Sposób otrzymywania pochodnych antybiotyków z grupy makrolidów polienowych Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywa¬ nia pochodnych antybiotyków z grupy makrolidów polienowych.Dotychczas znany sposób otrzymywania N-acylo- wych pochodnych antybiotyków z grupy makroli¬ dów polienowych polega na reakcji antybiotyków z bezwodnikami kwasów karboksylowych. Znany jest równiez sposób otrzymywania kompleksu am- foterycyny B z dezyksycholanem sodowym, zwa¬ nego fungizonem.Niedogodnoscia opisanego wyzej sposobu jest to, ze otrzymane pochodne nie tworza prawdziwych roztworów, lecz jedynie roztwory koloidalne. Po¬ nadto pochodne N-acylowe wykazuja znacznie niz¬ sza aktywnosc biologiczna w stosunku do niepod- stawionych polienów, zas kompleks z dezoksycho- lanem sodowym zawiera w swym skladzie niepo¬ zadany skladnik, nieobojetny dla zywego organiz¬ mu.Celem wynalazku jest opracowanie sposobu o- trzymywania pochodnych antybiotyków z grupy makrolidów polienowych, który pozwoli na otrzy¬ manie pochodnych antybiotyków dobrze rozpusz¬ czalnych w wodzie i o lepszych wlasnosciach te¬ rapeutycznych.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze na makrolid polienowy, zawierajacy co najmniej jed¬ na grupe aminowa, w srodowisku rozpuszczalnika takiego, jak dwumetyloformamid, metanol, dwu- metylosulfotlenek, pirydyna, wzglednie mieszani¬ ny rozpuszczalników, dziala sie mono- lub oligosa- charydami szeregu aldoz lub ketoz, wzglednie ich pochodnymi, zdolnymi do reagowania z grupa a- minowa, ewentualnie w obecnosci zwiazku, który 5 tworzy sól z czasteczka pochodnej makrolidu polie- nowego, w postaci zasad organicznych lub nieorga¬ nicznych, pozostawia do przereagowania, a nastep¬ nie wyodrebnia produkt reakcji i ewentualnie . przeprowadza go w sól. 10 Jako pochodne, zdolne do reagowania z grupa aminowa, stosuje sie dezoksycukry, dezoksycukry zawierajace co najmniej jeden inny heteroatom, zwiazki, w których zachowana jest jedna funkcja hemiacetalowa, zas pozostale funkcje podstawione 15 sa alkilem, aTylem, acylem oraz podane wyzej zwia¬ zki, w których grupa hydroksylowa na C 1 podsta¬ wiona jest grupa halogenowa, acylowa, tosylowa lub azydowa.Zaleta pochodnych cukrowych makrolidów polie- 20 nowych, jak tez i zwiazków tych antybiotyków z pochodnymi mono- i oligosacharydów jest duza lat¬ wosc dyspersji w wodzie, a w przypadku makroli¬ dów polienowych posiadajacych grupe karboksylo¬ wa, zdolnosc tworzenia, w srodowisku bliskim neu- 25 tralnemu, trwalych soli z kationami, bardzo dobrze rozpuszczalnych w wodzie.Rózne pochodne, róznych makrolidów polieno¬ wych i róznych cukrów oraz ich rózne sole z ka¬ tionami rozpuszczaja sie w wodzie, tworzac roztwo- 30 ry, skladajace sie w róznym stopniu z koloidu o 82 22482 224 3 duzym stopniu dyspersji i roztworu prawdziwego.Wiele z takich substancji jak np. sól sodowa glu¬ kozowej czy maltozowej pochodnej nystatyny, two¬ rzy roztwory prawdziwe nie zawierajace koloidu.Takie rozpuszczalne i trwale cukrowe pochodne makrolidów polienowych i ich sole posiadaja wyso¬ ka aktywnosc biologiczna. Ich spektrum mikrobio¬ logiczne jest identyczne, jak wyjsciowycli antybio¬ tyków.Ponadto, reakcja zawierajacych grupe aminowa makrolidów polienowych z cukrami przebiega w lagodnych warunkach, nawet bez uzycia kataliza¬ tora, którego zastosowanie jedynie przyspiesza prze¬ bieg real^iv mrtorma^t, ze wzgledu na latwosc rea¬ gowania cUkrów* z * irupami aminowymi makroli¬ dów polienowych nie jest konieczne uprzednie ak¬ tywowanie reagujacego cukru.Sposób otrzymywania pochodnych cukrowych makrolidów polienowych i ich oczyszczanie ilustru¬ ja podane nizej przyklady. 1% cm przy 304 nm), 3,0 g glukozy i 0,5 g imidazolu roz¬ puszcza sie w 50 ml dwumetyloformamidu i po¬ zostawia w cieplarce w temperaturze 36°S na ok¬ res dwóch dni.W tym czasie praktycznie calosc antybiotyku przereaguje. Otrzymana pochodna i nieprzereago- wana glukoze wytraca sie eterem etylowym, prze¬ mywa tym rozpuszczalnikiem i suszy w prózni.Otrzymuje sie 6,1 g surowej pochodnej w postaci l°/o = 260 przy 304 nm.Przyklad I. 3,0 g nystatyny (E x _ =560 soli z imidazolem o E 1 cm 1% Przyklad II. 3,0 g nystatyny (E1 cm = 560 przy 304 nm) i 3,0 g glukozy rozpuszcza sie w 50 ml dwumetyloformamidu i pozostawia w tempera¬ turze 36°C na okres dwóch dni. Dalszy tok poste¬ powania, jak w przykladzie I. Otrzymuje sie 3,6 g l°/o : 280 przy surowej pochodnej glukozowej o E1 340 nm. 1% Przyklad III. 10,0 g polifunginy (E1 Qm = = 825 przy 304 nm) rozpuszcza sie w 50 ml dwu¬ metyloformamidu, dodaje 3,0 g glukozy i 0,1 g kwasu askorbinowego i pozostawia w cieplarce w temperaturze 36°C na okres dwóch dni. Dalszy tok postepowania, jak w przykladzie I. Otrzymuje sie 1% 12,9 g surowej pochodnej o E 304 nm. 1 cm 570 przy l°/o Przyklad IV. 0,5 g nystatyny (E1 cm= 640 przy 304 nm) i 0,5 g maltozy rozpuszcza sie w 20 ml dwu¬ metyloformamidu i pozostawia w temperaturze 36°C na okres dwóch dni. Dalszy tok postepowa¬ nia, jak w przykladzie I. Otrzymuje sie 0,9 g su- 1% rowej pochodnej o E . = 310 przy 304 nm). 'l% Przyklad V. 1,0 g amfoterycyny B (E 1 cm = = 1420 przy 382 nm) i 0,3 g glukozy zawiesza sie w 20 ml dwumetyloformamidu i pozostawia na dwie doby w temperaturze 36°C. Dalszy tok poste¬ powania, jak w przykladzie I. Otrzymuje sie 1,3 g 1% surowej pochodnej o E . = 1250 . przy 382. nm. 1% Przyklad VI. 1,0 g amfoterycyny B (E - = = 1420 przy 382 nm) i 0,6 g maltozy w 20 ml dwu¬ metyloformamidu pozostawia sie na dwa dni w temperaturze 36°C. Dalszy tok postepowania, jak w przykladzie I. Otrzymuje sie 1,5 g surowej po- to l9/o chodnej o E , n = 1160 przy 382 nm. i cm 1% 55 Przyklad VII. 1,0 g kandycydyny (E 1 cm" = 430 przy 378 nm) 1,0 g glukozy i 0,05 g imida- l5 zolu rozpuszcza sie w 50 ml pirydyny i pozostawia w temperaturze pokojowej w ciemnosci na okres siedmiu dni. Dalszy tok postepowania, jak w przy¬ kladzie I. Otrzymuje sie 2,1 g surowej pochodnej 1% w postaci soli z zasada organiczna o E * = 200 20 1 c^l przy 378 nm.Przyklad VIII. 0,5 g kandycydyny (E 1% 1 cm- = 750 przy 378 nm) i 0,3 g maltozy rozpuszcza sie 25 w 10 ml dwumetyloformamidu i pozostawia w tem¬ peraturze 36°C na dwa dni. Dalszy tok postepowa¬ nia, jak w przykladzie I. Otrzymuje sie 0,7 g su- , . l°/o rowej pochodnej o E - = 410 przy 378 nm. 1% 30 Przyklad IX. 0,5 g pimarycyny (Ej cm = 800 przy 304 nm), 0,5 g rybozy i 0,5 g imidazolu roz¬ puszcza sie w 100 ml metanolu i pozostawia w tem¬ peraturze 36°C na okres 24 godzin, po czym oddes- 35 tylowuje sie w prózni metanol do objetosci 10 ml, a surowa pochodna wytraca sie i przemywa eterem etylowym. Otrzymuje sie 1,0 g surowej substancji 1% o E 1 = 340 nm, w postaci soli z imidazolem. 