Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia LnOiizyny na drodze fermentacji ze zwdiekszo- nymi wydajnosciami, kt6ry polegja na hodowaniu mdkrooriganizmu wytwarzajacego L-lizyne w sro¬ dowisku odzywczym z dodatkiiem plynu (hodowla¬ nego zawierajacego mikroorganizm wytwarzajacy L-leucyne.Lnliizyna jest dobrze znana jako jeden z pod¬ stawowych aminokwasów odzywczych dla ludzi i zwdierzajt, i istnieje duze zapotrzebowanie na nia jako ma pozywienie i dodatek do pokarmu zwierze¬ cego.Dotychczas, znano duzo róznych sposobów fer¬ mentacyjnego wytwarzania L-lizyny. Tytpowy pro¬ ces obejmuje stosowanie wytwarzajacych L-lizyne mutantów bakterii maczugowych wytwarzajacych kwas glutaminowy, których11 przedstawicielem jest Corynebacterium giutamicuim.Bakterie macziugowe, wytwarzajace kwas gluta- mdnowy, sa dokladnie omówdone w 'literaturze.Ogólnie cliarakteryzaja sie one ksztaltem od elip¬ soidalnego do krótkich paleczek, sa gramdodatnie, nie wytwarzaja zarodników, sa nieruchliwe, po¬ trzebuja biotyny i gromadtza duze ilosci kwasu Lngiutamiiinowego.Liczne bakterie maczugowe, wytwarzajace kwas glutaminowy, byly juz opisywane. Sklasyfikowane sa przez taksonomistów, którzy prowadzili bada¬ nia nad tymi bakteriami, na nastepujace gatunki: Corynebacterium glutamicum, Brevibaoteni'im antinogenes, Breviilbacterium divaricatumj Bre- vibacterium flavuim^ Brevibacteriuim lactofer- menitum, Breviiibacterium roseum, Brevribacte- rium saccharolyticum, Brevibacteriuim immiario- iphilium, Corynebaicterium acettoacidophilum, Go- rynebacteriuim iierculis, Corynebacterium lilium, Corynebacteriium caillunae, .Microbacterium amimo- niaphilum i Arthrobacter. Jednakze taksonomicz- !0 nie sa one bardzo zblizone do wszystkich innych opisanych przez Abe d 'innych w J. General and Applied Microbictogy, V©1. 13, 279—«3Q1 (1967). Bak- ' terie maczugowe, wytwarzajace kwas glutamino¬ wy, reprezentcwane sa przez Corynebacterium glu- tamiicum.Mutanty bakterii maczugowych, wytwarzajacych kwas glutaminowy, wytwarzajace L-lizyne, cha¬ rakteryzuja sde ogólnie tym, ze maja przyniajimniej jedna z dwóch wlasnosci wynikajaca z mutacji genowej.Jedna z dwóch wlasnosci jest calkowita lub niecalkowita blokada drogi biiosyntetycznej dla produkcji odpowiednich aminokwasów. Wlasnosc ta uznawana jest jako wymójg dla aminokwasów takich, jak L-homoseryna, L-treonina, L^metdo- ninta, L-leucyna, L-izoleucyna dtd. lulb jako wraz- liwiosc na L-trecmine luib L-imefcionine. Inna cecha jest calkowiite lub niecalkowite odchylenie sprze¬ zenia zwrotnego .przez aminokwasy. Wlasnosc ta jest traktowana jako odpornosc na aminokwasy 9798297982 takie, jak L-lizyna, L-trecnina itd. lab ich ana¬ logii takie, jak S^/2-amincetylo/-L-cyBteina itd.Wydajnosc L-Lizyny, uzyskanej z mutantów wy¬ twarzajacych L-liizyne o powyzszych wlasnosciach, jest polepszona przez kombinacje dalszych gene¬ tycznych mutacji innych niz opisane wyzej, na przyklad, wymaganych dla takich aminokwasów jak L-walima, L-tyrozyma itd., witaminy takie, jak tiamiina, witamina B12 itd., i zasady p*irynowe ta¬ kie, jak adenina, guanina itd. Ponadto, wydajnosc L-lizyny polepsza sie takze iprzez kombinacje ge¬ netycznych mutacji innych niz te, które opisano wyzej, na przyklad, odpornych na aminokwasy takie, jak L-izoleucyna, ich analogi takie, jak kwas 2-amino-3metylotiOHma,slowy itd. i antybiotyki tafcie, jak penicylina G, polimiksyna B itd. Do- pre¬ ferowanych mutantów wytwarzajacych L-lizyne naleza: Micrococcus glutamicum ATCC 15286, ATCC 13287, Brwiibacterium flavum ATCC 21475, ATCC 2111(27, ATCC 21138, ATCC 215/17, ATCC 21&18, ATCC 2L528, ATCC 21(529 i Co- rynebaoteriium glutamicum ATCC 21299, ATCC 21(300, ATCC 21513, ATCC 2L514, ATCC 21515, ATCC 21516, ATCC 2ia27, ATCC 21544 KY 10403, KY 10O31.Wiekszosc wyzej omówionych specyficznych mu¬ tantów opisano w opisach patentowych Sta¬ nów Zjednoczonych Ameryki Nr 2.979.430, 3.616.215, 3j687.810, 3.707.441, 3.708.395 i opisie paten¬ towym brytyjskimi Nr 