Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych podstawionych pochodnych pirazolu uzytecznych do zwalczania bakterii, grzybów i pier¬ wotniaków, zwlaszcza w medycynie i weterynarii.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie zwiaz¬ ki o wzorze 1, w którym R oznacza grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla, R1 oznacza grupe NH2 a R2 oznacza grupe —CONH2.Przeprowadzono duza liczbe badan nad znale¬ zieniem srodków do zwalczania infekcji u drobiu, swin i bydla, spowodowanych bakteriami i pier¬ wotniakami. Tak wiec przedmiotem szerokich ba¬ dan od wielu lat, byly zwiazki i sposoby zwalczania Escherichia coli, Pasteurella multocida, Salmonella typhimurium oraz kokcydioza u kurczat, jak rów¬ niez Treponema hyodysenteriae u swin.W belgijskim^ opisie patentowym nr 75 145 3/4 opisano podstawione 5-nitrofurany i 5-amino-4-cy- jano-l-metylo-3-(5-nitro-2-furylo)-pirazol, sposoby ich wytwarzania oraz leki zawierajace podstawione nitrofurany jako skladnik czynny. Podano, ze zwiaz¬ ki te wykazuja aktywnosc w zwalczaniu bakterii, robaków i pierwotniaków, oraz dzialaja jako srodki kocydiostatyczne, przeciwswidrowcowe i srodki przeciwmalaryczne.Takze w belgijskim opisie patentowym nr 782 851 przedstawiono 2-(5-nitro-2-imidazolilo)-pirymidyny oraz sposoby ich otrzymywania. Zwiazki te sa czyn¬ ne jako srodki przeciwrzesistkowe bakteriobójcze i przeciwgrzybowe, jak równiez sa uzyteczne przy leczeniu infekcji pochwowych.Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3 452 034 znane sa podstawione 2-(l,3 4,-tiadiazolilo-2)-4(5)-nitroimidazole oraz ich otrzy¬ mywanie. Podaje sie, ze zwiazki te sa uzyteczne jako srodki przeciwbakteryjne i amebobójcze, prze¬ ciwrzesistkowe oraz kokcydiostatyczne.Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3682942 znane sa sposoby wytwarzania 2-(2-amino-l,3,4-tiadiazolilo-5)-l- podstawionych 5- -nitroimidazoli. Produkty te sa uzyteczne do zwal¬ czania infekcji bakteryjnych pasozytniczych i wy¬ wolanych przez pierwotniaki u drobiu i zwierzat, zwlaszcza do zwalczania infekcji wywolanych przez Trichomonas vaginalis i Salmonella gallinarum, co opisal Berkelhammer i wspólpracownicy w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3452035.Podstawione w polozeniu 2 przez pierscieniowe uklady heterocykliczne 5-nitroimidazole ujawnia Rufer i wspólpracownicy, Progr. Antimikrob. Anti- caccer Chemother., Proc. Int. Conger. Chemother., 6-y 1969 (opublikowany 1970), 1,145—8, (Univ. Park Press: Baltimore, Maryland) Chem. Anstr. 74, 141632x (1971). Autorzy ci podaja, ze zwiazki te sa czynne przeciw Trichomonas vaginalis in witro.Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3682953 znane sa pochodne 3-(5-nitro-2- -furylo) pirazolu oraz ich farmaceutycznie dopusz- 96 80496 804 3 czalne sole addycyjne z kwasami a takze zawiera¬ jace te zwiazki kompozycje farmaceutyczne i pa¬ szowe, jak równiez sposoby leczenia infekcji bakte¬ ryjnych u ssaków oraz posoby ochrony materialu organicznego przed atakiem bakterii, przy zastoso¬ waniu zastrzezonych zwiazków. Twierdzi sie, ze zwiazki te wykazuja czynnosc przeciwbakteryjna, przeciw-robakom, przeciwpierwotniakowa, kokcy- diostatyczna, przeciwswidrowcowa oraz przeciw- malaryczna.Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3682956 znane jest, ze 5-amino-4-kar- bamylo-3-(5-nitro-2-fury1lo)pirazole wykazuja czyn¬ nosc przeciwbaktryjna. Zwiazki stosuje sie w taki sam sposób jak opisano w opisie patentowym Sta¬ nów Zjednoczonych Ameryki nr 3682953.Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3716555 znane sa pochodne 3-(5-nitro- -2-furylo)pirazolu i to, ze zwiazki te posiadaja wlas¬ ciwosci przeciwbakteryjne.Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3719759 znane sa srodki przeciwpier- wotniakowe zawierajace nitroimidazole. Opisane ni- troimidazole obejmuja 1-podstawione 2-arylo 5-nit- roimidazole, w których aryl oznacza podstawiony lub niepodstawiony fenyl lub naftyl, a podstawnik -w polozeniu 1 oznacza nizsza grupe alkilowa. Po¬ daje sie ze zwiazki te sa skuteczne przeciw infek¬ cjom spowodowanym przez pierwotniaki, takim jak histomonioza, zakazenie rzesistkiem, amebioza i swidrowica, jak równiez przeciw robakom, takim jak szczepy Meterakis i Ascarid, oraz bakteriom, takim jak szczep Salmonella, Streptococcus i Es- cherichia coli, oraz przeciw organizmom czynnym przy zapaleniu pluc i oplucnej.Z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3399211 znane sa sposoby wytwarza¬ nia zwiazków stosowanych w srodkach przeciw- pierwotniakowych opisanych w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3719759.Opisane powyzej znane zwiazki róznia sie znacz¬ nie budowa od zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku.Stanowiaca podstawnik we wzorze 1 grupa alki¬ lowa o 1—3 atomach wegla oznacza prosty lub roz¬ galeziony nasycony rodnik weglowodorowy taki jak metylowy, etylowy, n-propylowy lub izopropylowy.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze zwiazek o wzorze 2, w którym R i R1 maja wyzej podane znaczenie a R2 oznacza grupe —GN podda¬ je sie hydrolizie do zwiazku o wzorze 1, w którym R2 oznacza grupe karbonamidowa.Nowe zwiazki o wzorze 1, wytwarza sie wycho¬ dzac z dostepnego w handlu 2-metylo-5-nitroimida- zolu, który poddaje sie reakcji ze srodkiem alkilu¬ jacym takim jak siarczan dwumetylowy w odpo¬ wiednim rozpuszczalniku, na przyklad w benzenie.W wyniku reakcji otrzymuje sie l,2-dwumetylo-5- -nitro-imidazol. Zwiazek ten poddaje sie reakcji z benzaldehydem w obecnosci zasady, na przyklad etanolanu sodowego w bezwodnym etanolu, otrzy¬ mujac l-metylo-5-nitro-styryloimidazol.Nastepny etap syntezy nowych zwiazków polega na utlenianiu wiazania styrylowego w l-metylo-5- -nitro-styryloimidazolu. Mozna tego dokonac przy pomocy szeregu utleniaczy nadajacych sie do utle¬ nienia tego typu wiazania do grupy aldehydowej (formylowej). ; Utlenianie przeprowadza sie przez potraktowanie l-metylo-5-nitro-2-styryloimidazolu, w postaci za¬ wiesiny w odpowiednim rozpuszczalniku, ozonem w temperaturze w przyblizeniu pokojowej. Do od¬ powiednich rozpuszczalników nalezy metanol, mie¬ szanina metanolu z woda albo mieszanina metano¬ lu lu, chlorku metylenu i wody oraz tym podobne.Utlenianie zwiazku styrylowego mozna prowadzic równiez sposobem podanym w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3472864. Zba¬ dano uklad utleniajacy skladajacy sie z nadjodanu metalu alkalicznego i czterotlenku osmu w odpo¬ wiednim srodowisku wodnym, zwlaszcza i.w;wodzie i 1,2-dwumetoksyetanie, w temperaturze okolo °—35°C, w czasie okolo 10—20 gddzin. l-metylo-5-nitroimidazolilo-2-karboksyaldehyd, u- zyskany jednym z dwóch wyzej wymienionych spo¬ sobów, jest podstawowym, glównym zwiazkiem wyjsciowym stosowanym do wytwarzania nowych zwiazków.Nastepny etap wytwarzania nowych zwiazków polega na reakcji l-metylo-5-nitroimidazolifo-2- -karboksyaldehydu, z podstawiona hydrazyna o wzorze H2N—NHR* w którym R oznacza grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla. Reakcje prowadzi sie w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak chlo- roform, w temperaturze wrzenia pod chlodnica zwrotna, uzyskujac alkilchydrazon l-metylo-5-ni- troimidazolilo-2-karboksyaldehydu. Do odpowied¬ nich podstawionych hydrazyn stosowanych w tej reakcji nalezy metylohydrazyna, etylohydrazyna, 3S n-propylohydrazyna, izopropylohydrazyna, i tym podobne. Warunki reakcji sa takie same dla wszy¬ stkich hydrazyn. Zatem na przyklad, jesli