PT104739B

PT104739B - Xantonas sulfatadas e análogos xantónicos glicosilados sulfatados com actividade anticoagulante e processos para a sua preparação

Info

Publication number: PT104739B
Application number: PT10473909A
Authority: PT
Inventors: Madalena Maria De Magalhaes Pinto; Maria Emilia Da Silva Pereira Sousa; Marta Ramos Pinto Correia Da Silva Carvalho Guerra; Franklim Marques; Felix Dias Carvalho
Original assignee: Univ Do Porto
Priority date: 2009-09-08
Filing date: 2009-09-08
Publication date: 2013-03-08
Also published as: PT104739A

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE À OBTENÇÃO DA 2',2'',3',3'',4',4'',6',6''-O-OCTASSULFATO DE SÓDIO DE 3,6- BIS(O-ß-D-GLUCOPIRANOSIL)XANTEN-9-ONA E SEUS ANÁLOGOS GLICOSILADOS OCTASSULFATADOS. ESTAS NOVAS MOLÉCULAS INTERFEREM COM A COAGULAÇÃO SANGUÍNEA, DIMINUINDO-A E TÊM APLICAÇÃO NA PROFILAXIA E TRATAMENTO DE TROMBOSES, PREVENDO-SE UMA MELHORIA DAS CARACTERÍSTICAS DOS ANTICOAGULANTES NA TERAPÊUTICA, NO QUE DIZ RESPEITO À SUA OBTENÇÃO - UMA VEZ QUE O SEU PROCESSO SINTÉTICO DECORRE COM RENDIMENTOS ELEVADOS - E/OU À SUA BIODISPONIBILIDADE E/OU À SUA TOXICIDADE. ESTA INVENÇÃO INTEGRA-SE NO SETOR TÉCNICO DOS MEDICAMENTOS ANTICOAGULANTES E ANTITROMBÓTICOS.

Description

DESCRIÇÃO

Xantonas sulfatadas e análogos xantónicos glicosilados sulfatados com atividade anticoagulante e processos para a sua preparação

Domínio técnico da invenção

A presente invenção refere-se à obtenção da 2',2'',3',3'',4',4'',6',6''-O-octassulfato de sódio de 3,6bis(Ο-β-D-glucopiranosil)xanten-9-onae seus análogos glicosilados octassulfatados que interferem com a coagulação sanguínea, diminuindo-a, tendo aplicação na profilaxia e tratamento de tromboses, prevendo-se uma melhoria das características dos anticoagulantes na terapêutica, no que diz respeito à sua obtenção - uma vez que o seu processo sintético decorre com rendimentos elevados - e/ou à sua biodisponibilidade e/ou à sua toxicidade.

Esta invenção integra-se no setor técnico dos medicamentos anticoagulantes e antitrombóticos.

Antecedentes da Invenção

A antitrombina III é a principal reguladora endógena da cascata da coagulação. É uma glicoproteína plasmática, da família das serinas, inibidora das proteinases, especialmente do fator Xa e da trombina. A antitrombina III, isoladamente, é um inibidor fraco destas proteinases; no entanto, quando a heparina activa os locais de ligação à antitrombina, a sua atividade inibidora é acelerada cerca de 1000 vezes.

A heparina é um anticoagulante de uso parentérico com início de ação imediato e duração de ação curta. A eficácia anticoagulante da heparina sofre de variabilidade interindividual, tendo que ser monitorizada. A principal reação adversa da heparina é a hemorragia; deve, por isso, usar-se com extrema prudência nos doentes com riscos hemorrágicos. Outros efeitos colaterais importantes incluem a trombocitopenia imune, reações de hipersensibilidade, irritação no local de injeção e osteoporose. A heparina é um polímero linear sulfatado composto alternados de glucosamina e ácido urónico comercializada é um produto natural, de fonte bovina ou porcina, que pode conter uma mistura de várias espécies polissacáridas com cadeias de diferentes tamanhos (pode conter 10 a 80 daqueles resíduos) e diferente distribuição dos grupos sulfato. Os extensos fragmentos de cadeias altamente aniónicas conduzem à ligação da heparina a um elevado número de proteínas no plasma, sendo consequentemente responsável pelo desenvolvimento de efeitos adversos.

