PL98545B1 - Sposob enzymatycznej konwersji glikozy we fruktoze - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób enzymatycz¬ nej konwersji glikozy we fruktoze w roztworach zawierajacych glikoze.

Znanych jest wiele sposobów wytwarzania roz¬ tworów zawierajacych fruktoze. Sposoby te spro¬ wadzaja sie do trzech glównych kategorii. W pier¬ wszej z nich sacharoze poddaje sie inwersji do glikozy i fruktozy za pomoca kwasu lub inwerta¬ za W drugiej kategorii sposobów glikoze przeksztal¬ ca sie we fruktoze stosujac katalizatory alkalicz¬ ne. Jest wiele publikacji i opisów patentowych, w których omówiono rózne katalizatory alkaliczne i ich zastosowanie podczas konwersji glikozy we fruktoze. Uzycie zasadowych katalizatorów jest o- mówione na przyklad w opisach patentowych St.

Zjedn. Ameryki nr nr 2 487 121, 2 746 889, 2 354 665, 3 285 776, 338 245 i 3 305 395. Jednakze sposoby al¬ kalicznej izomeryzacji sa obarczone licznymi wy¬ raznymi wadami. Na przyklad, na skutek braku selektywnosci zasadowych katalizatorów tworza sie rózne niepozadane produkty uboczne, takie jak du¬ ze ilosci produktów barwnych i produktów o cha¬ rakterze kwasnym. Oczyszczanie roztworów, w których przeprowadzono alkaliczna izomeryzacje od niepozadanych produktów ubocznych tak, aby moz¬ na bylo uzyskac odpowiedni produkt koncowy na¬ strecza wiele klopotów i podraza koszty procesu.

Trzecia kategoria sposobów wytwarzania roztwo¬ rów fruktozy jest enzymatyczna konwersja glikozy w roztworach zawierajacych glikoze, takich jak na przyklad syrop kukurydziany. Znane sa rózne drob¬ noustroje wytwarzajace izomeraze glikozowa. Na przyklad, w artykule opublikowanym w Science 125, strony 648—649 w 1957 roku opisano enzym produkowany przez Pseudomonas hydrophila, po¬ wodujacy izomeryzacje glikozy we fruktoze. Rów¬ niez brytyjski opis patentowy nr 1 103 394 i japon¬ ski opis patentowy nr 7428 /1966/ udzielony na rzecz Takasaki i wspólpracowników, wymienia drobnoustroje nalezace do rodzaju Streptomyces, takie jak: Streptomyces flavovirens, Streptomyces achromogenes, Streptomyces echinatus i Strepto¬ myces albus wytwarzajace izomeraze glikozowa.

Istnieje wiele innych drobnoustrojów wytwarzaja¬ cych izomeraze glikozowa. Naleza do nich na przy¬ klad: Acrobacter cloacae, Bacillus mageterium, Acetobacter suboxydans, Bacillus fructose i Lacto- -bacillus fermenti.

Ze wzgledu na ekonomike wytwarzania izome- razy glikozowej jest szczególnie istotne stosowa¬ nie izomerazy w warunkach, które gwarantuja uzy¬ skanie maksymalnej wydajnosci fruktozy, przy mi¬ nimalnej ilosci uzytej izomerazy glikozowej. Po¬ nadto warunki w jakijch prowadzi sie proces po¬ winny byc takie, aby uzyskiwac jak najmniejsza ilosc niepozadanych produktów ubocznych.

Izomeraza glikozowa jest wytwarzana wewnatrz¬ komórkowe przez powyzej wymienione drobnou¬ stroje. Tak wiec, przewazajaca czesc izomerazy gli- 98 54598 545 kozowej znajduje sie wewnatrz i/lub na scianach komórkowych drobnoustrojów. Zwykle w proce¬ sie izomeryzacji glikozy we fruktoze stosuje sie te komórki. Podczas procesu izomeryzacji izomeraza zostaje uwolniona lub wyekstrahowana z komórek.

Uwolniona lub wyekstrahowana z komórek izo¬ meraza jest prawie rozpuszczalna. Wydzielenie roz¬ puszczonej izomerazy w celu jej ponownego uzy¬ cia w reakcji izomeryzacji jest dosyc kosztowne i skomplikowane.

