Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania mie¬ szaniny izomerów nowych pepstatyn przy uzyciudrobnou¬ strojów, wytwarzajacych pepstatyne. Stwierdzono, zepep- statyna jest skutecznym srodkiem przeciwko owrzodze- niom zoladkowym. Jako drobnoustroje, wytwarzajace pe¬ pstatyne, zidentyfikowano Streptomyces testaceus Hama- da i Okami, oznaczony jako Streptomyces testaceus ATCC nr 21469. Pepstatyna jest pentapeptydem, zawierajacym po stronie grupy aminowej N-zacylowany kwas izowale- rianowy i po stronie grupy karboksylowej - wolny kwas karboksylowy (J. Antibiotics, 23, 259-262, 1970, ibid., 23, 263-265, 1970).Pepstatyne mozna otrzymywac przez hodowle szczepu, •wytwarzajacego pepstatyne w odzywczym srodowisku, zawierajacym peptony i inne substancje dostarczajace azo¬ tu, oraz przez ekstrakcje z rozczynu hodowlanego i oczysz¬ czenie. Pepstatyne mozna równiez otrzymywac w postaci jej soli z metalami amidów lub estrów, jak to opisal Umezwa i wspólpracownicy w japonskim opisie patento¬ wym nr 659 783. Przeprowadzono badania inhibitorów pepsyny w rozczynie hodowli powyzszych szczepów, wy¬ twarzajacych pepstatyne. Na podstawiedoswiadczen,pro¬ wadzonych w róznych warunkach, stwierdzono wiecej, niz dwie substancjepodobnedo pepstatynyitak,jak pepstaty¬ na, wykazujace dzialanie antypepsynowe. Substancje te równia sie jednak od pepstatyny na chromatogramie cien¬ kowarstwowym na silikazelu oraz grupa kwasu tluszczo¬ wego pepstatyny w chromatografii gazowej, po hydrolizie w srodowisku kwasnym.Jedna z nowych pepstatyn, nazwanych pepstatyna B, mozna krystalizowac z roztworu metanolu jako jej ester metylowy w postaci drobnych igiel. Pepstatyna B topi sie w temperaturze okolo 254-255°C, jej sklad elementarny C-60,4, N-9,74, i H-9,38%, wartosci obliczone dla C„H67N50,: C-60,6, H-9,40 i H-9,28%, skrecalnosc optycz¬ na (a)"D = 95,5 (C = 0,5, kwas octowy). Podobnie, jak pepstatyna, daje ona niebieskie zabarwienie w reakcji Rydona Smitha oraz czerwone zabarwienie w reakcji z chlorkiem zelazowym hydroksyloaminy. Ester metylowy pepstatyny B jest umiarkowanie rozpuszczalny w dwume- tyloformamidzie, sulfotlenku dwumetylu i kwasie octo¬ wym oraz znacznie rozpuszczalny w wodzie, chloroformie, benzenie, octanie etylu i eterze. Jest on lepiej rozpuszczal¬ ny w metanolu, niz ester metylowy pepstatyny (5-10 mg/cm3).Produkty hydrolizy w srodowisku kwasnym estru mety¬ lowego pepstatyny B, prowadzonej, przy uzyciu 20%- owego kwasu solnego w ciagu 16 godzin w temperaturze 105°C, ekstrahowano eterem i badano metoda chromato¬ grafii gazowej i dwumiarowej chromatografii cienkowars¬ twowej. W ekstrakcie eterowym stwierdzono obecnosc kwasu n-kapronowego. W warstwie wodnej, oprócz kwasu 3-hydroksy-4-amino-6-metyloheksanokarboksylowego stwierdzono obecnosc waliny i alaniny w stosunku 2:1. Na tej podstawiemozna oszacowac, ze pepstatyna B zbudowa¬ na jest z podstawionej grupy kwasu tluszczowego pepsta¬ tyny o wzorze przedstawionym na rysunku, w którym R oznacza reszte n-kaproilowa wprzypadkupepstatyny B, a R oznacza reszte izo-kaproilowa w przypadku pepstaty¬ ny C, a R1 oznacza atom wodoru, nizsza grupe alkilowalub 88 96888 968 3 atom metalu alkalicznego i kwasu n-kapronowego.W chromatografii cienkowarstwowej na silikazelu przy uzyciu ukladu rozpuszczalników chloroform : metanól- i kwas octowy = 95 :-4 : 1, na podstawie barwnej reakcji Rydona-Smitha okresla siedla estru metylowego pepstaty¬ ny B wartosc R( = o,39 i dla estru metylowego pepstatyny Rr = 0,35. Dzialanie antypepsynowe estru metylowego pe¬ pstatyny B jest takie same, jak estru metylowego pepsta¬ tyny.Stwierdzono, ze szczep, wytwarzajacy pepstatyne, moze produkowac pepstatyne B, której grupa kwasu tluszczo¬ wego podstawiona jest dokwasukapronowego zczesteczki pepstatyny. Na tej podstawiemozna spodziewac sie wyste¬ powania wiekszej ilosci substancji podobnych do pepsta¬ tyny, rózniacych siegrupakwasu tluszczowego. Inna peps- tatyna, nazwana pepstatyna C, zawiera kwas izokaprono- wy, której ester metylowy wykazuje wartosc Rf = 0,39, taka sama, jak dla pepstatyny B. Ester metylowy innej jeszcze pepstatyny wykazuje wartosc Rf = 0,42. Tensklad¬ nik o dzialaniu antypepsynowym otrzymuje sie w postaci drobnych igiel; w produktach hydrolizy w srodowisku kwasnym tej substancji stwierdza sie w chromatografii gazowej wystepowanie tych samych aminokwasów ipieciu kwasów tluszczowych C5-C16.Wymienione nowe pepstatyny mozna okreslic jako peps¬ tatyny, zawierajace kwasy tluszczowe C5-C,6, takie, jak kwas n-kapronowy lub kwas izokapronowy, inne niz kwas izowalerianowy pepstatyny.Wedlug wynalazku, nowe pepstatyny wytwarza sie na¬ stepujacymi sposobami: Szczep, produkujacy pepstatyne, zaszczepia sie do odzywczego srodowiska, zawierajacego kazeine, smietanke z mleka i lub odzywke z