Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania fruktozy z glikozy na drodze enzymatycznej. Fruk¬ toza jest okolo dwukrotnie slodszym izomerem gli¬ kozy. Poniewaz ten sam stopien slodkosci daje ilosc fruktozy równa okolo polowie ilosci glikozy, fruk¬ toza jest szczególnie uzyteczna w przypadkach, wy¬ magajacych slodzenia przy minimalnym wkladzie kalorii.Znane jest, ze glikoze mozna czesciowo zizome- ryzowac do fruktozy przez podgrzewanie roztworu glikozy w obecnosci katalizatora alkalicznego lub przez poddanie roztworu glikozy katalitycznemu dzialaniu pewnych enzymów. Enzymy, które moz¬ na stosowac pochodza z róznych organizmów, ale ze wzgledu na ich zdolnosc katalizowania procesu izomeryzacji glikozy do fruktozy nazywane sa po¬ wszechnie izomeraza glikozy, bez wzgledu na po¬ chodzenie. Izomeraza glikozy odnosi sie do które¬ gokolwiek z tych enzymów.Alkaliczna izomeryzacja glikozy do fruktozy nie dawala zadowalajacych wyników ze wzgledu na to, ze nieselektywne katalizatory alkaliczne maja ten¬ dencje do wytwarzania niekorzystnych produktów ubocznych, które trudno usunac. Naleza do nich rózne zwiazki barwne i produkty kwasowe, których usuniecie wymaga dodatkowego procesu.Niektóre niedogodnosci, towarzyszace izomeryzacji alkalicznej, zostaly usuniete dzieki niedawnemu od¬ kryciu, ze w procesie izomeryzacji glikozy mozna stosowac w srodowisku alkalicznym subtelnie roz¬ drobniony tlenek glinowy, co przedstawia opis pa¬ tentowy St. Zjedn. Amer. nr 3 431253. Stwierdzono, ze stosujac tlenek glinowy o bardzo rozwinietej powierzchni w srodowisku alkalicznym o wartosci pH7 mozna uniknac powstawania produktów u- bocznych. Kolejna korzysc, wynikajaca z zastoso¬ wania czastek stalego tlenku glinowego jest ta, ze mozna latwo usunac go z mieszaniny reakcyjnej i uzyc ponownie.Stosowanie subtelnie rozdrobnionego tlenku gli¬ nowego jako katalizatora wymaga jednak stosun¬ kowo dlugiego czasu obecnosci glikozy, co unie¬ mozliwia bardziej ekonomiczna reakcje ciagla lub przeplywowa. Ponadto ze wzgledu na przypuszczal¬ nie istniejaca równowage miedzy glikoza i frukto¬ za optymalna przemiana glikozy w fruktoze jest bardzo ograniczona, w warunkach reakcji typu o- kresowego, opisanej w powyzszym opisie paten¬ towym.Ze wzgledu na ograniczenia, zwiazane ze znanymi metodami izomeryzacji alkalicznej, zwrócono uwa¬ ge na metody izomeryzacji enzymatycznej. Enzy¬ matyczna przemiana glikozy w fruktoze wymaga jedynie inkubowania roztworu, zawierajacego gli¬ koze z izomeraza glikozy w warunkach, umozliwia¬ jacych izomeryzacje takich, jak odpowiednia tem¬ peratura, pH, rózne dodatki itp. Poniewaz izome¬ raza glikozy posiada bardzo specyficzne dzialanie 9297192971 3 w typie reakcji, jaka wywoluje, czyli izomeryzacji oraz ze wzgledu na nadzwyczaj wysoka zdolnosc katalityczna enzymów, zastosowanie izomerazy gli- kozy bylo badane przez wielu specjalistów w celu znalezienia ekonomicznego sposobu wytwarzania fruktozy na drodze enzymatycznej.Jedno z najwczesniejszych ujawnien, opisujacych enzymatyczna izomeryzacje glikozy, mozna znalezc w opisie patentowym St. Zjedn. Amer. nr 2 950 228.Stwierdzono, ze produkt nawet wysoce specyficznej izomeryzacji enzymatycznej moze w niektórych przypadkach nadal zawierac równe niepozadane barwniki. Jedna z metod unikniecia lub przynaj¬ mniej ograniczenia do minimum powstawania ta¬ kich zwiazków przedstawia opis patentowy St.Zjedn. Amer, nr 3 623 953, gdzie ujawniono, ze do¬ danie róznych soli siarczynowych do roztworu izo- meryzacyjnego ogrinicza tworzenie sie barwników i równoczesnie zwieksza stabilnosc izomerazy gli¬ kozy. • Stosowanie enzymów na duza skale