PL91202B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia leczniczych preparatów antytoksynowych, w po¬ staci czynnych fragmentów przeciwcial, z surowicy uodpornionych zwierzat, zwlaszcza koni.Preparaty antytoksynowe stanowia jeden z waz¬ niejszych srodków leczniczych i profilaktycznych, stosowanych w schorzeniach, wywolanych dziala¬ niem toksyn pochodzenia biologicznego np. takich, jak blonica, tezec, przy pokasaniu przez zmije i w wielu innych przypadkach.Produkcja preparatów antytoksynowych do celów leczniczych polega na uodpornianiu zwierzat, a zwlaszcza koni, odpowiednimi toksynami lub tokso- idami (tj. toksynami, pozbawionymi zjadliwosci), az do osiagniecia pozadanego poziomu przeciwcial w surowicy. Po zakonczeniu cyklu immunizacji od zwierzat pobiera sie surowice i przeciwciala od¬ dziela sie od pozostalych bialek przez wysalanie.W celu zmniejszenia reaktogennosci otrzymanego preparatu wysalanie poprzedza sie na ogól ostroz¬ nym trawieniem proteolitycznym, które nie wplywa w sposób istotny na aktywnosc antytoksyczna su¬ rowicy. Postepowanie to jednak nie pozwala nigdy na wyodrebnienie przeciwcial swoistych wylacznie dla antygenu, przeciwko któremu surowica ma byc srodkiem leczniczym.W najlepiej oczyszczonych preparatach antyto¬ ksynowych do celów leczniczych (tzw. antytoksy- nach), swoiste przeciwciala stanowia nie wiecej, niz %—30°/o ogólnej ilosci bialka. Terapeutyczne sto- 30 sowanie takich preparatów prowadzi wiec do wpro¬ wadzenia do organizmu czlowieka znacznych ilosci zbednych — a jako obcogatunkowych — potencjal¬ nie szkodliwych bialek. Duze stezenie bialka w pre¬ paracie antytoksyny sprawia równiez, ze albo trze¬ ba je wstrzykiwac w postaci roztworów o wysokiej lepkosci, albo rozcienczac do duzej objetosci, co po¬ ciaga za soba znaczna bolesnosc i niebezpieczen¬ stwo miejscowych lub uogólnionych zaburzen kra¬ zenia.Dla usuniecia tych trudnosci próbowano wydzie¬ lac przeciwciala na drodze swoistej. W obecnosci wlasciwego antygenu przeciwciala tworza z nim nierozpuszczalny kompleks, z którego mozna je od¬ zyskac przez dysocjacje w srodowisku kwasnym, alkalicznym lub innym. Sposób ten nie daje jednak pozadanych rezultatów, poniewaz czynniki dysocju¬ jace kompleks denaturuja jednoczesnie przeciw¬ ciala tak, ze wydajnosc procesu jest bardzo niska.Jak to juz wyzej powiedziano, przeciwciala moga byc poddane trawieniu proteolitycznemu bez utraty aktywnosci. Przeciwcialo, zmodyfikowane w wyni¬ ku trawienia proteolitycznego (tzw. fragment czyn¬ ny przeciwciala), jest znacznie bardziej odporne na dzialanie, przynajmniej niektórych, czynników dy¬ socjujacych kompleks antygen-przeciwcialo.Wynalazek niniejszy oparty jest o te wlasnie ceche proteolitycznie zmodyfikowanego przeciwciala i prowadzi do otrzymywania preparatu, w którym obecne sa tylko swoiste fragmenty przeciwciala, tj. 9120291202 3 4 zdolne do reagowania z danym antygenem (toksyna).Istota wynalazku polega na tym, ze uzyskany na drodze trawienia proteolitycznego frógment czynny