PT103839A - Composições farmacêuticas contendo a enzima ciprosina, uma peptidase aspártica de cynara cardunculus, e a sua inclusão em formulações antitumurais - Google Patents

Abstract

É OBJECTO DA PRESENTE INVENÇÃO A UTILIZAÇÃO DUMA PREPARAÇÃO DE UMA FITEPSINA, MAIS PRECISAMENTE DE UMA CIPROSINA, CONTENDO O HETERODÍMERO, O SEU PROPÉPTIDO N-TERMINAL, PÉPTIDO MADURO N-TERMINAL E PÉPTIDO MADURO C-TERMINAL, ASSIM COMO OUTRAS ESPÉCIES PRECURSORAS, PRODUTOS DE PROCESSAMENTO E ESPÉCIES AGREGADAS, ISOLADAS OU EM QUALQUER COMBINAÇÃO DAS MESMAS, NATIVA, EXTRAÍDA A PARTIR DA PLANTA CYNARA CARDUNCULUS, OU RECOMBINANTE, EXTRAÍDA DO SOBRENADANTE DE UMA CULTURA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE, MODIFICADA GENETICAMENTE PARA A PRODUÇÃO HETERÓLOGA DA CIPROSINA, PARA FINS TERAPÊUTICOS, MAIS PRECISAMENTE PARA A SUA APLICAÇÃO COMO AGENTE ANTITUMORAL.

Description

DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS CONTENDO A ENZIMA CIPROSINA, UMA PEPTIDASE ASPÁRTICA DE Cynara cardunculus, E A SUA INCLUSÃO EM FORMULAÇÕES ANTITUMORAIS"

Domínio Técnico da Invenção São objecto da presente invenção formulações farmacêuticas contendo uma preparação de uma fitepsina, mais precisamente duma ciprosina, caracterizada por ser uma protease aspártica nativa da planta Cynara cardunculus (Número de acesso na UniProtKB/TrEMBL: Q39476). É objecto da presente invenção uma preparação da referida ciprosina contendo o heterodímero, o pré-propéptido da ciprosina e/ou o propéptido da ciprosina contendo a extremidade N-terminal e/ou o lobo/cadeia/subunidade madura N-terminal e/ou o propéptido da ciprosina contendo o C-terminal e/ou o domínio PSI, específico das fitepsinas vegetais e/ou o lobo/cadeia polipeptídica/subunidade madura N-terminal e/ou o polipéptido isolado contendo o domínio PSI e/ou qualquer outro produto secundário derivado do processamento ou degradação do pré-propéptido inicial, assim como outras espécies precursoras, produtos de processamento e espécies agregadas, isoladas ou em qualquer combinação das mesmas. É objecto da presente invenção uma preparação da referida ciprosina nativa, extraída a partir da planta Cynara cardunculus, ou da ciprosina recombinante, extraída, por exemplo, a partir do sobrenadante de uma cultura da levedura 2

Saccharomyces cerevisiae, modificada geneticamente para a produção heteróloga da ciprosina. É objecto da presente invenção a inclusão duma preparação da referida ciprosina em formulações farmacêuticas com actividade antitumoral, tal como demonstrado in vitro em linhas celulares tais como a linha epitelial humana derivada de um carcinoma do colon (HCT), a linha epitelial humana derivada de um adenocarcinoma (HeLa), a linha epitelial humana derivada de um fibrosarcoma (HT) e a linha epitelial humana derivada de um meduloblastoma (TE).

Antecedentes da Invenção

Os mecanismos de divisão e envelhecimento das células normais (não tumorais) e das células tumorais são idênticos. É a regulação anómala de um destes mecanismos que pode conduzir à formação de tumores. Factores, tais como agentes de radiação ou químicos, podem danificar o DNA e alterar a expressão de genes envolvidos na morte celular programada (MCP), ou apoptose, fazendo com que as células passem a proliferar indefinidamente, sem controlo, mesmo na ausência de factores de crescimento.

As enzimas proteolíticas, denominadas de peptidases, proteases ou proteinases, são enzimas capazes de hidrolisar ligações peptídicas. As exopeptidases actuam perto da região terminal de um polipéptido enquanto que as endopeptidases clivam a cadeia polipeptídica internamente, de uma forma mais ou menos específica, dependendo da natureza da enzima. Sabe-se que as endopepidases desempenham um papel fundamental na transmissão de sinais bioquímicos essenciais para o correcto funcionamento 3 dos programas de MCP. De acordo com o seu mecanismo catalítico, estas enzimas podem dividir-se em cinco subclasses distintas: endopeptidases de serina, endopeptidases de cisteína, endopeptidases de aspartato, metalo-endopeptidases e endopeptidases de treonina (Rawlings and Barret, 1999; Beers et al., 2000).

