Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych enzymów proteolitycznych, powodujacych in vivo korzystniejsza lepkosc wydzieliny sluzowatej jelit, oskrzeli i szyjki macicy.Staly rozwój intensywnej hodowli zwierzat w krajach uprzemyslowionych i powazny brak bialek zwierzecych w krajach rozwijajacych sie powoduje coraz wieksza koniecznosc badan w celu zwiekszenia szybkosci wzrostu zwierzat i zmniejszenia wskaznika spozycia paszy.Dotychczas badano wplyw dodatku do mieszanin paszowych dla zwierzat róznych pospolitych entymów (proteolitycznych, lipolitycznych i amylolitycznych) ulatwiajacych trawienie glównych skladników tych pasz (bialek, tluszczów i cukrów). Przypuszczano, ze te enzymy egzogenne dodane w celu uzupelnienia enzymów endogennych beda ulatwialy trawienie in vivo i tym samym wzrost zwierzat. Badania te nie doprowadzily do uzyskania wyników praktycznie waznych: polepszenie lekkostrawnosci i zmiana szybkosci wzrostu oraz wskazni¬ ka spozycia, które czasami stwierdzono, okazaly sie slabe i zmienne bez wzgledu na wartosc dodanych enzymów.Blona sluzowa jelit, nietrwala jak wszystkie blony sluzowe, ochraniana jest przed dzialaniem srodowiska zewnetrznego przez warstwe lepkiej cieczy: wydzieliny sluzowatej jelit. Lepkosc tej wydzieliny sluzowatej wiaze sie z obecnoscia makromolekul mucyny i mukopolisacharydów, które polaczone sa pomiedzy soba mostkami bialkowymi tworzacymi zwarta strukture siateczkowa. Wydzielina sluzowata jelit tworzy w ten sposób rodzaj bariery ochronnej pomiedzy blona sluzowa i masa rozdrobnionego podczas trawienia pokarmu. Ta bariera ochrania scianke jelita przed bezposrednim kontaktem z duzymi czasteczkami enzymów endogennych (trypsyny, chymotrypsyny), które przeprowadzaja trawienie pokarmu lecz moga nastepnie atakowac blony sluzowe. Ta bariera powinna dzialac wybiórczo przepuszczajac poprzez scianke jelita male czasteczki pochodzace ze strawionego pokarmu w celu wlaczenia ich w obieg krwi. - Jezeli wydzielina sluzowata jelit jest nadmiernie lepka hamuje przenikanie do krwi czasteczek pochodza¬ cych z pokarmu, jezeli wykazuje ona niedostateczna lepkosc przestaje spelniac role czynnika ochraniajacego blone sluzowa. Mozna przypuszczac, ze pomiedzy tymi dwoma stanami najkorzystniejsza lepkosc ustala sie bardzo rzadko. *2 87 286 Pospolite enzymy proteolityczne uprzednio juz wypróbowane w zywieniu zwierzat lecz bez sukcesów, wykazaly wplyw na lepkosc wydzieliny sluzowatej albo niedostateczna albo nadmierna, W pierwszym przypadku szybkosc absorpcji przez scianke jelita pozostawala bez zmian. W drugim przypadku nadmierne dzialanie enzymów jak inne dzialanie drazniace, powoduje zwiekszenie szybkosci gromadzenia sie wydzieliny sluzowatej w gruczolach sluzowych i niepozadane nadmierne wydzielanie jej na zewnatrz- ¦ Istnienie enzymów proteolitycznych zdolnych do powodowania korzystniejszej lepkosci wydzieliny sluzo¬ watej jelit, to jest zdolnych do znacznej redukcji tej lepkosci bez obawy nadmiernego wydzielania nie bylo oczywiste a priori. Podczas dlugiego przechodzenia przez jelita, pokarm jest zawsze calkowicie absorbowany i jak wykazaly doswiadczenia nie pozostaje w kale. Jednak, ta absorpcja nie jest dostatecznym kryterium korzys¬ tnego zuzycia pokarmu. Mozna przypuszczac, ze odpowiednia absorpcja powodowala jednoczesnie dostateczne stezenie we krwi wszystkich czynników syntezy anabolicznej. Lecz tylko doswiadczenie moglo potwierdzic prawo, które nie bylo oczywiste a priori: dla szybkosci wzrostu lepiej jest otrzymac we krwi maksymalne steze¬ nie czasteczek strawionego pokarmu w stosunkowo krótkim czasie, niz stezenie srednie podczas bardzo dlugie¬ go czasu jezeli w obydwu przypadkach calkowita ilosc przechodzacego do krwi pokarmu jest taka sama.Celem wynalazku jest taki sposób wytwarzania produktów enzymatycznych aby produkty te optymalizo¬ waly lepkosc sluzu w zywym organizmie, w konsekwencji zwiekszaly predkosc pochloniecia pokarmu podda¬ wanego trawieniu. < Stwierdzono, ze enzymy proteolityczne wytwarzane z nowych szczepów mikroorganizmów, a mianowicie szczepu 1998 i 2019 Streptomyces fradiae zlozonych