Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania pochodnych winblastyny, leurozydyny i leurokrystyny o wzorze przedstawionym na rysunku, w którym R oznacza grupe NH2, NH-NH2, NHCa, H5C lub NHCH3, R' oznacza atom wodoru lub grupe acetylowa, R" oznacza atom wodoru, grupe alkilowa o 1—3 atomach wegla, formylowa lub alkanoilowa o 2—4 atomach wegla, a jeden z podstawników R" i R"" oznacza grupe hydroksylo¬ wa, zas drugi grupe etylowa oraz ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli addycyjnych z kwasami.Sposób leczenia nowotworów polega na podawaniu ssakom cierpiacym na choroby nowotworowe efektywnych przeciwnowotworowo ilosci soli zwiazku o wzorze 1 w zakresie od 0,1 do 1,0 mg/kg wagi ciala ssaka. ' Szereg wystepujacych w przyrodzie naturalnych alkaloidów otrzymywanych z Vinca rozea posiada stwier¬ dzone aktywne dzialanie w leczeniu eksperymentalnie wywolywanych zlosliwych nowotworów u zwierzat.Wsród nich sa leurozyna (patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3370057), winkaleukoblastyna (winblasty- na) (patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3097137), leurozydyna (winorozydyna) i leurokrystyna (win- krystyna) (oba przedstawione w patencie Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3205220). Dwa z tych alkaloidów: winblastyna i leurokrystyna sa obecnie sprzedawane w postaci leków przeznaczonych do leczenia chorób zlosliwych, w szczególnosci bialaczki i chorób pokrewnych u ludzi. Sposród tych handlowych zwiazków leurokrystyna jest najbardziej aktywnym i uzytecznym srodkiem leczenia bialaczek lecz takze wystepujacym w najmniejszych ilosciach w Vinca rosea alkaloidom przeciwnowotworowym.Modyfikacje chemiczne alkaloidów Vinca sa raczej ograniczone. Po pierwsze struktura czasteczkowa tych zwiazków jest skrajnie zlozona i trudno jest znalezc reakcje chemiczne nadajace czasteczce szczególne funkcje.Po drugie alkaloidy pozbawione pozadanego charakteru chemoterapeutycznego wydzielane w Vinca rosea posiadaja, jak stwierdzono, taka strukture, która jest bardzo zblizona do struktury aktywnych alkaloidów. Tak wiec aktywnosc przeciwnowotworowa zdaje sie byc ograniczona do bardzo szczególnych struktur i szanse2 90 467 otrzymania leków bardziej aktywnych przez modyfikacje takich struktur wydaja sie byc malo prawdopodobne.Sposród zakonczonych sukcesem modyfikacji aktywnych fizjologicznie alkaloidów wymienic mozna wytworze¬ nie dwuhydrowinblastyny (patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 335286) oraz zastapienie grupy acetylowej przy weglu C4 (atom wegla oznaczony litera 4) w ukladzie pierscieniowym winblastyny, porównaj wzór 1 za pomoca wyzszych grup alkaloilowych lub niezwiazanych grup acyIowyeh (patrz patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3392173). Wiele z tych pochodnych umozliwia przedluzenie, zycia myszy zakazonych wirusem biataczkowym P1534. Jedna z tych pochodnych, w której acetylowa grupe C-4 zastapiono grupe ehloroacety Io¬ wa jest takze uzytecznym zwiazkiem posrednim przy wytwarzaniu zmodyfikowanych strukturalnie pochodnych winblastyny, w których zamiast grup acetylowej C-4 w winblastynie wystepuje grupa N,N-dwualkiloglicylowa (patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3387001). Zwiazek posredni, mianowicie 4-dezacetylowinblastyna wytwarzana jest w wyniku reakcji chemicznych prowadzacych do tych ostatnich pochodnych. Ten zwiazek posredni nie zawierajacy grupy acylowej w polozeniu CM, posiadajacy niezestryfikowana grupe hydroksylowa jest, jak doniósl Hargrove, Lloydia, 27f 340 /1964/ substancja toksyczna, posiadajaca niewielkie wlasnosci che- moterapeutyczne przeciwko mysiej bialaczce P1534.Sposób wedlug wynalazku polega na reakcji zwiazku o wzorze przedstawionym na rysunku, w którym R oznacza grupe OCHa, R' oznacza atom wodoru lub grupe acetylowa, zas R", R'" i R"" maja wyzej podane znaczenie, *e zwiazkiem o wzorze NHaR1# w którym Ri oznacza atom wodoru, grupe CH3, C2H5 lub NH2 otrzymany produkt poddaje sie reakcji z nietoksycznym kwasem organicznym lub nieorganicznym otrzymujac sole addycyjne.Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalazku stosuje sie do otrzymywania preparatów farmaceutycz¬ nych w postaci jednostkowych dawek podawanych w celu uzyskania efektów przeciwnowotworowych. Dawka jednostkowa zawiera efektywna ilosc soli zwiazku o wzorze 1, która wynosi od 0,1—1,0 mg/kg wagi ciala ssaka.Zwiazek stosuje sie w obecnosci rozcienczalnika farmaceutycznego.Jako nietoksyczne kwasy do wytwarzania farmaceutycznie dopuszczalnych soli addycyjnych zasad aminowych z kwasami stosuje sie kwasy nieorganiczne, jak chlorowcowodorowy, azotowy, siarkowy, fosforowy, bromowodorowy, jodowodorowy, azotawy i rózne kwasy fosforowe a takze kwasy organiczne, takie jak alifatyczne kwasy jedno- i dwukarboksylowe, kwasy tluszczowe podstawione grupami fenylowymi i hydroksylo¬ wymi, zarówno jedno- jak i dwukarboksylowe, kwasy aromatyczne oraz alifatyczne i aromatyczne kwasy sulfonowe, itp. Odpowiednimi farmaceutycznie dopuszczalnymi solami beda wiec siarczany, pirosiarczany, dwusiarezany, siarczyny, dwusiarczyny, azotany, fosforany i jednowodorofosforany, dwuwodorofosforany, metafosforany, pirofosforany, chlorki, bromki, jodki, octany, propioniany, kapryniany, kaproniany, akrylany, mrówczany, izomaslany, kaprylany, propiolany, szczawiany, maloniany, bursztyniany, suberyniany, sebacyniany, fumarany, melainiany, benzoesany, chlorobenzoesany, metylobenzoesany, dwunitrobenzoesany, hydroksybenzo¬ esany, metoksybenzoesany, ftalany, tereftalany, benzenosulfoniany, toluenosulfoniany/chlorobenzenosulfonia- ny, ksylenosulfoniany, fenylooctany, fenylopropioniany, fenylomaslany, cytryniany, mleczany, 2-hydroksymas- lany, glikolany, jablezany, winiany, metanosulfoniany, propanosulfoniany, naftaleno-1-sulfoniany, naftaleno-2- -sulfoniany oraz sole kwasów heksanokarboksylowego, butynodwukarboksylowego-1,4, heksynodwukarboksylo- wego-1,6 oraz inne podobne sole. N Zwiazki o powyzszym wzorze mozna ogólnie przedstawic albo jako pochodne winblastyny, w których R' oznacza grupe acetylowa, R" grupe metylowa, R'" grupe hydroksylowa i R"" grupe etylowa lub pochodne dezacetylowinblastyny jeslf R", R'" i R"" pozostaja takie same, lecz R' oznacza atom wodoru lub pochodne leurokrystyny, jesli R' oznacza grupe acetylowa, R" formylowa, R"' hydroksylowa i R"" etylowa, badz dezacetloleurokrystyny, jesli R", R'" i R"" pozostaja takie same, a R' oznacza atom wodoru. Moga to byc tez pochodne dezmttylowinblastyny (znanej takze jako dezformyleurokrystyna), przy czym R' oznacza grupe acetylowa, a R" atom wodoru, zas R"' i R"" grupe hydroksylowa i etylowa odpowiednio, badz tez dezacetylo- dezmetylowinblastyny (czyli dezacetylodezformyloleurokrystyny), przy czym zarówno R' jak i R" oznaczaja atomy wodoru, zas R"' oznacza grupe hydroksylowa, a R"" oznacza grupe etylowa. Moga to byc tez pochodne leurozydyny, przy czym R' oznacza grupe acetylowa, R" metylowa, R'" etylowa i R"" hydroksylowa lub pochodnymi dezmetyloleurozydyny, przy czym R', R'" i R"" pozostaja takie same, lecz R" oznacza atom wodoru, badz tez dezacetylodezmetyloleurozydyny, przy czym R' i R" oznaczaja atomy wodoru, zas R'" oznacza grupe etylowa i R"" grupe hydroksylowa. Moga to byc tez pochodne dezacetyloleurozydyny, przy czym R' oznacza atom wodoru, R" -grupe metylowa, zas R'"- grupe etylowa, a R"" grupe hydroksylowa.W kazdym przypadku termin „dezacetylo" oznacza brak grupy acetylowej w polozeniu C-4 kompleksowego ukladu pierscieniowego indolowodwuwodoroindolowego.Pochodne o wzorze przedstawionym na rysunku sa zwiazkami, w których grupa karbometoksylowa w polozeniu C-3 pewnych znanych alkaloidów indolowodwuwodoroindolowych jest przeksztalcona w grupe90 467 3 karboksyhydrazydowa lub karboksamidowa. Nie wszystkie z tych pochodnych daja sie wytworzyc w jednym procesie. Zwiazki, w których R we wzorze 1 oznacza grupe NH2, NH-NH2 N HC2H5 lub NH-CH3 wytwarza sie w sposób nastepujacy: Winblastyne, leurokrystyne, leurozydyne, dezmetylowinblastyne, dezmetyloleurozydyne lub ich odpowiednie 4-dezacetylowe pochodne poddaje sie reakcji z amoniakiem, metyloamina lub hydrazyna, otrzymujac odpowiednie amidy, N-metyloamidy lub hydrazydy. Produkt takiej reakcji z materialem wyjsciowym posiadajacym nienaruszona grupe 4-acetylowa jest zwykle mieszanina zwiazków, w których grupa karbometo ksy- lowa w polozeniu C-3 zamieniona jest w karboksamid N-metylokarboksamid lub grupe karboksyhydrazydowa lecz takze w których grupa acetylowa w polozeniu C-4 jest calkowicie lub czesciowo usunieta. W celu oczyszczenia otrzymanych pochodnych C-4 dezacetylowych rozdziela sie je na drodze chromatografii.Zwiazki, w których wystepuje grupa acetylowa przy weglu C-4 mozna, jak juz stwierdzono, wytworzyc w reakcji winblastyny, leurokrystyny lub leurozydyny bezposrednio z amoniakiem, metyloamina lub hydrazyna, a nastepnie wydzielajac pochodna 4-acetylowa z pochodnej 4-dezacetylowej. W przypadku hydrazydu konwersja do azydku, a