Os processos que levam à MCP ocorrem em três fases interligadas: síntese e emissão de sinais indutores (extracelular), vias de transmissão dos sinais indutores (intracelulares), e a ocorrência de uma via final (intracelular), comum a todas as células e denominada de via executora (Roberts et al., 1999). A função das endopeptidases na fase de geração de sinais específicos, indutores da MCP, ocorre através do processamento/clivagem e libertação de moléculas bioactivas e activação de receptores de superfície celular [e.g. as citocinas TNF-a, interferão-γ (IFN-γ) e TGF-β , assim como o ligando para o receptor Fas/APO-1] (Deiss et al., 1996) .

Existem inúmeros registos da acção das endopeptidases, nomeadamente das caspases, na fase de transmissão dos sinais indutores da MCP. Através da clivagem e consequente anulação da actividade de proteínas inibidoras de endonucleases, capazes de clivar os ácidos nucleicos, as caspases induzem indirectamente a fragmentação do DNA nuclear, o que explica as alterações morfológicas das células que ocorrem no início da apoptose, tais como a redução e a condensação do núcleo celular (Muzzio, 1998; Horta, 1999) . 4

Quanto à via executora final, a participação das proteases parece basear-se no processamento/clivagem de dois tipos de moléculas, pertencendo respectivamente a dois grupos funcionais distintos: moléculas envolvidas na organização e manutenção da estrutura celular e enzimas envolvidas na homeostase (Thornberry et al., 1997).

Em 1996, Louis Deiss e co-autores, através de uma estratégia baseada na inactivação aleatória de genes, causada pela introdução de bibliotecas de cDNA antisenso, preparadas em células expostas a citocinas, verificaram que o RNA antisenso da protease aspártica Catepsina D (CatD) protegia as células de uma linha epitelial humana, derivada de um adenocarcinoma (células HeLa), da MCP via IFN-γ, Fas/APO-1 e TNF-α (Deiss et al., 1996). Esta seria a primeira de muitas observações que implicariam directamente a CatD na indução da morte programada, mediada ou não, tal como neste caso especifico, pela via das citocinas.

Desde então, muitos outros mecanismos têm vindo a ser propostos para explicar a função da CatD na indução da MCP. Em 1998, Wu e co-autores correlacionaram a CatD com as vias de supressão de tumores dependentes do factor p53. Segundo Bidere e co-autores (2003) sugerem que a indução, via CatD, do fénotipo apoptótico prematuro em linfócitos T humanos, se faz através da activação da proteína Bax que, por sua vez, induz a libertação selectiva de uma proteína mitocondrial (factor AIF) cuja função específica é a activação da iniciação da apoptose. Piwnica et al. (2004) mostraram que a CatD é capaz de processar a prolactina humana em pequenos fragmentos semelhantes ao seu próprio N-terminal. Estes fragmentos, por sua vez, e devido à sua actividade anti-angiogénica exercem uma acção inibitória da 5 progressão de tumores. No mesmo ano, os padrões de expressão da proteína CatD foram examinados em 59 amostras de tumores do colo rectal, utilizando a técnica de Western blotting, ensaios de glicosilação e imunohistoquímica. 0 conteúdo em CatD foi determinado por densitometria laser e a perda de expressão da CatD observada foi correlacionada como a patologia, verificando-se em mais de 50% dos casos clínicos (Iacobuzio-Donahue et al. , 2004). Em 2005, Haendeler e co-autores observaram que a CatD induzia a MCP via degradação da Tioredoxina-1 (Trx), uma proteína anti-apoptótica essencial, pois é dos principais agentes captadores de radicais de oxigénio reactivos (ROR), indutores de apoptose. Mais recentemente, verificou-se que a CatD estimula a via da apoptose dependente das caspases, tanto numa linha celular tumoral embrionária, utilizando o modelo de rato (linha 3Y1-Adl2), como em células humanas de leucemia mielogénica crónica (K562). No primeiro caso, verificou-se que a indução da apoptose mediada pela CatD é independente da sua actividade catalítica, podendo portanto ser relacionada com os seus aspectos estruturais (Beaujouin et al., 2006; Wang et al., 2006) .

Presentemente é ainda prematuro concluir acerca da função primordial da CatD nas células animais, e muito menos considerar que a sua actividade pró-apotótica é maioritariamente devida a uma única via ou mecanismo. A verdade pode residir num conjunto de efeitos interligados que podem vir a ser explorados na busca de novas terapias contra alguns tipos de cancro.

Em contraste com o que acontece com os modelos animais, não existem nas plantas relatos científicos que estabeleçam uma 6 relação directa entre uma peptidase e a sua função específica na morte programada da respectiva célula vegetal. Existem apenas alguns relatos que correlacionam, em termos de mecanismo, algumas peptidases de origem vegetal com a MCP em plantas, em analogia com as suas congéneres animais (Dunn, 2002).

Um exemplo de peptidases de origem vegetal com especial relevância para a presente inovação são as fitepsinas: endopeptidases aspárticas do tipo das pepsinas, família AI (Beers et al., 2000). As fitepsinas são as únicas endopeptidases aspárticas listadas na base de dados MEROPS (Rawlings et al., 2006), considerada a base de dados de referência para as peptidases e seus inibidores específicos, como estando envolvidas na MCP em plantas. Evidências para este facto consistem, por exemplo, no facto de os níveis de expressão do RNA mensageiro destas enzimas aumentarem nas folhas e pétalas durante a fase de senescência (Buchanan-Wollaston, 1997; Panavas et al., 1999).