w Narodowym Muzeum Przyrodniczym w Paryzu wdn. 16.01.1969 i 12,03.1969 spelniaja to zadanie.Szczepy Streptomyces fradiae nr 1998 i 2019 charakteryzuja sie nastepujacymi cechami morfologicznymi i fizjologicznymi: 1. Morfologia. Torebki zarodnikowe rozgalezione zrosniete; proste lub falujace. Formy spiralne obserwo¬ wane tylko na niektórych typach pozywek, wyjatek stanowi szczep 1998 wykazujacy formy silnie skrecone.Nitki grzybni wegetatywnej maja srednice rzedu 0,5 ju. Zarodniki powstaja przez podzial wlókien powietrznych grzybni na cylindryczne fragmenty, które osiagajac dojrzalosc przyjmuja ksztalt owalny. Wymiary ich sa rzedu od 0,5 do 0,7 /i na 1,25 do 1,50 /i. 2„ Wlasciwosci fizjologiczne. ¦ a) Wlasciwosci proteolityczne Streptomyces fradiae okreslone zostaly na pozywce kazeinowej na mleku, zelatynie, L-tyrczynie. Stwierdzono, ze szczep 2019 rozwija sie punktowo — wytwarzanie zarodników jest szybkie z jednoczesnym bardzo wyraznym rózowo-lila zabarwieniem. Brak zabarwienia czarnego, spód kolonii jasno pomaranczowo-zólty. Szczep 1998 rozwija sie wolniej, grzybnia powietrzna rózowo-lila, spód pomaranczo¬ wy, brak barwnika czarnego„ b) Redukcja azotanów., Nie obserwowano zauwazalnej redukcji azotanów do azotynów. c) Skrobia. Rozwój organizmu badanego na plastrach kartofli jest ograniczony, wytwarzanie zarodników pojawia sie nie zawsze; natomiast na platkach owsianych rozwój obydwóch szczepów przebiega bardzo dobrze.W obydwóch przypadkach obserwowana byla wyrazna czynnosc diastatyczna. d) Produkcja siarkowodoru. Nie wystepuje.Sposób wytwarzania nowych enzymów proteolitycznych wedlug wynalazku, przeznaczonych do optymali¬ zacji lepkosci sluzu jelitowego, oskrzelowego i szyjnego polega na tym, ze szczep 1998 lub 2019 Streptomyces fradiae poddaje sie hodowli w znany sposób, to znaczy na pozywce zawierajacej zródlo azotu i soli mineralnych, przy napowietrzaniu srodowiska hodowlanego tak dlugo dopóki koncowe miano srodowiska fermentacyjnego nie osiagnie 3000 j. Ansona na 1 ml, po czym otrzymane produkty koncentruje sie i oczyszcza znanymi metodami.Jako pozywke wykorzystuje sie srodowisko ciekle, zawierajace: 30 g/l maki sojowej, 30 g/l glukozy, 0,8 g/l fosforanu dwupotasowego, 10 g/l weglanu wapniowego.Fermentacje prowadzi sie w temperaturze 28°C, przy pH = 7,0 i przy doprowadzaniu 0,3 objetosci powietrza na 1 objetosc pozywki na minute. Okres fermentacji wynosi 60—84 godzin.Jednostka Ansona (lub w skrócie U.A.) jest ilosc enzymu, która przy inkubacji wciagu 10 minut w temperaturze 25°C i pH 7,5 w obecnosci zdenaturowanej hemoglobiny uwalnia ekwiwalent 1 ^g tyrozyny oznaczanej metoda absorpcji na fotometrze przy dlugosci fali 2800/i w przesaczu nieoczyszczonym kwasem trójchlorooctowym.W wyniku fermentacji otrzymuje sie produkty enzymatyczne obnizajace lepkosc sluzu jelitowego w granicach od 35 do 65% i jednoczesnie niewrazliwe na inhibitory trypsyny.Produkty enzymatyczne wytwarzane sposobem wedlug wynalazku wywoluja w zywym organizmie adekwatna optymalizacje sluzu. W porównaniu z fermentami naturalnymi o dzialaniu optymalizujacymi trypsyne87 286 3 i chemotrypsyne — ich dzialanie optymalizujace jest wyzsze. Porównanie z tymi fermentami przeprowadza sie w probówce za pomoca testu ograniczonej redukcji lepkosci (w skrócie test RMV).Enzymy wytwarzane sposobem wedlug wynalazku powodujace in vivo odpowiednio korzystniejsza lepkosc wydzieliny sluzowatej jelit byly czesciowo scharakteryzowane przez porównanie ich dzialania in vitro w obecnosci wydzieliny sluzowatej jelit z dzialaniem dwu enzymów proteolitycznych: trypsyny i chymotrypsy- ny. Badania porównawcze przeprowadzono wedlug testu ograniczonej redukcji lepkosci (w skrócie tekst RMV) i ich niewrazliwosci na inhibitory trypsyny, te ostatnie badania przeprowadzono in vivo. • Redukcja lepkosci wydzieliny sluzowatej jelit przez enzymy wytwarzane sposobem wedlug wynalazku moze byc porównana w przyblizeniu ±5% w odniesieniu do lepkosci wymienionej wydzieliny sluzowatej jelit, na która nie dzialano enzymami, pomiedzy wartosciami redukcji lepkosci przez trypsyne i chymotrypsyne, to jest odpowiednio