração oral, intravenosa ou intramuscular) , incluindo potenciais aplicações nas indústrias alimentar e cosmética (sob a forma de soluções desinfetantes de superfícies, componentes de produtos de higiene pessoal, entre outras). Os sais de ciclamas N-substituidas (I) podem assim ser utilizados no fabrico de soluções, ou géis, ou suspensões, ou sólidos ou pós para o combate ou prevenção de infeções bacterianas causadas por bactérias Gram-positivas e/ou Gram-negativas. Podem também ser utilizados no fabrico de composições farmacêuticas contendo um ou mais sais de ciclamas N-substituídas (I), podendo essas formulações compreender igualmente outro antibiótico. Podem ainda ser usadas em composições de limpeza ou cosméticas contendo um ou mais sais de ciclamas N-substituídas (I), em formulações contendo tensioativos, ou perfumes, ou corantes ou combinações de qualquer um destes agentes. Os sais de ciclamas N-substituídas (I) objeto da presente invenção podem ser utilizados em composições farmacêuticas contendo um ou mais sais de ciclamas N-substituídas (I), contendo um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, ou compreender igualmente um anti-inflamatório, ou um analgésico ou a combinação de qualquer um destes agentes, para uso em aplicações terapêuticas em medicina humana ou veterinária.

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Lisboa, 20 de Junho de 2013. 20

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES Sais de ciclamas N-substituídas caracterizados pela fórmula geral (I), em que: R

   (I) a) R, R' , R' ' e R' ' ' são iguais ou diferentes e representam um átomo de hidrogénio ou um grupo funcional, contendo pelo menos um átomo de carbono até um máximo de 50 átomos de carbono ligados ao átomo de azoto através de ligações simples; b) a, b, c e d tomam valores de 0 e 1, em que pelo menos a ou b ou c ou d é 1; c) X representa um anião halogeneto ou qualquer outro anião orgânico, contendo pelo menos um átomo de carbono, ou inorgânico, contendo pelo menos um átomo de enxofre, ou oxigénio, ou fósforo, ou azoto ou boro; d) e toma valores de 1, 2, 3, ou 4: 1 quando a + b + c+dé 1 eXum monoanião, 1 ou 2 se X for dianião ou monoanião, respetivamente, quando a + b + c + d é 2, 1 ou 3 se X for trianião ou monoanião, respetivamente, quando a+b+c+dé 3, 2 ou 4 se X for dianião ou monoanião, respetivamente, quando a+b+c+dé4; e) Y representa uma molécula de co-cristalização, tal como água, dimetilsulfóxido, dimetilformamida, alcoóis, cetonas, nitrilos, éteres, ésteres, ácidos, halogenetos de alquilo ou arilo; f) f toma valores de 0 a 3.
2. 2. Processo de preparação dos sais de ciclamas N- substituídas (I) definidos na reivindicação 1, caracterizado por serem obtidos através da reação dos derivados de ciclama correspondentes com ácidos orgânicos, inorgânicos ou sais de amónio, ou por troca de aniões a partir de sais de ciclamas N-substituidas (I) com outros sais inorgânicos ou orgânicos.
3. 3. Processo de preparação dos sais de ciclamas N- substituídas (I), de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por se dissolverem em água, ou noutro solvente polar contendo um ou mais átomos de carbono.
4. 4. Processo de preparação dos sais de ciclamas N- substituidas (I), de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por cristalizarem por evaporação do solvente, ou por adição de um não solvente, ou por adição de uma sementeira ou por combinação de quaisquer das técnicas anteriores.
5. 5. Forma cristalina de [H2 (¾ (4 CF3Bn) 2Ciclama) ] (CH3COO) 2 · (CH3COOH) 2 do sal de ciclama N-substituida (I), tal como definido na reivindicação 1, caracterizada por cristalizar no grupo espacial P-l do sistema triclinico com os parâmetros de malha a = 2 8.5975(8) Â, b = 9.6029(8) Â, c = 11.6367(10) Â, α = 74.165(4)2, β = 86.798 (5) 2, γ = 86.611(4)2.
6. 6. Forma cristalina de [H (H2 (4_CF3Bn) 2Ciclama) ] Br do sal de ciclama N-substituída (I), tal como definido na reivindicação 1, caracterizada por cristalizar no grupo espacial P-l do sistema triclínico com os parâmetros de malha a = 9.1256(7) Â, b = 15.234(1) Â, c = 21.110(2) Â, α = 75.007(4) 2, β = 84.435(4) 2, γ = 81.024(4)2.
7. 7. Forma cristalina de [H (H2 (3,5_MeBn) 2Ciclama) ] Br do sal de ciclama N-substituída (I), tal como definido na reivindicação 1, caracterizada por cristalizar no grupo espacial P2i/n do sistema monoclinico com os parâmetros de malha a = 7.6293(8) Á, b = 14.578(1) Á, c = 24.648 (2) Â, α = 902, β = 90.975(3) 2, γ = 902 .
8. 8. Composições de limpeza ou cosméticas, contendo um ou mais sais de ciclamas N-substituídas (I), tal como definidos na reivindicação 1, caracterizadas por compreenderem igualmente um tensioativo, ou um perfume, ou um corante ou a combinação de qualquer um destes agentes.
9. 9. Composições farmacêuticas, contendo um ou mais sais de ciclamas N-substituídas (I), tal como definidos na reivindicação 1, caracterizadas por compreenderem um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
10. 10. Composições farmacêuticas, contendo um ou mais sais de ciclamas N-substituídas (I), de acordo com a reivindicação 9, caracterizadas por compreenderem 3 igualmente um anti-inflamatório, ou um analgésico ou a combinação de qualquer um destes agentes.
11. 11. Composições farmacêuticas de acordo com as reivindicações 9 e 10, caracterizadas por compreenderem igualmente outro antibiótico.
12. 12. Utilização dos sais de ciclamas N-substituidas (I), tal como definidos na reivindicação 1, caracterizado por ter aplicações terapêuticas em medicina humana ou veterinária.
13. 13. Utilização dos sais de ciclamas N-substituídas (I), de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por serem utilizadas no: a) fabrico de soluções, ou géis, ou suspensões, ou sólidos ou pós para o combate ou prevenção de infeções bacterianas causadas por bactérias Gram-positivas e Gram-negativas; b) fabrico de medicamentos para o tratamento ou prevenção de infeções bacterianas. Lisboa, 20 de Junho de 2013. 4