ziarna sojowe¬ go jako zródlo azotu i w ciagu 3-10 dni poddaje sie inkubacji w zwyczajnych warunkach aerobowych, do chwili uzyskania maksymalnego dzialania antypepsyno- wego rozczynu hodowlanego. Aktywny skladnik mozna ekstrahowac n-butanolem z rozczynu hodowlanego lub jego przesaczu albo metanolem z masy grzybniowej. Uzy¬ skany w ten sposób ekstrakt zateza sie do syropu lub do zóltych osadów. Syrop wkrapla sie do 5-20 objetosci wody w celu utworzenia osadu, który odsacza sie i po wysuszeniu otrzymuje sie nowe pepstatyny w stanie surowym. Surowa pepstatyne rozpuszcza sie w nizszymalkoholu iestryfikuje sie w ciagu kilku godzin w temperaturze pokojowej lub wyzszej przy uzyciu malych ilosci katalizatora estryfikacji takiego, jak kwas solny, kwas siarkowy, kwas p-tolueno- sulfonowy, chlorek tionylu, pieciochlorek fosforu, lub POCl3 itp, W wyniku estryfikacji surowych pepstatyn otrzymuje sie mieszanine ich estrów metylowych, przy " czym glówna czesc estru metylowego pepstatyny mozna wydzielic przez krystalizacje z roztworu metanolu. Na podstawie badania tej krystalicznej frakcji metoda chro¬ matografii cienkowarstwowej stwierdza sie, zeester mety¬ lowy oryginalnej pepstatyny i nowych pepstatyn wystepu¬ je w stosunku 1:1. Tegodrugiego estru wiecej znajdzie sie w lugu macierzystym i mozna go zatezyc nastepujacym sposobem. Krysztaly krystalizuje sie ponownie z roztworu metanolu i oddziela sie od nich lug macierzysty. W lugu tym nie ma juz prawie estru metylowego oryginalnej peps¬ tatyny i mozna z niego krystalizowac oczyszczony ester metylowy nowych pepstatyn w postaci drobnych igiel.Sposób wedlug wynalazku obejmuje otrzymywanie al¬ kalicznych soli nowych pepstatyn na drodze hydrolizy w srodowisku alkalicznym estrówtychpepstatynz alkoho¬ lem oraz otrzymywanie wolnych nowych pepstatyn, uzy- 4 skiwanych przez zobojetnienie powyzszych alkalicznych produktów hydrolizy. Hydrolize w srodowisku alkalicz¬ nym mozna przeprowadzic sposobem opisanym w opisie patentowym, dotyczacym oryginalnej pepstatyny, tj. w ja- ponskim opisie patentowym nr 659 783. Alkaliczne sole nowych pepstatyn, a konkretnie sól sodowa pepstatyny B jest bialym, bezpostaciowym proszkiem, rozkladajacym sie w temperaturze 250-255°C i wykazujacym 50%-owe zahamowanie pepsyny (ID)50 przy 0,055 y. W przeciwiens- twie do pepstatyny, pepstatyna B w postaci wolnego zwiazku jest bialym, bezpostaciowym proszkiem, który otrzymuje sie przez krystalizacje z metanolu i wody w sto¬ sunku 2:1. Rozklada sie ona w temperaturze okolo 210- 220°C. Skrecalnosc wlasciwa (a)20D-85° (C = 1,0 metanol), a ID50 pepsyny wynosi 0,05y. Widmo w podczerwieni dla pepstatyny B przedstawiono na fig. 2. Rozpuszcza sie ona rlatwo w metanolu, 100 mg/ml, tj. dziesieciokrotnie lepiej od oryginalnej pepstatyny. Ponadto, pepstatyna B rozpu¬ szcza sie w wodnym roztworze butanolu, w etanolu, alko- holu izopropylowym, dwumetyloformamidzie, sulfotlenku dwumetylu, kwasie octowym lub pirydynie, jest nieznacz¬ nie ropzuszczalna w wodnym roztworze acetonu, lecz trud¬ no rozpuszcza sie wodwodnionym acetonie, odwodnionym butanolu, chloroformie, benzenie, eterze i wodzie.Nizej podane przyklady ilustruja wynalazek, nie ograni¬ czajac jego zakresu.Przyklad I. Wytwarzajacy pepstatyne szczep Strepto- myces testaceus zaszczepia sie do 2900 1 sterylizowanej pozywki, zawierajacej 5,5% glikozy, 2,0% oleju sojowego, 4,5% smietanki z mleka, 5,0% kazeiny mleka, 0,15% K2HPO„ 0,35% NaCl i 0,15% MgS04. 7H20 (pH = 6,45).Pozywke poddaje sie inkubacji w ciagu 112 godzin.w tem¬ peraturze 23-24°C, mieszajac i napowietrzajac. Rozczyn zawiera skladnik antypepsynowy w ilosci równowaznej stezeniu pepstatyny 2260 /cm3. Dodajac rozcienczonego kwasu siarkowego, pH rozczynu doprowadza, sie do 2,5 orza dodaje sie 3600 1 metanolu. Mieszanine miesza sie w ciagu 40 minut w temperaturze 15-20°C, dodaje sie 4% 40 srodka, ulatwiajacego saczenie, przesacza*sie i przemywa.Do 6300 1 uzyskanego w ten sposób eluatu metanolowego dodaje sie lugu, az do pH = 10, metanol odparowuje siepod próznia i otrzymuje sie 1900 1 wodnej pozostalosci. Do tej pozostalosci dodaje sie 800 1 n-butanolu i pH mieszaniny doprowadza sie do 7,0. Mieszanine miesza sie w ciagu 30 minut w temperaturze 20°C i oddziela sie 960 1 ekstraktu butanolowego. pH tego ekstraktu doprowadza sie do war¬ tosci 3,0 i zateza sie go pod próznia do 55 1 syropu. Syrop ten wkrapla sie, mieszajac, w ciagu 60minut, do 8001 wody i wytracony osad odsacza sie. Osad przemywa sie woda, liofilizuje i otrzymuje sie 7990 g zóltego proszku surowych nowych pepstatyn. Proszek ten zawiera 64% skladnika antypepsynowego, równowaznego pepstatynie. 