nastepnie reakcja azydku z amina prowadzi do wytworzenia amidów o wzorze przedstawionym na rysunku. Jednak, z uwagi na ruchliwosc grupy acetylowej w polozeniu C-4 w zasadowych warunkach kolejne reakcje hydrazyna-amid prowadzi sie przy uzyciu pochodnej 4-dezacetylowej. Ogólnie biorac, 4-dezacetyloamidy o wzorze przedstawionym na rysunku 1 mozna acetylowac bezwodnikiem alifatycznym lub chlorkiemkwaso¬ wym, otrzymujac odpowiednie octany w pozycji 4, propioniany lub maslany, badz tez ich chloropochodne.W reakcji acylowania mozna uzyc chlorki kwasowe typu (C! -CaJ-alkilo-COCl lub chloro-IC^CaJ-alkilo-CoCI, badz tez bezwodnik kwasowy typu (C1-C3)-alkilo-CO/aO lub (chloro)C1-C3)-alkilo-CO)20. Korzystny sposób acylowania winblastyny lub leurokrystyny przedstawiono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3392173, w którym jako pierwszy produkt reakcji wytwarza sie pochodna dwuacylowa, a nastepnie poddaje sie ja selektywnej hydrolizie, uzyskujac zwiazek 4-acylowy. Do wytworzenia pochodnych 4-acylowyeh mozna równiez zastosowac inne metody, polegajace na selektywnym acylowaniu lub wielokrotnym acylowaniu, i hydrplizie.Istnieja jednak pewne ograniczenia, o których nalezy pamietac przy rozwazaniu metod acylowania. Po pierwsze, acylowania 1-dezformyloleurokrystyny (1-dezmetylowinblastyny) lub 1-dezmetyloleurozydyny bedzie powodowalo równiez acylowanie w polozeniu N-1. Dlatego tez zwiazek 1-dezformyIowy lub 1 -dezmetylowy nalezy formylowac, acylowac lub alkilowac uzyskujac pozadany podstawnik w polozeniu N-1 przed przystapie¬ niem do acylowania wegla C-4. Ponadto, jesli grupa karboksamidowa C-3 zawiera grupy dajace sie acylowac, to jest grupy hydroksylowe lub aminowe, wówczas acylowanie w polozeniu C-4 nalezy przeprowadzic przed reakcja azydekeamina, dajaca ostatecznie karboksamidowa grupe w polozeniu C-3. Korzystnym sposobem postepowania jest wiec acylowanie opisanymi metodami karboksyhydrazydu C-3 po uprzednim zabezpieczeniu grup hydrazy- dowych, gdyz w przeciwnym razie ulegna one równiez acylowaniu. Korzystnymi grupamido zabezpieczenia grup hydrazydowych sa grupy propylidenowe, utworzone przez reakcje aminowej czesci reszty hydrazydowej z acetonem. Grupe taka latwo mozna usunac dzialaniem kwasów lub tez korzystniej, pochodna propylidanowa jako taka mozna bezposrednio przeprowadzic w grupe azydowa dzialaniem kwasu azotowego (porównaj opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3470210, Przyklad VII).Alternatywna metoda wytwarzania pierwszorzedowych amidów (R oznacza NH2), hydrazydów (R oznacza NH-NH2) polega na zastosowaniu sposobu opartego na metodzie opisanej przez Ainswortha w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 2756235, gdzie hydrazyd poddaje sie hydrogenolizie za pomoca niklu Raney'a.Pochodne o wzorze 1 nazywane sa tutaj jedynie w odniesieniu do nowych grup powstajacych przy danym atomie wegla, na przyklad zwiazek wytworzony przez zastapienie w winblastynie grupy estru metylowego przy weglu C-3 grupa amidowa nazywamy po prostu C-3 karboksamidem winblastyny, anie C-3 karboksamidem C-3 dezkarbometoksywinblastyny.Zwiazki o wzorze przedstawionym na rysunku 1 w postaci wolnych zasad, wlaczajac w to zarówno karboksamidy i karboksyhydrazyny sa bialymi lub brazowo zabarwionymi bezpostaciowymi cialami stalymi.Korzystnie jednak, jesli to mozliwe, wyizoluje i rekrystalizuje sie amidy w postaci ich soli aminowych utworzonych z nietoksycznymi kwasami. Sole takie sa rozpuszczalnymi w wodzie krystalicznymi lub bezposta¬ ciowymi bialymi cialami stalymi o wysokiej temperaturze topnienia.Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalazku wykazuja dzialanie przeciw wirusowe in vitro przeciw¬ ko wirusowi opryszczki przy zastosowaniu kultury tkankowej w tescie zahamowania wzrostu kolonii podobnym do opisanego przez Siminoffa, Applied Microbiology, 9 66-72 (1961). Na przyklad, siarczan C-3 karboksamidu winblastyny dawal 20 mm strefe zahamowania (3-krotna wzgledem nominalu), bez toksycznosci przy dawkach rzedu 125/ig/ml. T«n sam zwiazek wykazywal zdolnosc do powodowania zablokowania metafazy w hodowa¬ nych komórkach jajnikowych chomika chinskiego przy dawkach zawartych od 2X10"2/ig/ml do4 90 467 2 X 10~5 jug/ml. Najbardziej-aktywnym srodkiem powodujacym takie zatrzymanie byl siarczan C-3 N-metylokar- boksamidu 4-dezacetyloleurokrystyny, który byl efektywny przy dawkach rzedu 10"6 /ig/ml.Ponadto, zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku wykazaly aktywnosc przeciwko