As fitepsinas são sintetizadas sob a forma de pré-propéptidos que exibem um elevado grau de homologia com a CatD animal, a excepção de aproximadamente 100 resíduos situados perto do seu C-terminal, denominado por domínio PSI, que representa um domínio exclusivo das fitepsinas vegetais (Runeberg-Roos et al., 1991). O domínio PSI apresenta, por sua vez, um elevado grau de homologia com as saposinas, activadoras dos esfingolípidos em animais. O domínio PSI é separado do propéptido C-terminal através duma primeira clivagem durante o processamento após a tradução que divide o pré-propéptido em duas porções quase equivalentes (Ramalho-Santos et al., 1998).

Esta clivagem inicial pode ser auto-catalítica, como no caso da 7 fitepsina do trigo e é condição essencial para a actividade endopeptidica da proteína madura. Esta, por sua vez, resulta da junção de duas cadeias; uma mais pesada que deriva do processamento do propéptido N-terminal, resultante do primeira clivagem, e uma mais leve, consistindo do C-terminal da segunda porção que contém o domínio PSI. Devido à ausência do domínio PSI, o propéptido N-terminal assume uma estrutura típica, comum às pró-formas das endopeptidases aspárticas de origem animal e microbiana, como seja a CatD (Ramalho-Santos et al., 1998).

Um caso típico de fitepsinas com elevada homologia com a CatD são as pertencentes à família das ciprosinas, anteriormente denominadas por cinarases, ou cinarinas, por terem sido isoladas pela primeira vez a partir de Cynara cardunculus, a planta do cardo (Heimgartner et al., 1989). Tal como as cardosinas, há muito utilizadas para o fabrico de queijos tradicionais na Península Ibérica, as ciprosinas foram descritas pela primeira vez como sendo endopeptidases aspárticas heterodiméricas, glicosiladas, cuja actividade máxima é obtida a pH 5.1, utilizando a caseína como substrato (Cordeiro et al., 1994). Desde então, foi construída uma biblioteca de cDNAs e isolado um clone contendo o cDNA codificante para a ciprosina, nomeadamente a sequência do gene CYPR011 entretanto decifrada, junto como a sua caracterização e a localização da sua expressão, dependendo do tipo de tecido (Cordeiro et al., 1994; 1995; 1998; Brodelius et al., 1995; 1998). Mais recentemente, estudos direccionados para a caracterização da proteína revelaram a sua estrutura global, forma de processamento típica das fitepsinas, sequências dos seus pré- e pró-domínios intra-moleculares e padrão de glicolisação (Faro et al., 1995, Veríssimo et al., 1996; Costa et al., 1997; Ramalho-Santos et al., 1997; 1998; Bento et al., 1998; Frazão et al., 1999). Mais recentemente ainda, os crescentes interesses económico e terapêutico das endopeptidases aspárticas levou a que a sequência do gene CYPR011 tivesse sido clonada e introduzida em Saccharomyces cerevisiae, com o objectivo final de produzir a enzima em larga escala (Pais et al., 2000).

Breve descrição dos desenhos

Figura 1: Cultura de células controlo FHs74 Int, não tumorais, e cultura de células HCT, tumorais. A - Células FHs74 Int antes da adição da preparação de ciprosina nativa, B - Células FHs74 Int 48h após adição de 100 μg/mL de uma preparação de ciprosina nativa, C - Células HCT antes da adição da preparação de ciprosina nativa, D - Células HCT 48h após adição de 100 μg/mL de uma preparação de ciprosina nativa. Ao contrário das células FHs74 Int, que não são afectadas pela adição da preparação de ciprosina nativa, as células HCT apresentam evidentes sinais de lise 48h após a adição da enzima. Barra de escala = 100 μπι.

Figura 2: Representação gráfica da viabilidade das células, coradas com SRB, em função do logaritmo da concentração ^g/ml) da enzima ciprosina nativa, para cada linha tumoral testada. A - HCT, B - HT, C -TE, D - Hela.

Figura 3: Representação gráfica da viabilidade das células coradas com SRB, em função do logaritmo da concentração ^g/ml) da enzima ciprosina nativa, para cada cultura celular não tumoral testada. A - Células Vero, B - Células FHs74 Int. 9

Figura 4: Cultura de células controlo FHs74 Int, não tumorais, e cultura de células HCT, tumorais. A - Células FHs74 Int antes da adição da preparação de ciprosina recombinante, B - Células FHs74 Int 48h após adição de 100 μρ/πΛ de uma preparação de ciprosina recombinante, C - Células HCT antes da adição da preparação de ciprosina recombinante, D - Células HCT 48h após adição de 100 μρ/πΛ de uma preparação de ciprosina recombinante. Ao contrário das células FHs74 Int, que não são afectadas pela adição da preparação de ciprosina recombinante, as células HCT apresentam evidentes sinais de lise 48h após adição da enzima. Barra de escala = 100 μπι.