de resíduos A heparina

O risco de desenvolver complicações hemorrágicas e a variabilidade na resposta à terapêutica foi diminuído, apesar de ainda existente, com as heparinas de baixo peso molecular (HBPM). Estas são obtidas a partir da heparina natural, através de modificações químicas e enzimáticas e correspondem a uma redução do peso molecular do polissacárido inicial de 14000 para 2000-5000 Da. No entanto, são ainda heterogéneas em termos de atividade biológica e duração de ação.

O fondaparinux, um pentassacárido de selectivo do fator Xa, que resultou síntese inibidor da simplificação

molecular	da	heparina para	uma	sequência	de	apenas	5
residuos,	é	um anticoagulante	melhor tolerado	que	as
heparinas.	No	entanto, ainda	apresenta o	mesmo	tipo	de
reações adversas e, tal como	as	heparinas,	não	pode	ser

administrado oralmente.

Por outro lado, os anticoagulantes orais varfarina sódica e acenocumarol são anticoagulantes derivados da 4hidroxicuramarina (benzopirona) de ação indirecta, que reduzem a sintese hepática dos fatores II, VII, IX e X da coagulação, por antagonizarem a ação da vitamina k. Os efeitos destas moléculas de baixo peso molecular, de natureza não polissacárida, só se tornam aparentes 2 a 3 dias após o inicio de administração. Deste modo, a terapêutica com estes fármacos é inadequada para um controlo inicial, sendo os derivados cumarinicos utilizados na manutenção de uma ação anticoagulante de longa duração. A reação adversa mais comum destes derivados é a hemorragia, necessitando constantemente de monitorização. Outras reações adversas incluem erupção, alopécia, necrose e/ou gangrena e possuem inúmeras interações medicamentosas e alimentares.

Variados esforços têm vindo a ser realizados no sentido de desenvolver novas moléculas anticoagulantes que possam ser administradas oralmente. Por exemplo, foram desenvolvidas várias moléculas de baixo peso molecular, não sacaridicas, sulfatadas, pertencentes à classe das flavonas e flavanóis. No entanto, estes compostos não demonstraram possuir propriedades anticoagulantes eficazes [Gunnarsson, G.T. et al. J. Med. Chem., 2002, 45, 1233; Gunnarsson, G.T. et al. J. Med. Chem., 2002, 45, 4460].

Por todos os problemas técnicos expostos, a terapêutica anticoagulante atual continua a carecer de moléculas anticoagulantes seguras, eficazes e que possam ser administradas oralmente.

Verificámos que as substâncias da presente invenção capazes de inibir por completo a coagulação e podem por isso, também úteis em procedimentos onde necessário a inibição total do processo da coagulação.

são ser, se j a

As substâncias da presente invenção apresentam vantagens em relação à heparina e derivados no que concerne ao método de obtenção e ao perfil farmacocinético.

As substâncias da presente invenção são obtidas por um processo sintético mais ao sua são perfil eficiente comparativamente pentassacárido sintético fondaparinux, isto é, a síntese processa-se num menor número de etapas e isoladas por um processo de purificação em condições ambientais favoráveis, com rendimentos superiores a 80%.

Ao contrário da heparina, que por corresponder a uma mistura de glicosaminoglicanos, possui heterogeneidade química que se traduz numa atividade anticoagulante e farmacocinético variáveis, as substâncias da presente invenção, apresentam uma homogeneidade química, isto é, possuem caracteristicas estruturais e físicoquímicas bem definidas que se traduzem numa atividade anticoagulante reprodutível.

Em consequência, no caso da heparina, apenas um terço da dose administrada é responsável pelos efeitos terapêuticos; as substâncias da presente invenção possuem um grau de pureza superior a 95 por cento.

