PL91662B1 - - Google Patents

Description

Opis patentowy opublikowano: 30.12.1977 91662 MKP C12d 9/04 Int. Cl.2 C12D 9/04 Twórca wynalazku: Uprawniony z patentu: Eli Lilly and Company, Indianapolis (Stany Zje¬ dnoczone Ameryki) Sposób wytwarzania mieszaniny nowych antybiotyków A-25822 oraz jej poszczególnych skladników A, B, D, H, L, M i N Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania mie¬ szaniny linowych antybiotyków A-25822 oraz jej poszczególnych skladników. Antybiotyki te oaleza do grupy wielopierscieniowych zwiazków zawiera¬ jacych atomazotu. 5 Posizczególne zwiazki z tej (grupy zostaly ozna¬ czone oprócz symbolu A-25822 symbolami A, B, D, H, L, M i N.

Sposób wytwarzania mieszaniny inowych anty¬ biotyków A-25822, .oraz jej poszczególnych sklad- io mików A, B, D, H, L, M i Ni ich soli addycyj¬ nych z kwasami, polega ma tym, ze prowadzi sie hodowle mowego szczepu Geotrichumi flava-brum- fneum NRRL 3862 ma podlozu, zawierajacym przy¬ swajalne zródla wegla, lazotu i soli tnieorgaoicz- 15 mych w warumkach napowietrzanej fermentacji (glebinowej i otrzymana imieszanine antybiotyków /izoluje sie i ewentualnie rozdziela sie poszczególne skladniki lub przeprowadza w sól albo jedmo i dru¬ gie, lub skladnik A korzystnie przeprowadza sie w 20 pochodna octanowa.

Antybiotyki A-25822 wytwarza sie metoda gle¬ binowej, napowietrzanej fermentacji mowego szcze¬ pu Geotrichuim flavo-bruiirmeujm, prowadzonej az do chwili uzyskania znacznej aktywnosci lanitybiotycz- 25 mej. Antybiotyki A-25822 wydziela sie z brzeczki fermentacyjnej przez ekstrakcje do rozpuszczal¬ nika organicznego, a nastepnie po alkalicznym przemyciu organicznego roztworu, reekstrakcje antybiotyków A-25822 do wodnego roztworu kwa- 50 su mineralnego. Kwasmy ekstrakt lalkaiizuje sie i czesc lantybiotyków o aktywnosci wiekszej prze- ekstrahowuje sie do rozpuszczalnika weglowodoro¬ wego, a nastepnie czesc o mniejszej 'aktywnosci antybiotycznej do polarnego rozpuszczalnika orga¬ nicznego. Ekstrakty 'organiczne laczy sie i odparo¬ wuje rozpuszczalnik, uzyskujac surowa mieszanine antybiotyków A-25822.

Pojedyncze skladniki mieszaniny A-25822 wy¬ dziela sie, stosujac metode chromatografii /kolum¬ nowej, cienkowarstwowej, gazowej oraz metode krystalizacji.

Antybiotyki A-25822 wykazuja dzialanie hamu- jaice ma drobnoustroje, wywolujace zakazenie u zwierzat i roslin, i sa iszozególnie icenne ze wzgie- idu ma dzialanie przeciwgrzybowe in vitro' i .fin vivo wobec takich szczepów, jak np.: Candiidia sp. i Oryptocoocus sp.

Absorpcje w podczerwieni poszczególnych sklad¬ ników mieszaniny A-25822 przedstawiono ma ry¬ sunku, gdzie fig 1 dotyczy skladnika A; fig. 2 —*¦ skladnika B; fig. 3 — skladnika D; fig. 4 —- sklad¬ nika H; fig. 5 — skladnika L; fig. 6 — skladni¬ ka M; fig. 7 — skladnika N.

Na podstawie analizy wlasciwosci chemicznych i fizycznych oraz analizy spektralnej laotybiotyfcorn A-25822 zostala przypisania struktura azasteroddów.

Kazdy ze skladników A-25822 /zawiera w swojej czasteczce jeden zasadowy atom azotu.-?.£* Poszczególne skladniki mieszaniny antybiotyków 91662M662 otrzymuje sie równoczesnie w procesie fermentacji w postaci mieszaniny, a nastepnie wydziela sie je w sposób opisany powyzej.

Miesizanjinia antybiotyków A-25822 jest olejem o barwie zóltej, rozpuszczalnym w wiekszosci paspo- 5 litych rozpuszczalników organicznych i praktycz¬ nie nie rozpuszczalnych w wodzie. Zarówno mie¬ szanina, jak i poszczególne skladniki sa trwale w slabo kwasnych roztworach wodnych w ciagu sze¬ regumiesiecy. 10 Charakterystyka poszczególnych skladników mie¬ szaniny A-25822^ , ¦ * Skladnik A jest krystaliczna substancja p barwie bialej i temperaturze topnienia 147°C (bezbarwne plytki z acetondtrylu). Masa czasteczkowa, oznaczo- 15 na metoda spektrografi masowej, wynosi 439. Wy¬ liczony wzór sumaryczny — C30H49NO. Analiza * elementarna wykazala fprocentowa zawartosc we¬ gla 82,17%, wodoru 11,31%, azotu — 3,38%, Skrecalnosc wlasciwa, loznaczonia w metanolu, wy¬ nosi [ elektrometryczine, wykonane w 68% dwumetylo- formamidzie (DMF), wykazalo obecnosc jednej grupy miareczkujacej sie o wartosci pKa 8,45.

Widmo w podczerwieni, wykonane w chloroformie, przedstawione na fig. 1, wylkazuje nastepujace maksima absorpcji, wyrazone w mikronach: 2,79, 3,0, 3,26, 3,42, 3.48, 6,10, 6,17, 6,87, 6,95, 7,29, 7,42, 7,62, 7,75, 8,68, 9,19, 9,37, 9,80, 9,96. 10,31, 10,73, %Q i 10,87. Skladnik A wykazuje w" ultrafiolecie w obojetnym i zasadowym etanolowym roztworze absorpcje przy >. mx 293 mjji.

Skladnik' B mieszaniny A-25822 jest ikrystaliczna mibstancja o barwie bialej i temperaturze topnie- 35 nia okolo 115—118°C (igly z mieszaniny aceton- helksan). Chlorowodorek skladnika B, otrzymany. podczas przepuszczania suchego chlorowodoru przez eterowy roztwór tego skladnika i odsaczenie wy¬ dzielonego osadu, itopnieje w (temperaturze 128— 49 141°C. Wzór sumaryczny — C28H45NO. Masa cza¬ steczkowa, wyznaczona metoda spektrografii ma¬ sowej, wynosi 411. Miareczkowanie elek/trome- tryczne wykonane w 66*/o wodnym roztworze dwu- metyloformamidu, wykazalo obecnosc jednej gru- 45 py miareczkujacej sie o wartosci pKa 8,5.

Analiza elementarna wykazala procentowa za¬ wartosc wegla — 81,47%; wodoru — 10,91% i azo¬ tu 3,21%.

Skrecalnosc wlasciwa [a]|j = —16,7° (C = 0,775, 5° MeOH). Widmo w podczerwieni wykonane w chlo¬ roformie, przedstawione ma fig. 2, wykazuje na¬ stepujace charakterystyczne maksima absorpcji: 2,78, 2,92, 3,12, 3,27^ 3,40, 3,48, 6,1 (silne), 6,15, 6,73, 6,93, 7,1, 7,27, 7,96, 8,63, 8,86, 9,17, 9,30, 9,53, 9,72, 55 9,81, 9,95, 10,15, 10,44, 10,76, 10,94, 11,23 i 11,78 mi-1 kronów.

Podobnie, jak skladnik A, skladnik B wylkazuje absorpcje w nadfiolecie przy x max 239 my. (iroz- 60 twór obojetny) i przy % max 279 im^i w srodowisku kwasnym. , Skladnik D mieszaniny A-25822 jest bezposta¬ ciowa substancja o barwie bialej, i temperaturze topnienia okolo 51—55°C, i masie czasteczkowej, &s oznaczonej metoda spektrografii masowej, 427.

Wzór sumaryczny — C28H45NO2.

