Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia preparatów aminokwasowych, zawierajacych re¬ gulowana ilosc fenyloalaniny, które wytwarza sie na drodze enzymatycznej hydrolizy surowców bial¬ kowych.Preparaty aminokwasowe z regulowana zawarto¬ scia fenyloalaniny sa stosowane w lecznictwie jako jedyny skuteczny srodek, przeciwdzialajacy pow- wstawaniu glebokich stanów uposledzenia umyslo¬ wego u dzieci z fenyloketonuria, wrodzona wada metaboliczna ustroju. Wada ta jest wynikiem braku w organizmie enzymu, przeksztalcajacego fenyloala- mine w tyrozyne, wskutek czego gromadzi sie w ustroju fenyloalanina oraz produkty jej wadliwego przeksztalcania, które niszcza tkanke mózgowa i prowadza do nieodwracalnych zmian w mózgu.Niekorzystny nadmiar fenyloalaniny jest najcze¬ sciej wprowadzany do organizmu z wysokobialko- wym pozywieniem, w którym aminokwas fenylo¬ alanina wystepuje w stosunkowo duzych ilosciach, to znaczy w okolo 5%.Dla zdrowego organizmu wystarczajaca zawar¬ tosc fenyloalaniny w dostarczanym pozywieniu sta¬ nowi ilosc do 0,5%, a jej nadmiar w ustroju zosta¬ je przy pomocy wlasciwego enzymu przeksztalcony w tyrozyne.W przypadku fenyloketonurii nieodzowne jest po¬ dawanie preparatów aminokwasowych o znacznie obnizonym poziomie fenyloalaniny, czesto az do mi¬ nimalnej ilosci tego aminokwasu. so Preparaty aminokwasowe z regulowana iloscia fe¬ nyloalaniny stanowia dla chorych na fenyloketo- nurie niskobialkowy pokarm naturalny. ^ Poziom fenyloalaniny w pokarmach bialkowych moze byc obnizony wylacznie po ich uprzedniej hydrolizie.Hydrolizaty bialkowe uzyskuje sie wedlug zna¬ nego sposobu, dzialajac silnymi kwasami nieorga¬ nicznymi na surowiec bialkowy. Sposób ten jest jednak niedogodny, gdyz w wyniku hydrolizy na¬ stepuje calkowite lub czesciowe przeksztalcenie nie¬ których, niezbednych dla organizmu aminokwasów i wskutek tej reakcji tworza sie niepozadane pro¬ dukty ich racemizacji.Wiadomo, ze preparaty aminokwasowe sa poda¬ wane pacjentom przez wiele lat, to tez produkty niekorzystnego przeksztalcenia bialka, które pow¬ staly w czasie prowadzonego procesu hydrolizy i znajduja sie wskutek tego w gotowych prepara¬ tach aminokwasowych, odkladaja sie nastepnie w tkankach i narzadach organizmu pacjenta, zmniej¬ szajac aktywnosc fizjologiczna tych narzadów.W znanych metodach wytwarzania hydrolizatów bialkowych z regulowana zawartoscia fenyloalaniny na przyklad wedlug patentu NRD nr 70 096 otrzy¬ mane aminokwasy i peptydy z hydrolizy bialka wydziela sie dalej przez zageszczenie roztworu i wy¬ tracanie ich alkoholem, co stanowi dodatkowa ope¬ racje w wytwarzaniu preparatów aminokwasowych, wydluzajaca czas trwania calego procesu. 88 304Inny znany sposób hydrolizy bialka, polegajacy na zastosowaniu enzymów proteolitycznych jest bardziej korzystny, gdyz nie powoduje przeksztalce- yftia.