Os compostos da presente invenção possuem ainda, relativamente às heparinas e ao fondaparinux, menor peso molecular, menor caráter aniónico e uma maior natureza hidrofóbica, conferida pela presença de um núcleo dibenzoγ-pirónico ou xantónico, o que poderá contribuir para uma melhoria da biodisponibilidade oral e uma redução do risco de efeitos adversos.

A biodisponibilidade oral da heparina é insignificante [Malkov, D. et al., Pharm. Res., 2004, 19, 1180] não sendo observado o seu transporte através da monocamada de células Caco-2 [Lamprecht, A. et al. Nanotechnology 2006, 17, 3673]ao contrário do descrito para as substâncias percursoras das presentes nesta invenção, o que pressupõe uma potencial biodisponibilidade oral.

Outra desvantagem da heparina é o facto da biodisponibilidade subcutânea ter um período de latência de 1-2 horas, daí ser preferida a administração intravenosa quando é necessário um rápido efeito anticoagulante [Haines, S.T et al. Venous thromboembolism. In: DiPiro JT, et al eds. Pharmacotherapy: A Pathophysiologic Approach. 6th ed. New York: McGraw-Hill, 2005; pp.373-413] . No caso da administração intraperitoneal, a heparina não produz acção anticoagulante sistémica [Canavese M. et al. Clin Nephrol 1986, 26, 116], ao contrário do previsto para as substâncias descritas nesta invenção.

Adicionalmente, as substâncias da presente invenção apresentam vantagens em relação aos anticoagulantes orais, varfarina sódica e acenocumarol. Uma das vantagens traduzse por apresentarem rápido início de ação; ao atuarem diretamente no fator Xa não são esperadas as interações medicamentosas e alimentares características dos antagonistas da vitamina K. Relativamente às moléculas de baixo peso molecular sulfatadas, pertencentes à classe das flavonas e flavanóis, as substâncias descritas nesta invenção que incluem uma porção sacarídica apresentam um efeito anticoaqulante superior.

Os sequintes dados, descritos na literatura, demonstram o potencial da utilização da tecnologia e das substâncias presentes nesta invenção, nomeadamente:

- métodos de persulfatação com auxílio de micro-ondas, que permitem uma obtenção em tempos reduzidos de pequenas moléculas hidroxiladas não pertencentes à classe das xantonas, foram já desenvolvidos [Raghuraman, A. et al. Tetrahedron Lett., 2007, 48(38), 6754];

a utilização de técnicas de isolamento ambientalmente favoráveis aplicadas à purificação de compostos hidrofílicos [Sousa, Μ. E et al. Sulfated Flavonoids: Nature Playing with the Hydrophilic-Hydrophobic Balance. In Natural products: chemistry, biochemistry and pharmacology; Brahmachari, G., Eds.; Narosa Publishing House: New Delhi, índia, 2008; pp. 392-416 e refências incluídas];

- um derivado sulfatado cuja fórmula não foi descrita e obtido por sulfatação com aquecimento convencional não mostrou atividade contra dermatófitos, leveduras e espécies de Aspergillus [Correia-da-silva, M., Sousa, E., Pinto, M., Vale-Silva, L., Pinto, E., 7th Portuguese National Meeting of Organic Chemistry, 2007, OC6.]

Pelo exposto, os compostos da presente invenção são considerados potenciais agentes anticoagulantes e antitromboticos

Descrição da invenção

Nesta invenção é descrito o desenvolvimento de novas moléculas sulfatadas de baixo peso molecular que interferem com a coagulação sanguínea, diminuindo-a e têm aplicação na profilaxia e tratamento de tromboses, prevendo-se uma melhoria das características dos anticoagulantes na terapêutica, no que diz respeito à sua obtenção - uma vez que o seu processo sintético decorre com rendimentos elevados -e/ou à sua biodisponibilidade e/ou à sua toxicidade.