1.186J*88.Przy wytwarzania L-lizyny przez hodowanie szczepów produkujacych L-lizyne, jak to opi¬ sano wyzej, szczepy te hoduje sie w warunkach tlenowych w srodowisku zawierajacym przyswa¬ jalne zródlo wegla, zródlo azotu, substancje nie¬ organiczne i inne pozywki. O ile badania nad pro¬ dukcja L-diizyny przy uzyciu szczepów produkuja¬ cych L^liizyne wykazywaly, ze musza byc spelnio¬ ne war mki takiie, jak dla L-leucyny, to obecnie stwierdzono, ze trzeba stosowac plyn hodowlany mutanta wytwarzajacego Lnleucyne jako dodatek do srodowiska hodowlanego odpowiadajacego L- -leucynde.W rezuUtaciie, nieoczekiwanie stwierdzono, ze wy¬ dajnosc Lnlrizyny, otrzymywanej przez szczepy wy¬ twarzajace L-lizyne, znacznie wzrosla. Ponadto stwierdzono,, ze efekt jest duzo wiekszy w stosun¬ ku do tego, jaki osiaga sie gdy dodaje sie wolna L-leucyne do srodowiska w ilosci odpowiadajacej ilosci, jaka znajduje sie w plynie hodowlanym mutanta wytwarzajacego L-leucyme. Stwierdzono takze, ze efekt dodania plynu hlcdowianego mutan¬ ta wytwarzajacego L-leucyme uzyskuje sie nie tylko wtedy, gdy szczep produkujacy L-lizyne spelnia wymogi dla L-leucyny ale takze wtedy, gdy stosuje sie szczep wytwarzajacy L-lizyne o róznych wlasnosciach.Wytwarzanie L-leucyny na drodze fermentacji jest takze dobrze znane. Tak jak w przypadku z mutantami wytwarzajacymi L-lizyne, mutanty wytwarzajace L-leucyme maja przewaznie co naj¬ mniej jedna wlasnosc z tych, jakde wymagane sa przez odpowiednie aminokwasy takie, jak L-izo¬ leucyna, L-metionina i L-walona oraz odpornosc na aminokwasy, wlaczajac L-leucyne i inne ana¬ logii takie, jaik kwas alfa — aim^o-m^loW^ J&L, wynikajace z calkowitej lub niecalkowitej blokady drogi biosymtetyczmej i calkowitego lub niecalfeo- b witego odchylenia sprzezenia zwrotnego. Wydaj¬ nosc L-leucyny polepsza sie przez kombinowanie wlasnosci innych niz opisano wyzej, na przyklad, wymogów dla aminokwasów takich, jak L-feny- loalamoma itd. Poza tymi, wydajnosc zwieksza -sie io takze przez komiblinacje odpornosci na aminokwa¬ sy takie, jak L-Mzyna, L-histydyma itd. oraz ich analogii takie, jak S^2-aimmoety(W-L-cysteina, 2- ^tiazoloalanina 'itd.Preferowane mutanty wytwarzajace L-leucyne obejmuja: Brevuibacterium flavum (FERM —P No. 1838) ATCC 21889, Brevtibacteriium lactofermen- tum (FERM—P No. 1837) ATCC 21888, Corynebac- terium glutamicum ATCC aii3G1^21308, ATCC 211885, ATCC 21886 (FERM—P No. 1836), oraz Corynebacterium acetocidophilum (FERM—P No. 1836) ATCC 21887.Niektóre z wyzej wymienionych specyficznych szczepów opisano w japonskim zgloszeniu patento¬ wym nr 101589/74.Dzieki stosowaniu sposobu wedlug wynalazku uzyskuje sie znacznie polepszone wydajnosci L-lii- zyny. Uzyskuje sie to przez hodowanie mutantów wytwarzajacych L-lizyne w srodowisku, wzboga¬ conym dodatkiem plynu hodowlanego mutantów wytwarzajacych L-leucyne. Mechanizm ten nie jest dotychczas jeszcze wyjasniony. Dobrze znane jest zwiekszenie wydajnosci L-dizyny przez do¬ datek róznych aminokwasów. Jak stwierdzono wy¬ zej, wplyw dodania plynu hodowlanego mutantów wytwarzajacych L-leucyne nie wynika tylko z .po¬ wodu L-leucyny, zawartej w cieczy kulturowej.Chociaz plyn hodowlany mutantów wytwarzaja¬ cych L-leucyne zawiera rózne aminokwasy, iiine niz L-leucyna, to stwierdzono takze wplyw dodat- *o ku plynu hodowlanego, nie przypisujac tego takim aminokwasom, jak poprzednio szczególowo opisa¬ no. Ponadto, wplyw dodania plynu hodowlanego u mutantów wytwarzajacych L-leucyne jest bardzo charakterystyczny, ale nie znaleziono takiego wply- « wu wówczas, gdy stosowano plyn hodowlany mi¬ kroorganizmów wytwarzajacych kwas L^glutami- nowy,i <*EE Zgodnie ze sposobem wedlug wynalazku, L-lizy¬ ne wytwarza sie ze zwiekszonymi wydajnoscia- 50 md przez hodowanie mutanta, wytwarzajacego L- -4izyne, bakterii maczugowych, produkujacych kiwas glutaminowy, w srodowisku odzywczym z dodat¬ kiem plynu hodowlanego, otrzymanego przez ho¬ dowanie mutanta, wytwarzajacego L-leucyne, bak- 55 