Miareczkowanie elektrometryczne wykazuj e- istnienie jednej' miareczkujacej sie grupy o war¬ tosci pKa 7,7.

Analiza elementarna skladnika D wykazuje pro¬ centowa zawartosc wegla — 78,40%, wodoru — ,28% i azotu 3,17%. Skrecalnosc wlasciwa wynosi [a]g = + 39° (C = 0,725, MeOH). Widmo w pod- czerwieniu, przedstawione na fig. 3, wykazuje na¬ stepujace maksima absorpcji przy dlugosci fali: 2,97, 3,43, 3,50, 3,7 (szerofkie), 5,97, 6,04, 6,09, 6,15r 6,82, 6,93, 7,28, 7,34, 7,42, 7,7, 7,94, 8,1, 8,34, 8,6, 8,87, 9,10, 9,18,9,35, 9,61, 9,77, 10,29, 10,4, 10,76, 10,92 ii 11,32 mikronów.

Widmo w? nadfiolecie skladnika D, wykonane w etanolu, wykazuje \ max 235 mp. (roztwór obojetny) i 270 nip w srodowisku kwasnym.

Skladnik H jest bezpostaciowa substancja o bar¬ wie bialej, masie czasteczkowe}, oznaczanej me¬ toda spektrografii masowej, 425 i temperaturze topnienia cikolo 74—77°C. . Wzór sumaryczny — C28H43NO2.

Miareczkowanie elektrometryczne skladnika H w 66% dwumetylofarmamidzie wykazuje istnienie jednej miareczkujacej sie grupy o pKa 6,9.

Skrecalnosc wlasciwa [a]^ = +15° (C = 0,147, MeOH). Jak pokazano na fig. 4, skladnik H wy¬ kazuje charakterystyczne maksima absorpcji w podczerwieni przy nastepujacych dlugosciach fal: 3,40, 3,50, 6,20, 6,60, 6,90, 7,20, 8,35, 9,35, 9,70, 10,40, ,85 i 11,25 mikronów.

W swietle nadfioletowym sikladnik H wykazuje miaksimum absorpcji w roztworze obojetnym i za¬ sadowym przy X max 235 m^i i A max 270 mpi w srodowisku kwasnym.

Skladnik L mieszaniny A-25822 jest bezposta¬ ciowa substancja o barwie zóltej, masie czastecz¬ kowej 425, oznaczonej metoda spektografii maso¬ wej. Wzór sumaryczny C28H43NO2. Analiza elemen- tarina wykazuje nastepujacy siklad skladnika L: wegiel 78,68%, wodór — 9/74%, azot — 3,00%.

Miareczkowanie elektromagnetyczne, wykonane w 66% dwoimeftyloformamidzie, wykazuje istnienie jednej miareczkujacej sie grupy o pKa 4,75.

Widimo w pódczerwieniLu, wykonane, w chlorofor¬ mie, wykazuje nastepujace charakterystyczne ma¬ ksima absorpcji: 2,80, 2,93, 3,40, 3,50, 6,0 6,10, 6,19, 6,32, 6,84, 6,89, 7,29, 7,36, 7,44, 7,66, 7,79, 7,95, 8,04; 8,18, 8,40, 8,74, 8,88, 9,18, 9,37, 10,41, 10,75, 10,90, 11,28 i 11,85 mikronów.

Widmo w nadfiolecie wytaazuje maksimum ab¬ sorpcji przy X max 262 m^ w roztworach obojet¬ nych i zasadowych, i przy X max 279 m^ w roz¬ tworze kwasnym. Skrecalnosc wlasciwa -[a] D =^ + 75° (C = 0,072, Met)H).

Skladnik M mieszaniny A-25822 jest pólkrysta- liozna substancja o barwie zóltej i temperaturze topnienia 140°C. Masa czasteczkowa, oznaczona me¬ toda spektografii masowej, wynosi 452.

Wzór sumaryczny okreslono jako — C30H47NO2.

Analiza elementarna wykazala nastepujacy sklad procentowy pierwiastków: wegiel — 78,04%, wo¬ dór — 10,83%, azot — 3,07%.91692 Sfcrecalnosc wlasciwa skladnika M wynosi [a] D = —15° (C = 0,021, MeOH).

Miareczkowanie elektirometryczne tego skladni¬ ka w 66*/o dwurnetyloformamidzie wykazalo istnie¬ nie jednej grupy miareczkujacej sie o pKa 7,9.

Widmo w podczerwieni (fig. 6) skladnika M, wy¬ konane w chloroformie ,wyfcazuje charakterystycz- ne maksima absorpcji pnzy: 3,45, 3,52, 5,82, 6,20, 3,84, 6,90, 7,0, 7,30, 7,38, 8,2—8,35, 9,21, 9,36, 9,60, 9,77, 9,80, 10,20, 10,60 i 11,28 mikronów.

Skladnik M wykazuje absorpcje w nadfiolecie przy A. max 239 rni^ w roztworach obojetnych d za¬ sadowych. W roztworiach kwasnych \ max jest przesunieta i wynosi 279 nifi.

Skladnik N grupy antybiotyków A-25822 jest toystaliozna substancja o barwie bialej, topniejaca w temperaturze okolo 165°C. Masa czasteczkowa, oznaczona na podstawie 'spektrografii masowej, wy¬ nosi 409, a wyliczony wzór sumaryczny - C28H43NO.

Analiza elementarna skladnika N wykazuje na¬ stepujaca zawartosc pierwiastków: wegiel — 82,09°/o, wodór — 10,58% i azot — 3,42%.

Skrecalnosc wlasciwa [a] ^ = —14° (C = 0,05 MeOH).

'Miareczkowanie elektrometryczoe skladnika N W 68°/o dwumetylofoimaimidzie wykazuje istnienie jednej' grupy miareczkujacej sie o pKa 7,45.

Jak pokazano na' fig. 7, widmo w podczerwieni skladnikia N, wykonane w chloroformie, wykazuje charakterystyczne maksima absorpcja przy: 3,40, 3,50, 5,88, 6,3€, 6,85, 7,28, 8,15—8,38, 9,35 i 11,25 mi¬ kronów.

W nadfiolecie skladnik N* wykazuje maksimum przy A. max 240 m^i w srodowisku obojetnym i za¬ sadowym, przesuniete w srodowisku kwasnym do wartosci 280 my.

Ustalono strukture skladnika A, pochodnych oc¬ tanowych skladników A, B i M (pochodna octano¬ wa skladnika B) i przedstawiono we wzorze ogól¬ nym 1, w (którym Ri i'R2 oznaczaja równoczesnie atomy wodoru lub grupy metylowe, a R3 oznacza grupe hydroksylowi lub acetoksylowa.

Gdy Ri i R2 oznaczaja równoczesnie latamy wo¬ doru, a R3 grupe hydroksylowa wzór ogólny 1 przedstawia skladnik B. Skladnik M przedstawiony jest wziorem ogólnym 1, w którym Ri i R2 ozima- cziaja równoczesnie atomy wodoru, a R3 oznacza grupe acetoksylowa. Gdy Ri i R2 ozniacziaja rów- nioczesnie grupy metylowe, a R3 oznacza hydroksy¬ lowa, wzór ogólny 1 przedstawia skladnik A. Po¬ chodna octanowa skladnika A (Ri = R2 = grupa metylowa, R3 — grupa acetoksylowa (wytwarza sie synrtetycznie ze skladnika A, poddajac go re¬ akcji z bezwodnikiem octowym w pirydynie. Rów¬ niez skladnik M mozna otrzymac na drodze syn¬ tezy, poddajac reakcji z bezwodnikiem octowym w pirydynie skladnik B.