Estas moléculas reúnem numa só estrutura um núcleo dibenzoγ-pirónico ou xantónico, 3,6-0-monossacárido, com oito grupos sulfato de acordo com a fórmula geral 1, em que Y representa contra-iões como sódio (Na+), potássio (K+), amónio (NH4+) ou tetra-alquilamónio (NR4+) coordenados ou ligados ionicamente nos grupos sulfato.

octassulfato

Outro aspeto da invenção diz respeito à preparação de octassulfatos do núcleo dibenzo-Y-pirónico ou xantónico,

3,6-0-monossacárido de fórmula geral 1, onde Y, foi já definido acima, por sulfatação de grupos hidroxilo de um intermediário de núcleo dibenzo-Y-pirónico ou xantónico, 3,6-0-monossacárido de fórmula geral 2, que foi preparado por glicosilação do intermediário de núcleo dibenzo-Y-pirónico ou xantónico de fórmula geral 3, e em que o dito núcleo dibenzo-Y-pirónico ou xantónico foi preparado por métodos descritos de síntese de xantonas.

A sulfatação deve ser efetuada com aductos de trióxido de enxofre e uma base de Lewis, a 65°C por 24 horas, em solvente inerte, sendo preferível usar aductos de trióxido de enxofre e trietilamina e utilizar como solvente a dimetilacetamida. É desejável usar excesso de agente sulfatante, por exemplo, 4-10 equivalente molar por hidroxilo de aductos, para se obter o produto com elevado grau de sulfatação. Após reação, a mistura reaccional deve ser adicionada à acetona, após alcalinização com uma amina, preferencialmente trietilamina. A mistura deve ser deixada a 4°C, durante 8 a 12 horas, para originar a insolubilização do produto sulfatado, na forma de sal de trietilamina e eliminar o excesso de aducto, solúvel na acetona. O óleo formado, após decantação da acetona e lavagem com acetona e éter, deve ser dissolvido em solução aquosa de um sal por exemplo, acetato de sódio a 30% (m/v). Por adição de etanol é insolubilizado o composto sulfatado. Se necessário, o produto assim obtido pode ser sujeito a métodos de purificação como por exemplo diálise com membrana de celulose de poro 1000 ou, alternativamente, por filtração por gele ou cromatografia de troca iónica.

A glicosilação pode ser conseguida por métodos que se encontram descritos por Toshima, K. e Tatsuta, K. em Chemical Reviews, 1993, 1503-1531.

A síntese do núcleo xantónico pode ser conseguida por métodos que se encontram descritos por Sousa, Μ. E. e Pinto, Μ. Μ. M. em Current Medicinal Chemistry, 2005, 12, 2447-2479.

Ainda outro aspeto da invenção diz respeito 2',2'',3',3'',4',4'',6',6 -O-octassulfato de bis(Ο-β-D-glucopiranosil)xanten-9-ona e ao emprego de sódio de 3,6análogos seus glicosilados octassulfatados de fórmula geral 1 como anticoagulantes, em humanos ou animais.

A avaliação da atividade anticoagulante foi efetuada inicialmente em condições experimentais in vitro, com a avaliação dos tempos clássicos da coagulação, em plasma humano. A 2', 2'' , 3', 3'' , 4', 4'' , 6', 6''-O-octassulfato de 3, 6-bis(Ο-β-D-glucopiranosil)xanten-9-ona de fórmula geral 1 prolongou os tempos de coagulação, tendo sido mesmo capaz de inibir totalmente a coagulação na concentração mais alta testada.

A avaliação do mecanismo de ação anticoagulante foi efetuada in vitro através do uso de enzimas humanas purificadas e de substratos cromogénicos apropriados. A 2', 2 , 3', 3 , 4', 4 , 6', 6-O-octassulfato de 3, 6-bis (Ο-βD-glucopiranosil) xanten-9-ona de fórmula geral 1 mostrou ser inibidor direto do fator Xa.

