Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych polipeptydów lub pochodnych polipeptydów o wzorze ogólnym przedstawionym na rysunku, w którym X oznacza atom wodoru, grupe aminowa, grupe R-CO-NH-, w której R oznacza alkil, ewentualnie podstawiony aralkil lub ewentualnie podstawiony aryl lub grupe R'OC-CO-NH-, w której R' oznacza alkil, alkenyl, ewentualnie podstawiony aralkil lub ewentualnie podstawiony aryl, przy czym reszta R' nie daje sie odszczepiac za pomoca kwasu trójfluorooctowego, a Y oznacza amid L-proliny lub amid L-prolino-L-waliny, oraz w którym reszta L-serylowa moze byc wymieniona na reszte L-treonylowa lub L-alanylowa, reszta L-asparaginylowa moze byc wymieniona na reszte L-aspartylowa, L-glutaminylowa lub L-glutamylowa, reszta L-treonylowa moze byc wymieniona na reszte L-serylowa lub L-alanylowa, reszta L-lizylowa moze byc wymieniona na reszte BOC-lizylowa, L-ornitylowa lub L-araginylowa, reszta L-glutaminylowa moze byc wymieniona nareszte L-glutamylowa, L-asparaginylowa lub L-aspartylowa, reszta L-glutamylowa moze byc wymieniona na reszte OTB-glutamylowa, L-glutaminylowa, L-asparaginylowa lub L-aspartylowa, reszta L-leucylowa moze byc wymieniona na reszte L-tyrozylowa, reszta L-tyrozylowa moze byc wymienion na reszte L-fenyloalanylowa oraz reszta L-arginylowa moze byc wymieniona na reszte L-ornitylowa lub L-lizylowa, jak równiez terapeutycznie aktywnych soli addycyjnych z kwasami i kompleksów z metalami ciezkimi wymienionych zwiazków.W przypadku gdy X oznacza grupe -NH2, R-CO-NH- lub R'-0-CO-NH-, to aminokwas HS- CH2-CHX-COOH wystepuje w postaci L.Podstawnik R moze np. oznaczac grupe metylowa, etylowa, propylowa, III—rzed.butyIowa lub ewentual¬ nie podstawiona atomem chlorowca, nizsza grupa alkoksylowa lub grupa nitrowa grupe fenylowa lub benzylowa.Podstawnik R' moze np, oznaczac grupe propylowa, allilowa, benzylowa, p-nitrobenzylowa, p-chloroben- zylowa, p-bromobenzylowa grupe p-azobenzylowa lub p-metoksyazobenzylowa.W sekwensach polipeptydowych o wyzej podanym wzorze ogólnym pojedyncze aminokwasy moga byc wymienione przez inne naturalne aminokwasy lub ich pochodne.Tak wiec np. w pozycji 2, 5, 13 i 29 Ser moze byc zastapiony przez Thr lub Ala, w pozycji 3 i 26 Asn przez Asp, Gin lub Glu, w pozycji 6, 21, 25, 27 i 31 Thr przez Ser lub Ala, w pozycji 11 i 18 Lys przez BOC-Lys,Orn2 90 224 lub Arg, w pozycji 14 i 20 Gin przez Glu, Asn lub Asp, w pozycji 15 Glu przez OTB—Glu, Gin, Asn lub Asp, w pozycji 19 Leu przez Tyr, w pozycji 22 tyr przez Phe i w pozycji Arg przez Orn lub Lys.Wedlug wynalazku polipeptydy lub pochodne polipeptydów o wyzej podanym wzorze ogólnym wytwarza sie w ten sposób, ze wymienione w powyzszym wzorze aminokwasy wzglednie ich pochodne kondensuje sie w kolejnosci podanej w tym wzorze pojedynczo lub po utworzeniu mniejszych jednostek peptydowych, przy czym aminokwas lub peptyd ochronionej grupie a-aminowej i aktywowanej koncowej grupie karboksylowej poddaje sie reakcji z aminokwasem lub peptydem o wolnej grupie a-aminowej i wolnej lub chronionej koncowej grupie karboksylowej, a aminokwas lub peptyd o aktywowanej grupie a-aminowej i chronionej koncowej grupie karboksylowej poddaje sie reakcji z aminokwasem lub peptydem o wolnej koncowej grupie karboksylowej i chronionej grupie a-aminowej, przy czym wolne grupy funkcyjne nie biorace udzialu w reakcji równoczesnie chroni sie, po zakonczeniu kondensacji odszczepia zbedne grupy ochronne, przy czym w wolnym momencie syntezy grupe karboksylowa wystepujacej w polozeniu koncowym reszty Pro wzglednie Pro-Val przeprowadza sie po jej zaktywowaniu w grupe amidowa droga reakcji z amoniakiem, grupe merkapto po utworzeniu sekwencji czesciowej 1—7 utlenia sie, w przypadku, gdy w polozeniu 1 wystepuje grupa merkapto-propionylowa, przed utlenianiem grup merkapto wystepujaca w polozeniu 2 grupe L-Ser albo czesci skladowe peptydu zawierajace te grupe L—Ser kondensuje sie z ewentualnie aktywowana pochodna kwasu propionowego i tak otrzymane produkty koncowe przeprowadza sie w znany sposób za pomoca organicznych lub nieorganicznych kwasów w terapeutycznie czynne sole addycyjne z kwasami albo w kompleksy z metalami ciezkimi.Grupe karboksylowa mozna np. zaktywowac przez przeprowadzenie w azydek, bezwodnik, imidazolid, izoksazolid kwasowy lub w aktywny ester albo przez reakcje z karbodwuimidem lub N,N'-karbonylodwuimidazo- lem. Korzystnie jako metode kondensacji stosuje sie metode karbodwuimidowa, azydowa, metode aktywowa¬ nych estrów, metode bezwodnikowa lub metode Merrifielda.Wprowadzenie ewentualnej pozadanej w produkcie koncowym grupy ochronnej do koncowej czasteczki L-hemicystyny moze nastapic w dowolnym etapie przed ostatnim etapem.W ostatnim etapie kondensacji nalezy jednak zastosowac metody, przy których racemizacjanie wystepuje, lub moze byc utrzymana na nieznacznym poziomie, korzystnie przez stosowanie azydków lub aktywowanych estrów, przy czym aktywacja moze byc dokonana korzystnie za pomoca N-hydroksysukcynimidu.Nie biorace udzialu w reakcji wolne, funkcyjne grupy moga byc chronione przy syntezie peptydów sposobem wedlug wynalazku w nastepujacy sposób. Dla zablokowania grupy guanidowej reszty argininowej w ponizej opisanym sekwensie skladowym B zastosowano grupe nitrowa, ale mozna równiez stosowac inne nadajace sie grupy ochronne, takie jak grupa tozylowa, grupa p-nitrokarbobenzoksylowa lub grupa 2-(izopropylo ksykarbonylo)-3,4,5,6-czterochlorobenzoilowa. Mozna równiez zastosowac w syntezie efekt ochronny protoni- zacji grupy guanidowej.W syntezie polipeptydów lub pochodnych polipeptydowych dla blokowania grupy 7-karboksylowej, np. w ponizej opisanym sekwensie skladowym D, korzystna okazala sie grupa 11 l-rzed.-butoksyIowa, jednakze moga byc równiez zastosowane inne grupy ochronne, takie jak grupa metoksylowa, etoksylowa, lll-rzed. amyloksylo- wa, amidowa lub benzyloksylowa.Dla zablokowania grupy co-aminowej reszty lizyny, np. w ponizej opisanym sekwensie skladowym C, mozna stosowac grupe karbo-lll-rzed.-alkoksyiowa, korzystnie karbo-l I l-rzed.-butoksy Iowa.Jako grupy ochronne dla grup merkapto w ponizej opisanym sekwensie skladowym EF i EF3 stosuje sie korzystnie grupe benzylowa, lub trytylowa. Grupy benzylowe lub trytylowe zastosowane do ochrony grup SH zwykle odszczepia sie na koncu syntezy dzialaniem sodu w cieklym amoniaku. Stwierdzono, ze odszczepianie grupy ochronnej benzylowej wzglednie trytylowej, jak równiez wytwarzanie wiazania S—S przed ostatnim etapem prowadzi do szczególnie dobrych wydajnosci produktu koncowego.Przeprowadzenie chronionej grupy merkapto lub aminowej w wolna grupe, jak równiez przeksztalcenie funkcyjnie przeksztalconej grupy karboksylowej w wolna grupe karboksylowa w trakcie wytwarzania polipepty¬ dów nastepuje wedlug ogólnie znanych metod dzialaniem srodków hydrolizujacych wzglednie redukujacych.Wyjsciowe produkty do wytwarzania polipeptydów wzglednie pochodnych polipeptydów o ile dotad nie byly znane, moga byc otrzymane wedlug metod znanych w chenrmpeptydów, przy czym aminokwasy laczy sie ze soba pojedynczo lub po uprzednim wytworzeniu mniejszych jednostek peptydowych.Polipeptydy lub pochodne polipeptydów mozna uzyskiwac wzglednie stosowac równiez w postaci ich soli.Jako sole wchodza w rachube sole z organicznymi kwasami, takimi jak np. kwas octowy, mlekowy, bursztynowy, benzoesowy, salicylowy, metanosulfonowy. toluenosulfonowy, jak równiez polimerycznymi kwasami, takimi jak kwas garbnikowy lub karboksymetyloceluloza, oraz sole z nieorganicznymi kwasami, takimi jak kwasy chlorow- cowodorowe, np. kwas solny, lub kwas siarkowy i fosforowy. Jako kompleks metalu ciezkiego wchodzi np. w rachube kompleks cynku (Zn++).90 224 3 Sposobem wedlug wynalazku korzystnie postepuje sie tak, ze od 111 -rzed.butyloksykarbonylo-L-hemicystynylo-L-serylo-L-asparaginylo-L-leucylo-L-serylo—L-treonylo-L- hemicystynylo-L-walilo-L-leucyloglicylo-e-lll-rzed.