pomiedzy 60 + 5 » 65% i 40 — 5 = 35% w odniesieniu do lepkosci wydzieliny sluzowatej jelit, na która nie dzialano enzymami, w warunkach opisanych dalej.Redukcja in vitro lepkosci wydzieliny sluzowatej jelit przez enzymy otrzymane sposobem wedlug wynalazku jest zawarta dokladnie pomiedzy redukcja wywolywana przez trypsyne i chymotrypsyne (60%-40%).Wytwarzanie enzymów proteolitycznych sposobem wedlug wynalazku kontrolowane jest testem RMV.Proces fermentacji zostaje zakonczony gdy wymagane substancje enzymatyczne daja redukcje lepkosci wydzieli¬ ny sluzowatej jelit rzedu pomiedzy dzialaniem chymotrypsyny obnizonym o 5% i dzialaniem trypsyny podwyzszonym o 5% (wartosci procentowe oznaczane byly w stosunku do lepkosci wydzieliny sluzowatej jelit, na która nie dzialano enzymami). Sposób wedlug wynalazku obejmuje takze stosowanie metod koniecznych do oczyszczenia otrzymanych preparatów, które nie sa wrazliwe na inhibitory trypsyny. - Mikroorganizmy stosowane do wytwarzania enzymów wybiera sie sposród tych, które daja preparaty enzymatyczne odpowiadajace 2 warunkom: test RMV dodatni i brak wrazliwosci na inhibitory trypsyny. Sposród mikroorganizmów odpowiednich do stosowania a/sposobie wedlug wynalazku interesujace sa organizmy z rodzaju Streptomyces szczególnie gatunek Streptomyces fradiae.Test RMV przeprowadza sie w sposób nastepujacy: a) Przygotowanie preparatu enzymatycznego do badan. Fermentacje przeprowadza sie klasycznym sposobem stosujac mikroorganizm wytwarzajacy duza ilosc mieszaniny enzymów proteolitycznych. Po zakoncze¬ niu fermentacji plyn saczy sie, zageszcza, liofilizuje lub suszy rozpylowo; w ten sposób otrzymuje sie surowy preparat enzymatyczny; korzystniej po przesaczeniu i zageszczeniu mozna otrzymac preparat przez stracenie siarczanem amonowym i wysuszenie w prózni. Mozna tez preparat poddac chromatografii lub elektroforezie.Takie preparaty oznaczone klasyczna metoda Anson'a zawieraja zaleznie od sposobu obróbki 100, 1000, 10000, 50000 jednostek na 1 mg. < Jako substrat do pomiaru lepkosci stosuje sie wydzieline sluzowata jelit cielecia lub swini. Natychmiast po uboju zwierzecia bedacego na diecie od 24 godzin pobiera sie od czesci wychodzacej z zoladka 3 kolejne odcinki jelita, okolo 1 metra kazdy. Przewiazuje sie koniec jelita i poddaje sie je slabemu cisnieniu w wyniku czego przez drugi koniec wyciska sie powierzchniowa wydzieline sluzowata i odrzuca, nastepnie jelito poddaje sie silnemu cisnieniu lub oskrobuje scianke wewnetrzna jelita uprzednio rozcietego pobierajac wydzieline sluzowata gleboka, oddziela sie substancje rozpuszczalne przez splukiwanie 3 objetosciami wody i wiruje. Przecietnie przygotowuje sie 50 ml wydzieliny sluzowatej z jednego zwierzecia i mozna ja przechowywac w ciagu wielu dni w temperaturze 20°C lub uzywac bezposrednio do badan lepkosci.Do tych badan stosuje sie mikrowiskozymetr Brookfield'a pozwalajacy na prace z 1 g nierozpuszczalnej wydzieliny sluzowatej. Szybkosc ruchomego walca wynosi na ogól 12 obrotów na minute i temperatura 37°C.Skala stopni od 0 do 100 pozwala oznaczyc lepkosc wzgledna przez bezposredni odczyt. Strzalke wiskozymetru ustawia sie na 100 z sama wydzielina sluzowata i nastepnie dodaje 0,1 ml roztworu buforowego o wartosci pH 7,5 zawierajacego badany preparat enzymatyczny. Jezeli ten preparat jest aktywny, lepkosc zmniejsza sie szybko i mozna wykreslic krzywa redukcji. Trypsyna i chymotrypsyna stosowane sa w postaci preparatów o wysokiej czystosci odpowiednio 16000 i 20000 j/mg. Powoduja one silna redukcje lepkosci ustajaca po 30 minutach, tak ze czas trwania pomiaru ustalono na 30 minut. Enzymy te w stezeniu 50 jednostek na gram wydzieliny sluzowatej powoduja redukcje lepkosci o 20%. W stezeniu 5 razy wiekszym 250 j/g albo jeden albo drugi enzym powoduje redukcje lepkosci odpowiednio 60% i 40%. Wydzielina sluzowata jelit cielecia lub swini, zwierzat rózniacych sie od siebie, moze dawac wyniki w zaleznosci od uzytej próby wydzieliny sluzowatej. W przypadku uzyskania wyników o zbyt odleglych wartosciach od uprzednio otrzymanych mozna eliminowac próbki lub poddac frakcjonowanemu