PT101167B - Gel essencialmente isento de glucanas e pectinas compreendendo uma rede polissacaridea, seu processo de producao e penso contendo o referido gel - Google Patents

Description

Memória Descritiva

O presente invento refere-se à produção de geles a partir de matéria vegetal e aos geles resultantes.

Um grande número de fontes vegetais contêm hemiceluloses, que são compostas por vários arranjos de pentoses (tais como xilose e arabinose), hexoses (tais como manose, glucose e galactose) e/ou ácidos urónicos (tais como ácido glucurónico e galacturónico). Os exemplos de materiais hemicelulósicos incluem xilanos (tal como arabinoxilano), mananos e galactanos, que podem ser substituídos por resíduos de ácido fenólico tal como ácido ferúlico (ácido 4-hidroxi-3-metoxicinâmico), ácido coumárico (ácido p-hidroxicinâmico) ou ácido vanílico (ácido 4-hidroxi-3-metoxilbenzóico). Tais materiais ocorrem naturalmente em cereais tais como milho, cevada (incluindo cevada maltada), trigo, aveia e arroz; grãos leguminosos, tal como soja; legumes e fruta.

A memória descritiva da patente francesa 2545101 refere-se à modificação das pectinas de beterraba açucareira por reacção de um sistema de oxidação compreendendo um enzima (tal como peroxidase) e um agente de oxidação (tal como peróxido de hidrogénio) com pectinas que foram isoladas a partir da beterraba açucareira. 0 isolamento das pectinas compreende submeter a beterraba açucareira a extracção ácida e a tratamento com calor.

De acordo com o presente invento, proporciona-se um processo de produção de um material em gel, caracterizado por compreender:

(a) proporcionar um meio de partida hemicelulósico solúvel, aquoso, que é substancialmente isento de glucanos e que se obtem a partir de material vegetal de testáceo;

(b) extrair o referido meio de partida com um reagente aquoso não ácido; e (c) fazer reagir o material extractado com um sistema de

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oxidação compreendendo, pelo menos, um peróxido, juntamente com, pelo menos, uma oxigenase (tal como uma peroxidase).

meio de partida hemicelulósico, solúvel, é tipicamente preparado a partir de material vegetal testáceo, de desperdício, contendo uma quantidade significativa (tal como, pelo menos, cerca de 10%, tal como cerca de 20%) de arabinoxilano ou glucuronoarabinoxilano, que está presente na natureza, principalmente na região da parede celular. Os exemplos de tais fontes preferidas incluem materiais de desperdício que são ricos em paredes celulares, tais como casca ou farelo de cereal, ou legumes (grãos de leguminosas). A casca ou farelo de cereal típico incluí milho, cevada, trigo, arroz ou aveia, ou malte ou colmos maltados (malt culrns) (radículas de cevada germinada, secas).

Numa concretização preferida, o meio de partida hemicelulósico está numa forma substancialmente moída tendo um tamanho de partícula não superior a cerca de 100 micra. Por consequência, o material vegetal é tipicamente moído, quer na forma seca quer na forma húmida (tal como trituração ou moagem a húmido conhecida como maceração) até ao tamanho de partícula requerido. 0 material moído é tipicamente classificado com ar ou peneirado para se remover o amido. 0 processo pode compreender a remoção do amido por tratamento enzimático adequado, por exemplo, com diatase (alfa e/ou beta-amilase).

Os glucanos são, preferivelmente, removidos do material vegetal por digestão enzimática com enzimas carbo-hidrase tais como glucanase.

material tratado com enzima, insolúvel, pode então ser seco (ao ar) antes do posterior processamento. O material vegetal pode ter sido pré-tratado de forma a remover os glucanos antes da aplicação do presente processo, mas é preferível que o processo de acordo com o invento envolva o tratamento enzimático de forma a remover os glucanos a seguir à moagem do material vegetal, acima descrita.

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-3As glucanases adequadas para utilização de acordo com o invento estão disponíveis comercialmente sob as marcas comerciais Viscozyme, Biofeed e Biofeed Plus que também possuem tipicamente actividade de hemicelulase, celulase, arabinase e xilanase. Prefere-se, normalmente, a Viscozyme.

A extracção não ácida compreende, preferivelmente, o tratamento com água quente ou com base fraca tipicamente inferior a 0,5% em peso do reagente aquoso. As bases preferidas são o NaOH e o KOH. A base é, preferivelmente, utilizada numa quantidade de 0,1 a 10% (tipicamente 0,5 a 2,5%) em peso do reagente aquoso, durante períodos de 20 minutos a 5 horas (tipicamente cerca de 2 horas). Alternativamente, os geles podem ser produzidos a partir de farelo de trigo e pó ou colmos (culms) de cevada utilizando-se água quente em vez de base.