1% 40 Przyklad X. 1,0 g pimarycyny o E 1 cm = 800 przy 304 nm i 0,6 g maltozy rozpuszcza sie w 20 ml dwumetyloformamidu i pozostawia w tempera¬ turze 36°C na okres dwóch dni. Dalszy tok poste- 45 powania, jak w przykladzie I. Otrzymuje sie 1,4 g 1% surowej pochodnej o E 1 _ =530 przy 304 nm. . 1% Przyklad XI. 0,5 g polifunginy (Ej =700 ^ przy 304 nm), 0,5 maltozy i 0,1 g imidazolu roz¬ puszcza sie w 20 ml dwumetyloformamidu i pozos¬ tawia w temperaturze 36°C na okres dwóch dni.Dalszy tok postepowania, jak w przykladzie I. O- trzymuje sie 1,1 g surowej pochodnej w postaci l°/o soli z imidazolem o E. = 318 przy 304 nm.Przyklad XII. 0,5 g trychomycyny (E 1% 1 cm" = 500 przy 378 nm) i 0,15 g glukozy rozpuszcza sie 60 w 8,0 ml dwumetyloformamidu i pozostawia w tem¬ peraturze 36°C na okres dwóch dni. Dalszy tok po¬ stepowania, jak w przykladzie I. Otrzymuje sie 1% 0,55 g surowej pochodnej o E1 =360 przy 6S 378 nm.82 224 3 V 1% Przyklad XIII. 1,0 g trychomycyny o Ej cm= = 500 przy 378 nm i 0,6 g maltozy rozpuszcza sie w 20 ml dwumetylosulfotlenku i pozostawia w tem¬ peraturze 36°C na dwa dni. Dalszy tok postepowa¬ nia, jak w przykladzie I. Otrzymuje sie 1,4 g su- 1% . rowej pochodnej o E . = 320 przy 378 nm. 1% Przyklad XIV. 0,5 g pimarycyny (Ej = = 800 przy 304 nm), 0,5 g fruktozy i 0,1 g imida- zolu rozpuszcza sie w 20 ml mieszaniny dwumetylo¬ formamidu i metanolu w stosunku 2:1 i pozostawia na dwa dni w temperaturze 36°C. Dalszy tok poste¬ powania jak w przykladzie I. Otrzymuje sie 1,0 g surowej pochodnej w postaci soli z imidazolem o „ 1% 1 cm = 370 przy 304 nm' 1% Przyklad XV. 0,1 g leworyny (Ej cm = 800 przy 378 nm) i 0,1 g glukozy rozpuszcza sie w 2,0 ml dwumetyloformamidu i pozostawia na dwa dni w temperaturze 36°C. Dalszy tok postepowania jak w przykladzie I. Otrzymuje sie 0,2 g surowej po- l°/o chodnej oE, =370 przy 378 nm. 1% Przyklad XVI. 0,5 g leworyny (Ej c = 800 przy 378 nm) i 0,3 g maltozy rozpuszcza sie w 20 ml mieszaniny dwumetyloformamidu i pirydyny w stosunku 2:1 i pozostawia w temperaturze 36° na dwa dni. Dalszy tok postepowania, jak w przykla¬ dzie I. Otrzymuje sie 0,7 g surowej pochodnej o 1% E 1 ™~ = 520 Przy 378 nm. 1 cm * 1% Przyklad XVII. 1,0 g rimocydyny (E. = = 500 przy 304 nm), 0,1 g glukozy i 0,2 g imidazo- lu rozpuszcza sie w 15 ml dwumetyloformamidu i pozostawia w temperaturze 36°C na okres dwóch dni. Dalszy tok postepowania, jak w przykladzie I. 1% Otrzymuje sie 2,0 g surowej pochodnej o E j cm= = 250 przy 304nm. , Przyklad XVIII. 