wytraceniu i ponownie zawiesic w celu odnalezienia przyblizonych wartosci.Z tego rodzaju próbka wydzieliny sluzowatej oznacza sie redukcje lepkosci powodowana przez 250 jednostek badanej substancji enzymatycznej na 1 g wydzieliny sluzowatej. Jezeli wartosc redukcji zawarta jest pomiedzy 40% i 60% i bardziej ogólnie pomiedzy 35% i 65% preparat enzymatyczny zalicza sie jako odpowiedni wedlug testu RMV i zdolny do powodowania korzystniejszej lepkosci wydzieliny sluzowatej.4 87 286 Dzialanie enzymów na wydzieline siuzowata jest przedstawione na fig. 1; gdzie czas podano w minutach i wartosc redukcji w procentach. Ten rysunek przedstawia krzywe otrzymane z trypsyna (krzywa 1) i chymotryp- syna (krzywa 2), z enzymem, który nie jest odpowiedni wedlug testu RMV mianowicie z papaina (krzywa 3), z enzymem, który jest scisle odpowiedni wedlug testu RMV (enzym Streptómyces fradiae czastka 2, krzywa 4) i z enzymem, który nie jest odpowiedni wedlug testu RMV przez nadmierne dzialanie (enzym u Bacillus subtilis, krzywa 5). ! Wynalazek zilustrowano przykladami nie ograniczajacymi jego zakresu. < Przyklad I. Mikroorganizm Streptómyces fradiae — poddano klasycznej fermentacji w temperaturze 28°C przy pH 7,5. Z produktów fermentacji wybrano te, dla których test RMV byl dodatni i u których stwierdzono brak wrazliwosci na inhibitory trypsyny. Plyn fermentacyjny podzielono na 4 partie, z których w rózny sposób przygotowano 5 produktów: A, B, C, D i E.Produkt A: plyn po fermentacji saczy sie i zageszcza w prózni, otrzymuje sie surowy plynny produkt 60000 j/ml.Produkt B: z czesci produktu A w wyniku suszenia rozpylowego otrzymuje lie staly produkt enzymatycz¬ ny o mocy 100 j/mg. - Produkt C: z czesci produktu A przez wytracenie siarczanem amonowym i wysuszenie w prózni otrzymuje sie czesciowo oczyszczony produkt enzymatyczny o mocy okolo 1000 j/mg.Produkt D: z czesci produktu A w wyniku serii wytracen siarczanem amonowym i rozpuszczen w acetonie oraz w wyniku wysuszenia w prózni koncowego produktu otrzymuje sie srednio czysty produkt enzymatyczny o mocy 10000 j/mg wykazujacy stosunkowa jednorodnosc elektroforetyczna.Produkt E: z czesci produktu D w stanie cieklym w wyniku elektroforyezy lub chromatografii na kolumnie, dializy lub liofilizacji oddziela sie enzym wysokiej czystosci o mocy okolo 50000 j/mg wykazujacy calkowita jednorodnosc elektroforetyczna.Wszystkie te produkty odpowiadaly testowi RMV.Przydatnosc tych produktów w praktyce opisano w dalszych przykladach. « Przyklad II. Badanie wplywu enzymów na zmniejszenie lepkosci wydzieliny sluzowatej i na wzrost szczurów.Trzytygodniowe biale szczury — albinosy o ciezarze ciala okolo 40 g, umieszcza sie w klatkach po samców lub 5 samic. Otrzymuja one dowolny pokarm jak równiez wode do picia; sa one wazone oddzielnie 2 razy w tygodniu wciagu 3 tygodni; sredni przyrost dzienny ciezaru ciala jest wiec okreslany przez grupe 10 zwierzat (5 samców i 5 samic). Grupa kontrolna otrzymuje pokarm Mc Collum. < Grupy doswiadczalne otrzymuja taki sam pokarm uzupelniony enzymami w ilosci 100 j/g i 1000 j/g.Przyjmujac, ze jeden hodowany szczur spozywa dziennie pokarm odpowiadajacy 1/10 ciezaru jego ciala (10 g pokarmu dziennie na jednego 100 g szczura). Te dawki zawieraja odpowiednio 10000 i 100000 jednostek na kg ciezaru ciala na dzien.Stosowano te enzymy, których dzialanie scharakteryzowane jest na fig. 1. Oprócz enzymu z S.F. czastka 2 (S.F. = Streptómyces fradiae) powodujacego zmniejszenie lepkosci wydzieliny sluzowatej o 50%, stosuje sie enzymy z S.F.1 czastka 1 i S.F. czastka 3, które zmniejszaja lepkosc o 40% i 60%. Kazdy z tych enzymów jest odpowiedni wedlug testu RMV w dosc szerokim zakresie poniewaz powoduje obnizenie lepkosci od 35% do 65%.Natomiast enzym z S.F. czastka 2 jest odpowiedni wedlug testu RMV w wezszym lecz wystarczajacym zakresie.Te3 enzymy odpowiadaja produktowi C i maja moc okolo 2000 j/mg.Otrzymane wyniki przedstawiono w tablicy I.Tablica I Wplyw enzymów na zmniejszenie lepkosci wydzieliny sluzowatej i na wzrost szczurów Enzym Papaina S.F. czastka 1 S.F. czastka 2 S.F. czastka 3 