We wzorze ogólnym 1 wiazanie pomiedzy ato¬ mami ,zaznaczone poziomymi 'kreseczkami ,'oznaicza- ja konfiguracje, podczas gdy wiazania dwóch am- giularnych (naroznych) grup metylowych i grupy hydroksylowej lub ocetoksylowej zaznaczone linia¬ mi ciaglymi loznaczaja konfiguracje (3. 50 55 Niazwy systorartyczne antybiotyków A-25822 zo¬ staly utworzone zgodnie z ogókiie przyjeta nomen¬ klatura zwiazków stereidowych. Sposób numero¬ wania poszczególnych pozycji jest przedstawiona we wzorze ogólnym 2. Skladnik A ^- 30-hydiroksy- -24-metyleno-14a-aza-D-homo-4,4-dwumet ylo-5a- -oholestdien-8(9), 14(14a). Pochodna octanowa sklad¬ nika A — 30-acetoksy-24-mert;yleno-14aHaza-D-ho- mo-4,4-dwumetylo-5a-chotles Skladnik B i jego pochodna octanowa M nosza nazwy: 3(3-hydroksy-24-metyleno-14a-aza-D-hoimo- -5a-cholestdien-8{9), 14(14a) i 30-acetoksy-24-mety~ leno^l4a-aza-D-homo-5a-choiestdien-8(9)-, . 14(14a).

Skladnik N jest 3-keto-24-metyleno-14a-aza^D-bo- mo-5a-choleBtddenem-8(9), 14(14a).

Strukture skladników mieszaniny A-25822 A, B, M i N ustalono na podstawie badanna ich wlasci¬ wosci fizycznych i chemicznych oraz na podstawie widm magnetycznego rezonansu jadrowego i widm w podczerwieni, i potwierdzono krystalograficzna analiza rentgenowska.

Struktura ¦pozostalych skladników A-25822 (D, L i H) nie zostala jeszaze ustalona, jakkolwiek dla skladników D i L. zostala wstepnie zapropo¬ nowana. Skladnik D, zawierajacy dwie grupy hy¬ droksylowe ,odpo(wiadalby podstawionemu w pozy¬ cji 15 grupa hydroksylowa skladnikowi B czyli bylby 3,15Hdwuhydroksy-24-metyleno-14a-aza-D- -homo^5aHcholestdienem-8<9), 14{14a). Skladnik L odpowiadalby 15-keto pochodnej skladnika B, czy¬ li 3 P-hydroksy-»15keto-24-metyleno-14a-aza-D-ho- mo-5a^cholesitdienowi-8(9), 14<14a). Struktury sklad¬ nika H jeszcze nie ustalono.

Antybiotyki A-25822 stosuje sie w postaci wolnej zasady lub w postaci nietoksycznych, dopuszczal¬ nych w farmacji soli addycyjnych.

Wolne zasady antybiotyków A-25822 tworza lat¬ wo addycyjne sole z kwasami mineralnymi takimi, jak kwasy chloro i bromowodorowy, siarkowy i fosforowy oraz z kwasami kargoksylowymi talka¬ mi, jakoctowy, proipionibwy, cytrynowy, maleinowy benzoesowy, winowy, szczawiowy, bursztynowy, eekcrbinowy, jaflWtowy i podobne, oraz z kwasa¬ mi sulfonowymi takimi, Jak np. ¦benzenosulfonowy, p^toluenosulfonowy, metanosulfionowy, laurylosul- flonowy i inne.

Skladniki A-25822 reaguja z jodkiem metylu, dajac krystaliczne metylojodki.

Mieszanina A-25822, jak i poszczególne skladni¬ ki w postaci wolnych zasad nie rozpuszczaja sie praktycznie zupelnie w wodzie, sa natomiast roz- puszczailne w rozpuszczalnikach organicznych ta¬ kich, jiak dwumetyloformaimid, dwumetylosulfotle- nek, aceton ,octan etylu i izoamylu, metanol, eta¬ nol, cWoroforni i innych. Rozpuszczalnosc ich jest mniejsza w nizej .podanych polarnych rozpuszczal¬ nikach takich, jak benzen czy czterochlorek we¬ gla i najmniejsza w weglowodiarch parafinowych takich, jiak pentan, heksan i heptan.

Sole mieszaniny A-25822 i jej skladników sa do¬ brze rozpuszczalne w wodzie, jak na przyklad chlo¬ rowodorek lub siarcza;n skladnika B.

Skladnik B jako wolna zasiada jest substancja91662 8 poMmorficzna. Krystalizacja z róznych rozpusz¬ czalników prowadzi do uzyskiwania substancji o róznych temperaturach topnienia i róznych rent¬ genowskich obradach dyfrakcyjnych. Na przyklad krystalizacja wolnej zasady z n-heksanu 'prowadzi ja 56^58°C. Krystalizacja z pentanu prowadzi do uzyskania wolnej zasady o /temperaturze topnienia 42—44°C, natomiast z mieszaniny aceton-heksan 1,15—118°C.

Kazda z form krystalicznych wykazuje takie sa¬ me wyniki analizy elementarnej, miareczkowania i analizy spektralnej, a rózni sie jedynie tempe¬ ratura topnienia i analiza .rentgenograficzna. Ze wzgledu mia czynnosc optyczna skladników A-25822 wydaje sie, ze poliimorficznosc wykazywana przez skladnik B jest zwiazana ze zjawiskiem diastereoi- zomerii.

Wystepowanie ;skladnika B w wielu postaciach jest typowe dla wielu azasteraidów.

Skladniki A, B i L reaguja z bezwodnikiem oc¬ towym, diajac pochodne , jednooctanowe, natomiast skladnik D tworzy pochodna dwuoctanowa.

Mieszanina antybiotyków A-25822 ioraz poszcze¬ gólne skladniki hamuja wzrost mikroorganizmów, wywolujacych choroby u zwierzat i roslin. Mie¬ szanina A-25822, jak równiez jej (pojedyncze stad¬ niki sa szczególnie aktywne tin vivo i in vitro w stosunku do chorobotwórczych grzybów ii moga byc stosowane przy zwalczaniu chorób wywola¬ nych grzybami u zwierzat i ludzi.

Pochodna octanowa skladnika A, o wzorze poda¬ nym uprzednio (Ri = R2 = grupa metylowa — R3 ¦— grcujpa acetoksylowa), wytwarzana na drodze re¬ akcji z bezwodnikiem octowym w pirydynie, jest nieco mniej laktywna niz skladnik A. Podobnie pochodnia octanowa (skladnika B (skladnik M) jest nieco mniej laktywna iod skladnika B. Obie pochod¬ ne octanowe stosuje isiie w podobny sposób, jak wyjsciowe zwiazki hydroksylowe, w hamowaniu wzrostu grzybów.

Tablica I przedsitawda najmniejsze stezenie ha¬ mujace antybiotyków A-25822, oznaczone sitandar- dowa metoda plytkowa w stosunku do szeregu wy¬ branych szczepów mifc]x>organizmów.

Tablica I Aktywnosc przeciwbakteryjna antybiotyków A-25822 in vitro Drobnoustrój Staphylococcus aureus 3055 Streptococcus faecalis Klebsiella aerobacter KA 17 Pasteurella multocida Erwinia amylovora Xanthomonas phaseoli Candida tropicalis A 17 Trichophyton mentagrophytes Botrytis cinerea Fusarium oxysporum Yerticilhum albo-atrum Najmniejsze stezenie hamujace ! mcg/ml - 1 50 -¦¦!¦¦ 50 6,25 50 78 78 3,12 1,56 45 Wrazliwosc din vitro wybranych patogenmych grzybów na mieszanine A-25822 oraz na iposzcze- gólne (sikladniiki A, B i D oznacza sie metoda iroz- cienczen, stosujac pozywke Sabourauda. Silikono- wane szklane probówki, zawierajace podwójnie roz¬ cienczony antybiotyk w pozywce Sabourauda, dino- kuluje sie zawiesina, sporzadzona ze zhomogenizo- wanych grzybni. Iookulowane probówki inkubuje sie na obrotowej wsifcrzasarce przy 250 obrotach/ /minute. Wszystkie oznaczenia wykonuje sie wtedy, gdy w probówkach kontrolnych pozbawionych antybiotyku ,pojawi isie obfity wzrost. Najmniejsze stezenie hamujace wyznacza sie jako najmniejsze stezenie antybiotyku, hamujace w wyrazny sposób rozwój grzybów.

Probówki, nie zawierajace w pozywce antybio¬ tyku, inokuluje sie nastepnie z probówek, w któ¬ rych bylo najmniejsze stezenie, hamujace wzrost (grzybów, celem oznaczenia $awki letaJnej.

