PL81802B1 - - Google Patents

Description

Uprawniony z patentu: Merck Patent GmbH, Darmstadt (Republika Federalna Niemiec) Sposób wytwarzania nowych pochodnych tiopirymidyny Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych pochodnych tiopirymidyny o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza grupe o wzorze 2, B oznacza grupe zasady pirymidynowej lub pury- nowej, X oznacza atom siarki lub grupe —NH, m oznacza liczbe calkowita 1—3, a n oznacza liczbe calkowita 0—2000, przy czym jednak suma (m + n) powinna wynosic co najmniej 2, a w tej samej cza¬ steczce moga wystepowac rózne grupy B. W zakres wynalazku wchodzi równiez sposób wytwarzania soli amoniowych, soli z metalami oraz dwusiarcz¬ ków zwiazków o wzorze 1.Stwierdzono, ze wyzej wymienione substancje moga w zywych komórkach ludzkich lub zwierze¬ cych zarówno in vitro jak i in vivo wywolywac po¬ wstawanie interferonów. Dzieki temu zwiazki te nadaja sie do ochrony zarówno komórek ludzkich i zwierzecych in vitro, jak i ludzi oraz zwierzat, przed zakazeniami, wywolywanymi przez wirusy i inne czynniki chorobotwórcze rozmnazajace sie sródkomórkowo, na przyklad zarazki malarii, tok¬ soplazmozy i jaglicy. Zwiazki o wzorze 1 nadaja sie równiez do hamowania wzrostu zlosliwych komó¬ rek in vitro i in vivo do hamowania rozwoju zlo¬ sliwych guzów i bialaczek w organizmie lub tez moga powodowac zanik, przy czym oprócz tworze¬ nia sie interferonów moga miec tutaj tez wplyw jeszcze i inne mechanizmy dotychczas nie wyjasnio¬ ne, na przyklad zwiekszenie obrony immunologicz¬ nej. Dzieki temu zwiazki wytwarzane sposobem 30 wedlug wynalazku moga byc stosowane jako leki w medycynie i weterynarii i moga tez stanowic produkty posrednie do wytwarzania innych leków.Mozna na przyklad, polinukleotydy o wzorze 1 przez usuniecie siarki przeksztalcic w inne, znane polinu¬ kleotydy, które same wykazuja dzialanie pobudza¬ jace interferony. Mozna nastepnie nie hybrydyzu- jace miedzy soba polinukleotydy o wzorze 1 hybry- dyzowac z innymi, na przyklad znanymi polinukle- otydami.Sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie po¬ chodne tiopirymidyny o ogólnym wzorze 1, w któ¬ rym R, B, X, m i n maja wyzej podane znaczenie, ale szczególnie cenne wlasciwosci maja te zwiazki o wzorze 1, w którym m oznacza 1, a n oznacza liczbe 1—2000, B oznacza grupe 2,4-dwutiouracyli- lowa, 2-tilO'cytoizy'lowa lub adeinylilowa, albo B oznacza grupe 2,4-dwutiouracylilowa, a X oznacza atom siarki, albo B oznacza grupe 2jtiocytozylowa, a X oznacza grupe =NH oraz sole amoniowe i me¬ taliczne, a takze dwusiarczki tych zwiazków, rym wszystkie symbole maja wyzej podane znacze¬ nie, wytwarza sie w ten sposób, ze jednofosforan 2,4-dwutiourydyny lub jednofosforan 2-tiocytydyny Wedlug wynalazku zwiazki o wzorze 1, w któ- albo zwiazek o wzorze 1, w którym m oznacza licz¬ be 1 poddaje sie reakcji z nieorganicznym orto- lub pirofosforanem, przy czym jedna z substancji wyjsciowych powinna byc w postaci zaktywowanej albo zwiazek o wzorze 1, w którym jednak zamiast 8180281 3 grupy XH znajduje sie grupa, która moze byc nia zastapiona, traktuje sie zwiazkiem o wzorze H2X, albo w zwiazku o wzorze 1 w którym jednak co najmniej jedna grupa funkcyjna znajduje sie w postaci funkcyjnie zmodyfikowanej, te grupe funk¬ cyjna uwalnia sie przez traktowanie srodkiem sol- wolizujacym lub redukujacym, po czym na otrzy¬ mana pochodna tiopirymidyny ewentualnie dziala sie polimeryzujacym enzymem ewentualnie w obec¬ nosci innego nukleotydu i/lub zwiazek o wzorze 1 traktuje sie srodkami utleniajacymi i/lub jedna gru¬ pe SH znajdujaca sie w zwiazku o wzorze 1, prze¬ prowadza sie ewentualnie