przeciwciala wychwytuje sie z roztworu przez swoiscie wiazacy sie z przeciwcialem anty¬ gen,* ale uprzednio zwiazany z nierozpuszczalnym nosnikiem (np. rozdrobnionym zelem agarozowym).W czasie kontaktu zelu z surowica, trawiona pro¬ teolitycznie, nastepuje swoiste wiazanie przeciwcial z nierozpuszczalnym nosnikiem za posrednictwem lacznika, którym jest antygen (toksoid lub toksy¬ na). Poniewaz reakcja miedzy toksyna a przeciw¬ cialem jest odwracalna (w odróznieniu od nieod¬ wracalnego wiazania antygenu z nosnikiem), mo¬ zliwe jest rozszczepienie kompleksu przeciwcialo- -ant^gen-nosnik i oddzielenie czynnego fragmentu od nosnik nadaje sie do powtórnego uzytku.Ujemna cecha stosowanych dotad procesów chro¬ matograficznych jest to, ze do elucji stosowano dosc stezone roztwory soli oraz kwasy okolo 0,1 mo- larne. To, w zestawieniu ze stosunkowo niskim ste¬ zeniem eluowanego bialka sprawia, ze oczyszczony preparat przed zageszczaniem musi sie pozbawiac nadmiaru elektrolitów np. za pomoca dializy. Jest to proces klopotliwy, czesto* prowadzacy do strat materialu i pojawiania sie cial goraczkotwórczych w preparacie koncowym. W metodzie wg niniejsze¬ go wynalazku trudnosc te usunieto przez zastoso¬ wanie rozcienczonego kwasu solnego o stezeniu, nie przekraczajacym 0,01 M, uzupelnionego niewielka, ponizej 0,01 M/l, iloscia chlorku sodu o stezeniu tak dobranym, ze wydajnosc procesu jest wysoka, a ostateczny preparat, nawet zageszczony do steze¬ nia 15 g/100 ml, zawiera dopuszczalne w lecznic¬ twie (izotoniczne) stezenie chlorku sodu.Proces technologiczny przebiega w "sposób naste¬ pujacy. Przygotowuje sie nosnik przez aktywowa¬ nie bromocyjanem rozdrobnionego zelu agarozowe- go, do którego dodaje sie antygen (toksoid lub tok¬ syne). Nosnik umieszcza sie w kolumnie szklanej i naklada sie na niego surowice odpornosciowa. Po odplukaniu bialek balastowych fragmenty czynne, zwiazane z nosnikiem, eluuje sie rozcienczonym kwasem solnym, zawierajacym niewielka ilosc chlorku sodu. Otrzymany roztwór zobojetnia sie do pH = 7,0 i suszy ze stanu zamrozenia.Ponizsza tabela wykazuje na podstawie akty¬ wnosci preparatów antytoksynowych (liczonej w jed¬ nostkach flokulacyjnych (Lf) na ml 15% roztworu), ze preparat, uzyskany sposobem wedlug wynalazku jest okolo 5-krotnie bardziej oczyszczony, niz pre¬ parat handlowy (tzw. oczyszczona antytoksyna).Tabela Preparat Handlowy (wytracony siarczanem amonu) **- Otrzymany na kolum¬ nie Surowica odpornosciowa 1 blonicza Lf/ml * 1850 8650 tezcowa Lf/ml * 4200 24000 *) roztw6r zawierajacy 15g bialka w 100 ml Przyklad I. Otrzymywanie przeciwbloni- czych preparatów antytoksynowych do celów lecz¬ niczych.Nosnik przygotowano ogólnie stosowana metoda, polegajaca na aktywowaniu bromocyjanem roz¬ drobnionego zelu agarozowego i przylaczeniu do niego toksoidu bloniczego. Do 1000 ml aktywowa¬ nego zelu agarozowego dodano 180 ml toksoidu bloniczego, zawierajacego 3000 jednostek flukula- cyjnych (Lf) w 1 ml. Zel przeniesiono do kolumny szklanej o wymiarach 20X8,5 