Tablica II pokazuje najmniejsze stezenie hamu¬ jace i najmniejsza dawke letalna mieszaniny A-25822 oraz skladników A, B i D w odniesieniu do wybranych grzybów chorobotwórczych.

Tablica II Aktywnosc przeciwgrzybowa antybiotyków A-25822 in vitro Oznaczenie brzeczki metoda rozcienczeniowa Antybiotyk A-25822 mieszanina Skladnik A Skladnik B Skladnik D Candida albicans Ar25 | Najmniejsz 1.25/2.5 1.25/40 | 0.625/20 I 10/40 Candida albicans A-26 | e stezenie han 2.5/5.0 2.5/40 2.5/40 /40 Cryptococcus neoformans lujace/najmniejsza 0.078/0.625 0.156/1.25 0.156/1.25 1.25/5 ' 1— Trichophyton mentagrophytes dawka letalna m 0.0156/0.0625 0.0019/1.0 0.0039/1.0 0.5/1.0 Trichophyton rubrum cg/ml ' 0.0156/0.0625 0.0019/0.5 0.0156/1.0 0.5/1.0 Mycosporum gypseum 0.0625/0.5 0.0156/1.0 0.0156/1.0 1.0/1.091662 W tablicy III pokazano aktywnosc przeciwgrzy- bowa in vitro skladników H, L, M a N. Badane wielkosci oznaczaja najmniejsze stezenie hamu¬ jace 'danego antybiotyku, wyrazone w mikrogra- muach na mdlllditir. atakujacych zewnetrznie powierzchinie przedmio¬ tów, na przyklad pomieszczenia do pryszniców, zewnetrzne powierzchnie drewniane, powierzchnie papieru i przedmiotów plastikowych itp., stosuje sie mieszanine antybiotyków w postaoi wolnych Tablica III Aktywnosc przeciwgrzybowa antybiotyków A-25822 in vitro Najmniejsze stezenie hamujace mcg/ml Skladnik A-25822 H L M N3 1) metoda plytkowa 2) metoda rozcienczen agaro 3) siarczan skladnika N Candida* albicans 0.625 0.625 1.0 2.5 wych Trichophyton1 mentagrophytes 0.156 0.156 0.25 0.312 Cryptococcus2 neoformans 2.5 .0 Blastomyces2 dermatitidis 0.625 0.625 .0 0.625 Histoplasm2 capsulatum 0.625 0.625 2.5 0.625 - Aktywnosc in vivo mieszaniny antybiotyków A-25822 oraz jego pojedynczych skladników ozna¬ czano na myszach, zakazonych C. albicans.

W tablicy IV przedstawiono aktywnosc in vivo mieszaniny A-25822 skladników A, B i D.' Wynikli, podane w tablicy, otrzymano na podstawie tesito- waniiia myszy, przeprowadzonego w nastepujacy sposób.

Grupe myszy po uprzednim napromieniowaniu dawka 400 r (rentgenów) zakazono przez podanie dozylnie komórek Candida albicans A26 1 X 106 komórek/mysz. Nastepnie po czasie -od 0 do 2 godzin podawano podskórnie oznaczany skladnik.

Przedluzenie czasu zycia myszy, której podano an¬ tybiotyk w stosunku do iczasu zycia myszy kon¬ trolnej, której nie podano antybiotyku, oznacza lafctywnosc iprzeciwgrzybowa.

Tablica IV przedstawia wyniki, uzyskane po po¬ dlaniu podskórnym (sic.) dawki antybiotyku, wyra¬ zonej w mg/kg wagi ciala. Czas przezycia podano w procentach w stosunku do czasu przezycia myszy kontrolnej. Brawa kolumna wskazuje LD50 (dawka smiertelna 50% testowanej grupy myszy), oznaiczio- na po czasie 7 dni, badana tylko dla dawki 50 mg/kg wagi ciala.

Skladniki A-25822 stosuje sie jako srodki prze- ciwgrzybowe w positaoi wolnej zasady lub nietok¬ sycznych, dopuszczalnych w farmacji soli z kwa¬ sami takimi, jiak kwas solny lub siarkowy. Sole fte ze wzgledu na latwa rozpuszczalnosc w wodzie sa korzystne podczas ich stosowania. Na przyklad moga byc isitosowane w postaci rozpylanych roz¬ tworów wodnych z dodatkiem srodka zwilzajacego do zwalczania isizkodliwych grzybów. Podobnie siole te mozna podawac przy zakazeniach grzybami do- otrzewnowo w positaoi izotonicznych roztworów.

W pewnych przypadkach mozna stosowac oczysz¬ czona mieszanine (antybiotyków A-25822 bez ko- -ndeoznosci rozdziellania i stosowania pojedynczych skladników. Na przyklad przy zwalczaniu grzybów, Tablica IV Aktywnosc przeciwgrzybowa in vivo antybiotyków A-25822 40 45 50 55 60 Skladnik antybiotyku l\ Mieszanina A-25822 Skladnik A Skladnik B Skladnik D Dawka mg/kg SC. 50 12,5 6,25 50 12.5 50 i 12,5 6,25 50 i Procent przezywalnosci w stosunku do myszy kontrolnej 32 105 71 63 46 75 58 16 106 16 23 | 64 9 LD50 1 mg/kg (po 7 dniach) 19,95 zasad lub irazipuiszczalnych w wodzie soli. ' Nato- imiast, .gdy zwalcza sie infekcje wewnatrz orga¬ nizmów zywych, pozadane jest stosowanie wyizo¬ lowanego, pojedynczego iskladnika, np. skladnika B.

Antybiotyki A-25822 stosuje sie równiez w.^zwal¬ czaniu infekcji, przypisywanych pasozytom skóry.

Na przyklad zaatakowana powierzchnie skóry .pod¬ daje sie, dzialaniu wodnego roztworu skladnika A-25822 o istezeniu wiekszym, niz najmniejsze ste¬ zenie, hamujace roztwój danego drobnipoistroju. Za¬ bieg ten przeprowadza sie, stosujac antybiotyk w postaci aerozolu lub plynu, lub isitpeujac przecie-91602 11 12 rannie chorej powierzchni skóry. Roztwory anty¬ biotyków A-25822 moga slyzyc do zapobiegania imprzestrzanujaridiu sie grzybic, na przyklad przaz stosowanie ich w miejscach mycia nóg na ply¬ walniach, w budynkach gospodarczych i uzytecz- nosoi publicznej.

Drobnoustrój, wytwarzajacy antybiotyki A-25822, zostal wyodirebniony metoda kolejnych rozcienczen z próbka gleby, pochodzacej z Grand Teton Niatio- nal Park z okolic Wyomiing. Drobnoustrój ten zo¬ stal taksonomicznie zidentyfikowany jako nawy szczep Geotrichum Flavobniinneum (Miller i wspól¬ pracownicy), oo opisano zigodnde z odpowiednimi przepisami.

Na ogól mowy szczep, produkujacy lamitybiotyki A-25822, jest .niepelnym grzybem, który tworzy grzybnie podzielona. Konadia, powstajace iprzy t>o- dziale grzybni, sa gruboscienne, krótkie, cylin¬ dryczne, przezroczyste, 9 scietych koncach.

Kolonie, wyhodowane na agarze ziemniaczano- dekisitryncwym, po inkubacja w temperaturze poko¬ jowej w ciagu 18 godzin, maja srednice, wynoszaca 7,8 cm. Powierzchnia kolonii ma barwe jasno-eze- koladowo-brazowa (6E tablica 13 w Maerz and Paul, A Dictionary ^of Oolor, 1950, Mc Graw-Hill, N.Y.). Kolonia wykazuje powolny wzrost, matowie¬ je i strzepki grzybni wzrastaja pasmowo. Grzybnia podstawowa mia barwe jasno-karmelowo-zlota i wytwarza pigment, dyffundujacy poprzez agar.

Kolonie, wyhodowane na agarzejkukurydzianym, sa cienkie, przewaznie glebinowe, bezbarwne, alDo o barwie jasnozóltej lub jasnobrazowej. Strzepki wegetatywne sa bezbarwne lub posiadaja jasna pigmentacje z wyraznymi .przegrodami.

