Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia podloza do hodowli bakterii.Dotychczasowy stan techniki Do hodowli drob¬ noustrojów uzywa sie wielu róznych podlozy tak podstawowych, jak i specjalnych wzbogaconych.Podloza te wykonuje sie róznymi metodami przy uzyciu najczesciej jako skladnika podstawowego bialka zwierzecego, w szczególnosci miesa wolowe¬ go. Podloza wykonane w oparciu o bialka roslin¬ ne maja swoje zastosowanie, lecz ich przydatnosc jest bardziej ograniczona, niz podlozy wykonanych w oparciu o bialko zwierzece. Szczególnie odnosi sie to do bakterii chorobotwórczych. Najczesciej uzywa sie podlozy wykonanych przez gotowanie miesa i otrzymywanie z niego tak zwanych wycia¬ gów, z których sporzadza sie buliony przez male rozcienczenie woda i dodanie peptonu, chlorku sodu i ustalenie pH.Dosc czesto trzeba takie podloza wzbogacac krwia, surowica lub innymi zwiazkami tak orga¬ nicznymi, jak i nieorganicznymi w celu uzyska¬ nia lepszych wzrostów, jak równiez selektywnosci w odniesieniu do scisle okreslonych grup bakterii.Znane i opisywane podloza wykonuje sie, prze¬ prowadzajac hydrolize bialka enzymami, zawarty¬ mi w jednym narzadzie np. trzustce. Do podlozy takich mozna zaliczyc bulion Hottingera i bulion Hartleya. W przypadku bulionu Hottingera uzywa sie mieso i zmielona swieza trzustke. Hydroliza za¬ chodzi w czasie kilku dni. Równiez bulion Hartleya 50 uzyskuje sie przy wykonywaniu wyciagu z trzustki, prowadzac hydrolize w okresie 6 godzin.Przy znanych sposobach otrzymywania wyciagów miesnych straty bialka po wykonaniu podlozy wy¬ nosza okolo 90 procent.W przypadku otrzymywania podloza sposobem wedlug wynalazku straty bialka sa minimalne^ a podloze spelnia zadane warunki.Istota wynalazku. Celem wynalazku bylo opraco¬ wanie technologii otrzymywania podloza do hodowli bakterii z mozliwoscia dlugotrwalego przechowy¬ wania w postaci koncentratu.Cel ten osiagnieto przez dlugoletnie prace do¬ swiadczalne nad doborem surowca, jak i skladni¬ ków naturalnych, zawierajacych enzymy. Prace pozwolily na ustalenie, ze najkorzystniejsze wyni¬ ki otrzymano przez dzialanie na elementy uposta¬ ciowane krwi zestawem enzymów, zawartych w zmielonym zoladku wieprzowym dodanym w ilosci —25 procent, w roztartej trzustce wieprzowej do¬ danej w ilosci 8—12 procent oraz w sluzówce jelita cienkiego swini dodanej w ilosci 2—4 procent, w stosunku do wagi elementów upostaciowanych krwi.Hydrolize przeprowadza sie w temperaturze 37°—41°C w srodowisku o pH=8,0—8,2 w czasie 72—96 godzin. Po tym czasie hydrolizat poddaje sie zakwaszeniu do pH=4,5.Elementy upostaciowane krwi sa bezuzytecznym bialkiem po odwirowaniu potrzebnej do innych ce¬ lów surowicy. 84 5773 84 577 4 Podloze, wykonane w oparciu o elementy uposta¬ ciowane krwi, jak stwierdzono, posiada 18 amino¬ kwasów oraz sole mineralne. Pozwala to na sto¬ sowanie go bez specjalnych dodatków wzbogacaja¬ cych do ustalenia lepszych wzrostów.Hydroliza enzymatyczna, przeprowadzona przy powyzszym doborze jakosciowym i ilosciowym, pozwolila na uzyskanie podloza do hodowli bakterii w postaci koncentratu, który nadaje sie do normal¬ nego przechowywania i wykazuje przydatnosc przez okres ponad dwu lat.Wykonujac caly szereg doswiadczen, stwierdzono, ze elementy upostaciowane krwi, poddane hydroli¬ zie enzymatycznej daja produkt koncowy, który w wielu przypadkach jest lepszy od produktów kon¬ cowych, otrzymanych przez hydrolize miesa, czy tez innego bialka. Zaleta jest otrzymywanie pro¬ duktu koncowego jako ekstraktu, który po wielo¬ krotnym rozcienczeniu woda od 1:5 do 1:20 w za- i . leznosci ód potrzeb, spelnia taka role, jak wiekszosc Jak juz zaznaczono, ekstrakt otrzymany na dro¬ dze hydrolizy enzymatycznej elementów upostacio¬ wanych krwi mozna przechowywac przez dluzszy okres czasu, w