metylo- hydrazyne poddaje sie reakcji z l-metylo-5-nitro- imidazolilo-2-karboksyaldehydem w chloroformie, 40 otrzymuje sie metylohydraizon l-metylo-5-nitroimi- dazolilo-2-karboksyaldehydu.Utworzone w ten sposób hydrazony poddaje sie reakcji' z N-bromosukcynimidem w przyblizeniu w temperaturze pokojowej, w odpowiednim roz- 45 puszczalniku, takim jak chloroform, otrzymujac al- kilohydrazony bromku l-metylo-5-nitroimidazoilo- -2-karbonylu. Reakcja z N-bromosukcynimidem na¬ daje sie do jakiegokolwiek podstawionego hydra- zonu i prowadzi do bromopodstawionych hydra- 50 zonów. Na przyklad jesli metylohydrazon 1-metylo- -5-nitroimidazolilo-2-karboksyaldehydu poddaje sie reakcji z N-bromosukcynimidem w temperaturze pokojowej w chloroformie, to otrzymuje sie mety¬ lohydrazon bromku l-metylo-5-nitroimidazolilo-2- 55 -karbonylu.Podstawiony bromem hydrazon jest nietrwaly i posiada wlasciwosci parzace i lzawiace. Z tego powodu wykorzystuje sie go bez wydzielania lub dokladniejszego oczyszczania. Z podstawionego 60 bromem hydrazonu wytwarza sie zawiesine w od¬ powiednim rozpuszczalniku, na przyklad bezwod¬ nym metanolu i dodaje nitrylu kwasu malonowego.Nastepnie do tak utworzonej mieszaniny dodaje sie trójetyloamine rozpuszczona w absolutnym meta- 65 nolu, przy czym mieszanine reakcyjna utrzymuje96 804 6 sie w temperaturze okolo 10—20°C, przy pomocy odpowiedniego srodka chlodzacego. Reakcja ta jest nieznacznie egzotermiczna i aby utrzymac zadana temperature potrzebne jest chlodzenie.W miare postepu reakcji poczatkowo zólta za¬ wiesina rozpuszcza Sie i w czasie okolo 1—2 godziny zostaje zastapiona przez inna zawiesine. Staly ma¬ terial w tej drugiej zawiesinie jest zadanym pro¬ duktem, który odsacza sie, przemywa metanolem, a nastepnie woda, i suszy. Jesli na przyklad sto¬ suje sie metylohydrazon bromku l-metylo-5-nitro- imidazolilo-2-karbonylu, to na podstawie analizy elementarnej i widma NMR staly produkt identy¬ fikuje sie jako 5-amino-l-metylo-3(l-metylo-5-nit- ro-2-imidazolilo(pirazolo-4-karbonitryl. Hemologicz- ne 5-amino-l-alkilo-3(l-metylo-5-nitro-2-imidazoli- lo)pirazolo-4-karbonitryle mozna zsyntezowac z od¬ powiednich bromopodstawionych alkilohydrazonów postepujac w taki sam sposób, jak przy reakcji z nitrylem kwasu malonowego.Grupe 4-karbonitrylowa mozna latwo zhydrolizo- wac do grupy karbonamidowej w reakcji karbo- nitrylu ze stezonym kwasem siarkowym w absolut¬ nym etanolu. Na przyklad, jesli 5-amino-1-metylo- -3-(l-metylo-5-nitro-2-imidazolilo)pirazolo-4-karbo- nitryl poddaje przez okolo 1 godzine reakcji ze stezonym kwasem siarkowym w absolutnym eta¬ nolu, i w temperaturze lazni parowej, otrzymuje sie 5-amino-1-metylo-3(l-metylo-5-nitro-2-imidazo- lilo)pirazolo-4-karbonamid.Zwiazki o wzorze 1 wykazuja in vitro aktywnosc przeciw nastepujacej grupie drobnoustrojów, z których wiele jest czynnikiem chorobotwórczym u zwierzat: Escherichia coli, Salmonella dublin, Arizona paracolon, Pseudomonas, Pasteurella mul- tocida (wydzielona z wolu), (wydzielona z ptaków), (wydzielona ze swin), Pasteurella hemolytica, Stre- ptococcus (zapalenie sutek) Staphylococcus (zapa¬ lenie sutek), Streptococcus grupy E, Spherophorus necrophorus, Bordetella bronchiseptica, Erysipelo- thrix rhusiopathiae, Mycoplasma gallisepticum, My- coplasma synoviae, Mycoplasma hyopneumoniae, Mycoplasma hyosynoviae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma Szczepu T (z wolu), Bacteroides fra- gilis. ' Stwierdzono, ze nowe zwiazki o wzorze 1, wy¬ kazuja takze czynnosc in vivo i sa uzyteczne przy zwalczaniu szeregu infekcji u zwierzat, takich jak Escherichia coli u drobiu, Pasteurella multocida u kurczat, indyków i myszy, oraz Salmonella ty- phimuarium u kurczat. Zwalczanie tych organizmów przeprowadza sie przez podawanie skutecznych da¬ wek zwiazku drobiu lub myszom w postaci zas¬ trzyków, doustnie lub w karmie. Ustalono, ze zwiaz¬ ki byly takze skuteczne jako promotory wzrostu, gdy podawano je kurczetom.Stwierdzono takze, ze nowe zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalazku wykazuja aktywnosc in vivo i in vitro przeciw Treponema hyodysente- riae, która powoduje biegunke u swin. Biegunka swinska jest zakazna choroba infeksyjna charakte¬ ryzujaca sie sluzowo-krwistym rozwolnieniem. Cho¬ roba ta powoduje duze straty ekonomiczne spo¬ wodowane zmniejszonym przyrostem, gorszym wy¬ korzystaniem paszy oraz padnieciami. Wystepowa¬ nie choroby jest czeste zarówno w Stanach Zjed¬ noczonych, jak i w tych krajach gdzie istnieje intensywna hodowla swin.Nowe zwiazki wykazuja ponadto aktywnosc in vitro przeciw szeregowi bakterii beztlenowych, ta¬ kich jak: Actinomyces bovis 13684; Clostridium in- ocuum 1373, Clostridium perfringens 81, Clostri¬ dium ramosum 1313, Clostridium epeticum 1128, Clostridium septicum bovine, Eubaeterium aerofa- ciens 1235, Peptococcus anaerobius 1428, Peptostrep- tococcus intermedius 1264, Propionibacterium acnes 44, Propionibacterium acnes 79, Bacteroides fragi¬ lis sp. fragilis 1877, Bactoroides fragilis sp. fragilis 1936B, Bacteroides fragilis sp. thetaiotaomicron 1438, Bacteroides fragilis sp. vulgatus 1563, Bac¬ teroides fragilis sp. vulgatus 1211, Fusobacterium symbiosum 1470, Fusobacterium neerophOrum 13859, Veillonella alcalescens 1., Nowe zwiazki otrzymane sposobem wedlug wy¬ nalazku posiadaja wlasciwosci przeciwdrobnoustro- jowe, a zwlaszcza wykazuja uzyteczna w wetery¬ narii czynnosc przeciwbakteryjna, przeciwgrzybowa i przeciwpierwotniakowa. Zwiazki te sa szczególnie cenne przy leczeniu infekcji u drobiu, spowodowa¬ nych przez Escherichia coli, Pasteurella multocida i Salmonella typhimurium, a takze sa czynne jako promotory wzrostu u pisklat.Zatem przy leczeniu infekcji u pisklat, spowo¬ dowanej przez Escherichia coli, skuteczne jest po¬ dawanie w karmie zwiazku o wzorze ogólnym 1, w ilosci okolo 50—200 g na tone karmy.Infekcje u kurczat i indyków, spowodowane przez Pasteurella multocida, opanowuje sie skutecznie przez podawanie jednego z nowych zwiazków w ilosci okolo 100 g na tone karmy.Takze u kurczat opanowanie infekcji spowodo¬ wanych przez Salmonella typhimurium przeprowa¬ dza sie droga doustnego podawania jednego z no¬ wych zwiazków w ilosci okolo 25—100 g zwiazku na 1 tone karmy. Zatem infekcje u kurczat i in¬ dyków, spowodowane przez Escherichia coli, Pas¬ teurella multocida i Salmonella typhimurium, opa¬ nowuje sie przez doustne podawanie jednego z no¬ wych zwiazków, w ilosci okolo 25—200 g na 1 tone karmy.Opanowanie infekcji u kurczat, spowodowanych przez Salmonella typhimurium, mozna przeprowa¬ dzic przez podskórne podawanie nowych zwiazków, w dawkach okolo 3—60 mg na kilogram wagi ciala.Infekcje u myszy spowodowana przez Pasteurel¬ la multocida, opanowac mozna przez dootrzewnowe wstrzykiwanie zwiazku w ilosci 2,5 mg na kilo¬ gram ciala zwierzecia. Infekcje te mozna równiez opanowac przez podanie doustne okolo 100 g zwiaz¬ ku na 1 tone pozywienia.Badano jeden z nowych zwiazków, 5-amino-1-me- tylo-3-(l-metylo-5-nitro-2-imidazolilo)pirazolo-4- -karbonitryl, i stwierdzono, ze jest on skuteczny jako hormon wzrostu, £dy podawany jest doustnie piskletom w dawkach okolo 50 g na 1 tone karmy.Wyzej opisana czynnosc przeciwdrobnoustrojowa zwiazków stwierdzono w szeregu wielostronnych prób, przedstawionych ponizej.Doswiadczenie 1. Badano skutecznosc nowych zwiazków przeciw infekcjom u myszy spowodo- 40 45 50 55 60W 804 7 S wanym przez Pasteurella multocida, przy podawa¬ niu droga wstrzykiwania.Do badan wykorzystano