£rajbefriizicji aminokwasów. Niedogodnoscia te¬ go sposobu jest jego dlugotrwalosc, wynoszaca 100 lub wiecej godzin, trwania procesu enzymatycznej hydrolizy bialka.Nieoczekiwanie okazalo sie, ze czas hydrolizy bialka mozna znacznie skrócic przy pomocy enzy¬ mów, zawartych w trzustce, nawet do 32 godzin, przy czym regulowanie czasu* hydrolizy jesjt uzaleznione od zamierzonego poziomu fenyloalaniny w prepara¬ tach aminokwasowych. Efekt skróconego czasu hy¬ drolizy uzyskano przede wszystkim przez zastoso¬ wanie odpowiednio przygotowanej trzustki, której ^MwiMiiinzdolnosc odszczepiania z czasteczki MtffllralLasów aromatycznych, szczególnie fe- J-BLWfLMy,^gidzielanej nastepnie z hydrolizatu TlaTEowegoprzy pomocy wegla aktywnego.Ustalajac odpowiednio czas hydrolizy, ilosc oraz sposób dodawania wegla aktywnego i stosujac su¬ szenie hydrolizatów znana metoda, otrzymuje sie w znacznie skróconym czasie i z wysoka wydaj¬ noscia preparaty aminokwasowe o dowolnie regulo¬ wanej zawartosci fenyloalaniny.Na wydatne skrócenie czasu hydrolizy ma zasad¬ niczy wplyw porcjowanie dodawanej trzustki w okreslonych ilosciach i w odpowiednim czasie.Jako surowiec wyjsciowy do hydralizy stosuje sie kazeine lub bialko z mleka, które bylo poddawane dzialaniu enzymów w ^czasie procesu fermentacji antybiotyków przy udziale szczepu Streptococcus lactis. Bialko to stanowi produkt odpadkowy, uzys¬ kany przy wydzielaniu nizyny z brzeczki pofermen¬ tacyjnej zgodnie z polskim opisem patentowym nr 68835.Wedlug wynalazku do zawiesiny bialka takiego, jak kazeina lub bialko z mleka, stanowiace produkt odpadkowy ^ procesu fermentacji antybiotyków, zwlaszcza nizyny, w stezeniu 10—20%, korzystnie 13—16%, w wodzie zalkalizowanej 10% Toztworu wodorptlenku sodowego lub potasowego do wartosci pH = 7,0—7,5 z dodatkiem srodka antyseptycznego, zwlaszcza toluenu, dodaje sie rozdrobniona, aktyw¬ na trzustke zwierzeca o wartosci pH = 5,0—7,5, korzystnie 5,5—6,5, rozmrozona od temperatury —10°C do temperatury —£°C—h50C, korzystnie +2°C—+4°C, w trzech porcjach wagowych 1 :1 :0,8 z tolerancja ±10%, przy czym pierwsza porcje trzustki dodaje sie na poczatku procesu hydrolizy bialka, druga w 1/3, a trzecia 2/5 czasu trwania prov cesu, prowadzonego w ciagu 32—80 godzin, korzy¬ stnie 65—"-72 godzin, nastepnie mieszanine po hydro¬ lizie ogrzewa sie do temperatury 75°—98PC, nieroz¬ puszczalne skladniki odsacza sie w podwyzszonej temperaturze, najkorzystniej 85°C, przesacz hydro¬ lizatu ochladza sie do temperatury +5°—0°C, osad wytraconej tyrozyny oddziela sie, przesacz zadaje weglem aktywnym dwukrotnie lub trzykrotnie w zaleznosci od zawartosci fenyloalaniny w przesaczu w porcjach wagowych 1 :1 lub 2 :1 :1 w ciagu 3—6 godzin i w ilosci 65—160% w stosunku do suchej masy bialka, kazdorazowo wegiel oddziela od prze¬ saczu, po czym otrzymany hydrolizat z obnizona zawartoscia fenyloalaniny wzbogaca sie oczyszczona 304 ~ 4 * . tyrozyna, solami mineralnymi i innymi skladnikami recepturowymi farmaceutycznie dopuszczalnymi oraz*: suszy