B.S. « Zmniejszenie lepkosci o 40 50 60 80 Bez enzymu g/dzien 2,85 z 100 j/g g/dzien 2,85 3,45 4,15 3,25 3,0 Wzrost szczurów paszy % 100 121 145 114 105 z 1000 j/g paszy g/dzien 2,85 3,40 4,05 2,95 2,40 % 100 119 142 103 8487 286 S.F.: enzym ze Streptomyces fradiae B.S.: enzym z Bacillus subtilis Enzym ze S.F. czastka 2, którego dzialanie na wydzieline sluzowata znajduje sie pomiedzy dzialaniem trypsyny i chymotrypsyny (redukcja lepkosci: 50% stymuluje szybkosc wzrostu szczurów o 40%—45% po zastosowaniu 2 dawek. < W przypadku zastosowania enzymu z S.F. czastka 1 dzialanie na wydzieline sluzowata jest porównywalne z dzialaniem chymotrypsyny (redukcja lepkosci 40%). Ta stymulacja jest slabsza i osiaga 20% po zastosowaniu 2 dawek. » W przypadku zastosowania enzymu z S.F. czastka 3, którego dzialanie zblizone jest do dzialania trypsyny (redukcja lepkosci 60%) stymulacja wzrostu jest rzedu 14% po dodaniu slabej dawki, natomiast po zastosowaniu silnej dawki nie zaobserwowano zadnych zmian.Mozna stwierdzic, ze czasteczki enzymów z S.F. odpowiednie sa wedlug testu RMV w sposób niejednoznaczny i wykazuja korzystny lecz nierównomierny wplyw na wzrost szczurów. W przypadku prowadzenia fermentacji niezgodnie ze sposobem wedlug wynalazku otrzymuje sie enzymy nieodpowiednie wedlug testu RMV i wykazujace wyraznie niekorzystny wplyw na wzrost szczurów.Papaina, która nie jest odpowiednia wedlug testu RMV nie wykazuje wplywu na wzrost szczurów.Pewien enzym z Bacillus subtilis nie jest odpowiedni wedlug testu RM V w nadmiarze, podany w niewielkiej dawce wykazuje korzystny wplyw na wzrost szczurów. Jednak przy podaniu wiekszej dawki wplyw ten jest znikomy. Podczas autopsji stwierdzono, ze sciana jelita szczurów po tej silnej dawce wykazuje hipersekrecje co wystarczajaco tlumaczy zwolnienie tempa wzrostu.Trypsyna i chymotrypsyna wywoluja niewielkie i zmienne zwiekszenie szybkosci wzrostu szczurów wahajace sie ponizej 10%. Te enzymy trzustki, które in vitro dzialaja na wydzieline sluzowata podobnie jak enzymy zS.F.; in vivo wplywaja na wzrost szczurów znacznie gorzej. Te anomalie moze tlumaczyc fakt, ze trypsyna i chymotrypsyna stosowane w nadmiarze sa podatne na blokowanie in vivi przez endogenne inhibitory takie jak inhibitor trzustkowy Kunitz'a, natomiast enzym dominujacy w czastkach 1, 2 i 3 otrzymany ze Streptomyces fradiae jest praktycznie niewrazliwy na te inhibitory jak i na inhibitory egzogenne takie jak inhibitor sojowy. » Przyklad III. Wpryw enzymów proteolitycznych na wzrost szczurów przy karmieniu ich pokarmem bogatym w bialka sojowe. « Pokarm ten stosowany zwykle w hodowli kurczat ma nastepujacy sklad: maka kukurydziana 60%, maka sojowa 33%, lój 3%, mieszanka mineralna i witaminowa 4%. Doswiadczenie jest prowadzone w grupach po 10 szczurów samców, ogólnie w takich samych warunkach jak w doswiadczeniach poprzednich. « Grupa kontrolna ma sredni przyrost ciezaru ciala 5,25 g/dzien.Grupa doswiadczalna 1 otrzymujaca taki sam pokarm uzupelniony enzymem z S.F. czastka 2 w ilosci 1000 j/g (dawka ta odpowiada w przyblizeniu 100000 j na kg-ciezaru ciala dziennie) wykazuje taki sam przyrost dzienny jak grupa kontrolna. • Grupa doswiadczalna 2 otrzymujaca taki sam pokarm, lecz równiez wode do picia z rozpuszczonym enzymem S.F. czastka 2 w ilosci 500 j/ml (dawka ta odpowiada w przyblizeniu 100000 j na kg ciezaru ciala dziennie) wykazuje sredni przyrost 7,3 g/dzien, co odpowiada zwiekszeniu ciezaru ciala o 39%.Niepowodzenie obserwowane w grupie doswiadczalnej 1 nie jest spowodowane obecnoscia w soi inhibitora Northrop, poniewaz jest on uprzednio zniszczony podczas obróbki termicznej dokonywanej zwykle przed podaniem substratu. To niepowodzenie wiaze sie raczej z faktem, ze enzym wykazuje powinowactwo do bialek sojowych, które dodawane do pokarmu w zwiekszonym stezeniu moga wiazac caly enzym, co z kolei eliminuje jego dzialanie na bialka wydzieliny sluzowatej, której lepkosc nie ulega redukcji. W przypadku dodania enzymu do wody pitnej zamiast do pokarmu problem ten bedzie czesciowo wyeliminowany i stad uzyskuje sie sukces w grupie doswiadczalnej 2U Lepiej jest