-butoksykarbonylo-L-lizylo-L-leucylo-L-serylo-L- glutaminylo-y-butoksy-L-glutamylo-L-leucylo-L-histydylo-e^ L-glutaminylo-L-treonylo-L-tyrozylo-L-prolilo-L-arginylo-L-treonylo-L-asparaginylo-L-treonylo-glicylo L-seryloglicylo-L-treonylo-L-prolinamidu odszczepia sie grupy ochronne otrzymujac L-hemicystynylo-L-serylo-L-asparaginylo-L-Leucylo-L-serylo-L-treonylo-L-hemicystynylo-L-walilo-L-leucylo- glicylo-L-lizylo-L-leucylo-L-serylo-L^lutaminylo-L^lutamylo-L-leucylo-L-histydylo-L-lizylo-L-leucylo L-glutaminylo-L-treonylo-L-tyrozylo-L-prolilo-L-arginylo-L-trenylo-L-asparaginylo-L-treonylo-glicylo ¦L-serylo-glicylo-L-treonylo-L-prolinamid, od lll-rzed.butyloksykarbonylo-L-hemicystynylo-L-serylo-L-asparaginylo-L-leucylo-L-serylo-L-treonylo-L- hemicystynylo-L-walilo-L-leucylo-glicylo-e-111-rzed.butoksykarbonylo-L-lizylo-L-leucylo-L-serylo-L- glutaminylo-L^|lutaminylo-L-leucylo-L-hi$tydylo-€-lll-rzed.butoksykarbonylo-L-lizylo-L-leucylo-L- glutaminylo-L-treonylo-L-tyrozylo-L-prolilo-L-arginylo-L-treonylo-L-asparaginylo-L-treonylo-glicylo-L- serylo-glicylo-L-treonylo-L-prolinamidu odszczepia sie grupy ochronne otrzymujac L-hemicystYfnylo-L-serylo-L-asparaginylo-L-leucylo-L-serylo-L-treonylo-L-hemicystynylo-L-walilo-L-leucylo -glicylo-L-lizylo-L-leucylo-L-serylo-glutaminylo-L-glutaminylo-L-leucylo-L-histydylo-L-lizylo-L- leucylo-L-glutaminylo-L-treonylo-L-tyrozylo-L-prolilo-L-arginylo-L-treonylo-L-asparaginylo-L-treonylo ¦glicylo-L-serylo-glicylo-L-treonylo-L-prolinoamid, od 111 -rzed.butyloksykarbonylo-L-hemicystynylo-L-serylo-L-asparaginylo-L-leucylo-L-serylo-L-treonylo- L-hemicystynylo-L-walilo-L-leucylo-glicylo-e-lll-rzed.butoksykarbonylo-L-lizylo-L-leucylo-L-serylo-L- glutaminylo-7-lll-rzed.butoksy-L-glutamylo-L-leucylo-L-histydylo-e-;il-rzed.butoksykarbonylo-L-lizylo -L-tyrozylo-L-glutaminylo-L-treonylo-L-tyroz/lo-Li3rolilo-L-arginylo-L-treonylo-Lnasparaginylo-L-treo nylo-glicylo-L-sery lo-glicylo-L-treonylo-L-prohnamidu odszczepia sie grupy ochronne, otrzymujac L-hemicystynylo-L-serylo-L-asparaginylo-L-leucylo-L-serylo-L-trenylo-L-hemicystynylo-L-walilo-L-leucylo glicylo-L-lizylo-L-leucylo-L-serylo-L-glutaminylo-L-glutamylo-L-leucylo-L-histydylo-L-lizylo-L- tyrozylo-L-glutaminylo-L-treonylo-L-tyrozylo-L-prolilo-L-arginylo-L-treonylo-L-asparaginy lo-L-treony lo-glicylo-L-serylo-glicylo-L-treonylo-L-prolinamid#od 11 l-rzed.butyloksykarbonylo-L-hemicystynylo-L- sery lo-L-asparaginylo-L-leucylo-L-sery lo-L-treonylo-L-hemicystynylo-L-walilo-L-leucyloglicylo-e lll-rzed.butoksykarbonylo-L-lizylo-L-leucylo-L-serylo-L-glutaminylo-L-glutaminylo-L-leucylo L-histydylo-e-l 11-rzed.butoksykarbonylo-L-lizylo-L-tyrozylo-L-glutaminylo-L-treonylo-L-tyrozylo-L-pro lilo-L-arginylo-L-treonylo-L-asparaginylo-L-treonylo-glicylo-L-serylo-glicylo-L-treonylo-L-prolinarnidu odszczepia sie grupy ochronne, otrzymujac L-hemicystynylo-L-serylo-L-asparginylo-L-leucylo-L-sery lo-L-treony lo-L-hemicystynylo-L-walilo-L-leucylo- glicylo-L-lizylo-L-leucylo-L-serylo-L-glutaminylo-L-glutaminy lo-L-leucy lo-L-histydylo-L-lizylo-L-tyro zylo-L-glutaminy lo-L-treonylo-L-tyrozylo-L-prolilo-L-arginylo-L-treonylo-L-asparaginylo-L-treonylo-gli cylo-L-serylo-glicylo-L-treonylo-L-prolinamid, od ]3merkaptopropionylo-L-serylo-L-asparaginylo-L-leucylo-L-serylo-L-treonylo-L-cysteinylo-L-walilo-L leucylo-glicylo-N-e-lll-rzed.butoksykarbonylo-L-lizylo-L-leucylo-L-serylo-L-glutaminylo^y-lll-rzed.butoksy- -L-glutamylo-L-leucylo-L-histydylo-N-e-l 11 -rzed.butoksykarbonylo-L-lizy lo-L-leucylo-L-glutaminylo-L-treonylo-L-tyrozylo -L-prolilo-L-arginylo-L-treonylo-L-asparaginylo-L-treonylo-glicylo-L-serylo-glicylo-L-treonylo-L-prolinamidu odszczepia sie grupy ochronne, otrzymujac ^-merkaptopropiony lo-L-serylo-L-asparaginylo-L-leucylo-L-serylo-L-trenylo-L-hemicystynylo-L-walilo- L-leucylo-glicylo-L-lizylo-L-leucylo-L-serylo-L-glutaminylo-L-glutamylo-L-leucylo-L-histydylo-L-lizylo -L-leucylo-L-glutaminylo-L-treonylo-L-tyrozylo-L-prolilo-L-arginylo-L-treonylo-L-asparginylo -L-treonylo-glicylo-L-serylo-glicylo-L-treonylo-L-prolinamid.Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalazku maja istotne terapeutyczne znaczenie. Obnizaja one poziom wapnia w surowicy krwi i jako zwiazki antagonistyczne hormonu paratowego powoduja pozytywny bilans wapnia w kosciach. Biologiczne dzialanie nowych zwiazków zbadano na szczurach, przy czym w wyniku obnizenia poziomu wapnia we krwi uzyskano wartosc 3 000-5 000 jednostek MRC na mg peptydu.Stosowana dawka zalezy od pozadanego dzialania, jak równiez od sposobu zastosowania. W ogólnosci uzyskuje sie jednak zadowalajace wyniki za pomoca jednej dawki dziennej wynoszacej 1—10 jednostek na kologram wagi ciala zwierzecia. Dla wiekszych ssaków dawka dzienna wynosi okolo 70—700 jednostek, które4 90 224 mozna podawac w jednej lub kilku porcjach. Do stosowania domiesniowego odpowiednia postac zawiera okolo 70—700 jednostek substancji aktywnej zmieszanej z cieklym nosnikiem.Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalazku sa wiec dzieki temu wskazane we wszystkich stanach, przy których pozadane jest obnizenie poziomu wapnia w surowicy krwi wzglednie wplywanie na przemiane materii kostnej, np. w hyperkalcemiach wskutek braku endogennej tyreokaloitoniny w wyniku niedoczynnosci tkanki gruczolu tarczycowego lub nadczynnosci gruczolów przytarczycznych. Ponadto sa one wskazane przy wszystkich schodzeniach kosci, polegajacych na wzmozonej odbudowie lub przy których pozadane jest utrwalenie wapnia w kosciach, np. przyosteoporozie róznego pochodzenia (np. postklimakterycznej.postrauma- tycznej wywolanej przez terapie kortikostero idowa lub brak aktywnosci itd. (zlamaniach, rozmiekczeniach kosci, krzywicy i dystrofii kostnej na podlozu nerkowym, jak równiez w szczególnosci dla terapii kombinacyjnej za pomoca wapnia wzglednie fosforanów.Korzystna strona polipeptydów wzglednie pochodnych polipeptydowych otrzymanych sposobem wedlug wynalazku o wzorze ogólnym podanym na rysunku, w którym X oznacza grupe R—CO—NH, w której R oznacza alkil, ewentualnie podstawiony aralkil lub ewentualnie podstawiony aryl lub grupe R'—O—CO—NH—, w której R oznacza alkil, alkenyl, ewentualnie podstawiony aralkil lub ewentualnie podstawiony aryl, jest ich trwalosc wzgledem odbudowujacego dzialania aminopeptydaz.Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalazku moga znalezc zastosowanie jako srodki lecznicze, np. w postaci farmacutycznych preparatów. Preparaty te zawieraja wymienione zwiazki w mieszaninie z organicznym lub nieorganicznym nosnikiem nadajacym sie do stosowania pozajelitowego. Moga byc one równiez podawane w postaci preparatów o przedluzonym dzialaniu.W opisie stosuje sie nastepujace skróty: Z = karbobenzoksy (benzyloksykarbonyl) Bzl = benzyl BOC = Ml-rzed.butyloksykarbonyl TrT = trytyl = trójfenylometyl OTB = lll-rzed.-butyloksy ONP = ester p-nitrofenylowy OCP = 2,4,5-trójchlorofenoksy OME = metoksy OEt = etoksy N02 = nitro Ser = L-seryl Asn = L-asparaginyl Leu = L-leucyl Thr = L-treonyl Val = L-walil Tyr = L-tyrozyl Arg = L-arginyl Gin = L-glutaminyl Glu = L-glutamyl His = L-histydyl Pro = L-prolil Gly = glicyl Cys = L-cysteinyl Piv = piwaloil MCP = /3-merkaptopropionyl OSu = N-oksysukcynimid EOC = etoksykarbonyl DCHA = dwucykloheksyloamina W nastepujacych przykladach, wszystkie temperatury podane sa w stopniach Celsjusza. Wartosc cprzy skrecalnosci optycznej wynosi 1. Analiza aminokwasów w nastepujacych przykladach wykazuje, ze pojedyncze aminokwasy wystepuja w oczekiwanych stosunkach.Przyklad I. Sekwens skladowy A: H-Ser-GlyThr-Pro-NH2. a) H-Thr-Pro-NH2 • HCI.Rozpuszcza sie w temperaturze — 5° 134g Z-Thr-NH-NH2 w 2 litrach 1 n kwasu solnego i zadaje 0,55 litra 1n azotynu sodowego. Po uplywie 5 minut dodaje sie weglanu potasowego do wartosci pH = 9, otrzymany90 224 5 azydek ekstrahuje sie za pomoca octanu etylu i dodaje sie roztwór 80 g H—Pro—NH2 • HCI w 100 ml wody, 500 ml dwumetyloformamidu i 77 ml trójetyloaminy. Odparowuje sie octan etylu w temperaturze 20° pod zmniejszonym cisnieniem i pozostawia na noc w temperaturze 25°. Pozostaly roztwór odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem, pozostalosc rozpuszcza sie w octanie etylu, roztwór przemywa sie woda, rozcienczo¬ nym kwasem solnym i wodnym roztworem weglanu potasowego i osusza nad siarczanem sodowym. Odparowuje sie pod zmniejszeniem cisnieniem, rozpuszcza w cieplym octanie etylu i oziebia. Otrzymuje sie Z—Thr—Pro-NH2; temperatura topnienia 148°, [a]fr° = —72° w 95% kwasie octowym. Nastepnie rozpuszcza sie 90 g Z—Thr—NH2 w 2 litrach dioksanu i 260 ml In kwasu solnego i uwodornia w temperaturze 20° pod normalnym cisnieniem w obecnosci katalizatora palladowego. Przesacza sie, odparowuje roztwór pod zmniejszo¬ nym cisnieniem, przemywa krystaliczna pozostalosc octanem etylu i otrzymuje H—Thr—Pro-NH2 • HCI; tempe¬ ratura topnienia 216°C, [a]o0 = —64° w 95% kwasie octowym. b) Z-Ser-Gly-NHNH2.Rozpuszcza