nowotworom zaszczepionym myszom in vito. Na przyklad, siarczan C-3 karboksamidu 4-dezacetylowinblastyny, siarczan C-3 N-metylókarboksamidu 4-dezacetylowinblastyny, siarczan C-3 karboksamidu winblastyny, siarczan C-3 Nmetylo- karboksamidu winblastyny, siarczan C-3 amidu 4-dezacetyloleurozydyny i C-3 karboksyhydrazyd 4-dezacetylo¬ winblastyny, podobnie jak inne zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku o wzorze 1 wykazuja taka aktywnosc. Szczególnie jednak interesujaca jest aktywnosc siarczanu C-3 karboksamidu 4-dezacetylowinblastyny i jego pochodnych N-alkilowych i N-hydroksyalkilowych przeciwko rakowi tkanki kosciotwórczej Ridgewaya (ROS) i miesakowi tkanki chlonnej Gardnera (GLS).Celem wykazania dzialania zwiazków wytwarzanych sposobem wedlug wynalazku przeciwko wspomnia¬ nym nowotworom stosowano badanie obejmujace podawanie leku, zwykle na drodze dootrzewnej, przy danej dawce przez okres 7—10 dni po zaszczepieniu nowotworu.W tablicy podano wyniki szeregu eksperymentów, w których myszom z zaszczepionym nowotworem podawano z dobrymi rezultatami zwiazki o wzorze przedstawionym na rysunku 1. W tablicy tej w kolumnie 1 podano nazwe zwiazku, w kolumnie 2 oznaczenie zaszczepionego nowotworu, w kolumnie 3 dawke lub zakres dawek i liczbe dni, przez które te dawke leku podawano, zas w kolumnie 4 procentowe inhibitowanie wzrostu nowotworu. Skrótem ROS okreslano raka tkanki kosciotwórczej Ridgewaya, skrótem GLS — miesaka tkanki chlonnej Gardnera, zas skrótem CA 755 — gruczolakoraka.Zwiazki o wzorze przedstawionym na rysunku 1 podobne do leurokrystyny i winblastyny wykazuja toksycznosc przy podawaniu myszom w dawkach wyzszych od dawek powodujacych 100 procentowe zahamo¬ wanie przeszczepionych nowotworów. Ponadto z niezrozumialych wzgledów wszystkie leki w opisywanym tekscie, wlaczajac w to leki kontrolne podobne do winblastyny moga wykazywac toksycznosc w dawkach, które zwykle daja zahamowanie wzrostu nowotworu bez toksycznosci. Dlatego tez wyniki zestawione w tablicy 1 sa wynikami typowych eksperymentów, w których lekarstwa dawaly spodziewane rezultaty, a nie sa srednia ze wszystkich testów. < Zwiazki o wzorze przedstawionym na rysunku wykazuja równiez dzialanie przeciwko innym przeszczepio¬ nym nowotworom. Na przyklad w przypadku miesaka tkanki chlonnej Mecca pozajelitowe wstrzykiwanie 0,25 mg/kg w ciagu 9 dni siarczanu C-3 N-metylokarboksamidu winblastyny dalo 50% zahamowanie wzrostu nowotworu, a wstrzykiwanie C-3 amidu 28% zahamowanie wzrostu. Przy tych dawkach sama winblastyna nie wykazywala zadnego dzialania.Ponadto, w badaniach nad zwalczaniem gruczolakoraka CA 755 siarczan C-3 karboksamidu 4-dezacetylo¬ winblastyny dawal 67% zahamowanie wzrosty nowotworu, siarczan C-3 N-metylokarboksamidu 4-dezacetylo¬ winblastyny 61% zahamowanie, zas siarczan C-3 karboksamidu winblastyny 49% zahamowanie przy dawce 0,25 mg/kg w ciagu 8 dni i 72% zahamowanie przy dawce 0,3 mg/kg. W podobnym tekscie winblastyna dawala 31%-we zahamowanie, zas leurokrystyna przy zblizonej dawce 0,2 mg/kg dawala zahamowanie 79%, przy dosko¬ nalej ogólnej ocenie efektywnosci. W przypadku zwalczania limfocytowej bialaczki L5178Y siarczan C-3 karbo¬ ksamidu winblastyny przy dawce 0,25 mg%kg w ciagu 10 dni w tescie przy uzyciu pieciu myszy dal trzy prze¬ zycia nieokreslonej dlugosci; okres zycia dwóch chorych myszy zostal przedluzony o 26% w stosunku do zwie¬ rzat kontrolnych. W tym samym eksperymencie winblastyna dala 36% przedluzenia zycia, lecz nie dala ani jed¬ nego przezycia o nieokreslonym okresie, co upowaznilo do okreslenia jej jako bardzo malo efektywnej.Zgodnie z oczekiwaniami amidy i hydrazyny róznia sie swoim spektrum przeciwnowotworowym od winblastyny, leurokrystyny i leurozydyny, podobnie jak i od estrów C-4, N,N-dwualkiloglicylowych winblastyny w ten sam sposób, jak spektra'nowotworowe tych zwiazków róznia sie miedzy soba; niektóre z nich sa bardziej efektywne przeciwko niektórym nowotworom lub klasom nowotworów, a mniej efektywne w dzialaniu przeciw¬ ko innym* Przy wykorzystaniu amidów i hydrazydów jako srodków przeciwnowotworowych stosowac mozna zarów¬ no podawanie poza jelitowe jak i doustne. Dla uzytku doustnego odpowiednia ilosc farmaceutycznie dopuszczal¬ nej soli zasady o wzorze przedstawionym na rysunku, z wyjatkiem tych, w których R oznacza NH-NH2 utworzonej z nietoksycznym kwasem miesza sie ze skrobia lub innym rozczynnikiem i mieszanine umieszcza sie w teleskopowo skladanych kapsulkach