wiec podawac enzym w wodzie pitnej.' Wyniki doswiadczen wykazuja, ze stabilnosc enzymu w roztworze jest dobra, co pozwala na zastosowanie tej metody w hodowli przemyslowej.Przyklad IV. Wplyw enzymów proteolitycznych na wzrost szybkosci wchlaniania pokarmu przez sciany jelitowe. « Operacje przeprowadza sie na 5 szczurach bedacych na diecie w ciagu 24 godzin, wazacych okolo 150 g, znieczulonych uretanem. Po otworzeniu jamy brzusznej izoluje sie okolo 10 cm jelita cienkiego i laczy koniec sonda ze srodowiskiem zewnetrznym, po przemyciu jelita wprowadza sie 0,4 ml roztworu hydrolizatu kazeiny zawierajacego 2,5 mg azotu i pozostawia w jelicie w ciagu 10 minut, po zebraniu roztworu kazeiny wprowadza sie w roztwór plukanki, który nastepnie takze odciaga sie.6 87 286 Na tym samym szczurze przeprowadzono identyczne doswiadczenie wprowadzajac jednak uprzednio 0,05 ml roztworu zawierajacego 0,5 mg/ml enzymu S.F. czastka 2, co odpowiada okolo 50 jednostek.Stwierdzono, ze w próbkach kontrolnych bez enzymu procent absorbowanego azotu jest zmienny u róznych zwierzat i wynosi srednio 5%. W próbach doswiadczalnych procent ten jest mniej zmienny i bardziej zwiekszony osiagajac srednia wartosc 17%.Stosujac te sama technike mozna badac szybkosc wchlaniania innych pokarmów i ewentualne zwiekszenie wchlaniania pod wplywem enzymu. Stwierdzono, ze zjawisko to zachodzi w wiekszym stopniu przy wchlanianiu bialek niz cukrów czy tluszczów. Zwiekszenie szybkosci wzrostu pod wplywem enzymu znajduje odbicie raczej w obrazie miesni niz w tworzeniu sie substancji zapasowych. Mozna wiec powiedziec, ze wzrost zwierzecia nalezy rozpatrywac jako korzysc jakosciowa i ilosciowa. ¦ Stosujac te sama technike mozna równiez badac szybkosc wchlaniania lekarstw, których przenikanie przez sciany jelit moze byc lub nie byc uzaleznione od specyficznych przenosników. Stwierdzono, ze szybkosc wchlaniania lekarstw w przypadku zastosowania enzymu zwieksza sie lecz w sposób nierównomierny.Przyklad V. Wplyw enzymów proteolitycznych na przyrost wagi kurczat.— Kurczeta hodowane sa na ziemi. Kurczeta — samce gatunku Arbor-Acres najpierw hodowane w grupie otrzymuja taki sam pokarm.Kurczeta 12-dniowe rozdziela sie na 4 grupy po 25 szt. o takim samym srednim ciezarze ciala (124 g) i o takim samym odchyleniu standardowym (3,28)).Grupa kontrolna 1 otrzymuje pokarm, którego podstawa jest kukurydza i soja o malym stezeniu bialka (16%). W 46 dniu doswiadczenia sredni ciezar ciala 58-dniowych kurczat wynosi 1430 g a wskaznik spozycia (stosunek ciezaru pokarmu spozytego do ciezaru ciala zwierzat) wynosi 2,30. • Grupa doswiadczalna 1 otrzymuje taki sam pokarm uzupelniony 4 g/kg substancji B powyzej okreslonej o mocy 100 j/mg; dawka enzymu wynosi w ten sposób 400 j/kg pokarmu co odpowiada w przyblizeniu 40000 j/kg ciezaru ciala na dzien. Pod koniec doswiadczenia sredni ciezar wynosi 1553 (—8%) a wskaznik spozycia 2,15 (-7%).Grupa kontrolna 2, otrzymuje pokarm, którego podstawa jest kukurydza i soja, zawierajacy normalne stezenie bialka (22%), pod koniec doswiadczenia sredni ciezar ciala wynosi 1676 g a wskaznik spozycia 2,09.Grupa doswiadczalna 2 otrzymuje taki sam pokarm uzupelniony dawka 400 j/kg pokarmu. Pod koniec doswiadczenia sredni ciezar wynosi 1772 g (-6%) a wskaznik spozycia 1,98 (-5%).Przyklad VI. Wplyw enzymów proteolitycznych na przyrost wagi kurczat hodowanych w inkubatorach z oswietleniem. < s Doswiadczenie przeprowadzone jest w 2 grupach okolo 600 kurczat gatunku Vavguard-Garrison w klatkach. Grupa kontrolna otrzymuje pokarm handlowy, którego podstawa jest soja i kukurydza, zawierajacy 21% bialka i 5% tluszczu. Pokarm ten zawiera 8 mg penicyliny prokainowej i 25 mg/kg tetracykliny. Grupa doswiadczalna otrzymuje taki sam pokarm uzupelniony 400 mg/kg produktu C okreslonego powyzej; dawka enzymu wynosi w ten sposób 800 j/kg pokarmu, co odpowiada w przyblizeniu 8000 j/kg ciezaru ciala dziennie.W 30 dniu doswiadczenia kurczeta wykazywaly w dwu grupach pozornie taki sam rozwój, lecz pojedyncze kurcze spozywalo srednio 1080 g w grupie kontrolnej a w grupie doswiadczalnej tylko 903 g, co stanowi