Figura 5: Representação gráfica da viabilidade das células, coradas com SRB, em função do logaritmo da concentração (μρ/ιηΐ) da enzima ciprosina recombinante, para cada cultura celular testada. A - HCT tumoral, B -FHs74 Int não tumoral.

Descrição geral da invenção A presente invenção baseia-se no estudo da citotoxicidade de preparações de uma ciprosina (Número de acesso na UniProtKB/TrEMBL: Q39476), nativa, extraída a partir da planta Cynara cardunculus, ou recombinante, extraída, por exemplo, a partir do sobrenadante de uma cultura de Saccharomyces cerevisiae (BJ1991), modificada geneticamente para a sua produção heteróloga, contendo as suas duas cadeias constituintes: cadeia N-terminal (pode estar sob a forma do propéptido N-terminal ou péptido maduro N-terminal, ou ainda combinação dos dois) e cadeia C-terminal (péptido maduro C-terminal). 10

Tanto a proteína nativa como a recombinante são extraídas e purificadas de acordo com métodos previamente estabelecidos (Brodelius et al., 1995; Pais et al., 2000). O estudo de citotoxicidade que deu origem à invenção foi executado através do método da sulforadamina B (SRB). Este método consiste numa técnica rápida e sensível de medição da citotoxicidade de uma cultura, através da quantificação colorimétrica da biomassa proteica celular total, em culturas de células humanas coradas com SRB. A sulf orodamina B (C27H30N2O7S2) é um corante brilhante de cor púrpura, com dois grupos sulfónicos, solúvel em água. Sob condições ácidas a SRB liga-se aos aminoácidos das proteínas básicas em células previamente fixadas com ácido tricloroacético (TCA), indicando um conteúdo em proteína na cultura de células fixadas que é proporcional à densidade celular.

Um aumento ou diminuição do número de células resulta portanto numa alteração proporcional da quantidade do corante incorporado nas células em cultura, o que indica o grau de citotoxicidade causada pelo composto em estudo (Skehan, et al., 1989). 0 ensaio de SRB termina com a medição da absorvância, visto que o corante absorve luz a um comprimento de onda de 565 nm e emite luz nos 586 nm. Deste modo é possível determinar o crescimento relativo ou a viabilidade das células expostas e não expostas ao composto em estudo (Monks, et al., 1991). 11 0 efeito citotóxico da ciprosina foi determinado em linhas celulares tumorais humanas, por observação da morfologia celular e determinação dos respectivos IC5o (parâmetro que traduz a concentração à qual um composto inibe em 50% a proliferação celular in vítro), sendo estes parâmetros comparados com os obtidos em culturas celulares não tumorais.

Comparando os resultados obtidos sobre o efeito da ciprosina nas linhas celulares tumorais e nas culturas de células não tumorais, verificou-se que a enzima, a uma concentração de 100 μg/mL, provocou alterações morfológicas em todas as linhas celulares tumorais testadas, apresentando as células alguns sinais de lise. Nas culturas de células não tumorais testadas, submetidas à mesma concentração de ciprosina (100 μg/mL) não se verificaram alterações significativas na morfologia nem no crescimento celulares.

No que respeita aos valores do IC50, comparando a actividade citotóxica da ciprosina nas linhas tumorais com a mesma actividade nas culturas celulares não tumorais, verificou-se que as preparações da enzima apresentam uma eficácia letal sobre células tumorais muito acentuada, sem prejudicar significativamente as população de células normais.

Descrição detalhada da invenção

Dada a natureza da invenção, a sua descrição detalhada é melhor conseguida através de exemplos.

Os Exemplos que se seguem ilustram a presente invenção sem limitar o âmbito da mesma. 12

EXEMPLO I

Actividade antitumoral de uma preparação de ciprozina nativa contendo as duas cadeias constituintes: cadeia N-terminal (constituída por propéptido N-terminal e péptido maduro N-terminal) e cadeia C-terminal (péptido maduro C-terminal), isolada e purificada a partir de pétalas secas de Cynara cardunculus A preparação da ciprosina foi obtida a partir de pétalas secas da flor da planta do cardo, Cynara cardunculus, tal como anteriormente descrito (Brodelius et al., 1995). A actividade antitumoral da preparação enzimática foi testada, como exemplo, em quatro linhas celulares tumorais humanas: uma linha epitelial derivada de um carcinoma (HCT116, ATCC CCL-247), uma linha epitelial derivada de um fibrosarcoma (HT1080, ATCC CCL-121), uma linha epitelial derivada de um meduloblastoma (TE671, ATCC CCL-136), e uma linha epitelial derivada de um adenocarcinoma (Hela, ATCC CCL-2™) , assim como em duas culturas de células não tumorais, uma consistindo de células epiteliais do intestino delgado humano (FHs74 Int, ATCC CCL-241) e outra consistindo de células epiteliais de rim de macaco verde Africano (Vero, ATCC CRL-1587).