terii maczugowych, produkujacych kwas glutami¬ nowy.W sposobie wedlog wynalazku do produkcji L- -lizyny mozna stosowac dowolny mutant, wytwa¬ rzajacy L-lizyne, bakterii maczugowych, wytwa- 60 rzajacych kwas glutaminowy, o wyzej opisanych wlasnosciach.W sposobie wedlug wynalazku do hodowli mu¬ tanta, wytwarzajacego L-lizyne, mozna stosowac srodowisko syntetyczne albo naturalne tak dlugo, 05 jak dlugo zawiera ono zródlo przyswajalnego we-S7982 6 gla, zródlo azotu, substancje nieorganiczne i inne skladniki przyspieszajace wzrost, wymagane przez stosowane tu okreslone szczepy.Jako zródlo wegla w zaleznosci od stosowanych mikroorganizmów mozna stosowac weglowodany takie, jak glukoza, fruktoza, sorbitol, mannitol, gli¬ ceryna, krochmal, hydrolizat krochmalu, itd., me¬ lasa, koncowe melasy z doa itd., i alkohole takie, jak metanol, etanol, itd., kwasy organdczne takie, jak kwas octowy, kwas fumarowy, kwas mlekowy itd. W praktyce, jako zródlo wegla preferowane sa melasa, koncowa melasa z dna, kwias octowy i glukoza.Jako zródlo azotu mozna stosowac amoniak, or¬ ganiczne i nieorganiczne sole amoniowe takie, jak chlorek amonu, siarczan amonu, weglan amonu, octan amcnu, fosforan amonu itd., zwiazki zawie¬ rajace azot takze, jak mocznik itd., peptony, eks¬ trakt miesny, ekstrakt drozdzowy, ciecz z moczo¬ nej kukurydzy, hydrolizat kazeinowy, mieso rybie, wyciag z miesa rybiego, ódltiiszczcna scije, wy¬ ciag z odtluszczonej sojd, hydrolizat kwasowy pro¬ teiny sojowej itd. Poza tym, mozna stosowac substancje nieorganiczne, takie jak dwuwodoroor- to fosforan potasu, kwasny fosforan potasowy, siarczan magnezu, chlorek sodu, siarczan zelazawy, siarczan magnezowy, weglan wapniowy itd.Ponadto, gdy mutanty wytwarzajace L-lizyne maja pozywke, wymagana przez aminokwasy, wi¬ taminy, zasady purynowe itd., to oczywiscie od¬ powiednie ilosci takich pozywek musza byc do¬ dane do srodowiska. Na przyklad, bakteria ma¬ czugowa wytwarza kwas glutaminowy i dlatego jej mutanty wytwarzajace L-lizyne wymagaja do wzrostu bic aiby w srodowisku odzywczym znajdowala sie od¬ powiednia ilosc biotyny. To jest zrozumiale, ze jesli pozadane pozywki znajduja sie w innych skladnikach srodowiska, .to nie jest konieczne spe¬ cjalne dodawanie zródel tych pozywek do srodo- . wiska.Zgodnie ze sposobem wedlug wynalazku, doda¬ tek plynu hodowlanego, otrzymanego przez hodo¬ wanie mutanta, wytwarzajacego Lnleucyne, do srodowiiiska fermentacyjnego L-lizyny efektywnie zwieksza wydajnosc L-lizyny. Taki plyn hodo¬ wlany, dodawany do srodowiska fermentacyjnego L-lizyny, moze byc uzyty jako taki lub po usu¬ nieciu komórek mikrobowych. W kazdym przy¬ padku konieczna jest oczywiscie sterylizacja ply¬ nu hodowlanego lab przesaczu hodowlanego przed jego uzyciem.Ilosc plynu hodowlanego mutanta, wytwarzaja¬ cego 1-ieucyne, stosowanego jako dodatek do sro¬ dowiska odzywczego dla wytworzenda L^lizyny, za¬ lezy od mikroorganizmów oraz skladu srcdowdska, stosowanego zarówno przy wyftwarzaniu L^liizyny, jak i L-leucyny. Preferowane jest jednak, aby sro¬ dowisko fermentacyjne L-lizyny zawieralo plyn hodowlany w stezeniu od 2 do 150 ml/l, liczac na objetosc srodowiska odzywczego dla fermentacji L-lizyny; optymalna ilosc latwo: ijest okreslic dla kazdego szczególnego, przypadku^ Po dodandiii plynu hodowlanego mutanta, wy¬ twarzajacego L-leucyne, cala : ilosc cieczy, jaka ma byc dodana, moze znajdowac sie w srodowisku poczajtkowym Mozliwe jest takze dodanie czesci tego plynu do srodowiska poczatkowego, a pozo¬ stala czesc podczas prowadzenia hodowii. Alterma- tywnie, cala ilosc, jaka ma byc dodana, mozna dodac dopiero podczas hodowli.Jesli plyn hodowlany dcdaje sie do srodowiska fermentacyjnego L-lizyny podczas hodowfld, to mo¬ zna go dodawac w calosci -od razu, z jprzerwaimi lub w sposób ciagly. W tym przypadku, celem uzyskania pozadanego efektu, wywolanego doda¬ niem plynu hodowdanego mutanta, wytwarzajace¬ go L-leucyne, pozadane jest, aby dodawanie za¬ konczyc do konca etapu logarytmicznego rozmna- zania sie mikroorganizmu. Przewaznie logarytmi¬ czny etap rozmnazania wynosi od 10 do 24 godzin cd momemtu rozpoczecia hodowfli.Fermentacje mutanta, wytwarzajacego L-leucy¬ ne, prowadzi sie w warunkach normalnie stoso- wainych przy fermentacji L-lizyny, to jest w wa¬ runkach tlenowych, na ^przyklad, z napowietrza¬ niem i mieszaniem lub wstrzasaniem w tempera¬ turze 25—40° i przy pH=6-^8,5.