A atividade anticoagulante da 2' ,2'', 3',3'', 4',4'', 6',6''O-octassulfato de 3,6-bis(Ο-β-D-glucopiranosil)xanten-9-ona de fórmula geral 1 foi avaliada ex vivo por tromboelastograf ia. A 2' , 2'' , 2' , 2'' , á' , á'' , <ó' , <ó''-0octassulfato de 3,6-bis(Ο-β-D-glucopiranosil)xanten-9-ona de fórmula geral 1 revelou possuir marcada atividade anticoagulante em contacto com sangue humano total. 0 tromboelastograma obtido sugeriu forte potencialidade da 2', 2 , 3', 3 , 4', 4 , 6', 6-O-octassulfato de 3, 6-bis (Ο-βD-glucopiranosil) xanten-9-ona de fórmula geral 1 para demonstrar sucesso in vivo.

A agregação plaquetária foi avaliada, na presença da 2', 2 , 3', 3 , 4', 4 , 6', 6-O-octassulfato de 3, 6-bis(0-β9

D-glucopiranosil)xanten-9-ona de fórmula geral 1, também em sangue humano, por agregometria por impedância elétrica induzida pelo péptido de ativação do receptor de trombina (teste TRAP), pelo ácido araquidónico (teste ASPI) e pelo 5'-difosfato de adenosina (teste ADP) . A 2', 2 , 3', 3 , 4', 4 , 6', 6-O-octassulfato de 3, 6-bis (Ο-βD-glucopiranosil)xanten-9-ona apresentou atividade antiagregante plaquetária. Esta descoberta significa que a 2',2,3',3,4',4,6',6-O-octassulfato de 3, 6-bis (Ο-βD-glucopiranosil)xanten-9-ona de fórmula geral 1 poderá vir a permitir a prevenção tanto da trombose arterial como da venosa.

emprego da 2', 2'' , 3', 3'' , 4', 4'',6',6''-O-octassulfato de

3,6-bis(Ο-β-D-glucopiranosil)xanten-9-ona e seus análogos glicosilados octassulfatados.de fórmula geral 1 pode ser útil para profilaxia e tratamento de tromboses, como adjuvantes da terapêutica fibrinolítica/antiagregante plaquetária, durante a hemodiálise e outros procedimentos de circulação extracorporal, para cirurgia geral e ortopédica, para prevenir a coagulação do sangue para transfusões e de amostras para doseamentos diversos, durante procedimentos para os quais seja necessário diminuir ou bloquear a coagulação sanguínea ou em ensaios experimentais como controlos/padrões.

Ainda outro aspeto da invenção diz respeito ao processo para a preparação de uma composição farmacêutica consistindo na combinação de 2',2'',3',3'',4',4'',6',6''-0octassulfato de sódio de

3,6-bis(Ο-β-Dglucopiranosil ) xanten-9-ona seus análogos glicosilados octassulfatados. de fórmula geral 1 com um veículo ou excipiente inerte. A composição farmacêutica pode ser apresentada sob a cápsulas, cremes farmaceuticamente forma de injetáveis, comprimidos, com um veículo ou excipiente aceitável. Os adjuvantes podem corresponder a uma ou mais substâncias que atuam como diluentes, aromatizantes, edulcorantes, solubilizantes, lubrificantes, agentes suspensores, ligantes ou agentes desagregantes e pode ainda corresponder a um agente encapsulante.

Os compostos da presente invenção podem ser administrados internamente, por exemplo, oralmente, parenteralmente, intraperitonealmente, ou extracorporalmente, por exemplo, topicamente.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1 - 2', 2'' , 3', 3'',4',4'',6',6''-O-octassulfato de sódio de 3,6-bis(Ο-β-D-glucopiranosil)xanten-9-ona e respetivos análogos glicosilados octassulfatados.

Figura 2 - 3,6-Bis(Ο-β-D-glucopiranosil)xanten-9-ona.

Figura 3 - 3,6-Di-hidroxixanten-9-ona.