wielostopniowo, w grupe NH2 dzialaniem srodka amonolizujacego.Symbol B oznacza korzystnie grupe 2,4-dwutio- uracylilowa lub 2-tiocytozylowa, a takze grupe za¬ sady wystepujacej w naturalnych nukleozydach, np. grupe adeniny, guaniny, cytozyny, uracylu, ty- miny, ksantyny, hipoksantyny lub grupe 5-fluoro- uracylu, 5-metylocytozyny lub 5-hydroksymetylo- cytozyny oraz grupe innej tiopochodnej jednej z tych zasad, np. grupe 2-tiouracylu, 4-tiouracylu, 2-tiotyminy i 2,4-dwu'tlbtyminy. Jako sole zwiaz¬ ków o wzorze 1 szczególnie korzystne sa fizjologicz¬ nie dopuszczalne sole metali alkalicznych, np. sodu lub potasu, metali ziem alkalicznych, np. .wapnia, magnezu, metali ciezkich, np. manganu i ewentual¬ nie podstawione sole amoniowe, np. sole trójetylo-, jednoetanolo-, dwuetanolo-, trójetanolo- oraz trój- -n-butylo-amonibwe. Jednofiosforany 2,4-dwutioury- dyny lub 2-tiocytydyny msl, n = 0 sa znane. Re¬ akcja tych substancji lub zwiazku o wzorze 1, w którym m oznacza liczbe 1 z nieorganicznym orto- lub pirofosforanem, np. z fosforanami lub pirofo- sforanami trójalkiloamoniowymi, prowadzi do od¬ powiednich dwu- lub trójfosforanów to jest zwiaz¬ ków o wzorze 1, w którym m oznacza liczbe 2 lub 3. Jeden z substratów powinien znajdowac sie przy- tym w postaci zaktywowanej, np. jako imidazoli- nian, otrzymywany przez reakcje z karbonylodwu- imidazolem np. w dwumetyloformamidzie (DMF) w temperaturze 0—50°C, korzystnie 20—40°, morfo- linian, otrzymywany przez reakcje z nDorfolina i srodkiem kondensujacym takim jak np. dwucyklo- hefesylokarbodwuimid (DDC) lub chlorek arylosul- fonylu, anilid, otrzymywany przez reakcje z anili¬ na i srodkiem kondensujacym, takim jak np. DCC lub chlorek arylosulfonylu, lub jako zaktywowany ester, np. ester p-nitrofenylowy, otrzymywany przez reakcje z p-nitrofenolem i srodkiem konden¬ sujacym, takim jak np. DDC lub chlorek arylo- sulfonylu, albo jako ester 2-pirydylbwy, otrzymy¬ wany przez reakcje z 2-hydroksypirydyna i srod¬ kiem kondensujacym lub przez reakcje z wegla¬ nem bis-2-pirydylu.Reakcje prowadzi sie korzystnie w obojetnym rozpuszczalniku, takim jak dwumetyloformamid, dwumetylosulfotlenek (DMSO), pirydyna, acetoni- tryl lub III-rzed. butanol, w temperaturze 10—100°C, a korzystnie w temperaturze pokojowej. Czas reak¬ cji wynosi z reguly 1—48 godzin. Proces nalezy pro- ^wadzic delikatnie, aby uniknac rozkladu, spowodo¬ wanego solwoliza, to tez stosuje sie na ogól meto¬ dy chromatograficzne, na przyklad na dwuetylo- aminoetylocelulozie (celuloza DEAE), 802 4 Otrzymane produkty mozna ewentualnie prze¬ ksztalcic w ich sole metaliczne lub amoniowe, pod¬ dajac reakcji z zasadami lub solami, na przyklad z nadchloranem sodowym w acetonie. 5 Mozna takze zwiazek o wzorze 1, w którym jed¬ nak zamiast grupy.XH znajduje sie grupa, dajaca sie zastapic ta grupa, przeksztalcic w zwiazki o wzo¬ rze 1 dzialaniem amoniaku lub siarkowodoru. Gru¬ pami dajacymi sie zastapic grupa XH sa takie gru- !0 py, które w reakcji nukleofilowej maja dobre wla¬ sciwosci „leaving group", jak na przyklad nizsze grupy alkilomerkaptanowe, takie jak metylo-, n- -propylo- i benzylomerkaptanowa, grupy sulfono¬ we i ich sole, na przyklad —SOsNa, grupy alkilo- is i aryloestrów kwasów sulfonowych oraz grupy chlo¬ rowcowe, jak na przyklad chlor lub brom. Reakcje prowadzi sie korzystnie w obojetnym rozpuszczal¬ niku, przykladowo w nizszym alkoholu, na przy¬ klad w metanolu, etanolu lub izopropanolu w tem- 20 peraturze 0—40°, a korzystnie w temperaturze po¬ kojowej. Reakcje z H2S prowadzi sie korzystnie w obecnosci katalizatora zasadowego, na przyklad trój- etyloaminy, trój-n-butyloaminy lub wodorotlenku czteroetyloamoniowego. 