Na podlozu, opisanym powyzej, powstaja dwa rodzaje komórek irotarodczych: 1) artrospory o wymiarach 4,0 — 9,0 X 2,2 — 4,0 (mikronów, sciete, gladkie o jasnym pigmencie, po¬ wstajace poprzez fragmentaoje pionowych strzep¬ ków grzybni powietrznej lub firagmenitacje strzep¬ ków pelzajacych lub obydwu rodzajów jednoczes¬ nie, polaczone w lancuchy nierózgalezione lub rzadko tworzace jedno lub dwa boczne odgalezie¬ nia, o najczesciej spotykanej dlugosci od 90 do 100 mikronów, 2) wlaczone chlamydospory: graboscienne, glad¬ kie, bezbarwne lub o jDarwie zóltawej, kuliste lub owalne, o wymiarach od 9X7 mikronów do 21 X 11 mikronów, o srednich wymianach 14 —16 X 9 — 11 mikronów.

Na podstawie wyzej opisanych badan taksono¬ micznych szczep, produkujacy lantybiotyki A-25822, sklasyfikowano jako nowy szczep Geotrichium flayo^brumneum (Miller, J.H. i wspólpracownicy Mycologia — 49, 779—808, (1957).

Opisywana hodowla w charakteryczny sposób wytwarza wiele dodatkowych chiamydosporów, o czym nie wspomina taksonomia, umieszczona w cytowanym odsylaczu, ale ragadza sie to pod kaz¬ dym wzgledem z taksonomia, publikowana dla tego gatunku.

Drobnoustrój, wytwarzajacy antybiotyk A-25822, pochodzil z kolekcji Agrfcultujral Research Service, Northern IKiliriatkm Research and Development Diyision, Department of Agricultuire, Peoria, Illi- nois, gdzie zostal zdeponowany bez ograniczen ko- frzystania z kolejnym numerem kolekcji NRRL* 3862.

Drobnoustrój, wytwarzajacy mieszanine arttybKK tyków A-25822 hoduje sie na jakimkolwiek podlo¬ zu, ziawieirajacym zródla energii, niezbedne dla roz¬ woju szczepu. Tak wiec w podlozu hodowlanym moga znajdowac sie róznorodne weglowodany, za¬ spokajajac zapotrzebowanie drobnoustroju na we- gjel, oraz rózne zródla 'azotu takie, jak aminokwa¬ sy a ekstrakty gorzelniane.

Ze wzgledu na ekoniomike wytwarzainiia, opty¬ malna wydajnosc oraz latwosc izolowania aoitybio- (tyków, pewne podloza sa bardziej korzystne. Np. jednym z bardziej korzystnych zródel weglowoda¬ nów jest melasa, chociaz mozna takze stosowac glukoze lub sacharoze. Korzystnymi zródlami azo¬ tu sa peptony, maczka sojowa, mieszanina amino¬ kwasów itp. Jak zwykle do podfcoza omawianej hodowli dodaje sie sole nieorganiczne, zawierajace jony sodowe, potasowe, amonowe, wapniowe, fos¬ foranowe, chlorkowe, weglanowe itp. Dla zapew¬ nienia wzrostu i rozwoju drobnoustrojów, wytwa¬ rzajacych antybiotyki A-25822, w podlozu hodo¬ wlanym musza znajdowac sie pewne pierwiastki w ilosciach sladowych. Te pierwiastki zwykle wy¬ stepuja jako zanieczyszczenia w innych skladni¬ kach podloza w ilosciach, wystarczajacych do osiagniecia ilosci, niezbednych dla wzrostu dro¬ bnoustroju.

Drobnoustrój, wytwarzajacy mieszanine antybio¬ tyków A-25822, moze wzrastac w róznych warun¬ kach. Np. bedzie wzrastac na róznych podlozach, w których wartosc poczatkowa pH zawiera sie w szerokich granicach. Jednak pozadana wartosc pH podloza, dla zapoczatkowaniia fermentacji miesci sie w granicach okolo 6—8 pomiedzy okolo 6—7.

Zwykle podczas wzrostu drobnoustroju pH podloza izwieksza sie stopniowo od wartosci poczatkowej do pH = 7,5 lub wyzej. Koncowa wartosc pH pod¬ loza zalezy przynajmniej w czesci od wieki czyn¬ ników takich, jak: poczatkowa wartosc pH podlo¬ za, bufory obecne w podlozu, oraz czasu wzrasta¬ nia drobnoustroju. 45 Drobnoustrój, wytwarzajacy mieszanine antybio¬ tyków A-25822, moze wzrastac w róznych typach podlozy, np. ma skosach agarowych, w wytrzasa¬ nych kolbach lub w tankach fermentacyjnych.

Sposobem wedlug wynalazku mieszanine anity- 50 biotyków A-25822 wytwarza sie w duzej sikali w warunkach napowietrznej fermentacji glebinowej.

Dla wytworzenia odpowiednio mniejszych ilosci mieszaniny antybiotyków A-25822, stosuje sie wy¬ trzasane kolby lub butle (hodowle powierzchniowe). 55 Podczas wytwarzania mieszaniny antybiotyków A-25822 metoda napowietrzanej fermentacji glebi¬ nowej, drobnoustrój poczatkowo wzrasta na -skosie agarowym, który nastepnie wprowadza sie do ino- fculum wegetatywnego. Otrzymane w ten sposób 60 inokulum wegetatywne (zabezpiecza szybki wzrost drobnoustroju w malej skali.

Imokulowame podloze wegetatywne pozwana otrzymac zdolna do zycia hodowle wzrastajacego drobnoustroju, która nastepnie uzywa sie do imo- 65 kulowaniia tanków. so 40ftlMS 13 14 Zastosowanie inokulm wegetatywnego jako po¬ sredniego stadium w wytwarzaniu mieszaniny antybiotyków jest korzystne w bezposredniej imo- kulacjd i w duzej skali tanku fermentacyjnego za¬ rodnikami, uzyskanymi ze skosów agarowycn.

Podloze fermentacyjne w tanku, dnokulowane przy uzyciu podloza wegetatywnego, daje szybszy wzrost drobnoustroju, niz w przypadku bezposred¬ niej imokulacji tanku skosami 'agarowymi. Tak szybki wzrost, uzyakany przy zastosowaniu ino- kulum wegetatywnego, jest bardzo pozadany, po¬ niewaz skraca czas produkcji antybiotyków.

Szczep, wytwarzajacy rnieazanine ajatybiottyków A-25822, najszybciej wzrasta w zakresie tempera¬ tur 26—35°C. Optymalna produkcja mieszaniny antybiotyków zachodzi w zakresie temperatur oko¬ lo 25—289C.

Jak zwykle w procesach napowietrzanej fermen¬ tacji glebinowej, do podloza fermentacyjnego pod¬ czas fermentacji wprowadza sie sterylne porwie- trze. Dla zapewnienia wysokiego wzrostu drobno¬ ustroju i w konsekwencji wydajnej produkcji mie¬ szaniny antybiotyków objetosc wprowadzanego po¬ wietrza musi byc wieksza, nj£ 1/10 objetosci po¬ dloza w ciagu 1 minuty. W napowietrzanej fer¬ mentacji glebinowej uzyskuje sie optymalna wy¬ dajnosc mieszaniny antybiotyków A-25822, jesli wprowadza sie co najmniej 0,3 objetosci powie¬ trza w ciagu 1 minuty na 1 objetosc podloza ho¬ dowlanego.

Przewaznie maksymalna produkcje mieszaniny antybiotyków A-25822 w warunkach napowietrza¬ nej fermentacja glebinowej uzyskuje sie pomiedzy okolo 3—6 dniem po inokulaoji podloza hodowla¬ nego, w wytrzasanych kolbach. Maksymalna war¬ tosc produkcji mieszaniny antybiotyków w duzych tamkach fermentacyjnych uzyskuje sie po czasie 73 godzin* W warunkach hodowli powierzchniowej pozadana wielkosc produkcji mieszaniny antybio¬ tyków osiaga sie po znacznie dluzszym okresie czasu.