jest jednak ograniczone glównie z powodu wysokich kosztów enzymów, które, bedac rozpuszczalne w wodzie, sa trudne do usuniecia po wykorzystaniu, wiec moga byc uzyte tylko raz i czesto sa czescia skladowa produktu koncowego ze wzgledu na koszty zwiazane z ich usunieciem.W ostatnich latach opracowano technike „unie¬ ruchamiania" czy tez „nierozpuszczania" róznych enzymów przez adsorbowanie lub chemiczne przy¬ laczenie ich do nierozpuszczalnych z zasady nosni¬ ków, co umozliwia latwe usuniecie powstalych w rezultacie ukladów enzymatycznych. Enzymy la¬ czono z substancjami organicznymi takimi, jak róz¬ ne pochodne celulozy, kulki poliaminopolistyreno- we itp. oraz z róznymi substancjami nieorganiczny¬ mi takimi, jak porowate szklo i kserozele krze¬ mionkowe. W wielu przypadkach preferuje sie nos¬ niki nieorganiczne nad organiczne ze wzgledu na ich wieksza sztywnosc, napecznienie i stabilnosc cieplna.Metody adsorbowania enzymów na róznych no¬ snikach krzemionkowych mozna znalezc w opisie patentowym St. Zjedn. Amer. nr 3556945, a meto¬ dy chemicznego polaczenia enzymów z nosnikami nieorganicznymi w opisie patentowym St. Zjedn.Amer. nr 3519538. Mimo ze adsorbowanie enzy¬ mów na nosnikach nieorganicznych ma rózne za¬ lety, ma tez wady, które przeszkadzaja w stoso¬ waniu tego procesu w przemysle. Na przyklad przy¬ gotowanie nosnika krzemionkowego takiego, jak porowate szklo, jest zwykle kosztowne. Ponadto porowate szklo podobnie, jak kserozele krzemion¬ kowe, nie jest odporne na alkalia, co jest ko¬ nieczne w dlugotrwalym procesie z zastosowaniem enzymu takiego, jak izomeraza glikozy, która posia¬ da alkaliczne optimum pH. Dlatego wlozono wiele wysilku w znalezieniu lepszego nosnika dla izo¬ merazy glikozy, który mialby korzystne cechy nos¬ ników nieorganicznych, a równoczesnie byl po¬ zbawiony charakterystycznych dla nich wad.Sposób wytwarzania fruktozy polega na inkubo- waniu roztworu, zawierajacego glikoze z unieru¬ chomionym ukladem enzymatycznym, zawieraja¬ cym izomeraze glikozy, zaadsorbowana w porach tlenku glinowego o przecietnej srednicy porów 100—1000 A. Porowaty nosnik z tlenku glinowego korzystnie posiada czastki o uziarnieniu 0,177—0,71 mm wedlug normy St. Zjedn. Amer, a uklad en¬ zymatyczny, zawierajacy czastki porowatego tlenku glinowego, korzystnie jest umieszczony w kolumnie przeplywowej, przez która przepuszcza sie ciagle roztwór glikozy *w warunkach izomeryzacji. Od¬ powiednia temperatura inkubowanda wynosi 50°C— 70°C. Reakcja przebiega dobrze w obecnosci róz¬ nych mieszanin buforowych, korzystnie iw zakresie pH =7,2—8,2,, przy czym szczególnie korzystna war- tosc pH wynosi 7,4—7,8. Poniewaz nosnik sklada sie z porowatego tlenku glinowego', otrzymany u- klad enzymatyczny wykazuje bardzo dobra od¬ pornosc na alkalia w zakresie wartosci pH, w któ¬ rym zwiazana izo'meraza glikozy wykazuje optiimoim aktywnosci.W sposobie wytwarzania fruktozy bardzo istotna role odgrywa porowaty nosnik z tlenku glinowego, stosowany dla izomerazy glikozy. Nosnik musi miec przecietna srednice porów 100—1000A, umozliwiajaca maksymalne zaadsorbowanie enzymu. Dolna granica 100A okreslona jest najwiekszym rozmdairem cza¬ steczka izomerazy glikozy jest wydluzona. Tak wiec blizeniu 100 A. Przecietny wymiar porów musi wy¬ nosic przynajmniej 100 A, aby umozliwic wejscie so czasteczki w pory i imasowa dyfuzje enzymu glebo¬ ko w porowata siec przed koncowym zaadsorbo- waniem na wewnetrznej powierzchni nosnika. Cza¬ steczka izomerazy glikozy jest wydluzona. Tak wiec stosujac nosnik z tlenku glinowego o srednicy po- rów, równej przynajmniej najwiekszemu wymiarowi czasteczki — 100 A, zapewnimy