A extracção alcalina pode ocorrer a uma temperatura de 30 a 100°C e ocorre tipicamente a uma temperatura de 60 a 90°C, geralmente durante 10 minutos a 5 horas. Para os geles fortes, são preferivelmente utilizadas temperaturas de 60 a 75°C durante 0,5 a 1,5 horas; para os geles mais fracos são utilizadas preferivelmente temperaturas de 60 a 85^eC durante 2 a 5 horas. A extracção com água quente é realizada a temperaturas de 50 a 80°C (tipicamente 60 a 70 °C) durante 0,5 a 2 horas (tipicamente 1 a 1,5 horas). A extracção é geralmente efectuada com agitação suave. 0 material extractado resultante compreende em geral celulose insolúvel e hemiceluloses solúveis; a celulose é tipicamente removida por centrifugação, com ou sem acidificação.

É vantajoso evitar condições extremas (tais como contacto prolongado do meio hemicelulósico com hidróxido de sódio ou temperaturas acima do intervalo preferido anteriormente descrito) durante a extracção alcalina de forma a optimizar as características de gelificação do material gelatinoso produzido por um processo de acordo com o presente invento.

A extracção alcalina vai produzir um material extractado substancialmente isento de pectinas visto que estas últimas são

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HWA/MA/P62790PT lábeis em condições alcalinas e são extractáveis por reagentes ácidos como descrito na FR 2545101.

A seguir à extracção alcalina o material hemicelulósico, que é rico em arabinoxilanos e está substituído por ácidos fenólicos, é preferivelmente neutralizado (por exemplo, utilizando-se ácido clorídrico, sulfúrico, acético ou cítrico, dos quais se prefere o ácido cítrico). A neutralização é vantajosa visto que ajuda a evitar a hidrólise rápida dos resíduos de ácido ferúlico presentes no material extractado; tal hidrólise iria danificar as propriedades de gelificação do material. Os sólidos podem ser removidos do extracto neutralizado por filtração ou centrifugação, o que resulta em propriedades de gel melhoradas.

A purificação do material hemicelulósico pode então ser realizada por precipitação com um álcool tal como metanol ou etanol (ou álcool desnaturado industrial) ou isopropanol (propan-2-ol). Tais álcoois podem ser adicionados em quantidades de 1,5 a 3,5 volumes de acordo com a fracção desejada por massa molecular. O material hemicelulósico pode ser alternativamente purificado por passagem através de uma coluna de carbono activado e subsequentemente concentrado por precipitação com sulfato de amónio a 70-80% da saturação ou a qualquer um dos álcoois acima utilizados para precipitação. Alternativamente a concentração do eluído pode envolver secagem (tal como por pulverização ou secagem rotativa sob vácuo) e redissolução do eluído.

material hemicelulósico pode ser posteriormente purificado por tratamento de permuta iónica, de preferência com uma resina de permuta catiónica para se removerem as impurezas catiónicas.

A precipitação diferencial ou selecção por corte (cut-off”) de massa molecular (por exemplo, diafiltração ou filtração de corrente cruzada) nesta fase podem proporcionar fracções do polissacárido que variam em massa molecular e exibem

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HWA/MA/P62790PT diferentes propriedades reológicas e consequentemente propriedades viscoelásticas dos geles que produzem. Por exemplo, a precipitação com sulfato de amónio a saturações entre 60 e 80% dá fracções que diferem em massa molecular; similarmente, a adição de etanol de 1,7 a 3 volumes dá a mesma gama de fracções.

Após separação por filtração ou centrifugação, e redissolução do precipitado em água, pode-se realizar uma segunda precipitação por adição de 2 a 4 volumes de álcool. A fracção obtida pode ser filtrada (e seca no filtro utilizando-se éter) ou redissolvida em água e liofilizada.

Pode-se diminuir o teor em sal, se desejado, (por exemplo, se o gel final for posteriormente utilizado em produtos alimentares), tipicamente por diálise ou ultrafiltração de corrente tangencial. 0 material dessalinizado pode ser separado numa resina de permuta aniónica tal como Purolite A500 para produzir fracções que diferem na carga (dependente do teor em ácido urónico). A selecção de fracções nesta fase pode controlar ainda as propriedades reológicas/viscoelásticas do produto final. 0 material resultante pode ser seco nesta fase (por exemplo, por secagem por pulverização, criodessecação, secagem rotativa sob vácuo ou secagem num filtro utilizando-se éter dietilico); o material seco resultante pode ser re-hidratado antes do tratamento com um sistema de oxidação, como posteriormente descrito.

material re-hidratado (ou, se relevante, o material não seco) é então tratado com um peróxido (tal como H₂O₂) e uma peroxidase (tal como peroxidase de rábano silvestre). A extensão da reticulação no gel resultante pode ser controlada por variação da concentração de peróxido de hidrogénio e, por consequência, do número de grupos de ácido ferúlico livres que se transformam em ligações cruzadas di-ferúlicas. Por exemplo, uma solução a 0,5% do meio de partida hemicelulósico pode produzir geles com uma dureza” que varia de 0,008 Kg a 0,058 kg por ajuste da concentração de peróxido de hidrogénio na reacção enzimática. 0 termo dureza é uma medida das propriedades

¹ 74 623 HWA/MA/P62790PT viscoelásticas do gel.