zelatynowych, zawierajacych kazda 7,5-50 mg skladnika aktywnego.Podobnie sól o dzialaniu przeciwnowotworowym mozna mieszac ze skrobia, srodkiem wiazacym i srodkiem smarujacym i mieszanine te prasowac w tabletki zawierajace od 7,5-50 mg. Tabletkom tym mozna nadac wyzlobienia ulatwiajace ich dzielenie, jesli przewiduje sie stosowanie nizszych dawek.Sposród metod podawania pozajelitowego najbardziej korzystne jest podawanie dozylne. Dlatego tez stosuje sie izotoniczne roztwory zawierajace od 1 do 10 mg/ml soli omawianych amidów indolowo-dwuwodoro-90 467 5 indolowych o wzorze przedstawionym na rysunku, z wyjatkiem hydrazydów. Zwiazki te podaje sie w dawce od okolo 0,1 do 1 mg/kg wagi ciala w ciagu 1 tygodnia zaleznie zarówno od aktywnosci uzytego zwiazku, jak i od jego toksycznosci. Wolne zasady zwiazków o wzorze przedstawionym na rysunku, w którym R oznacza grupe NH-NH2 przygotowuje sie 4 odpowiedniej postaci i podaje w sposób i w dawkach podobnych do pozostalych zwiazków.O ile wiekszosc zwiazków wytworzonych sposobem wedlug wynalazku jest uzyteczna jako leki przeciwno- wotworowe i przeciwwirusowe, to hydrazydy, zwiazki o wzorze przedstawionym na rysunku, w którym R oznacza grupe NH-NH2 sa takie uzyteczne jako zwiazki posrednie, co juz uprzednio stwierdzono. Hydrazyd mozna przeprowadzic w azydek w wyniku reakcji ze srodkiem nitrozujacym lub tez bezposrednio w amid na drodze hydrogenolizy. : Przy k,l ad I. C-3 N-metylokarboksamid winblastyny iC-3 N-metylokarboksamid 4-dezacetylowinblas- tyny. < Przygotowano roztwór o temperaturze —78°C zawierajacy 21 g metyloaminy w 199 ml bezwodnego metanolu. Do roztworu tego dodano okolo 3,5 kg winblastyny. Reaktor zamknieto i umieszczono w temperatu¬ rze 50°C utrzymywanej lazni w ciagu 8 dni. Nastepnie reaktor otworzono i skladniki lotne odparowano przez odparowanie pod próznia. Widmo MRJ i w podczerwieni wykazaly, ze pozostalosc jej mieszanina C-3 N-metylo- karboksamidu 4-dezacetylowinblastyny i 4-dezacetylowinblastyny. Pozostalosc rozpuszczono w 100 ml pirydy¬ ny i dodano 20 ml bezwodnika octowego. Otrzymany roztwór utrzymywano w temperaturze otoczenia przez okolo 18 godzin. Skladniki lotne usunieto przez odparowanie pod próznia, a uzyskana pozostalosc oczyszczano metoda chromatograficzna na tlenku glinu, stosujac jako element mieszanine octanu etylu i chloroformu (1 :1).Frakcje zawierajace C-3 N-metylokarboksamid winblastyny, co stwierdzono metoda chromatografii cienkowar¬ stwowej, polaczono i rozpuszczalnik odparowano z nich pod próznia.Powyzsza metoda acylowania nie tylko powtórnie acyluje grupe hydroksylowa C-4, lecz takze powoduje zacytowanie grupy hydroksylowej C-3. Grupe acetylowa przy weglu C-3 usuwa sie metoda Hargrove'a, Lloydja, 27, 340 (1964), polegajaca na tym, ze produkt zawierajacy substancje acylowana w polozeniu C-3 poddaje sie dzialaniu zelu krzemionkowego w wodnym roztworze metanolu w temperaturze pokojowej w czasie od 6 godzin do kilku dni, co daje produkt pozbawiony funkcji acetylowej w polozeniu C-3. W opisywanym szczególnym przypadku pozostalosc z polaczonych poszczególnych frakcji chromatograficznych rozpuszczono w 50 ml metanolu. Nastepnie dodano 20 ml wody i 2 g zelu krzemionkowego. Otrzymana mieszanine przesaczono i filtrat odparowano do sucha pod próznia, zas pozostalosc rozdzielono chromatograficznie na zelu krzemionkowym, stosujac jako eluent mieszanine benzenu, chloroformu i trójetyloaminy (10Q: 50 :7,5). Frakcje zawierajace pozadany C-3 N-metylokarboksamid winblastyny polaczono i rozpuszczalnik usunieto przez odparowanie pod próznia. Pozostalosc rozpuszczono w wodnym roztworze metanolu i pH roztworu doprowadzono do wartosci 2,9 za pomoca 1% kwasu siarkowego. Odparowanie otrzymanej mieszaniny pod próznia dalo siarczan C-3 N-metylokarboksamidu winblastyny, który krystalizowany z bezwodnego etanolu dal substancje o temperaturze topnienia z rozkladem 272—275°C.Widmo w podczerwieni C-3 N-metylokarboksamidu winblastyny w postaci wolnej zasady uzyskane w opisa¬ ny wyzej sposób wykazuje obecnosc pasma przy 1672 cm"1 (nie wystepujace w widmie winblastyny) wskazujace na obecnosc grupy amidowej. Widmo MRJ pozostawalo w pelnej zgodnosci z widmem przewidywanym dla struktury C-3 N-metylokarboksamidu winblastyny, wlaczajac w to nowoprowadzona grupe N-metylokarboksami- dowa, reprezentowana przez wyrazny rezonans grupy metylowej przy 2,81 ppm. * C-3 N-metylokarboksamid 4-dezacetylowinblastyny wyizolowano z mieszaniny 4-dezacetylowinblastyna wytworzona w etapie