% Zwykle po 30 do 150 godzinach hodowania w plynde hodowlanym gromadzi sie znaczna ilosc L-lizyny. Po zakoncze¬ niu hodowli L-dizyne oddziela sie i oczyszcza je¬ dnym z dobrze znanych siposobów, takim jak trak¬ towanie zywiica jonowymienna, krystalizacja przez zatezanie itd.Plyn hodowlany mutanta, wytwarzajacego L- leucyne, pozwalajacy na uzyskanie wiekszych wy¬ dajnosci L-lizyny zgodnie ze sposobem wedlug wynalazku, mozna przygotowac metodami konwen¬ cjonalnymi dla produkcji L-leucyny. Do prodak- cji plynoi hodowlanego mozna stosowac dowolny mutant, wytwarzajacy L-leucyne, bakterii maczu¬ gowych, wytwarzajacych kwas glutaminowy, po¬ siadajacy wyzej opisane wlasnosci.Podobnie przy fermentacji L-lizyny mozna tak 40 dlugo stosowac albo medium syntetyczne, albo naturalne do fermentacja L-leucyny, jak dlugo zawiera ono odpowiednie zródla przyswajalnego wegla, zródlo azotu, substancje nieorganiczne i in¬ ne pozywki, konieczne do wzrostu stosowanych 45 mikroorganizmów. Co do specyficznych zródel we¬ gla, zródel azotu i substancji nieorganicznych, wspomnianych przy fermentacji L-lizyny, to sa one takze uzyteczne przy fermentacji L-leucyny.Melasa, koncowa melasa z dna, kwas octowy i glu- 50 koza, wspomniane poprzednio, sa polecane z prak¬ tycznego punktu widzenia. Przy stosowaniu spe¬ cyficznych szczepów, wymagajacych specyficznych pozywek, pozywki taikie musza oczywiscie znajdo¬ wac sie w srodowisku odzywczym. 5f Hodowle mutanta; wytwarzajacego L-leucyne, prowadzi sie w konwencjonalnych warunkach ho¬ dowlanych. Przewaznie hodowle prowadzi sie w warunkach tlenowych, na przyklad z nagxywietrza- niem i mieszaniem lub z wstrzasaniem w tempe- 60 raturze 25°—40°C i przy PH=G—9 przez 48-^lfiO godzin.Nastepujace przyklady doswiadczalne ilustruja preferowany zakres ilosci pjynu hodowlanego mu¬ tant©, wyttwarziajacelgo L-leucyne, jaka ma t#c «5 dodana do srodowiska fermentacyjnego L-lizyny,97982 8 Przyklad doswiadczalny 1 Przygotowuje sie srodowisko stepujacym skladzie: glukoza (NH4)2S04 KHjjPO* MgS04 • 7HjjO FeS04 • 7H20 MnS04 ¦• 4H20 biotyna Chlorowodorek tiaminy Ajtieki1 OaC03 L-treonina DL-anetionina (ipH przed sterylizacja podstawowe o na- 150 g/l 40 g/l 1 g/l 0,4 g/l 0,01 g/l 6 mg/l 300 y/1 200 ytf\. 1 600 200 g/l BAL y/1 y/i wynosi 7,4) 1 Nazwa handlowa dla kwasnego hydrolizatu proteiny sojicwej, otrzymywanego z firmy Ajino- moto Inc., Japan. 6 rodzajów srodowiska przygotowywano, dodajac plyn hodowlany szczejpu, wytwarzajacego L-leu- cyne, zawierajacy 15,6 g/l L-leucyny, do podsta¬ wowego srodowiska w róznych ilosciach, poda¬ nych w Tablicy L Brevitoacterium flavum ATCC 21518 zaszczepia sie w 10 md porcjach srodcwiska podstawowego, otrzymujac w ten sposób 6 rodzajów odzywek w 250 ml-kolbach Erlenmeyea^a i hoduje w tempera¬ turze 28°C przez 110 godzin, stosujac wstrzasanie.Po zakonczeniu okresu hodowania, oznacza sie wy¬ dajnosci L-lizyny oraz wzrost komórek. Wyniki podano w Tablicy 1.Tablica 1 Stezenie doda¬ wanego plynu hodowlanego szczepu, wytwa¬ rzajacego L- -leucyne '° 1 2 1 10 '20 40 60 Wydajnosc L-lizyny (g/l) 32 40 48 . 