Sposób wytwarzania 2,-amino-2,-dezoksykanamycyny Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia 2'-amino-2'-dezoksykanamycyny na drodze ho¬ dowli w warunkach aerobowych szczepu 0-4-1 mi¬ kroorganizmu Streptomyces kanamyceticus zare¬ jestrowanego jako ATCC 21252, w srodowisku 5 zawierajacym pozywke weglowodanowa i azotowa. 2'-amino-2'-dezoksykanamycyna jest antybioty¬ kiem skutecznie hamujacym rozwój bakterii Gram- -dodatnich, Gram-ujemnych i odpornych na dzia¬ lanie kwasów, np. bakterii takich jak Staphylo- 10 coccus, Pseudomonas, Salmonella, Shigella i My- cobacterium, jak równiez chorobotwórczych bak¬ terii odpornych na dzialanie innych antybiotyków i syntetycznych srodków leczniczych. Antybiotyk ten ma bardzo mala toksycznosc w stosunku do 15 organów sluchu i w organizmach ludzkich i zwie¬ rzecych dziala skutecznie przy zakazeniach bak¬ teriami Gram-dodatnimi, Gram-ujemnymi lub od¬ pornymi na kwasy. Antybiotyk ten ma sumarycz¬ ny wzór C18H87N5O10-H2O, a budowe tego zwiazku 20 przedstawia wzór podany na rysunku.Z brytyjskich opisów patentowych nr 817 385 i nr 925 790 wiadomo, ze jezeli mikroorganizm Streptomyces kanamyceticus hoduje sie w wa¬ runkach aerobowych, wówczas razem z kanamy- 25 cyna A wytwarza sie niekiedy kanamycyna B, to jest 2'-amino-2'-dezoksykanamycyna oraz kana¬ mycyna C. Jednakze dotychczas znane sposoby ho¬ dowli i oczyszczania nie umozliwiaja wytwarza¬ nia i oczyszczania 2'-amino-2'-dezoksykanamycy- 30 ny w takich ilosciach, które umozliwialyby stoso¬ wanie tego antybiotyku w praktyce.Wynalazek umozliwia wytwarzanie 2'-amino-2'- -dezoksykanamycyny z wysoka wydajnoscia. Spo¬ sób wedlug wynalazku polega na tym, ze szczep 0-4-1 mikroorganizmu, Streptomyces kanamyceti¬ cus, zarejestrowanego jako ATCC 21252, poddaje sie hodowli w warunkach aerobowych w srodo¬ wisku, zawierajacym pozywke weglowodanowa i azotowa, a cecha tego sposobu jest to, ze hodo¬ wle prowadzi sie w srodowisku zawierajacym do¬ datkowo aminoglikoze lub zwiazki typu glikozy¬ dów takie, jak paromamina, dezoksystreptamino- -0-kanosaminid, neamina lub antybiotyk NK-1003 albo antybiotyk NK-1001. Gdy w brzeczce hodo¬ wlanej osiagnie sie dostatecznie wysokie steze¬ nie 2'-amino-2'-dezoksykanamycyny, proces fer¬ mentacji przerywa sie i z brzeczki wyosabnia pro¬ dukt i oczyszcza go.Jako zwiazki aminoglikozowe w procesie pro¬ wadzonym sposobem wedlug wynalazku stosuje sie np. D-glikozamine, 3-amino-3-dezoksy-D-gliko- ze, 6-amino-6-dezoksy-D-glikoze lub 2,6-dwudezo- ksy-2,6-dwuamino-D-glikoze. Pozostale zwiazki, które w procesie wedlug wynalazku mozna sto¬ sowac jako dodatkowe skladniki pozywki, sa zwiazkami typu glikozydów, a mianowicie paro¬ mamina jest 4-(2-D-glikozaminylo)-a-dezoksy- streptamina, neamina jest 4-(2,6-dwudezoksy-2,6- -dwuaminoglikozylo)-a-dezoksystreptamina, anty- 80 34280 342 3 4 biotyk NK-1003 jest to 5-0-(6-amino-6-dezoksy-a- -D-glikozylo)-dezoksystreptamina, zas antybiotyk NK-1001 stanowi a-D-glikozyd antybiotyku NK-1003. Antybiotyki NK-1001 i NK-1003 sa opi¬ sane w Asian Medical Journal, tom II, nr 2, str. 74—75, luty 1968.Wspomniane wyzej dodatki dodaje sie do sro¬ dowiska hodowlanego przed lub po rozpoczeciu procesu hodowli Streptomyces, przy czym dodaje sie je znanymi sposobami. Stosunek ilosciowy tych dodatków do calosci srodowiska hodowlane¬ go nie ma decydujacego znaczenia dla przebiegu procesu, ale korzystnie wynosi on 0,05—l,09/o, zwlaszcza' 0,l^-0,5*/« ,wagowych. Stwierdzono, ze zawartosc wytworzonej w srodowisku hodowlanym 2'iamino-2/-dezoksykanamycyny osiaga w tych wa¬ runkach maksimum :po uplywie 3—7 dni od roz¬ poczecia procesu, fermentacji.Hodowle "prowadzi sie w sposób znany, stoso¬ wany przy hodowaniu actinomycetes, przy uzyciu srodowiska zawierajacego pozywke odpowiednia dla tych mikroorganizmów. Srodowisko to moze zawierac jako zródlo wegla np. skrobie, sacharoze, maltoze, glikoze, gliceryne itp., a jako zródlo azo¬ tu — make sojowa, rozpuszczalne bialka roslin¬ ne, wyciag namokowy z kukurydzy, pepton, wy¬ ciag miesny, azotany lub sole amonowe. Srodo¬ wisko to moze tez zawierac inne sole nieorganicz¬ ne, np. chlorek sodowy, siarczan magnezowy, a takze substancje sprzyjajace rozwojowi Strepto¬ myces kanamyceticus.Do wytwarzania 2'-amino-2'-dezoksykanamycyny mozna tez stosowac srodowiska stale, ale w celu wytwarzania duzych ilosci tego antybiotyku ko¬ rzystniej jest prowadzic proces