którym to nie traci on swych war¬ tosci uzytkowych.Najbardziej zaskakujace wyniki otrzymano po¬ przez badania porównawcze wzrostu róznych bak¬ terii na podlozu rozcienczonym woda, otrzymanym z ekstraktu hydrolizy enzymatycznej upostaciowa- podlozy, wykonanych w oparciu o mieso zwierze¬ ce, które to najczesciej rozciencza sie woda w sto¬ sunku 1:2.Inna zaleta opracowanego podloza jest to, ze kontrolujac jego przydatnosc do hodowli bakterii przez okres ponad dwu lat, nie traci ono nic ze swej wartosci uzytkowej. Zaleta podloza wykona¬ nego na drodze hydrolizy enzymatycznej elementów upostaciowanych krwi jest równiez i to, ze do roz¬ cienczonego jui hydrolizatu nie potrzeba dodawac peptonu w celu jego wzbogacenia, a tylko nalezy korygowac pH i dodawac chlorek sodu.Wykonujac badania na zawartosc azotu amino¬ wego i bialkowego stwierdzono duza koncentracje szczególnie azotu aminowego w ekstrakcie w po¬ równaniu do bulionu wolowego peptonowego i 1 procentowej wody peptonowej, a nawet ekstraktu, otrzymanego na drodze hydrolizy enzymatycznej miesa wolowego. ' Otrzymane wyniki ilustruje ponizsza tabela 1. nych elementów krwi w odniesieniu do wzrostu na bulionie peptonowym wolowym.Ilustruje to tabela 3. abel o < abel Tabela 1 Lp. 1 2 3 4 Hydrolizat enzymatyczny z elementów upostaciowa¬ nych krwi (ekstrakt) Hydrolizat enzymatyczny z miesa wolowego (ekstrakt) Bulion wolowy peptonowy Woda peptonowa 1 pro¬ centowa Azot aminowy w procentach objetosciowych 0.546 0,507 0,0210 0,0490 \zot bialowy procent, w przeliczeniu na wage 1 ml 1,053 1,318 0,1905 0,0687 Tabela 2 Lp. 1 2 3 4 6 Seria hydrolizatu (elementy upostacio¬ wane krwi) 14 14 13 13 12 1)2 Czas przechowywania po wykonaniu po 6-ciu tyg. lezakowania po wykonaniu po 10-ciu mies. lezakowania po wykonaniu po 10-ciu mies. przechowywania Azot aminowy w°/o objetosciowych 0,622 0,637 0,546 0,721 0,485 0,507 Azot bialkowy w f/o w przeli¬ czeniu na wage 1 ml 1,161 1,248 1,053 1,236 1,054 1,414 Ponizsza tabela 2 ilustruje zawartosc azotu ami¬ nowego i bialkowego w zaleznosci od czasu prze¬ chowywania w temperaturze pokojowej przez okres miesiecy.84 577 Tabela 3 LP- 1 1 ¦— — 3 4 1 6 Rodzaj bakterii < gat. Pasteuri&lla nwltocida Looli Streptococcus Curynefeac- terium Salmonella Ilosc komórek bakteryjnych w mld w 1 rai po 18 godzinach inkubacji bulion wolowy peptonowy 0,8—2,5 0,1—1,2 0,1—0,5 0,5—0,7 0,5—1 podloze wykonane z enzyma¬ tycznego ekstraktu elementów upostaciowanych krwi rozcien¬ czone woda 1:10 baz peptonu z 4o4attte» JfeCl ftjty) ] —9 %m* * j 0,1—6,5 1—2 2—3 1 Wykonujac badania przydatnosci ekstraktu po dwuletnim przechowywaniu w temperaturze poko¬ jowej nie stwierdzono, by ten czasokres wplywal ujemnie na wartosc ekstraktu i podlóz z niego wykonywanych, odnosnie wzrostu bakterii. W ta¬ beli 3 nie podano innych rodzajów, czy gatunków drobnoustrojów, które uzywano do badan przydat¬ nosci wyzej omawianego podloza, wyniki wzrostu bakterii byly równiez lepsze niz na bulionie wolo¬ wym peptonowym i to w rozcienczeniach wyzszych.Przyklad I 1000 gram elementów upostaciowanych krwi miele sie przez maszynke do miesa, dodajac do nich 2000 mililitrów wody wodociagowej i gotuje w na¬ czyniu na malym ogniu przez 15—20 minut Na¬ stepnie oziebia sie do temperatury 37-^40 stopni Celsjusza, ustala pH na 8,0—8,2 10 procentowym lugiem sodowym, w dalszej kolejnosci dodaje sie 200 gram zmielonego zoladka swinskiego, 100 gram roztartej w mozdzierzu trzustki wieprzowej, 20 gram sluzówki z jelita cienkiego swin, 25 mililitrów chloroformu i 25 mililitrów toluenu.Po dodaniu i zmieszaniu wszystkich skladników i ochlodzonych do temperatury 37—40 stopni Cel¬ sjusza elementów upostaciowanych krwi z woda, calosc wstawia sie do termostatu o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 72 