jej wejscie w pory.Pozwala to na wykorzystanie w duzym stopniu po¬ wierzchni wewnetrznej do adsorbowania enzymu.Z kilku powodów wazne jest, by przecietna wiel- 40 kosc pora nosnika z tlenku glinowego nie prze¬ kraczala 1000 A. Jesli przecietna wielkosc pora nosnika nieorganicznego przekracza 1Ó00A, zmniej¬ sza sie powierzchnia adsorpcyjna oraz adsorbowanie enzymu. Ponadto, jesli przecietny rozmiar porów 45 przekracza 1000 A, sztywna struktura wewnetrzna porów mniej chroni enzym przed wplywami oto¬ czenia, co powoduje oderwanie sie enzymu. Gdyby na przyklad unieruchomiony uklad enzymatyczny umiescic w kolumnie przeplywowej, spadek cisnie- 50 nia w kolumnie stanowic bedzie jeden z takich gwaltownych czynników, powodujacych odrywanie enzymu, zaadsorbowanego w porach nosnika o prze¬ cietnej srednicy wiekszej, niz 1000 A.Poniewaz w procesie adsorpcji konieczna jest 55 wzglednie duza powierzchnia, na przyklad wieksza niz 5 m2/g i poniewaz konieczna jest ochrona zaad¬ sorbowanego enzymu przed czynnikami zewnetrzny¬ mi, przecietna srednica porów nosnika z tlenku gli¬ nowego nie powinna byc wieksza, niz 1000 A. Naj- 60 bardziej korzystny przecietny rozmiar porów nosni¬ ka z tlenku glinowego wynosi 140—-220 A. Wlasci¬ wosci fizyczne takiego nosnika opisano bardziej szczególowo ponizej.Po przygotowaniu lub otrzymaniu porowatego 65 tlenku glinowego o przecietnej srednicy pora 100—5 92971 1000 A moze okazac sie konieczne, sproszkowanie go do pozadanego uziarnienia, które bedzie odpowied¬ nie dla nosnika, stosowanego do unieruchomienia izomerazy glikozy. Kiedy uklad enzymatyczny u- mieszcza sie w kolumnie cylindrycznej, przez któ¬ ra przeplywa ciagle roztwór glikozy, najbardziej odpowiednia wielkosc czastek nosnika wynosi 0,074—4,76 mm wedlug znormalizowanego sita a- merykanskiego. Czastki wieksze, niz 4,76 mm, wy¬ magaja wiecej czasu na dyfuzje enzymu przed zwiazaniem, dluzszego czasu przechowania substra¬ tu, utrudniaja jego dyfuzje oraz powoduja, ze prze¬ miana jest nieekonomiczna. Z drugiej strony, jesli wielkosc czastki nosnika jest mniejsza, niz 0,074 mm, trudno poslugiwac sie ukladem i utrzymac go w kolumnie, a poniewaz w konsekwencji nastepuje ciasniejsze zaladowanie kolumny, wynikiem jest nie¬ pozadanie duzy spadek cisnienia w kolumnie, co zwykle wymaga dodatkowego wyposazenia^ Naj¬ bardziej korzystna wielkosc czastki nosnika wyno¬ si 0,177—0,71 mm i nosniki o takiej przecietnej wielkosci czastek stosuje sie w opisanych nizej do¬ swiadczeniach.Po sproszkowaniu i przesianiu porowatego tlenku glinowego do otrzymania czastkopózadanej wielkos¬ ci sa one uwadniane i wstepnie przygotowane przy pomocy odpowiedniego buforu lub soli. Korzystne dla nosnika z tlenku glinowego jest uwodnienie przy pH o wartosci 7,0. Nastepnie usuwa sie mie¬ szanine buforowa, znajdujaca sie na zewnatrz po¬ rów, ale porowate substancje z tlenku glinowego pozostaja mokre przed adsorpcja. Do zwilzonego nosnika dodaje sie roztwór izomerazy glikozy o ta¬ kim stezeniu na jednostke masy porowatego nosni¬ ka z tlenku glinowego, które umozliwia optymalna adsorpcje izomerazy glikozy.Proces adsorpcji ulatwia sie przez mieszanie, cyr¬ kulacje, odwracanie, uzycie reaktora fluidyzacyjne¬ go, zawierajacego nosnik, albo pnych znanych spo¬ sobów, odpowiednich do wytworzenia srodowiska pobudzonego, powodujacego masowa dyfuzje 'en¬ zymu przez pory. Czas optymalnej adsorpcji zalezy od rozmiaru czastek nosnika, wielkosci enzymu, znajdujacego sie naprzeciw pora o przecietnej sred¬ nicy i od innych czynników takich, jak temperatu¬ ra i pH, ale powinien on wynosic przynajmniej 0,5 godziny. Stwierdzono, ze okres