w znany sposób. , ' \ ;.Wspólzaleznosc zalozonej zawartosci feriyloalani- ny w preparatach aminokwasowych, czasu trwania enzymatycznej hydrolizy surowca kazeiny, ilosci wegla, potrzebnej do oczyszczania hydrolizatu bial¬ kowego, pozbawionego tyrozyny, i wydajriosci ca¬ lego procesu wytwarzania preparatów aminokwaso- io wych ilustruje ponizsza tabela.Zalozona ilosc fenyloalaniny w mg/lOOg preparatu aminokwasowego ponizej 20 , 150—200 450—500 ponizej 20 150—200 450 — 500 pnnizej 20 150—200 450—500 'Czas trwania hydrolizy wi godzi¬ nach ! ' 80 80 80 60 60 60 40 40 40 Ilosc we¬ gla akty¬ wnego na 1 kg su-»' , chej^masyt kazeiny i 950 750 650 1100 900 750 1400 1100 900 .Wydaj- 1 nosc w % | 60 1 70 75 1 55 65 70 [ 48 [ 58 65 Zastosowanie bialka z mleka, otrzymanego przy udziale szczepu Streptócoccus lactis prowadzi do- skrócenia czasu hydrolizy o okolo 20%.Ponadto przedmiot Wynalazku ilustruja przykla¬ dy: Przyklad I. Sposób otrzymywania preparatu. aminokwasowego z kazeiny o obnizonym poziomie fenyloalaniny do 0,5%. 1,4 kg trzustki, zamrozonej do temperatury—10°C,. rozdrobniono,, jednoczesnie rozmrazajac ja do tem¬ peratury pomiedzy + 2°C; i + 4°C. Utrzymywano 40 trzustke w tej temperaturze przez 72 godziny, regu¬ lujac pH rozmrozonej trzustki w granicach @,0—6,5 przy pomocy 10% roztworu kwasnego weglanu so¬ dowego.Osobno przygotowano 10% zawiesiny kazeiny, w 45 wodzie, zalkalizowanej 10%. roztworem wodorotlen¬ ku sodowego do pH = 7,5, Zawiesine sporzadzona z 3 kg kazeiny w trzech równych porcjach, doda¬ wanych- do alkalizowanej- wody trzykrotnie w, ciaga 2 godzin. Do gotowej zawiesiny kazeinowej za$to- 5o sowano 200 ml toluenu, jako srodka antyseptycznego* Do tak sporzadzonej zawiesiny kazeinowej doda¬ wano w trzech porcjach uprzednio przygotowana trzustke w stosunku wagowym 1:1 ; 0,8, w,kolej- nych godzinach procesu enzymatycznej hydrolizy:^ 55 w godzinie zerowej, 27 i 32. Hydrolize prowadzono- przez 80 godzin regulujac pH mieszaniny w gra¬ nicach 7,0—7,5 przy, pomocy 10% roztworu wodo¬ rotlenku ; sodowego. Uzyskany hydrolizat bialka podgrzano do temperatury 85°C i odsaczono skla- 6o dniki stale, a przesacz ochlodzono do temperatury °C—0°C. W tej temperaturze wydziela sie w prze¬ saczu osad tyrozyny, który odsaczono,, przeznaczajac go do oczyszczenia.Po oddzieleniu tyrozyny^ ^zadawana fcydrolizat~ IH bialkowy weglem aktywnym, dwukrotnie porejami5 w ciagu 5 godzin w ilosciach 0,6 kg i 0,3 kg wegla na l kg suchej masy bialkowej. Po Hazdym doda¬ niu porcji wegla, wymieszaniu jej z hydrolizatem i odsaczeniu, wegiel oddzielano jako produkt od¬ padkowy.Otrzymany wodny roztwór hydrolizatu bialkowe¬ go wysuszono po dodaniu substancji uzupelniajacych takich, jak oczyszczona tyrozyna, sole mineralne i inne skladniki okreslone receptura. Uzyskano pre¬ parat aminokwasowy o zawartosci 0,45—0,5% fe- nyloaminy. Wydajnosc 75%.Przyklad II. Sposób otrzymywania preparatu aminokwasowego z kazeiny