okolo 16% oszczednosci pokarmu.W 40 dniu wybuchla w calej hodowli epidemia, która o wiele lepiej przetrwala grupa doswiadczalna. < W 60 dniu doswiadczenia smiertelnosc w grupie kontrolnej wynosila 5% a w grupie doswiadczalnej tylko 1,6%.Sredni ciezar ciala wynosi 1346 g i 1319 g. To niewielkie wahanie ciezaru ciala w grupie doswiadczalnej tlumaczy fakt, ze w grupie tej zwierzeta o slabszej budowie przezyly epidemie i zawdzieczaja to obecnosci enzymu w pokarmie. Wskazniki spozycia wynosza 2,8 i 2,68 co stanowi okolo 6,5% oszczednosci pokarmu w grupie doswiadczalnej.Rachunek ekonomiczny wyraznie wskazuje, ze zysk z 1000 kurczat wynosi odpowiednio 64 F i 260 F nie wliczajac kosztu enzymu. « Doswiadczenie kontrolne: na poczatku glównego doswiadczenia z kazdej grupy hodowlanej na ziemi przeniesiono po 25 kurczat do odizolowanego pomieszczenia zapewniajac w ten sposób zwierzetom jak najlepsze warunki sanitarne, smiertelnosc w tych grupach jest znikoma. Sredni ciezar ciala w grupie kontrolnej wynosi 1603 g a w grupie doswiadczalnej 1746 g (+9%) wskazniki spozycia równaja sie odpowiednio 2,68 i 2,41 (-10%).Przyklad VII. Wplyw enzymów wytwarzanych w/g wynalazku na smiertelnosc i aktywnosc plemników. • Postepowano jak w przykladzie VI, z ta róznica, ze doswiadczenie z kurczetami przeprowadzono raz w lecie podczas duzych upalów, drugi raz w jesieni w bardziej ustabilizowanych warunkach klimatycznych.W koncu doswiadczenia w 60 dniu smiertelnosc w grupie kontrolnej wynosi 7,9% i 4,8% w grupie doswiadczalnej.87 286 7 Srednie ciezary wynosza szacunkowo 1338 g i 1356 g.Wskazniki spozycia równaja sie odpowiednio 2,73 i 2,38, co stanowi okolo 12,4% oszczednosci pokarmu w grupie doswiadczalnej. Rachunek ekonomiczny wyraznie wskazuje, ze zysk z 1000 kurczat wynosi 77 F i 469 F nie wliczajac kosztów enzymu, i ¦ Doswiadczenia na kurczetach byly przeprowadzone przed wysunieciem zalozen o wiazaniu enzymu przez bialka sojowe i przed podjeciem zapobiegawczych czynnosci polegajacych na dodawaniu enzymu do wody pitnej tak jak w przykladzie II. Dodanie enzymu do wody pitnej zamiast do pokarmu, wplywa korzystnie na wyniki a szczególnie na stymulacje wzrostu, co pokrywa sie z uzyskanymi uprzednio wynikami w przykladzie II (+39%).Doswiadczenia na cieletach. Oprócz dzialania podstawowego na wydzieline sluzowata jelit, substancja enzymatyczna wytworzona sposobem wedlug wynalazku moze wywierac takze duzy wplyw na sam pokarm.Pomiedzy momentem, gdy mleko przeznaczone dla cielat jest umieszczone w temperaturze 37°C I momentem gdy jest ono spozyte przez cieleta, uplywa czesto okolo 1/2 godziny, Okres ten jest wystarczajacy do czesciowej degradacji bialka mleka w srodowisku plynnym w temperaturze 37°C przez substancje enzymatyczna, co moze w pewnym stopniu przyczynic sie do ogólnej poprawy wzrostu cielat.Przyklady VI i VII wskazuja, ze w hodowli przemyslowej smiertelnosc jest wyraznie zmniejszona w grupie doswiadczalnej. Fakt ten mozna róznie interpretowac.Wiadomo, ze mikroorganizmy patogenne posiadaja czasem gruba otoczke sluzowata a kokcydy lub inne pasozyty moga przyczyniac sie do tworzenia zaglebien w jelitach, w których umiejscowiaja sie. Gruba warstwa ochronna zbyt lepkiej otoczki sluzowatej mikroorganizmów, kokcydów !ub pasozytów, moze eliminowac dzialanie antybiotyków, kokcydiostatyków lub zwiazków przeciwpasozytniczych dodawanych zwykle do pokarmu. Enzymy zdolne do zmniejszania lepkosci wydzieliny sluzowatej jelit moga spelniac role aktywatorów antybiotyków, kokcydiostatyków i zwiazków przeciwpasozytniczych. Fakt ten moze tlumaczyc czesciowe zmniejszenie smiertelnosci w grupie doswiadczalnej. Substancje enzymatyczne wytworzone sposobem wedlug wynalazku moga pozwolic na ograniczenie dawki antybiotyków, kokcydiostatyków i zwiazków przeciwpasozytniczych dodawanych zwykle do pokarmu dla zwierzat bez zmniejszenia roli ochronnej zapewnianej przez te 3 typy zwiazków. < Z drugiej strony, substancje enzymatyczne wytworzone sposobem wedlug wynalazku ulatwiaja wchlanianie pewnych lekarstw dla zwierzat, co zostalo przedstawione w przykladzie III. Substancje te sa wiec