szwajcarskie myszy plci zenskiej o ciezarze 15—20 g Po odwazeniu 5 mg badanego zwiazku rozpuszczono go w 0,5 ml dwu- metylosulfotlenku i tak przygotowany roztwór do¬ dano do 9,5 ml zawiesiny soli sodowej karboksy- metyloeelulozy. Myszom, w grupach po 5 sztuk wstrzykiwano dootrzewnowe 0,1 ml w powyzszy sposób przygotowanej kompozycji doswiadczalnej, co odpowiada dawce 2,3 mg na 1 kilogram cie¬ zaru ciala myszy. Zwiazki badane byly w daw¬ kach 2,5, 5,0 i 7,5 mg na 1 kilogram ciezaru ciala myszy, przy czym sposób przygotowania dawek 5,0 i 7,5 mg/kg byl taki sam jak dawki 2,5 mg/kg.Bezposrednio po otrzymaniu badanego zwiazku my¬ szy byly zakazone podskórnie przy pomocy 16- i 20- -godzinnej tryfctozowej hodowli Pasteurella mul¬ tocida, stosujac rozcienczenia równe dziesietnemu logarytmowi 10^*, 10-*, 10"* 10^7, przy uzyciu 0,1 ml na mysz. Zakazano takze podobne grupy my¬ szy kontrolnych, których przedtem nie traktowano nowymi zwiazkami, przy czym szczepionke zaka¬ zajaca podawano podskórnie. Badane grupy myszy obserwowano codziennie porównujac smiertelnosc w grupach traktowanych nowymi zwiazkami ze smiertelnoscia w grupach kontrolnych nie trak¬ towanych nowymi zwiazkami.Wyniki badan zebrano w tablicy I, w której ba¬ dany zwiazek jest zidentyfikowany numerem przy¬ kladu, w którym opisano jego synteze. W kolumnie 1 wyszczególniono badany zwiazek, w kolumnie 2 dawke badanego zwiazku w mg/kg ciezaru ciala myszy, w kolumnie 3 rozcienczenie organizmu za¬ kazajacego, a w kolumnie 4 przezycie wzgledne tj. stosunek liczby myszy, które przezyly próbe, przy danej dawce i rozcienczeniu, do liczby myszy poddanych próbie.Tablica I Zwiazek i 3 Hawka w mg/kg 2,5 2,5 Grupy kontrolne zakazone Rozcien¬ czenie -4 -5 io-« -7 -4 -5 -« -4 -5 -6 Przezycie wzgledne 1/10 8/20 24/30 19/20 /10 9/10 /10 0/10 2/10 8/10 Doswiadczenie 2. W podobny sposób oceniano skutecznosc nowych zwiazków przy zwalczaniu in¬ fekcji u kurczat, spowodowanych przez Salmonella typhimurium.Doswiadczenie przeprowadzono na 1-dniowych piskletach o ciezarze okolo 33 g kazde. Z uwagi na wielkosc dawki piskleta podzielono na grupy po 5 sztuk. Czesc pisklat otrzymala badany zwia¬ zek, w postaci zawiesiny w 0,2 ml gilkolu poliety¬ lenowego 200, droga podskórnego zastrzyku w szyje.Grupa kontrolna zwiazku nie otrzymala. Wszystkie piskleta zakazano przy pomocy kultury bakterii w rozcienczeniu 1: 200, przez domiesniowe wstrzyknie¬ cie 0,1 ml w noge kazdego pisklecia. Piskleta ob¬ serwowano przez 6 dni, przy czym liczbe przypad¬ ków smiertelnych w. grupie kontrolnej porówny¬ wano z liczba przypadków smiertelnych u pisklat, które otrzymaly badany zwiazek. Wyniki badan zebrano w tablicy II, W tablicy II w kolumnie 1 wyszczególniono ba¬ dany zwiazek, w kolumnie 2 dawke badanego zwiazku w mg/kg, a w kolumnie 3 przezycie wzgledne.Tablica II Zwiazek 3 Dawka mg/kg 60 ia 7.5 Przezycie wzgledne 7/15 U/25 6/15 0/10 Doswiadczenie 3. Oznaczono wrazliwosc bakterii w beztlenowych, zarówno gram-dodatnich, jak i gram- -ujemnych, na reprezentatywna liczbe nowych zwiazków, korzystajac z agarowej metody rozcien- czen. Bakterie wyizolowano z pacjentów przebywa¬ jacych na leczeniu w Osrodku Medycznym Uni- wersytetu w Indianie. Wyizolowane bakterie zi¬ dentyfikowano w laboratorium anaerobowym Cen¬ trum Medycznego przy pomocy kryteriów opraco¬ wanych przez Dowella i wspólpracowników, Labo- ratory Methods in Anaerobic Bacteriology, Public 40 Health Serv, Publ. nr 1803 (1968) {Center for Disea- se Control, Atlanta, Ca.]; oraz przez Smitha i wspól¬ pracowników, The Pathogenic Anaerobic Baeteria, strony 96—136 (1968) {Charles C. Thomas, Publis¬ her, Springfield, Iii], Wszystkie drobnoustroje prze- 45 chowywano w srodowisku glukozowym z posieka¬ nym miesem (Scott Laba) w temperaturze poko¬ jowej.Metoda stosowana w próbach z rozcienczeniem agarowym oparta byla na badaniach Suttera i 59 wspólpracowników Antimicrob. Ag. Chemother. 3,188—193 (1973). Rasy bakterii anaerobowyeh. ho¬ dowano w rurkach o wymiarach 16X120 mm w ciagu 16—18 godzin w srodowisku tioglikolanu bez wskaznika 135C (Becton, Dickinson and Co.), do 55 którego przed autoklawowaniem dodano 5 pg he- miny na 1 mililitr oraz po autoklawowaniu 1 mg wodoroweglanu sodowego i 0,ljjig menadionu ste¬ rylizowanego przez filtr. Rurki wzrostowe dla bak¬ terii Veillonella alcalescens zaopatrzono w 5 mg 60 mleczanu sodowego na 1 mililitr. Szczepy bakterii zostaly wyskalowane na zmetnienie zgodnie ze wzorcem nr 1 Mc Farlanda w srodowisku tiogli¬ kolanu bez wskaznika 135C, zawierajacym dodat¬ kowo 0,13% Bacto-agaru (Difco). Kazdy szczep u^ 65 mieszczano nastepnie na powierzchni plytki Pe¬ le W »0 40 45 50 55 6096 864 triego (o wymiarach 100X15 mm) przy pomocy re- plikatora.Do badan z rozcienczeniem agarowym przygo¬ towano 2-krotne rozcienczenie badanych zwiazków w odmineralizowanej wodzie, do których nastepnie dodano zhemolizowanej krwi owczej i sterylizowa¬ nego przez filtr menadionu, tak ze stezenia po roz¬ cienczeniu agarowym wyniosly odpowiednio 5% i 10 jig/ml. Do kazdego rozcienczenia dodano równa objetosc agaru Brucella o podwójnej mocy (Bec- ton, Dickinson and Co.), na lazni wodnej utrzymy¬ wanej w temperaturze 50°C, a nastepnie wylano je na szalki Petriego.Wszystkie operacje wykonywano wewnatrz plas¬ tikowej komory rekawicowej, z wyjatkiem inkuba¬ cji rurek wzrostowych i wylania na plytki. Po stwardnieniu plytki umieszczono w komorze re¬ kawicowej przynajmniej na dwie godziny przed szczepieniem. Operacje w komorze rekawicowej przeprowadzono glównie wedlug Aranki i wspól¬ pracowników, Applied Microbiology, 17, 568—576 (1969), lecz wprowadzajac nastepujace zmiany. Su¬ che materialy wprowadzano do komory rekawico¬ wej droga opróznienia sluzy do 71 cm slupa rteci i wypelnienia jej azotem, a nastepnie przez ko¬ lejne opróznienie w ten sam sposób i napelnienie jej mieszanina 80% azotu, 10% C02 i 10% wodoru.Plyny i plytki agarowe wprowadzano do komory rekawicowej droga opróznienia sluzy do 25 cm slupa rteci i czterokrotne napelnienie gazem. Do wypelnienia sluzy po pierwszych dwóch opróznie¬ niach wykorzystano azot, natomiast do dwóch na¬ pelnien koncowych — wyzej opisana mieszanine gazów.Wszystkie plytki poddano inkubacji w tempera¬ turze 37°C w slojach typu Gas Pak (Becton, Dic¬ kinson and Co.) zawierajacych katalizatory glinowe pokryte palladem (reaktywowane po kazdym uzy¬ ciu). Wyniki prób sposobem rozcienczenia agaro¬ wego odczytywano okolo 24 godziny od rozpocze¬ cia inkubacji. Jako minimalne stezenie hamujace rozwój (MIC) przyjeto najnizsze stezenie badanego zwiazku, przy którym nie zaobserwowano rozwoju bakterii.Wyniki tych badan in vitro zebrano w tablicy III i IV, przy czym badane zwiazki oznaczono w taki sam sposób jak w poprzednich doswiadcze¬ niach. Dla celów porównawczych równolegle próby przeprowadzono takze z antybiotykami cefa- lotyna i erytromycyna i wyniki wlaczono do tab¬ licy III i IV.Przyklady I i II przedstawiaja synteze zwiazków wyjsciowych., Przyklad I. Synteza l-metylo-5-nitroimidazo- lilo-2-karboksyaldehydu.Do roztworu 5 g (0,0394 mola) 2-metylo-5-nitro- imidazolu w 100 ml wrzacego benzenu wkrapla sie roztwór 5 g (0,0394 mola) siarczanu dwumetyluwlO ml benzenu, po czym calosc ogrzewa sie pod chlod¬ nica zwrotna przez noc. Z kolei mieszanine reak¬ cyjna chlodzi sie wkrapla do niej roztwór 6 g we¬ glanu potasowego w 6 ml wody. Calosc miesza sie przez 1..godzine i saczy. Po rozdzieleniu fazy or¬ ganicznej i wodnej przesaczu, czesc wodna przemy¬ wa sie 2 razy