sie 14,5 g Z—Ser—OH w 100 ml chloroformu i dodaje 6,1 g N-metylomorfoliny; nastepnie wkrapla sie 8,2 g estru izobutylowego kwasu chloromrówkowego. Po 10 minutach dodaje sie roztwór 6,5 g estru etylowego gliceryny w 50 ml chloroformu i,miesza wciagu 1 godziny w temperaturze pokojowej. Mieszanine reakcyjna przemywa sie rozcienczonym amoniakiem, potem roztworem kwasu solnego, osusza nad siarczanem sodowym i odparowuje faze organiczna. Przekrystalizowuje sie otrzymany Z-Ser-GlyOEt z octanu etylu.Temperatura topnienia 103°, [oJd0 = + 3° wdwumetyloformamidzie. Rozpuszcza sie 19,4g Z—Ser-Gly—OEt w 270 ml alkoholu etylowego, dodaje 27 ml wodzianu hydrazyny i pozostawia w ciagu dwóch dni w temperatu¬ rze pokojowej. Krystaliczna mase odsacza sie, przemywa metanolem i suszy. Otrzymuje sie Z—Ser—Gly-NHNH2,temperatura topnienia 180°, [a]o° = + 2° wdwumetyloformamidzie. c) H-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 Do 200 ml dwumetyloformamidu dodaje sie 25 ml 4n roztworu chlorowodoru w eterze etylowym i rozpuszcza sie w tym 11 g Z—Ser—Gly—NHNH2. Nastepnie wkrapla sie w temperaturze —10° 5,4 ml azotynu I ll-rzed.butylowego, dodaje sie roztwór 18 ml trójetyloaminy i nastepnie przesacza. Równoczesnie rozpuszcza sie 12 g H—Thr-Pro-NH2 • HCI w 100 ml dwumetyloformamidu, dodaje 6,2 ml trójetyloaminy, odsacza od wytraconego chlorowodorku trójetyloaminy i dodaje do przesaczu otrzymany wyzej roztwór azydku dwupepty- du. Pozostawia sie na okres 2 godzin w temperaturze 0°, odparowuje do sucha, rozpuszcza pozostalosc w mieszaninie 500 ml metanolu i 100 ml wody i przepuszcza sie otrzymany roztwór przez kolumne ze 100 ml Dowex—50 (postac H+). Odparowuje sie i przekrystalizowuje pozostalosc z metanolu/octanu etylu. Otrzymuje sie Z—Ser—Gly-Pro-NH2 o temperaturze topnienia 132° z rozkladem [a]o0 = —22° wdwumetyloformamidzie.Rozpuszcza sie 22 g Z-Ser-Gly—Thr—Pro-NH2 w mieszaninie 440 ml metanolu i 88 ml wody i uwodornia w temperaturze 20° pod cisnieniem normalnym w obecnosci palladu osadzonego na weglu. Nastepnie przesacza sie odparowuje od sucha, pozostalosc przemywa sie eterem i suszy.Otrzymuje sie H—Ser—Gly—Thr—Pro—NH2 o temperaturze topnienia 95° z rozkladem [ajp0 = —27° w dwumetyloformamidzie.Sekwens skladowy B: BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH2 a) Z-Asn-Thr-Gly-OEt.Rozpuszcza sie 43 g Z—Thr—Gly—OEt w 500 ml dwumetyloformamidu i uwodornia pod normalnym cisnienia w temperaturze pokojowej w obecnosci palladu osadzonego na weglu. Przesacza sie, dodaje 60 g Z—Asn—OCP# pozostawia w ciagu 16 godzin w temperaturze 25°, zateza do okolo 250 ml dodaje octanu etylu, przemywa za pomoca rozcienczonego kwasu solnego, suszy nad siarczanem sodowym i odparowuje do sucha.Pozostalosc przemywa sie octanem etylu i suszy. Otrzymuje sie Z—Asn—Thr—Gly—OEt. Temperatura topnienia 225°,[a]fc° = —4° wdwumetyloformamidzie. b) Z-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt.Rozpuszcza sie 29 g Z-Asn-Thr-Gly—OEt w 700 ml dwumetyloformamidu, uwodornia pod normalnym cisnieniem w temperaturze pokojowej w obecnosci palladu osadzonego na weglu, przesacza i zadaje przesacz za pomoca Z-Thr—N3, wytworzonego z 30 g Z-Thr-NHNH2 (patrz sekwens skladowy A a)). Po uplywie 2 godzin w temperaturze 0° odparowuje sie do sucha, przemywa pozostalosc za pomoca wody. eteru i etanolu. Otrzymuje sie Z—Thr-Asn—Thr-Gly—OEt o temperaturze topnienia 230°, [aft0 = -8° w dwumetyloformamidzie. c) BOC-Arg(N02)-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH2 Rozpuszcza sie 22 g Z-Thr—Asn—Thr—Gly-OEt w 700 ml dwumetyloformamidu, uwodornia pod normal¬ nym cisnieniem w temperaturze pokojowej w obecnosci palladu osadzonego na weglu i przesacza. Rozpuszcza sie 23 g BOC-Arg(N02)-OH w,500 ml dwumetyloacetamidu, dodaje 12 ml trójetyloaminy, oziebia do temperatury —10°, dodaje 9,4 ml estru izobutylowego kwasu chloromrówkowego, pozostawia sie do reakcji na 10 minut i dodaje otrzymany powyzej roztwór czteropeptydu. Po uplywie 30 minut w temperaturze 25° dodaje sie 100 ml wody, traktuje sie otrzymany roztwór Amberlitem—IRA—410 (postac OH), az do negatywnej reakcji na chlor,6 90 224 przesacza i odparowuje do sucha/Przemywa sie pozostalosc za pomoca chloroformu, octanu etylu i eteru i suszy.Otrzymuje sie BOC-Arg(N02)-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt. Temperatura topnienia okolo 100°C„ [ot]o° = —4° w dwumetyloformamidzie.Rozpuszcza sie 12 g BOC-Arg(N02)-Thr-Asn-Thr-Gly-OEt w mieszaninie 200 ml kwasu octowego i 40 ml wody, uwodornia w obecnosci palladu osadzonego na weglu w temperaturze 20° pod normalnym cisnieniem, przesacza i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 20° do sucha. Rozpuszcza sie pozostalosc w dwumetyloformamidzie i odparowuje. Czynnosc te powtarza sie tak dlugo, az kwas octowy stanie sie niewykrywalny. Rozpuszcza sie pozostalosc w 120 ml dwumetyloformamidu, dodaje 6 ml wodzianu hydrazyny, pozostawia na okres 16 godzin w temperaturze 25°, odparowuje, przemywa pozostalosc eterem, metanolem (eterem) 1:1) i nastepnie znowu eterem i suszy. Otrzymuje sie BOC—Arg—Thr—Asn—Thr—Gly— NHNH2, temperatura topnienia 175°Cz rozkladem [a]d° = -42° w dwumetyloformamidzie (1 n HCI (1 : 1), Sekwens skladowy AB: H-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 • 2 CH3COOH Rozpuszcza sie 13,5 g BOC-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-NHNH2 (sekwens skladowy B) w 270 ml dwume¬ tyloformamidu (wody) (8:2), oziebia do temperatury —15°, dodaje 40 ml 4n roztworu kwasu solnego wdioksanie i 2,5 ml azotynu lll-rzed.-butylowego. Miesza sie wciagu 10 minut w temperaturze—15°, dodaje 28 ml trójetyloaminy, odsacza dodaje 10 5g H-Ser—Gly—Thr-Pro—NH2 (sekwens skladowy A), miesza sie w ciagu 16 godzin w temperaturze 0°. Nastepnie odparowuje sie do sucha, przemywa pozostalosc eterem i suszy.Rozpuszcza sie pozostalosc w metanolu, dodaje dziesiata czesc objetosci wody oraz siedmiokrotna ilosc chloroformu i przepuszcza sie otrzymany roztwór przez kolumne z 500 ml zelu krzemionkowego. Po eluowaniu wzrastajacymi ilosciami metanolu otrzymuje sie po odparowaniu BOC—Arg—Thr—Asn—Thr—Gly-Ser—Gly-Thr- —Pro-NH2. Zawiesza sie go w200 ml 4n roztworu kwasu solnego wdioksanie i miesza wciagu 2 godzin w temperaturze 25°. Odparowuje sie do sucha, rozpuszcza sie pozostalosc w0,2n kwasie octowym, zadaje amberlitem I RA—410 (postac octanowa) i,liofilizuje wodny roztwór. Nastepnie przemywa sie pozostalosc eterem, octanem etylu i znowu eterem i suszy nad wiórkami wodorotlenku sodowego. Otrzymuje sie H—Arg—Thr- —Asn—Thr—Gly-Ser—Gly—Thr-Pro-NH2 -2CH3COO H, temperatura topnienia 195° z rozkladem [a]fc° - -64° w dwumetyloformamidzie (1 n HCI(1 :1).Sekwens skladowy C : Z-His-Lys(BOC)- Leu-GIn-Thr-Pro-OH a) H-Thr-Tyr-Pro-OH Rozpuszcza sie 176 g Z—Tyr(Z)-Pro—OMe w 1000 ml metanolu/1 n HCI, uwodornia w obecnosci palladu osadzonego na weglu w temperaturze 20° pod cisnieniem 1 atm i odparowuje. Rozpuszcza sie pozostalosc w 400 ml dwumetyloformamidu, dodaje w temperaturze 0° 100 ml trójetyloaminy, odsacza wykrystalizowany chlorowodorek trójetyloaminy i zadaje przesacz Z—Thr—N3 (wytworzony z 87 g Z—Thr—NHNH2, patrz sekwens skladowy A a). Pozostawia sie nastepnie na okres 16 godzin w temperaturze 0° odparowuje do sucha, rozpuszcza pozostalosc w octanie etylu, przemywa kolejno rozcienczonym kwasem solnym i rozcienczonym amoniakiem, osusza i odparowuje. Pulweryzuje sie pozostalosc w heptanie, przemywa eterem naftowym i suszy. Otrzymuje sie Z-Thr-Tyr—Pro—OMe, temperatura topnienia 80° z rozkladem [a]o0 = -23° w dwumetyloformamidzie- Rozpuszcza sie 53 g Z—Thr—Tyr—Pro—OMew 550 ml metanolu, dodaje 100 ml 2 n roztworu wodorotle¬ nku sodowego, pozostawia wciagu 1 godzinywtemperaturze 25° dodaje 50 ml 2n kwasu solnego, zateza do okolo 200 ml, dodaje jeszcze 100 ml wody, nastawia wartosc pH na 10, przemywa wodny roztwór dwukrotnie octanem etylu, nastepnie nastawia za pomoca 4n kwasu solnego na wartosc pH 1, ekstrahuje wydzielony trójpeptyd Z—Thr—Tyr-Pro-OH octanem etylu, suszy i odparowuje. Temperatura topnienia 80°, [a]L°*~—23° w dwumetyloformamidzie. Rozpuszcza sie pozostalosc w mieszaninie 500 ml dioksanu i 100 ml wody i uwodor¬ nia w temperaturze 20° pod normalnym cisnieniem w obecnosci katalizatora palladowego. Przesacza sie, odparowuje do sucha, przemywa pozostalosc eterem i suszy. Otrzymuje sie H-Thr—Tyr—Pro—OH,temperatura topnienia 180° z rozkladem, [a]fr° = -31° w kwasie