tworzenia amidu. Wyodrebnienie prowadzono w sposób nastepujacy. Pozostalosc otrzyma¬ na przez zatezenie (przed powtórnym acetylowaniem) mieszaniny reakcyjnej do sucha, pod próznia poddano oczyszczeniu chromatograficznemu na zelu krzemionkowym, stosujac jako eluent wspomniana wczesniej mieszanine rozpuszczalników benzen-chloroformylo-trójetyloamina. Frakcje, które w chromatografii cienkowar¬ stwowej wykazaly zawartosc C-3 N-metylokarboksamidu 4-dezacetylowinblastyny polaczono i rozpuszczalnik odparowano znich pod próznia, uzyskujac N-metylokarboksamid jako bezpostaciowe cialo stale. Widmo w podczerwieni tego zwiazku wykazalo pasmo przy 1672 cm"1, charakterystyczne dla grupy amidowej. Brak grupy acetylowej w polozeniu 4 potwierdzony zostal przez brak rezonansu charakterystycznego dla tej grupy przy 2,1 ppm w widmie MRJ (wystepujace w widmie winblastyny). Ciezar czasteczkowy okreslony metoda spektroskopii masowej wyniósl 767, co pozostalo w zgodnosci z wartoscia teoretyczna obliczona dla C44Hs7Ns07.Sól kwasu siarkowego C-3 N-metylokarboksamidu 4-dezacetylowinblastyny wytworzono metoda opisana dla wytworzenia siarczanu N-metylokarboksamidu winblastyny. Otrzymany produkt stanowia bezpostaciowe, rozpuszczalne w wodzie ciala stale.Postepujac w sposób opisany powyzej rozpuszczono 2 g 4-dezacetylowinblastyny w 75 ml bezwodnego metanolu i20g etyloaminy. Reaktor zamknieto i ogrzewano do temperatury okolo 60°C przez okres okolo6 90 467 8 dni. C-3 N-etylokarboksamid 4-dezacetylowinblastyny otrzymany w ten sposób wydzielono na drodze chroma¬ tografii cienkowarstwowej. Otrzymane cialo stale wykazywalo w widmie podczerwieni pasmo absorpcyjne przy '-1670 cm"1, charakterystyczne dla podstawionej grupy karboksamidowej.Przyklad II. Wytwarzanie C-3 karboksamidu 4-dezacetylowinblastyny.Okolo 10 g siarczanu winblastyny przeprowadzono znanymi metodami w wolna zasade winblastynowa.Wolna, zasade, otrzymana jako pozostalosc po odparowaniu wytraconego ekstraktu eterowego rozpuszczono w okolo 200 ml bezwodnego metanolu. Nastepnie dodano 300 ml bezwodnego cieklego amoniaku, reaktor zamknieto i utrzymywano w temperaturze okolo 100°C w ciagu 60 godzin. Nastepnie reaktor otwarto i zawar¬ tosc usunieto, po czym odparowano do sucha pod próznia. Otrzymana pozostalosc rozdzielono chromatograficz¬ nie i frakcje zawierajace C-3 karboksamid 4-dezacetylowinblastyny, co stwierdzono metoda chromatografii cienkowarstwowej, polaczono i rozpuszczalnik odparowano z nich pod próznia. Uzyskano w ten sposób jako pozostalosc oczyszczony C-3 karboksamid 4-dezacetylowinblastyny w postaci wolnej zasady. Widmo MRJ i w podczerwieni dla stalej wolnej zasady potwierdzily zalozona strukture. Wolna zasada wykazywala pasma absorpcyjne w podczerwieni przy 1687 cm-1, charakterystyczne dla grupy amidowej. Ciezar czasteczkowy wolnej zasady okreslony na drodze spektroskopii masowej wynosil 753, co pozostaje w zgodnosci z wartoscia teoretyczna obliczona dla C4 3H5 c Ns 07. 600 mg powyzszej pozostalosci przeprowadzono w siarczan zgodnie z metoda opisana w przykladzie I.Odparowanie mieszaniny reakcyjnej do sucha dalo siarczan C-3 karboksamidu 4-dezacetylowinblastyny, który po krystalizacji z mieszaniny etanolu z izopropanolem stanowil cialo stale o temperaturze topnienia powyzej 250°C (z rozkladem). Sól ta jest dobrze rozpuszczalna w wodzie.C-3 karboksamid 4-dezacetylowinblastyny przeprowadzono w C-3 karboksamid winblastyny metodami opisanymi w przykladzie I w sposób nastepujacy: 2,8 g C-3 karboksamidu 4-dezacetylowinblastyny w postaci womej zasady acylowano mieszanina bezwodnej pirydyny i bezwodnika octowego. Mieszanine reakcyjna utrzymywano przez 3 dni w temperaturze pokojowej. Lotne skladniki usunieto przez odparowanie pod próznia a pozostalosc rozpuszczono w chlorku metylenu. Roztwór w chlorku metylenu przemyto woda, wysuszono i odparowano do sucha, uzyskujac jako pozostalosc C-3 karboksamid winblastyny. Amid ten oczyszczono na drodze chromatografii na zelu krzemionkowym, stosujac jako eluent mieszanine octanu etylu i etanolu (1 :1).Frakcja wykazujace w chromatografii cienkowarstwowej obecnosc C-3 karboksamidu winblastyny polaczono i rozpuszczalnik usunieto przez odparowanie pod próznia. Otrzymano w ten sposób jako pozostalosc C-3 karboksamid winblastyny w postaci wolnej zasady. Ta wolna zasada posiadala charakterystyczne dla grupy amidowej pasma w widmie w podczerwieni wystepujace przy okolo 1700 cm-1. Ciezar czasteczkowy okreslono na drodze spektroskopii