o obnizonym poziomie fenyloalaniny do 0,02%, Przygotowano trzustke i 10% zawiesine kazeiny w alkalicznej wodzie oraz porcjowana trzustke, jak w przykladzie I, lecz proces enzymatycznej hydro¬ lizy prowadzono w ciagu 40 godzin, podczas któ¬ rego clruga i trzecia porcje trzustki dodawano w 13 i 16 godzinie hydrolizy.Operacje podgrzewania hydrolizatu, odsaczania skladników stalych, ochladzania hydrolizatu i od¬ dzielania tyrozyny prowadzono równiez analogicz¬ nie, jak w przykladzie I.Hydrolizat, pozbawiony tyrozyny, zadano trzykrot¬ nie weglem aktywnym w porcjach wagowych 2:1:1 o lacznej ilosci 1,4 kg wegla na 1 kg suchej masy kazeiny w ciagu 5 godzin i kazdorazowo we¬ giel oddzielono. Uzyskano wodny roztwór hydroli¬ zatu bialkowego, który po dodaniu tyrozyny i in¬ nych skladników wedlug receptury wysuszono. Ot¬ rzymano preparat aminokwasowy, zawierajacy 0,02% fenyloalaniny z wydajnoscia 48%.Przyklad III. Sposób otrzymywania preparatu aminokwasowego o obnizonym poziomie fenyloala¬ niny do 0,5%.Aktywna trzustke przygotowano analogicznie, jak w przykladzie I, natomiast zawiesine kazeinowa sporzadzono w stezeniu 15% postepujac, jak w przykladzie I z tym, ze doprowadzono pH zawiesiny kazeinowej do wartosci 7,5 przy pomocy 10% roz¬ tworu wodorotlenku potasowego. Do tak przygoto¬ wanej zawiesiny dodawano aktywna trzustke w ilo¬ sci 0,8 kg na 1 kg zawiesiny w trzech porcjach we wzajemnym stosunku wagowym 1 :1 :0,8 podczas 60 godzin procesu hydrolizy, to znaczy w godzinie zerowej, 20 i 24. W ciagu hydrolizy utrzymywano pH w granicach 7,0—7,5.Otrzymana mieszanine po hydrolizie podgrzano do temperatury 87°C, nastepnie odsaczono skladniki stale od hydrolizatu i ochlodzono go der tempera¬ tury pomiedzy 5°C i 0°C.Wydzielona w tej temperaturze tyrozyne odsa¬ czono, przeznaczajac ja do oczyszczenia. Pozostaly przesacz hydrolizatu zadawano dwukrotnie weglem aktywnym w dwu porcjach w ilosciach 0,5 kg i 0,25 kg wegla na 1 kg kazeiny w czasie 5 godzin.Kazdorazowo zuzyty wegiel oddzielano.Otrzymano wodny roztwór hydrolizatu, który po dodaniu tyrozyny, soli mineralnych oraz innych substancji uzupelniajacych wedlug receptury — wy¬ suszono.Uzyskano suchy preparat aminokwasowy z za- 6 wartoscia 0,45—0,5% fenyloalaniny i z wydajno¬ scia 70%.Przyklad IV. Sposób otrzymywania preparatu aminokwaspwego o poziomie fenyloalaniny ponizej 0,02%.Przygotowano aktywna trzustke, zawiesine kaze¬ iny, prowadzono hydrolize, podgrzano mieszanine po hydrolizie, odsaczono hydrolizat, oziebiono prze* sacz hydrolizatu i odsaczono tyrozyne w sposób, ' io podany w przykladzie III.Nastepnie zadano hydrolizat trzykrotnie weglem aktywnym wylacznej ilosci 1,1 kg wegla na 1 kg ka^r zeiny w trzech porcjach w wzajemnym stosunku wagowym 2:1 :1 podczas 5 godzin. Kazdorazowo zuzyty wegiel oddzielano.Wodny roztwór hydrolizatu, wzbogacony substan¬ cjami uzupelniajacymi wedlug receptury — wysu* szono. Otrzymano suchy preparat aminokwasowy