od 1,5—5 lub 6 go¬ dzin jest wystarczajacy do uzyskania maksymalnej adsorpcji izomerazy glikozy w porach tlenku gli¬ nowego o przecietnej srednicy 175 A. Adsorpcja przebiega dobrze w zakresie wartosci pH 6,9—9,0, korzystnie przy pH=7;i—6,5. Pozostale po adsorpcji enzymy usuwa sie przez plukanie ukladu w wodzie, roztworze soli np. 0,5 NaCl, lub w innych srodkach pluczacych, które nie maja szkodliwego wplywu na nosnik, czy przylaczony enzym.W praktyce uklad enzymatyczny moze byc u- mieszczony w kolumnie, reaktorze zbiornikowym z ciaglym mieszaniem, reaktorze fluidyzacyjnym, czy innym naczyniu, do którego lub przez które wprowadza sie roztwór substratu w celu inkubo¬ wania. Podane nizej przyklady przedstawiaja uklad, zawierajacy izomeraze glikozy oraz nosnik, umiesz¬ czony w kolumnach, przez które przeplywa roztwór glikozy w warunkach inkubowania.Ze wzgledów ekonomicznych korzystny jest pro- ces ciagly, a odpowiednim urzadzeniem jest ko¬ lumna z regulowanym przeplywem. Kolumna mo¬ ze byc oslonieta plaszczem wodnym w celu utrzy¬ mania optymalnej temperatury inkubowania i/lub temperatury, w której pólokres aktywnosci enzy- mu jest maksymalny. Temperatura inkubowania 50°C—70°C, korzystnie 60°C, nie tylko zapewnia efektywna inwersje glikozy do fruktozy, lecz takze dopuszcza dlugi pólokres aktywnosci enzymatycz¬ nego ukladu. Korzystnie roztwór substratu zawiera przynajmniej 45% wagowych glikozy.Zakres pH inkubowania i stosowany bufor za- \ lezy od ukladu enzymatycznego i warunków reakcji.Dla opisanego wyzej enzymatycznego ukladu reak- cja przebiega dobrze przy pH o wartosci 7,2—8,2, szczególnie korzystnie przy pH=7,4—7,8. Wybór buforu zalezy od stopnia kwasowosci roztworu substratu, spowodowanej przez sam roztwór i/lub od obecnosci róznych aktywnych jonów, które mo¬ ga byc dodane do substratu, oraz od srodowiska wewnatrz porów. Na przyklad podczas inkubowania 50*/o roztworu glikozy z ukladem, zawierajacym izomeraze glikozy, niewielka ilosc jonów kobaltu i magnezu moze byc dodana do substratu przed do¬ prowadzeniem do zetkniecia z ukladem enzyma¬ tycznym. Odczyn tych jondw mozna usunac przez dodanie soli siarczynowych, które zarazem zwieksza¬ ja stabilnosc ukladu. Mieszaniny buforowe, stoso¬ wane w przypadku izomerazy glikozy, sa znane i moga byc latwo okreslone przez fachowców.W podanych nizej przykladach do wytwarzania enzymatycznego ukladu stosuje sie izomeraze gli¬ kozy, pochodzaca z dwóch róznych zródel, a nastep¬ nie porównuje sie wyniki, dotyczace okresu stabil- 40 nosci i pólokresu aktywnosci. Uklady bada sie w standardowych warunkach w reaktorze o dziala¬ niu okresowym. Wyniki podaje sie w miedzynaro¬ dowych jednostkach izomerazy glikozy IGIU, gdzie IGIU jest iloscia enzymu, potrzebna do przeksztal- 45 cenia 1 ^mola glikozy do fruktozy/minute w tem¬ peraturze 60°C i przy pH o wartosci 6,85. Nosnik i uklad sporzadza sie nizej opisanym sposobem, o- kreslajac równoczesnie okres stabilizacji i pólokres aktywnosci ukladu. Doswiadczenia prowadzi sie w 50 celu porównania skutecznosci ukladu z innymi, za¬ wierajacymi izomeraze glikozy chemicznie zwiazana z nieorganicznym nosnikiem. W celu okreslenia wplywu na proces izomeryzacji samego nosnika z tlenku glinowego, przeprowadzono dodatkowe do- 55 swiadczenia.Korzystny nosnik, zastosowany w podanych przy¬ kladach, posiada nastepujace wlasnosci, sredni wy¬ miar porów 175 A, minimalny rozmiar porów 140 A, maksymalny rozmiar porów — 220 A, powierzch- 60 nia 100 m2/g, objetosc porów 0,6 cmtyg, porowatosc 62,5*/o, uziaTnienie 0,25—0,71 mm. Rozklad wielkos¬ ci porów okreslono powszechnie stosowanymi me¬ todami i stwierdzono, ze