As linhas celulares tumorais HCT116, HT1080 e TE671 foram inoculadas em meio basal DMEM (Cambrex), suplementado com 5% de Soro Fetal Bovino (FBS - Gibco). As concentrações finais de glucose (Sigma) e de L-glutamina (Sigma) foram respectivamente 4,5 g/L e 6,0 mM. O meio pode também ser suplementado com 1% de Penicilina/Estreptomicina (Gibco) ou qualquer outro antibiótico semelhante. 13 A linha celular tumoral Hela foi inoculada em meio basal EMEM (Cambrex), suplementado com 10% FBS (Gibco); 2,1 g/L de solução de bicarbonato de sódio (NaHCCh) (Sigma); 1,0 mM de piruvato de sódio (Sigma) e 0,1 mM duma solução de aminoácidos não essenciais (NEAA) (Cambrex). As concentrações finais de glucose (Sigma) e de L-glutamina (Sigma) foram respectivamente 1,0 g/L e 2,0 mM. O meio pode também ser suplementado com 1% de Penicilina/Estreptomicina (Gibco) ou qualquer outro antibiótico semelhante.

As células Vero, não tumorais, foram inoculadas em meio de cultura basal DMEM (Cambrex), suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) (Gibco) e 3,56 mM de L-glutamina (Sigma). O meio pode também ser suplementado com 1% Penicilina/Estreptomicina (Gibco) ou qualquer outro antibiótico semelhante. A linha celular não tumoral FHs74 Int foi inoculada em meio basal Hybricare (ATCC; Cat. 46-X), suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS - Gibco); 2,10 g/L duma solução de bicarbonato de sódio (NaHC03) (Sigma); 2,0 mM L-glutamina (Sigma) e 30 ng/mL de Factor de Crescimento Epidermal (EGF -Sigma) . O meio pode também ser suplementado com 1% Penicilina/Estreptomicina (Gibco) ou qualquer outro antibiótico semelhante.

As células foram propagadas em sistemas de cultura de superfície estática, operadas em descontínuo. A concentração e a viabilidade celulares foram avaliadas através do método de exclusão do Azul de Tripano. 14 A Tabela III apresenta a taxa especifica de crescimento (μ) e o tempo de duplicação (Td) correspondente para cada uma das culturas celulares.

Tabela III — Taxa especifica de crescimento (μ) e tempo de duplicação para as linhas celulares tumorais e não tumorais utilizadas. Células μ (h'1) Td (h) Linhas celulares tumorais HCT116 0,031(±0,001) 23 HT1080 0,020(±0,001) 35 TE671 0,024(±0,001) 29 Hela 0,031(±0,001) 22 Culturas celulares não tumorais Vero 0,029(±0,001) 24 FHs74 Int 0,0041(±0,0005) 169 A determinação dos valores do IC5o para as diferentes culturas celulares, foi realizada pelo método da sulforodamina B (SRB).

Para cada tipo de células foi inoculado, em triplicado, um volume total de 100 pL de suspensão celular em placas de 96 poços. As respectivas densidades de inoculação foram calculadas com base nas respectivas taxas especificas de crescimento, por forma a que passadas 24h todas as culturas apresentassem uma confluência de 50%. Assim, as densidades de inoculo para as células HCT116 e Hela foram de 3.1xl04 células/cm2, para as linhas HT1018 e Vero foram de 9.4xl03 células/cm2, para a linha TE671 foi de 1.6 xlO4 células/cm2, e finalmente, para a linha FHs74 Int foi de 2.5xl04 células/cm2.

As culturas foram incubadas durante 24h a 37°C, em atmosfera com 7% de C02 e 90% de humidade. 15

Decorridas 24h após inoculação, adicionaram-se em cada poço, ΙΟΟμίϋ de preparação de ciprosina às concentrações desejadas, nomeadamente, e em ordem decrescente, 100C^g/mL, 10C^g/mL, lC^g/mL, ^g/mL, 0,^g/mL, 0,01μg/mL e 0,001μg/mL, para determinação do IC50.

As placas foram incubadas durante 48h a 37 C, em atmosfera com 7% de CO2 e 90% de humidade.

Para todas as linhas celulares, foram efectuados ensaios controlo, nos quais as células proliferaram na ausência de preparação de ciprosina.

Passadas 48h após aplicação da preparação da enzima, procedeu-se à análise das culturas, por microscopia óptica, de modo a registar a confluência e as caracteristicas morfológicas das células.

Os resultados desta análise, para a cultura de células controlo FHs74 Int, não tumorais, e cultura de células HCT, tumorais, para uma concentração de preparação enzimática de 100 μg/mL são representativos e podem ser visualizados na Fig. 1.

De uma forma geral, apenas as concentrações de preparação de ciprosina de 1000 μg/mL e 100 μg/mL provocaram efeitos na morfologia das linhas e culturas celulares testadas, sendo que a concentração mais elevada provocou a lise da totalidade da populações celulares, tanto tumorais como não tumorais. 16 A preparação da enzima à concentração de 100 μg/mL, provocou alterações morfológicas significativas em todas as linhas celulares tumorais, apresentando-se as células mais finas e alongadas, e sendo visíveis também alguns sinais de lise (Fig. D ·

Nas culturas celulares não tumorais, FHs74 Int e Vero, as células submetidas a 100 μg/mL não apresentaram qualquer alteração da sua morfologia (Fig. 1).