As propriedades do gel podem ser posteriormente modificadas pelas condições utilizadas no tratamento com peroxidase. O tratamento com uma peroxidase (com uma pequena quantidade do peróxido) pode resultar num gel límpido de fraco até forte a concentrações de 0,05 a 10% (de preferência 0,5 a 2,5%). O restante é geralmente água, os catiões metálicos polivalentes (tais como Ca2⁺, Cu2⁺, Ζη^*, Fe^⁺ ou Al^⁺) adicionados antes do tratamento com peróxido/peroxidase vão modificar os geles, por exemplo, de forma a que eles se possam subsequentemente transformar-se em soles.

Em todos os casos, o gel resultante, que é constituído por material fibroso reticulado compreendendo uma rede polissacarídea substituída com ácido fenólico, tipicamente rica em arabinoxilanos, é altamente termoestável e pode ser autoclavado. (Por exemplo, o gel pode aguentar 103 KPa (15 Psi) a 122° C durante 15 minutos). Em particular, os geles purificados podem ser preparados com propriedades viscoelásticas e reológicas reproduzíveis.

O controlo adicional sobre as propriedades viscoelásticas (tais como fragilidade) pode ser exercido pela adição de açúcar, sais ou álcoois, ou por tratamento com enzimas carbo-hidrase.

A peroxidase é tipicamente utilizada numa quantidade de 1 a 100 microgramas por grama de substrato; o peróxido é tipicamente utilizado numa quantidade na ordem de um décimo da quantidade de peroxidase.

De acordo com um primeiro aspecto do presente invento, proporciona-se um material em gel que se obtém a partir de um meio de partida hemicelulósico, sendo o referido material em gel substancialmente isento de glucanos e pectinas e compreendendo uma rede polissacarídea que compreende:

(i) uma matriz de segmentos de cadeia polissacarídea; e ‘ 74 623

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(ii) uma multiplicidade de pontes de ferulato de reticulação dispostas em locais de ligação, em intervalos substancialmente regulares, ao longo dos segmentos reticulados.

material em gel de acordo com o primeiro aspecto do presente invento é caracterizado por uma absorvância em infra-vermelhos quer no intervalo de comprimentos de onda de 1550 - 1600 cm^-1 quer no intervalo de comprimentos de onda de 1100 - 1160 cm”¹.

De acordo com um segundo aspecto do presente invento, proporciona-se um material em gel que se obtém a partir de um meio de partida hemicelulósico, compreendendo o referido material uma matriz polissacarídea que possui uma disposição substancialmente regular de pontes de reticulação e que é caracterizada por uma absorvância em infra-vermelhos quer no intervalo de comprimentos de onda de 1550 - 1600 cm”¹ quer no intervalo de comprimentos de onda de 1100 - 1160 cm”¹.

material em gel de acordo com o segundo aspecto do presente invento é, de preferência, substancialmente isento de glucanos e pectinas. A ausência destas unidades de açúcar relativamente grandes facilita a formação de pontes de reticulação na matriz polissacarídea.

A matriz polissacarídea compreende preferivelmente uma multiplicidade de segmentos de cadeia polissacarídea ligados por meio das pontes de reticulação. A disposição regular de pontes de reticulação consiste tipicamente, essencialmente em pontes de ferulato dispostas em locais de ligação, a intervalos substancialmente regulares, ao longo dos segmentos de cadeia da matriz polissacarídea. As porções de ferulato são responsáveis pelas características de absorvância em infra-vermelhos quer no intervalo de comprimentos de onda de 1550 - 1600 cm”¹ quer no intervalo de comprimentos de onda de 1100 - 1160 cm”¹, exibida pelo material em gel.

A frequência de pontes de ferulato na rede polissacarídea

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-8influencia as propriedades do gel resultante. Como anteriormente descrito, a extensão da reticulação por ferulato pode ser substancialmente controlada por condições de reacção seleccionadas durante o tratamento com a peroxidase e oxigenase, em que os resíduos de ácido ferúlico são acoplados oxidativamente para formar as reticulações di-ferulato.