6080 g tego surowego produktu rozpuszcza sie w 33 55 1 metanolu i w celu odbarwienia dodaje 1,25 kg wegla aktywnego. Do 381 odbarwionego roztworu metanolowego dodaje sie 125 cm3stezonego kwasu siarkowego i miesza sie go w ciagu 2,5 godziny w temperaturze 60°C. Mieszanine reakcyjna zobojetnia sie 0,63 1 trójetyloaminy i miesza sie 60 w ciagu 120 minut w temperaturze 50-60°C. Otrzymuje sie bialy, krystaliczny osad, który przemywa sie woda i meta¬ nolem, i suszy pod próznia. Uzyskuje sie 3230 g estrów metylowych nowej pepstatyny o dzialaniu antypepsyno¬ wym (ID)50 przy y 0,056. Temperatura rozkladu: 250-251°C 65 i (a),0D- 90°C (C = 1,0, kwas octowy). Proszek ten zawiera88 968 powyzej 80% estrów metylowych pepstatyny B i C o Rf = 0,39 (chromatografia cienkowarstwowa).Przykladu. 3100 g estru metylowego nowej pepstatyny (uzyskanej wedlug przykladu I) rozpuszcza sie w 130 1 mieszaniny 90% metanolu, zawierajacej 0,2 n wodorotle¬ nek sodowy i hydrolizuje sie w ciagu 2 godzin w temperatu¬ rze 60°C. Z mieszaniny reakcyjnej odparowuje sie pod próznia i uzyskuje sie szlamowaty koncentrat. Koncentrat rozpuszcza sie w 201 wody nasyconej n-butanolem, dodaje sie 151 wody i rozcienczonym kwasem siarkowym ustala sie pH = 3,0. Mieszanine miesza sie w ciagu 60 minut i uzyskany osad odsacza sie, i prze¬ mywa woda. Przemyty osad suszy sie pod próznia i otrzymuje sie 2500 g proszku o temperaturze Wkladu 205-210° (a£° -84° (c= 1,0, metanol), ID50 (50%-owe zahamowanie pepsyny) przy y 0,055. Krzywa miareczkowania wskazuje zazycie 9,7 cm3 0,1 n NaOH na 700 mg próbki.Przyklad III. 100 g estrówmetylowych nowej pepstaty¬ ny (uzyskanej wedlug przykladu I) rozpuszcza sie w 4 1 absolutnego metanolu i odbarwia sie20gwegla aktywne¬ go. Roztwór metanolowy pozostawia sie na nociotrzymuje w pierwszym rzucie 24 g bialych krysztalów. 4,3 1 metano¬ lowego lugu macierzystego zateza sie do objetosci 1,3 1, miesza sie w ciagu 60 minut w temperaturze 60°C w celu przeprowadzenia krystalizacji. Mieszanine pozostawia sie na noc i w drugim rzucie uzyskuje sie 5,5 g bialych krysztalów. Krysztaly tego drugiego rzutu rozpuszcza sie w 1,5 1 goracego metanolu i poddaje dzialaniu wegla aktywnego. Metanolowy roztwór pozostawia sie na noc i otrzymuje sie 12,0 g bialych krysztalów trzsciego rzutu.Fizykochemiczne wlasnosci uzyskanych w ten sposób' substancji krystalicznych: Krysztaly pierwszego rzutu: temperatura rozkladu 250- 251°C (a)20D - 90,5° (C = 0,5, kwas octowy), ID50 przy y 0,05 substancja o Rf 0,35: substancja o Rf 0,39 = 1 : 1 do 1 : 2 (chromatografia cienkowarstwowa), chloroform : meta¬ nol : kwas octowy = 95 : 4 : 1).Krysztaly drugiego rzutu: temperatura rozkladu 253- 254°C,(a)20D-91,5°(C = 0,5, kwas octowy), ID50 przy y 0,05, glównie substancja o Rf 0,39 i slady substancji o Rf 0,42 (chromatografia cienkowarstwowa, chloroform : metanol- : kwas octowy = 95 : 4 : 1).Krysztaly trzeciego rzutu: temperatura rozkladu 254- 255°C, (a)2UD - 95,5° (C = 0,5, kwas octowy, ID50 przy y 0,05, glównie substancja o Rf 0,39 (pepstatyny B) i sladysubstan¬ cji o Rf 0,42 (chromatografia cienkowarstwowa, chloro¬ form : metanol : kwas octowy = 95 : 4 : 1), widmo w pod¬ czerwieni przedstawiono na fig. 1, wartosci oznaczone: C-60,14, H-9,38 i N-9,74%, umiarkowana rozpuszczalnosc w sulfotlenku dwumetylu, dwumetyloformamidzie i kwa¬ sie octowym, mala rozpuszczalnosc w metanolu (5-10 mg/cm3), lecz lepsza, nize estru metylowego pepstatyny.Przyklad IV. Wytwarzajacy pepstatyne szczep zasz¬ czepia sie do 130 1 sterylizowanej pozywki, zawierajacej 6,0% glikozy, 2,0% gliceryny, 4,0% smietanki z mleka, 4,5% kazeiny mleka, 0,1% K2HP04, 0,3% NaCl i 0,1% MgS04.7H20 (pH = 6,8) i poddaje sie inkubacjiw ciagu 137 godzin w warunkach, opisanych w przykladzie I. Do 1251 rozczynu hodowlanego, zawierajacego skladnik antypep- synowy w ilosci równowaznej 170 g pepstatyny, dodaje sie 60 1 n-butanolu i mieszanine miesza sie w ciagu 40 minut w temperaturze pokojowej. Nastepnie, warstwe butanolo- wa, warstwe wodna i warstwe stala (mase grzybniowa) 6 rozdziela sie przez odwirowanie. Warstwe butanolowa przemywa sie woda i zateza sie po próznia do 1,51 syropu.Us"tala sie pH syropu na wartosc 3,0, dodaje sie 7,51 n-he- ksanu i miesza w celu uzyskania zóltawo-brazowego osa- du. Mieszanine miesza sie jeszcze w ciagu 60 minut, osad odsacza sie, przemywa i suszy pod próznia, i otrzymuje sie 164 g surowej nowej pepstatyny o dzialaniu antypepsyno- wym ID50 przy y 0,075. 