po 50 ml benzenu. Benzenowy eks- trat laczy sie z pierwotna warstwa organiczna i calosc suszy nad bezwodnym siarczanem magne¬ zowym. Po odsaczeniu srodka suszacego przesacz zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem uzyskujac produkt o temperaturze topnienia okolo 135—138°C, który zidentyfikowano jako l,2-dwumetylo-5-nitro- imidazol. Ciezar produktu wynosil 4 g.W 10 litrowej okraglodennej kolbie, zaopatrzo¬ nej w mieszadlo mechaniczne, chlodnice zwrotna i wkraplacz, umieszczono 705 g (5,0 moli) 1,2-dwu- metylo-5-nitroimidazolu i 3,75 litrów absolutnego etanolu, po czym calosc mieszano do czasu pelnego rozpuszczenia. Do tak przygotowanego roztworu do¬ dano szybko 685 g (6,5 moli) benzaldehydu. Z kolei do mieszaniny dodano szybko 150 g sodu rozpusz¬ czonego w 2,5 1 metanolu, przy czym dodawanie przeprowadzono w temperaturze pokojowej. Calosc mieszano i ogrzewano w temperaturze okolo 70°C przez okolo 90 minut. Po osiagnieciu temperatury 40°C barwa roztworu zmienila sie na ciemnobra- Badany zwiazek 3 erytro¬ mycyna cefalo- tyna co 1 3 oo G co O ^ C co < 0,125 1,0 2 Tablica III Wrazliwosc wyodrebnionych bakterii anaerobowych Minimalne stezenie wstrzymujace rozwój, po 24 godzinach (^ig/ml) co S 2 ostridiu ocuum G.S < 0,125 128 8 ostridium rfringens 81 . i—t Ci) O a < 0,126 <0,5 2 co I-i £ «-¦ ostridiu mosum U U < 0,125 < 128 8 00 CM £ 2 ostridiu pticum U co < 0,125 1,0 1,0 m bovine ostridiu pticum urn kns 1235 ibacteri orofacie O w ' W cd < 0,125 <0,5 4 < 0,125 1,0 2 us s 1428 ptococc aerobiu & 3 < 0,125 1.0 2 ptocóccus us 1264 ptostre] termedi PL, .5 1,0 8 1,0 acterium opionib nes 44 PL( Cd 0,5 <0,5 211 96 804 Tablica IV 12 Badany. zwiazek 3 erytro- rnycyna Mcefalo- tyna 6 2 actei C3 c- o Propi< acnes < 0,126 <0,5 1,0 Wrazliwosc wyodrebnionych bakterii anaerobowych Minimalne stezenie wstrzymujace rozwój, po godzinach (ng/ml) i 'Sb cd es fr gilis 2 2 u Bacte lis sp. 1877 <0,125 4 128 , ' W cd es fr gilis 2 2 U Bacte lis sp 1936B < 0,125 4 128 «fH U) cd , co •fi .2 3 w «S H u . o i Bacte lis sp taomi < 0,125 4 64 i •r4 &D cd co es fr Igatu 2 * o u Bacte lis sp. 1563 < 0,125 2 8 j 'Sb cd co za 2 s o »-i Bacte lis sp. 1211 < 0,125 2 4 24 q ^ r«» icterium •sum 14' co o Fusob symbi < 0,125 <0,5 64 8 ^ .2 S o u -*- O 8 -S Cd rv Fusob necro] 13859 < 0,125 2 <0,5 cd 22 3 § 2 w G CO Veillo alcale < 0,125 1 <0,5 zowa. Po uplywie 90 minut mieszanine poreakcyjna oziebiono zanurzajac naczynie reakcyjne na 90 mi¬ nut w lazni lodowo-wodnej. Wytracil sie osad, któ¬ ry oddzielono od brazowej mieszaniny. Krystaliczny produkt przemyto 4 razy mieszanina lodu, wody i etanolu w stosunku 1:1:1, wykorzystujac do tego celu 1 litr mieszaniny. Produkt suszono na powietrzu w temperaturze 100°C i zidentyfikowano jako l-metylo-5-nitro-2-styryloimidazol. Posiadal on temperature topnienia okolo 191—192°C, ciezar 582 g.W trójszyjnej okraglodennej 5-litrowej kolbie, zaopatrzonej w mieszadlo i rurke do wprowadzania gazu, przygotowano roztwór 454 g (2,0 mole) 1-me- tylo-5-nitro-2-styryloimidazolu w mieszaninie 2,5 litrów metanolu, 1,5 litrów dwuchlorometanu i 200 ml wody. Kolbe utrzymywano w temperaturze po¬ kojowej za pomoca lazni wodnej. Przez roztwór przepuszczono mieszanine ozonu i tlenu (3*/© 03 w 1,1 litrze na minute). Tworzenie sie ózonku kontro¬ lowano w pewnych przedzialach czasu za pomoca chromatografii gazowo-cieczowej i chromatografii cienkowarstwowej. Calkowity czas trwania ozono- lizy wynosil okolo 25 godzin i po uplywie tego czasu barwa roztworu zmienila sie na jasnozólta.Roztwór 594 g jodku sodowego w 2 litrach wody i 400 ml kwasu octowego mieszano w okragloden¬ nej, 10-litrowej kolbie, do którego stosunkowo szyb¬ ko wlano roztwór po ozonolizie, utrzymujac tem¬ perature ponizej 40°C za pomoca lazni lodowo-wod¬ nej. Po okolo 10 minutach mieszania dodano roz¬ twór pirosiarczynu sodowego (192 g w dwóch lit¬ rach wód*") w celu usuniecia wolnego jodu i przy¬ wrócenia zóltej barwy roztworu. Z kolei mieszanine mieszano jeszcze przez okolo 1 godzine, a nas¬ tepnie przesaczono odrzucajac zólte krysztaly. Prze¬ sacz zatezono pod próznia do okolo 1/3 objetosci i zobojetniono , do wartosci pH 6,5 przez dodanie, z mieszaniem, stalego wodoroweglanu sodowego, w ilosci okolo 300 g. Mieszanine ekstrahowano 4 por¬ cjami po 700 ml octanu etylu, po czym polaczone wyciagi suszono nad bezwodnym siarczanem mag¬ nezowym przez okolo pól godziny. Po odsaczeniu srodka suszacego przesacz odparowano pod zmniej¬ szonym cisnieniem otrzymujac kleista pozostalosc.Pozostalosc rozpuszczono w okolo 2,5 1 n-heksanu, po czym roztwór ogrzewano pod chlodnica zwrotna przez okolo 15 minut, a resztki brazowego stalego materialu usunieto przez saczenie.Po ochlodzeniu z przesaczu wytracily sie zólte 3i krysztaly, które odsaczono i wysuszono pod próznia w temperaturze 40°C. Przesacz wykorzystano po¬ nownie ogrzewajac pod chlodnica zwrotna wyzej wymieniony brazowy material resztkowy i prze¬ prowadzajac cztery takie ektrakcje. W ten sposób uzyskano ogólem okolo 146 g produktu o tempera¬ turze topnienia okolo 81—83°C, który zidentyfiko¬ wano jako l-metylo-5-nitroimidazolo-2-karboksy- aldehyd.Przyklad II. Synteza 5-amino-l-metylo-3-(l- 40 -metylo-5-nitro-2-imidazolilo)pirazolo-4-karbonitry- lu.Mieszanine 23,5 g (0,152 mola) l-metylo-5-nitro- imidazolilo-2-karboksyaldehydu i 7,0 g (0,152 mola) metylohydrazyny w 300 ml chloroformu ogrzewano 45 w stanie wrzenia pod chlodnica zwrotna przez okolo 2 godziny, po ozym mieszanine poreakcyjna odparo¬ wano do sucha otrzymujac okolo 25,5 jasnozóltego ciala stalego. Mala próbka tej substancji po prze- krystalizowaniu z etanolu posiadala temperature 50 topnienia okolo 175°C i zidentyfikowano ja jako metylohydrazon l-metylo-5-nitroimidazolilo-2-kar- boksyaldehyd.Do mieszanego roztworu 23,5 g (0,128 mola) me- tylohydrazonu l-metylo-5-nitroimidazolilo-2-karbo- 55 ksyaldehydu w 200 ml chloroformu dodano powoli, w temperaturze pokojowej, 22,9 g (0,128 mola) N- -bromosukcynimidu. Reakcja byla nieznacznie izo- termiczna i temperature roztworu utrzymywano po¬ nizej 30°C za pomoca dorywczego chlodzenia zew- 60 netrznego. Po mieszaniu przez okolo 2 godziny chlo¬ roform usunieto pod próznia, a pozostalosc ekstra¬ howano za pomoca 5 porcji po 100 ml goracego czterochlorku wegla. Nierozpuszczalna pozostalosc usunieto, a polaczone wyciagi w czterochlorku we- 65 gla zatezono otrzymujac jasnozólte cialo stale, które96 804 13 14 zidentyfikowano jako metylohydrazon bromku 1- metylo-5-nitroimidazolilo-2-karbonylu z wydajnos¬ cia 31,0 g. Chromatografia cienkowarstwowa wyka¬ zala, ze zwiazek byl prawie czysty.Poniewaz zwiazek byl nietrwaly i posiadal wlas¬ ciwosci lzawiace i parzace, to wykorzystano go na¬ tychmiast w nastepnym etapie syntezy.Tak otrzymany bromohydrazon, w ilosci 31,0 g (0,118 mola), zawieszono w 250 ml bezwodnego me¬ tanolu i dodano 7,80 g (0,118 mola) swiezo przedes- tylowego nitrylu kwasu malonowego. Utrzymujac temperature okolo 10—20°C do mieszaniny reak¬ cyjnej wkroplono roztwór 12 g (0,118 mola) tróje- tyloaminy w 25 ml metanolu. Reakcja przebiegala lekko egzotermicznie.Poczatkowo zólta zawiesina rozpuscila sie a na jej miejsce po uplywie okolo 1—2 godzin utwo¬ rzyla sie inna zawiesina. Wtedy mieszanine reak¬ cyjna przesaczono i zebrano staly produkt, który przemyto metanolem, a nastepnie woda i wysu¬ szono. Produkt ten wazyl okolo 23 g, posiadal tem¬ perature topnienia powyzej 300°C i zidentyfikowa¬ no go jako 5-amino-l-metylo-3-(l-metylo-5-nitro-2- -imidazolilo)pirazolo-4-karbonitryl. Po