octowym (95%) b) Z-Leu-GIn-OMe Rozpuszcza sie 70 g Z-GIn-OH w 1,5 litra dioksanu i dopuszcza sie tak dlugo eterowy roztwór dwuazometanu, az roztwór zostanie zabarwiony na zólto. Nastepnie roztwór odparowuje sie i biala pozostalosc przerabia sie eterem. Otrzymuje sie Z-GIn-OMe, temperatura topnienia 136°C, [ajp0 = -21° w dwumetylofor¬ mamidzie. Rozpuszcza sie 71 g estru w 1,7 litra metanolu. Potem miesza sie wciagu 5godzin 10% palladu osadzonego na weglu aktywnym z 59 ml 4 n kwasu solnego i dodaje do roztworu. Calosc poddaje sie 3-godzinnemu uwodornieniu w temperaturze pokojowej pod cisnieniem normalnym. Zuzywa sie przy tym okolo 83% teoretycznej ilosci wodoru. Katalizator odsacza sie, a przesacz calkowicie odparowuje, przy czym otrzymuje sie H—Gin—OMe • HCI w postaci gestego oleju. Rozpuszcza sie 64 g Z—Leu—OH w 200 ml acetonitrylu, zadaje 27,7 g N-hydroksysukcynimidu i oziebia do temperatury -10°. Do tego wlewa sie roztwór 50 g dwucykloheksy- lokarbodwuimidu w 100 ml acetonitrylu. Po uplywie okolo 30 minut odsacza sie dwucykloheksylomocznik.90 224 7 Przesacz zadaje sie 47,3 g H—Gin—OMe • HCI, rozpuszczonego w dwumetyloformam idzie, przy równoci#*nyr*i dodaniu równowaznej ilosci N-metylomorfoliny. Pozostawia sie na okres 4 godzin i odparowuje. Pozdftatos^ rozpuszcza sie w octanie etylu i przemywa 5% roztworem kwasnego weglanu sodowego, 1 n kwasem s6lr!Vri1 i woda. Organiczna faze osusza sie nad siarczanem sodowym i odparowuje sie pod zmniejszonym cisnienlerH: Pd przekrystalizowaniu z metanolu i eteru otrzymuje sie Z—Leu-GIn—OMe, temperatura topnienia 1798, [a]o° = —16° wdwumetyloformamidzie. c) Z-Lys(BOC)-Leu-Gln-OMe 42 g Z-Leu-GIn—OMe rozpuszcza sie w 1500 ml metanolu. Nastepnie wprowadza sie mieszajac 16 g 1096 palladu osadzonego na weglu aktywnym z 25,8 ml 4 n kwasu solnego i dodaje do roztworu. Calosc poddaje sie 8-godzinnemu uwodornieniu w temperaturze pokojowej pod cisnieniem normalnym. Zuzywa sie przy tym 95% teoretycznej ilosci wodoru. Katalizator odsacza sie i przesacz odparowuje. Otrzymuje sie H—Leu—Gin—OMe -HCI w postaci piany. Nastepnie rozpuszcza sie H-Leu-GLn-OMe -HCI 300 ml dwumetylo- formamidu, dodaje 34 g Z—Lys(BOC)—OCP i 8,4 ml trójetyloaminy. Po wytrzasnieciu pozostawia sie na okres 16 godzin. Nastepnie mieszanine reakcyjna zageszcza sie pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc traktuje sie woda i odsacza od wody. Nastepnie rozpuszcza sie w malej ilosci metanolu i wytraca za pomoca eteru. Po odsaczeniu i wysuszeniu otrzymuje sie Z—Lys(BOC)—Leu—Gin—OMe, [ajp0 = 21° wdwumetyloformamidzie. d) Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-NH-NH2 Rozpuszcza sie 38 g Z-Lys-(BOC)-Leu-Gln-OMe w 300 ml dwumetyloformamidu, dodaje sie 15 g 10% palladu osadzonego na weglu, uwodornia pod cisnieniem normalnym w temperaturze pokojowej i odsacza katalizator. Nastepnie zadaje sie Z—His—N3 otrzymanym z 25,2g Z—His-NHNH2 pozostawia wciagu 5 godzin w temperaturze pokojowej, odparowuje, rozpuszcza sie pozostalosc w octanie etylu, przemywa woda, osusza nad siarczanem sodowym, odparowuje i przemywa pozostalosc eterem. Otrzymuje sie Z—His-Lys(BOC)—Leu-GIn- OMe, temperatura topnienia 120° z rozkladem, [a]o° = —19° wdwumetyloformamidzie. Rozpu zeza sie 33g Z-His-Lys(BOC)-Leu—Gin—OMe w 330 ml metanolu, zadaje 7,5 ml wodzianu hydrazyny, pozostawia sie w ciagu 2 dni w temperaturze 25° i nastepnie odparowuje do sucha. Potem rozpuszcza sie wdwumetyloformamidzie odparowuje i powtarza to do chwili gdy zaden slad hydrazyny nie da sie wiecej wykryc. Przemywa sie pozostalosc eterem, woda i eterem, suszy i otrzymuje Z-His—Lys(BOC)-Leu-Gln-NH-NH2, temperatura topnienia 199°, Md° = -22° w,metanolu. e) Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Thr-Pro-OH Rozpuszcza sie 40 g Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-NH-NH2 w 400 ml dwumetyloformamidu, oziebia do temperatury —20°, dodaje 75 ml mieszaniny dioksanu z 2 HCI i nastepnie 6 ml azotynu lll-rzed.-butylowego, miesza w ciagu 10 minut w temperaturze -20°, dodaje 30 ml trójetyloaminy i 20 g H-Thr—Tyr-Pro-OHi pozosta¬ wia do reakcji wciagu 16 godzin w temperaturze 25°. Potem odparowuje sie do sucha, przemywa pozostalosc eterem, rozcienczonym kwasem octowym, eterem i w koncu goracym octanem etylu. Potem osusza sie w wysokiej prózni i otrzymuje Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln—Thr—Tyr-Pro-OH,temperatura topnienia 215° z roz¬ kladem [a]o° = —23° wdwumetyloformamidzie.Sekwens skladowy Cl: Z-His-Lys(BOC)-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Pro-OH a) H-Thr-Tyr-Pro-OH.Patrz sekwens skladowy Ca). b) Z-GIn-Thr-Tyr-Pro-OH.Rozpuszcza sie 40,1 g Z-GIn-ONP i 38,4 g H-Thr-Tyr-Pro-OH w 500 ml dwumetyloformamidu i zadaje 12,2 ml N-metylomorfoliny. Pozostawia sie wciagu 16 godzin w temperaturze pokojowej i potem odparowuje roztwór pod zmniejszonym cisnieniem calkowicie. Odparowana pozostalosc rozpuszcza sie w octanie etylu/n-bu- tanolu (10:1) i przemywa 1n kwasem siarkowym (30% roztworem chlorku sodowego (1 :1), a nastepnie 15% roztworem chlorku sodowego. Po osuszeniu nad siarczanem sodowym odparowuje sie faze organiczna calkowicie pod zmniejszonym cisnieniem. Rozpuszcza sie pozostalosc w chloroformie/metanolu (1:1) i przesacza przez kolumne z zelem krzemionkowym (20-krotna ilosc). Otrzymuje sie Z-GIn-Thr-Tyr-Pro-OH w postaci piany, Mfc° = —19° wdwumetyloformamidzie. c) Z-Lys(DOC)-Tyr-OMe 143,9 g Z-Lys(BOC)-OH • DCHA rozpuszcza sie w 600 ml cieplego dwumetyloformamidu i po oziebieniu do temperatury 35° zadaje sie roztworem 65,1 g H-Tyr-OMe• HCI w 200 ml dwumetyloformamidu, przy czym wykrystalizowuje calkowicie DCHA • HCI. Po przesaczeniu dodaje sie do przesaczu 30 g N-hydroksysukcynimi- du, oziebia do temperatury —15° i zadaje roztworem 53,6 g dwucykloheksylokarbodwuimidu w 200 ml acetoni- trylu. Wytrzasa sie wciagu 15 godzin w temperaturze 0°, odsacza od dwucyklohekslomocznika i odparowuje przesacz pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc rozpuszcza sie w octanie etylu, przemywa sie 5% roztworem kwasnego weglanu sodowego, woda, 1n kwasem siarkowym i woda, osusza nad siarczanem sodowym i zageszcza do stanu piany. Otrzymuje sie w ten sposób Z-Lys(BOC)-Tyr-OMe,[a]o° = —6° w metanolu.8 90 224 d) Z-His-Lys(BOC)Tyr-NHNH2. 113r5g Z-Lys(BOC)Tyr-OMe rozpuszcza sie w 2 litrach metanolu, zadaje zawiesine 10 g 10% palladu osadzonego na weglu aktywnym w 50 ml 4n kwasu solnego i uwodornia sie w temperaturze pokojowej pod ^cisnieniem normalnym. Po 3-godzinnym uwodornianiu zuzywa sie 90% teoretycznej ilosci wodoru. Katalizator odsacza sie i przesacz calkowicie odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem. H-Lys(BOC)-Tyr-OMe• HCI w postaci piany jest jednolity w chromatografii cienkowarstwowej i wiaze go sie z,Z-His-N3 w nastepujacy sposób. Rozpuszcza sie 88,5 g Z-His-NHNH2 w 1800 ml dwumetyloformamidu, oziebia do temperatury —20°, dodaje 405 ml 3,7 n roztworu HCI w eterze i po kropli 36,6 ml azotynu lll-rzed.-butylowego. Po wymieszaniu wciagu 10 minut w temperaturze -20° dodaje sie 270 ml trójetyloaminy i roztwór H-Lys(BOC)-Tyr-OMe• HCI w 600 ml dwumetyloformamidu, który juz zawiera 27,3 ml trójetyloaminy. Po uplywie 5 godzin odsacza sie wykrystalizowany chlorowodorek trójetyloaminy. Przesacz odparowuje sie calkowicie w wysokiej prózni.Pozostalosc rozpuszcza sie w mieszaninie kwasu octowego i wody (2 :1), przemywa organiczna faze czterokrot¬ nie 15% roztworem chlorkku sodowego, osusza nad siarczanem sodowym i odparowuje. Po rozpuszczeniu pozostalosci w chloroformie/metanolu/ (98 : 2) i przesaczeniu poprzez kolumne z zelem krzemionkowym (25-krotna ilosc otrzymuje sie Z-His-Lys(BOC)-Tyr-OMew postaci bezpostaciowej [a]o° = -11° w dwumetylo¬ formamidzie. Rozpuszcza sie 90,4 g Z-His-Lys(BOC)-Tyr-OMew 300 ml metanolu i zadaje sie 20 ml wodzianu hydrazyny. Po 2 dniach stania krystalizuje wytworzony hydrazyd. Dodaje sie 300 ml eteru, odsysa, przemywa eterem i osusza pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymuje sie w ten sposób Z-His-Lys(BOC)-Tyr-NHNH2, temperatura topnienia 187°, [a]fc° = —24° w dwumetyloformamidzie. e) Z-His-Lys(BOC)-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Pro-OH Rozpuszcza sie 36,7 g Z-GIn-Thr-Thr—Pro-Oh w 500 ml dwumetyloformamidu, dodaje 15 g 10% palladu osadzonego na weglu aktywnym, uwodornia w temperaturze pokojowej pod cisnieniem normalnym odsacza od katalizatora. Przesacz zawiera H-GIn-Thr-Tyr-Pro-OH, który laczy sie z Z-His-Lys(BOC)-Tyr-N3 w nastepujacy sposób: 40,4 g Z-His-Lys(BOC)-Tyr-NHNH2'ozpuszcza sie w 400 ml dwumetyloformamidu, oziebia do tempera¬ tury —20°, zadaje sie 88 ml dioksanu /2n HCI i nastepnie oziebia do temperatury 7,3 ml azotynu lll-rzed.