Descrição Detalhada da Invenção

A avaliação da atividade anticoagulante foi efetuada inicialmente em condições experimentais in vitro, com a avaliação dos tempos clássicos da coagulação, o tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT), tempo de protrombina (TP) e tempo de trombina (TT) em plasma humano. A 2', 2 , 3', 3 , 4', 4 , 6', 6-O-octassulfato de 3, 6-bis (Ο-βD-glucopiranosil) xanten-9-ona de fórmula geral 1 revelou possuir marcada atividade anticoagulante in vitro evidenciando-se a inibição completa da coagulação, para a concentração de 5X10”³ mol/L. 0 que isto significa é que a 2',2,3',3,4',4,6',6-O-octassulfato de 3,6-bis(Ο-β11

D-glucopiranosil)xanten-9-ona de fórmula geral 1 é capaz de inibir por completo a coagulação e pode ser, por isso, também útil em procedimentos onde seja necessária a inibição total da coagulação. 0 valor da concentração, para a 2',2'',3',3'',4',4'',6',6''-O-octassulfato de 3, 6-bis(0β-D-glucopiranosil)xanten-9-ona de fórmula geral 1, que duplica o tempo de coagulação correspondeu a um valor na ordem dos micromolar para o APTT (Tabela 1).

Tabela 1. Concentração necessária para prolongar, para o dobro, os tempos de coagulação APTT (APTT2), TP (TP2) e TT(TT2), em plasma humano, em condições experimentais in vitro.

	APTT₂ (xlO^-3mol/L)	TP₂ (xlO^-3mol/L)	TT₂ (xlO^-3mol/L)
XGS	0.064	0,709	0, 607
HEPARINA	0.4UI/mL	1.9UI/mL	0.2UI/mL

XGS : 2',2'',3',3'',4',4'',6',6''-O-octassulfato de 3,6bis(Ο-β-D-glucopiranosil)xanten-9-ona

A avaliação efetuada in purificadas, cromogénicos octassulfato fórmula geral apresentando produzir 50% enzima) de 7.

do mecanismo de ação anticoagulante foi vitro através do uso de enzimas humanas fator Xa e trombina, e de substratos apropriados. A 2' , 2’’ , 3' , 3 , 4' , 4 , 6' , 6-0de 3,6-bis(Ο-β-D-glucopiranosil)xanten-9-onade 1 mostrou ser um inibidor direto do fator Xa, um valor de CI₅o (concentração necessária para do efeito inibitório da atividade máxima da 40 χ IO’⁴ mol/L.

Seguidamente foi avaliado se o efeito anticoagulante se verificava na presença de todos os componentes do sangue, onde estão presentes células com um papel importante na coagulação e que não se encontram presentes quando se utiliza apenas plasma. Recorreu-se à tromboelastografia que, para além de utilizar sangue humano total, é o método que melhor mimetiza a coagulação in vivo. Na presença da 2', 2 , 3', 3 , 4', 4 , 6', 6-O-octassulfato de 3, 6-bis (Ο-βD-glucopiranosil)xanten-9-ona de fórmula geral 1, foi possível verificar que o tromboelastograma apresentou o perfil de um sangue hipocoagulado, com as reacções enzimáticas diminuídas, com níveis de fibrinogénio baixos, e com a diminuição do tamanho máximo do coágulo. Este último parâmetro reflete a importante contribuição das plaquetas tendo, por isso, levantado a suspeita de um possível efeito destes compostos, também a nível das plaquetas. Por isso, foi, seguidamente investigado, o efeito dos compostos sulfatados na agregação plaquetária. Num aparelho designado por multiplate, que também utiliza sangue total, foi verificado que, na presença da 2',2,3',3,4',4,6',6-O-octassulfato de 3, 6-bis (0-βD-glucopiranosil)xanten-9-ona de fórmula geral 1, também a agregação plaquetária era inibida. A

2',2,3',3,4',4,6',6-O-octassulfato de 3, 6-bis (0-βD-glucopiranosil)xanten-9-onade fórmula geral 1 apresentou atividade antiagregante plaquetária, inibindo a agregação plaquetária induzida quer pelo ácido araquidónico, quer pelo ADP.