W pracy Tsumury i wspólpracowników zatytu¬ lowanej „Ciagla metoda izomeryzacji glikozy na kolumnie z zaadsorbowanym enzymem" opubliko- rj^^^^^j^g^-^Shokuchia Kogyo Gakkaishi U/iiAti&i opisano |netode, w której izomeraze gli- Ikozowa pochodzaca^ ze Streptomyces phaechromo- gene*?osadzono na* sefadeksie — DEAE. Osadzony enz^m umieszcza *sle w kolumnie, przez która prze- W ponizszej tablicy 1 zamieszczono dane obliczone wedlug artykulu Tsamury i wspólpracowników.

Tablica1 J Dane obliczone wedlug artykulu Tsamury i wspólpracowników puszcza"sie^naslepnie w sposób ciagly roztwór gli¬ kozy. Podczas zetkniecia z osadzonym enzymem glikoza ulega izomeryzacji i w sposób ciagly po¬ wstaje fruktoza. Aczkolwiek sposób opisany w tej publikacji zasadniczo rozwiazuje problem ponow¬ nego uzycia izomerazy glikozowej, to jednak pro¬ ces prowadzony jest w tak malej skali, ze jego parametrów nie daje sie zadawalajaco przeniesc na skale przemyslowa. Jest bardzo trudno, a w zasadzie nawet niemozliwe zastosowanie tego spo¬ sobu w skali przemyslowej i otrzymanie ta meto¬ da roztworu zawierajacego glikoze i fruktoze o zadowalajacej jakosci.

W celu porównania sposobu wedlug wynalazku ze sposobem znanym dokonano oceny danych za¬ wartych w artykule Tsamury i wspólpracowników pod tytulem „Ciagla izomeryzacja glikozy na ko¬ lumnie z zaadsorbowanym enzymem", wspomnia¬ nym poprzednio, który ukazal sie w „Journal of Food Science and Technology" tom 14, no. 12, str. 539—540 /1967/.

Oceny wyników dokonano w nastepujacy sposób: Frakcje glikozy skonwertowanej we fruktoze /w I równowazniku/ obliczono dla kilku wybranych numerów probówek dzielac przez 100 odpowiednie wartosci rzednych, oznaczonych jako stopien izo¬ meryzacji. Numery probówek i czas odbierania w minutach na probówke uzyto do obliczenia czasu eluowania kolumny podczas odbierania odcieku z kolumny do kazdej z probówek. W ten sposób obliczono szereg wartosci I w odpowiadajacych so¬ bie okresach eluowania kolumny. Szybkosc prze¬ plywu R obliczono na podstawie objetosci odbie¬ ranego wycieku — 2,2 ml na probówke i czasu odbierania — minuty na probówke.

W ten sposób okreslono szybkosc przeplywu w ml/godz. dla kazdego z czasów eluowania kolum¬ ny. Wykorzystujac te informacje okreslono wskaz¬ nik aktywnosci dla wybranych czasów eluowania kolumny. W równaniu E jest stale dla kazdej ko¬ lumny i moze miec kazda wartosc inna niz zero, chyba ze nalezy podac okreslony wskaznik aktyw¬ nosci. Przy ocenie wartosci stabilnosci izomerazy zwiazanej z Sefadeksem-DEAE poczatkowa ilosc jednostek IGIU w kolumnie, czyli E nie byla zna¬ na i dlatego wartosc E okreslono dowolnie jako I. 45 Czas eluowania kolumny /godz./ 3,3 4,3 8,8 13,3 ,6 17,8 ,1 22,3 Szybkosc przeplywu /ml godz.^1/ 13,2 22,0 9,8 9,8 9,8 9,8 9,8 9,8 I 0,440 0,340 0,475 0,475 0,460 0,440 0,420 0,410 Wskaznik aktywnosci 11,83 1 ,73 12,15 12,15 ,38 8,78 7,62 ' 7,15 Na fig. na rysunku przedstawiono zaleznosc wskaznika aktywnosci z tablicy 1 od wartosci sta¬ bilnosci. W celu okreslenia wartosci stabilnosci w okresie 23,8 godz. przeprowadzono liniowa ekstra¬ polacje danych na wykresie. Nalezy dodac, ze wy¬ branie odpowiedniego wskaznika aktywnosci czte¬ rogodzinnej bylo trudne ze wzgledu na mala ko¬ relacje poczatkowych danych uzyskanych w okre¬ sie pierwszych 10 godzin, co spowodowalo pewne trudnosci w odczytywaniu danych. Wzglednie mala korelacja charakteryzuje dane otrzymane przez Tsamure i wspólpracowników co powoduje, ze na wykresie wystepuje znaczny rozrzut wyników.