55 60 59 56 Wzrost komó¬ rek (g/l) su¬ chych komórek 9,-8 ,9 12,5 f 13,8 ,3 14,7 1 13,5 Plyn *hodowlany szczepu* wytwarzajacego L- -leucyne, otrzymuje siie w sposób nastepujacy: Corynebacterium glutamiciim (FERM—P No. 1$34) ATCC 21i885 zaszczepia sie w 5 litrowym na¬ czyniu fermentacyjnym w 3 litrach pozywki za¬ rodowej o nastepujacymi skladzie: D^glukoza pepton ekstrakt drozdzowy ciecz po rozmoczeniu ziaren kukurydzy chlorek sodowy mocznik biotyna 50 g/l g/l g/l g/l 2y5 g/l 3 50 g/l y/i Hodowle prowadzi sie w temperaturze 30°C przez 18 godzin, stosujac napowietrzanie z szyb¬ koscia 3 l/min i mieszanie z szybkoscia 600 obr./ /min. 1 1 tej kultury zarodowej zaszczepia sie w 30 litrowym naczyniu fermentacyjnym w 10 1 glów¬ nego srodowiska fermentacyjnego o nastepujacym skladzie: 40 45 50 55 octan amonowy KHjjP04 MgSC4 • 7H*0 FeS04 • 7H*0 MnS04 • 4H*0 biotyna ,0 g/l 2,0 g/l 0,5 g/l 0,1 g/l 0,01 g/l 50yA chlorowodorek tiaminy 100 mg/l (pH=7,4 przed sterylizacja) Hodowle prowadzi sie w temperaturze 30°C przez 60 godziin, stosujac napowietrzanie z szybkoscia l/min i mieszanie z szybkoscia 400 obr./min.Po 3 godzinach od rozpoczecia hodowania 10 1 mieszaniny, zawierajacej 71 g/l octanu amonowego i 380 g/l kwasu octowego, wprowadza sie w spo¬ sób ciagly do srodowiska odzywczego przez okres 56 godzin w taki sposób, aby pH srodowiska u- trzymac na poziomie 6,8 i aby stezenie kwasu oc¬ towego w srodowisku wynosilo 1,2—19 g/l. Po za¬ konczeniu hodowli, w plynie hodowlanym groma¬ dzi sie ,15,6 g/l L-leucyny.Przyklad doswiadczalny 2 Jako szczep wytwarzajacy L-lizyne stosuje sie Corynebacterium glutamicum ATCC 21516, który hoduje sie w taki sam sposób, jak opisano w przykladzie doswiadczalnym 1, z tym wyjatkiem, ze stosuje sie rózne ilosci plynu hodowlanego szczepu wytwarzajacego L-leucyne, jak pokazano w Taiblicy 2.Tablica 2 Stezenie doda¬ nego plynu hodo¬ wlanego szczepu wytwarzajacego 'L-leucyne i(m(l/l) 0 2 1 .20 40 60 80 100 | 150 Wydajnosc L-lizyny (g/D. 37 48 56 | 62 58 55 53 54 52 Wzrost komórek {g/l suchych komórek) 9,3 i0vi l<2y6 13,5 14,9 14,4 14,0 13,8 13,3 13,5 (pH=7y2 przed sterylizacja) 61 Nizej podane przyklady ilustruja sposób wedlug wynalazku.Przyklad I. Corynebacterium glutamicum ATCC 21513 (szczep wytwarzajacy Lnlizyne) za¬ szczepia sie w 330 ml pozywki zarodowej, która hoduje sie w 2 1 kolbie Erlenmeyer^ w tempera¬ turze 28°C przez 24 godziny, stosujac wstrzasanie.Sklad pozywki zarodowej9 97982 D-glukoza KHjP04 K4HPO4 mocznik MgS04-7H20 pepton ekstrakt miesny biotyna 40 g/l 0,^ g/l 1,5 g/l 3 g/l 0,5 g/l g/l g/l 50 y/1 Tablica 3 (pH=7^2 przed sterylizacja) Przygotowuje sie odpowiednio 5 rodzajów sro¬ dowisk o nastepujacych skladach: Srodowisko A—1: koncowa melasa z MgS04-7H20 KH*P04 mocznik , Ajceki dna 150 g/1 (jako glukoza) 0,3 g/l 0,7 g/l 3 g/l g/l (pH=7,4 przed sterylizacja) Srodowisko A—2: srodowisko A—1 + 13 ml/1 plynu hodowlanego szcze¬ pu wytwarzajacego L-leucyne (zawierajacego 15,0 g/l L-leucy- ny) Srodowisko A—3: Srodowisko A—1 + 200 mg/l L-leucyny Srodowisko A—4: Srodowisko A—1 + 13 ml/l plynu hodowlanego szcze¬ pu wytwarzajacego kwas L-glu- taminowy (zawierajacego 60 g/l kwasu Lf^glutaimSnowego) Srodowisko A—5: Srodowisko A—1 + 13 ml/l plynu hodowlanego szcze¬ pu wytwarzajacego kwas L-glu- tam-inowy, stosowanego do otrzy¬ mania srodowiska A—4 + 200 mg/l L-leucyny 1 1 otrzymanej wyzej kultury nasiennej zaszcze¬ pia sie w 10 1 porcjach podanych wyzej 5 rodza¬ jów srodowisk w 30 litrowych naczyniach fer¬ mentacyjnych. Hodowanie prowadzi sie w tempe¬ raturze 28° do 48 godzin, stosujac napowietrzanie z szybkoscia 10 l/min. i mieszaniie z szybkoscia 400 obr./min. Podczas hodowania pH srodowiska utrzymuje sie na poziomie 6^8 za pomoca 22% roz¬ tworu wodnego amoniaku.Po zakonczeniu hodowania, plyn hodowlany za¬ wiera L-lizyne, jak pokazano w Tablicy 3.Plyn hodowlany szczepu wytwarzajacego L-le¬ ucyne i szczepu wytwarzajacego kwas L^glutami- nowy, jakie stosowano wyzej, Otrzymuje sie w nastepujacy sposób, odpowiednio: Otrzymywanie plynu hodowlanego szczepu wy¬ twarzajacego L-leucyne 40 45 50 55 Srodowisko A-l A-2 A-3 A-4 A-5 Dodatek Zaden Plyn hodowlany szcze¬ pu wytwarzajacego L- -deucyne L-leucyna Plyn hodowlany szcze¬ pu wytwarzajacego kwias L-glutaminowy Plyn hodowlany szcze¬ pu wytwarzajacego kwas L-glutamino¬ wy+L-leucyna Wydajnosc L-Jlizyny 40 55 44 40 46 Brevibacterium lactofermentuim (FERM-P No. 1837) ATCC 21888) ród wytwarzajacy Lnleucyne (zaszczepia