-buty¬ lowego. Po 10 minutach mieszania w temperaturze —20° dodaje sie 37 ml trójetyloaminy i roztwór dwumetylo¬ formamidu zawierajacy H-GIn-Thr-Tyr-Pro-OH. Po uplywie 5 godzin w temperaturze 20° odparowuje sie mieszanine calkowicie pod zmniejszonym cisnieniem, rozpuszcza sie pozostalosc w octanie ety Iu/n-butanolu (5:1), przemywa rozcienczonym kwasem octowym z dodatkiem roztworu chlorku sodowego, osusza sie nad siarczanem sodowym i zageszcza. Niezupelnie odparowany olej zadaje sie eterem, dobrze przerabia i odsysa. Po wysuszeniu w wysokiej prózni otrzymuje sie Z-His-Lys(BOC)-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Pro-OH, temperatura topnienia 193° [a]o° = -33° w dwumetyloformamidzie.Sekwens skladowy ABC: H-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 • 3Ch3- COOH Rozpuszcza sie 10 g heptapeptydu (sekwens skladowy C) w 100 ml dwumetyloformamidu, odparowuje, rozpuszcza sie pozostalosc w 100 ml dwumetyloformamidu, 15 g N-hydroksysukcynimidu, oziebia sie do temperatury 0°, dodaje 5g dwucykloheksylokarbodwuimidu, pozostawia do reakcji na okres 3 godzin, przesacza wytracony dwucykloheksylomocznik, zateza do 30 ml i wytraca otrzymany ester hydroksysukcynimidowy heptapeptydu Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gfn-Thr-Tyr-Pro-OSudodatkiem eteru. Po przemyciu eterem rozpuszcza sie pozostalosc w 100 ml dwumetyloformamidu, zadaje 10 g amidu nonapeptydu (sekwens AB) i pozostawia do reakcji w ciagu 16 godzin. Dodaje sie 500 ml octanu etylu i przesacza. Rozpuszcza sie pozostalosc w dwumetylo¬ formamidzie, dodaje 10 ml kwasu octowego i ponownie wytraca octanem etylu. Odsacza sie, przemywa octanem etylu i eterm i suszy. Otrzymuje sie Z-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2- • 2 AcOH, [a]fe° = —19° w dwumetyloformamidzie, który bezposrednio rozpuszcza sie w 80% w kwasie octo- wym.Nastepnie dodaje sie 5g palladu osadzonego na weglu i uwodornia w temperaturze pokojowej pod cisnieniem normalnym. Przesacza sie, odparowuje w wysokiej prózni do sucha i przemywa pozostalosc eterem.Po wysuszeniu ponad wiórkami KOH otrzymuje sie sekwens skladowy ABC, temperatura topnienia 170° z rozkladem [a]fc° = —53° w 1n kwasie octowym.Sekwens skladowy ABCI : H-His-Lys(BOC)-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pr- o-NH2 • 3 CH3COOH Wedlug analogicznego sposobu jak przy otrzymywaniu sekwensu skladowego ABC otrzymuje sie z 10 g nonapeptydu (sekwens skladowy Cl) i 10 g nonapeptydu (sekwens skladowy AB) sekwens skladowy ABCI, temperatura topnienia 166° z rozkladem, [a]o° = -50° w 1n kwasie octowym.Sekwens skladowy D: Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Glu(OTB)-Leu-NHNH2. a) Z-Glu(OTB)-Leu-OMe Rozpuszcza sie 151 g Z-Glu(OTB)-OH, 54 g N-hydroksysukcynimidu w 700 ml acetonitrylu i oziebia do temperatury —20°. Nastepnie dodaje sie 96,5 g dwucykloheksylokarbodwuimidu, rozpuszczonego w 350 ml90 224 9 acetonitrylu. Po uplywie okolo 30 minut odsacza sie powstaly dwucykloheksylomocznik. Do przesaczu dodaje sie 71,2 g H-Leu-OMe, potem pozostawia sie na okres 4 godzin i odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem. Stala pozostalosc zadaje sie octanem etylu /woda (2:1). Organiczna faze przemywa sie nastepnie 5% roztworem kwasnego weglanu sodowego, woda i rozcienczonym kwasem siarkowym (pH = 3), po przemyciu do odczynu obojetnego osusza sie nad siarczanem sodowym i odparowuje. Pozostalosc rozpuszcza sie w chloroformie, do którego dodano 1% metanolu i przesacza poprzez kolumne z zelem krzemionkowym (10-krotna ilosc). Otrzy¬ muje sie Z-Glu(OTB)-Leu-OMe, temperatura topnienia 31° [a]fc° - -12° w dwumetyloformamidzie. b) H-G1n-Glu(OTB)-Leu-OMe Rozpuszcza sie 118g Z-Glu(OTB)-Leu-OME w2000ml metanolu. Potem miesza sie 15g 10% palladu osadzonego na weglu aktywnym z 63 ml 4 n kwasu solnego i dodaje do roztworu. Calosc poddaje sie uwodornieniu w ciagu 2 godzin w temperaturze pokojowej pod cisnieniem normalnym. Zuzywa sie przy tym 85% teoretycznej ilosci wodoru. Katalizator odsacza sie i przesacz calkowicie odparowuje, przy czym otrzymuje sie H-Glu-OTB)-Leu-OMe. HCI w postaci bezpostaciowej piany. 91,7 g Z-GIn-ONP i 93,8 g H-Glu(OTB)-Leu-OMe * HCI rozpuszcza sie w 500 ml dwumetyloformamidu i zadaje 51 ml N-metylomorfoliny. Pozostawia sie wciagu 15 godzin w temperaturze pokojowej i nastepnie odparowuje roztwór calkowicie pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymana w ten sposób pozostalosc przerabia sie z woda i odsacza od wody. Nastepnie przekrystalizowuje sie z metanolu. Otrzymuje sie Z-Gln-Glu(dtTB)-Leu- OMe, temperatura topnienia 210° z rozkladem [a]fc° * —40° w dwumetyloformamidzie.Rozpuszcza sie 44,4g Z-Gln-Glu(OTB)-Leu-OMe w 1200 ml metanolu/dwumetyioformamidu (1:1).Potem zadaje sie 15 g 10% palladu osadzonego na weglu aktywnym w 50 ml wody i dodaje do roztworu. Po okolo 2 godzinach uwodorniania zuzywa sie prawie teoretyczna ilosc wodoru. Katalizator odsacza sie i przesacz odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc rozpuszcza sie w octanie etylu i trzykrotnie przemywa nasyconym roztworem chlorku sodowego. Organiczna faze osusza sie na siarczanem sodowym i odparowuje przesacz do okolo 1/3 pierwotnej objetosci. Po dodaniu eteru naftowego staly trójpeptyd daje sie odsaczyc. Otrzymuje sie H-Gln(OTB)Leu-OMe, temperatura topnienia 123°, [a]fc° ¦ -14° w dwumetyloforma¬ midzie. c) Z-Lys(BOC)-Leu-Ser-OMe.Rozpuszcza sie 43 g H-Leu-Ser-Ome • HCI i 80 g Z-Lys(BOC)OCPw 400 ml dwumetyloformamidu, dodaje 22 ml trójetyloaminy, pozostawia na okres 25 godzin w temperaturze 25°, odsacza wydzielona trójetyloamine i odparowuje przesacz do sucha. Pozostalosc rozpuszcza sie w octanie etylu, przemywa rozcienczonym kwasem solnym oraz rozcienczonym roztworem kwasnego weglanu potasowego, osusza nad siarczanem sodowym, odsacza i odparowuje. Przekrystalizowuje sie pozostalosc z octanu etylu/eteru i otrzymuje Z-Lys(BOC)-Leu-Ser- OMe, temperatura topnienia 110° [a]fr° = —14° w dwumetyloformamidzie. d)Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-NHNH2.Rozpuszcza sie 158 g Trt-Gly-OH w 2000 ml dwuchlorometanu i 72 ml trójetyloaminy, oziebia do temperatury —5°, zadaje 50 ml estru etylowego kwasu chloromrówkowego i miesza w ciagu 10 minut w tempera¬ turze -5°. Równoczesnie rozpuszcza sie 300 g Z-Lys(BOC)-Leu-Ser-OMe w 3000 ml dioksanu/wody) (8 :,2), uwodornia w obecnosci palladu osadzonego na weglu w temperaturze pokojowej pod cisnieniem normalnym, odsacza i odparowuje. Pozostalosc rozpuszcza sie w chloroformie i zadaje sie wyzej otrzymanym mieszanym bezwodnikiem. Pozostawia sie na okres 1 godziny w temperaturze 0°, przemywa roztwór chloroformowy rozcienczonym kwasem octowym i nastepnie rozcienczonym roztworem kwasnego weglanu potasowego, osusza {odparowuje do sucha. Pozostalosc rozpuszcza sie w 1250 ml metanolu, zadaje 175 ml wodzianu hydrazyny i pozostawia na okres 16 godzin w temperaturze 25°. Zateza sie do 500 ml, zadaje woda, przesacza, przemywa pozostalosc woda i osusza nad pieciotlenkiem fosforu; Otrzymuje sie Trt-GLy-Lys(BOC)-Leu-Ser-NHNH2, temperatura topnienia 204°' [a]}? = —6° w dwumetyloformamidzie. e) Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Glu(OTB)-Leu-NHNH2. Rozpuszcza sie w76g Trt-Gly-Lys(BOC)- Leu-Ser-NHNH2 w 300 ml dwumetyloformamidu, oziebia do temperatury -20°, dodaje 75 ml dioksanu/ 4n HCI i nastepnie 11,6 ml azotynu lll-rzed.-butylowego, miesza wciagu 10 minut w temperaturze -15°, zadaje 70 ml trójetyloaminy i 49,5 g H-Gln-Glu(OTB)-Leu-OMe. Potem miesza sie w ciagu 16 godzin w temperaturze 0°.Odsacza sie wytracony chlorowodorek trójetyloaminy, zateza przesacz do okolo 100 ml i zadaje pozostalosc woda. Odsacza sie wydzielona pozostalosc, która nastepnie przemywa sie woda i w koncu suszy w wysokiej prózni w temperaturze 50°. Pozostalosc wygotowuje sie z octanem etylu, przemywa eterem i suszy. Otrzymany ester nonapeptydu Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Glu-(OTB)-Leu-OMe o temperaturze topnienia 234°, [a]fc° - -20° w dwumetyloformamidzie, rozpuszcza sie w 200 ml dwumetyloformamidu, zadaje 4 ml hydrazyny i pozostawia na okres 24 godzin w temperaturze 25°. Po zatezeniu do okolo 100 ml dodaje sie 500 ml wody, odsacza wytracona substancje przemywa woda do odczynu obojetnego i osusza nad pieciotlenkiem fosforu10 90 224 w temperaturze 50°. Otrzymuje sie Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Glu(OTB)-Leu-NHNH2, temperatura topnie¬ nia 265°, [a]o° = -18° w dwumetyloformamidzie/wodzie (8:2).Sekwens skladowy ABCD: H-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Glu-(OTB)-Leu-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Tyr- Pro-Arg-Thr-AsnThr-Gly-Ser-GlyThr-Pro-NH2 • 3 Ac OH -3 H20.Rozpuszcza sie 3g hydrazydu heptapeptydu (sekwens skladowy D) w 30 ml dwumetyloformamidu, oziebia do temperatury —20°, dodaje 2 ml dioksanu (4n HCI i nastepnie 0,3 ml azotynu lll-rzed.