1,0 g surowej glukozowej po¬ chodnej kandycydyny w postaci soli z imidazolem, otrzymanej w przykladzie VII, rozpuszcza sie w 20 ml wody i po zakwaszeniu kwasem octowym wytrzasa z 20 ml butanolu. Po odstaniu sie warstw, warstwe wodna usuwa sie,a pozostala warstwe bu- tanolowa, zawierajaca pochodna antybiotyku, prze¬ mywa sie kilkakrotnie nasycona butanolem i za¬ kwaszona kwasem octowym woda, porcjami po 10 ml, az do usuniecia calkowitego imidazolu. Pozos¬ taly roztwór butanolowy glukozowej pochodnej kandycydyny, uwolniony z soli z imidazolem, za-, geszcza sie w prózni az do calkowitego usuniecia azeotropowo wody. Z pozostalego roztworu wytra¬ ca sie pochodna eterem etylowym, przemywa osad tym rozpuszczalnikiem i suszy w prózni. Otrzymuje sie 0,5 g produktu nie zawierajacego imidazolu o 1% "E j cm=300. W identyczny sposób uwalnia sie z soli z imidazolem pochodne cukrowe pozostalych makrolidów polienowych. 6 Przyklad XIX. 10 g surowego prodirfdai^ Or trzymanego w wyniku reakcji nystatyny z JjJuiKr- za (przyklad II), rozpuszcza sie w 100 ml r&esma- niny octanu etylu, butanolu, metanolu i wody, w stosunku 20:10:5:35. Roztwór przesacza sie przez warstwe celitu i laduje do pieciu elementów apa¬ ratu do rozdzialu przeciwpradowego, przeprowadza 100 przeniesien fazy górnej i na przemian po 50 przeniesien fazy górnej i dolnej. Polozenie substan¬ cji antybiotycznej okresla sie w oparciu o pomiar absorpcji swiatla przy 305 nm, po uprzednim roz¬ cienczeniu pobieranych próbek górnej fazy meta¬ nolem.Z elementów odpowiadajacych polozeniu krzywej 15 rozdzialu przeciwpradowego antybiotyku wydziala sie oczyszczona substancje przez oddestylowanie rozpuszczalników z dodatkiem butanolu do malej objetosci w prózni i wytraca z pozostalosci eterem etylowym. Osad przemywa sie eterem etylowym i 20 suszy w prózni. Otrzymuje sie 1,5 g preparatu o 1% E i c = 720 przy 304 nm- Przyklad XX. 200 mg glukozowej pochodnej kandycydyny, otrzymanej w przykladzie XVIII, roz- 25 puszcza sie w 2,0 ml mieszaniny chloroformu, me¬ tanolu i wody, w stosunku 10:5:1 i rozdziela na kolumnie wypelnionej 7,0 g Sephadex LH-20, a krzywa wycieku antybiotyku okresla na podstawie pomiaru absorpcji swiatla przy 378 nm. Z wycier- 3fi ku, zawierajacego oczyszczony antybiotyk, wydzte- la sie substancje przez odparowanie rozpuszczalni¬ ka z dodatkiem butanolu w prózni, wytracenie ete¬ rem etylowym, przemycie eterem osadu i wysusze¬ nie w prózni. Otrzymuje sie 60 mg produktu o 35 io/0 1 cm Przyklad XXI. 0,5 g surowej pochodnej glu¬ kozowej nystatyny, otrzymanej w przykladzie II, oczyszcza sie metoda chromatografii podzialowej rra. 40 kolumnie z zelem krzemionkowym typu kieselgel\ Merck, ziarno ponizej 0,08 mm, nasyconym woda w proporcji 1:1. Stosujac mieszanine chloroformu, metanolu i wody w stosunku 10:10:3, krzywa wy¬ cieku antybiotyku z kolumny okresla sie na dro- 45 dze pomiaru absorpcji swiatla przy 304 nm. Z wy¬ cieku wydziela sie oczyszczona substancje przez od¬ parowanie rozpuszczalników z dodatkiem butanolu- w prózni, wytracenie eterem etylowym, przemycie osadu tym rozpuszczalnikiem i wysuszenie w próz- 50 i ni. Otrzymuje sie 0,12 g preparatu o Ej cm = 715 przy 305 nm.Przyklad XXII. 0,5 g oczyszczonej glukozowej pochodnej nystatyny, otrzymanej w przykladzie XIX, dodaje sie do 10 ml wody i przy silnym mie¬ szaniu i chlodzeniu z zewnatrz w lazni lodowej, zobojetnia molowa iloscia 0,1 N roztworu kwasna* go weglanu sodu, po czym roztwór liofilizuje sie.Otrzymuje sie 0,5 g soli sodowej glukozowej po- 60 1% chodnej nystatyny o E ^ = 710.Przyklad XXIII. 