Przebieg fermentacji sledzi sie poprzez okresowe badanie podloza fermentacyjnego wobec szczepów, wrazldwyoh na dzialanie mieszaniny antybiotyków A-25822, takich jak Oanddda laropioaMs i Tricho- phyton mentasjrophytes.

Opisana powyzej mieszandine lanitybiotyków, wy¬ tworzona w procesie napowietrzanej fermemtacji glebinowej, izoluje sie z brzeczki fermentacyjnej metodami ogólnie znanymi. Wieksza czesc wypro¬ dukowanej (przez drobnoustrój mieszaniny anty¬ biotyków zawiera grzybnia, zas w odsaczonej breeczoe znajduja sie tylko niewielkie ilosci 'anty¬ biotyków. Np. po przeprowadzeniu fermentacji w tanku o pojemnosci okolo 1000 litrów, okolo 90*/o wyprodukowanej mieszaniny antybiotyków odsacza sie razem z grzybnia, zas pozostale 10°/o zawarte jest wprzesaczu. .

W opisanych powyzej warunkach szczep, opisany powyzej i oznaczony jako szczep NKBL 3862, wy¬ twarza mieszanine antybiotyków, w której glów¬ nym skladnikiem jest skladnik B. Na ogól sklad¬ nik B stanowi okolo 80—90*/i calkowitej uzyskiwa¬ nej .aktywnosci antybiotycznej. Wszystkie pozostale skladniki stanowia reszte aktywnosci antybio- tycznej.

Antybiotyki A-25822 wyodrebnia sie po fermen¬ tacji, w .postaci mieszaniny.

Poniewaz przewazajaca ilosc aktywnosci anty¬ biotycznej wiaze sie z grzybnia, podloze fermen¬ tacyjne saczy ""sie, oddzielona grzybnie ekstrahuje odpowiednimi rozpuszczalriikami lorganicznymi ta- kkni, jak nizsze alkohole np. metanol, etanol; lub izopropanol, estry, np. octan amylu i octan izoa- mylu. Koizysitnie stosuje sie octan etylu. Ekstrakt suszy sie, rozpuszczalnik oddestylawuje i otrzy¬ muje surowa mieszanine antybiotyków w postaci suchej pozostalosci.

Mozna takze ekstrahowac oala brzeczke fermen¬ tacyjna organicznym rozpuszczalnikiem, nie mie¬ szajacym sie z woda takim, jak cctan etylu. Na- istepnie otrzymany ekstrakt saczy sie i stasuje tok postepowania taki, Jak w pierwszym etapie przy otrzymywaniu surowej mieszaniny antybiotyków.

Otrzymana surowa mieszanine antybiotyków A-25822 rozpuszcza sie w rozpuszczalniku organicznym i oczyszcza sie przez przemycie kwasem lub zasada, albo metodami chromatografii kolumnowej na od- powiiednim absorbencie takim, jak tlenek glinu lub zel krzemionkowy.

Sposób korzystny wedlug wynalazku polega na ekstrahowaniu calej brzeczki fermentacyjnej odpo¬ wiednim rozpuisziozalniifciem 'organicznym takim, iak 80 octan etylu lub amylu i przemyciu ekstraktu w celu usuniecia zanieczyszczen. Korzystnie ekstrakt przemywa sie wodnym roztworem .kwasu w celu wymycia zasadowych antybiotyków w postaci soli addycyjnych. Otrzymana kwasna faze. wodna alka* lizuje sie zasada itaka, jak wodorotlenek sodowy i antybiotyki w .postaci wolnych zasad ponownie eks¬ trahuje rozpuszczalnikiem organicznym takim, jak, octan etylu lub eter dwuetylowy. Ekstrakt organicz¬ ny przemywa sie, suszy, rozpuszczalnik oddestylo- wuje i otrzymuje oczyszczona mieszanine rozpusz¬ czalników w postaci suchej pozositalosci.

Otrzymana oczyszczona mieszanine antybiotyków rozdziela sie znanymi metodami, np. chromatogra- 45 ficznymi i izoluje poszczególne skladniki. Rozdzial przeprowadza sie na tlenku glinu lub zelu krze- mionkowyim albo metoda frakcjonowanej krystali¬ zacji. Ze wzgledu na ilosc skladników, obecnych w otrzymanej mieszaninie antybiotyków, a takze go z powodu podobienstw budowy skladników mie¬ szaniny, rozdziela sie je i izoluje polaczonymi me¬ todami chromatografii i frakcjonowanej krystali¬ zacji, Skladnik B, wytwarzany w przewazajacych ilos- 55 ciach, ozoluje *ie bardzo latwo. Pozostale bpdsfne powyzej skladniki wystepuja w mniejszych ilos¬ ciach i rozdzielenie ich, i wyizolowanie jest znacz¬ nie .trudniejsze. Np. skladnik B otrzymuje sie w postaci krystalicznej, stosujac nastepujacy sposób M postepowania: mieszanine antybiotyków rozpusz¬ cza sie w minimalnej ilosci acetonu lub octanu etylu, rozciencza duza iloscia heksanu i oziebia do temperatury okolo —20 do —5°C.

Krystalizuje wtedy znaczna ilosc skladnika B. ts Osad odsacza sie i oczyszcza iprzez ponowna kry- 3591662 stalizacje. Przesacz odparowuje sie do sucha, otrzymujac pozostalosc, zawierajaca pozostale skladniki mieszaniny antybiotyków oraz niewielkie ilosci skladnika B. Fczositalosc te rozdziela sie me¬ toda chromatografii kolumnowej, stosujac tech¬ nike gradientowa na kolumnie, wypelnionej zasa¬ dowym tlerikiem,. glinu. Kolumne eluuje sie mie¬ szanina octanu etylu z heksanem i woda, uzysku¬ jac irozdziial pozadanych skladiników. Otrzymane eluiaty rozdziela sie ponownie, stosujac metode cbromiaitogriatM oraz metode frakcjonowanej kry¬ stalizacji i uzyskuje poszczególne" skladniki, wyste¬ pujace w mieszaninie w malych ilosciach. * Nastepujace przyklady ilustruja calkowicie spo¬ sób wytwarzania miesizaiminy antybiotyków A-25822 wedlug wynalazku.

Przyklad I. 'Zarodniki szczepu Geotnichum flavo-brumneuim NRRL 3862 inokulowano na sko¬ sach agarowych o nastepujacym skladzie: Skladnik Waga/objetosc w g/l Glukoza 20 Pepton 5 Fosforan jednopotasowy 0,5 Siarczan magnezowy 0,02 Siarczan,zelazawy 0,01 Agar '¦ 20 frodowle na skosach agarowy($i inkubuje sie w temperaturze 25°C w ciagu 7 dna, a nastepnie przechowuje w lodówce iaz do uzycia. Zarodniki z hodowli na iskosaoh, otrzymanej sposobem, opi¬ sanym powyzej, przenosi sde do podloza wegeta¬ tywnego o objetosci 100 mililitrów, umieszczonego w kolbie o pojemnosci 500 miliiliitrów i uzyskuje w ten isipiosób iiniokulum wegetatywne.

Sklad podloza imokulum wegetatywnego: Skladnik Waga/objetosc wg/l 36 Sacharoza Melasa jadalna Moczona kukurydza Fosforan jedniopotasowy NZ laase1 Woda wodociagowa 2 Hodowle wegetatywna wytrzasa sie na wytrza¬ sarce obrotowej przy 250 obrotach/minute, w ciagu 24 do 48 godzin w temperaturze okolo 25°C i in¬ kubuje sie. 5% objetosci otrzymanego1 linokulum wegetatywnego, zawierajacego wzrastajacy drob¬ noustrój, stosuje sie do inokulowania podloza fer¬ mentacyjnego do produkcji - mieszaniny antybio¬ tyków A-25822.

Sklad podloza fermentacyjnego: Skladnik Glukoza Moczona skrobia Waga/objetosc w g/l 16 Pepton (miesny) 10 NZ AminaA2 4 Melasa 5 Sterczam magnezowy sredniciwodmy 5 Weglan wapniowy 2 Woda wodociagowa Poczatkowa wartosc pH podloza produkcyjnego wynosi 6,2. Po inoikulowaniu prowadzi sie fermen¬ tacje w sterylnym itanku fermentacyjnym, miesEa- jac w temperaturze 25°C w iciagu 72 godzin.