150 g nowej pepstatyny rozpuszcza sie w 1,5 1 90%- io owego metanolu w temperaturze 40-50°C i odbarwia sie 150 g wegla aktywnego. Do 1,6 1 odbarwionego roztworu metanolowego dodaje sie w temperaturze pokojowej 1,0 # 1 wody i uzyskuje sie zelowaty osad. Osad przesacza sie, przemywa 50%-owym metanolem i poliofilizacji otrzymu- je sie 94 g lekko zóltawego proszku, wykazujacegoprzeciw pepsynie ID60 przy 7 0,062. Proszek ten rozpuszcza sie w 90%-owym ^etanolu, dwukrotnie zadaje sie weglem aktywnym tak, jak to powyzej opisano, i uzyskuje sie 45 g bialego proszku nowej pepstatyny. ID50 przy y 0,055, temperatura rozkladu 198 do 205°C, (a)2nD = -79° (C = 1,0, metanol), na cMromatogramie cienkowarstwowym okresla sie R, 0,35 - pepstatyna, Rf 0,39 -pepstatyna B i pepstatyna C oraz Rf 0,42, a proporcje substancji o R( 0,35, 0,39 i 0,42 wynosily 1 : 3 : 0,1.Przyklad V. Wytwarzajacy pepstatyne szczep zaszcze¬ pia sie do 1301 sterylizowanej pozywki, zawierajacej 6,0% - glikozy, 2,0% gliceryny, 1,5% smietanki mleka, 1,5% kaze¬ iny mleka, 5,7% pozywki z ziarna sojowej, 0,1% K2HP04, 0,3% HaCl i MgSO,. 7H20 (pH = 5,5) i poddaje sie inkuba- cji w ciagu 137 godzin w warunkach, opisanych w przykla¬ dzie I. 110 g rozczynu hodowlanego, zawierajacego sklad¬ nik antypepsynowy w ilosci równowaznej 132 g pepstaty¬ ny, przesacza sie z dodatkiem 7 kg srodka, ulatwiajacego saczenie. Dodajac rozcienczonego kwasu siarkowego, ustala sie pH = 2,0 i mieszanine rozdziela sie na 33 kg (masa na mokro) masy grzybniowej i 75 1 przesaczu. Do masy grzybniowej dodaje sie 83 1 absolutnego metanolu i uzyskana szlamowata mieszanine miesza sie w ciagu 40 ' minut. Nastepnie, mieszanine przesacza sie, placek filtra- 40 cyjny przemywa sie dwukrotnie 401 70%-owego metanolu i otrzymuje sie 1401 wodnego, metanolowego eluatu. Do 75 1 przesaczu hodowli dodaje sie 35 1 n-butanolu, miesza sie go w ciagu 15 minut i po rozdzieleniu otrzymuje sie 37 1 warstwy butanolowej i 731 warstwy wodnej. 1401 wodne- 45 go, metanolowego eluatu, uzyskanego z masy grzybniowej, zateza sie pod próznia do 27 1 wodnego roztworu i miesza sie z 37 1 butanolowgo ekstraktu uzyskanego z przesaczu hodowli. Mieszanine te odwirowuje sie w celu usuniecia warstwy wodnej i otrzymujesie 351 ekstraktu butanolowe- 50 go. Ustala sie pH tego ekstraktu 3,0 i zateza sie go pod próznia do 1,0 1 syropu. Syrop wkrapla sie do 15 1 wody i miesza sie w ciagu 60 minut, az do wytracenia osadu. Osad odsacza sie, przemywa woda i powysuszeniuw temperatu¬ rze 60-70°C otrzymuje sie 158 g zóltawego proszku nowej 55 pepstatyny o ID50 przeciw pepsynie przy y 0,072.Takuzyskany proszek estryfikuje sie metanolem sposo¬ bem, podanym w przykladzie I i uzyskuje sie 62 g bialego, krystalicznego proszku estru metylowego pepstatyny.IDB0 przy y 0,05, temperatura rozkladu 250-252°C (a)"D - 90,6° 60 (C = 0,5, kwas octowy), na chromatogramie cienkowars¬ twowym stwierdza sie wystepowanie glównie estru mety¬ lowego nowej pepstatyny o Rf 0,39 i sladowych ilosci estru metylowego pepstatyny. g tego estru metylowego nowej pepstatynyhydrolizu- 65 je sie w ciagu 2 godzin w temperaturze 60°C przy uzyciu88 968 450cm3 90%-owego roztworu metanolu, zawierajacego 0,2 nNaOH. Dodajac rozcienczonego kwasu solnego, ustala sie pH mieszaniny reakcyjnej na 8,5 i zateza sie do objetosci 150 cm', przy czym wytraca sie osad. Osad odsacza sie, przemywa metanolem i po wysuszeniu pod próznia otrzy¬ muje sie 17,9 g bialego proszku soli sodowej nowej pepsta- tyny o ID50 przy y 0,05, temperatura rozkladu 245-249°C, (a)20D-84° (C = 1,0, metanol), podczas miareczkowania zuzywa sie 10,1 cm10,1 n kwasu solnego napróbke 700 mg.Przyklad VI. 4,0 g nowej pepstatyny w postaci wolnego kwasu, uzyskanej wedlug przykladu II, rozpuszcza sie, ogrzewajac w 100 cm3 absolutnego etanolu i dodaje sie 0,2 cm3 stezonego kwasu siarkowego. Te mieszanine ogrzewa siew ciagu 6 godzin na lazni z wrzaca woda i zateza sie pod próznia do objetosci 50 cm3. Utworzony osad odsacza sie, przemywa woda, suszy i otrzymuje sie 1,6 g proszjcu.Proszek ten krystalizuje sie ze 100 cm3 roztworu absolutne¬ go metanolu i uzyskuje sie 1,15 g bialego, krystalicznego proszku estru metylowegonowej pepstatyny (estru metylo¬ wego pepstatyny B) o ID50 przy 0,054, temperatura rozkla¬ du 250-252°C i (a)20n- 90°C (C = 0,5, kwas octowy).Przyklad VII. 3,0 g nowej pepstatyny, uzyskanej we¬ dlug przykladu II, rozpuszcza sie, ogrzewajac w 100 cm3 absolutnego alkoholu n-propylowego, dodaje sie 0,2 cm3 stezonego kwasu siarkowego i estryfikuje sie w ciagu 6 godzin w temperaturze 80°C. Mieszanine reakcyjna zateza sie pod próznia do objetosci 20 cm3 i wytracony osad odsacza sie, przemywa alkoholem n-propylowym : po wy¬ suszeniu otrzymuje sie900 mg bialego proszku. Proszekten krystalizuje sie z 40,0 cm3 roztworu absolutnego alkoholu propylowego i uzyskuje sie 48,0 mg bialego proszku estru n-propylowego pepstatyny B o ID51) przy 0,073, temperatu¬ ra rozkladu 218-220°C (a)20t) - 89,5° (C = 0,5, kwas octowy).Przyklad VIII. 3,0 g nowej pepstatyny, uzyskanej we¬ dlug przykladu II, rozpuszcza sie w 100 cm3 goracego, absolutnego n-butanolu i dodaje sie 0,2 cm3 stezonego 8 kwasu siarkowego. Estryfikacje prowadz-i sie w ciagu 6 godzin w temperaturze 80°C, po czym mieszaninezateza sie pod