Para as restantes concentrações de enzima, nomeadamente abaixo de 10 μg/mL, não foi detectado, com o método utilizado, qualquer tipo de toxicidade da enzima sobre as culturas celulares em estudo.

Decorrida a avaliação microscópica todos os poços das placas foram incubados, durante lh a 4°C, com 50 μΐϋ de TCA (Fluka) a 50% (p/v). Posteriormente, as placas foram lavadas cinco vezes com água destilada.

Após a última lavagem, secaram-se as placas e adicionaram-se em cada poço 100 μΒ de solução de SRB (Sigma) a 0,4% (p/v), preparada no momento.

As placas foram incubadas durante 30 minutos, à temperatura ambiente, protegidas da luz. O corante SRB foi extraído das células, após cinco lavagens com 250 pL de 1% ácido acético (Rieldel-de Haên). 17

Seguidamente, cada poço da placa foi incubado com 200μΙϋ de solução lOmM Trizma base (Fluka), durante lOmin, à temperatura ambiente, com agitação constante e protegidas da luz. Deste modo, as células foram lisadas e consequentemente libertadas as proteínas coradas com o SRB. 0 ensaio terminou com a medição da absorvância, sendo deste modo possível determinar o crescimento relativo ou a viabilidade das células expostas e não expostas à preparação de ciprosina.

De modo a obter os valores de IC50, foi determinada a incorporação da SRB nas proteínas celulares (%SRB), relativamente à do controlo, através da equação (1), onde SRBE representa a absorvância média para cada concentração da preparação enzimática, SRBb a absorvância média para os ensaios em branco, e SRBC a absorvância média para os ensaios controlo: % SRB = (SRBe - SRBb) /(SRBc - SRBb) x 100 (1) O ajuste das curvas nos gráficos da % SRB versus logaritmo (concentração da enzima, μg/ml) foi realizado utilizando a função de Hill (2), determinado pelo programa de bioestatística Prism 5, para o Windows (GraphPad Software) , onde os parâmetros de Fundo e Topo são respectivamente 0% e 100%: Y = Fundo + (Topo-Fundo) /(1 + 10 (logIC5(fx)* declive de híHj (2) A representação gráfica da percentagem da viabilidade das células coradas com SRB, em função do logaritmo (concentração da enzima ciprosina, μρ/ιηΐ), para cada cultura celular pode ser 18 vista na Fig. 2. Os valores dos respectivos parâmetros IC5o encontram-se resumidos na Tabela IV, em baixo:

Tabela IV - Valores do parâmetro IC50 recorrendo ao programa de bioestatistica Prism 5, para o Windows (GraphPad Software) , com base nos valores de absorvância obtidos para cada linha celular tumoral e cultura celular não tumoral.

ic50 TE671 97,54 μg/mL Linhas Celulares Tumorais HT1080 81,09 μg/mL Hela 69,73 μg/mL HCT116 38,59 μg/mL Culturas Celulares Não Tumorais Vero 617,8 μg/mL FHs74 Int 118,5 μg/mL

Nas linhas tumorais estudadas, verificou-se que as células HCT116 são as mais sensíveis ao efeito antitumoral da preparação da enzima, enquanto que as células TE671 são as mais resistentes. Por outro lado, nas culturas de células não tumorais, verificou-se que as células FHs74 Int são mais sensíveis que as células Vero. 0 facto mais relevante, e de acordo com as observações morfológicas observadas previamente, é a consistente menor resistência das linhas tumorais à preparação de ciprosina, representada por valores do IC5o que, em média, são cinco vezes inferiores, em termos absolutos, aos valores apresentados pelas culturas de células não tumorais.

No geral, os resultados traduzem uma eficácia letal especifica da preparação da enzima nativa, purificada a partir de pétalas 19 secas da planta do cardo, sobre linhas de células tumorais, em função de populações de células não tumorais submetidas às mesmas concentrações da preparação.

Os resultados sugerem ainda que o potencial efeito citotóxico antitumoral da preparação da enzima ciprosina nativa se situa em concentrações até 1000 μg/ml.

EXEMPLO II

Actividade antitumoral de uma preparação de ciprosina recombinante, contendo as duas cadeias constituintes: cadeia N-terminal (constituída por propéptido N-terminal e péptido maduro N-terminal) e cadeia C-terminal (péptido maduro C-terminal), isolada e purificada a partir do meio de cultura de Saccharomyces cerevisiae transformada com o gene CYPROll.

A preparação da ciprosina foi obtida a partir do sobrenadante de uma cultura de Saccharomyces cerevisiae transformada com o gene CYPROll (estirpe BJ1991), codificante para a ciprosina, tal como anteriormente descrito (Pais et al., 2000 ). A actividade antitumoral da preparação enzimática foi testada, como exemplo, numa linha tumoral humana, epitelial, derivada de um carcinoma (HCT116, ATCC CCL-247), assim como numa cultura de células não tumorais, consistindo de células epiteliais do intestino delgado humano (FHs74 Int, ATCC CCL-241).