0,5 g glukozowej pochodnej amfoterycyny B, otrzymanej wedlug przykladu V 6* i oczyszczonej wedlug metody opisanej w przykla- 55 *7 82 224 8 1% ., . dzie-XIX, o E - c = 1370 dysperguje sie w 10 ml wody £ przy chlodzeniu z zewnatrz lodem i silnym mieszaniu neutralizuje do pH = 7,2 przy pomocy 0,1 N roztworu wodnego wodorotlenku sodu. O- trzymany klarowny roztwór soli liofilizuje sie 0,5 g soli sodowej glukozowej pochodnej amfoterycy- 1% nyBoEj cm=1355. 1% Przyklad XXIV. 1,0 g pimarycyny o E = = 800 przy 304 nm i 0,6 g ramnozy rozpuszcza sie w 100 ml metanolu i pozostawia w temperaturze 36°C na okres dwóch dni. Metanol oddestylowuje sie do objetosci okolo 10 ml i surowa pochodna wyodrebnia sie przez wytracenie i przemycie ete¬ rem etylowym. Otrzymuje sie 1,5 g pochodnej o • l°/o M = 550 przy 304 nm. 1 cm * J 1% Przeklad XXV. 1,0 g pimarycyny o E - = =±*#8G,vprzy 304 nm i 0,6 g 6-acetyloglukozy rozpusz¬ cza sie w 100 ml metanolu i pozostawia na okres dwóch dni w temperaturze 35°C. Dalszy tok poste¬ powania, jak w przykladzie XXIV. Otrzymuje sie 1% 1,55 g surowej pochodnej o E j = 540 przy 304 nm.Przyklad XXVI. 1,5 g pochodnej cukrowej antybiotyku zawiesza sie w 20 ml wody i dodaje 100 mg imidazolu, przesacza przez Sephadex G-15 i liofilizuje.Przyklad XXVII. 1 g pochodnej cukrowej an¬ tybiotyku zawiesza sie w 20 ml wody, dodaje 84 g kwasnego weglanu sodowego, przepuszcza przez Sephadex G-15 i liofilizuje.Przyklad XXVIII. 1 g cukrowej pochodnej antybiotyku zawiesza sie w 20 ml wody, dodaje 120 mg 2-amino-2-(hydroksymetylo)-propan-l,3-diolu, przepuszcza przez Sephadex G-15 i liofilizuje.P~r z y k l a d XXIX. 1 g pochodnej cukrowej an¬ tybiotyku zawiesza sie w 20 ml wody, dodaje 84 g kwasnego weglanu sodowego wzglednie 100 mg imidazolu, wode oddestylowuje sie pod zmniejszo¬ nym cisnieniem z butanolem i wytraca sól pochod¬ nej suchym eterem etylowym.Przyklad XXX. 200 mg aureofacyny z 50 mg kwasu glukuronowego zawiesza sie w 10 ml dwu- metyloformamidu i pozostawia na noc w tempe¬ raturze 32°C. Nierózpuszczona substancje odwiro¬ wuje sie, a antybiotyk wytraca suchym eterem ety¬ lowym. Otrzymano 110 mg pochodnej glukuronowej 0 E 1(380) = 370' Przyklad XXXI. 200 mg amfoterycyny B i 50 mg kwasu glukuronowego zawiesza sie w 10 ml dwumetyloformamidu i pozostawia przez noc w temperaturze 32°C. Powstala pochodna wytraca sie 5 suchym eterem etylowym. Otrzymano 240 mg po- l°/o chodnej glukoronowej o Ei/333) = 940.Przyklad XXXII. 200 mg polifunginy i 50 mg kwasu glukuronowego zawiesza sie w 10 ml 18 awumetyloformamidu i pozostawia przez noc w temperaturze 32°C. Powstala pochodna wytraca sie suchym eterem etylowym. Otrzymano 156 mg po¬ chodnej glukuronowej o E ^304) = 480. 15 Przyklad XXXIII. 100 mg perimycyny o 1% E 1 cm= 710 przy 380 nm rozpuszcza sie w 5 ml dwumetyloformamidu, dodaje 30 mg kwasu D-glu- 20 kuronowego i pozostawia w temperaturze 38°C na okres 24 godzin. Surowa pochodna wytraca sie 100 ml suchego eteru etylowego. Otrzymano 100 mg x. ... x, l0/° substancji ° E j ,cm = 690 Przy 380 nm. 25 PL PL