o zawartosci fenyloalaniny ponizej 20 mg z wydaj- noscia;33%.Przyklad V. Sposób otrzymywania preparatu aminokwasowego o obnizonym poziomie fenyloala¬ niny do 0,5%.Przygotowano aktywna trzustke w sposób, podany w przykladzie I. Do enzymatycznej hydrolizy zasto¬ sowano 10 kg bialka z mleka, wydzielonego jako osad z brzeczki pofermentacyjnej przy produkcji ^lizyny (opis patentowy polski nr 68 835). Poczatko¬ wo sporzadzono 13% zawiesine ^bialka z mleka w so alkalicznym roztworze wodnym o pH =?= 7,5, który uzyskano przy pomocy 10% roztworu wodorotlenku sodowego. Do tak sporzadzonej zawiesiny dodano przygotowana uprzednio aktywna trzustke w ilosci 0,44 kg na 1 kg suchego bialkav Po uplywie 4 go- dzin uzupelniono wsad bialka z mleka do stezenia %, doprowadzajac ponownie pH do wartosci 7,0—7,5 przy pomocy 10% roztworu wodorotlenku sodowego. Proces hydrolizy prowadzono w ciagu 32 godzin, podczas którego jeszcze dwukrotnie do- 40 dawano aktywna trzustke w ilosciach 0,44 kg i 0,35 kg na 1 kg suchej masy bialka w 13 i 16 go¬ dzinie hydrolizy.Mieszanine hydrolizatu i skladników nierozpusz¬ czalnych ogrzano do temperatury 90°C i przesaczo- 45 no, po czym przesacz hydrolizatu oziebiono do tem¬ peratury +5°C—0°C. Z hydrolizatu wytracono ty¬ rozyne i odstawiono do oczyszczenia.Hydrolizat, pozbawiony tyrozyny, zadawano dwu¬ krotnie weglem aktywnym w porcjach 0,6 kg i 0,3 50 kg wegla na 1 kg suchej masy bialka. Zuzyty we¬ giel kazdorazowo oddzielano.Otrzymano wodny roztwór hydrolizatu, który po dodaniu tyrozyny i innych substancji uzupelniaja¬ cych wedlug receptury —wysuszono.Tak uzyskany preparat aminokwasowy zawiera 0,45—0,5% fenyloalaniny. Wydajnosc 63%.Przyklad VI. Sposób otrzymywania preparatu aminokwasowego o poziomie fenyloalaniny ponizej „ 0,02%.Aktywna trzustke przygotowano w sposób, po¬ dany w przykladzie I, natomiast do enzymatycznej hydrolizy zastosowano zawiesine bialka z mleka, sporzadzona, jak w przykladzie V z tym, ze wode M alkalizowano 10% roztworem wodorotlenku potaso-88 304 8 wego do pH = 7,5. Proces hydrolizy prowadzono przez 64 godziny, podczas którego dodawano akty¬ wna trzustke w porcjach i ilosciach, jak w przy¬ kladzie V, trzykrotnie w czasie hydrolizy w godzi¬ nach: 0, 24 i30. 5 Uzyskana mieszanine hydrolizatu i skladników nierozpuszczalnych podgrzano do temperatury 90°C i saczono w granicach temperatury 90°C—85°C, po czym przesacz hydrolizatu oziebiono i wytracono tyrozyna, jak w przykladzieV. io Hydrolizat, pozbawiony tyrozyny, zadawano we¬ glem aktywnym w ilosci lacznej 0,95 kg na 1 kg suchej masy bialka z mleka w trzech porcjach w wzajemnym stosunku wagowym 2:1:1 podczas 5 godzin. Kazdorazowo zuzyty wegiel oddzielano. 15 Otrzymano wodny roztwór hydrolizatu, który uzu¬ pelniono tyrozyna oraz innymi substancjami zgodnie z receptura, po czym hydrolizat wysuszono.Uzyskany w ten sposób preparat aminokwasowy zawiera ponizej 0,02% fenyloalaniny. Wydajnosc 20 60%. PL