Podczas fermentacji do podloza produkcyjnego wprowadza sde sterylne powietrze w liloscd równej polowie objetosci powietrza na jedna objetosc po¬ dloza fermentacyjnego w ciagu 1 minuty. Podczas fermentacji od icziasu do czasu pobiera, isie próbki podloza fermentacyjnego i bada ich aktywnosc antybiotyczna wobec szczepu Trichophyton menta- grophytes. W iczasie fermentacji wartosc pH po¬ dloza stopniowo rosnie do koncowej wartosci 7,3.

Mieszanine antybiotyków A-25822 oddziela siie od .podloza fermentacyjnego w nastepujacy sposób: 900 litrów brzeczki fermentacyjnej miesza sie z równa objetoscia oatanu etylu, saczy ii rozdziela obie warstwy przesaczu. Fiaze wodna odrzuca sie.

Odsaczona grzybnie ekstrahuje isrie po raz drugi 100 litrami octanu etylu i odrzuca. Ekstrakty oota- nowe laiczy sde, rozpuszczalnik oddestylowuje sie, a (pozostalosc przeprowadza do fazy wodnej o obje- _n itosci 50 litrów i rozcienioza woda destylowana do objetosci 100 litrów. pH roztworu doprowadza sie do wartosai 10, dodajac 5n roztwór wodorotlenku sodowego. Alkaliczny (wodny roztwór dwa razy ekstrahuje sie równymi porcjami octanu etylu.

Faze wodna odrzuca sie, zas fazy organiczne laazy i oddestylowuje z iniioh rozpuszczalnik, uzyskujac pozostalosc w postaci oleju, zawierajaca mieszanine antybiotyków. Pozostalosc vte rozpusz¬ cza sde w 20 litrach eteru dwuetylewego i prze- 40 mywa dwukrotnie 10 liitirawyimd porcjiami 2^ n roztworu wodorotlenku sodowego, a nastepnie trzykrotnie 10 litrowymi (porcjami zimnej wody destylowanej. Wszystkie fazy. wodne odrzuca sie, a roztwór eterowy nateza do objetosci 5 litrów 45 i dwukrotnie ekstrahuje 2 litrowymi porcjami 0,2 n roztworu kwiasu saairkjowego. Faze organiczna od¬ rzuca isiie, a kwasne ekstrakty laczy, doprowadza IPH do waTrtosici 10,0 przy uzyciu 5,0 n roztworu wodorotlenku sodowego. Nastepnie roztwór alka- 50 liczny eksitrahuje sie dwukrotnie 5-litrpwymi porcjami m-heksanu i rajz 5 litrami loctanu etylu.

Faze wodna odrzuca sie, a ekstrakty n-heksanowe - laczy sie i saczy. Przesacz suszy siie nad N&2S0.4, oddestylowuje sie z niiego rozpuszczalnik pod 55 zmniejszonym cisnieniem i otrzymuje 43 gramy surowej mieszaniny antybiotyków A-25822 w po¬ staci piany. Ekstrakt octanowy saczy sie, przesacz suszy nad NiaaSO^ oddestylowuje z niego rozpusz¬ czalnik pod zmniejszonym idsnieniem i otrzymuje 60 1 gram mieszaniny iantybiotyfców A-25822 w po¬ staci spieniionej pozostaloscd.

W przykladzie II opisano rozdzielanie, oczysz- czanie i izolowanie poiszczególnych skladników 1 enzymatycznie hydrolizowana kazeina Scheffield Che¬ mical Co., Norwich, N.Y. 65 e pankreatynowy hydrolizat kazeiny Scheffield Chemi¬ cal Company, Norwich, N.Y.01 17 mieszaniny anityoiotyków A-25822. Poniewaz w mieszaninie antybiotyków A-25822 przewaza sklad¬ nik B, to mozna go najlatwiej wyizolowac sposród pozostalych 7 zidentyfikowanych skladników wy¬ mienionej mieszaniny.

Erzyklad II. Mieszanine antybiotyków, otrzy¬ mana sposobem, opisanym w przykladzie I, roz¬ puszcza sie w 200 cmililitrach mieszaniny n-heksa¬ nu i acetonu o skladzie 4:il. Otirzymiany iroztwór rozciencza sie n-heksanem do objetosci 1 litra i oziebia do temipenatury ^—20°C. Krystaliczny skladnik B w ilosci 22,0 g odsacza siie. Z przesaczu oddestylowuje sie rozpuszczalnik pad zmniejszo¬ nym cisnieniem i otrzymuje 20 gramów .mieszaniny antybiotyków w postaci stalej. Mieszanine te roz¬ puszcza sie w górnej warstwie mieszaniny, zawie¬ rajacej 80 czesci octanu etylu, 16 czesci n-heksianu i 4 czesci wody destylowanej. Roztwór przepro¬ wadza sie przez kolumne o wymiarach 13 cm X 62 cm, wypelniona zasadowym tlenkiem glinu (Wioelm W200, Water Associates Inc., Framingham, Mass).

Kolumne napelnia sie w górnej fazie mieszanina octan etylu : sn-heksan : woda 80:16:4, a nastepnie wypelnia adsorbentem. Kolumne eluuje sie ta sa¬ ma "mieszanina, która sluzy jako rozpuszczalniiifc i zbiera frakcje o objetosci 1 litra. Identyfikacje skladników w poszczególnych frakcjach przepro¬ wadza sie metoda chromatografii 'Cienkowarstwo¬ wej. Chramotografie cienkowarstwowa prowadzi sie ma plytkach szklanych o wymianach 20 cm X cm, powleczonych warstwa zelu krzemionko¬ wego F254 o grubosci warstwy 0,25 mm, wypro¬ dukowanych przez Brinkmann Insitruments, Inc., Westberry, N.Y. 11590. Plytki rozwija sie w mie- szaindnie eter dwuetylowy : etanol 3:1. Identyfikacje poszczególnych skladników w 'Odpowiednich frak¬ cjach przeprowadza sie metoda chromatografii gazowo-cieczowej.

W tablicy V przedstawiono kombinacje anty¬ biotyków, wystepujace we frakcjach, otrzymanych po rozdziale, na kolumnie chromatograficznej.

Tablica V Chromatograficzny rozdzial skladników mieszaniny anty¬ biotyków An25822 na zasadowym tlenku glinu Zestaw antybiotyków I II ¦ III IV . V Frakcje polaczone 7—8 9—23 24—42 43-48 55—70 Skladnik mieszaniny antybiotyków M i N A i L B i H B D Kazdy zestaw antybiotyków zateza sie przez oddestylowanie rozpuszczalnika pod zmniejszonym cisnieniem i uzyskuje pozostalosc w postaci oleju. 500 miligramów I zestawu antybiotyków, za¬ wierajacego skladniki M i N, rozpuszcza sie w G61 ml acetonu i oziebia do temperatury —20°C.