cm. 4,5 1 natywnej surowicy konskiej przeciwbloniczej rozcienczono w stosunku 1:2 0,15 M chlorkiem sodu, doprowadzo¬ no pH do 3,2 i trawiono pepsyna przez 30 minut w temperaturze 30°C. Zobojetniona mieszanine przesaczono , natychmiast przez wyjalowiony filtr.Cala w ten sposób otrzymana mieszanine o obje¬ tosci 13,5 1, zawierajaca okolo 800 000 Lf nakladano na kolumne z szybkoscia 1—1,5 1 na godzine. Po przejsciu mieszaniny, kolumne przeplukano 0,15 M roztworem chlorku sodu. Fragment czynny przeciw¬ ciala bloniczego eluowano roztworem, zawierajacym 0,005 M roztwór kwasu solnego i 0,005 M roztwór chlorku sodu (pH =2,7—2,8). Wyplywajacy z kolumny roztwór fragmentu czynnego przeciwciala natych¬ miast zobojetniano 0,1 M roztworem wodorotlenku sodu do pH = 7,0 i poddano liofilizacji. Zawieral on 55% ogólnej ilosci przeciwcial, zwiazanych z 3o nosnikiem, a jego aktywnosc wlasciwa wynosila 70 Lf/mg bialka. W wielu przeprowadzonych dos¬ wiadczeniach wydajnosc przeciwcial z kolumny byla w granicach od 55 do 65%, a aktywnosc wlasciwa od 50 do 70 Lf/mg bialka.Pozostale na kolumnie przeciwciala byly mocno zwiazane z nosnikiem i dlatego nie mogly byc od¬ zyskane w tych warunkach. Do nastepnego uzycia nosnik regenerowano 6 M roztworem mocznika w 0,1 M roztworze HC1, a nastepnie plukano 0,15 M 40 roztworem chlorku sodu o pH = 7,0. W czasie re¬ generacji w plynie, wyplywajacym z nosnika, stwierdzono obecnosc przeciwcial, ale nie uzywano ich do przygotowania preparatów antytoksynowych do celów leczniczych. 45 Przyklad II. Otrzymywanie przeciwtezcowych preparatów antytoksynowych do celów leczniczych.Natywna surowice konska przeciwtezcowa trawio¬ no w podobny sposób, jak opisano w przykladzie 50 I, a nastepnie oddzielono od bialek balastowych przez wysolenie siarczanem amonu. Wytracone przeciwciala odwirowano, rozpuszczono i dializo¬ wano do wody. Przeciwciala, zobojetniajace toksyne tezcowa, wyodrebniono na kolumnie, wypelnionej 55 rozdrobnionym zelem agarozowym, zawierajacym nieodwracalnie zwiazany toksoid tezcowy (w sposób taki, jak opisano w przykladzie I). Aktywacje zelu agarozowego, podstawienie toksoidu tezcowego, na¬ kladanie bialka na kolumne oraz wymywanie prze- 60 ciwcial tezcowych przeprowadzono w sposób po¬ dany w przykladzie I. Wydajnosc, wyliczana w stosunku do ogólnej ilosci jednostek przeciwtezco¬ wych, zwiazanych przez nosnik, wynosila 60%. Ak¬ tywnosc wlasciwa otrzymanego preparatu wynosi- 85 la 175 Lf/mg bialka.91202 6 PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób otrzymywania leczniczych preparatów an¬ tytoksycznych w postaci czynnych fragmentów przeciwcial z surowicy uodpornionych zwierzat, zwlaszcza koni, po proteolitycznym trawieniu tych surowic, znamienny tym, ze fragmenty czynne prze¬ ciwcial wychwytuje sie za pomoca swoistego anty¬ genu, kowalencyjnie zwiazanego z nierozpuszczal¬ nym nosnikiem, a nastepnie eluuje sie za pomoca roztworu HCl o stezeniu, nie przekraczajacym 0,01 M, zawierajacego chlorek sodu w ilosci ponizej 0,01 M/l. PL