próznia do objetoaci 2,0 cm3. Uzyskany osad odsacza sie, przemywa n-butanolem i po wysuszeniu otrzymuje sie 800,0 mg bialego proszku. Proszek ten krystalizuje sie 15,0 cm3 roztworu n-butanolu i uzyskuje sie 340 mg bialego proszku estru n-butylowego nowej pepstatyny B o ID50przy 0,084, temperatura rozkladu 205-207T i (arn-80°C (C = 0,5, kwas octowy). PLThe subject of the invention is a process for the preparation of a mixture of isomers of new pepstatin by using fine particles that produce pepstatin. Zepstatin has been found to be effective against gastric ulcers. Streptomyces testaceus Hamada and Okami, designated Streptomyces testaceus ATCC No. 21469, were identified as pstatin-producing microorganisms. Pepstatin is a pentapeptide containing N-acylated isovalric acid on the amino side and free carboxylic acid on the carboxyl side. (J. Antibiotics, 23, 259-262, 1970, ibid., 23, 263-265, 1970). Pepstatin can be obtained by culturing a pepstatin-producing strain in a nutrient environment containing peptones and other nitrogen-donating substances, and by extraction from the culture solution and purification. Pepstatin may also be obtained in the form of its metal salts, amides or esters, as described by Umezwa and colleagues in Japanese Patent No. 659,783. Studies have been carried out on pepsin inhibitors by culturing the above pepstatin producing strains. On the basis of experiments carried out under different conditions, more than two substances similar to pepstatin, such as pepstatin, having an antipepsinic effect were found. However, these substances are equal to the pepstatin in a silicasel thin-layer chromatogram and the pepstatin fatty acid group in gas chromatography, after hydrolysis in an acidic environment. One of the new pepstins, called pepstatin B, can be crystallized from a methanol solution as its methyl ester in form of fine needles. Pepstatin B melts at about 254-255 ° C, its elemental composition is C-60.4, N-9.74, and H-9.38%, values calculated for C "H67N50,: C-60.6, H-9.40 and H-9.28%, optical accuracy (a) "D = 95.5 (C = 0.5, acetic acid). Like pepstatin, it gives a blue color in the Rydon Smith reaction and red color in reaction with hydroxylamine ferric chloride Pepstatin B methyl ester is moderately soluble in dimethylformamide, dimethyl sulfoxide and acetic acid, and significantly soluble in water, chloroform, benzene, ethyl acetate and ether. in methanol than pepstatin methyl ester (5-10 mg / cm3). The products of hydrolysis in the acid environment of pepstatin B methyl ester, carried out with 20% hydrochloric acid for 16 hours at 105 ° C, were extracted with ether and the gas chromatography and two-step thin-layer chromatography were examined. Acid was found in the ether extract. u n-kapron. In the aqueous layer, in addition to the 3-hydroxy-4-amino-6-methylhexanecarboxylic acid, valine and alanine in the ratio 2: 1 were found. On this basis, it can be estimated that pepstatin B is composed of the substituted peptin fatty acid group of the formula shown in the figure, in which R is an n-caprooyl residue in the case of pepstatin B, and R is an iso-caprooyl residue in the case of pepstatin C. and R1 is a hydrogen atom, a lower alkyl group or an alkali metal and n-caproic acid group 88 96 888 968 3 In thin layer chromatography on silicazel with the solvent system chloroform: methanol- and acetic acid = 95: -4: 1, based on the color The Rydon-Smith reaction determines the site of pepstatin B methyl ester R value (= 0.39 and for pepstatin methyl ester Rr = 0.35. The antipepsin effect of pstatin B methyl ester is the same as that of peptatin methyl ester. that the strain, which produces pepstatin, can produce pepstatin B, the fatty acid group of which is substituted with caproic acid from the pepstatin molecule. Testing for more peptin-like substances that differ in the group of fatty acid. Another pepstatin, called pepstatin C, contains isocaproic acid, the methyl ester of which has an Rf value of 0.39, the same as that of pepstatin B. The methyl ester of another still pepstatin has an Rf value of 0.42. The ingredient with an antipepsinic effect is obtained in the form of fine needles; The presence of the same amino acids and five C5-C16 fatty acids in the acidic hydrolysis products of this substance is found in gas chromatography. These new pepstatins can be described as pepstatin, containing C5-C, 6 fatty acids, such as n-caproic acid or isocaproic acid, other than pepstatin isovaleric acid. According to the invention, the new pepstatins are produced by the following methods: The pepstatin producing strain is inoculated into a nutrient medium containing casein, milk cream and or soybean nutrient as a nitrogen source and within 3-10 days incubated under customary