25 Zwiazki o wzorze 1 mozna wytwarzac takze w ten sposób, ze w zwiazku odpowiadajacym na ogól wzorowi 1, w którym jednak co najmniej jedna grupa funkcyjna, na przyklad OH, SH lub NH2, znajduje sie w postaci funkcyjnie zmodyfikowanej, 30 na przyklad jako ester, eter, acetal, ortoester, tio- ester lub amid, te grupe funkcyjna wyzwala sie za pomoca traktowania srodkiem solwolizujacym, a korzystnie hydrolizujacym. W szczególnosci funk¬ cyjnie zmodyfikowanymi grupami OH moga byc 35 przykladowo: grupa acyloksylowa majaca korzystnie do 8 atomów wegla, na przyklad formyloksylowa, acetoksylowa, propionyloksylowa, butyryloksylowa, izobutyryloksylowa lub benzoiloksylowa, a takze grupa benzyloksylowa lub trójfenylometoksylowa. 40 Funkcyjnie zmodyfikowana grupa SH moze byc grupa acylomerkaptanowa, majaca korzystnie do 8 atomów wegla, na przyklad grupa formylo-, ace- tylo-, propionylo-, butyrylo-, izobutyrylo- lub ben- zoilomerkaptanowa, zas funkcyjnie zmieniona gru- 45 pa NH2 moze byc grupa acyloamidowa, majaca ko¬ rzystnie do 8 atomów wegla, na przyklad acetoami- dowa, propionamidowa i benzamidowa.Sasiadujace za soba grupy OH moga byc w funk¬ cyjnie zmodyfikowanej postaci acetalowej, ketalo- 50 wej lub ortoestrowej, na przyklad jako ewentualnie podstawione grupy benzylidenodwuoksylowe, izo- propylidenodwuskylowe lub alkoksymetylenodwu- oksylowe, na przyklad grupy etoksymetylenodwu- oksylowe. Rozklad solwolityczny grup funkcyjnie 55 zmodyfikowanych prowadzi sie korzystnie w srodo¬ wisku zasadowym lub lekko kwasnym, gdyz w bar¬ dziej kwasnym srodowisku reakcyjnym moze byc zaatakowane wiazanie C—N pomiedzy cukrem i grupa zasadowa. Dlatego tez korzystnie stosuje 60 sie wodorotlenki, weglany lub wodoroweglany me¬ tali alkalicznych, na przyklad sodu lub potasu, albo metali ziem alkalicznych, na przyklad wapnia lub baru, jak równiez czwartorzedowe wodorotlenki amoniowe lub wodny roztwór kwasu octowego, przy $5 czym reakcje prowadzi sie w temperaturze od —1081802 5 do 1Ó0°C, a w szczególnosci w temperaturze poko¬ jowej. Solwolize mozna takze prowadzic w niskiej temperaturze, na przyklad, od —10 do 10°C, a ko¬ rzystnie w 0°C, za pomoca bardzo rozcienczonego, na przyklad 0,01-molowego kwasu solnego lub 1% kwasu trójfluorooctowego w obojetnym rozpuszczal¬ niku. Solwolize prowadzi sie na ogól w srodowisku wodnym przy czym w razie potrzeby do wodnego roztworu mozna dodac jeden lub kilka obojetnych rozpuszczalników organicznych. Jako rozpuszczal¬ niki stosuje sie, na przyklad metanol, etanol lub izopropanol, ketony, na przyklad aceton lub buta- non, aminy, na przyklad pirydyna lub trójetyloami- na, amidy, na przyklad DMF, oraz sulfotlenki, na przyklad DMSO. Grupy funkcyjnie zmodyfikowane i dajace sie redukowac, na przyklad grupy benzylo- ksylowe, trójfenylometoksylowe, nitrowe lub azy- dowe, mozna przeprowadzac w wolne grupy OH lub NH2 takze za pomoca traktowania srodkami re¬ dukujacymi. Na przyklad, grupy nitrowe lub azy- dowe mozna redukowac do grup aminowych pylem cynkowym w roztworze wodnym, korzystnie w sro¬ dowisku 80% kwasu octowego, w temperaturze 0— 40°C, a zwlaszcza 15—30°C.Otrzymane sposobem wedlug wynalazku pochod¬ ne tiopirymidyny, a w szczególnosci mononukleo- tydy o wzorze 1, w którym m oznacza liczbe 2' lub 3, a n oznacza liczbe zero mozna ewentualnie polimeryzowac, poddajac je dzialaniu enzymów po¬ limeryzujacych. Jesli nie dodaje sie przy tym inne¬ go nukleotydu, to zwykle otrzymuje sie oligo-, lub polinukleotydy o wozrze 1, w którym n oznacza liczbe wieksza od 1, w których wystepuja tylko jed¬ nakowe grupy B, mianowicie 2,4-dwutiouracylilowe lub 2-tiocytozylowe. Jezeli