w srodowisku cie¬ klym w warunkach aerobowych, metoda wglebna.Mozna tez prowadzic hodowle metoda wstrzasa¬ nia lub mieszania w srodowisku cieklym. Tempe¬ ratura hodowli wynosi zwykle 25—35°C, korzyst¬ nie okolo 28°C.Nagromadzona w srodowisku hodowlanym 2'- amino-2'-dezoksykanamycyne wyosabnia sie do¬ wolna, znana metoda, stosujac zywiczne wymienia¬ cze jonowe, ekstrakcje rozpuszczalnikami orga¬ nicznymi lub stracanie za pomoca substancji sto¬ sowanych przy oczyszczaniu znanych, rozpuszczal¬ nych w wodzie antybiotyków zasadowych. Na skale techniczna najkorzystniej jest stosowac me¬ tode adsorpcji i eluowania przy uzyciu wymienia¬ cza jonowego, korzystnie zywicznego wymieniacza typu karboksylowego, albo ekstrakcje rozpuszczal¬ nikiem organicznym, zawierajacym odpowiedni nosnik, na przyklad kwas p-toluenosulfonowy lub kwas laurynowy. Mozna na przyklad odsaczac ciala stale takie, jak grzybnia i przesacz, zawie¬ rajacy 2'-amino-2'-dezoksykanamycyne adsorbo- wac za pomoca Amberlite IRC-50, bedacego zy¬ wicznym wymieniaczem kationowym, zawieraja¬ cym glównie kopolimer kwasu metaksylowego z dwuwinylobenzenem. Mozna tez eluowac wodnym roztworem amoniaku, zbierac i stezac czynne frak¬ cje, a nastepnie poddawac je chromatograficzne¬ mu rozdzieleniu za pomoca Dowex 1X2, bedace¬ go silnie zasadowym zywicznym wymieniaczem anionowym, skladajacym sie glównie z kopolime¬ ru styrenu z dwuwinylobenzenem i zawierajacym czwartorzedowe grupy anionowe. Czynne frakcje laczy sie, steza i poddaje dalej oddzielaniu chro¬ matograficznemu przez adsorbowanie za pomoca 5 Amberlite CG-50 i stopniowe eluowanie wodnym roztworem amoniaku. Mozna otrzymac pojedyncza frakcje, zawierajaca aktywny zwiazek, to jest 2'-amino-2'-dezoksykanamycyne. Frakcje te odpa¬ rowuje sie ze stanu zamrozenia i Otrzymany pro¬ szek przekrystalizowuje z rozcienczonego woda dwumetyloformamidu, otrzymujac krystaliczna 2'-amino-2'-dezoksykanamycyne.Sposobem wedlug wynalazku 2'-amino-2'-dezo- ksykanamycyne wyosabnia sie z brzeczki' pohodo- wlanej korzystnie w ten sposób, ze z brzeczki, ewentualnie po jej przesaczeniu, adsorbuje sie 2'-amino-2'-dezoksykanamycyne razem z kanamy- cyna A za pomoca zywicznego wymieniacza ka¬ tionowego, eluuje wymieniacz wodnym roztworem amoniaku, zbiera frakcje aktywne i traktuje je zywicznym wymieniaczem anionowym, eluuje za pomoca wodnego roztworu amoniaku, zbiera od¬ dzielnie frakcje, zawierajace 2'-amino-2'-dezoksy- kanamycyne, i frakcje, zawierajace kanamycyne A, odparowuje ze stanu zamrozenia frakcje, za¬ wierajace 2'-amino-2'-dezoksykanamycyne i otrzy¬ many produkt w postaci proszku rozpuszcza sie w wodzie, oczyszcza roztwór chromatograficznie na kolumnie z zywicznego wymieniacza kationo¬ wego, eluujac wodnym roztworem amoniaku, przy czym poczatkowe frakcje, zawierajace sladowe do¬ mieszki kanamycyny A, odrzuca sie, a z pozosta¬ lych wyosabnia czysta 2'-amino-2'-dezoksykana- mycyne.Wariant tego sposobu polega na tym, ze brzecz¬ ke pohodowlana przesacza sie, przesacz alkalizuje wodorotlenkiem metalu alkalicznego do wartosci pH=10, ekstrahuje n-butanolem zawierajacym al¬ dehyd benzoesowy, wyciag miesza z woda, zakwa¬ sza kwasem siarkowym do wartosci pH=2 i mie¬ sza, oddziela faze wodna i chromatografuje ja na kolumnie z zywicznego wymieniacza anionowego, eluujac wodnym roztworem amoniaku, przy czym zbiera sie oddzielnie frakcje zawierajace 2'-ami- no-2'-dezoksykanamycyne i frakcje zawierajace kanamycyne A, odparowuje ze stanu zamrozenia frakcje zawierajace 2/-amino-2'-dezoksykanamycy- ne i otrzymany produkt w postaci proszku roz¬ puszcza w wodzie, oczyszcza roztwór chromatogra¬ ficznie na kolumnie z zywicznego wymieniacza kationowego, eluujac kolumne wodnym roztwo¬ rem amoniaku, przy czym poczatkowe frakcje za¬ wierajace sladowe domieszki kanamycyny A od¬ rzuca sie, a z pozostalych wyosabnia czysta 2'-ami- no-2'-dezoksykanamycyne.Otrzymana 2'-amino-2'-dezoksykanamycyna sta¬ nowi bezbarwne krysztaly iglaste o temperaturze topnienia 183—186°C, o odczynie zasadowym, roz¬ puszczalna w wodzie, w rozcienczonym woda me¬ tanolu, etanolu, acetonie, ale nierozpuszczalna w bezwodnym metanolu, etanolu, octanie etylu, octa¬ nie butylu, eterze etylowym, chloroformie i ben¬ zenie. Daje ona dodatnia reakcje z ninhydryna, a takze z odczynnikami Elson-Morgana i Molischa, ale nie daje reakcji z odczynnikami Saka^uc^i, 15 20 25 30 35 40 45 50 56 6080 