aerobic conditions, until the antipepsinic effect of the culture solution is maximized. The active ingredient can be extracted with n-butanol from the culture solution or its slurry or with methanol from the mycelial mass. The extract thus obtained is concentrated to a syrup or to yellow precipitates. The syrup is dripped into 5-20 volumes of water to form a precipitate which is filtered off and after drying, new raw pepstatins are obtained. Crude pepstatin is dissolved in lower alcohol and esterified in a few hours at room temperature or above using small amounts of an esterification catalyst such as hydrochloric acid, sulfuric acid, p-toluenesulfonic acid, thionyl chloride, phosphorus pentachloride, or POCl3 etc. esterification of the crude pepstatins gives a mixture of their methyl esters, and the main part of the pepstatin methyl ester can be separated by crystallization from methanol solution. Based on the examination of this crystalline fraction by thin-layer chromatography it is concluded that the methyl ester of the original pepstatin and the new pepstatin The ratio of this second ester will be found in the mother liquor more and can be concentrated by the following method. The crystals are recrystallized from the methanol solution and the mother liquor is separated from them. There is almost no methyl ester of the original peps in this ester. ¬ tatin and it can be crystallized purified methyl ester of the new pepstatin in the form of fine needles. The method of the invention comprises the preparation of alkaline salts of the new pepstatin by hydrolysis in an alkaline environment of the pepstatin ester with alcohol, and the preparation of free new pepstatin obtained by neutralizing the above alkaline hydrolysis products. Hydrolysis in an alkaline environment can be carried out as described in the patent pending the original pepstatin, i.e. in Japanese Patent No. 659,783. The alkaline salts of the new pepstatin, in particular the sodium salt of pepstatin B, is a white, amorphous powder that decomposes in at 250-255 ° C and showing 50% inhibition of pepsin (ID) 50 at 0.055 µ. Unlike pepstatin, free pepstatin B is a white, amorphous powder that is obtained by crystallization from methanol and water in a ratio of 2: 1. It decomposes at a temperature of about 210-220 ° C. The specificity of the specificity (a) is 20D-85 ° (C = 1.0 methanol), and the ID50 of pepsin is 0.05y. The infrared spectrum for pepstatin B is shown in Figure 2. It dissolves readily in methanol, 100 mg / ml, ie ten times better than the original pepstatin. Furthermore, pepstatin B is dissolved in aqueous butanol, ethanol, isopropyl alcohol, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, acetic acid or pyridine, is slightly soluble in aqueous acetone, but hardly dissolves in aqueous acetone, in dehydrated butanol, chloroform, benzene, ether and water. The following examples illustrate the invention without limiting the scope of the invention. Example 1. A pepstatin producing strain of Streptomyces testaceus is inoculated into 2900 liters of sterilized medium containing 5.5% glucose, 2 , 0% soybean oil, 4.5% milk cream, 5.0% milk casein, 0.15% K2HPO, 0.35% NaCl, and 0.15% MgSO4. 7H 2 O (pH = 6.45). The medium is incubated for 112 hours at 23-24 ° C, while stirring and with aeration. The solution contains an antipepsin component in an amount equivalent to a pepstatin concentration of 2260 / cm3. By adding dilute sulfuric acid, the pH of the solution is adjusted to 2.5 hours, 3600 liters of methanol are added. The mixture is stirred for 40 minutes at 15-20 ° C, 4% of a filter aid is added, filtered and washed. To 6300 l of the methanol eluate obtained in this way is added lye until the pH = 10, the methanol is evaporated under vacuum and 1900 liters of an aqueous residue are obtained. 800 l of n-butanol are added to this residue and the pH of the mixture is adjusted to 7.0. The mixture is stirred for 30 minutes at 20 ° C and 960 liters of butanol extract are separated. The pH of this extract is adjusted to 3.0 and it is concentrated under a vacuum to 55 liters of syrup. This syrup was added dropwise, with stirring, for 60 minutes, to 800 liters of water, and the precipitate was filtered off. The precipitate is washed with water and freeze-dried to obtain 7990 g of a yellow powder of crude new pepstatin. This powder contains 64% of an antipepsinic ingredient, which is equivalent to pepstatin. 6080 g of this crude product is dissolved in 33.5 l of methanol and 1.25 kg of activated carbon are added for decolorization. 125 ml of concentrated sulfuric acid are added to 381 of the decolorized methanol solution, and it is stirred for 2.5 hours at 60 ° C. The reaction mixture is neutralized with 0.63 l of triethylamine and stirred for 120 minutes at 50-60 ° C. A white, crystalline precipitate is obtained which is washed with water and methanol and dried under vacuum. 