zas przy polimeryzacji dodaje sie innego nukleotydu, na przyklad adenozy- nodwu- lub trójfosforanu, urydynodwu- lub trójfo¬ sforanu, cytydynodwu- lub trójfosforanu, guanozy- nodwu- lub trójfosforanu, inozynodwu- lub trójfo¬ sforanu, tymidynodwu- lub trójfosforanu, ksantozy- nodwu- lub trójfosforanu, wówczas tenze nukleotyd zostaje równiez wbudowany w polinukleotyd. W ta¬ kim przypadku otrzymuje sie oligo-lub polinukleo¬ tydy o wzorze 1, w których w tej samej czasteczce wystepuja rózne grupy B, np. grupa 2,4-dwutioura- cylilowa i adenylilowa. Enzymami odpowiednimi do przeprowadzenia syntezy enzymatycznej tego ro¬ dzaju polinukleotydów, a w szczególnosci polimery¬ zacji mononukleotydów (m = 2, n = 0), sa polinu- kieotydofosforylazy E.C.2.7.7.8. np. z Escherichia coli.Jesli polimeryzacja enzymatyczna mononukleoty¬ dów o wzorze 1, w którym m oznacza liczbe 2 lub 3, a n oznacza zero nastepuje przez matrycowo-za¬ lezne polimerazy, to wówczas sklad i sekwencja polinukleotydów okreslona jest przez sklad i se¬ kwencje matrycy. W przypadku uzycia polidezoksy- ryboadenylilotymidyny jako matrycy otrzymuje sie np. oligo- lub polinukleotydy o wzorze 1, w któ¬ rych w tej samej czasteczce wystepuja powtarzaja¬ ce sie w naprzemian sekwencji grupy B 2,4-dwutio¬ uracylilowe i adenylilowe. Odpowiednimi enzymami do przeprowadzenia syntezy tego rodzaju polinu¬ kleotydów, a w szczególnosci polimeryzacji mono¬ nukleotydów o wzorze 1, w którym m oznacza licz- Ó be 3, a n oznacza zero sa RNA^politmerazy E.C.2,7. 7.6 np. z Escherichia coli. Enzymy mozna stosowac takze i w postaci surowych ekstraktów. W celu unikniecia tworzenia sie dwusiarczków korzystnie r 5 jest przy polimeryzacji stosowac dodatek odpowied¬ niego inhibitora, np. dwutiotreitolu lub dwutioery- tritolu [treo- lub erytro-2,3-dwuhydroksybutano- dwutiol-1,4; „odczynnik Clelanda"] albo tez 2-me- rakaptoetanolu. 10 Polimeryzacje prowadzi sie z reguly w srodowi¬ sku wodnym o wartosci pH 5,5—9,5 korzystnie 8—9 i w temperaturze 0—80°C, korzystnie 20—45°C, a w szczególnosci w temperaturze ca 37°C, przy czym korzystnie jest dodac substancji buforowych, 15 np. tris-(hydroksymetylo)-aminometanu („Tris"), weglanu amonowego lub katoodylanu sodowego. Ko¬ rzystne jest takze przy polimeryzacji dodawanie soli nieorganicznych, np. chlorku magnezowego, chlor¬ ku manganawego lub chlorku wapniowego. Polime- 20 ryzacje prowadzi sie z reguly w ciagu 1—72 go¬ dzin.Otrzymane polimery moga tworzyc pasma wielo¬ krotne, np. spirale podwójne. Na przyklad, kwas poli-2,4^dwutiourydylowy X = S, B = 2,4-dwutio- 25 uracylil, n = ca 1000 tworzy sam ze soba trwala podwójna spirale.Mono-, oligo- lub polinukleotydy o wzorze w któ¬ rym X oznacza atom siarki mozna utleniac do od¬ powiednich dwusiarczków za pomoca srodków utle- 34) niajacych, np. jodu. Reakcje prowadzi sie korzystnie w wodnych roztworach buforów fosforanowych o wartosci pH 5—9, a w szczególnosci od 7—7,5 i w temperaturze od —10°C do 40°C, a w szczególnosci 0—10°C. 35 w przypadku oligo- i polinukleotydów utlenianie mozna prowadzic tak, ze utlenione zostana nie wszystkie grupy SH znajdujace sie w czasteczce, lecz tylko niektóre z nich. Utworzenie mostków —S—S— wewnatrz podwójnej spirali wywiera byc 40 moze wplyw stabilizujacy, np. przeciwko nuklea- zom. Mozliwe jest takze przeksztalcenie jednej grupy SH znajdujacej sie w zwiazku o wzorze 1 w grupe NH2. Mozna to przeprowadzic na przy¬ klad przez traktowanie soli trójalkiloamoniowych 45 zwiazku o wzorze 1, w którym X oznacza atom siarki, gazowym amoniakiem w rozpuszczalnikach, np. w alkoholach, DMF lub DMSO i w temperatu¬ rze 50—100°C. Korzystniejsza jest jednak wielo¬ stopniowa amonoliza, podczas której zwiazek o wzo- M rze 1 przeksztalca sie przede wszystkim w odpo¬ wiedni sulfonian o wzorze 1, w którym zamiast grupy XH znajduje sie grupa SOsNa. Reakcje te prowadzi sie w ciagu okolo 0,5—8 godzin, poddajac zwiazek o wzorze 1, w którym X oznacza atom siar- 66 ki reakcji z powietrzem lub tlenem w obecnosci siarczynu lub wodosiarczynu sodowego w roztwo¬ rze wodnym, korzystnie przy wartosci pH okolo 7 i w temperaturze okolo 0—40°C, a korzystnie w temperaturze pokojowej. Przez traktowanie otrzy- 60 manego sulfonianu solami amonowymi, np. NH4C1, w roztworze wodnym o wartosci pH 7—10, korzyst¬ nie okolo 8,5 i w temperaturze 0—40°C, korzystnie w temperaturze pokojowej, otrzymuje sie zwiazki aminowe o wzorze 1 w którym X oznacza grupe 45 =NH.7 iiiM * Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalaz¬ ku moga byc stosowane w mieszaninie ze stalymi, cieklymi i/lub pólcieklymi nosnikami jako leki w medycynie ludzkiej lub w medycynie weterynaryj¬ nej. Nosnikami moga byc substancje organiczne lub nieorganiczne, nadajace sie do stosowania po¬ zajelitowego, jelitowego lub miejscowego oraz nie reagujace ze zwiazkami o wzorze 1. Moga to byc takie substancje jak np. woda, oleje roslinne, alko¬ hole, benzylowe, polietylenoglikole, zelatyna, lakto¬ za, skrobia, stearynian magnezu, talk, wazelina i cholesteryna. Do stosowania pozajelitowego na¬ daja sie w szczególnosci roztwory, korzystnie roz¬ twory wodne lub oleiste, jak równiez zawiesiny, emulsje lub wszczepy. Do stosowania jelitowego nadaja sie tabletki, drazetki, kapsulki, syropy, soki lub czopki, a do stosowania miejscowego masci, kremy lub pudry. Preparaty te moga byc ewentual¬ nie wyjalawiane lub zawierac domieszki substan¬ cji pomocniczych, takich jak np. srodki zwieksza¬ jace poslizg, konserwujace, stabilizujace lub zwil¬ zajace, emulgatory, sole wplywajace na cisnienie osmotyczne, substancje buforowe, barwiace, sma¬ kowe i/lub zapachowe. Preparaty te podaje sie ko¬ rzystnie w dawkach zawierajacych po 0,1—100 mg substancji czynnej.W ponizszych przykladach okreslenie „analiza fosforanowa" oznacza stosunek nukleozydu do fo¬ sforanu, oznaczony metoda „Can. J. Biochem. Phy- siol." tom 41, str. 469 (1963). Wartosc S20w otrzy¬ mano prze zanalize szybkosci sedymentacji za po¬ moca analitycznej ultrawirówki.Przyklad I. a) 1 mol 2,4-dwutiourydyno-5'- -fosforanu bis-trójetyloamoniowego w 10 ml DMF poddaje sie reakcji z 2 molami karbonylodwuimi- dazolu w temperaturze 20—40°C, wytwarzajac imi- dazolinian. Po 20 minutach dodaje sie 5 moli fo¬ sforanu tris-(trój-n-butylo)-amoniowego w 5 ml DMfeO i pozostawia do odstania na przeciag nocy.Nastepnie rozpuszczalnik usuwa sie czesciowo pod zmniejszonym cisnieniem, a pozostalosc traktuje 800 ml wody. Wodny roztwór poddaje sie na kolum¬ ne z celuloza DEAE (50X2,5 cm), eluuje roztworem 0—0,5 molowym wodoroweglanu trójetyloamonio- wego wedlug gradientu liniowego, a nastepnie laczy frakcje, zawierajace 2,4-dwutiourydyno-5'-dwufo- sforan i odparowuje do suchosci pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 15°C. Pozostalosc roz¬ puszcza sie w niewielkiej ilosci metanolu, dodaje 2 równowazniki nadchloranu sodowego w niewiel¬ kiej ilosci acetonu i straca dodaniem acetonu. Po odwirowaniu i kilkakrotnym przemyciu acetonem suszy sie otrzymana bezpostaciowa sól dwusodowa 2,4-dwutiourydyno-5'-dwufosforanu pod cisnieniem wynoszacym 15 torów. Widmo UV (w wodzie, pH 5,5) : ^max 280 i 340 nm. Analiza fosforanowa 1 :2,2.Jezeli jako substancje wyjsciowa zastosuje sie 2- -tiocytydyno-5'-fosforanu bis-trójetyloamoniowy wówczas postepujac w analogiczny sposób otrzymu¬ je sie sól