wydzieleniu produkt byl analitycznie czysty.Przyklad III. Synteza 5-amino-l-metylo-3-(l- -metylo-5-nitro-2-imidazolilo)pirazolo-4-karbona- mid.Do mieszaniny 3 ml stezonego kwasu siarkowego i 2 ml absolutnego etanolu dodano 1,0 g 5-amino- -l-metylo-3-(l-metylo-5-nitro-2-imidazolilo)pirazolo- -4-karbonitrylu, po czym calosc ogrzewano na lazni parowej przez okolo 1 godzine. Po uplywie tego czasu do mieszaniny dodano 10 ml wody i pozos¬ tawiono ja przez noc w temperaturze otoczenia.Wytracil sie osad, który odsaczono i przekrystali- zowano z handlowego absolutnego etanolu uzys¬ kujac produkt w postaci stalej o temperaturze top- nienia 255—256°C. Na podstawie widma NMR pro¬ dukt ten zidentyfikowano jako 5-amino-l-metylo- -3-(l-metylo-5-nitro-2-imidazolilo)pirazolo-4-kairbo- namid. PLThe subject of the invention is a process for the preparation of new substituted pyrazole derivatives which are useful in the control of bacteria, fungi and protozoa, especially in human and veterinary medicine. The present invention provides the compounds of formula I in which R is an alkyl group of 1-3 carbon atoms, R1 is NH2 and R2 is -CONH2. A great deal of research has been done to find agents to combat infections in poultry, pigs and cattle caused by bacteria and protozoa. Thus, the subject of extensive research for many years have been the compounds and methods of controlling Escherichia coli, Pasteurella multocida, Salmonella typhimurium, and coccidiosis in chickens, as well as Treponema hyodysenteriae in pigs. Belgian Patent Specification No. 75 145 3/4 describes substituted 5-nitrofurans and 5-amino-4-cyano-1-methyl-3- (5-nitro-2-furyl) -pyrazole, methods for their preparation, and drugs containing substituted nitrofurans as active ingredient. These compounds are reported to be active against bacteria, worms and protozoa, and to act as catidiostatic, antipyretic and antimalarial agents. Also, Belgian Patent Specification No. 782,851 describes 2- (5-nitro-2-imidazolyl) -pyrimidines. and how to get them. These compounds are active as anti-parasite, bactericidal and antifungal agents, and are also useful in the treatment of vaginal infections. US Pat. No. 3,452,034 discloses substituted 2- (1,3,4, -thiadiazol-2) -4 (5) -nitroimidazoles and their preparation. These compounds are said to be useful as antibacterial and amoebicides, anti-parasitic and coccidiostatic agents. U.S. Patent No. 3,682,942 discloses methods of making 2- (2-amino-1,3,4-thiadiazolyl-5) - l- substituted 5-nitroimidazoles. These products are useful for controlling parasitic and protozoal bacterial infections in poultry and animals, particularly for controlling infections caused by Trichomonas vaginalis and Salmonella gallinarum, as described by Berkelhammer et al. In U.S. Patent No. 3,452,035. position 2 by ring heterocyclic systems 5-nitroimidazoles are disclosed by Rufer et al., Progr. Antimicrob. Anti-caccer Chemother., Proc. Int. Conger. Chemother., 6th 1969 (published 1970), 1,145-8, (Univ. Park Press: Baltimore, Maryland) Chem. Anstr. 74, 141632x (1971). These authors report that these compounds are active against Trichomonas vaginalis in vitro. US Pat. No. 3,682,953 describes 3- (5-nitro-2-furyl) pyrazole derivatives and their pharmaceutically acceptable salts acid addition compositions as well as pharmaceutical and feed compositions containing these compounds, as well as methods of treating bacterial infections in mammals and methods of protecting organic material from attack by bacteria using the proprietary compounds. These compounds are said to have antimicrobial, anthelmintic, antiprotozoal, coccidiostatic, antipyretic and anti-malarial activity. US Patent 3,682,956 discloses 5-amino-4-carbamyl-3-3. (5-nitro-2-furyl) pyrazoles exhibit antimicrobial activity. The compounds are used in the same manner as those described in U.S. Patent No. 3,682,953. U.S. Patent No. 3,716,555 discloses 3- (5-nitro-2-furyl) pyrazole derivatives and that these compounds are possess antimicrobial properties. US Pat. No. 3,719,759 discloses antipyretic agents containing nitroimidazoles. Described nitrimidazoles include 1-substituted 2-aryl 5-nitrimidazoles, wherein the aryl is substituted or unsubstituted phenyl or naphthyl and the substituent on position 1 is a lower alkyl group. These compounds appear to be effective against infections caused by protozoa such as histomoniasis, trichomoniasis, amoebiasis and endomata, as well as against helminths such as Meterakis and Ascarid strains, and against bacteria such as strains Salmonella, Streptococcus and Escherichia coli, and against organisms active in pleurisy. US Pat. No. 3,399,211 discloses methods of producing compounds used in antiprotozoal agents described in US Pat. No. 3,719,759. The above-described known compounds are described in The structure of the compounds according to the invention differs significantly from those of the compounds of the present invention. The substituent of Formula 1 is an alkyl group of 1 to 3 carbon atoms which represents a straight or branched saturated hydrocarbon radical such as methyl, ethyl, n-propyl or isopropyl. according to the invention, it consists in the compound of formula 2 in which R and R 1 have the above meanings R2 is the group —NN, is hydrolyzed to the compound of formula I, in which R2 is carbonamide. The new compounds of formula I are prepared starting from commercially available 2-methyl-5-nitroimidazole, which is reacted with an alkylating agent such as dimethyl sulfate in a suitable solvent, for example benzene, to give 1,2-dimethyl-5-nitro-imidazole. This compound is reacted with benzaldehyde in the presence of a base, for example sodium ethoxide in anhydrous ethanol, to give 1-methyl-5-nitro-styrylimidazole. The next step in the synthesis of the new compounds is the oxidation of the styryl bond into 1-methyl-5- - nitro-styrylimidazole. This can be done with a variety of oxidants which are suitable for oxidizing this type of linkage to an aldehyde (formyl) group. ; The oxidation is accomplished by treating 1-methyl-5-nitro-2-styrylimidazole as a suspension in a suitable solvent with ozone at approximately room temperature. Suitable solvents include methanol, a mixture of methanol and water, or a mixture of methanol, methylene chloride, and water, and the like. Oxidation of the styryl compound may also be carried out as described in US Patent No. 3,472,864. oxidizing, consisting of alkali metal periodate and osmium tetroxide in a suitable aqueous environment, in particular in water and 1,2-dimethoxyethane, at a temperature of about 35 ° C for about 10-20 hours. 