Nalezy równiez zaznaczyc, ze dane wymienione przez Tsamure i wspólpracowników uzyskano przy zastosowaniu nieco innych warunków dla okresle¬ nia wartosci stabilnosci, niz warunki w sposobie wedlug wynalazku. Róznice te zestawione w na¬ stepujacej tablicy 2.

Tablica 2 Warunki Temperatura PH Stezenie substratu Stezenie Mg++ Stezenie Co++ Warunki Tsamury i wspólpracow¬ ników 60°C 7,6—7,8 1,8 mol. 1,5X10-* mola 0 Warunki 1 okreslania wartosci stabil¬ nosci w sposo¬ bie wedlug wynalazku 60°C 6,5 3 mol. 0,6X10"* mola lX10-» mola Na podstawie doswiadczenia w dziedzinie izo¬ meryzacji glikozy z izomeraza ze Streptomyces sp.

ATCC 21175 mozna stwierdzic, ze wymienione róz¬ nice powoduja nastepujace skutki: 1. Zastosowanie wartosci pH 7,6—7,8 powoduje okolo 10t/t-owy wzrost wartosci stabilnosci w po¬ równaniu z wartoscia stabilnosci uzyskana przy wartosci pH=6,5. # 2. 1,8 molowe stezenie substratu powoduje wzrost98 545 wartosci stabilnosci o okolo 15f/t w porównaniu z wartoscia uzyskana przy 3 molowym stezeniu sub- stratu. 3. Róznica stezenia Mg^ i Co++ ma nieznaczny wplyw na wartosc stabilnosci.

Z powyzszego wynika, ze stabilnosc izomerazy glikozowej zwiazanej z Sefadeksem DEAE opisa¬ na przez Tsamure i wspólpracowników okreslona w warunkach odpowiadajacych stosowanym w spo¬ sobie wedlug wynalazku wynosi nawet mniej niz 23,8 godziny.

Istnieje zatem potrzeba znalezienia ciaglej me¬ tody izomeryzacji glikozy do fruktozy w skali przemyslowej.

Sposobem wedlug wynalazku enzymatyczna kon¬ wersje glikozy we fruktoze prowadzi sie sporza¬ dzajac roztwór zawierajacy glikoze o lepkosci 0,5— —100 centypauzów, wartosci pH wynoszacej 6—9 i zawartosci glikozy 5—801/* wagowych. Konwersje prowadzi sie w temperaturze 20—80°C przepusz¬ czajac roztwór glikozy przez warstwe zloza ze zwiazana izomeraza glikozowa, w którym izomera- za glikozy zwiazana jest z obojetnym nosnikiem o aktywnosci wynoszacej 3 jednostki IGIU na cm1 zloza i stabilnosci przynajmniej 50 godzin, z taka predkoscia, aby konwersji ulegalo do okolo 54*/* glikozy. Barwa poddawanego konwersji roztworu poglebia sie mniej niz o 2 jednostki barwne i nie obserwuje sie powstawania zauwazalnych ilosci psykozy.

Ponizej podano znaczenie rozmaitych specyficz¬ nych terminów i zwrotów uzytych uprzednio i w dalszej czesci opisu oraz w przykladach.

Stabilnosc oznacza sie umieszczajac odpowied¬ nia ilosc osadzonej izomerazy glikozowej w ko¬ lumnie do uzyskania w niej aktywnosci wynosza¬ cej 1000—4000 jednostek IGIU. Przez kolumne prze¬ puszcza sie w temperaturze 60°C 3 molarny w stosunku do glikozy, 0,001 molarny w stosunku do COCl2 i 0,005 molarny w stosunku do NaSOs roz¬ twór o wartosci pH równej 6,5 z predkoscia 10— —200 ml/godz. Frakcje wycieku konwertowanego roztworu glikozy oznacza sie po uplywie 4 godzin, aby miec pewnosc, ze podloze z którym zwiazana jest izomeraza glikozowa zostalo ustabilizowane.

Wspólczynnik aktywnosci osadzonej izomerazy gli¬ kozowej wyznacza sie korzystajac z nastepujacego "wzoru: wspólczynnik aktywnosci=/R/E/log/0,504/0,504—I/, w którym I oznacza te czesc glikozy, która ulegla konwersji, R oznacza szybkosc przeplywu w ml/godz., a E oznacza wyjsciowa ilosc jednostek IGIU w kolumnie.