Exemplos

Exemplo 1: Síntese de 2',2'',3',3'',4',4'',6',6''-0octassulfato de 3,6-bis(Ο-β-D-glucopiranosil)xanten-9-ona (sal de sódio). A 3,6-bis(Ο-β-D-glucopiranosil)xanten-9ona, foi dissolvida em N, N-dimetilacetamida (5 mL) a 65°C.

aducto de trióxido de enxofre e trietilamina (6 equivalente/ OH) foi adicionado e a mistura reaccional mantida com aquecimento e agitação por 24 horas. A mistura reaccional foi arrefecida e após alcalinização com trietilamina foi adicionada à acetona (100 mL) . A suspensão foi mantida 8 a 12 horas a 4°C. O liquido sobrenadante foi decantado e o óleo formado lavado várias vezes com acetona e éter para remover vestígios de aducto de trióxido de enxofre e trietilamina. O óleo foi dissolvido numa solução de acetato de sódio a 30% (equimolar) e água. O produto obtido por insolubilização com etanol foi sujeito a diálise, por membrana de celulose Spectra/Por 6, durante 4 horas. A solução aquosa interior foi recolhida e evaporado o solvente com auxilio da pressão reduzida tendo-se obtido um sólido de cor castanho-pálido. A 3,6-bis(Ο-β-Dglucopiranosil ) xanten- 9-ona foi obtida após desmetilação com metóxido de sódio (4 mol/glucose) do produto formado da reação da 3,6-di-hidroxixantona (1 g; 4,4 mmol) com acetobromoglucose (2:1), K2CO3 (2:1) em dimetilformamida anidra (15 mL) à temperatura ambiente. A 3,6-dihidroxixantona foi sintetizada a partir da 2,2',4,4'-tetrahidroxibenzofenona (2 g; 8,1 mmol) comercialmente disponível (Sigma T16403) por aquecimento a 220°C, em mufla, durante 4 horas.

Exemplo 2: As experiências in vitro foram efectuadas em plasma humano de voluntários saudáveis, sendo para o efeito previamente misturado e incubado a 37°C com concentrações crescentes da 2',2'’,3',3'',4',4'',6',6''-O-octassulfato de

3,6-bis(Ο-β-D-glucopiranosil)xanten-9-ona de fórmula geral

1. Foram utilizados kits comerciais (HemosIL™, Instrumentation Laboratory, Milão, Itália) e os tempos de coagulação foram determinados usando um coagulômetro (ACL

100 Coagulation Analyzer, Milão, Itália). As determinações foram feitas em duplicado e a experiência repetida em 3 dias consecutivos. Para cada coagulação ± desvio padrão foi do tempo de coagulação foi coagulação na ausência de concentração necessária para tempo de coagulação.

grupo, a média	do	tempo	de
determinada. 0	prolongamento
comparado com	o	tempo	de
composto e	calculada	a
prolongar, para o	dobro,	0

Exemplo 3: Nos ensaios de inibição enzimática, a

2', 2 , 3', 3 , 4', 4 , 6', 6-O-octassulfato de 3, 6-bis (Ο-βD-glucopiranosil)xanten-9-ona de fórmula geral 1 foi incubada a lxlO^-3 mol/L com antitrombina (lUI/mL para fator Xa e 0,lUI/mL para trombina) e/ou 4,3 nM de fator Xa ou 0,06NIH/mL de trombina em tampão Tris-HCl a 50mM, pH 8,3, a 37°C. Após incubação a atividade residual, do fator Xa ou trombina, foi medida espetrofotometricamente, usando como substratos CBS 31.39 ou Chromozym TH, respetivamente. A diminuição da atividade enzimática residual foi comparada com a atividade enzimática na ausência de composto e calculada a percentagem de inibição. Em ensaios de inibição do fator Xa foram utilizadas concentrações crescentes do composto e calculada a concentração necessária para produzir 50% do efeito inibitório da atividade máxima da enzima (CI₅₀) .