1-methyl-5-nitroimidazolyl-2-carboxaldehyde, obtained by one of the two above-mentioned methods, is the basic main starting material for the production of new compounds. The next step in the preparation of new compounds is the 1-methyl-5 reaction. nitroimidazolypo-2-carboxaldehyde, with a substituted hydrazine of the formula H 2 N — NHR *, wherein R is an alkyl group of 1-3 carbon atoms. The reactions are performed in a suitable solvent such as chloroform under reflux to give the alkylchydrazone of 1-methyl-5-nitrimidazolyl-2-carboxaldehyde. Suitable substituted hydrazines for use in this reaction include methylhydrazine, ethylhydrazine, 3S n-propylhydrazine, isopropylhydrazine, and the like. The reaction conditions are the same for all hydrazines. Thus, for example, if methyl hydrazine is reacted with 1-methyl-5-nitroimidazolyl-2-carboxaldehyde in chloroform, 1-methyl-5-nitroimidazolyl-2-carboxaldehyde methylhydraizone is obtained. the hydrazones are reacted with N-bromosuccinimide at approximately room temperature in a suitable solvent such as chloroform to give 1-methyl-5-nitroimidazoyl-2-carbonyl bromide alkylhydrazones. The reaction with N-bromosuccinimide will add to any substituted hydrazone and lead to bromo-substituted hydrazones. For example, when 1-methyl-5-nitroimidazolyl-2-carboxaldehyde methylhydrazone is reacted with N-bromosuccinimide at room temperature in chloroform, 1-methyl-5-nitroimidazolyl-2-carbonyl bromide methylhydrazone is obtained. The bromine substituted hydrazone is unstable and has blistering and tearing properties. For this reason, it is used without separation or more thorough cleaning. The bromine-substituted hydrazone is suspended in a suitable solvent, for example anhydrous methanol, and malonic acid nitrile is added. Triethylamine dissolved in absolute methanol is then added to the mixture thus formed, while the reaction mixture remains stable. at a temperature of about 10-20 ° C, with the help of a suitable cooling agent. This reaction is slightly exothermic and cooling is required to maintain the desired temperature. As the reaction proceeds, the initially yellow suspension dissolves and is replaced by another suspension in about 1-2 hours. The solid material in the latter slurry is the desired product, which is filtered off, washed with methanol, then water, and dried. If, for example, 1-methyl-5-nitroimidazolyl-2-carbonyl bromide methylhydrazone is used, the solid product is identified by elemental analysis and NMR spectrum as 5-amino-1-methyl-3 (1- methyl-5-nitro-2-imidazolyl (pyrazole-4-carbonitrile. Hemological 5-amino-1-alkyl-3 (1-methyl-5-nitro-2-imidazolyl) pyrazole-4-carbonitrile can be synthesized from the corresponding bromo-substituted alkylhydrazones in the same way as for the reaction with malonic acid nitrile. The 4-carbonitrile group can be easily hydrolyzed to the carbonamide group by reacting the carbonitrile with concentrated sulfuric acid in absolute ethanol. For example, if 5-amino-1-methyl-3- (1-methyl-5-nitro-2-imidazolyl) pyrazole-4-carbonitrile is reacted for about 1 hour with concentrated sulfuric acid in absolute ethanol, and at steam bath temperature, 5-amino-1-methyl-3- (1-methyl-5-nitro-2-imidazolyl) pyrazole-4-carbonamide is obtained. Compounds of formula I show in vitro activity antimicrobial resistance against the following group of microorganisms, many of which are pathogenic in animals: Escherichia coli, Salmonella dublin, Arizona paracolon, Pseudomonas, Pasteurella multocida (excreted from goit), (derived from birds), (derived from pigs), Pasteurella hemolytica , Streptococcus (mastitis), Staphylococcus (mastitis), Group E Streptococcus, Spherophorus necrophorus, Bordetella bronchiseptica, Erysipelotrix rhusiopathiae, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma mycoplasma, Mycoplasma mycoplasmae, Mycoplasma mycoplasma T (from goiter), Bacteroides frigilis. The novel compounds of formula I have also been found to be active in vivo and useful in the control of a variety of infections in animals such as Escherichia coli in poultry, Pasteurella multocida in chickens, turkeys and mice, and Salmonella typhimuarium in chickens. . Control of these organisms is accomplished by administering effective doses of the compound to poultry or mice in the form of episodes, orally or in the feed. It was found that the compounds were also effective as growth promoters when administered to chickens. It was also found that the new compounds according to the invention showed in vivo and in vitro activity against Treponema hyodysenteriae which causes diarrhea in pigs. Swine diarrhea is an infectious infectious disease characterized by muco-bloody diarrhea. This disease causes great economic losses due to reduced growth, poor feed conversion and deaths. Disease prevalence is common in both the United States and those countries where pigs are intensively reared. The new compounds are also active in vitro against a number of anaerobic bacteria, such as: Actinomyces bovis 13684; Clostridium inocuum 1373, Clostridium perfringens 81, Clostridium ramosum 1313, Clostridium epeticum 1128, Clostridium septicum bovine, Eubaeterium aeroface 1235, Peptococcus anaerobius 1428, Peptostrep- tococcus anaerobius 1428, Peptostrep- tococcus acacia, Propionium Acacia 1264, Propion acacia. ¬ lis sp. Fragilis 1877, Bactoroides fragilis sp. Fragilis 1936B, Bacteroides fragilis sp.thetaiotaomicron 1438, Bacteroides fragilis sp. Vulgatus 1563, Bac¬ teroides fragilis sp. Vulgatus 1211, Fusobacterium symbiosum 1470, Fusobacterium symbiosum 1470, Fusobacterium 1.859, Fusobacterium al. The new compounds according to the invention possess antimicrobial properties, and in particular exhibit antimicrobial, antifungal and antiprotozoal activity useful in veterinary medicine. These compounds are especially valuable in the treatment of infections in poultry caused by Escherichia coli, Pasteurella multocida and Salmonella typhimurium, and are also active as growth promoters in chicks. Thus, in treating infection in chicks caused by Escherichia coli, it is effective. the addition of a compound of formula I in the feed in an amount of about 50-200 g per ton of feed. Chickens and turkeys infections caused by Pasteurella multocida are successfully managed by administering one of the new compounds at about 100 g per ton of feed. .Also in chickens control of infections caused by Salmonella typhimurium is carried out by the oral administration of one of the new compounds in the amount of about 25-100 g of the compound per 1 ton of food. Thus, infections in chickens and insects, caused by Escherichia coli, Pasteurella multocida and Salmonella typhimurium, are managed by the oral administration of one of the new compounds in an amount of about 25-200 g per 1 ton of food. in chickens caused by Salmonella typhimurium, the new compounds can be administered subcutaneously at doses of about 3 to 60 mg per kilogram of body weight. Infections in mice caused by Pasteurel la multocida can be managed by intraperitoneal injection of 2 compounds. 5 mg per kilogram of animal body. These infections can also be controlled by oral administration of about 100 g of the compound per 1 ton of food. One of the new compounds, 5-amino-1-methyl-3- (1-methyl-5-nitro-2-imidazolyl) has been tested. Pyrazole-4-carbonitrile, and it has been found to be effective as a growth hormone, when administered orally to chicks in doses of about 50 g per 1 ton of food. The antimicrobial activity described above has been found in a number of multilateral trials, presented below. Experiment 1 The efficacy of the new compounds against infections in mice caused by Pasteurella multocida was investigated by the injection route. Swiss female mice weighing 15-20 g were used for the study. After weighing 5 mg of the test compound. it was dissolved in 0.5 ml of dimethylsulfoxide, and the solution thus prepared was added to 9.5 ml of the sodium carboxy methyl cellulose suspension. Mice, in groups of 5, were injected intraperitoneally with 0.1 ml of the experimental composition prepared as above, which corresponds to a dose of 2.3 mg per kilogram of mouse body weight. The test compounds were dosed at 2.5, 5.0, and 7.5 mg per kilogram of mouse body