Wspólczynnik aktywnosci oznacza sie w wybra¬ nych odstepach czasu, a czas w którym wartosc wspólczynnika aktywnosci osiagnie polowe wartos¬ ci wyjsciowej /wartosc po uplywie 4 godzin/ ozna¬ cza wartosc stabilnosci wyrazona w godzinach.

Barwe oznacza sie metoda spektrofotometryczna mierzac absorpcje przy dlugosci fali 450 mji i 600 mjji odpowiednio rozcienczonych roztworów w kiu- wetach 1 cm, stosujac wode jako próbe porów¬ nawcza. Do pomiarów stosowano spektrofotometr typu DK-2A firmy Beckman Instrument Company. i« Barwe oznacza sie stosujac nastepujacy wzór: 109/A4M—Am jednostki barwne= A45o = absorpcja przy 450 m\i Amo = absorpcja przy 600 mjjt C = stezenie w g/100 ml.

Zawartosc fruktozy oznacza sie na podstawie po¬ miarów zmian skrecalnosci wlasciwej zachodzacych podczas izomeryzacji. Skrecalnosc wlasciwa ozna¬ cza sie za pomoca automatycznego polarymetru typu NPL, Model 969 firmy Bendix Corporation przy stezeniu 2,5 g/100 ml w szklanych kiuwetach termostatowanych w temperaturze 25°C. Dlugosc drogi optycznej w kiuwetach wynosi 50 mm. Skre- calnoiic wlasciwa oznacza sie po rozpoczeciu re¬ akcji i po dodaniu wszystkich skladników do roz¬ tworu zawierajacego glikoze. W celu oznaczenia zmian ziwartosci fruktozy w izomeryzowanym roz¬ tworze oznacza sie wartosc skrecalnosci wlasci- wej. Znliane zawartosci fruktozy oznacza sie sto¬ sujac nastepujacy wzór: 100/Aj—A0/ zawartosc fruktozy w •/•¦=- —138,9 Aj — skrecalnosc wlasciwa roztworu po izomery¬ zacji A0 — skrecalnosc wlasciwa roztworu zawierajace¬ go glikoze przed izomeryzacja.

^ Wspólczynnik — 138,9 w powyzszym wzorze o- znacza zmiany skrecalnosci wlasciwej po calkowi¬ tej konwersji glikozy we fruktoze.

IGIU jest angielskim skrótem nazwy jednostki zdefiniowanej jako miedzynarodowa jednostka izo- merazy glikozowej i odpowiadajacej ilosci enzymu potrzebnej do konwersji 1 mikromola glikozy we fruktoze, w ciagu 1 minuty, w roztworze o war¬ tosci pH 6,84—6,85 /0,2 molarny roztwór jablcza- nu wapnia/ zawierajacym 2 mole glikozy na litr 40 0,02 mola siarczanu magnezu na litr oraz 0,001 mola CoCl2 na litr, w temperaturze 66°C.

Sposób wedlug wynalazku posiada wiele waz¬ nych zalet. Mianowicie, sposób ten moze byc z lat¬ woscia i tanio zastosowany w skali przemyslowej. 45 Ponadto jest on wyjatkowo przydatny do wyko¬ rzystywania izomerazy glikozowej i wytwarzania roztworów glikozy minimalnie zabarwionych oraz o minimalnej zawartosci popiolu i psykozy. Reakcje izomeryzacji mozna prowadzic w sposób ciagly, co go oczywiscie ma duze znaczenie w procesach prze¬ myslowych.

Wlasciwosci roztworu zawierajacego glikoze ma¬ ja czasami duzy wplyw na ustalenie dokladnych warunków prowadzenia procesu izomeryzacji. Zna- 55 nych jest szereg metod wytwarzania roztworów zawierajacych glikoze, z których wiekszosc obec¬ nie stosowanych polega na przeprowadzaniu skrobi w glikoze.