dwusodowa 2-tiocytydyno-5'-dwufosforanu.Widmo UV (w wodzie, pH 7,0) : ^max 247, ramie przy 272 nm, A247/A272 = 1,23. Analiza fosforanowa 1 :1,90.Analogicznie za pomoca pirofosforanu tetrakis- -trój-n-butyloamoniowego otrzymuje sie sól trójso¬ dowa 2,4-dwutiouiydyno-5'jtrójfosforanu [(Widmo UV w wodzie, pH 5,5) lmlx 280 i 340 nm, A^o/A^o = = 1,85; analiza fosforanowa 1 :2,90] lub sól trójso- dowa 2-tiocytydyno-5'-trójfosfoiianu (Widmo UV w 5 wodzie, pH 7,0; ^max 247, ramie przy 272 nm; A247/A272=l,30; analiza fosforanowa 1:2,95). b) 4 ml mieszaniny wodnej (pH 8,3) zawierajacej 0,4 mmola buforu Tris. HOl, 0,008 mmola M,gCl2, 0,04 mmola soli dusodowej 2,4-«dwutiourydyno-5/-dwufo- io sforami, 0,04 mmola dwutiotreitolu i 10 jednostek en- zymowych polinukleotydofosforylazy (aktywnosc wlasciwa: 0,165 mmoli UDP/godzine X mg bialka w temperaturze 37°C poddaje sie inkubacji w ciagu 4 godzin w temperaturze 37°C po czym usuwa sie U bialko przez kilkakrotne ekstrahowanie mieszanina chloroformu i alkoholu izoamylowego (w stosunku objetosciowym 25:2). Faze wodna zateza sie w temperaturze 15°C do objetosci ca 1,5 ml i poddaje dializie w komorze dializacyjnej w ciagu 48 godzin 20 i w temperaturze 3°C wobec 0,01-molowego roztwo¬ ru Tris HC1 (pH 7,0). Bufor wymienia sie cztero¬ krotnie. Otrzymuje sie poli-2,4-dwutiourydyno-5'- -fosforan (kwas poli-2,4-dwutiourydylowy; poli- -S2S4U). 25 Wartosc S20w : 12 S. Widmo UV (w wodzie, pH 7:^max 270 ,nm (*p = 350°); A280/A840&5,4; war¬ tosc pK : 9,2 (oznaczono miareczkowaniem spektro- fotometrycznym). Widmo UV w 0,05-molowym roz¬ tworze kakodylanu sodowego (pH 7,0) wykazuje M przejscie z postaci spiralnej w postac zwojowa, przy czym wartosc Tm wynosi 81°C. Analogicznie z soli dwusodowej 2-tiocytydyno-5'-dwufosforanu otrzy¬ muje sie poli-2-tiocytydyno-5)-fosforan (kwas poli- -2-tiocytydylowy; 'poli-S2C). Wartosc S^^ : 5 S. 35 Widmo UV (wada, pH 7,0) : ^max 244, ramie przy 270 nm; A^/A^o = 1,25. c) 2,5 ml mieszaniny inkubacyjnej, zawierajacej 0,003 mmola adenozynotrójfosforanu, 0,003 mmola soli brójsodowej 2,4-dwutiourydyno-5'-trójfosforanu, 40 0,003 mnnoila dwutiioforertolu, 0,075 mmola MgCl2, 0,6 jednostek A2fl0 (ca 0,0001 mmola) polidezoksyryboade- nylilotymidyny i 360 jednostek enzymowych poli- merazy RNA (okreslono metoda podana w „Pro- cedures in Nucleic Acid Research", G.L. Captoni 45 i D.R. Davies, Ed. Hairper i Row. Nowy Jork i Lon¬ dyn, 1966, tom I, str. 323) poddaje sie inkubacji w ciagu 6 godzin w temperaturze 37°C, a nastepnie rozciencza 0,7 ml 4% roztworu dodecylosulfonianu sodowego i usuwa bialko przez wielokrotne ekstra- 50 howanie mieszanina chloroformu i alkoholu izo¬ amylowego (5 :2. Faze wodna zateza sie w tempe¬ raturze 15°C do objetosci ca 1 ml i poddaje diali¬ zie w komorze dializacyjnej w ciagu 48 godzin w temperaturze 3°C i wobec 0,01-molowego roztworu 55 Jaworowego Tris. HC1 (pH 7,0). Po tej operacji ko- nlora zawiera kwas poliryboadenylilo-2,4-dwutio- urydylowy poli-r-(A-sVU).Wartosc SwfW : 12 S. Widmo UV (w wodzie, pH 7,0) :^max 280*i 340 nm, A280/A840 = 1,90. W widmie 60 UV w temperaturze 0—1009C nie stwierdza sie zad¬ nego przejscia termicznego z postaci spiralnej w postac zwojowa. Polinukleotyd wystepuje wiec prawdopodobnie w postaci zwojowej. d) 0,001 mmola (21 jednostek A270) poli-s^U w ¦ 1 ml 0,1-molowego buforu fosforanowego (pH 7,4)81802 traktuje sie w temperaturze 3QC 0,001 mola J2 (0,01 ml wodnego, 0,1 — normalnego rozwoju J2). Po 2 godzinach w temperaturze 3°C roztwór reakcyjny poddaje sie w ciagu 15 godzin w temperaturze 3°C dializie w komorze dializacyjnej wobec 0,05^molo- wego roztworu Tris-HCl (pH 7,0). Otrzymuje sie