weight, the preparation of the 5.0 and 7.5 mg / kg doses being the same as for the 2.5 mg doses. / kg. Immediately after receipt of the test compound, the mice were subcutaneously infected with a 16- and 20-hour tryptose culture of Pasteurella multocida, using dilutions equal to 10 *, 10 *, 10 "* 10 ^ 7, using 0.1 ml per mouse. Similar groups of control mice that had not previously been treated with the novel compounds were also prohibited, but the infectious vaccine was administered subcutaneously. The test groups of mice were monitored daily by comparing the mortality in the groups treated with the new compounds with the mortality in the groups. The results of the tests are summarized in Table I, in which the test compound is identified by the example number in which its synthesis is described. Column 1 lists the compound to be tested, column 2 lists the dose of the test compound in mg / m. kg weight the body of the mice, in column 3 the dilution of the infectious organism, and in column 4 the relative survival, i.e. the ratio of the number of mice that survived the test at a given dose and dilution, to the number of mice tested. Table I Compound and 3 Hawk in mg / kg 2 , 5 2.5 Forbidden control groups Dilution -4 -5 io- -7 -4 -5 - -4 -5 -6 Relative survival 1/10 8/20 24/30 19/20 / 10 9 / 10/10 0/10 2/10 8/10 Experiment 2. Similarly, the efficacy of the new compounds against Salmonella typhimurium infections in chickens was assessed. The experiment was carried out on 1-day-old chicks weighing approximately 33 g each. Due to the size of the dose, the chick was divided into groups of 5. Part of the chicks received the test compound, as a suspension in 0.2 ml of polyethylene glycol 200, by subcutaneous injection in the neck. The control group did not receive the compound. All hatchlings were forbidden with a 1: 200 bacterial culture by injection of 0.1 ml intramuscularly into the leg of each hatchling. The hatchling was followed for 6 days, and the number of deaths in the control group was compared with the number of deaths in the hatchlings that received the test compound. The results of the tests are summarized in Table II. In Table II, column 1 lists the test compound, column 2 lists the dose of the test compound in mg / kg, and column 3 lists the relative survival. Table II Compound 3 Dose mg / kg 60 and 7.5 Relative survival 7 / 15 U / 25 6/15 0/10 Experiment 3. The sensitivity of anaerobic bacteria, both gram-positive and gram-negative, to a representative number of new compounds was determined, using the agar dilution method. The bacteria were isolated from patients undergoing treatment at the Medical Center of the University of Indiana. The isolated bacteria were found in the anaerobic laboratory of the Medical Center using criteria developed by Dowell et al., Laboratory Methods in Anaerobic Bacteriology, Public Health Serv, Publ. No. 1803 (1968) {Center for Disease Control, Atlanta, Ca.]; and by Smith et al., The Pathogenic Anaerobic Baeteria, pp. 96-136 (1968) (Charles C. Thomas, Publisher, Springfield, III). All microorganisms were stored in a glucose environment with chopped meat ( Scott Laba) at room temperature. The method used in the agar-dilution tests was based on a study by Sutter and 59 Antimicrob contributors. Ag. Chemother. 3, 188-193 (1973). The breeds of anaerobic bacteria. cultured in 16 × 120 mm tubes for 16-18 hours in a non-135C thioglycolate environment (Becton, Dickinson and Co.), to which 5 µg of hemin per 1 ml was added before autoclaving and 1 mg of bicarbonate after autoclaving sodium and 0.1 µg menadione sterilized by the filter. The growth tubes for the bacteria Veillonella alcalescens were provided with 5 mg of 60 sodium lactate per milliliter. The bacterial strains were scaled according to a McFarland No. 1 standard in a non-135C thioglycan environment containing an additional 0.13% Bacto-agar (Difco). Each strain of u 65 was then placed on the surface of a Peel W 40 0 40 45 50 55 6096 864 plate (100 × 15 mm in size) with a replicator. A 2-fold dilution of the compounds to be tested was prepared for the agar dilution studies. of demineralised water to which was then added hemolyzed sheep blood and filter-sterilized menadione, such that the concentrations after agar dilution were 5% and 10 µg / ml, respectively. An equal volume of double strength Brucella agar (Beckton, Dickinson and Co.) was added to each dilution in a water bath maintained at 50 ° C and then poured into petri dishes. All operations were performed inside a plastic chamber. glove, except for the incubation of the growth tubes and pouring out onto the plates. After hardening, the plates were placed in the glove chamber for at least two hours before inoculation. The glove box operations were primarily conducted according to Aranka et al., Applied Microbiology, 17, 568-576 (1969), but with the following changes. The dry materials were introduced into the glove chamber by emptying it to a 71 cm column of mercury and filling it with nitrogen, and then by emptying it in the same way and filling it with a mixture of 80% nitrogen, 10% CO2 and 10% hydrogen. Liquids and agar plates were introduced into the glove compartment. The path of emptying serves up to a 25 cm mercury column and is filled four times with gas. Nitrogen was used for the filling after the first two emptyings, while the two final fills were filled with the gas mixture described above. All plates were incubated at 37 ° C in Gas Pak jars (Becton, Dickinson and Co. ) containing palladium-coated aluminum catalysts (reactivated after each use). The results of the agar dilution tests were read approximately 24 hours after the start of the incubation. The lowest concentration of the test compound at which no bacterial growth was observed was taken as the minimum growth inhibitory concentration (MIC). The results of these in vitro tests are summarized in Tables III and IV, and the test compounds were determined in the same manner as in the previous experiments. For comparative purposes, parallel trials were conducted with cephalic and erythromycin antibiotics and the results are included in Tables III and IV. Examples I and II show the synthesis of starting compounds. Example I. Synthesis of 1-methyl-5-nitroimidazolyl-2 -carboxaldehyde. A solution of 5 g (0.0394 mol) of dimethyl sulfate in 10 ml of benzene is added dropwise to a solution of 5 g (0.0394 mol) of 2-methyl-5-nitroimidazole in 100 ml of boiling benzene, and then the whole is heated under the cold. ¬ feedback overnight. The reaction mixture is then cooled and a solution of 6 g of potassium carbonate in 6 ml of water is dropped thereto. The whole thing is mixed for 1 hour and sucked. After separating the organic and aqueous phases in the filtrate, the aqueous part is washed twice with 50 ml of benzene each. The benzene extract is combined with the original organic layer and dried over anhydrous magnesium sulfate. After the desiccant was filtered off, the filtrate was concentrated in vacuo to give a product, mp about 135-138 ° C, which was identified as 1,2-dimethyl-5-nitroimidazole. The product weight was 4 g. In a 10 liter round bottom flask equipped with a mechanical stirrer, reflux condensers and dropping funnel, 705 g (5.0 moles) of 1,2-dimethyl-5-nitroimidazole and 3.75 liters of absolute ethanol were placed. then it was stirred until it was completely dissolved. To the solution thus prepared, 685 g (6.5 moles) of benzaldehyde were quickly added. 