5 Tollensa, F^hlinga? Miliona i Benedicta. Wodny roztwór tego antybiotyku o stezeniu 1% wyka¬ zuje skrecalnosc rwlasciwal [a]D21°c wynoszaca -h 118°. Pochodna. N-acetylowa, otrzymana przez acetylowanie 2'-amino-2'-dezoksykanamycyny bez¬ wodnikiem octowym w metanolu ma wzór suma¬ ryczny C18H32N5Ó10-5(CH3CO)-H2O topnieje w tem¬ peraturze 290—300ae z objawami rozkladu i wy¬ kazuje skrecalnosc wlasciwa [a]D21°c wynoszaca +118°. : 10 Bakteriobójcze wlasciwosci 2'-amino-2'-dezoksy- kanamycyny sa dosc stale w podwyzszonej tem¬ peraturze i gdy roztwór tego antybiotyku w 6n kwasie solnym ogrzewa sie w temperaturze 100°C w ciagu 40 minut, to roztwór ten wykazuje na- 15 stepnie 60—80% pierwotnej aktywnosci wzgledem Bacillus subtilis. Roztwór ten nanosi sie w postaci plamy na arkusz papieru filtracyjnego firmy Toyo nr 50 i nastepnie rozwija rozpuszczalnikiem sta¬ nowiacym mieszanine butanolu — kwasu octowe- 20 go i wody (4:2: 1). To badanie chromatograficzne wykazuje, ze sa dwie plamy dajace dodatnia reak¬ cje na ninhydryne i jedna z tych plam daje rów¬ niez dodatnia reakcje na azotan srebra w amo¬ niaku. 25 2'-amino-2'-dezoksykanamycyna wykazuje silne dzialanie bakteriobójcze w odniesieniu do bak¬ terii Gram-dodatnich, Gram-ujemnych i odpor¬ nych na kwasy, a takze w odniesieniu do szcze¬ pów odpornych na dzialanie kanamycyny A, in- 30 nych znanych antybiotyków i srodków leczniczych.Toksycznosc 2'-amino-2,-dezoksykanamycyny jest bardzo mala, gdyz LD50 w odniesieniu do myszy przy podawaniu dozylnym wynosi tylko 190 mg/Kg.Wlasciwosci bakteriobójcze 2'-amino-2'-dezoksy- 35 kanamycyny w stosunku do róznych organizmów sa podane w tablicy 1.Tablica 1 Badany mikroorganizm Aerobacter aerogenes IAM 1102 Alcaligenes faecalis Bacillus agri Bacillus subtilis ATCC 6833 Bacillus subtilis PCI 219 ; Diplococcus penumoniae Ty- pe 3110 Escherichia coli IAM 1253 Klebsiella penumoniae 607 Lactobacillus arabinosus ATCC 8014 Lactobacillus fermenti ATCC 9338 Staphylococcus albus PCI 1200A Staphylococcus aureus 209P Staphylococcus aureus Te- rashima [ | Minimalne stezenie w mikro- gramach na 1 ml powodujace calkowite | zahamowanie 0,15 0,031 0,078 0,039 0,078 0,31 1,25 ... 0,31 1,56 0,15 0.0-T9 0,31 0,015 | 6 Tablica¦ 1 (ciag dalszy) Badany mikroorganizm Mycobacterium phlei No. 56 Mycobacterium phlei Seki- guchi Mycobacterium 607 Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa 1 IAM 1007 Pseudomonas aeruginosa Takasaki Pseudomonas aeruginosa Masakuro Salmonella paratyphi A . Salmonella paratyphi B Salmonella paratyphi C Sarcina lutea PCI 1001 Saccharomyces cerevisiae IAM 4626 Shigella flexneri EW 10 2a Streptococcus faecalis ATCC 8043 Staphylococcus aureus 209P (odporny na streptomy¬ cyne) Staphylococcus aureus 209P (odporny na erytromycy¬ na) Escherichia coli K-12 CS-2 Escherichia coli K-12 CS-2 (odporny na antybiotyki) 1 Minimalne stezenie w mikro- gramach na 1 ml powodujace calkowite zahamowanie 0,62 0,31 0,78 7,8 0,1 1 0,78 0,39 0,62 0,62 1,25 0,31 500 0,039 15,6 2,5 0,31 0,31 1,56 | Na rysunku fig. 1 przedstawia wykres absorpcji roztworu wodnego 2,-amino-2'-dezoksykanamycyny o stezeniu 1 mg/ml w zaleznosci od dlugosci fal swiatla pozafioletowego, fig. 2 — krzywa absorp¬ cji roztworu 2'-amino-2'-dezoksykanamycyny w nujolu w zaleznosci od dlugosci fal swiatla pod¬ czerwonego, fig. 3 — wykres absorpcji roztworu wodnego antybiotyku NK-1001 o stezeniu 1 mg/ml w zaleznosci od dlugosci fali swiatla pozafioleto¬ wego, fig. 4 — krzywa absorpcji roztworu anty¬ biotyku NK-1001 w nujolu w zaleznosci od dlu¬ gosci fali swiatla podczerwonego, fig. 5; — wykres absorpcji roztworu wodnego antybiotyku NK-1003 o stezeniu 1 mg/ml w zaleznosci od dlugosci fali swiatla pozafioletowego i fig. 6 — krzywa absorp¬ cji roztworu antybiotyku NK-1003 w nujolu w za¬ leznosci od dlugosci fali swiatla podczerwonego.Na fig. 1 i 2 uwidoczniono, ze 2'-amino-2'-dezo- ksykanamycyna nie wykazuje absorpcji w swie¬ tle pozafioletowym przy dlugosci fali 220-340 mi- limikronów, ale wykazuje charakterystyczne pasma absorpcyjne przy nastepujacych dlugosciach fali w cm-1: 3600, 3000, 1650, 1600, 1570, 1140, 1110, 1095, 1090, 1060, 1035, 960, 900, 895, 880, 845, 815, 790, 780, 765 i 725.Kultura zwyklego szczepu 0-4-1 Streptomyces kanamyceticus, stosowana wedlug zasadniczego80 342 Sposobu wedlug wynalazku, zostala zlozona w A.T.C.C. Washington, D.C. Stany Zjedn. Ameryki