sie w 5 litrowym naczyniu fermenta¬ cyjnym w 3 1 pozywki zarodowej i hoduje w tem¬ peraturze 30°C przez 18 godzin, stosujac napo¬ wietrzanie z szybkoscia 3 1/rrain i mieszanie z szyb¬ koscia 600 obr./imin.Sklad pozywki zarodowej: Dngiukoza pepton ekstrakt drozdzowy ciecz po rozmoczeniu ziaren kukurydzy NaCl mocznik biotyna 50 2,5 3 50 g/l g/l g/l g/l g/l g/l Y/l 65 (pH przed sterylizacja 7,2) 1 1 przygotowanej w ten sposób pozywki zaro¬ dowej zaszczepia sie w 30 litrowym naczyniu fer¬ mentacyjnym w 10 1 glównego medium fermen¬ tacyjnego o nastepujacym skladzie: Sklad glównego medium fermentacyjnego: octan amonowy 15 g/l KH^P04 j2y0 g/1 MgS04-7H20 0,5 g/l FeS04-7H20 0,1 g/i MnS04-4H20 0,01 g/1 biotyna 50 yjl chlorowodorek tiaminy 100 mg/1 (pH=7,4 przed sterylizacja) Hodowle prowadzi sie w temperaturze 30°C przez 60 godzin, stosujac napowietrzanie z szybkoscia l/min i mieszanie z szybkoscia 400 obr/imdn., utrzymujac pH srodowiska okolo 6,8 za pomoca 60°/o wodnego kwasu octowego. Po 7 godzinach od rozpoczecia hodowania, 70 ml porcje wodnego roz¬ tworu, zawierajacego 11 g octanu amonowego, wprowadza sie do srodowiska co 1 godzine przez 50 razy. Podczas hodowania stezenie kwasu octo¬ wego w srodowisku utrzymuje sie na poziomie 1,2—18 gfl. Po zakonczeniu hodowania w plynie hodowlanym gromadzi sie 16,0 g/l L-leucyny.Otrzymywanie plynu hodowlanego szczepu wy¬ twarzajacego kwas L-glutaminowy11 Atfthrobaicter paraffiineus ATCC 15591 (szczep wytwarzajacy kwas L-glutaunimowy) zaszczepia sie w 2 litrowej kolbie Erleromeyer^a w 300 ani po¬ zywki zarodowej i hoduje w 30° przez 24 godziny stosujac wstrzasanie.Sklad pozywki zarodowej: octan sodu 10 g/0, pepton 10 g/l ekstrakt miesny 5 g/l NaCl 2,5 g/l i (pH=7,0 przed sterylizacja) 300 ml w ten sposób otrzymanej kultury zaro¬ dowej zaszczepia sie w 5 litrowym naczyniu fer¬ mentacyjnym w 3 1 glównego medium fermenta¬ cyjnego o nastepujacym skladzie: Sklad glównego medium fermentacyjnego: octan amonu 20 gyU KH*P04 1 g/1 K2HP04 1 g/1 MgS04-7H20 0,5 g/l MnSO^HgO 10 mg/l FeS04-7H^O 10 mg/I chlorowodorek tiaminy 5 y^1 (pH=7,0 przed sterylizacja) Tablica 4 97982 12 j Amino-? kwas Alanina Kwas as- paragiino- wy Arginina Cystyna Glicyna | kwas glutami¬ nowy Histydyna Izoleu- cyna Leucyna Lizyna Metioni¬ na Fenylo- alanima dolina Seryna Treomkia 1 Tryptofan Tyrozyna Walina | 1 Ilcsci Pochodza¬ cy z plynu hodowla¬ nego szcze¬ pu wytwa¬ rzajacego L-leucyne 6^7 — — — 431 12,6 ,85 195 ,2 — . - — ~• — — — — — | aminokwasów (mg/l) 1 Pochodza¬ cy z Ajieki f 176 067 546 — 332 1570 242 284 586 550 98 340 460 , 376 362 , — ¦ 208 310 | Pochodza¬ cy z kon¬ cowej me¬ lasy z dna 99^0 278 7,5 (jako chlo¬ rowodorek) 3,0 7,5 9,0 1 13,5 (jako chlo¬ rowodorek) — — — — 12,0 • — 52,5 52,5/ 7,5 13,5 48 | 10 Hodowle prowadzi sie w temperaturze 30°C przez 3 dni, stosujac napowietrzanie z. szybkoscia 3 l/min i mieszanie z szyfokosóia 600 obrymin.Podczas hodowania 1 1 wodnego roztworu, otrzy¬ manego przez dodanie 3 czesci wagowych wody do miesizaniiny 70 czesci wagowych lodowatego kwasu octowego i 27 czesci wagowych 22°/o wod¬ nego roztworu amoniaku, wprowadza sie do sro¬ dowiska, utrzymujac pH srodowiska 4—9. Doda¬ wanie konczy sie na 2 godziny przed zakoncze¬ niem hodowania. Po zakonczeniu hodowania 60 g/l kwasu L-glutaminowego gromadzi sie w plynie hodowlanym.Srodowisko A—2 stosowane wyzej, zawierajace srodowfisko A—1 i plyn hodowlany, otrzymany przez hodowanie szczepu wytwarzajacego L-leu¬ cyne, zawiera aminokwasy pochodzace z plynu hodowlanego, Ajieki i koncowej melasy z dna w ilosciach podanych w. tablicy 4.Z tablicy wynika, ze ilosci aminokwasów, po¬ chodzace z plynu hodowlanego szczepu wytwa¬ rzajacego L-leucyne, sa bardzo male w porówna¬ niu do aminokwasów, pochodzacych z Ajieki lub koncowej melasy z dna. Wynika z tego, ze amd- nokwasy, pochodzace z plynu hodowlanego mu¬ tanta wytwarzajacego L-leucyne, nie wywieraja dodatkowego wplywu ma produkcje L-lizyny. Na tej podstawie dochodzi sie do