W tym celu stosuje sie trzy rodzaje metod. Pier- 00 wsza z nich jest hydroliza kwasowa skrobi przy zastosowaniu rozcienczonych roztworów kwasów, prowadzaca do otrzymywania glikozy. W drugiej stosuje sie kombinacje polegajaca na lagodnym dzialaniu w pierwszym etapie kwasem, w celu u- 45 plynnienia skrobi, a nastepnie na enzymatycznej7 konwersji uplynnionej skrobi w glikoze. Trzecia metoda polega na stosowaniu kolejno dwóch roz¬ maitych enzymów, pierwszy z nich uplynnia skro¬ bie, a drugi konwertuje ja w glikoze. W sposobie wedlug wynalazku korzystne jest stosowanie roz¬ tworów zawierajacych glikoze wytwarzanych jed¬ na z dwóch ostatnich metod. Roztwory te zawiera¬ ja wiecej dekstrozy w przeliczeniu na mase suchej substancji, mniejsza ilosc kwasów, zawieraja mniej oligosacharydów i sa mniej zabarwione. W razie potrzeby roztwór glikozy mozna oczyszczac stosu¬ jac znane w tej dziedzinie sposoby.

Lepkosc roztworów zawierajacych glikoze po¬ winna wynosic od okolo 0,5 do okolo 100 centy- pauzów, korzystnie 2—20 centypauzów. W przypad¬ ku, gdy lepkosc roztworu jest zbyt duza cisnienie potrzebne do przepychania sie roztworu przez war¬ stwe zloza jest bardzo wysokie. Zmniejszenie cis¬ nienia powoduje natomiast zwolnienie szybkosci przeplywu, do tego stopnia, ze czas stykania sie roztworu ze zwiazana izomeraza jest za dlugi. Z drugiej strony zbyt dlugie przetrzymywanie roz¬ tworu w warunkach w jakich prowadzi sie izome¬ ryzacje /temperatura, wartosc pH/ moze powodo¬ wac poglebianie sie barwy i wzrost wytwarzania psykozy. Stezenie glikozy w roztworze powinno wynosic 5—80% wagowych, korzystnie 40—60% wagowych.

Wartosc pH roztworu zawierajacego glikoze po¬ winna wynosic 6"—9, korzystnie 6,5—8, najlepiej 7—7,5. Utrzymanie wlasciwego zakresu wartosci pH roztworu zawierajacego glikoze podczas proce¬ su izomeryzacji ma bardzo duze znaczenie, gdyz poza tym zakresem izomeraza szybko sie inakty- wuje i/lub powstaja duze ilosci niepozadanych pro¬ duktów ubocznych, takich jak substancje barwne i psykoza. W roztworze zawierajacym glikoze mo¬ ga byc obecne jony róznych metali spelniajace role aktywatorów i/lub stabilizatorów izomerazy, takich jak rozpuszczalne sole kobaltu, magnezu i inne.

Wlasciwosci nosnika, na którym osadza sie izo- meraze glikozowa maja szczególne znaczenie dla jakosci wytwarzanego roztworu zawierajacego fruk¬ toze i glikoze oraz dla prowadzenia procesu w skali przemyslowej. Zloze powinno zawierac co naj¬ mniej 3 jednostki IGIU izomerazy glikozowej na centymetr szescienny, korzystnie co najmniej 20 jednostek IGIU. Jezeli zawartosc izomerazy gliko¬ zowej jest mniejsza niz 3 jednostki IGIU na cen¬ tymetr szescienny, potrzebna jest wieksza ilosc zlo¬ za dla izomeryzacji równowaznej ilosci dekstrozy.

Moze to stwarzac dodatkowe problemy, takie jak wiekszy spadek cisnienia w zlozu, dluzszy czas zetkniecia roztworu zawierajacego glikoze z izo¬ meraza i zwiekszenie kosztów zwiazanych z ko¬ niecznoscia powiekszenia wymiarów urzadzen. Po¬ nadto, w miare zwiekszania wysokosci warstwy, zloze wykazuje wieksza sklonnosc do zbijania sie, co jest wynikiem koniecznosci zwiekszania w tym przypadku cisnienia niezbednego dla przepchniecia roztworu zawierajacego glikoze.

W takim przypadku nastepuje tak duzy spadek cisnienia w warstwie zloza, ze dla przepchniecia roztworu glikozy przez zloze potrzebne jest tak du- 545 8 ze cisnienie, przy którym nie mozna stosowac ty¬ powych urzadzen.

Trwalosc zwiazanej z nosnikiem izomerazy gliko¬ zowej powinna wynosic co najmniej 50 godzin, ko- rzystnie co najmniej okolo 300 godzin, najlepiej co najmniej 400 godzin.