jest bardzo bliski prze¬ cietnemu wymiarowi porów np. 90°/o w obrebie 65 ±26°/o o wielkosci 175A.7 92971 8 Przyklad I. W procesie adsorpcji stosuje sie surowy preparat izomerazy glikozy, zawierajacy o- kolo 444 IGIU/g, pochodzacy z organizmu Strepto- myces. Okolo 5 gram preparatu izomerazy glikozy .dodaje sie do 28,7 ml roztworu octanu magnezo¬ wego o stezeniu 0,1 mola, znajdujacego sie w 50 ml zlewce.Zawiesine miesza sie przez 25 minut w tempera¬ turze pokojowej, a nastepnie saczy przez bibule fil¬ tracyjna. Pozostalosc na saczku splukuje sie 14,3 ml octanu magnezowego o stezeniu 0,1 mi 4,3 ml NaHC03 o stezeniu 0,5 m. Popluczyny zbiera sie bezposrednio na oryginalny filtr enzymatyczny. Cal¬ kowita objetosc roztworu (przesaczu) po przeplu¬ kaniu wynosi 50 ml. 500 mg porowatego tlenku glinowego umieszcza sie w 50 ml kolbie okraglodennej. Do kolby do¬ daje sie nastepnie 10 ml roztworu izomerazy gli¬ kozy. Kolbev przytwierdza sie do obrotowego apa¬ ratu wyparnego. W wyparce wytwarza sie próz¬ nie, a kolbe obraca sie na lazni w temperaturze —45°C przez 25 minut. Nastepnie do kolby do¬ daje sie kolejne 10 ml roztworu izomerazy glikozy, a odparowanie kontynuuje sie przez nastepne 35 minut w tych samych warunkach. Dodawanie roz¬ tworu i odparowywanie prowadzi sie przez 4 go¬ dziny w tych samych warunkach. Proces ten po¬ wtarza sie jeszcze dwukrotnie z oddzielnymi 10 ml.roztworu izomerazy glikozy. Do kolby dodaje sie nastepnie ostatnie 7 ml roztworu izomerazy gli¬ kozy i kontynuuje sie odparowywanie przez go¬ dzine i 10 minut w temperaturze 45°C. Kolbe z za¬ wartoscia wyjmuje sie z aparatu wyparnego i u- mieszcza sie w chlodnym pokoju na okres 2 dni.Do tlenku glinowego dodaje sie 47 ml roztworu izomerazy glikozy.Do enzymatycznego ukladu dodaje sie 50 ml roz¬ tworu buforowego (0,01 m maleinianu sodowego o wartosci pH = 6,8—6,9, zawierajacego 0,001 m chlorku kobaltu i 0,005 m siarczanu magnezowego) i W ciagu nastepnej godziny pobiera sie próbke w temperaturze pokojowej. Próbke o objetosci 50 ml zachowuje sie do analizy. Uklad plucze sie nastep¬ nie 200 ml wody, a potem 10 ml chlorku sodowego o stezeniu 0,5 m. Koncowe plukanie 50 ml wody prowadzi sie na lejku ze spiekanego szkla. Uklad przenosi sie nastepnie do 50 ml kolby Erlenmeye- ra i przechowuje w roztworze buforowym w tem¬ peraturze pokojowej, dokonujac okresowych analiz calej próbki w ciagu 106 dni.Wyniki: Analiza 50 ml próbki — 39,8 IGIU/ml (aktyw¬ nosc enzymatyczna^ w próbce — 90%) Analiza ukladu enzymatycznego — 130 IGIU/500 mg próbke (aktywnosc enzymatyczna ukladu — 6%) Przecietna wartosc adsorpcji — 260 IGIU/g W celu oznaczenia trwalosci przechowywania próbki w ciagu 106 dni przeprowadzono 21 okre¬ sowych analiz, z których 16 analiz tej samej prób¬ ki wykazalo aktywnosc 100—150 IGIU/500 mg lub 200—300 IGIU/g.Przyklad II. W celu okreslenia okresu sta¬ bilnosci i pólokresu aktywnosci enzymatycznego ukladu przygotowuje sie nastepna próbke, umiesz¬ czona w kolumnie przeplywowej, przez która prze¬ plywa roztwór, zawierajacy glikoze w warunkach przemyslowych.Opisany powyzej nosnik z tlenku glinowego o sredniej wielkosci porów 175 A, i uziarnieniu 0,25—0,71 mm poddaje sie nastepujacej obróbce. 