wniosku, ze wplywu dcdatku plynu hodowlanego szczepu wytwarza- jacego L-leucyne niie mozna przypisac amiinokwa- som, zawartym w plynie hodowlainym.Przyklad II. Przygotowuje sie 4 .rodzaje srodowisk o nastepujacym skladzie, odpowiednio: 60 Srodowisko B—1 D-gluikoza /NH44S04 KHgP04 MigS04-7H20 FeS04-7H20 MnS04-4HiO biotyna chlorowodorek Ajieki CaO03 L^treonina DL-metionlina 150 g/l 40 0/1 1 g/l 0,4 g/l 0,011 @/U 6 mgfl 300 7/I tiaminy 200 yM 1 g/l g/1 600 y/ml 200 yM)l 40 45 Srodowisko B—(2: Srodowisko B—1 50 + ml/l plynu hodowlanego szcze¬ pu wytwarzajacego L-leucyne (zawierajacego 15,6 g/l L-leucy- ny), otrzymanego w Przykladzie 55 doswiadczalnym 1 Srodowisko B—3: ' Srodowisko B—1 + 320 mg/d L-leucymy Srodowisko B—4: Srodowisko B—1 + - 1 g/l Ajieki 65 Brewbacteriuim flavum ATCC 21518 (szczep wy-13 twaarzaijacy Lnlizyne (zaszczepia sie w 250 ml kc4- bach Erlerameye^a w 10 ml porcje wyzej opisa¬ nych czterech rodzajów medium i hoduje sie w 80°C przez 110 godzin, stosujac wstrzasanie.Po zakonczeniu .hodowania otrzymany plyn ho¬ dowlany zawiera L-lizyne, jak pokazano w Ta¬ blicy 5.Tablica 5 m*± 14 mediów zawieraja^L-Mzyne w ilosciach, jak po¬ kazano w tablicy 6.Tablica 6 Srodowisko B—ii B—2 B^3 B—4 Dodatek Nde ma Plyn hodowlany szcze¬ pu wytwarzajacego L-leucyne L-leucyna Ajieki Wydajnosc L-Mzyny (mg/l) 32 GO 36 | 46 Przyklad III. Stosuje sie Corynebacterium glutamicum 21516, Brevilbacte 21523, Corynebacteriuim glutamicum ATCC 21544 i Corynebaoteirium igUuitamicum KY 10013 (z któ¬ rych wszystkie sa szczepami wytwarzajacymi L- -lizyne).Szczepy te zaszczeipia sie oddzielnie w 250 ml kol¬ bie Erlenimeyerte w 40 ml pozywki zarodowej i hoduje w 28°C przez 24 godziny, stosujac wstrza¬ sanie.Sklad pozywki zarodowej: " D-glukoza NaCl mocznik pepton ekstrakt drozdzowy ciecz z namoczenia ziaren k-jkorydzy biotyna 50 2,5 3 50 g/l g/l g/l g/l g/l g/l y/i (pH=72 przed sterylizacja) Przygotowuje sie 3 rodzaje srodowisk o naste¬ pujacych skladach: Srodowlisko C—1: koncowa melasa z dna KH*P04 MgS04 (bezwodny) /NH44S04 Ajieki 100 g/1 (jako glukoza) 0,5 g/l 0,5 g/l "' ¦ 3,3 g/l g/1 40 45 50 (pH=7,4 przed sterylizacja) Srodowisko C—2: Srodowisko C—1 + ml/1 plynu hodowlanego szcze¬ pu wytwanzajacego L-leucyne, otrzymanego w przykladzie 1 (zawierajacego 15,0 g/1 L-leucy- ny) Srodowisko C^3: Srodowisko C—1 + 300 mg/l L-leucyny Plyny po hodowli z zastosowaniem powyzszych «5 55 60 Szczep Corynebac¬ terium glu¬ tamicum ATCC 21516 1 Breviibacte- rium flavum ATCC 21528 1 Corynebac- terrjm glu¬ tamicum ATCC 21544 1 Corynebac¬ terium glu- tamicuim KY 10013 - Srodo¬ wisko C—1 C^2 C—3 C—1 C-^2 C—3 C—1 C-i2 C^3 C^l C^2 C^3 Dodatek Nie ma Plyn hodo¬ wlany szcze¬ pu wytwa¬ rzajacego -L-leucyne L-leucyna Nie ma Plyn hodo¬ wlany szcze¬ pu wytwa- nzajjacego Lnleucyne LHleucyna Nie ma Plyn hodo¬ wlany szcze¬ pu wytwa¬ rzajacego L-leucyne Lnleucyna Nie ma Plyn hodo¬ wlany szcze- (pu wytwa¬ rzajacego L-leucyne L-leucyna Wydaj¬ nosc ILnlizy- <€/l) 27,0 32,0 | 27£ 26,1 1 28,7 26,0 | 27,8 ,5 26,8 | 23,0 ,0 22,9 1 Przyklad IV. W przykladzie tym Coryne¬ bacterium glutaimiicuim KY 10403 (szczep wytwa¬ rzajacy L-lizyne) jest hodowany zarodowo w taki sam sposób, jak opisano w Przykladzie I.Przygotowano 3 rodzaje srodowisk o nastepuja- cym skladzie: Srodowisko D-l: Koncowa melasa z dna 150 g/1 (jako (glukoza) MgS04 •7H*0 0,3 g/1 KH2P04 0,7 ®/l mocznik 3 g/1 Ajieki 10 grtl (pH = 7,4 przed sterylizacja Srodowisko D-2: Srodowisko D-l + ml/l plynu hodowlanego szczepu wytwarzajacego L-leu-15 Cyne, otrzymanego w Przykla¬ dzie I (zawierajacego 15,0 g/l L-deucyny) Srodowisko Dh3: Srodowisko D^l + 300 mg/1 L-leucyny 1 1 kul/tary zarodowej zaszczepia sie w 30 li¬ trowych naczyniach fermentacyjnych w 10 d (por¬ cjach powyzej wspomnianych 3 rodzajów medium i hoduje w taki sam sposób, jak opisano w Przy¬ kladzie I.Po zakonczeniu hodowania otrzymane plyny hodowlane zawieraja L-lizyne w ilosciach, jak po¬ kazano w Taiblicy 7.Tablica 7 97982 4* Tablica 8 Srodowisko