Um material em gel fornecido com um arranjo substancialmente regular de pontes de ferulato, como anteriormente descrito, aproxima-se de perto de um sistema de gel ideal. 0 termo sistema de gel ideal como aqui utilizado refere-se a um gel de estrutura macromolecular substancialmente ordenada, cuja produção é desejável devido às propriedades substancialmente previsíveis do gel resultante.

Um gel de acordo com o presente invento é preferivelmente obtido a partir de um meio de partida hemicelulósico de acordo com um processo substancialmente como aqui anteriormente descrito. Por consequência, o presente invento permite a produção de um sistema de gel ideal a partir de um material biológico que ocorre naturalmente. A definição anterior de um gel de acordo com o presente invento abrange também um material em gel obtido por técnicas de síntese química.

Prefere-se que a rede polissacarídea compreenda uma pluralidade de cadeias polissacarídeas discretas ligadas por meio das pontes de ferulato. Os segmentos de cadeia polissacarídea são preferivelmente ricos em porções arabinoxilano ou glucuronoarabinoxilano. Tipicamente, a integridade molecular das porções arabinoxilano ou glucuronoarabinoxilano é substancialmente quebrada como resultado do tratamento enzimático do meio de partida hemicelulósico. Como anteriormente descrito, o tratamento enzimático envolve, tipicamente, o tratamento por glucanases adequadas, tais como as glucanases disponíveis comercialmente sob as marcas comerciais Viscozyme, Biofeed e Biofeed Plus.

material em gel pode compreender adicionalmente um ' 74 623

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líquido aquoso, tal como água, que está preferivelmente presente numa quantidade de 98-99,9% em peso. Adicionalmente, podem estar presentes no material em gel catiões metálicos como anteriormente descrito.

A massa molecular do material em gel de acordo com o presente invento está, tipicamente, no intervalo de 80 a 600 kdalton (mais geralmente 90 a 500 kdalton).

Adicionalmente, o presente invento proporciona um material em gel obtido por um processo substancialmente como acima descrito.

Podem ser produzidas soluções viscosas em vez de geles quer por limitação posterior da concentração de peróxido quer por utilização de uma solução tendo uma concentração hemicelulósica abaixo da concentração critica de formação de gel, de cerca de 0,05%. Por exemplo, podem ser produzidas soluções de viscosidade que varia entre 0,1 e 0,5 Pa.s (100 e 500 cP) a partir de uma concentração hemicelulósica de 0,1%, por limitação da concentração de peróxido a níveis inferiores àqueles que formam geles.

Um extracto produzido substancialmente como anteriormente descrito pode co-gelificar com outros materiais derivados de hemicelulose de forma a que os dois agentes de gelificação sejam sinérgicos. Por exemplo, o material extractado derivado de milho, no processo de acordo com o invento, pode ser misturado com o material extractado derivado de outros cereais (tais como trigo, malte ou cevada) no processo de acordo com o invento, em proporções nas quais nenhum deles forma, sozinho, um gel firme, mas nas quais se forma um gel firme com os dois materiais. Por exemplo, pode-se obter um gel firme com 0,7 a 3% de material derivado de milho e cerca de 2% de material derivado de trigo (estando todas as proporções anteriores numa base sólida).

material em gel de acordo com o invento pode ter uma ampla variedade de utilizações, das quais são exemplificativas ^r 74 623

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-10as que se seguem:

1. Em composições médicas, por exemplo, como uma formulação tópica ou penso para ferida (tal como para o tratamento de queimaduras) ou agente de desbridamento, como um veículo para ferro ou zinco, como um lubrificante, ou um espessante para composições parentéricas, ou como vim agente de encapsulação, ou como um veículo de libertação lenta para distribuição da droga (quer para distribuição oral, parentérica quer para distribuição anal), ou para utilização com a finalidade de implantações e prótese para fins ortopédicos (tal como geles aliviadores de pressão), para fins oculares ou utilização em supositórios. Uma aplicação médica particularmente preferida do gel é a utilização como um penso para ferida e é adicionalmente proporcionado pelo presente invento um penso para ferida tendo uma região de contacto de superfície compreendendo um gel como anteriormente descrito. O penso para ferida consiste essencial e vantajosamente num material em gel substancialmente como anteriormente descrito.

2. Em produtos alimentares ou rações para animais, por exemplo, como um gel de endurecimento a frio para utilização como um estabilizante para gelados ou semelhantes, como um agente de suspensão para partículas tais como côco, como um agente de revestimento da carne ou semelhantes, como um agente de endurecimento de geleias, ou como um agente espessante para molhos de carne, purés, doces, sopas ou semelhantes, como uma fibra solúvel, como um lubrificante de alimentos, como um agente de viscosidade para aromas, como um gel para enlatados, alimentos funcionais ou isco para peixe.