150 g of sodium dissolved in 2.5 liters of methanol were then rapidly added to the mixture, the addition being carried out at room temperature. The mixture was stirred and heated to approximately 70 ° C for approximately 90 minutes. After reaching the temperature of 40 ° C, the color of the solution changed to a dark brown - Test compound 3 erythromycin cephalotin every 1 3 o G co O ^ C every <0.125 1.0 2 Table III Sensitivity of isolated anaerobic bacteria Minimal concentration inhibiting growth after 24 hours (µg / ml) co S 2 ostridiu ocuum GS <0.125 128 8 ostridium rfringens 81. i — t Ci) O a <0.126 <0.5 2 co Ii £ «-¦ ostridiu mosum UU <0.125 <128 8 00 CM £ 2 ostridiu pticum U co <0.125 1.0 1.0 m bovine ostridiu pticum urn kns 1235 ibacteri orofacie O w 'W cd <0.125 <0.5 4 <0.125 1.0 2 us s 1428 ptococc aerobiu & 3 <0.125 1.0 2 ptococcus us 1264 ptostre] termedi PL, .5 1.0 8 1.0 acterium opionib nes 44 PL (Cd 0.5 <0.5 211 96 804 Table IV 12 Test compound 3 erythrnicin Mcephalatin 6 2 actei C3 c- o Propi <acnes <0.126 <0.5 1.0 Sensitivity of the isolated anaerobic bacteria Minimum growth-inhibitory concentration, after hours (ng / ml) i 'Sb cd es fr gilis 2 2 u Bacte lis sp. 1877 <0.125 4 128,' W cd es fr gilis 2 2 U Bacte lis sp 1936B <0.125 4 128 «fH U) cd, co • fi .2 3 w« SH u. oi Bacte lis sp taomi <0.125 4 64 i • r4 & D cd co es fr Igatu 2 * ou Bacte lis sp. 1563 <0.125 2 8 j 'Sb cd co 2 so »-i Bacte lis sp. 1211 <0.125 2 4 24 q ^ r «» icterium • sum 14 'co o Fusob symbi <0.125 <0.5 64 8 ^ .2 S ou - * - O 8 -S Cd rv Fusob necro] 13859 <0.125 2 <0.5 cd 22 3 § 2 in G CO Veillo alcale <0.125 1 <0.5 word. After 90 minutes had elapsed, the reaction mixture was cooled by immersing the reaction vessel for 90 minutes in an ice-water bath. A precipitate formed which was separated from the brown mixture. The crystalline product was washed 4 times with a 1: 1: 1 mixture of ice, water and ethanol, using 1 liter of the mixture. The product was air dried at 100 ° C and identified as 1-methyl-5-nitro-2-styrylimidazole. It had a melting point of about 191-192 ° C, weight 582 g. In a three-necked 5-liter round bottom flask equipped with a stirrer and a gas injection tube, a solution of 454 g (2.0 mol) of 1-methyl-5-nitro was prepared. 2-styrylimidazole in a mixture of 2.5 liters of methanol, 1.5 liters of dichloromethane and 200 ml of water. The flask was kept at room temperature with a water bath. A mixture of ozone and oxygen (3% / © 03 in 1.1 liters per minute) was passed through the solution. The formation of the bed was controlled at certain intervals by gas-liquid chromatography and thin-layer chromatography. The total duration of ozonolysis was about 25 hours and after this time the color of the solution turned to a light yellow. A solution of 594 g of sodium iodide in 2 liters of water and 400 ml of acetic acid was mixed in a round 10 liter flask which was relatively dry. The ozonolysis solution was quickly poured in, keeping the temperature below 40 ° C by means of an ice-water bath. After stirring for about 10 minutes, sodium metabisulphite solution (192 g in two liters of water * ") was added to remove free iodine and restore the yellow color of the solution. The mixture was then stirred for about 1 hour and then filtered thoroughly. discarding yellow crystals. The slurry was concentrated under vacuum to about 1/3 volume and neutralized to a pH value of 6.5 by adding, with stirring, solid sodium bicarbonate, in an amount of about 300 g. The mixture was extracted with 4 portions of 700 ml. ethyl acetate, and the combined extracts were dried over anhydrous magnesium sulfate for about half an hour. After the desiccant had been filtered off, the filtrate was evaporated under reduced pressure to give a sticky residue. The residue was dissolved in about 2.5 liters of n-hexane and the solution was heated. under the reflux condenser for about 15 minutes, and the remains of the brown solid material were removed by siphoning. After cooling, the yellow 3i crystals precipitated from the filtrate, which was drained and dried under vacuum at 40 ° C. The screen was reused by heating the above-mentioned brown residual material under a reflux condenser and carrying out four such extractions. Thus, a total of about 146 g of product melting at about 81 ° -83 ° C. was obtained, which was identified as 1-methyl-5-nitroimidazole-2-carboxaldehyde. Synthesis of 5-amino-1-methyl-3- (1- 40-methyl-5-nitro-2-imidazolyl) pyrazole-4-carbonitrile Mixture 23.5 g (0.152 mol) 1-methyl-5-nitro - imidazolyl-2-carboxaldehyde and 7.0 g (0.152 moles) of methylhydrazine in 300 ml of chloroform are heated under reflux for about 2 hours, after which the reaction mixture is evaporated to dryness, giving about 25.5 light yellow solids . A small sample of this substance, after recrystallization from ethanol, had a melting point of about 175 ° C and was identified as 1-methyl-5-nitroimidazolyl-2-carboxaldehyde methylhydrazone. For a mixed solution of 23.5 g (0.128 mol) 1-methyl-5-nitroimidazolyl-2-carboxaldehyde tylohydrazone in 200 ml of chloroform was slowly added at room temperature 22.9 g (0.128 mol) of N-bromosuccinimide. The reaction was slightly isothermal and the temperature of the solution was kept below 30 ° C. by occasional external cooling. After stirring for about 2 hours, the chloroform was removed under vacuum and the residue was extracted with 5 portions of 100 ml. Hot carbon tetrachloride. The insoluble residue was removed and the combined carbon tetrachloride extracts concentrated to give a pale yellow solid which was identified as 1-methyl-5-nitroimidazolyl-2-carbonyl bromide methylhydrazone in a yield of 31.0 g. Thin layer chromatography. It regretted that the compound was almost pure. As the compound was unstable and had tearing and blistering properties, it was used immediately in the next stage of the synthesis. Bromohydrazone thus obtained, in an amount of 31.0 g (0.118 mol), was suspended in 250 ml of anhydrous methanol and 7.80 g (0.118 mol) of freshly pre-stretch malonic acid nitrile were added. While maintaining a temperature of about 10-20 ° C., a solution of 12 g (0.118 mol) of triethylamine in 25 ml of methanol was added dropwise to the reaction mixture. The reaction was slightly exothermic. The initial yellow suspension dissolved and in its place another suspension was formed after about 1-2 hours. The reaction mixture was then filtered and the solid was collected, washed with methanol followed by water and dried. This product weighed about 23 g, had a melting point above 300 ° C and was identified as 5-amino-1-methyl-3- (1-methyl-5-nitro-2-imidazolyl) pyrazole-4. carbonitrile. After isolation, the product was analytically pure. Example III. Synthesis of 5-amino-1-methyl-3- (1-methyl-5-nitro-2-imidazolyl) pyrazole-4-carbonamide. To a mixture of 3 ml of concentrated sulfuric acid and 2 ml of absolute ethanol was added 1.0 g 5-amino-1-methyl-3- (1-methyl-5-nitro-2-imidazolyl) pyrazole-4-carbonitrile and then heated on a steam bath for about 1 hour. After this time, 10 ml of water was added to the mixture and it was left to stand overnight at ambient temperature. A precipitate was filtered off and recrystallized from commercial absolute ethanol to give a solid product, mp 255-256 ° C. This product was identified from the NMR spectrum as 5-amino-1-methyl-3- (1-methyl-5-nitro-2-imidazolyl) pyrazole-4-cairamamide. PL