A linha tumoral HCT116 foi inoculada em meio basal DMEM (Cambrex), suplementado com 5% de Soro Fetal Bovino (FBS Gibco). As concentrações finais de glucose (Sigma) e de L-glutamina (Sigma) foram respectivamente 4,5 g/L e 6,0 mM. O 20 meio pode também ser suplementado com 1% de Penicilina/Estreptomicina (Gibco) ou qualquer outro antibiótico semelhante. A linha celular não tumoral FHs74 Int foi inoculada em meio basal Hybricare (ATCC; Cat. 46-X), suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS - Gibco); 2,10 g/L duma solução de bicarbonato de sódio (NaHCCb) (Sigma); 2,0 mM L-glutamina (Sigma) e 30 ng/mL de Factor de Crescimento Epidermal (EGF -Sigma) . O meio pode também ser suplementado com 1% Penicilina/Estreptomicina (Gibco) ou qualquer outro antibiótico semelhante.

As células foram propagadas em sistemas de cultura de superfície estática, operadas em descontínuo. A concentração e a viabilidade celulares foram avaliadas através do método de exclusão do Azul de Tripano. A taxa específica de crescimento (μ) e tempo de duplicação para as linhas celulares tumoral e não tumoral utilizadas, HCT116 e FHs74 Int respectivamente, estão registados na Tabela III, na descrição do Exemplo I.

Tal como no Exemplo I, procedeu-se a uma análise morfológica das células por microscopia óptica e a determinação dos valores do IC50 foi realizada pelo método da sulforodamina B (SRB).

Os resultados da análise morfológica, a uma concentração de preparação enzimática de 100 μg/mL, podem ser visualizados na Fig. 4. Ao contrário das células não tumorais FHs74 Int, que não são afectadas pela adição da preparação de ciprosina 21 recombinante, as células HCT apresentam evidentes sinais de lise 48h após a adição da preparação da enzima.

Tal como no Exemplo I, os parâmetros IC50 foram determinados após a análise microscópica para ambas as culturas. A representação gráfica da percentagem da viabilidade das células coradas com SRB, em função do logaritmo (concentração da enzima ciprosina, μg/ml), para cada cultura celular pode ser vista na Fig. 5.

Os valores dos respectivos parâmetros IC5o foram de 20,51 μg/mL para a linha celular tumoral HCT116 e de 70,50 μg/mL para a cultura de células FHs74 Int indicando uma sensibilidade da linha tumoral à preparação da ciprosina mais de três vezes superior à demonstrada pelas células controlo FHs74 Int.

Os resultados traduzem também uma eficácia letal da preparação da enzima recombinante superior à verificada com a preparação nativa, resultando a sua acção em valores de IC5o consistentemente inferiores.

Os resultados sugerem ainda que o potencial efeito citotóxico antitumoral da preparação da ciprosina recombinante se situa em concentrações até 100 μρ/ιηΐ. 22

REFERENCIAS

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Claims (20)