pod numerem 21252. Szczep 0-4-1 Streptomyces kanamyceticus stosowany w procesie prowadzo¬ nym sposobem wedlug wynalazku ma nastepuja¬ ca charakterystyke morfologiczna. Grzybnia pod¬ stawowa ma szerokosc okolo 1 mikrona i jest rozgaleziona, zas grzybnia powietrzna rozwinieta z grzybni zasuszonej tworzy rozgalezienia, które jednak nie sa stosunkowo drobne i zazwyczaj nie tworzy skretów ani okólek. Zarodniki tworza sie na koncach powietrznej grzybni i zwykle maja ksztalt owalny lub walcowaty, a ich szerokosc wy¬ nosi 1,0—1,5 mikrona. Powierzchnia zarodników jest gladka. W tablicy 2 podano warunki rozwoju szczepu Streptomyces kanamyceticus 0-4-1 w róz¬ nych pozywkach, w temperaturze 28°C, po uply¬ wie 14 dni hodowli.Tablica 2 Pozywka Sacharoza Czapka, agar Gliceryna Czapka, agar Glikoza, aspa- ragina, agar (Krainski) Glikoza, aspa- ragina, agar (Uszynski) Jablczan wap¬ nia, agar Obserwacje Porost Grzybnia po¬ wietrzna Pigment roz¬ puszczalny Porost Grzybnia po¬ wietrzna Pigment rozr puszczalny Strona odwrotna Porost Grzybnia po¬ wietrzna Pigment roz¬ puszczalny Porost Grzybnia po¬ wietrzna Pigment roz¬ puszczalny Porost Grzybnia po¬ wietrzna Pigment roz¬ puszczalny Strona odwrotna S. kanamycetius 0-4-1 Dobry, zabar¬ wienie slabozól- te Brak Zabarwienie zólte | Dobry, zabar¬ wienie zóltawo- szare Brak Brak Slabe zabarwie¬ nie szarawozól- te 1 Silne zabarwie¬ nie jasnozólte Slabe zabarwie¬ nie zólte Brak Silne zabarwie¬ nie zólte Brak Brak Bialy do bardzo slabo zóltego — Brak Zabarwienie zól¬ tawe ^Barwa biala 20 25 30 35 45 50 55 €0 65 Tablica 2 (ciag dalszy) Pozywka Gliceryna, jablczan wap¬ nia, agar Bulion, agar Glikoza, bulion, agar Skrobia, siar¬ czan amonu, agar Plat ziem¬ niaka Plat marchwi Surowica krwi Loeffler'a Obserwacje Porost Grzybnia po¬ wietrzna Pigment roz¬ puszczalny Porost Grzybnia po¬ wietrzna Pigment roz¬ puszczalny Porost Grzybnia po¬ wietrzna Pigment roz¬ puszczalny Porost Grzybnia po¬ wietrzna Pigment roz¬ puszczalny Strona odwrotna Porost Grzybnia po¬ wietrzna Pigment roz¬ puszczalny Porost Grzybnia po¬ wietrzna Pigment roz¬ puszczalny Porost Grzybnia po¬ wietrzna Pigment roz¬ puszczalny Porost w temperaturze 37°C S. kanamycetius 1 0-4-1 Dobry, zabar¬ wienie zólte Brak Brak Bezbarwny do szarozóltego Brak Brak Drobno pomar¬ szczony, bialy do zóltawego Brak Brak Zóltawy do zól¬ tego Brak Brak Zóltawa Powierzchnia pomarszczona, ziarnista, barwa zóltawa do bra¬ zowej Nikle zabarwie¬ nie biale Brak Pomarszczony, slabszy niz na ziemniaku, ziar¬ nisty Nikle zabarwie¬ nie biale Brak Barwa szara do kremowej Brak Brak Podobny do pro¬ szku w tempe¬ raturze 28°C801342 9 TVabli ca 2 (ciag dalszy) Pozywka Jajo Mlekd ooV i tluszczorie Obserwacje Porost Grzybnia po- i wietrzna Pigment roz¬ puszczalny Porost Grzybnia po- 1 -wietrzna | Pigment roz¬ puszczalny | S. kanamycetius 0-4-1 | Pomarszczony, barwa zólta Brak Brak Pierscieniowy W tablicy 3 podano fizjologiczne dzialanie szcze¬ pu 0-4-1 Streptomyces kanamyceticus, zaobserwo¬ wane przy hodowli w temperaturze 28°C po uply¬ wie 14 dni.Tablica 3 Dzialanie fizjologiczne Redukcja azotanu Hydroliza skrobi Wytwarzanie siarkowo¬ doru Wytwarzanie tyrozynazy Uplynnianie zelatyny (w ciagu 14 dni w tempe- 1 raturze 15°C) Rozpuszczanie surowicy krwi Loeffler'a (w temperaturze 28°C i 37°C) w ciagu 14 dni Mleko odtluszczone 1 1 S. kanamyceticus 0-4-1 Tak Tak Nie Nie Tak Nie zaobserwowano Nie powoduje koa¬ gulacji, powolna peptonizacja | W tablicy 4 podano zdolnosc wykorzystywania róznych zródel wegla przez szczep S. kanamyce¬ ticus 0-4-1.Tablica 4 .. Zródlo wegla Sacharoza Ksyloza 1 Laktoza , Octan sodowy Cytrynian sodowy Bursztynian sodowy Sorbit | Dulcyt Stopien 1 wykorzystania + + -!- + + ± + + + + + + + 1 + + + | Wspomniane wyzej nowe antybiotyki NK-1001 i NK-1003, które moga byc stosowane zgodnie z wynalazkiem jako dodatki przy, wytwarzaniu 2'<-amino-2'-dezoksykanamycyny, wytwarza sie ho- 10 dujac szczep Streptojaypes kanamyceticus w sso- dowisku zawierajacym specjalny dodatek. ; Antybiotyk NK-1001 zwalcza skutecznie bakterie Gram-dodatnie i Gram ujemne, na przyklad Bacil- lus subtillis, Lacto-bacillus fermenti i Shigella dy- senteriae. Jest to substancja zasadowa, rozpusz¬ czalna w wodzie, w wodnym roztworze metanolu lub etanolu, ale nierozpuszczalna w bezwodnym metanolu i etanolu, w octanie etylu, octanie bu¬ tylu i benzenie. Daje ona dodatnia reakcje z