3. Na indústria petrolífera, por exemplo, para isolar os estratos acima dos depósitos de petróleo, como um agente de isolamento na perfuração de petróleo, como um aditivo para lamas de perfuração ou semelhantes, e para a recuperação de petróleo a partir de estratos possuidores de petróleo.

4. Na indústria microbiológica, por exemplo, como agente de gelifícação, um biorecipiente de esporos ou um biorecipiente de

HWA/MA/P62790PT * 74 623 culturas.

5. Na indústria agrícola, como um biorecipiente de libertação lenta de pesticida, um meio de cultura de plantas, um agente anti-secagem, um material de isolamento de silos de forragem ou semelhantes.

Os geles obtidos de acordo com o invento podem ser preparados de forma a que se transformem eventualmente na forma de sol.

O presente invento é ainda ilustrado por referência aos Exemplos seguintes e desenhos em anexo os quais não limitam, de forma alguma, o âmbito do invento. Nos desenhos em anexo:

a Figura 1 é uma comparação gráfica das propriedades de dureza, elasticidade e fragilidade de um gel de acordo com o presente invento (identificado como Gel G.B.), um gel de pectina e gelatina;

a Figura 2 ilustra a variação da elasticidade e fragilidade com a concentração polissacarídea de um gel de acordo com o presente invento;

a Figura 3 ilustra a variação da dureza e adesividade com a concentração polissacarídea de um gel de acordo com o presente invento;

a Figura 4 ilustra os espectros de UV de (i) uma solução de ácido ferúlico (Figura 4a), e (ii) um gel de acordo com o presente invento (Figura 4b);

a Figura 5 é um espectro de UV de referência a partir do qual pode ser calculada a extensão de reticulação por di-ferulato num gel de acordo com o presente invento; e a Figura 6 ilustra os espectros IV de (i) um polissacárido não gelifiçado (Figura 6a), e (ii) um gel de acordo com o presente invento (Figura 6b).

EXEMPLO 1

Produção de um Gel Firme a partir de Milho (Zea Mavs)

1. Moagem farelo de milho foi submetido a moagem a qual envolveu a ¹ 74 623

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trituraçâo a húmido inicial seguida por trituração a seco até um tamanho de partícula médio no intervalo de 80-300 micra.

2. Tratamento Enzimático

0,01% p/p de uma enzima citase a 45 °C durante 2 a 24 horas dependendo do tipo e textura da matéria prima (por exemplo, para farelo de milho moído um período de cerca de 6 horas).

3. Extraccão com Base

Preparou-se uma suspensão a 10% (p/v) do farelo de milho moído em hidróxido de potássio a 1% p/v (aquoso) e agitou-se suavemente a 65-80°C durante 2-3 horas.

4. Separação material insolúvel, consistindo essencialmente em celulose, foi removido por centrifugação a 2500 rpm.

5. Neutralização/Diálise sobrenadante foi cuidadosamente decantado, neutralizado com ácido clorídrico (ou ácido cítrico) e dialisado contra água da rede, corrente, durante 2 dias.

6· Gelificacão

A concentração do extracto dialisado foi ajustada a 3% p/v com água desionizada. Retiraram-se 100 ml desta solução e misturou-se completamente 1 ml de uma solução de peroxidase de rábano silvestre a 100 microgramas/ml. Quando distribuídos, adicionou-se e misturou-se 0,5 ml de peróxido de hidrogénio a 40 microgramas de I^C^/ml; a mistura foi então deixada repousar à temperatura ambiente (5-15 min) ou a uma temperatura mais elevada (1-2 min a 40°C).

Utilizou-se um Instron Texture Profile Analyser para se medir a dureza, fragilidade e elasticidade do que se segue: - um gel produzido pelo exemplo anterior, gelatina e um gel de pectina reticulado com ácido ferúlico que foi preparado de acordo com os ensinamentos da memória descritiva da patente Francesa 2545101.

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-13Como se pode observar a partir da Figura 1, o gel de acordo com o presente invento tinha uma dureza superior relativamente à gelatina e ao gel de pectina, uma elasticidade semelhante à da gelatina e era menos frágil do que qualquer um dos outros dois geles.

As Figuras 2 e 3 mostram, respectivamente, a variação da elasticidade e fragilidade, dureza e adesividade com a concentração polissacarídea do gel (p/v).

EXEMPLO 2

Co-gelificacão dos Extractos de Farelo de Milho e de Farelo de Trigo

1. Preparou-se um extracto farelo de milho como nos passos 1-4 do Exemplo 1.

2. 0 farelo de trigo foi macerado em água quente (70°C) e removeram-se as gomas e amidos solúveis em água quente por centrifugação a 2500 rpm, durante 15 minutos, rejeitando-se os sobrenadantes.