11 g porowatego tlenku glinowego umieszcza sie w 100 ml szklanym cylindrze z doszlifowanym kor¬ kiem, do którego nastepnie dodaje sie 100 ml oc¬ tanu . magnezowego o stezeniu 0,05 m, octanu ko¬ baltowego o stezeniu 0,01 m, pH ¦ = 7,5. Cylinder zamyka sie, a zawartosc delikatnie miesza przez odwracanie i nastepnie umieszcza sie na lazni w temperaturze 60°C. Po 15 minutach" cylinder od¬ wraca sie, a plyn dekantuje. Do cylindra dodaje sie 100 ml swiezego octanu magnezowego i kobaltowe¬ go, cylinder odwraca sie i pozostawia w tempera¬ turze pokojowej przez 2,5 godziny.Surowy roztwór izomerazy glikozy z opisanego wyzej zródla, zawierajacy 590 IGIU/ml w nasyco¬ nym siarczanie amonowym o stezeniu 0,6 m oczysz¬ cza sie i poddaje reakcji z tlenkiem glinowym.Do 40 ml roztworu izomerazy glikozy w zlewce dodaje sie 1,4 g siarczanu amonowego w celu wy¬ tracenia enzymu, mieszajac zawiesine w temperatu¬ rze pokojowej przez 20 minut. Nastepnie próbke wiruje sie z szybkoscia 16000 obrotów na minute w temperaturze 2°C przez 30 minut. Plyn sklaro¬ wany nad osadem wylewa sie. Do osadu dodaje sie 12 ml roztworu octanu magnezowego i kobaltowego, miesza sie, a nastepnie do roztworu enzymatycz¬ nego dodaje sie 3 ml wodoroweglanu sodowego o stezeniu 0,5 m i miesza sie w celu rozpuszczenia enzymu. Roztwór umieszcza sie na lazni wodnej w temperaturze 60°C na 15 minut. Po usunieciu z lazni roztwór wiruje sie przez 15 minut z szyb¬ koscia 16000 obrotów na minute w temperaturze 2°C. Czysty, sklarowany nad osadem roztwór en¬ zymatyczny zlewa sie, a osad odrzuca. Stwierdzo¬ no, ze roztwór enzymatyczny o objetosci 28 ml ma pH o wartosci 7,5. Jesli w czasie oczyszczania nie nastapilo obnizenie aktywnosci, roztwór ten powi¬ nien zawierac 23600 IGIU.Roztwór octanu magnezowo-kobaltowego oddzie¬ la sie od porowatego tlenku glinowego przez od¬ wrócenie. Do porowatego tlenku glinowego umie¬ szczonego w cylindrze dodaje sie 28 ml roztworu enzymatycznego. Cylinder zatyka sie korkiem, a zawartosc miesza przez odwracanie cylindra i u- mieszcza sie go na lazni wodnej w temperaturze 60°C. Doprowadza sie do reakcji enzymu z poro¬ watym tlenkiem glinowym (11 g) w czasie 2 go¬ dzin 30 minut w temperaturze 60°C. W tym cza¬ sie cylinder odwraca sie co 15 minut. Po usunie¬ ciu z lazni o temperaturze 60°C reakcja przebiega dalej w temperaturze pokojowej, przy czym cy¬ linder odwraca sie co 30 minut przez nastepne 2 godziny. Reakcje kontynuuje sie przez noc w tem¬ peraturze pokojowej juz bez odwracania cylindra.Roztwór enzymatyczny o objetosci 28,5 ml i pH o wartosci 7,1 zlewa sie i zachowuje do analizy.Uklad enzymatyczny plucze sie 60 ml wody desty¬ lowanej, 40 ml roztworu chlorku sodowego o ste- 40 45 50 55 60a 92971 zeniu 0,5 m i 40 ml roztworu octanu magnezowego i kobaltowego. Trzy próbki w ilosci 1 g pobiera sie z porcji w celu dokonania analizy. Pozostale g umieszzca sie w kolumnie termostatowanej w 60°C. Do kolumny wprowadza sie roztwór, za¬ wierajacy 50% glikozy i siarczan magnezowy o stezeniu 0,005 m buforowany siarczynem sodowym do pH o wartosci 7,7—8,0. W czasie pierwszych 26 godzin do kolumny wprowadza sie chlorek kobal¬ towy o stezeniu 0,001 m. Po 26 godzinach nie wpro¬ wadza sie juz kobaltu i jedynym srodkiem akty¬ wujacym w pozostalym czasie pracy kolumny sa jony magnezu. Poczatkowa szybkosc przeplywu w kolumnie wynosi w przyblizeniu 190 ml/godzine.Ilosc wytwarzanej fruktozy utrzymuje sie w gra¬ nicach 80—85% ilosci teoretycznej, zmniejszajac szybkosc przeplywu w róznych odstepach czasu.Kolumna dziala w przyblizeniu 31 dni. Po tym czasie ze wzgledu na brak doprowadzania sub¬ stratu, kolumna wyschla calkowicie i pozostala su¬ cha przez okolo 15 godzin. Przyblizona wartosc pól- okresu aktywnosci ukladu enzymatycznego otrzy¬ muje sie przez obliczenie ilosci zebranego produ¬ ktu i przemiane produktu w naczyniu zbieraja¬ cym. Stwierdzono, ze planowany pólokres aktyw¬ nosci ukladu wynosi okolo-42 dni.Analiza ukladu przed 'uzyciem go wykazala zdol¬ nosc adsorpcyjna 381 IGItT/g. Stanowi to 17,8% aktywnosci calosci IGIU poddanych