nin- hydryna, odczynnikami Elson-Morgena i Molischa, ale nie daje reakcji z odczynnikami Sakaguchi, Tollehsa, Fehlmga, Miliona i Benedicta. Zawie¬ ra ona wegiel, wodór, tlen r'azot, ale nie zawiera siarki, chlorowców i popiolu. Jej empiryczny wzór jest C18H85Nj012-H20. Substancja ta tworzy bez¬ barwne krysztaly iglaste, rozkladajace sie w tem¬ peraturze 238—242°C, jej l°/o roztwór wodny ma skrecalnosc wlasciwa [a]D21°c=l32°, nie absorbuje swiatla pozafioletowego o dlugosci fal 220-340 mi- limikronów, jak to uwidoczniono na fig. 3, nato¬ miast wykazuje charakterystyczne pasma absorp¬ cyjne w swietle podczerwonym, jak to uwidocz¬ niono na fig. 4. Na skutek hydrolizy antybiotyku 25 NK-1001 przez ogrzewanie go w roztworze w 6n kwasu solnego w temperaturze 100°C w ciagu 40 minut, traci on wlasciwosci antybakteryjne.Otrzymany po hydrolizie roztwór naklada sie w postaci plam na arkusz 40 cm X 2 cm bibuly 30 filtracyjnej i rozwija ku dolowi za pomoca mie¬ szaniny butanolu z pirydyna, kwasem octowym i woda (6:4:1:3). Otrzymany chromatogram wy¬ kazuje powstanie 3 plam, mianowicie jednej pla¬ my dajacej dodatnia reakcje z ninhydryna i amo- 35 niakalnym roztworem azotanu srebra, drugiej da¬ jacej dodatnia reakcje tylko z ninhydryna i trze¬ ciej, która daje dodatnia reakcje z amoniakalnym roztworem azotanu srebra. W porównaniu ze zna¬ nymi próbkami okazuje sie, ze te trzy plamy od- 40 powiadaja dezoksystreptaminie, 6-amino-6-dezoksy- -a-glikozie i d-glikozie. W zwiazku z tym oraz biorac pod uwage oznaczony ciezar czasteczkowy antybiotyku NK-1001, stwierdza sie, ze antybiotyk ten sklada sie z jednej czasteczki dezoksystrep- 45 tarniny, jednej czasteczki 6-amino-6-dezoksy-d-gli- kozy i jednej czasteczki d-glikozy. Antybiotyk ten jest zasadniczo nietoksyczny i jego LD50 przy do¬ zylnym podawaniu myszom wynosi 3050 mg/kg.Antybiotyk NK-1001 wytwarza sie hodujac szczep 0-4-1 Streptomyces kanamyceticus w warunkach aerobowych, w srodowisku zawierajacym pozywke weglowodanowa i azotowa, jak równiez pewna ilosc streptydyny. Po nagromadzeniu sie antybio¬ tyku w hodowli wyosabnia sie go. Proces fermen- 55 tacji w celu wytworzenia antybiotyku NK-1001 prowadzi sie podobnie do procesu opisanego wy¬ zej w odniesieniu do wytwarzania 2'-amino-2'- -dezoksykanamycyny, przy czym mozna stosowac równiez podobne zródla wegla i azotu. Tak na 60 przyklad mozna stosowac hodowle wstrzasowa i hodowle zbiornikowa. Temperatura hodowli wy¬ nosi 25—35°C, korzystnie okolo 28°C. Ilosc strep¬ tydyny dodawana do srodowiska nie ma decydu¬ jacego znaczenia i wynosi korzystnie 0,05—1,0%, 65 zwlaszcza 0,1—0,5°/o w stosunku wagowym do ilo-80342 11 12 sci srodowiska.. Streptydyne mozna dodawac przy rozpoczeciu hodowli lub podczas procesu. Wyosab- nianie i oczyszczanie antybiotyku NK-1001 prowa¬ dzi sie podobnie, jak wyosabnianie 2'-amino-2'- -dezoksykanamycyny. 5 Antybiotyk NK-1003 ma równiez wlasciwosci antybakteryjne w odniesieniu do bakterii Gram- '-dodatnich, Gram-ujemnych i bakterii odpornych na dzialanie kwasów, na przyklad Bacillus subtil- lis, Lectobacillus fermenti, Shigella dysenteriae itp. io Jest to. substancja zasadowa, rozpuszczalna w wo¬ dzie i w wodnym roztworze metanolu lub etanolu, ale nierozpuszczalna w bezwodnym metanolu, bez¬ wodnym etanolu, octanie etylu, octanie butylu i benzenie. Daje ona dodatnia reakcje z ninhy- 15 dryna* odczynnikami Elson-Margana i Molischa, ale nie daje reakcji z odczynnikami Sahaguchi, Tollensa, Fehlinga, Miliona i Benedicta. Zawiera ona wegiel, wodór, tlen i azot, a nie zawiera siar¬ ki, chlorowców i popiolu. Jej empiryczny wzór 20 jest: G12H25N,07. Stanowi ona bezbarwne igly kry¬ staliczne, rozkladajace sie w temperaturze 202— 205°C. Wodny roztwór 1% tego antybiotyku wy¬ kazuje skrecalnosc wlasciwa [a]D21°c= +95°. W swietle pozafioletowym o dlugosci fali 220—340 mi- 25 limikronów nie wykazuje absorpcji, jak to uwi¬ doczniono na fig. 5, natomiast wykazuje charak¬ terystyczne pasma absorpcyjne w podczerwieni, jak to uwidacznia fig. 6.Poddajac antybiotyk NK-1003 hydrolizie przez 30 ogrzewanie w roztworze w 6n kwasie solnym w temperaturze 100°C w ciagu 40 minut pozbawia sie go wlasciwosci antybakteryjnych. Roztwór otrzymany w wyniku hydrolizy nanosi sie w po¬ staci plamy na arkusz bibuly filtracyjnej 40 cm 35 X 2 cm i nastepnie" rozwija mieszanine butanolu, pirydyny, kwasu octowego i wody (6:4:1:3).Otrzymany chromatogram