Do osadzania izomerazy glikozowej na nosniku mozna stosowac jakakolwiek ze znanych metod po¬ zwalajacych na otrzymywanie zloza o podanych wyzej wlasciwosciach. Stwierdzono, ze izomeraze glikozowa mozna osadzac na wielu nosnikach, na przyklad na DEAE — celulozie /celuloza dwuetylo- aminoetylowa/ i podobnych. Oczywiscie w tym ce¬ lu izomeraze glikozowa nalezy wyizolowac z ko- morek i nie moze ona byc zanieczyszczona substan¬ cjami utrudniajacymi wiazanie z nosnikiem. Pro¬ ces osadzania mozna prowadzic w srodowisku wod¬ nym lub w roztworze cukru, na przyklad w syro¬ pie kukurydzianym. Izomeraza glikozowa moze byc osadzana na obojetnym nosniku razem z materia¬ lem komórkowym lub we wzglednie oczyszczonej postaci. W charakterze nosników mozna stosowac rózne polimery, z tym, ze ich porowatosc powinna byc tego rodzaju, by pozwalala na swobodne zet- kniecie glikozy z izomeraza glikozowa.

W przypadku, gdy izomeraza osadzona jest na bardzo drobnoziarnistym nosniku, takim na przy¬ klad jak DEAE — celuloza, korzystnie jest pro¬ wadzic proces w taki sposób, by warstwa zloza, przez które przechodzi roztwór zawierajacy gliko¬ ze byla stosunkowo nie wysoka. Stwierdzono, ze grubosc zloza z osadzona izomeraza glikozowa po¬ winna wynosic od 2,5—12,5 cm, z tym, ze srednica zloza moze byc oczywiscie duza. Korzystnie jest, jezeli stosunek grubosci warstwy zloza do srednicy wynosi 0,01—0,1, najlepiej 0,02—0,05. W takich wa¬ runkach spadek cisnienia w warstwie zloza jest niewielki, co oznacza minimalne zbijanie sie war¬ stwy. 40 Z drugiej jednak strony, przy stosunkowo malej grubosci warstwy istnieje mozliwosc przebicia jej i w efekcie obnizenie skutecznosci dzialania izo¬ merazy. Dlatego najlepiej jest umieszczac co naj- l5 mniej dwie warstwy zloza, korzystnie co najmniej szesc, kolejno za soba i mieszac wyciek z kazdej kolejnej warstwy przed przepuszczeniem przez na¬ stepna. W takim przypadku ewentualne przebicie jednej z warstw nie ma praktycznie wplywu na 50 wydajnosc procesu.

Ze znanych aparatów moze byc do powyzszego celu stosowana cisnieniowa ramowa prasa filtra¬ cyjna. Prasa taka sklada sie z szeregu plaskich ram filtracyjnych umieszczonych pionowo lub po- 55 ziomo w zbiorniku o ksztalcie cylindrycznym. Ra¬ my filtracyjne moga miec ksztalt okragly lub pro¬ stokatny i posiadaja powierzchnie filtracyjna z obu stron. Dluzsza os zbiornika cylindrycznego mo¬ ze byc osia pozioma lub pionowa. Rama filtracyj- 60 na moze sie skladac z plyt o duzych otworach lub zebrowanych i tkaniny filtracyjnej lub drobnej siatki z drutu. Nosnik z osadzona izomeraza gliko¬ zowa zawiesza sie w roztworze zawierajacym gli¬ koze i otrzymana zawiesine pompuje sie przez pra- -. se filtracyjna w taki sposób, aby kazda rama zo-98 545 9 10 stala równomiernie pokryta warstwa nosnika z o- sadzonym enzymem.

W przypadku stosowania pionowej prasy filtra¬ cyjnej w celu utrzymania nosnika z osadzonym enzymem na ramach, utrzymuje sie caly czas cis¬ nienie i nastepnie roztwór zawierajacy glikoze po¬ daje sie za pomoca pompy na prase filtracyjna.

Po przejsciu przez wszystkie ramy proces izome¬ ryzacji jest zakonczony. Ilosc powstajacej frukto¬ zy zalezy od czasu zetkniecia sie roztworu z osa¬ dzonym na nosniku enzymem.

Dokladny sklad po izomeryzacji roztworu zawie¬ rajacego glikoze moze sie zmieniac w zaleznosci od warunków prowadzenia procesu. W tablicy 3 przedstawiono charakterystyke roztworów zawiera¬ jacych glikoze, po izomeryzacji prowadzonej spo¬ sobem wedlug wynalazku.