1. REIVINDICAÇÕES 1- Composições farmacêuticas caracterizadas por conterem a proteína ciprosina.
2. 2- Composições farmacêuticas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pela proteína ciprosina ser extraída, com ou sem purificação, directamente a partir de uma fonte natural, mais precisamente, mas não limitada a Cynara cardunculus.
3. 3- Composições farmacêuticas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pela sequência de DNA codificante para a enzima ciprosina, ou qualquer fracção da mesma, ser recombinante, e consequentemente o produto, ou produtos, da tradução e processamento após tradução ser/em extraído/s e purificado/s a partir de um microrganismo detentor da/s sua/s expressão/ões heteróloga/s, mais precisamente a partir de, mas não limitado/s a Sacharomyces cerevisiae ou Escherichia coli.
4. 4- Composições farmacêuticas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pela sequência de DNA codificante para a enzima ciprosina, ou qualquer fracção da mesma, ser recombinante, e consequentemente, o produto, ou produtos da tradução e processamento após tradução ser/em extraído/s e purificado/s a partir da cultura de uma linha celular geneticamente manipulada, como sejam, mas não limitadas a, 1 linhas celulares de insecto e linhas celulares de mamífero, tais como linhas celulares humanas.
5. 5- Composições farmacêuticas, de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizadas por conterem a holoenzima, todos os lobos/cadeias polipeptídicas/subunidades, precursoras e finais, constituintes da holoenzima, sob a forma combinada ou isolada, quer numa mistura contendo qualquer combinação e proporção das mesmas, quer numa composição contendo uma única entidade polipeptídica, produto da tradução do transcrito derivado do gene da ciprosina e/ou do posterior processamento do produto traduzido.
6. 6- Composições farmacêuticas, de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizadas por conterem o pré-propéptido da ciprosina e/ou o propéptido da ciprosina contendo a extremidade N-terminal e/ou o lobo/cadeia/subunidade madura N-terminal e/ou o propéptido da ciprosina contendo o C-terminal e/ou o domínio PSI, específico das fitepsinas vegetais e/ou o lobo/cadeia polipeptídica/subunidade madura N-terminal e/ou o polipéptido isolado contendo o domínio PSI e/ou qualquer outro produto secundário derivado do processamento ou degradação do pré-propéptido inicial.
7. 7- Composições farmacêuticas, de acordo com as reivindicações 1 a 6 caracterizadas pela sequência de nucleótidos do DNA codificante para a enzima ciprosina, ou qualquer fracção da mesma, ter sido modificada por técnicas de engenharia genética de forma a alterar a sequência de 2 ou produtos, da amino ácidos do respectivo produto expressão da sequência alterada.
8. 8- Composições farmacêuticas, de acordo com as reivindicações 1 a 7, caracterizadas por conterem um ou mais péptidos, de qualquer dimensão, cuja sequência de amino ácidos se pode/m deduzir da sequência do pré-propéptido da ciprosina, derivado ou não duma sequência de DNA previamente modificada, obtido/s através da degradação ou digestão peptídica do pré-propéptido, ou produtos do processamento natural do mesmo, ou sintético/s, obtido/s por sintese química.
9. 9- Composições farmacêuticas, de acordo com as reivindicações 1 a 8, caracterizadas por conterem qualquer espécie das anteriormente descritas, conjugadas com elementos de interacção com o sistema imunitário, como sejam anticorpos ou qualquer um dos seus lobos/cadeias/subunidades ou fracções das mesmas, imuno-estimulantes de qualquer natureza, antigénios, linfócitos-T com actividade citotóxica e/ou células dendríticas.
10. 10- Composições farmacêuticas, de acordo com as reivindicações 1 a 9, caracterizadas pela sua administração em combinação, conjugação, ou inseridas em moléculas transportadoras, ou veículos, como sejam, mas não limitadas a, nanoparticulas encapsuladoras. 3
11. 11- Composições farmacêuticas, de acordo com a reivindicação 1 a 10, caracterizadas por serem administradas em combinação, ou conjugação, como aditivos, diluentes, solventes, filtros, lubrificantes, excipientes ou estabilizadores.
12. 12- Composições farmacêuticas, de acordo com a reivindicações 1 a 11, caracterizadas por serem administradas em animais, preferencialmente mamíferos, nomeadamente em humanos.
13. 13- Composições farmacêuticas, de acordo com a reivindicação 12, caracterizadas por serem administradas de forma sistémica ou localizada, por via intravenosa, oral, ou por qualquer outra via.
14. 14- Composições farmacêuticas, de acordo com as reivindicações 12 e 13, caracterizadas por terem actividade anti-tumoral.
15. 15- Composições farmacêuticas, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por terem actividade anti-tumoral in vitro, em linhas celulares como sejam, mas não limitadas a, uma linha epitelial humana derivada de um carcinoma do colon (HCT), uma linha epitelial humana derivada de um adenocarcinoma (HeLa), uma linha epitelial humana derivada de um fibrosarcoma (HT) e uma linha epitelial humana derivada de um meduloblastoma (TE). 4
16. 16- Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por inibir em 50% o crescimento de linhas tumorais como sejam, mas não limitadas a, uma linha epitelial humana derivada de um carcinoma do colon (HCT), uma linha epitelial humana derivada de um adenocarcinoma (HeLa), uma linha epitelial humana derivada de um fibrosarcoma (HT) e uma linha epitelial humana derivada de um meduloblastoma (TE), a uma concentração de preparação de ciprosina que pode variar entre 1 e 100 ug/ml.
17. 17- Composição farmacêutica, de acordo com as reivindicação 14, caracterizada por ter capacidade de inibir em 50% o crescimento de linhas tumorais humanas a uma concentração de preparação de ciprosina que pode variar entre 0,001 e 1 ug/ml.
18. 18- Utilização das composições farmacêuticas, de acordo com as reivindicações 14 a 18, caracterizados por serem aplicadas em terapias contra formas de cancro.
19. 19- Utilização das composições farmacêuticas, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pela forma de cancro se poder incluir dentro do grupo constituído pelo cancro do colo do recto, cancro do intestino, cancro do colo do útero, cancro do ovário, cancro da próstata, cancro do estômago, cancro da mama, cancro da bexiga, linfoma, sarcoma, cancro do pâncreas, melanoma, glioma, neuroblastoma, cancro do pulmão, cancro da boca, cancro da 5 cabeça e pescoço, cancro do fígado, cancro de origem cervical, e cancros de origem hematológica.
20. 20- Composições farmacêuticas, de acordo com as reivindicações 12 a 13, caracterizadas por serem utilizadas para diminuir a velocidade de progressão, minimizar os efeitos malignos, promover o tratamento ou cura de condições fisiológicas ou patologias humanas, nomeadamente, mas não limitadas a, hipertensão arterial, infecção retroviral, degradação da hemoglobina e problemas digestivos. 28 de Setembro de 2007 6