D—1 D^2 .D—3 Dodatek Nie ona Plyn hodowlany szcze¬ pu wytwarzajacego L- -leucyne L-leucyna Wydajnosc L-lizyny g/l 41 52 45 Przyklad V. Corynebactenium glutamicum ATCC 21513 (szczep wytwarzajacy L-lizyne) jest hodowany zarodowo w tatki sam sposób, jak opisano w Przykladzie I.Przygotowano trzy rodzaje srodowisk o naste¬ pujacych skladach: Srodowisko E—1: Taki saim sklad, jak Srodowisko A—1, opasane w przykladzie I.Srodowisko E—2: Srodowisko E—a + 13 mil/tt plynu hodowlanego szcze¬ pu wytwarzajacego L-leucyne (zawierajacego 16,8 g/l L-leucy¬ ny) Srodowisko E—3: Srodowisko E—1 + 200 mg/l L-leucyny 1 Mitr plynu hodowlanego zaszczepia sie w 30 litrowych naczyniach fermentacyjnych , do 10 li¬ trowych porcji wyzej wspomnianych 3, rodzajów srodowisk. Hodowanie prowadzi sie w temperatu¬ rze 28°C przez 48 godzin, stosujac napowietrzanie z szybkoscia 10 l/min i mieszanie z szybkoscia 400 obr./Mlln.Podczas hodowania pH srodowiska utrzymuje sie 6y8 za pomoca 22% wodnego roztworu amoniaku.Po zakonczeniu hodowania otrzymany plyn ho¬ dowlany zawiera L-lizyne, jtak pokazano w Tabli¬ cy 8.Plyn hodowlany szczepu wytwarzajacego L-leu¬ cyne, stosowany wyzej przygotowuje sie w sposób nastepujacy.Brevibacteri'aim laotofermentum (FERM—P. No. 1837) ATCC 21888 (ród wytwarzajacy L-leucyne) 40 45 50 55 i Srodowisko E—d E—2 E—3 Dodatek Nie tma Plyn hodowlany szcze¬ pu wytwarzajacego L- ileucyne L-leucyna Wydajnosc L-lizyny ¦ 41 57 46 °C szyib- 65 hoduje sie zarodowo w taki sam sposób, jak opi¬ sano w Przykladzie 1. 1 litr kultury zarodowej zaszczepia sie w 30 litrowym naczyniu fermenta¬ cyjnym w 10 litrach glównego srodowiska fermen¬ tacyjnego o nastepujacym skladzie.Sklad glównego medium fermentacyjnego: koncowa melasa z dna 150 g/l (jako glukoza) MgS04 • 7H*0 0,3 g/1 KH^PO, 0,7 g/1 (NH4)a{S04 20 g/1 Hodowanie prowadzi sie w temperaturze przez 30 godzin, stosujac napowietrzanie z koscia 10 l/min i mlieszamie z szybkoscia 400 obrV /min, utrzymujac pH srodowiska 6,8 za pomoca 22*/o-owego -wodnego roztworu amoniaku. Po za¬ konczeniu hodowania w cieczy kulturowej groma¬ dzi sie 15,8 g/l L-leucyny.Przyklad VI Corynebacteriuim glutamicum ATCC 21513 (ród wytwarzajacy L-lizyne) jest ho¬ dowany zarodowo w taki sam sposób, jak opisa¬ no w przykladzie I.Przygotowano 3 rodzaje srodowisk o nastepu¬ jacych skladach: Srodowisko F—1: octan amonu 15 g/l KH*P04 2,0 g/1 MjgS04 -7H*0 0,5 g/1 FeS04 •7H*0 04 g/1 MinS04 •4H20 0,01 g/1 biotyna 50 y/1 chlorowodorek tiaminy 100 mg/l Ajieki 20 g/l flpH=7,4 przed sterylizacja) Srodowisko F—2: Srodowisko F—1 + 13 midi plynu hodowlanego szcze¬ pu wytwarzajacego L-ieucyne (zawierajacego 15,8 g/U L-leucy¬ ny) otrzymanego w przykladzie V.Srodowisko F—3: Srodowisko F—0. + 200 mg/l L-leucyny 1 litr kultury zarodowej zaszczepia sie w 30 li¬ trowych naczyniach fermentacyjnych do 10 litro¬ wych porcji powyzej wspomnianych 3 rodzajów srodowisk. Hodowanie prowadzi sie w temperatu¬ rze 28°C przez 612 godziny, stosujac napowietrza¬ nie z szybkoscia 10 iitrówitoin. i mieszanie z szyb¬ koscia 400 obrJmin., utrzymujac pH srodowiska97982 17 6,8 za pomoca 60°/*-owego wodnego roztworu kwa¬ su octowego. Bo 10 godzinach od rozpoczecia ho¬ dowania co godzine, do srodowiska wprowadza sie 70 ml porcje wodnego roztworu, zawierajacego 13 g octanu anionu, 50 razy. Podczas hodowania stezenie kwasu octowego w srodowisku utrzymu¬ je sie w igranicach 0,5—1<5 g/l.Po zakonczeniu hodowania otrzymane plyny ho¬ dowlane zawieraja L-lizyne, jak pokazano w Ta¬ blicy 9.Tablica 9 18 Srodowisko F^l F—2 F—3 Dodatek Nie ma Plyn hodowlany szcze¬ pu Wytwarzajacego L- -leucyne L-leucyna Wydajnosc 1 L-lizyny te/si) 32 48 Przyklad VII. Powtórzono procedure, opi¬ sana w przykladzie I z tym wyjatkiem, ze zasto¬ sowano plyn hodowlany szczepu wytwarzajacego L-leucyna, otrzymany w przykladzie I.Otrzymane 'wyniki przedstawiono w Tablicy 10.Tablica 10 Dodaitek Nie ma Plyn hodowlany szcze¬ pu wytwarzajacego L- -leucyne L-leucyna Wydajnosc L-Oiizyny 40 | 84 1 PL