Exemplo 4: Amostras de sangue de indivíduos saudáveis foram colhidas para tubos com 3.8% citrato de trisódio numa proporção de 1:9 (v/v) e as análises de tromboelastografia foram realizadas dentro de 5 h após a colheita. O ensaio foi efetuado de acordo com as instruções do fabricante do

Rotem delta (Pentapharm GmbH, Germany). Todos os reagentes foram comprados na Pentapharm GmbH. A 2', 2 , 3', 3 , 4', 4 , 6', 6-O-octassulfato de 3,6-bis(Ο-βD-glucopiranosil ) xanten- 9-ona de fórmula geral 1 foi dissolvido em soro e diluído em sangue total (1:16) a uma concentração final de 6.25 x IO^-4 M. No controlo, foi adicionado apenas soro ao sangue total (1:16) . Após a adição da 2',2'',3',3'',4',4'',6',6''-O-octassulfato de

3,6-bis(Ο-β-D-glucopiranosil)xanten-9-onade fórmula geral 1 ao sangue o programa foi ligado e a formação do coágulo foi monitorizada durante 60 min a 37 °C.

Exemplo 5: Amostras de sangue de indivíduos saudáveis foram colhidas para tubos com hirudina (concentração final de 25 pg/mL) e analisadas entre 0.5-1 hora após a colheita. A solução da 2',2'',3',3'',4',4'',6',6''-O-octassulfato de

3,6-bis(Ο-β-D-glucopiranosil)xanten-9-ona de fórmula geral 1, (125 pL, soro) foi adicionada ao sangue total (1875 pL) a uma concentração final de 6.25 x ΙΟ^-4 Μ. O ensaio foi efetuado de acordo com as instruções do fabricante (Multiplate, Dynabyte, Munich, Germany): 300 pL de sangue total foi adicionado à temperatura ambiente a 300 pL de soro pré-aquecido a 37°C; após uma incubação de 180 s, 20 pL de solução do agonista selecionado (Dynabyte, Munich, Germany) foi adicionada, obtendo-se uma concentração final de péptido de ativação do receptor de trombina (TRAP-6) de 32 pM (teste TRAP), de ácido araquidónico de 0.5 mM (teste ASPI) e de 5'-difosfato de adenosina (ADP) de 6.5 pM (teste ADP). A análise foi efetuada durante 6 min.

Claims

1. Composto caracterizado por ser 2', 2 , 3', 3 , 4', 4 , 6', 6-O-octassulfato de 3, 6-bis (Ο-βD-glucopiranosil)xanten-9-ona de fórmula geral 1, em que, Y representa contra-iões como sódio (Na⁺) , potássio (K⁺) , amónio (NH4⁺) ou tetra-alquilamónio (NR4⁺) coordenados ou ligados ionicamente com os grupos sulfato.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1 para uso na profilaxia e/ou tratamento de tromboses, caracterizado por prevenir ou reduzir a coagulação.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por inibir a coagulação in vitro.

4. Processo para a preparação de um composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender os seguintes passos:

a) sulfatação do 3,6-O-dissacárido de xanten-9-ona de fórmula geral 2, com o uso de 4-10 equivalente molar por hidroxilo de aductos de trióxido de enxofre e trietilamina em dimetilacetamida;

b) alcalinização com trietilamina, e arrefecimento;

c) isolamento do produto sulfatado na forma de sal de trietilamina por acetona;

d) tratamento do sal com um catião farmaceuticamente aceitável em solução aquosa e purificação por diálise.

5. Composição farmacêutica de acordo com as reivindicações 1-2, caracterizada por incorporar um composto de fórmula geral 1.

6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por ser apresentada sob a forma de injetáveis, comprimidos, cápsulas, cremes com um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por os adjuvantes corresponderem a uma ou mais substâncias que atuam como diluentes, aromatizantes, edulcorantes, solubilizantes, lubrificantes, agentes suspensores, ligantes, agentes desagregantes ou agentes encapsulantes.