godziny, codziennie kil¬ ka razy lekko mieszajac, jak równiez sprawdzajac pH i w razie koniecznosci doprowadzajac do pH=8,0—8,2 10 procentowym lugiem sodowym. Po okolo 72 godzinach trzymania w termostacie, hy¬ drolizat zakwasza sie 10 procentowym kwasem solnym do pH=4,5.Nastepnie zakwaszony hydrolizat doprowadza sie do wrzenia, gotujac 15—30 minut. Po zagotowaniu hydrolizat chlodzi sie do temperatury okolo 60 stopni Celsjusza i przesacza przez wate. Po prze- filtrowaniu pozostawia sie hydrolizat w chlodnym miejscu na 24 godziny. Po tym czasie uzupelnia sie ubytek hydrolizatu woda do pierwotnej objetosci, doprowadza sie pH hydrolizatu do 7,6 i przesacza przez bibule. Nastepnie rozlewa sie hydrolizat do jalowych naczyn, szczelnie zamyka korkami lub kapslami gumowymi i sterylizuje w autoklawie w temperaturze 120 stopni Celsjusza przez MO minus.Po sterylizacji hydrolizat wstawia sie mozliwie w 45 50 chlodne miejsce do lezakowania na okres szesciu tygodni. Przed uzyciem hydrolizat przesacza sie i rozciencza sie woda w zaleznosci od potrzeb.Badania kontrolne hydrolizatu wykazaly zawar¬ tosc nastepujacych ilosci azotu aminowego w pro¬ centach objetosciowych i azotu bialkowego w prze¬ liczeniu na wage 1 mililitra: azot aminowy w procentach objetosciowych —0,507 azot bialkowy procent w przeliczeniu na wage 1 mililitra —1,414 Przyklad II 1000 gram elementów upostaciowanych krwi miele sie przez maszynke do miesa, dodajac do nich 3000 mililitrów wody wodociagowej i gotuje w naczyniu na malym ogniu przez 15—20 minut Nastepnie oziebia sie do temperatury 37—40 stopni Celsjusza, ustala pH na 8,0—8,2 10 procentowym lugiem sodowym, w dalszej kolejnosci dodaje sie 90 gram zmielonego zoladka swinskiego, 50 gram roztartej w mozdzierzu trzustki wieprzowej, 10 gram sluzówki z jelita cienkiego swini, 25 mililitrów chloroformu i 25 mililitrów toluenu.Po dodaniu i zmieszaniu wszystkich skladników i ochlodzonych do temperatury 37—40 stopni Cel¬ sjusza elementów upostaciowanych krwi z woda, calosc wstawia sie do termostatu o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 72 godziny, codziennie kil¬ ka razy lekko mieszajac, jak równiez sprawdzajac pH i w razie koniecznosci doprowadzajac do pH=8,0—8,2 10 procentowym lugiem sodowym.Po okolo 72 godzinach trzymania w termostacie, hydrolizat zakwasza sie 10 procentowym kwasem solnym do pH=4,5. Nastepnie zakwaszony hydro¬ lizat doprowadza sie do wrzenia gotujac 15—30 mi¬ nut. Po zagotowaniu hydrolizat chlodzi sie do tem¬ peratury okolo 60 stopni Celsjusza i przesacza przez wate* Po przefiltrowaniu pozostawia sie hy¬ drolizat w chlodnym miejscu na 24 godziny. Po tym czasie uzupelnia sie ubytek hydrolizatu woda do pierwszej objetosci, doprowadza sie pH hydroli¬ zatu do 7,6 i przesacza przez bibule. Nastepnie rozlewa sie hydrolizat do jalowych naczyn, szczel¬ nie zamyka korkami lub kapslami gumowymi i sterylizuje w autoklawie w temperaturze 120 stop¬ ni CeJfjttsza przez 30 minut. Po sterylizacji hy¬ drolizat wstawia sie w mozliwie chlodnym miejscu7 84 577 8 do lezakowania na okres szesciu tygodni. Przed uzyciem hydrolizat przesacza sie i rozciencza sie woda w zaleznosci od potrzeb.Badania kontrolne hydrolizatu wykazaly zawar¬ tosc nastepujacych ilosci azotu aminowego w pro¬ centach objetosciowych i azotu bialkowego w prze¬ liczeniu na wage 1 mililitra: azot aminowy w procentach objetosciowych— 0,042 azot bialkowy procent w przeliczeniu na wage 1mililitra — 0,283 Jak z powyzszych przykladów i wyników widac do szczególnych zalet podloza otrzymanego sposo¬ bem wedlug wynalazku nalezy ekonomiczny dobór skladników, mozliwosc wielokrotnego rozcienczania woda i dlugotrwala przydatnosc preparatu bez za¬ bezpieczenia specjalnych warunków lezakowania, co bylo zalozeniem badan nad rozwiazaniem we¬ dlug wynalazku. PL