mas; wynosil on 795, co pozostaje w zgodnosci z wartoscia teoretyczna obliczona dla C45H57N508. Siarczan C-3 karboksamidu winblastyny wytworzono metoda opisana w przykladzie I i po krystalizacji z etanolu otrzymano cialo stale o temperaturze topnienia powyzej 250°C.Przyklad III. C-3 karboksyhydrazyd 4-dezacetylowinblastyny.Zgodnie ze sposobem opisanym w przykladzie I 4-dezacetylowinblastyne ogrzewano w bezwodnym etano¬ lu z nadmiarem bezwodnej hydrazyny w zamknietym naczyniu reakcyjnym w temperaturze ekolo 60°C w ciagu okolo 18 godzin. Reaktor ochlodzono i otwarto, zawartosc usunieto i lotne skladniki odparowano pod próznia.Otrzymana pozostalosc zawierajaca C-3 karboksyhydrazyd 4-dezacetylowinblastyny umieszczono w chlorku metylenu i roztwór ten przemyto woda, rozdzielono i wysuszono, po czym chlorek metylenu odparowano pod próznia. Otrzymana pozostalosc rozpuszczono w mieszaninie chloroformu i benzenu (1 :1) i poddano oczyszcza¬ niu chromatograficznemu na zelu krzemionkowym. Jako eluent stosowano, podobnie jak w przykladzie I, mieszanine benzenu, chloroformu i trójetyloaminy. Pierwsze frakcje chromatograficzne zawieraly nieprzereago- wana 4-dezacetykwinblastyne. Dalsze frakcje, jak stwierdzono, zawieraly C-3 karboksyhydrazyd 4-dezacetylo- -18-dezkarbometoksywinblastyny, uprzednio opisany przez Neussa i innych. Tetrahedron Letters, 1968, 783.Dalsze frakcje, co stwierdzono w wyniku chromatografii cienkowarstwowej zawieraly C-3 karboksyhydrazyd 4-dezacetylowinblastyny. Frakcje te polaczono i rozpuszczaniki odparowano pod próznia. Otrzymano cialo stale o temperaturze topnienia 210-220°C z rozkladem. Tak wytworzony C-3 karboksyhydrazyd 4-dezacetylowin¬ blastyny wykazywal w widmie w podczerwieni pasmo absorpcyjne charakterystyczne dla grupy karbometoksylo- wej przy 1726-1736 cm"1, przy czym odróznial sie od zwiazku 18-dezkarbometoksylowego, opisanego przez Neussa i innych. W widmie w podczerwieni wystepowalo równiez pasmo przy 1690 cm'1 przypisywane grupie hydrazydowej. Ciezar czasteczkowy okreslono metoda spektrografii mas. Wynosil on 768, co zgadza sie z wartoscia teoretyczna obliczona dla C4 aHf *Nt07. Widmo MRJ wykazywalo wyrazny rezonans przy 3,6 ppm zwiazany z grupa metylowa w ugrupowaniu karfaometoksylowym C-18.Zgodnie z powyzsza procedura 4-dezacetyloleurokrystyna otrzymana metoda Hargrove'a (patent Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3392173) poddano reakcji z bezwodna hydrazyna w bezwodnym metanolu uzysku-90467 7 jac C-3 karboksyhydrazyd 4-dezacetyh-1-leufokrystyny jako bezpostaciowy proszek. Widmo w pod- czttwkfiH wykazywalo maksimum przy 1730 cm'1 (ester), 1670 om'1 (hydrazyd). Widmo jonów czasteczko¬ wych: m(e»754i zgodne ze wzorem C42 H54N407h MRJ: 3,60 (metylo Clt), 3.74 (metyl Cl£)e 4,05 (wodór C4), 6,34 (wodór amidowy).Przyklad IV. C-3 N-metytokarboksamkJ4HJez3C»tyloletrokrystyfry. • Roztwór 900 mg leurokrystyny w 473 ml bezwodnego metanolu nasycono gazowym chlorowodorem . w temperaturze okolo 0°C. Kolbe zamknieto nastepnie rurka suszaca i ogrzewano do temperatury pokojowej. Po utrzymywaniu mieszaniny w tej temperaturze przez okolo 24 godziny lotne skladniki usunieto przez odparowa¬ nie pod próznia, a pozostalosc rozpuszczono w wodzie. Roztwór wodny tak uzyskany zalkalizowano 14 n wodorotlenkiem amonu i nierozpuszczone w nim zasady ekstrahowano chlorkiem metylenu. Ekstrakty w chlorku metylenu polaczono wysuszono i odparowano do sucha pod próznia. Otrzymana pozostalosc, zawierajaca 4-dezacetylo-1-dezformyloleurokrystyne stanowila jasno brazowe, bezpostaciowe cialo stale. Ciezar czasteczko¬ wy okreslony na drodze spektrografii mas wynosil 754, co zgadza sie z obliczeniami dla C43H54N408.W widmie w podczerwieni brak bylo pasma przy 1670 cm"1, charakterystycznego dla grup 1-formylowych natomiast wystepowalo silne pasmo przy 1730 cm"1, charakterystyczne dla absorpcji przez grupe estrowa.Podobnie w widmie MRJ stwierdzono piki przy 3,61 ppm i 3,85 ppm, charakterystyczne dla dwóch grup karbometoksylowych; istnial równiez dodatkowy pik przy 4,11 charakterystyczny dla protonu w polozeniu (M.Sporzadzono roztwór zawierajacy 500 mg 4-dezacetylo-1-dezformyloleurokrystyny wytworzonej w sposób opisany powyzej w 75 ml bezwodnego metanolu, uprzednio nasyconego metyloamina w temperaturze -78°C (ilosc metyloaminy wynosila okolo 20 g). Naczynie reakcyjne zamknieto i ogrzewano do temperatury 60°C przez okolo 1 tydzien. Lotne skladniki usunieto nastepnie przez odparowanie pod próznia, otrzymujac