-butylowego.Miesza sie wciagu 10 minut w temperaturze —20°, dodaje 2 ml trcjetyloaminy i 3g amidu heksadekapeptydu (sekwens skladowy ABC), miesza sie w ciagu 16 godzin w temperaturze 0° i odparowuje do sucha. Przemywa sie pozostalosc w temperaturze 0° rozcienczonym kwasem octowym i nastepnie woda, przesacza, rozpuszcza sie pozostalosc w metanolu/wodzie (9:1), saczy przez zel krzemionkowy, odparowuje pozostalosc przemywa octanem etylu, rozpuszcza sie w 200 ml 80% kwasu octowego, pozostawia n okres 4 godzin w temperaturze 25°, odparowuje w temperaturze 20° do sucha, przemywa pozostalosc eterem, octanem etylu i eterem przesacza i suszy. Otrzymuje sie sekwens skladowy ABCD, temperatura topnienia 240° z rozkladem, [a]o° = -38° w kwasie octowym.Sekwens skladowy Dl: Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Gln-Leu-NHNH2 a) Z-GIn-Leu-OMe.Rozpuszcza sie 40 1 g Z-GIn-ONP i 19,1 g H-Leu-OMe. HCI w 300 ml dwumetyloformamidu, dodaje 34,1 , ml N-metylomorfoliny i pozostawia na okres 15 godzin w temperaturze 20° mieszajac od czasu do czasu.Nastepnie roztwór reakcyjny odparowuje sie calkowicie pod wysoka próznia. Pozostalosc maceruje sie dobrze z woda i przesacza. Po krystalizacji z metanolu otrzymuje sie Z-GIn-Leu-OMe, temperatura topnienia 168°, [a]fc° = _11° wdwumetyloformamidzie. b) H-GIn-GIn-Leu-OMe Rozpuszcza sie 27,8 g Z-GIn-Leu-OMe w 130 ml kwasu octowego i zadaje 220 ml 40% bromowodoru w kwasie octowym. Calosc pozostawia sie wciagu 1 godziny mieszajac od czasu do czasu. Po calkowitym odparowaniu pod zmniejszonym cisnieniem pozostalosc pulweryzuje sie w bezwodnym eterze. Po odsaczeniu silnie higroskopijny H-GIn-Leu-OMe • HBr wstanie zwilzenia eterem suszy sie w suszarce w temperaturze pokojowej. 77,5 g Z-GIn-ONP i 81,4g H -Gln-Leu-Ome • HBr rozpuszcza sie w 750 ml dwumetyloformamidu i zadaje £6,5 ml N-metylomorfoliny. Pozostawia sie na okres 15 godzin w temperaturze pokojowej i nastepnie odparo¬ wuje roztwór calkowicie pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymana w ten sposób pozostalosc maceruje sie dobrze z woda i odsacza od wody. Pozostalosc po odsaczeniu maceruje sie acetonem i za pomoca prasy oddziela sie faze acetonowa. Po wysuszeniu pod zmniejszonym cisnieniem otrzymuje sie Z-GIn-GIn-Leu-OMe, temperatura topnienia 238°, [a]o0 = —18° wdwumetyloformamidzie. Rozpuszcza sie 54,8 g Z-GIn-GIn-Leu-OMe w 1200 ml dwumetyloformamidu. Potem dodaje sie do tego roztworu zawiesine 10 g 10% palladu osadzonego na weglu aktywnym w 70 ml wody. Po okolo 1 godzinie uwodornienia w temperaturze pokojowej pod cisnieniem normalnym zuzywa sie stechiometryczna ilosc wodoru. Katalizator odsacza sie, a przesacz odparowuje sie calkowicie pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc przekrystalizowuje sie z metanolu/eteru. Otrzymuje sie H-GIn-GIn-Leu-OMe, temperatura topnienia 151°, [a]fe° = —10° w dwumetyloformamidzie. c) Z-Lys(BOC)-Leu-Ser-OMe. Patrz sekwens skladowy D c). . d) Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-NHNH2.Patrz sekwens skladowy D d). e) Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Gln-Leu-NHNH2.Przy zastosowaniu tego samego sposobu jak opisano dla sekwensu skladowego D e), przy czym zastepuje sie H-GIn-Glu (OTB)-Leu-OMe przez taka sama ilosc H-GIn-GIn-Leu-OME, otrzymuje sie Trt-Gly-Lys(BOC)-Leu- Ser-Gln-Gln-Leu-NHNH2, temperatura topnienia 270°, [a]o0 = -12° w dwumetyloformamidzie/wodzie (8 :2).Sekwens skladowy ABCDI: H-GLy-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Gln-Leu-His-Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg- Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 • 3 AcOH • 3H20. 0 Przy zastosowaniu tego samego sposobu jak dla wytwarzania sekwensu skladowego ABCD oraz przy zastapieniu sekwensu skladowego D przez taka sama ilosc sekwensu skladowego Dl otrzymuje sie sekwens skladowy ABCDI, temperatura topnienia 245° z rozkladem [a]o° = -40° w kwasie octowym.Sekwens skladowy ABCID: H-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Glu(OTB)-Leu-His-Lys(BOC)-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Pro- Arg-Thr-Adn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NN2• AcOH -3 H20 Przy zastosowaniu tego samego sposobu jak dla wytwarzania sekwensu skladowego ABCD oraz przy zastapieniu sekwensu skladowego D przez taka sama ilosc sekwensu skladowego Dl, Przy zastosowaniu tego samego sposobu jak dla wytwarzania sekwensu skladowego ABCD i przy zastapieniu sekwensu skladowego ABC przez taka sama ilosc sekwensu skladowego ABC1, otrzymuje sie sekwens skladowy ABC1D, temperatura topnienia 230° z rozkladem [a]o°= -40° w kwasie octowym.90224 11 Sekwens skladowy E: H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH a) H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe • HBr Rozpuszcza sie 21,0g Z-Cys(Bzl)OCP i 12,3 g H-Val-LeuOMe • HCI w 120 ml dwumetyloformamidu.Potem dodaje sie do tego 5,9 ml trójetyloaminy, pozostawia sie wciagu 16 godzin w temperaturze 25°, dodaje octanu etylu, przemywa rozcienczonym kwasem solnym, suszy nad siarczanem sodowym, odparowuje do sucha i krystalizuje pozostalosc z octanu etylu/eteru etylowego. Otrzymuje sie Z-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe, temperatura topnienia 160°, [a]o° = —28° w dwumetyloformamidzie, który rozpuszcza sie w 210 ml 40% roztworu bromo- wodoru w kwasie octowym. Pozostawia sie na okres 1 godzinyw temperaturze 25°, odparowuje do sucha i przekrystalizowuje pozostalosc z izopropanolu/eteru etylowego. Otrzymuje sie H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe • HBr, temperatura topnienia 168°, [a]£°= + 14° wdwumetyloformamidzie. b) H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe- 1,3 HBr Rozpuszcza sie 20 g Z-Thr-NHNH2 w 350 ml dwumetyloformamidu, oziebia do temperatury —20°,dodaje 100 ml roztworu 2n kwasu solnego wdiokasnie i nastepnie jeszcze 10 ml azotynu lll-rzed.-butylowego. Po uplywie 10 minut w temperaturze —20° dodaje sie 45 ml trójetyloaminy i 25,5 g H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe • HBr i otrzymana mieszanine wytrzasa sie w ciagu 16 godzin w temperaturze 0°. Odparowuje sie do sucha, rozpuszcza sie pozostalosc w mieszaninie octan etylu/woda, przemywa organiczna faze rozcienczonym kwasem solnym, osusza nad siarczanem sodowym, odparowuje i przekrystalizowuje pozostalosc z octanu etylu. Otrzymuje sie Z-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe;temperatura topnienia 208°, [a]2}0 = -27° w dwumetyloformamidzie.Rozpuszcza sie 20 g otrzymanego wyzej czteropeptydu w 200 ml mieszaniny kwasu trójfluorooctowego i octanu etylu (1:1) przepuszcza wciagu 1 godziny w temperaturze 0° strumien gazowego bromowodoru, nastepnie odparowuje sie i krystalizuje sie pozostalosc z metanolu/eteru etylowego. Otrzymuje sie H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe • 1,3 HBr, temperatura topnienia 202°, [aft0 =-10° wdwumetyloformamidzie. c) H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH Rozpuszcza sie 372 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe • 1,3 HBr w 1800 ml metanolu, dodaje 900 ml 2n roztworu wodorotlenku sodowego pozostawia wciagu 1 godziny w temperaturze 25°, dodaje 240 ml kwasu octowego i pozostawia naokres 2 godzin w temperaturze 0°. Odsacza sie wydzielona krystaliczna mase, przemywa ja najpierw 1n kwasem octowym, nastepnie woda i suszy w temperaturze 50° w wysokiej prózni.Otrzymuje sie H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH,temperatura topnienia 219°' [a]20 = -53° w 1n amoniaku.Sekwens skladowy F: BOC-Cys(Bzl)-Ser-A.n-Leu-Ser-NHNH2 a) H-Asn-Leu-Ser-OMe • HCI Rozpuszcza sie 43 g H-Leu-Ser-OMe- HCI i 53 g BOC-Asn-ONP w 400 ml dwumetyloformamidu, dodaje 22 ml trójetyloaminy, pozostawia na okres 16 godzin w temperaturze 25° odparowuje do sucha i krystalizuje pozostalosc z metanolu. Otrzymuje sie BOC-Asn-Leu-Ser-OMe, temperatura topnienia 190°, [a]o0 = —24° wdwumetyloformamidzie, który rozpuszcza sie w 500 ml 4n roztworu kwasu solnego w metanolu .Pozostawia sie na okres 1 godziny w temperaturze 25°, odparowuje do sucha, rozpuszcza pozostalosc w metanolu i wytraca eterem etylowym. Otrzymuje sie H-Asn-Leu-Ser-OMe • HCI, temperatura topnienia 180°, [a]2}0 = —23° wdwu¬ metyloformamidzie. b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe • HCI.Rozpuszcza sie 39,5 g BOC-Ser-NHNH2 w 500 ml dwumetyloformamidu, oziebia do temperatury —20°, dodaje 200 ml 2n roztworu kwasu solnego w dioksanie i nastepnie 20 ml azotynu lll-rzed.