Po krystalizacji, odsaczeniu i wysuszeniu otrzy¬ muje sie 39 mg skladnika N mieszaniny antybio¬ tyków A-25822 w postaci slupów o barwie bialej i temperaturze 'topnienia 156—9°C. Po powtórnej krystalizacji z acetonu otrzymuje sie skladnik N o temperaturze topnienia okolo 165°C. Z przesaczu oddestylowuje sie rozpuszczalnik ipod zmniejszo- nym cisnieniem i otrzymuje pozostalosc w postaci oleju. Pozostalosc te rozpuszcza sie w cMoroformie i roztwór przeprowadza przez kolumne o wymia¬ rach 1,0 X 25 cm, wypelniona zasadowym tlen¬ kiem glinu, który uprzednio dezaktywuje sie woda destylowana i przemywa chloroformem. - Wode po dezaktywacji i chloroform po przemy¬ ciu odrzuca sie. Kolumne eluuje isie chloroformem i zbiera frakcje o objetosci 10 ml. Frakcje od 18 do 31 laczy sie, rozpuszczalnik oddestylowuje pod aminiejszonym cisnieniem i otrzymuje pozostalosc w postaci oleju. Pozostalosc te rozpuszcza sie x w benzenie liofilizuje i otrzymuje 334 mg skladnika M mieszaniny lantybioityków A-25822 jako bez¬ postaciowe cialo stale o temperaturze topnienia okolo 140°C z rozkladem. 6,0 g II zestawu antybiotyków, zawierajacego skladniki A i L, rozpuszcza sie w 100 ml acetonu, oziebia sie do temperatury 4°C i pozostawila do krystalizacji. Otrzymane krysztaly odsacza sie i po¬ nownie krystalizuje z goracego .acetonu, otrzymu- 80 jac 1,78 g skladnika A mieszaniny antybiotyków A-25822 o temperaturze topnienia 147°C. Z pierw¬ szego acetonowego przesacza oddestylowuje sie 'aceton pod zmniejszonym cisnieniem i otrzymuje pozositalosc w postaci oleju. Pozostalosc te roz- 85 puszcza sie w chloroformie i roztwór przeprowa¬ dza przez kolumne o wymiarach 1,7 cm X 58 cm, wypelnione zelem krzemicinJkcwym Column Grade, Activity 111/30 mm., Alupharm Chemicals, New Orleans,La./. c 40 Kolumne wypelnia sie suchym zelem i eluuje chloroformem. Rozdzial frakcji, zawierajacych po¬ szczególne stóadniiki A i L mieszaniny antybioty¬ ków, wykrywa sie w swietle ultrafioletowym przy dlugosci fali 254 mi]imiikirony. Nastepnie po na¬ lozeniu kolumne elluje sie porcja chloroformu o objetnosci, odpowiadajacej 2,3 objetosci kolumny.

Skladnik L zbiera sie w objetosci chloroformu, od¬ powiadajacej jednej objetosci kolumny. Z eluatu, zawierajacego skladnik L, oddestylowuje sie roz¬ puszczalnik pod zmniejszonym cisnieniem i otrzy¬ muje 0,191 g skladnika L mieszaniny antybioty¬ ków A-25822 Jako bezpostaciowe cialo stale o temperaturze topnienia okolo 30^C. 5j 8,0 g III zestawu antybiotyków, zawierajacego skladniki B i H, rozpuszcza sie w chloroformie i przeponowdza przez (kolumne o wymiarach 6,2 cm X 12 cm, wypelniona zdezakitywowanym zasado¬ wym tlenkiem glinu. Kolumne eluuje sde chloro- eo formem i zbiera wiekszosc frakcji o objetosci ml kazda. Frakcje od 10 do 40, które zawieraja skladnik B laczy sie. Osobno laczy sie frakcje od 81 do 210, które zawieraja skladnik H. Obecnosc poszczególnych skladników mieszaniny lantybiaty- ti ków w wymienionych frakcjach stwierdza sie me-91662 i*> 20 todami chromatografii gazowp-cieczowej i chroma¬ tografii cienkowarstwowej.

Z polaczonych frakcji, zawierajacych skladnik H, rozpuszczalnik oddesitylowuje sie pod zmniejszo- nym loisinieniem i otrzymuje sie olej. Olej ten roz¬ puszcza sie w 4 ml acetonu, roztwór acetonowy dzieli isie na 6 czesci i kazda z nich nanosi na wyprodukowana przez E. Merck plytke szklana do chromatograiiii cienkowarstwowej o wymianach iom X 20 cm, pokryta warstwa zelu krzemion¬ kowego F254 o grubosci 2,0 mm (Brinkmann In¬ struments, Inc., Westburry. N.Y.), która rozwija isie w mieszaninie eter dwuetylowy: etanol 3:1.

Z kazdej plytki zeskrcbuje sie zel, .zawierajacy skladnik H, a otrzymany material laczy, suszy na powietrzu i nanosi na wierzcholek kolumny o wy¬ miarach 6,2 om X 3 cm, wypelnionej zelem krze¬ mionkowym (Grade 62,60 — 200, Mexh, M&the- son, Coleman and Bell, Norwood, Ohio), który uprzedoio przemywa sie octanem etylu. Kolumne eluuje sie 1 litrem octanu etylu, eluat zbiera, rozpuszczalnik oddesitylowuje sie pod zmniejszo¬ nym cisnieniem i otrzymuje 0,146 g skladnika H mieszaniny antybiotyków A-25822 jako bezpostta- ciowe olalo stale o temperaturze topnienia 74^7°C. 2,5 g V zestawu antybiotyków, zawierajacego skladnik D, co stwierdza sie metoda chromato- girafii cienkowarstwowej, rozpuszcza isie w chloro¬ formie i przeprowadza przez kolumne o wymia¬ rach 4,6 om X 55 om, wypelniona zelem ikrzemiion- kowym, który uprzednio przemywa sie chlorofor¬ mem. Kolumne eluuje sie chloroformem, do któ¬ rego dodaje sie od 0 do 40% metanolu w gradien¬ cie liniowym. Zbiera sie wiejkszosc frakcji o obje¬ tosci 20 ml. Skladnik D eluuje sie we frakcjach od 135 do 170, co wykrywa sie metodami chroima- toigrafii cienkowarstwowej i chromatografii gazo- wo-eieczowej. Frakcje od 135 do 170 laczy sie, rozpuszczalnik oddesitylowuje pcd zmniejszonym ¦cisnieniiem i otrzymuje 0,818 g skladnika D mie¬ szaniny antybiotyków A-25822 Jako bezpostaciowe cialo stale o temperaturze topnienia okolo 51—5UC. t 1 h Tl -t 12 13 15 Dlugosc fali l/i) Fig. 591662 4000 3000 2500 100f ' ' 2000 •o O. 20h Czestotliwosc (cm"1) 1500t400iy>0 1200 H00 1000 950 900 850 800 750 200 £5p 12 13 15 Dlugosc foli (/i) Fig. 6 4000 3000 2500 2OO0 Czestotliwosc (cm'1! lS00l400 lO 12 M 14 15 Dtugosc foli (/u) Fig. 7

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania - mieszaniny nowych anty¬ biotyków A-25822 oraz jej poszczególnych skladni¬ ków A, B, D, H, L, M i N w postaoi wolnej lub soli addycyjnych z kwasami, znamienny tym, ze hodowle szczepu Geotrichum flavo-brunneum NRRL, 3862 prowadzi sie ma podlozu, zawierajacym przyswajalne zródla wegla, azotu i soli nieoirga- niczinych, w warunkach napowietrzanej fermentacji glebinowej i otrzymana mieszanine antybiotyków ewentualnie izoluje sie i rozdziela ina poszczególne skladniki lub przeprowadza w sól albo jedno i drugie, lub skladnik A korzystnie przeprowadza w pochodna octanowa. CH2 /CH2 h CH3-CH 0£ CH,' CHK CH3 CH, zór 1 CH, m CH3-CH ^CH„ XCH ^CH3 XCH, r,7 r; Wzdr 3 vzo 5r l91 662 4000 3000 2500 2000 Czestotliwosc (cm'1) 1500 14001300 1200 1100 1000 950 900 850 800 750 700 ID W Dtugosc foli (jd) 650 3 o. IM o: 4000 3000 2500 2,000 100 Fig.! Czestotliwosc (cm"V 1500 14001300 1200 11Q0 1000 950 900 850 800 750 700 650 ' ' ' ' ¦ i i " 1 1 i —r ^i f0 m 11 Dlugosc fali (ju) Fig 2 5000 4000 3000 2500 2000 ** 100 Czesto11mosc (cm'1} 150014001300 1200 1100 1000 950 900 850 800 750 700 6 7 8 9 10 11 12 Dtugosc foli (Ai) Fig 391 663 4000 3000 2500 2000 Czestotliwosc (cm'1) 1500 H001300 1200 1100 1000 950 900 B50 800 750 7p0 650 12 Dlugosc fali (/*/ Fig. 4 -^ 4000 3000 2500 2000 ^ioofM ' ^ — :tf 4^ M 60 o. 40 20 Czestotliwosc (cm'1) 15001400^3001200 M00 1000 950 900 850 fiOO 750 700 650 ——i 1 1 1 r^ ^ r—^i "h *