dwusiarczek poli-s^U.Wartosc S20 w : 17 S. Widmo UV (w wodzie, pH 5,5) :XmAX 288 nm (£p=30 000) i 340 nm (fp = 2800).Odpowiedni dwusiarczek otrzymuje sie analogicznie z poli-r-(A-s2s4U). Wartosc S20lW : 16 S. Widmo UV (w wodzie, pH 5,5) : Xm&x 288 rim (ep=15 000) i 340 nm (ep = 1400). e) dio 2 ml wodtneglo roizJtwioiru 5 mmoli soli dwu- sodowej 2,4-dwutiourydyno-5'-dwufosforanu do¬ daje sie 0,02 ml mieszaniny (objetosciowo 3:1) 1- -molowego roztworu Na^Os i 1-molowego roztwo¬ ru NaHSOs. Przez roztwór reakcyjny przepuszcza sie strumien powietrza, a w odstepach czasu co 30 minut dodaje sie jeszcze czterokrotnie po 0,02 ml odczynnika siarczynowego. Przebieg reakcji sle¬ dzi sie za pomoca chromatografii cienkowarstwo¬ wej. Po uplywie 2,5 godzin roztwór reakcyjny, za¬ wierajacy sól sodowa 2^tiourydyno-4-sulfoniano-5'- -dwufosforanu, traktuje sie 1 ml 0,2-molowego roz¬ tworu NH4C1 (pH 8,5) i pozostawia w temperaturze pokojowej na przeciag jednej godziny. Po wykon¬ czeniu otrzymuje sie sól dwusodowa 2-tiocytydyno- -5'-dwufosforanu.Analogicznie z poli-2,4-dwutiourydyno-5'-fosfora- nu otrzymuje sie poli-2-tiocytydyno-5'-fosforan (poli-s*C).Przyklad II. Roztwór 0,1 mmola soli trójety- loamoniowej 4-metylotio-2-tiourydyno-5'-dwufosfo- ranu [widmo UV w wodzie, pH 5,5 : ^max 286 i 340 nm; A^g/A^o c= 11; analiza fosforanowa: 1 :1,95; sporzadzony w sposób opisany w przykladzie I z soli trójetyloamoniowej 4-metylotio-2-tiourydyno-5' -fo¬ sforanu] w 10 ml CH8OH i 1 ml trójetyloaminy nasyca sie siarkowodorem w temperaturze pokojo¬ wej i pozostawia do odstania na przecig 15 godzin.Nastepnie roztwór odparowuje sie do sucha a po¬ zostalosc rozpuszcza sie w 1 ml CH3OH i dodaje do 10 ml 1% roztworu NaC104 w acetonie. Straco¬ na sól dwusodowa 2,4-dwutiourydyno-5'-dwufosfo- ranu odwirowuje sie, a nastepnie suszy pod zmniej¬ szonym cisnieniem (15 torów). Analogicznie z soli trójetyloamoniowej 4-metylotio-2-tiourydyno-5'- -trójfosforanu otrzymuje sie sól trójsodowa 2,4- -dwutiourydyno-5'-trójfosforanu.Przyklad III. Roztwór 0,1 mmola soli trójety¬ loamoniowej 4-metylotio-2-tiourydyno-5'-dwufosfo- ranu w 10 ml CH3OH nasyca sie amoniakiem w temperaturze pokojowej i pozostawia do odstania na przeciag 15 godzin, po czym odparowuje do su¬ cha pozostalosc rozpuszcza w 0,5 ml CH3OH i roz¬ twór ten dodaje do 10 ml 1% roztworu NaC104 w acetonie. Stracona sól dwusodowa 2-tiocylydyno-5'- -dwufosforanu odwirowuje sie i poddaje suszeniu.Analogicznie z soli trójetyloamoniowej 4-metylotio- -2-tiourydyno-5'-trójfosforanu otrzymuje sie sól trójsodowa 2-tiocytydyno-5*-trójfosforanu.Przyklad IV. Do 0,2 mmola 2,4-dwutiourydy- no-5'-fosforanu bis-trójetyloamoniowego w 1 ml pirydyny dodaje sie. 145 mg (0,44 mmola) (2-cyjano- 10 etylo)-a-pirydylofosforanu cykloheksyloamoniowego, a nastepnie mieszanine wytrzasa w ciemnosci w ciagu 3 dni w temperaturze 30°C. Otrzymana mie¬ szanine rozciencza sie 3 ml 2-normalnego roztworu 5 NH4OH i odparowuje do sucha. Syrop rozpuszcza sie w temperaturze 0°C w 3 ml 2-normalnego roz¬ tworu NaOH, nastepnie pozostawia w temperatu- . rze 0°C na przeciag 30 minut, po czym rozciencza 3 ml wody i zobojetnia kwasnym wymieniaczem 10 jonowym. Nastepnie odsacza sie wymieniacz jono¬ wy, przemywa dokladnie woda i wodne roztwory zateza do niewielkiej objetosci. Otrzymany 2,4-dwu- tiourydyno-5'-dwufosforan wyosabnia sie w sposób opisany w przykladzie la. W wyniku reakcji 0,2 15 mmoli 2,4-dwutiourydyno-5/-fosiforanu bis-trójetylo¬ amoniowego z 0,8 molami (0,3 g) imidazolinianu kwasu P1!52 — (2)-cyjanoetylopirofosforowego (sól dwucykloheksyloamoniowa) w 5 ml DMF otrzy¬ muje sie w analogiczny sposób bezpostaciowa sól 