3. A pelota de material insolúvel foi ressuspensa em água quente (80°C) e adicionalmente centrifugada para se remover a matéria solúvel. Este procedimento foi repetido até não ser removida mais matéria solúvel.

4. A matéria insolúvel remanescente foi suspensa a 10% p/v em KOH a 2% e agitada suavemente a 65-80°C durante 2-3 horas, após o que se removeu o material insolúvel por centrifugação a 2500 rpm durante 20 minutos.

5. 0 sobrenadante foi neutralizado com ácido (clorídrico ou cítrico) e dialisado contra água corrente durante 2 dias.

6. Os extractos obtidos nos passos 1-5 e o extracto de farelo milho obtido nos passos 1-4 do Exemplo 1 foram misturados de forma a darem uma solução contendo extracto de farelo de trigo a 2,0% p/v e extracto de farelo de milho a 0,5% p/v. A 100 ml

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HWA/MA/P62790PT desta mistura adicionou-se com mistura 1 ml de uma solução de peroxidase de rábano silvestre a 100 microgramas/ml, seguido por 0,5 ml de peróxido de hidrogénio a 40 microgramas de H₂O₂/ml. Após mistura, a solução foi deixada repousar durante 5-15 minutos à temperatura ambiente, durante 1-2 minutos a 40°C ou durante menos do que um minuto a 50°C.

Por outro lado, nem os extractos de farelo de trigo a 2,0% nem os extractos de farelo de milho a 0,5% descritos acima formam um gel firme quando utilizados sozinhos.

EXEMPLO 3

Purificação do Extracto de Farelo de Milho

Purificou-se um extracto de farelo de milho preparado como nos passos 1-4 do Exemplo 1, como se segue:

1. Neutralizacão extracto foi neutralizado com ácido clorídrico até pH 6-6,5 e diluído até cerca de 1,5% de matéria seca com água.

2. Remoção dos Sais (Opcional) extracto foi dessalinizado por diálise contra água corrente durante 3 dias. Alternativamente, este passo pode envolver ultrafiltração de corrente tangencial.

3. Separação

O extracto foi então passado através de uma coluna contendo carbono activado a uma velocidade de 2-4 volumes de leito por hora até estar exausta a capacidade da coluna. Obteve-se um eluído que estava substancialmente isento de mono e oligossacáridos, ácidos ferúlico e diferúlico livres e de outros compostos orgânicos que contribuem para a cor e odor.

4. Concentração eluído foi concentrado por precipitação com sulfato de amónio (podiam ter sido utilizados outros reagentes de precipitação, tais como o etanol, IMS,propano-2-ol ou metanol). Alternativamente, a concentração podia ter sido realizada por ^s 74 623

HWA/MA/P62790PT y/y '

-15^CÍ' ^J - , secagem (por pulverização ou secagem rotativa sob vácuo) e redissolução do eluído.

5. Precipitação

O precipitado redissolvido produzido na fase 4 foi submetido a precipitação com álcool por adição de 2,8 volumes de álcool.

6. Tratamento com Peróxido precipitado redissolvido foi adicionado a água para produzir um meio gelificante de concentração hemicelulósica entre 0,05 e 3,0% p/v. Adicionaram-se ao meio 30-100 micromoles de peróxido por grama do polissacárido e 100-200 microgramas de enzima peroxidase.

processo de purificação anterior podia ser similarmente aplicado a um extracto de farelo de trigo.

EXEMPLO 4

A presença de reticulações de di-ferulato num material em gel de acordo com o presente invento foi investigada espectrofotometricamente investigada.

Pode-se observar, com referência ao espectro de ultra-violeta mostrado na Figura 4a que se obteve um pico de absorvância característico para uma solução de ácido ferúlico a 50 μΜ, a um comprimento de onda de excitação de cerca de 320 nm. (Sendo o ácido ferúlico conhecido por possuir um pico de absorvância a 320 nm, o coeficiente de extinção = 15 100 para este pico, embora o di-ferulato mostre pequena absorvância a este comprimento de onda). Por contrário, com referência à Figura 4b, não se obteve um tal pico de absorvância característica a 320 nm para um gel de acordo com o presente invento, confirmando assim a ausência de resíduos de ácido ferúlico no gel.

Verificou-se ser possível investigar a extensão da reticulação de di-ferulato no gel por correlação da absorvância em UV do gel contra um polissacárido não gelificado tendo ‘ 74 623

HWA/MA/P62790PT resíduos de ácido ferúlico.

A correlação foi alcançada por medição da absorvância em UV do gel, a 320 nm, contra a absorvância do polissacárido não gelifiçado ao mesmo comprimento de onda. A Figura 5 mostra o pico de absorvância negativa, obtido, sendo a extensão da reticulação de di-ferulato calculada a partir do pico negativo.