C-3 N-me tylokarboksamid-4-dezformyloleurokrystyny w postaci jasno brazowego bezpostaciowego ciala stalego. Spek¬ trografia w podczerwieni powyzszego zwiazku wykazala silne pasmo amidowe przy 1666 cm"1, obok pasma estrowego przy 1730 cm"1. fc-3 N-metylokarboksamid 4-dezacetylo-1-dezformyloleurokrystyny wytworzony w powyzszy sposób pod¬ dano formylowaniu za pomoca mieszaniny 24 ml 97% kwasu mrówkowego i 2 ml bezwodnika kwasu octowego.Mieszanine reakcyjna pozostawiono w temperaturze pokojowej przez okres okolo 24 godzin, po czym usunieto pod próznia skladniki lotne. Takotrzymana pozostalosc rozpuszczono w wodzie i roztwór wodny zalkalizowano 14 n wodorotlenkiem amonu. Zasady amonowe nierozpuszczalne w roztworze alkalicznym ekstrahowano chlorkiem metylenu. Ekstrakty chlorku metylenu polaczono, wysuszono i usunieto chlorek metylenu przez odparowanie pod próznia, otrzymujac C-3 N-metylokarboksamid 4-dezacetyloleurokrystyny jako jasno brazowe, bezpostaciowe cialo stale o nastepujacej charakterystyce: Ciezar czasteczkowy wyznaczony metoda spektrografii mas 781, co pozostaje w zgodnosci zwartoscia teoretyczna obliczona dla C-3 N-metylokarboksamidu 4-dezacetyloleurokrystyny, C44 H5 5 Ns 0B.Widmo MRJ wykazalo piki przy 3,65 ppm, charakterystyczne dla grupy karbometoksylowej i przy 2,99 ppm, charakterystyczne dla grupy N-metylokarboksamidowej.Widmo w podczerwieni zawieralo silne pasmo amidowe przy 1678 cm'1, wskazujac na obecnosc wiecej niz jednej grupy amidowej w czasteczce, oraz charakterystyczne pasmo estrowe przy 1728 cm"1.Metoda opisana w przykladzie I wolna zasade C-3 N-metylokarboksamidu 4-dezacetyloleurokrystyny przeprowadzono w odpowiedni siarczan za pomoca 1% kwasu siarkowego. Siarczan ten stanowil bialy, bezpostaciowy proszek.W opisany wyzej sposób mozna wytworzyc inne pochodne amidowe C-3 N-metylokarboksamidu 4-dezace- tylo-1-dezformyloleurokrystyny przez zastapienie srodka formylujacego bezwodnikiem octowym lub propiono- wym, wytwarzajac odpowiednie C-3 karboksamidowe pochodne 4-dezacetyló-1-dezformylo-1-acetylo (lub 1-pro- pionylo)-leurokrystyny. Niespodziewanie powtórne acylowanie 4-dezacetyloleurokrystyny nie wplywa na grupe 1-formyIowa, która pozostaje nie zmieniona w calym procesie syntezy.Przyklad V. C*3 karboksyhydrazyd 4-dezacetyloleurozydyny.Metoda opisana w przykladzie 111 poddano reakcji 1500 mg leurozydyny 25 ml bezwodnej hydrazyny w roztworze bezwodnym metanolu. Mieszanine reakcyjna zamknieto w reaktorze, ogrzewano do temperatury 50°C przez okres 12 dni. Odparowanie lotnych skladników pod próznia dalo C3 karboksyhydrazyd 4-dezacety¬ loleurozydyny o nastepujacych charakterystycznych wlasnosciach fizycznych: maksima absorpcyjne w podczer¬ wieni przy: 1735 cm"1 (ester), 1660 cm"1 (hydrazyd); ciezar czasteczkowy okreslony metoda spektrometrii mas- 768 (zgodny ze wzorem C4 3 H5 6 N$07).P r z y k lra d VI. Wytwarzanie soli.Inne sole, w tej liczbie sole zawierajace nieorganiczne aniony, takie jak chlorki, bromki, fosforany, azotany, itp., oraz amidy organiczne, takie jak octany, chlorooctany, trójchlorooctany, benzoesany, a Ikilo- lub arylosu lfo-8 90 467 niany, itp. wytwarzane z zasad amidowych metoda analogiczna do opisanej w przykladzie I dla wytwarzania siarczanu przez zastapienie 1% wodnego roztworu kwasu siarkowego odpowiednim kwasem w odpowiednim rozcienczalniku. < Wiadomo, ze obecnosc innych grup estrowych i/lub amidowych w ukladzie indolowodwuhydroindolowym wymaga dodatkowej ostroznosci przy wytwarzaniu soli, aby zapobiec wytwarzaniu soli, przeestryf ikowaniu i innym reakcjom, które zachodza w podwyzszonych temperaturach, przy bardzo kwasowym pH, itp.Tablica Zwiazek Nowotwór Dawka mg/kgX liczba dni Procentowe inh ibitowanie Siarczan C-3 N-metylokarboksamidu 4-dezacetylowinblastyny Siarczan C-3 karboksamidu Winblastyny Siarczan C-3 N-metylokarboksamidu 4-dezacetyloleuro krystyny Siarczan C-3 karboksamidu 4-dezacetylowinblastyny Siarczan C-3 N-etylokarboksamidu 4-dezacetylowinblastyny Siarczan C-3 N-metylokarboksamldu Winblastyny Karboksyhydrazyd C-3 4-dezacetylowinblastyny Siarczan C-3 karboksamidu 4-dezacetyloleurokrystyny CfH ROS GLS ROS GLS CA755 CfH GLS ROS GLS ROS GLS ROS GLS ROS ROS GLS ROS 0,25-0,3X9 0,15-0,3X10 0,05-0,4X6 0.1-0,5X10 0,05-0,6X8 1,0X9 1,0X9 0,3-1,0X8 0,3-1,0X10 0,15-1,0X10 0,15-0,4X10 0,2X7 0,2-0,4X7 0,1-0,25X6 0,1-0,3X10 0.1-0.3X8-10 0.2-0,4X10 5X10 -49 48-100 60-100 23-84 47-100 76 36 57-100 39-100 79-100 49-100 90 53-100 38-100 57-100 49-100 73-100 32 PL