W celu lepszego zrozumienia sposobu wedlug wynalazku podano ponizsze przyklady.

Przyklad I. Przyklad ilustruje zastosowanie izomerazy glikozowej osadzonej na DEAE — celu¬ lozie do konwersji w sposób ciagly glikozy we fruktoze.

Drobnoustrój Streptomyces ATCC 21175 hoduje sie w warunkach podpowierzchniowej hodowli z napowietrzaniem, a nastepnie saczy sie brzeczke fermentacyjna. Jeden kilogram odsaczonego osadu zawiesza sie w 5 litrach odjonizowanej wody za¬ wierajacej 50 ml 0,1 molarnego roztworu CoCl2 i 8 g kationowego detergentu Arauad 18—50/Armour Industrial Chemical Co./. Calosc miesza sie w cia¬ gu 3,75 godziny w temperaturze 60°C i przy war¬ tosci pH 6,7—6,8, a nastepnie saczy pod zmniejszo¬ nym cisnieniem przez bibule filtracyjna Whatman 1. Przesacz zateza sie pod zmniejszonym cisnie¬ niem do stezenia wynoszacego 30 jednostek IGIU na mililitr. 500 ml stezonego roztworu rozciencza sie do 1500 ml odjonizowana woda i dodaje 5 gramów DEAE — celulozy /Callex — D, produkowany przez Bio-Rad Laboratories/. Po mieszaniu w ciagu pól godziny zawiesine saczy sie pod zmniejszonym cis¬ nieniem przez bibule filtracyjna whatman 1. O- sad przemywa sie na saczku woda. Osad sklada sie glównie z materialu nie zawierajacego izome¬ razy. Polaczone, oczyszczone przesacze zawieraja 9,2 jednostek IGIU na mililitr.

Trzydziesci gramów DEAE — celulozy zawiesza sie w 1500 ml wody, miesza energicznie i pozo¬ stawia na okres 30—45 minut do odstania sie.

Górna warstwe zawierajaca zawiesine pylu DEAE — celulozy dekantuje sie. Powyzsze postepowanie powtarza sie czterokrotnie, po czym saczy zawie¬ sine pod zmniejszonym cisnieniem. Dwadziescia gramów /w przeliczeniu na sucha mase/ odsaczo¬ nej DEAE — celulozy dodaje sie do oczyszczone¬ go roztworu enzymu zawierajacego 9,2 jednostek IGIU na mililitr i calosc miesza w ciagu pól godzi¬ ny w temperaturze pokojowej. Po przesaczeniu za¬ wiesiny otrzymuje sie wilgotny osad DEAE — ce¬ lulozy ze zwiazana z nia izomeraza, o aktywnosci 215 jednostek IGIU w gramie. 6,25 g wilgotnego osadu zawiesza sie w 50 ml wodnego roztworu za¬ wierajacego 0,001 m CoClf w litrze, 0,005 m MgSO, w litrze oraz 0,1 mola chlorku sodowego w litrze.

Zawiesine wlewa sie do kolumny o srednicy 1 cm Tablica 3 Charakterystyka nieoczyszczonych roztworów zawierajacych fruktoze /w procentach na sucha mase/ Typowy sklad Korzystny sklad Najbardziej korzystny sklad Glikoza —60 —60 —60 Fruktoza —54 —54, —54 Polisa¬ charydy * 0—50 0—30 0—30 Psykoza 0—1 0—0,5 0—0,1 Popiól ** 0,1—0,5 0,1—0,2 0,05—0,1 Jednostka barwy 0—2,0 0—0,05 0—0,03 */ ilosc polisacharydów zalezy glównie od pozadanego produktu. '*/ popiól sklada sie glównie z soli metali dodawanych do izomeryzacji jako stabilizatory i/lub aktywatory izomerazy glikozowej.

Dlica 3 h roztworów zawierajacych fruktoze ti na sucha mase/ Polisa¬ charydy * 0—50 0—30 0—30 Psykoza 0—1 0—0,5 0—0,1 Popiól ** 0,1—0,5 0,1—0,2 0,05—0,1 Jednostka barwy 0—2,0 1 0—0,05 0—0,03 i zadanego produktu. iawanych do izomeryzacji jako stabilizatory i/lub 40 45 50 55 i pozostawia do odstania. W, dolnej czesci kolum¬ ny umieszcza sie cienka warstwe waty szklanej.