EXEMPLO 5

A reticulação de di-ferulato foi ainda investigada por espectrofotometria de infra-vermelhos.

Os ácidos aromáticos substituídos possuem muitas bandas de absorvância características entre os números de onda 1480 e 1700 cm^--*- e entre os números de onda 1000 e 1250 cm”·*·.

O aparecimento de picos de absorvância adicionais a cerca de 1550 - 1600 cm”¹ e à volta de 1100 - 1160 cm”¹ é característico de grupos bifenilo substituídos e é indicativo da formação do di-ferulato.

Pode-se observar a partir das comparações da Figura 6a (um espectro de infra-vermelho de um polissacárido não gelifiçado) e Figura 6b (um espectro de infra-vermelho de um gel de acordo com o presente invento) que há picos de absorvância adicionais na região de comprimentos de onda 1550 a 1600 cm”¹ e 1100 - 1160 cm”¹. Os picos adicionais foram atribuídos à presença de reticulações de di-ferulato, como anteriormente discutido.

Lisboa, 30. oez. 1992

Por GB BIOTECHNOLOGY LIMITED =0 AGENTE OFICIAL=

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Claims (51)

1. REIVINDICAÇÔES

   1 - Material em gel obtenível a partir de um meio de partida hemicelulósico, caracterizado por estar substancialmente isento de glucanas e pectinas e por compreender uma rede polissacarídea que compreende:

   (i) uma matriz de segmentos de cadeia polissacarídea; e (ii) uma multiplicidade de pontes de ferulato de reticulação ligadas, a intervalos substancialmente regulares, ao longo dos referidos segmentos reticulados.
2. 2 - Material em gel de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ter uma absorvância em infravermelhos quer na gama de comprimentos de onda de 1550 - 1600 cm^-1 quer na gama de comprimentos de onda de 1100 - 1160 cm¹.
3. 3 - Material em gel obtenível a partir de um meio de partida hemicelulósico, caracterizado por o referido material em gel compreender uma matriz polissacarídea que possui uma disposição substancialmente regular de pontes de reticulação e sendo caracterizado por uma absorvância em infra-vermelhos quer na gama de comprimentos de onda de 1550 - 1600 cm^-1 quer na gama de comprimentos de onda de 1100 - 1160 cm¹.
4. 4 - Material em gel de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por estar substancialmente isento de glucanas e pectinas.
5. 5 - Material em gel de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado por a referida matriz polissacarídea compreender uma multiplicidade de segmentos de cadeia polissacarídea ligados uns aos outros por meio das referidas pontes de reticulação.
6. 6 - Material em gel de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por as referidas pontes de reticulação estarem dispostas em locais de ligação, a intervalos substancialmente regulares, ao longo dos referidos segmentos de cadeia.

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   HWA/MA/P62790PT
7. 7 - Material em gel de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 6, caracterizado por as referidas pontes de reticulação consistirem essencialmente em pontes de ferulato.
8. 8 - Material em gel de acordo com qualquer uma das reivindicações l a 7, caracterizado por ser derivado de um meio de partida hemicelulósico.
9. 9 - Material em gel de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o referido meio de partida hemicelulósico ser obtido a partir de material vegetal testáceo.
10. 10 - Material em gel de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por a referida matriz polissacarídea compreender uma pluralidade de cadeias polissacarídeas discretas.
11. 11 - Material em gel de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por os referidos segmentos de cadeia conterem porções arabinoxilano e/ou glucuronoarabinoxilano.
12. 12 - Material em gel de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por a integridade molecular das referidas porções arabinoxilano e/ou glucuronoarabinoxilano ter sido substancialmente quebrada.
13. 13 - Material em gel de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por possuir um peso molecular na gama de 80 a 600 kdaltons.
14. 14 - Material em gel de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por compreender adicionalmente um líquido aquoso presente numa quantidade de 98 a 99,9% em peso.
15. 15 - Material em gel de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o referido líquido aquoso consistir essencial- ³ 74 623

    HWA/MA/P62790PT mente em água.
16. 16 - Material em gel de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por conter catiões metálicos compreendendo um ou mais de Ca²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Fe³⁺ e Al³⁺.
17. 17 - Processo de produção de um material em gel, caracterizado por compreender:

    (a) proporcionar um meio de partida hemicelulósico solúvel, em água, que é substancialmente isento de glucanas e que é obtenível a partir de material vegetal testáceo;

    (b) extracção do referido meio de partida com um reagente aquoso não acídico; e (c) a reacção do material extractado com um sistema de oxidação compreendendo pelo menos um peróxido, juntamente com pelo menos uma oxigenase.
18. 18 - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por o meio de partida ser preparado a partir de material vegetal testáceo, de desperdício, contendo pelo menos cerca de 10% de arabinoxilano e/ou glucuronoarabinoxilano.
19. 19 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o referido material de desperdício compreender casca ou farelo de cereais, ou legumes.
20. 20 - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a casca ou farelo de cereais compreender um ou mais de milho, cevada, trigo, arroz ou aveia, ou malte ou colmos maltados (malt culrns).
21. 21 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 20, caracterizado por o meio de partida estar numa forma substancialmente moída tendo um tamanho de partícula não superior a cerca de 100 micra.