wykazuje 2 plamy, przy czym obie daja dodatnia reakcje z ninhydryna, a jedna z nich daje takze dodatnia reakcje z amo- 40 hiakalriym roztworem azotanu srebra. Porównujac ze znanymi próbkami stwierdza sie, ze te dwie jflahiy odpowiadaja dezoksystreptaminie i 6-d-gli- kozaminie. Biorac to pod uwage, jak równiez uwzgledniajac okreslony ciezar czasteczkowy, 45 stwierdza sie, ze antybiotyk NK-1003 jest zwiaz¬ kiem zlozonym z jednej czasteczki dezoksystrep- taminy i jednej czasteczki 6-d-glikozaminy. Anty¬ biotyk ten jest zasadniczo nietoksyczny i jego LD^ przy podawaniu myszom dozylnie wynosi 50 1550 mg/kg.Antybiotyk NK-1003 wytwarza sie hodujac szczep Streptomyces kanamyceticus w srodowisku zawie¬ rajacym -weglowodany i pozywke azotowa oraz pewna ilosc antyBIotyku NKtIOUI. Hodowle pro- K wadzi sie w warunkach aerobowych i po nagro¬ madzeniu sie antybiotyku w hodowli wyosabnia sie go. Proces fermentacji prowadzi sie w sposób podobny do opisanego w odniesieniu do wytwa¬ rzania 2'-amino-2'-dezoksykanamycyny, przy 60 czym mozna stosowac tez podobne zródla wegla i azotu. Korzystnie jest stosowac hodowle aero- bowa wglebna* przy czym temperatura wynosi 25^30°C, korzystnie okolo 28°C. Ilosc dodawane¬ go antybiotyku NK-1001 nie ma decydujacego zna- 65 czenia i wynosi 0,05—1,0%, korzystnie 0,1—0,5°/o w stosunku wagowym do ilosci srodowiska. Anty¬ biotyk NK-1001 mozna dodawac na poczatku pro¬ cesu lub w czasie jego trwania. Wytworzony anty¬ biotyk NK-1003 wyosabnia sie i oczyszcza w spo¬ sób podobny do opisanego w odniesieniu do 2'-amino-2'-dezoksykanamycyny.Wlasciwosci antybiotyków NK-1001 i NK-1003 podano w tablicy5 Tabl Badany mikroorganizm Aerobacter aerogenes IAM 1102 Alcaligenes faecalis Bacillus agri ^ Bacillus subtilis ATCC 6633 Candida albicana Diplococcus pneumo- niae Type 31 ID Escherichia coli IAM 1253 Klebsiella pneumoniae 607 Lactobacillus fermenti ATCC 9338 Staphylococcus albus PCI 1200A Staphylococcus aureus 209P Staphylococcus aureus Terashina Mycobacterium phlei KS Mycobacterium 607 Salmonella peratyphi A Sarcina lutea PCI 1001 Saccharomyces cerevi- siae IAM 4626 Shigella flexneri EW 10 2a Streptococcus haamoly- ticus D-90 ica 5 Najnizsze 'zabójcze | stezenie i w mikrogramach/litr NK-1001 31,2 • — 7,8 6,25 powyzej 500 500 125 31,2 3,9 15,6 62,5 6,25 15,6 62,5 62,5 500' powyzej 500 6,25 500 | NK-1003 15,6 3,9 2,0 3,125 powyzej 500 250 125 31,2 3,9 7,8 62,5 3,125 25 50 62,5 250 powyzej 500 3,125 500 1 Przyklad I. 15 litrów cieklego srodowiska hodowlanego zawierajacego 3,0% skrobi, 2,0% malr tozy, 2,5% maczki sojowej, 1,2% azotanu sodowego i 0,5% chlorku sodowego zaszczepia sie typowym szczepem 0-4-1 Streptomyces kanamyceticus ATCC 21252 i poddaje hodowli w temperaturze 28°C, napowietrzajac i mieszajac. Po uplywie 22 godzin do srodowiska dodaje sie 50 g 3-aminoglikozy i kontynuuje proces. Po uplywie 150 godzin za¬ wartosc 2'-amino-2'-dezoksykanamycyny osiaga maksimum. Wówczas ciekla kulture przesacza sie i do przesaczu dodaje 4 litry Amberlitu IRC-50 (typ amonowy). Zaadsorbowane antybiotyki eluuje80 342 18 14 sie z zywicy za pomoca 0,5n roztworu wodnego amoniaku i czynne frakcje zbiera sie i zageszcza na syrop. Syrop ten rozpuszcza sie w 500 ml wódy i odbarwia roztwór dodajac 6 g wegla aktywo¬ wanego. Po odsaczeniu wegla przesacz eluuje sie 5 chromatograficznie za pomoca Dowex 1X2 (typ wodorotlenowy). Frakcje zawierajace 2'-amino-2'- -dezoksykanamycyne eluuje sie najpierw, przed oddzieleniem kanamycyny A. Frakcje o duzym stezeniu 2'-amino-2'-dezoksykanamycyny steza sie io i wymraza do sucha, otrzymujac 2,2 g surowej 2'-amino-2'-dezoksykanamycyny w postaci prosz¬ ku. Proszek ten rozpuszcza sie w 50 ml wody i roztwór traktuje preparatem Amberlite CG-50 (typ amonowy). Zywice eluuje sie 'chromatogra- 15 ficznie 0,ln—0,5n wodnego roztworu amoniaku, przy czym najpierw eluuje sie mala ilosc kana¬ mycyny A, która znajduje sie w tym roztworze.Nastepnie eluuje sie oddzielnie 2'-amino-2'-dezo- ksykanamycyne w jednej frakcji, która wymraza 2q sie na suchy proszek. Po przekrystalizowaniu tego proszku otrzymuje sie 1,1 g 2'-amino-2'-dezoksy- kanamycyny w postaci bezbarwnych krysztalków w ksztalcie igiel. Analiza elementarna produktu wykazuje, ze zawiera on 42,62% C, 7,52% H i 12,30% N. Ciezar czasteczkowy produktu wynosi 435.Przyklad II. 15 litrów cieklego srodowiska opisanego w przykladzie I zaszczepia sie tym