3230 g of new pepstatin methyl esters with antipepsinic activity (ID) 50 are recovered at? 0.056. Decomposition temperature: 250-251 ° C 65 and (a), 0D- 90 ° C (C = 1.0, acetic acid). This powder contains88,968 of more than 80% pepstatin B and C methyl esters with Rf = 0.39 (thin layer chromatography). 3100 g of new pepstatin methyl ester (obtained according to Example 1) are dissolved in 130 liters of a 90% methanol mixture containing 0.2 N sodium hydroxide and hydrolyzed for 2 hours at 60 ° C. The reaction mixture is evaporated under vacuum to give a slimy concentrate. The concentrate was dissolved in 201 water saturated with n-butanol, water was added and the pH was adjusted to 3.0 with dilute sulfuric acid. The mixture is stirred for 60 minutes and the resulting precipitate is filtered off and washed with water. The washed pellet is dried under vacuum to give 2500 g of powder with a Feed temperature of 205-210 ° (a ≤ -84 ° (c = 1.0, methanol), ID50 (50% inhibition of pepsin) at y 0.055. Titration indicates the use of 9.7 cm3 of 0.1 N NaOH per 700 mg of sample. Example 3 100 g of new pepstatin methyl esters (obtained according to Example 1) are dissolved in 4 liters of absolute methanol and decolorized by activated carbon. 24 g of white crystals are obtained overnight. 4.3 liters of the methanol mother liquor is concentrated to 1.3 liters, stirred for 60 minutes at 60 ° C to crystallize out. The mixture is left to stand overnight. and in the second crop, 5.5 g of white crystals are obtained. The crystals of the latter crop are dissolved in 1.5 l of hot methanol and treated with activated carbon. The methanol solution is left overnight and 12.0 g of three-throw white crystals are obtained. Physico-chemical property obtained h in this way 'of crystalline substances: First-line crystals: decomposition temperature 250-251 ° C (a) 20D - 90.5 ° (C = 0.5, acetic acid), ID50 at y 0.05 substance with Rf 0.35 : substance with Rf 0.39 = 1: 1 to 1: 2 (thin layer chromatography), chloroform: methanol: acetic acid = 95: 4: 1). Second wave crystals: decomposition temperature 253-254 ° C, (a ) 20D-91.5 ° (C = 0.5, acetic acid), ID50 at y 0.05, mainly substance with Rf 0.39 and traces of substance with Rf 0.42 (thin layer chromatography, chloroform: methanol-: acid acetic acid = 95: 4: 1) Third wave crystals: decomposition temperature 254-255 ° C, (a) 2UD - 95.5 ° (C = 0.5, acetic acid, ID50 at y 0.05, mainly substance with Rf 0.39 (pepstatin B) and a trace of a substance with Rf 0.42 (thin layer chromatography, chloroform: methanol: acetic acid = 95: 4: 1), the infrared spectrum is shown in Fig. 1, : C-60.14, H-9.38 and N-9.74%, moderate solubility in dimethyl sulfoxide, dimethylformamide and acetic acid, low solubility in methanol (5-10 mg / cc) but better than pepstatin methyl ester. Example IV. The pepstatin-producing strain is seeded into 130 liters of sterilized nutrient medium containing 6.0% glucose, 2.0% glycerin, 4.0% milk cream, 4.5% milk casein, 0.1% K2HPO4, 0.3 % NaCl and 0.1% MgSO4.7H2O (pH = 6.8) and incubated for 137 hours under the conditions described in Example I. To 1251 a culture solution containing an antipepin component in an amount equivalent to 170 g of pepstatin is added 60 l of n-butanol are added and the mixture is stirred for 40 minutes at room temperature. Then, the butanol layer, the aqueous layer and the solid layer (mycelial mass) 6 are separated by centrifugation. The butanol layer is washed with water and concentrated under vacuum to 1.51 of the syrup. The pH of the syrup is adjusted to 3.0, 7.51 n-hexane is added and stirred to obtain a yellowish-brown precipitate. The mixture is stirred for another 60 minutes, the precipitate is filtered off, washed and dried under vacuum, and 164 g of crude new pepstatin with ID50 antipepsinic activity are obtained at 0.075. 150 g of new pepstatin is dissolved in 1.5 1 90% - and of this methanol at 40-50 ° C and 150 g of activated carbon are decolourised. To 1.6 l of decolorized methanol solution is added 1.0% of water at room temperature to obtain a gel-like precipitate. The precipitate is filtered, washed 50 With% methanol and polyophilization, 94 g of a slightly yellowish powder is obtained, exhibiting anti-pepsin ID60 at 0.062. This powder is dissolved in 90% ethanol, and twice with activated carbon as described above, 45 g of white powder of novel pepstatin ID50 at y 0.055, r from the composition 198 to 205 ° C, (a) 2nD = -79 ° (C = 1.0, methanol), on the thin-layer cMromatogram is R, 0.35 - pepstatin, Rf 0.39 - pepstatin B and pepstatin C and Rf 0.42, and the proportion of the substances with R (0.35, 0.39 and 0.42 was 1: 3: 0.1). Example 5 A pepstatin-producing strain was inoculated into 1301 sterilized medium containing 6.0% - glucose, 2.0% glycerin, 1.5% milk cream, 1.5% milk casein, 5.7% soybean nutrient, 0.1% K 2 HPO 4, 0.3% HaCl and MgSO. 7H 2 O (pH = 5.5) and incubated for 137 hours under the conditions described in Example I. 110 g of the culture solution containing an antipepsin component in an amount equivalent to 132 g of pepstatin is filtered from with the addition of 7 kg of a decongestant. By adding dilute sulfuric acid the pH is adjusted to 2.0 and the mixture is divided into 33 kg (wet weight) of mycelial pulp and 75 liters of filtrate. 