    Processo de acordo com a reivindicação 21, ¹ 74 623

    HWA/MA/P62790PT caracterizado por o material moído ser peneirado ou classificado com ar para remover o amido.
22. 23 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 22, caracterizado por compreender a remoção do amido por tratamento enzimatico.
23. 24 - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por o tratamento enzimático compreender o tratamento com alfa- e/ou beta-amilase.
24. 25 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 24, caracterizado por as glucanas terem sido removidas do meio de partida hemicelulósico por digestão enzimática com material de enzima carbo-hidrase.
25. 26 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 25, caracterizado por a extracção compreender o tratamento com água quente ou um alcali fraco, numa quantidade inferior a 0,5% em peso do referido reagente aquoso.
26. 27 - Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por o alcáli ser NaOH ou KOH.
27. 28 - Processo de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizado por o alcáli ser utilizado numa quantidade de 0,1 a 10% em peso do referido reagente aquoso durante períodos de 20 minutos a 5 horas.
28. 29 - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracterizado por o alcáli ser utilizado numa quantidade de 0,5 a 2,5% em peso do referido reagente aquoso durante cerca de 2 horas.
29. 30 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 29, caracterizado por a extracção alcalina ser realizada a uma temperatura de 30 a 100°C.

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    HWA/MA/P6 2 7 9 OPT
30. 31 - Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por a extracção com água quente ser realizada a uma temperatura de 50 a 80°C durante 0,5 a 2 horas.
31. 32 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 31, caracterizado por compreender tratamento ácido a seguir à extracção.
32. 33 - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o ácido compreender ácido clorídrico, sulfúrico, acético ou cítrico.
33. 34 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 33, caracterizado por o gel resultante ser seco.
34. 35 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 34, caracterizado por o meio de partida hemicelulósico ser substancialmente purificado por precipitação com um álcool.
35. 36 - Processo de acordo com a reivindicação 35, caracterizado por o álcool ser metanol, etanol ou isopropanol.
36. 37 - Processo de acordo com a reivindicação 35 ou 36, caracterizado por o álcool ser adicionado em quantidades de 1,5 a 3,5 volumes.
37. 38 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 37, caracterizado por o meio de partida hemicelulósico ser purificado por tratamento de permuta iónica.
38. 39 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 38, caracterizado por o meio de partida hemicelulósico ser purificado por passagem através de uma coluna de carbono activado.
39. 40 - Processo de acordo com a reivindicação 38 ou 39, caracterizado por o eluído ser concentrado por secagem rotativa sob vácuo ou por pulverização.

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    HWA/MA/P62790PT
40. 41 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 40, caracterizado por o meio de partida hemicelulósico extractado ser concentrado por precipitação com sulfato de amónio, metanol, etanol ou isopropanol.
41. 42 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 41, caracterizado por compreender a diálise ou ultrafiltração por corrente tangencial para diminuir o teor em sal do meio de partida hemicelulósico.
42. 43 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 42, caracterizado por a oxigenase consistir numa peroxidase.
43. 44 - Processo de acordo com a reivindicação 43, caracterizado por a peroxidase consistir em peroxidase de rábano silvestre.
44. 45 - Processo de acordo com as reivindicações 43 ou 44, caracterizado por a peroxidase ser utilizada numa quantidade de 1 a 100 microgramas por grama do referido material extractante.
45. 46 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 45, caracterizado por o peróxido ser utilizado numa quantidade de cerca de um décimo da quantidade da referida peroxidase.
46. 47 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 46, caracterizado por o peróxido consistir em peróxido de hidrogénio.
47. 48 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 47, caracterizado por compreender a adição de catiões metálicos polivalentes ao referido meio de partida ou ao referido meio de partida extractado antes do tratamento com peróxido.
48. 49 - Processo de acordo com a reivindicação 48, caracterizado por os catiões metálicos compreenderem um ou mais

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    HWA/MA/P6 27 9ΟΡΤ de Ca²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Fe³⁺ e Al³⁺.
49. 50 - Material em gel, caracterizado por ser produzido por um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 17 a 49.
50. 51 - Penso para ferida tendo uma região de contacto com a superfície caracterizada por compreender um material em gel de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, ou com a reivindicação 50.
51. 52 - Penso para ferida de acordo com a reivindicação 51, caracterizado por consistir essencialmente no referido material em gel.