sa¬ mym szczepem Streptomyces kanamyceticus i pod- 30 daje hodowli w temperaturze 28°C, napowietrza¬ jac i mieszajac. Po uplywie 22 godzin dodaje sie 50 g 6-aminoglikozy i kontynuuje hodowle. Naj¬ wyzsze stezenie 2'-amino-2'-dezoksykanamycyny uzyskuje sie po uplywie 145 godzin. Postepujac dalej w sposób opisany w przykladzie I otrzymuje sie 1,0 g krystalicznej 2'-amino-2'-dezoksykanamy- cyny.Przyklad III. 15 litrów pozywki zawieraja¬ cej 3,0% skrobi, 2,5% maczki sojowej, 1,2% azo- 40 tanu sodowego i 0,35% chlorku sodowego zaszcze¬ pia sie tym samym szczepem jaki stosuje sie w przykladzie I i poddaje hodowli przy napowie¬ trzaniu i mieszaniu w temperaturze 28°C. Po uply¬ wie 20 godzin dodaje sie 30 g antybiotyku NK-1001 45 i kontynuuje proces. Najwyzsze stezenie 2'-amino- -2'-dezoksykanamycyny osiaga sie po uplywie 140 godzin. Postepujac dalej w sposób opisany w przykladzie I otrzymuje sie 2:5 g krystalicz¬ nej 2'Hamdino-H2'Hdezokisyiklainamycyny. 50 iPirzylklajd IV. 15 Mtrów ctieklej pozywM o skladizie poktenylm w przylklatóe III zaszczepia sie tyim samytm szpaepem Sitreptomyices kaniamyieeiti- cus, jaki uzyto w przykladzie I i poddaje hodowli w temperaturze 28°C, napowietrzajac i mieszajac. w Po uplywie 20 godzin dodaje sie 30 g antybiotyku NK-1003 i prowadzi proces dalej, otrzymujac naj¬ wyzsze stezenie 2*-amino--2'-dezoksykanamycyny po uplywie 140 godzin. Postepujac dalej w sposób podany w przykladzie I otrzymuje sie 1,5 g kry- *° stalicznej 2'-amino—2'-dezoksykanamycyny.Przyklad V. 15 litrów cieklej pozywki o skladzie podanym w przykladzie III zaszczepia sie tym samym szczepem, jaki stosuje sie w przykla¬ dzie i poddaje hodowli w temperaturze 28°C na- 65 powietrzajac i mieszajac. Po uplywie 20 godzin dodaje sie 45 g neaminy i proces prowadzi dalej, uzyskujac najwyzsze stezenie 2'-aminb-2'-dezoksy- kanamycyny po uplywie 140 godzin. Postepujac dalej w sposób opisany w przykladzie I, otrzy¬ muje sie 1,2 g krystalicznej 2'-amino-2'-dezoksy- kanamycyny, Przyklad VI. 15 litrów cieklej pozywki, za¬ wierajacej 3,0% skrobi, 2,5% maczki sojowej, 1,2% azotanu sodowego i 0,35% chlorku sodowego, sterylizuje sie, chlodzi i miesza z wysterylizowa- nym i ochlodzonym roztworem 30 g antybiotyku NK-1001 w wodzie. Otrzymana mieszanine za¬ szczepia sie tym samym szczepem Streptomyces kanamyceticus, jaki stosuje sie w przykladzie I i nastepnie poddaje procesowi hodowli w tempe¬ raturze 28°C, napowietrzajac i mieszajac. Najwyz¬ sze stezenie 2'-amino-2'jdezoksykanamycyny osiaga sie po uplywie 140 godzin. Postepujac dalej w sposób opisany w przykladzie I, otrzymuje sie 2,2 g krystalicznej 2'-amino-2'-dezoksykanamycyny.Przyklad VII. Prowadzi sie hodowle Strep¬ tomyces kanamyceticus w obecnosci antybiotyku NK-1001, w sposób opisany w przykladzie III.Otrzymana ciecz odsacza sie i do przesaczu o obje¬ tosci 14 litrów dodaje sie wodorotlenku sodowego az do uzyskania pH=10. Przesacz ten ekstrahuje sie nastepnie 1/4 objetosci n-butanolu, zawieraja¬ cego 2 g aldehydu benzoesowego na 1 g rozpu¬ szczalnych w wodzie antybiotyków, zawartych w przesaczu. Wyciag butanolowy miesza sie z 1/10 objetosci wody i do otrzymanej mieszaniny doda¬ je sie tyle kwasu siarkowego, aby uzyskac pH=2f0.Po wymieszaniu zasadowe antybiotyki przechodza do fazy wodnej. Faze te odbarwia sie weglem aktywowanym i chromatografuje za pomoca Do- wex 1X2 (typ OH) i za pomoca AmberUtu CG-50 (typ amonowy), jak opisano w przykladzie I. Otrzy¬ many surowy produkt w postaci proszku prze- krystalizowuje sie z wody, i dwumetyloformami- du, otrzymujac 1,1 g 2'-amino-2'-dezoksykanamy- cyny w postaci bezbarwnych igiel.Przyklad VIII — próba porównawcza. Prze¬ prowadza sie szereg prób w celu wykazania, jak nieoczekiwany, a korzystny wplyw na proces wy¬ twarzania 2/-amino-2'-dezoksykanamycyny wywie¬ ra zgodnie z wynalazkiem dodawanie aminoglikoz i ich zwiazków dezoksystreptaminowych, w porów¬ naniu z przebiegem procesu bez tych. dodatków.W próbach tych szczep 0-4-1 Streptomyces ka¬ namyceticus hoduje sie w temperaturze 28°C w ciagu 150 godzin, w sposób podany w przykla¬ dzie I, stosujac podobne urzadzenie fermentacyj¬ ne i pozywki o tym \amym skladzie. Po uplywie róznych okresów czasu od rozpoczecia hodowli, do srodowiska dodaje sie rózne ilosci róznych amino¬ glikoz i ich zwiazków streptaminowych, jak to uwidoczniono w tablicy 6. Po uplywie 150 godzin brzeczki traktuje sie w sposób opisany w prze¬ kladzie I, w celu uzyskania mozliwie najwiekszych ilosci 2'-amino-2'-dezoksykanamycyny i kanamy¬ cyny A. Ilosci te oraz inne dane dotyczace prób podano w tablicy 6.:. 