dzialaniu nos¬ nika. Analiza reakcyjnego roztworu enzymatycz¬ nego w ilosci 28,5 ml wykazala 161 IGIU/ml, a ak¬ tywnosc w reakcyjnym roztworze enzymatycznym wynosila okolo 19,4%. Wartosc pH w kolumnie utrzymywana byla w granicach 7,4—7,8 przez od¬ powiednie regulowanie pH substratu. Calkowite za¬ ladowanie kolumny wynosilo 3810 IGIU.Przyklad III—X. W celu okreslenia wplywu róznych buforów na pólokres aktywnosci ukladu przeprowadza sie badania w 8 kolumnach. W kaz¬ dym przypadku izomeraza glikozy adsorbowana by¬ la na porowatym tlenku glinowym, o przecietnej wielkosci porów 175 A i uziarnieniem 0,25—0,71 mm. Uzyte enzymy pochodzily z dwóch zródel. W przykladach III i IV podobnie, jak w przykladach I i II, stosuje sie roztwór izomerazy glikozy, po¬ chodzacej z organizmów Streptomyces (zródlo A).W przykladach V—X.stosuje sie inny roztwór izo¬ merazy glikozy, zawierajacy 1000 IGIU/ml, pocho¬ dzacy z innego organizmu Streptomyces (zródlo B).Proces adsorpcji prowadzi sie wedlug sposobu, opi¬ sanego w przykladzie II.W kazdej kolumnie umieszcza sie 10 g ukladu en¬ zymatycznego. 50% roztwór glikozy ze wskazany¬ mi buforami przepuszcza sie przez kazda kolumne z zaznaczeniem poczatkowej predkosci przeplywu, przy czym szybkosc przeplywu reguluje sie okre¬ sowo tak, aby otrzymac okolo 84% stopien prze¬ miany (przy teoretycznym 100%, luib koncowym produkcie glikoza^fruktoza 50—50). 84% przemiane prowadzi sie przy zmniejszaniu szybkosci przeply¬ wu. Wszystkie roztwory substratu i kolumny termo¬ statuje sie w 60°C utrzymujac stala wartosc pH = 7,8. Ilosc enzymu w kazdej kolumnie w IGIU/g u-. kladu podano w wartosciach srednich przy górnej i dolnej granicy tolerancji, wynoszacej 95%.W kazdym przykladzie podano wydajnosc adsor¬ pcji enzymu przez nosnik, przy czym wydajnosc adsorpcyjna odnosi sie do stosunku w procentach IGIU zaadsorbowanych na calkowitej ilosci nosni¬ ka do poczatkowej liczby IGIU, uzytych w proce¬ sie adsorpcji.Uzyskane wyniki ilustruje tablica 1.Przyklad XI. Pólokres aktywnossi enzyma¬ tycznego ukladu z przykladów II—X jest dluzszy od pólokresu aktywnosci ukladu, skladajacego sie z izomerazy glikozy, polaczonej chemicznie z po¬ rowatym nosnikiem z powlekanego szkla, stoso¬ wanym w podobnych warunkach. Polaczona che¬ micznie izomeraze glikozy przygotowuje sie zgod¬ nie z danymi ujawnionymi w zgloszeniu patento¬ wym St. Zjedn. Ameryki na 227205 zatytulowanym „Ulepszone nosniki enzymatyczne". Nosnikiem jest porowate szklo pokryte dwutlenkiem cyrkonu, do którego przylaczono chemicznie enzym ze zródla A. Uklad poddano amidzie w reaktorze o dzialaniu okresowym w standardowych warunkach i stwier¬ dzono, ze /posiada aktywnosc 1068 IGIU/g. Anali¬ zowanym roztworem byla glikoza o stezeniu 2 im, zawierajaca 0,02 m MgS04 ti 0,001 im CoCl2.Kolumna, zawierajaca 10 g (wagi suchej) powyz¬ szego, chemicznie polaczonego ukladu enzymatycz¬ nego, dzialala przez 18 dni w temperaturze 60°C.Przez kolumne przepuszcza sie 50% roztwór gliko¬ zy o stalej szybkosci przeplywu 124—131 ml/godz.Aktywnosc kolumny w danym okresie czasu oblicza sie doswiadczalnie przez porównanie ilosci wytwo¬ rzonej fruktozy w procentach przy danej szybkos¬ ci podawania substratu w specyficznych warun¬ kach kolumny w odniesieniu do aktywnosci, mie¬ rzonej Procent fruktozy mierzy sie automatycznym pola¬ rymetrem Bendixa 12 razy w okresie od 3—431 go¬ dzin, notujac spadek aktywnosci ukladu z 934 do 473 IGIU/g. Stwierdzono, ze szacunkowy pólokres aktywnosci wynosi 16,6 dnia z zakresem toleran¬ cji 95 od 14,8—18,8 dnia. W okresie pierwszych 24 godzin substrat skladal sie z roztworu zawieraja¬ cego 50% wagowych glikozy