-butylowego. Po uplywie 10 minut w temperaturze —20° dodaje sie 90 ml trójetyloaminy i 38,0 g H-Asn-Leu-Ser OMe • HCI, potem miesza sie wciagu 16 godzin w temperaturze 0°, odparowuje do sucha i pozostalosc przekrystalizowuje z chloroformu/eteru etylowego. Otrzymuje sie BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, temperatura topnienia 135°, Md° = —22° w dwumetyloformamidzie, który rozpuszcza sie w 420 ml 4n roztworu kwasu solnego w metanolu Pozostawia sie na okres 1 godzinyw temperaturze 25°, odparowuje do sucha i przekrystalizowuje z metanolu /octanu etylu/. Otrzymuje sie H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe • HCI, temperatura topnienia 155° z rozkladem Mcr= —15° w dwumetyloformamidzie. c) BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2 Rozpuszcza sie 18,5 g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe • HCI i 18 g BOC-Cys(Bzl)-ONP w 100 ml dwumetyloforma¬ midu, dodaje sie 10 ml wody, 3,5 ml kwasu octowego i 5,6 ml trójetyloaminy« pozostawia na okres 16 godzin w temperaturze 25°, odparowuje do sucha i przekrystalizowuje z metanolu.Otrzymuje sie BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn- -Leu-Ser-OMe, temperatura topnienia 182°, [a]o° = —17° wdwumetyloformamidzie. który przy slabym ogrze¬ waniu rozpuszcza sie 200 ml dwumetyloformamidu. Dodaje sie 200 ml metanolu i 20 ml wodzianu hydrazyny, pozostawia na okres 16 godzin w temperaturze 30°, wytraca za pomoca eteru etylowego, przemywa osad eterem etylowy/metanolem (1 :1) i suszy otrzymany w ten sposób BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2,temperatura topnienia 224°, [a]2}0 = —13° wdwumetyloformamidzie. Sekwens skladowy EF:BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-SerThr- Cys-Val-Leu-OH.12 90 224 Rozpuszcza sie 18,4 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2 (sekwens skladowy F) w 150 ml dwumetyloformamidu, oziebia do temperatury —20°, dodaje 40 ml 2n roztworu chlorowodoru w dioksanie i 15 ml azotynu lll-rzed.-butylowego. Po uplywie 10 minut w temperaturze —20° dodaje sie jeszcze 28 ml trójetyloaminy i 16 2 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH (sekwens skladowy E) i miesza w ciagu 16 godzin w tempera¬ turze 25°. Potem odsacza sie, roztwór odparowuje, a pozostalosc przemywa 1n kwasem octowym. Otrzymuje sie BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OHftemperatura topnienia 217°, [a]J0 - -17° w dwume- tyloformamidzie. Rozpuszcza sie otrzymany produkt w 5000 ml suchego amoniaku, dodaje sie przy mieszaniu i wrzeniu amoniaku sodu metalicznego az do ciemno niebieskiego zabarwienia W celu odbarwienia dodaje sie chlorku amonowego. Odparowuje sie do sucha i przemywa pozostalosc 1n roztworem kwasu octowego i acetonu. Po wysuszeniu otrzymuje sie BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu OH, temperatura topnienia 248° z rozkladem, [a]fc° = -41° w dwumetyloformamidzie/ wodzie (3:1). Rozpuszcza sie otrzymany nonapep- tyd w 5000 ml 0,01 n roztworu amoniaku.dodaje mieszajac 1n roztworu nadtlenku wodoru, az do negatywnej reakcji na nitroprusydek, potem jeszcze 200 ml kwasu octowego, przesacza i liofilizuje Otrzymuje sie BOC-Cys- Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH,temperatura topnienia 238° z rozkladem [a]fc° * —18° w dwumetylofor¬ mamidzie/wodzie (3 :1).Sekwens skladowy EFI: Piv-Cys-Ser-Asn-Leu Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH.BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH (sekwens skladowy EF) rozpuszcza sie w 300 ml kwasu trójfluorooctowego, pozostawia na okres 30 minut w temperaturze 25°, odparowuje pozostalosc przemywa sie octanem etylu i rozpuszcza sie w 300 ml dwumetyloformamidu. Do tego roztworu dodaje sie 30 g estru p-nitrofenylowego kwasu piwalinowego, wytworzonego w opisany ponizej sposób, jak równiez Mml trójetylo¬ aminy, pozostawia na okres 16 godzin w temperaturze 25°, odparowuje i przemywa pozostalosc chloroformem.Rozpuszcza sie w 300 ml dwumetyloformamidu.dodaje 50 ml wody i 50 g Dowex—50, miesza w ciagu 15 minut, przesacza, przemywa zywice dwumetyloforrramidem i odparowuje przesacz do sucha. Przemywa sie pozostalosc najpierw chloroformem, nastepnie octanem etylu i suszy. Otrzymuje sie Piv-Cys-Ser-Asn«Leu-Ser ThrCys-Val- Leu-OH, temperatura topnienia 234°, [a]fr° = —17° w dwumetyloformamidzie/wodzie (3:1).Ester p-nitrofenylowy kwasu piwalinoweuo.Rozpuszcza sie 95 g kwasu piwalinowego i 131 g p-nitrofenolu w 1000 ml octanu etylu, dodaje 197 g dwucykloheksylokarbodwuimidu, miesza wciagu 2 godzin w temperaturze 25°, przesacza.odparowuje przesacz i krystalizuje pozostalosc z mieszaniny octan etylu-eter naftowy. Otrzymuje sie ester p-nitrofenylowy kwasu piwalinowego, temperatura topnienia 104°.Sekwens skladowy EF2: BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-LeuOH.Wychodzac zsekwensu skladowego EF oraz estru etylowo-p-nitrofenylowego kwasu weglowego, który wytwarza sie w sposób ponizej opisany, otrzymuje sie sekwens skladowy EF2 wed lugtego samego sposobu jak opisano dla wytworzenia sekwensu skladowego EF1. Temperatura topnienia 263°, [a]fc° * 21° w dwumetylofor¬ mamidzie/wodzie (3 :1).Ester etylo-p-nitrofenylowy kwasu weglowego.Rozpuszcza sie 200 g p-nitrofenolu i 113 ml pirydyny w 1200 ml octanu etylu, oziebia do temperatury 0°, dodaje mieszajac 156 ml estru etylowego kwasu chloromrówkowego. miesza jeszcze w ciagu 30 minut w tempera¬ turze 0°, przemywa woda, osusza nad Na2S04 i odparowuje do sucha. Rozpuszcza sie pozostalosc w eterze etylowym i krystalizuje ester etylo-p-nitrofenylowy kwasu weglowego przez dodanie eteru naftowego, temperatu¬ ra topnienia 65°.Sekwens skladowy F3: Bzl-MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH2 a) H-Asn-Leu-Ser-OMe • HCI Patrz sekwens skladowy F a). b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe • HCI Patrz sekwens skladowy F b). c) Bzl-MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2 Wychodzac z 18,5g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe* HCI i 1359 BzI-MCP-ONP otrzymuje sie, wedlug tego samego sposobu jak dla wytwarzania sekwensu skladowego F c),Bzl-MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2,temperatura topnienia 251°, [a]fc° =* -16° w dwumetyloformamidzie.Sekwens skladowy EF3: MCP-Ser-Asn-Leu-SerThr-Cys-Val-Leu-NHNH2.ROzpuszcza sie 16,2 g Bzl-MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2 (sekwens skladowy F3) w 150 ml dwumetylofor¬ mamidu, oziebia do temperatury —20° dodaje 40 ml 2 n roztworu kwasu solnego w dioksanie i 15 ml azotynu III-rzed-buty Iowego. Po uplywie 10 minut w temperaturze —20° dodaje sie jeszcze 28 ml trójetyloaminy i 243 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe* 1,3 HBr (sekwens skladowy E b) i miesza w ciagu 16 godzin w temperaturze 25°.Potem przesacza sie, roztwór odparowuje, a pozostalosc przemywa goracym metanolem. Otrzymuje sie Bzl-MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe,temperatura topnienia 244°, [ajp0 = -22° w dwumetylo¬ formamidzie, który rozpuszcza sie w temperaturze 60° w 100 ml dwumetyloformamidu, dodaje 10 ml wodzianu90224 13 hydrazyny i pozostawia na okres 2 godzin w temperaturze 60°. Otrzymany hydrazyd nonapeptydu wykrystali o- wuje. Przemywa sie eterem etylowym, woda i metanolem i osusza pod wysoka próznia nad pieciotlenkiem fosforu. Otrzymuje sie hydrazyd nonapeptydu, temperatura topnienia 265°, [a]o° = —35° w dwumetyloformami- dzie/wodzie (3 :/1).Otrzymani produkt rozpuszcza sie w 5000 ml suchego amoniaku, dodaje mieszajac przy wrzeniu amoniaku sód metaliczny az do ciemnoniebieskiego zabarwienia. W celu odbarwienia dodaje sie chlorku amonowego i