80 342 15 16 Tablica 6 Numer próby 1 2 3 4 5 " 6 " 7 Dodatek Bez dodatku 3-aminoglikoza 6-aminoglikoza Antybiotyk NK-1001 Antybiotyk NK-1001 Antybiotyk NK-1003 Neamina Ilosc dodatku w gra¬ mach 50 50 30 30 30 45 Czas do¬ dawania mierzony od chwili rozpo- czecia- procesu w go¬ dzinach 22 22 20 0 20 20 Zawar¬ tosc 2'-amino- -2'-dezo- ksykana- mycyny w mikro- gramach na 1 ml 26 240 225 575 480 345 260 Wydaj¬ nosc 2'-amino- -2'-dezo- ksykana¬ mycyny w gra¬ mach 0,12 1,10 1,00 2,50 2,20 1,50 1,20 Zawar¬ tosc kanamy¬ cyny A w mikro- gramach na 1 ml 2790 1480 1730 1240 1450 1700 1390 Wydaj¬ nosc kanamy- cyny A w gra¬ mach 26,8 12,7 15,2 11,2 13,6 16,0 12,8 Wyniki te dowodza, ze dodawanie aminoglikoz lub ich zwiazków z dezoksystreptamina sposobem wedlug wynalazku zwieksza wyraznie wydajnosc procesu Wytwarzania 2'-amino-2'-dezoksykanamy- cyny.W przykladach IX i X opisano sposób wytwa¬ rzania antybiotyków NK-1001 i NK-1003, stoso¬ wanych w procesie wedlug wynalazku jako do¬ datek do srodowiska hodowlanego.Przyklad IX. 15 litrów cieklego srodowiska zawierajacego 2,0% skrobi, 3,0% maltozy, 3,Ou/o maczki sojowej, 1,0% azotanu sodowego i 0,5% chlorku sodowego zaszczepia sie typowym szcze¬ pem 0-4-1 Streptomyces kanamyceticus i poddaje sie hodowli w temperaturze 28°C, napowietrzajac i mieszajac. Po uplywie 80 godzin dodaje sie 30 g streptydyny i prowadzi dalej proces w ciagu na¬ stepnych 80 godzin, uzyskujac najwyzsze stezenie antybiotyku NK-1001 pod koniec tego okresu. Cie¬ kla brzeczke odsacza sie, otrzymujac 14 litrów przesaczu, który traktuje sie 4 litrami Amberlitu IRO50 (typ amonowy) w celu zaadsorbowania antybiotyków. Zywice te eluuje sie nastepnie 0,5n wodnego roztworu amoniaku i aktywne frakcje eluatu laczy sie i steza, a nastepnie rozpuszcza w 100 ml wody i miesza z 1 g wegla aktywowa¬ nego w ciagu 30 minut. Po przesaczeniu odbar¬ wiony przesacz traktuje sie 2 litrami Amberlitu CG-50 (typu amonowego) i zywice te eluuje 0,3n roztworem wodnym amoniaku. Pojedyncza frak¬ cje antybiotyku NK-1001 oddziela sie przed wy¬ dzieleniem kanamycyny A, steza i wymraza do sucha, otrzymujac 28,5 g antybiotyku NK-1001 w postaci bialego proszku. Proszek ten rozpuszcza sie w 12 ml wody i traktuje stopniowo 50 ml me¬ tanolu, powodujac wydzielanie sie krysztalów. Po odsaczeniu i wysuszeniu otrzymuje sie 17,4 g anty¬ biotyku NK-1001 w postaci bialych igiel. Analiza elementarna tego produktu wykazuje: 44,27% C, 7,09% H i 8,95% N, bez siarki, chlorowców i po¬ piolu. Ciezar czasteczkowy tego zwiazku, oznaczo¬ ny metoda preznosci pary wynosi 492.Przyklad X. 15 litrów cieklej pozywki, za¬ wierajacej 2,0% skrobi, 3,0% maltozy, 3,0% macz¬ ki sojowej, 1,0% azotanu sodowego i 0,5% chlorku sodowego zaszczepia sie typowym szczepem 0-4-1 5 Streptomyces kanamyceticus i prowadzi hodowle w temperaturze 28°C, napowietrzajac i mieszajac.Po uplywie 20 godzin dodaje sie 25 g antybiotyku NK-1001, otrzymanego w sposób opisany w przy¬ kladzie IX i proces prowadzi dalej, napowietrza¬ jac i mieszajac. Najwieksze stezenie antybiotyku NK-1003 osiaga sie po uplywie 6 dni. Brzeczke przesacza sie wówczas, otrzymujac 14 litrów prze¬ saczu, który traktuje sie 4 litrami Amberlitu IRC (typ amonowy), w celu zaadsorbowania antybioty¬ ków. Nastepnie eluuje sie zywice 0,5n roztworem wodnym amoniaku, laczy aktywne frakcje eluatu i steza, a nastepnie rozpuszcza w 100 ml wody i miesza z 1 g wegla aktywowanego. Po odsa¬ czeniu od wegla, odbarwiony roztwór traktuje sie 2 litrami Amberlitu CG-50 (typ amonowy) i za- adsorbowane na tej zywicy, po przemyciu woda, eluuje sie 0,3n roztworem wodnym amoniaku, od¬ dzielajac najpierw frakcje kanamycyny A i na¬ stepnie pojedyncza frakcje antybiotyku NK-1003.Frakcje te steza sie i wymraza do sucha, otrzy¬ mujac 11,3 g surowego antybiotyku NK-1003 w po¬ staci proszku. Po przekrystalizowaniu tego proszku z mieszaniny wody z metanolem i wysuszeniu otrzymuje sie 7,5 g antybiotyku NK-1003 w po¬ staci bialych igiel. Analiza elementarna tego pro¬ duktu wykazuje, ze zawiera on 44,42% C, 7,81% H i 13,11% N, a jego ciezar czasteczkowy, oznaczony metoda preznosci pary, wynosi 305 (1 czasteczka metanolu pozostaje po krystalizacji zwiazana z produktem). PL PL