20 trójsodowa 2,4-dwutiourydyno-5'-trójfosforanu.P r yk l a d V. 0,5 mmola soli dwusodowej 3',2'- -0-dwuacetylo-2,4-dwutiourydyno-5'-dwufosforanu rozpuszcza sie w 50 ml stezonego wodnego roztwo¬ ru amoniaku. Po uplywie 2 godzin w temperaturze 25 20°C roztwór odparowuje sie do sucha pod zmniej¬ szonym cisnieniem w temperaturze 15°C. Pozosta¬ losc luguje sie wielokrotnie na cieplo bezwodnym etanolem, a nastepnie etanol dekantuje sie i od¬ rzuca, a pozostalosc z niewielka iloscia etanolu mie¬ so sza z acetonem i odwirowuje. Otrzymana bezposta¬ ciowa sól dwusodowa 2,4-dwutiourydyno-5'-dwufo- sforanu suszy sie pod cisnieniem 15 torów. Jesli jako substancji wyjsciowej uzyje sie soli dwusodo¬ wej N4-acetylo-2-tiocytydyno-5'-dwufosforanu, wów- 35 czas w analogiczny sposób otrzymuje sie sól dwu¬ sodowa 2-tiocytydyno-5-dwufosforanu.Przyklad VI. 0,5 mmola soli dwusodowej 3',2'- -0-etoksymetyleno-2,4-dwutiourydyno-5'-dwufosfo- ranu rozpuszcza sie w 50 ml 80% kwasu octowego. 40 Po 5-godzinnym odstanu w temperaturze 20°C od¬ parowuje sie do sucha pod zmniejszonym cisnie¬ niem w temperaturze 25°C. Z pozostalosci tworzy sie zawiesine w 50 ml acetonu, a nastepnie bez¬ postaciowa sól dwusodowa 2,4-dwutiourydyno-5'- 45 dwufosforanu odwirowuje sie i szuszy pod cisnie¬ niem 15 torów.Przyklad VII. 1 mmol soli dwusodowej 4- -azydo-2-tiopirymidylo-(l'^,D-rybozo)-5'-dwufosfo- ranu rozpuszcza sie w 50 ml 80% kwasu octowego, 50 dodaje 0,5 g pylu cynkowego i zawiesine wytrzasa w ciagu 2 godzin w temperaturze 20°C. Nastepnie odsacza sie pyl cynkowy i przesacz odparowuje do sucha pod zmniejszonym cisnieniem w temperatu¬ rze 15°C. Pozostalosc rozpuszcza sie w 100 ml 2- 55 -normalnego roztworu NH4OH, a nastepnie wpro¬ wadza siarkowodór, po czym odsacza sie stracony ZnS, a przesacz lagodnie odparowuje do sucha. Sól dwusodowa 2-tiocytydyno-5'-dwufosforanu wyodreb¬ nia sie w sposób opisany w przykladzie la. 60 PL PL PL PL PL PL PL PL

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania nowych pochodnych tiopiry- midyny o wzorze ogólnym 1, w którym R oznacza 65 grupe o wzorze 2, B oznacza grupe zasady pirymi-81802 li 12 dynowej lub purynowej, X oznacza atom siarki lub grupe =NH, m oznacza liczbe calkowita 1—3, a n oznacza liczbe calkowita 0—2000, przy czym jednak suma (m -|- n) powinna wynosic co najmniej 2, a w tej samej czasteczce moga wystepowac rózne gru¬ py B, jak równiez dwusiarczków oraz soli meta¬ licznych i amoniowych zwiazków o wzorze 1, zna¬ mienny tym, ze 2-4-dwutiourydynojednofosforan lub 2-tiocytydynojednofosforan albo zwiazek o wzorze 1, w którym m oznacza liczbe 1, poddaje sie reakcji z nieorganicznym orto- lub pirofosforanem przy czym jedna z substancji wyjsciowych powinna byc w postaci zaktywowanej, lub zwiazek o wzorze 1, w którym zamiast grupy XH znajduje sie grupa, która moze byc nia zastapiona, a pozostale sym¬ bole maja wyzej podane znaczenie traktuje sie zwiazkiem o wzorze H2X, albo w zwiazku o wzo¬ rze 1, w którym co najmniej jedna grupa funkcyj¬ na znajduje sie w postaci funkcyjnie zmodyfikowa¬ nej, te grupe funkcyjna wyzwala sie przez trakto¬ wanie srodkiem solwolizujacym lub redukujacym i ewentualnie na tak otrzymana pochodna tiopiry- midyny dziala sie polimeryzujacym enzymem ewen¬ tualnie w obecnosci innego nukleotydu i/lub zwia¬ zek o wzorze 1 traktuje sie srodkami utleniajacymi i/lub jedna grupe SH, znajdujaca sie w zwiazku o wzorze 1, przeprowadza sie, ewentualnie wielo¬ stopniowo, w grupe NH2 dzialaniem srodka amo- nolizujacego, HO- PO(0H)-0 XH i m i ^ \4 H H H OR OH Wzór 7 -P0(0H)-0-CH2 B .0 0- OH H Wzór 2 PZG Bydg., zam. 422/76, nakl. 110 + 20 Cena 10 z\ PL PL PL PL PL PL PL PL