potem przepuszcza sie przez roztwór strumien powietrza az do negatywnej reakcji nitroprusydkowej.Odparowuje sie do sucha i przemywa pozostalosc woda i acetonem. Po wysuszeniu otrzymuje sie MCP-Ser-Asn- Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-NHNH2,temperatura topnienia 278°, [aj^0 = -19° w dwumetyloformamidzie/wodzie (3:1).Przyklad II. BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln- lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-AsnThr-Gly- Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 • 2 CH3 COOH • 3 H20.Rozpuszcza sie 1,0 g nonapeptydu (sekwens skladowy EF) w 10 ml dwumetyloformamidu, dodaje 1,5 g N-hydroksysukcynimidu i 0,52 g dwucykloheksylokarbodwuimidu, miesza sie w czasie 6 godzin w temperaturze °, przesacza i odparowuje przesacz do sucha. Przemywa sie pozostalosc octanem etylu i eterem etylowym i suszy. Otrzymuje sie BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OSu,temperatura topnienia 242°, który roz¬ puszcza sie w 10 ml dwumetyloformamidu. Do tego roztworu dodaje sie 3,1 g. dwuoctanu trikozapeptydu (sekwens skladowy ABCD) i 1,2 g N-hydroksysukcynimidu i miesza w ciagu 16 godzin w temperaturze 25°.Odparowuje sie do sucha, przemywa pozostalosc eterem etylowym, chloroformem i acetonem. Otrzymuje sie w ten sposób surowy chroniony dotriakontapeptyd, który rozpuszcza sie w 50 ml mieszaniny chloroform/meta¬ nol/woda (70:30:5). Otrzymanym roztworem nawarstwia sie kolumne z zelem krzemionkowym, która uprzednio wyrównano wymieniona powyzej mieszanina. Eluowanie przeprowadza sie za pomoca metanolu 0 wzrastajacym stezeniu. Polaczone frakcje zawierajace czysty peptyd odparowuje sie, nastepnie przemywa eterem etylowym i osusza nad wodorotlenkiem potasowym w wysokiej prózni. Otrzymuje sie zwiazek wymienio¬ ny w tytule, temperatura topnienia 230° z rozkladem, [a]o° = —45° w 50% kwasie octowym.Przyklad III. H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln<3lu-Len-His-Lys-Leu-Gln- h-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 • 6CH3COOH • 10 H20 Rozpuszcza sie 3,3 g chronionego dwuoctanu trójwodzianu dotriakontapeptydu (przyklad II) w atmosferze azotu w 100 ml kwasu trójfluorooctowego, pozostawia nokres 15 minut w temperaturze 20° i odparowuje do sucha. Rozpuszcza sie w 300 ml 0,2 n roztworu kwasu octowego, zadaje 20 ml amberlitu 1 RA—410 (octan), liofilizuje, przemywa eterem etylowym i osusza nad wodorotlenkiem potasowym, w wysokiej prózni. Otrzymuje sie zwiazek wymieniony w tytule, temperatura topnienia 220° z rozkladem [a]o° = —46° w 50% kwasie octowym.Przyklad IV. Piv-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Glu(OTB)-Leu-His-L Lys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 • 2CH3COOH • 3H20 Postepujac w sposób opisany w przykladzie II i stosujac jako produkt wyjsciowy sekwens skladowy EFI i ABCD, otrzymuje sie zwiazek tytulowy o temperaturze topnienia 220° z rozkladem, [a]o° = —45° w 50% kwasie octowym.Przyklad V. PivrCys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-leu-His-Lys-Leu<3ln- Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Gly-Thr-Pro-NH2 • 6CH3COOH • 8H20 Postepujac w sposób opisany w przykladzie III i stosujac jako produkt wyjsciowy dotriakontapeptyd z przykladu IV, otrzymuje sie zwiazek tytulowy o temperaturze topnienia 216° z rozkladem, [a]o0 = —49° w 50% kwasie octowym.Przyklad VI. BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-(BOC)-Leu-Ser-Gln<3lu-(OTB)-Leu- isLys(BOC)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Glyy-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 • 2CH3COOH • 3 H20.Postepujac wedlug przykladu II i stosujac jako produkt wyjsciowy sekwensy skladowe EF2 i ABCD, otrzymuje sie zwiazek tytulowy o temperaturze topnienia 230° z rozkladem, [a]?)0 = —45° w 50% kwasie octowym.Przyklad VII. BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-GI tr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-pro-Nh^ • 6CH3COOH • 8 H20 Postepujac wedlug przykladu III i stosujac jako produkt wyjsciowy dotriakontapeptyd z przykladu VI, otrzymuje sie zwiazek tytulowy o temperaturze topnienia 240° z rozkladem [q:]d0 = —52° w 50% kwasie octowym.Przyklad VIII. MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Glu(OTB)-Leu-His-L SBOC)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 • 2CH3COOH.- 3/H2014 90 224 Postepujac wedlug przykladu II i stosujac jako produkty wyjsciowe sekwensy skladowe EF3 i ABCD, otrzymuje sie zwiazek tytulowy o temperaturze topnienia 230° rozklad, [a]o0 = -45° w 50% kwasie octowym.Przyklad IX. MCP-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-^ Ty-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NHi " 6 CH3COOH • 8 H20 Postepujac wedlug przykladu III i stosujac jako produkt wyjsciowy dotriakontapeptyd z przykladu VIII, otrzymuje sie zwiazek tytulowy o temperaturze topnienia 220° z rozkladem, [a]o° =-60° w 50% kwasie octowym. „ Przyklad X. BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Va^Leu-Gly-Lys(BOC)-Leu-Sef-GIn-GIn-Leu- Hi$-Lys- (BOC)-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-GlyThr-Pro-NH2 • CH3COOH • 3H20. X Postepujac wedlug przykladu II i stosujac jako produkty wyjsciowe sekwensy skladowe EF i ABCDI, otrzymuje sie zwiazek tytulowy o temperaturze topnienia 235° z rozkladem, [a]fc° = —46° w 50% kwasie octowym.-.Przyklad XI. H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu- Gly-Lys-Leu-Ser-Gln<3ln-Leu-His-Lys-Leu-Gln Thr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 • 6CH3COOH • 10 H20 Rozpuszcza sie 1,05 g hydrazydu oktapaptydu (sekwens skladowy EF3) w mieszaninie 50 ml dwumetylo- formamidu i 1,2 ml dioksanu/2n HCI w temperaturze -20°. Dodaje sie 0,116 ml azotynu Ijl-rzed.-butylowego, miesza w ciagu 10 minut w temperaturze —20°C, dodaje 1,4 ml trójetyloaminy i 3,1 g dwuoctanu trikozapeptydu (sekwens skladowy ABCD) i 5 ml wody i miesza wciagu 16 godzin w temperaturze 0°C. Odparowuje sie do sucha, przemywa pozostalosc eterem etylowym, chloroformem i acetonem. Otrzymany w ten sposób surowy peptyd rozpuszcza sie w 100 ml 0,3 n kwasu octowego, traktuje 20 ml Amberlitu-IRA-410(octan) i dodaje 50 ml 0,6 n wodorotlenku amonowego. Nastawia sie wartosc pH na 6,5 i przepuszcza sie otrzymany roztwór przez kolumne wypelniona karboksymetyloceluloza (10 X 100 cm) która wyrównano za pomoca roztworu buforowe¬ go 0,15 n octanu amonowego. Eluowanie prowadzi sie za pomoca buforu octanu amonowego o wzrastajacym stopniu stezenia i wartosci pH = (0,15—0,4 n; pH = 6,5-7,0). Polaczone frakcje zawierajace czysty peptyd liofilizuje sie trzykrotnie, pozostalosc przemywa sie etanolem i nastepnie eterem etylowym i osusza sie nad wodorotlenkiem potasowym w wysokiej prózni. Otrzymuje sie zwiaze^ tytulowy o temperaturze topnienia 230° (rozklad) [a]?° = 45° w 50% kwasie octowym.Przyklad XII. BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys(BOC)-Leu-Ser-Gln-Glu(OTB)-Leu- His-Lys(BOC)-Tyr-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 • 2CH3COOH -3 H20.Postepujac wedlug przykladu III i stosujac jako produkty wyjsciowe sekwensy skladowe EF iABCID, otrzymuje sie zwiazek tytulowy o temperaturze topnienia 230° z rozkladem, [a]fc° s —45° w 50% kwasie octowym.Przyklad XIII. H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Tyr- Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly- Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 • 6 CH3COOH • 10 H20 Postepujac wedlug przykladu III i stosujac jako produkt wyjsciowy dotriakontapeptyd z przykladu XII otrzymuje sie zwiazek tytulowy o temperaturze topnienia 216° z rozkladem, [a]20 =43° w 50% kwasie octowym.Przyklad XIV. BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-SerThr-Cys-Val-Leu (BOC)-Tyr^Gln-ThrTyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser -Gly-Thr-Pro-NH2 • 2 CH3COOH • 3 H20 Postepujac wedlug przykladu II i stosujac jako produkty wyjsciowe sekwensy skladowe EF i ABCIDI, otrzymuje sie zwiazek tytulowy o temperaturze topnienia 235° (rozklad, [aft0 ¦ -43° win kwasie octo¬ wym/metanolu (2 :1).Przyklad XV. H-Cys-Ser-Asn-Leu-SerThr-Cys-Val-Leu<3ly-Lys-Leu-Ser<3ln<5ln-Leu-His-LysTyr<3ln-Th tr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 -6CH3COOH- 10 H20 r Postepujac wedlug przykladu III i stosujac jako produkt wyjsciowy dotriakontapeptyd z przykladu XIV otrzymuje sie zwiazek tytulowy o temperaturze topnienia 216° (rozklad), [a]fc° - -43° w 1n kwasie octowym. PL