83 L of absolute methanol are added to the mycelium and the resulting slimy mixture is stirred for 40 'minutes. Then, the mixture is filtered, the filter cake is washed twice with 401 of 70% methanol to give 1401 of aqueous methanol eluate. 35 l of n-butanol are added to 75 l of the culture slide, it is stirred for 15 minutes and after separation 37 l of butanol layer and 731 of water layer are obtained. 1401 of the aqueous methanol eluate obtained from the mycelial mass is concentrated under vacuum to 27 L of aqueous solution and mixed with 37 L of butanol extract obtained from the culture filtrate. This mixture is centrifuged to remove the aqueous layer to obtain 351 of the butanol extract. The pH of this extract is adjusted to 3.0 and concentrated under vacuum to 1.0 liters of syrup. The syrup was dropped into 15 liters of water and stirred for 60 minutes until precipitation was effected. The precipitate is filtered off, washed with water and after drying at 60-70 ° C, 158 g of a yellowish powder of new pepstatin with an ID50 against pepsin are obtained at 0.072. The soaked powder is esterified with methanol according to the method given in example 1 and obtained 62 g of white, crystalline powder of pepstatin methyl ester. IDB0 at y 0.05, decomposition temperature 250-252 ° C (a) "D - 90.6 ° 60 (C = 0.5, acetic acid), on thin layer chromatogram the presence of mainly new pepstatin methyl ester with Rf 0.39 and trace amounts of pepstatin methyl ester is found. g of this new pepstatin methyl ester is hydrolyzed in 2 hours at 60 ° C using 88 968 450 cm3 of a 90% solution methanol containing 0.2 N NaOH. By adding dilute hydrochloric acid, the pH of the reaction mixture is adjusted to 8.5 and the mixture is concentrated to 150 cm2, the precipitate is separated out. The precipitate is filtered off, washed with methanol and, after drying in a vacuum, is obtained. I have 17.9 g of white new peptin sodium powder with ID50 at y 0.05, decomposition temperature 245-249 ° C, (a) 20D-84 ° (C = 1.0, methanol), 10.1 cm is consumed during titration10.1 n hydrochloric acid for a sample of 700 mg. Example VI. 4.0 g of the new pepstatin free acid obtained according to Example 2 are dissolved in 100 cm 3 of absolute ethanol by heating and 0.2 cm 3 of concentrated sulfuric acid are added. This mixture is heated for 6 hours in a bath with boiling water and concentrated under vacuum to 50 cm3. The precipitate formed is filtered off, washed with water and dried to obtain 1.6 g of powder. This powder is crystallized from 100 cm3 of absolute methanol to give 1.15 g of a white crystalline powder of pepstatin methyl ester (pepstatin methyl ester). B) having an ID50 at 0.054, decomposition temperature 250-252 ° C and (a) 20n-90 ° C (C = 0.5, acetic acid). Example VII. 3.0 g of the new pepstatin obtained according to Example 2 are dissolved by heating in 100 ml of absolute n-propyl alcohol, 0.2 ml of concentrated sulfuric acid are added and esterified for 6 hours at 80 ° C. The reaction mixture is concentrated under vacuum to a volume of 20 cm 3 and the precipitate is filtered off, washed with n-propyl alcohol: after drying 900 mg of white powder are obtained. The powder is crystallized from 40.0 cm3 of absolute propyl alcohol solution and gives 48.0 mg of white powder of n-propyl ester of pepstatin B (ID51) at 0.073, decomposition temperature 218-220 ° C (a) 20t) - 89, 5 ° (C = 0.5, acetic acid). Example VIII. 3.0 g of the new pepstatin obtained according to Example 2 are dissolved in 100 cm 3 of hot absolute n-butanol and 0.2 cm 3 of concentrated sulfuric acid are added. The esterification is carried out for 6 hours at 80 ° C, after which the mixture is concentrated under vacuum to a volume of 2.0 cm3. The resulting precipitate is filtered off, washed with n-butanol, and after drying, 800.0 mg of a white powder are obtained. This powder crystallizes in 15.0 cm3 of n-butanol solution to give 340 mg of white powder of n-butyl ester of new pepstatin B with an ID50 of 0.084, decomposition point 205-207T and (arn-80 ° C (C = 0.5, acid vinegar) PL