Po napelnieniu kolumny do wysokosci 25 cm, w celu usuniecia zanieczyszczen barwnych i innych przepuszcza sie 350 ml wodnego roztworu zawie¬ rajacego 0.001 mola CoClj na litr, 0,005 mola MgSOj na litr oraz 0,1 mola NaCl na litr.

Roztwór glikozowy o wartosci pH 6,5 zawiera¬ jacy 3 mole glikozy na litr, 0,001 mola CoCl, na litr oraz 0,005 mola MgSOj na litr przepuszcza sie przez kolumne z szybkoscia 0,2 ml/minute. Kolum¬ ne utrzymuje sie w temperaturze 60°C. Stopien konwersji glikozy we fruktoze wynosi po 6 go¬ dzinach 49,6Vo, a po 186 godzinach 45,0%. Trwalosc enzymu wynosi 198 godzin.

Przyklad II. Przyklad ilustruje zastosowanie izomerazy glikozowej osadzonej na porowatej, syn¬ tetycznej anionowej zywicy Jonowymiennej do pro¬ wadzonej w sposób ciagly konwersji glikozy we fruktoze.

Izomeraze glikozowa izoluje sie z komórek ho¬ dowli szczepu Streptomyces ATCC 21175 i oczysz¬ cza w sposób opisany w przykladzie I. 100 g Amberlitu IRA-938 /Rohm and Haas/ la¬ duje sie do kolumny o srednicy 2,6 cm, w której wysokosc warstwy wymieniacza wynosi 37 cm. Ko¬ lumne utrzymuje sie w temperaturze 60°C i prze¬ mywa kolejno: 500 ml 1,5 n roztworu wodorotlen¬ ku sodowego, 100 ml odjonizowanej wody, 1 000 ml 2 n kwasu solnego oraz 1000 ml odjonizowanej wody. Do 1480 ml czesciowo oczyszczonego roztwo¬ ru izomerazy glikozowej, przygotowanego w spo- Dlic h ro: ri na Pi che 0 0 0 zadar iawa 40 45 50 5598 545 ll sób opisany w przykladzie I dodaje sie w tempe¬ raturze 50°C 100 g Amberlitu IRA-938. Calosc miesza sie w ciagu dwóch godzin i saczy. Prze¬ sacz przepuszcza sie przez kolumne z szybkoscia 3 ml/minute, a nastepnie przemywa zloze 100 ml odjonizowanej wody. Zawartosc osadzonego enzy¬ mu wynosi 3 430 jednostek IGIU.

Roztwór zawierajacy 3 mole glikozy w litrze, 0,001 mola CoCl2 w litrze oraz 0,005 mola MgSOs w litrze, o wartosci pH wynoszacej 6,5 przepusz¬ cza sie przez zloze z szybkoscia 3,6 ml/minute.

Kolumne utrzymuje sie w temperaturze okolo 60°C.

Stopien konwersji glikozy we fruktoze wynosi po 41 godzinach pracy kolumny 21,9% oraz 19,5% po 210 godzinach pracy. Trwalosc enzymu wynosi o- kolo 600 godzin.

Claims (4)

Zastrzezenia patentowe

1. Sposób enzymatycznej konwersji glikozy we fruktoze polegajacy na sporzadzeniu roztworu za- 10 12 20 wierajacego glikoze o lepkosci 0,5—100 centypau- zów, wartosci pH wynoszacej 6—9 i zawartosci glikozy wynoszacej 5—80% wagowych, prowadze¬ niu konwersji w temperaturze 20—80°C i przepusz¬ czaniu glikozy przez warstwe zloza ze zwiazana izomeraza glikozowa, znamienny tym, ze stosuje sie zloze ze zwiazana izomeraza glikozowa o ak¬ tywnosci izomerazy glikozowej co najmniej 3 jed¬ nostki IGIU na cm3 zloza i stabilnosci co najmniej 50 godzin.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie zloze ze zwiazana izomeraza glikozo¬ wa zawierajace co najmniej 20 jednostek IGIU na cm3 zloza.

3. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, ze stosuje sie zloze ze zwiazana izomeraza glikozowa o stabilnosci co najmniej 300 godzin.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie zloze, w którym stosunek wysokosci do szerokosci wynosi 0,01—0,1. f*Y \ Q \ \ W f5 20 CZAS ELUOtiflNil KOLU/*?;: 25 ., .-/- v Bltk 1166/78 r. 90 egz. A4 Cena 45 zl