oraz 0,005 m MgS04, 0,004 m Na^O, i 0,001 m CoCl2, przy pH o wartosci 7,8, w nastepnym okresie czasu sklad substratu zmieniono przez wyeliminowanie CoCl2 przy rów¬ noczesnym utrzymaniu innych skladników na po¬ przednim poziomie.Z powyzszego porównania widoczne sa korzysci stosowania ukladu, zawierajacego izomeraze gliko¬ zy, zaadsorbowana na porowatym tlenku glino¬ wym, poniewaz poza dluzszym pólokresem aktyw¬ nosci przygotowanie ukladu, zawierajacego zaad¬ sorbowana izomeraze glikozy, jest znacznie tansze ze wzgledu na nizszy koszt substancji nosnych.Przyklad XII. Przeprowadzono badania w ce¬ lu okreslenia wplywu samego tlenku glinowego na proces przemiany glikozy w fruktoze, poniewaz z opisu pantetowego St. Zjedn. Ameryki nr 3 431253 wiadomo jest, ze granulki tlenku glinowego moga byc stosowane w tyim procesie. W badaniach tych 40 45. 50 55 6092971 11 12 Tablica 1 lad N U Oh 1 III IV V VI | VII VIII IX X Zródlo enzymu 2 A A B B B B B B Ilosc enzymu w wartosc dolna 3 554 510 164 176 179 372 268 i 372 wartosc srednia 4 573 563 206 192 204 407 398 407 IGIU/g wartosc górna 591 616 248 209 229 441 528 441 Wydajnosc adsorpcji w °/o 6 76,5 70,8 36,5 32,3 39,9 49,2 49,2 Substraty dodatkowe w molach 7 0,004 MgS04 0,001 CoCl2 0,004 Na2SOs 0,005 MgCl2 0,001 CoCl2 0,004 NH4HCQS 0,005 MgCl2 0,001 CoCl2 0,004 NazSOg 0,005 MgCl2 0,001 CoCl2 0,004 NH4HCOs 0,005 MgCl2 0,004 NH4HCOs Co++ O' « O o o o 0,005 MgCl2 0,004 NH4HCO3 Co++ liii Poczatko¬ wa pred¬ kosc prze¬ plywu w ml/godz. 8 122 122 45 38 48 74 74 36 Pólokres aktyw¬ nosci w dniach 9 49,0 | 23,0 47,0 17,0 18,0 38,0 23,0 • 20,0 stosuje sie tlenek glinowy z przykladów II—X. W kolumnie umieszcza sie 11 g porowatego tlenku gli¬ nowego potraktowanego 0,05 m octanem magnezo¬ wym i octanem kobaltowym o stezeniu 0,01 m w temperaturze 60°C przez 15 minut, powtarzajac zabieg, majacy na celu przygotowanie nosnika przed adsorbcja.Porowaty tlenek glinowy umieszcza sie w kolu¬ mnie termostatowej w 60°C. Roztwór, zawierajacy 0,005 m MgS04, 0,004 m Na2S08, 0,001 m OoCl2 i 50% wagowych glikozy przy pH o wartosci 7,8, prze¬ puszcza sie przez kolumne ze stala predkoscia prze¬ plywu okolo 45 ml/godz. Uklad, zawierajacy zaad- sorbowana izomeraze glikozy, analizowany przy 227 IGIU/g w identycznych warunkach, dawal 84°/o te¬ oretycznej przemiany glikozy w fruktoze. Próbke wycieku z kolumny, zawierajaca tylko tlenek gli¬ nowy, pobiera sie codzienne i oznacza polarymetry¬ cznie w celu okreslenia w procentach przemiany glikozy w fruktoze przy uzyciu roztworu substratu do nastawienia przyrzadu na zero. Kontroluje sie równiez wartosc pH produktu. Uzyskane wyniki ilustruje tablica 2.W celu okreslenia przemiany w °/o, spowodowa- Tablica 2 Dzien Pierwszy Drugi Trzeci Czwarty Predkosc przeplywu w ml/godz. 43,8 47,0 47,0 47,0 Teoretycz¬ ny e/o fruktozy 4,8 0,0 0,0 0,0 PH produktu ,4 6,4 , 7,5 1 7,5 nej podgrzewaniem wsadu uruchomiono nastepna kolumne w 60°C o szybkosci przeplywu 45 ml/godz., 55 nie zawierajaca tlenku glinowego ani enzymatycz¬ nego ukladu. Stwierdzono, ze przemiana wynosi 0,5°/© a pH produktu 7,45. Z powyzszych przykla¬ dów wynika, ze sam tlenek glinowy ewentualnie powoduje nieznaczna przemiane glikozy w frukto- 60 ze. Alkaliczna izomeryzacja glikozy do fruktozy przy uzyciu rozrobnionego lub porowatego tlenku glinowego wymagalaby wiec znacznie dluzszego cza¬ su dla zaistnienia odpowiedniej przemiany.Sposób przemiany glikozy w fruktoze z zastoso- 65 .waniem unieruchomionego ukladu, zawierajacego13 92971 14 izomeraze glikozy jest bardzo wydajny i mozna go stosowac na duza skale.Podane przyklady ilustruja siposób wedlug wy¬ nalazku. PL