uzywane do przygotowywania róznych mieszanek dla zwierzat. « Mieszanki paszowe dla zwierzat zawieraja przynajmniej jedna z substancji A, B lub C. Stosowane sa w ilosci od 1000 do 20000 j na kg ciezaru ciala na dzien. Dla substancji enzymatycznych stosuje sie przed ich uzyciem zwiazki balastowe albo stale jak laktoza albo plynne, badz otoczki ochronne.Mieszanki dla zwierzat dzialajace na wydzieline sluzowata jelit w celu ulatwienia wchlaniania lekarstw zawieraja przynajmniej jedna z substancji A, B lub C, które sa podawane w ilosci od 5000 do 200000 j/kg ciezaru ciala na dzien. ¦ W obydwu przypadkach najlepszym sposobem podawania jest podawanie doustne. Wyniki uzyskane na materiale zwierzecym mozna wykorzystac w medycynie. W tym przypadku mozna zapewnic maksimum bezpieczenstwa stosujac zamiast surowej lub czesciowo oczyszczonej substancji enzymatycznej, substancje wzglednie oczyszczona np. substancje D. Mieszanki dietetyczne zawieraja przynajmniej jedna z substancji D lub E stosowanych w dawkach od 1000 do 20000 j/kg ciezaru ciala na dzien.Mieszanki farmaceutyczne dzialajace na wydzieline sluzowata jelit, zwiekszaja anabolizm i efektywnosc lekarstw dzieki obecnosci przynajmniej jednej z substancji D lub E stosowanej w ilosci od 5000 do 200000 j/kg ciezaru ciala na dzien.Wydzielina sluzowata jelit jak równiez wydzielina sluzowata oskrzeli zawdziecza czesciowo swa lepkosc obecnosci makromolekul mucyny polaczonych miedzy soba mostkami bialkowymi.W lecznictwie dróg oddechowych (oskrzeli) zaproponowano stosowanie trypsyny i chymotrypsyny lecz za¬ stosowanie ich zostalo ograniczone z.róznych powodów, a szczególnie z powodu obecnosci w wydzielinie sluzo¬ watej oskrzeli inhibitorów trypsyny, zreszta innych niz inhibitor Kunitz'a. « Wyniki doswiadczen wykazuja, ze te inhibitory nie maja zadnego wplywu na substancje enzymatyczne wytwarzane sposobem wedlug wynalazku. Substancje te sa wiec stosowane do umiarkowanej redukcji lepkosci wydzieliny sluzowatej oskrzeli co przyczynia sie do usuniecia nadmiaru tej wydzieliny i ulatwia dzialanie antybiotyków.Oczyszczone substancje enzymatyczne takie jak substancja D dla zwierzat lub E dla ludzi sa bardziej korzystne dla blony sluzowej oskrzeli, która jest bardziej delikatna i mniej rozlegla niz blona jelitowa.8 87 286 Substancje te stosowane sa w mniejszych dawkach 500 i 50000 j/kg ciezaru ciala na dzien.Tak samo jak wydzielina sluzowata jelit, wydzielina sluzowata szyjki macicy zawdziecza swa lepkosc obecnosci makromolekul polaczonych miedzy soba mostkami bialkowymi- Dzialanie ograniczajace lepkosc wydzieliny sluzowatej jest wiec dzialaniem ograniczonym na bialka- - Wyniki badan nad lepkoscia wydzieliny sluzowatej szyjki macicy maja istotne znaczenie przy stosowaniu sztucznego zaplodnienia u bydla rogatego. Powodzenie pierwszej interwencji wynosi srednio 65% i wiaze sie czesciowo z faktem, ze wydzielina sluzowata szyjki macicy o zbyt duzej lepkosci powoduje tworzenie sie czopów doprowadzajacych do zablokowania szyjki macicy co utrudnia wedrówke plemników. Ponadto wiadomo, ze powodzenie zaplodnienia jest czesciowo uwarunkowane obecnoscia w nasieniu dostatecznej aktywnosci trypsynowej zapewniajacej zdolnosc plemników do zapladniania. Wiadomo jest równiez, ze w wydzielinie sluzowatej szyjki macicy wystepuja pewne inhibitory trypsyny. • Produkty enzymatyczne nalezace do grupy powyzej okreslonej i wykazujace wlasciwosci trypsynowe i niewrazliwe na inhibitory trypsyny moga powodowac ograniczona redukcje lepkosci wydzieliny sluzowatej szyjki macicy, co ma pewien wplyw na zwiekszenie aktywnosci plemników. Substancje te moga takze ulatwiac leczenie antybiotykami chorób dróg plciowych i zwiekszac skutecznosc sztucznego i naturalnego zapladniania.Oczyszczone substancje enzymatyczne stosowane sa w preparatach dopochwowych i tak substancja D dla zwierzat i D lub E dla ludzi i sa bardziej korzystne dla blon sluzowych pochwy i macicy, które sa bardziej delikatne i mniej rozlegle niz blony sluzowe jelit Substancje te stosowane sa w dawkach wzglednie slabszych (na ogól pomiedzy 500 i 50000 j/kg ciezaru ciala na dzien). PL