Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia antybiotyku znanego pod nazwa kanamycyny B, to jest 2'-amino-2'-dezoksykanamycyny na dro¬ dze hodowli mikroorganizmu Streptomyces kana- myceticus w warunkach aerobowych, w srodowis¬ ku zawierajacym pozywke weglowodanowa i azo¬ towa.Kanamycyna B jest antybiotykiem, skutecznie hamujacym rozwój bakterii Gram-dodatnich, Gram- -ujemnych i odpornych na dzialanie kwasów, np. bakterii takich, jak Staphylococcus, Pseudomonas, Salmonella, Shigella i Mycobacterium, jak równiez chorobotwórczych bakterii, odpornych na dzialanie innych antybiotyków i syntetycznych srodków lecz¬ niczych, a równoczesnie antybiotyk ten ma bardzo mala toksycznosc w stosunku do organów sluchu.Sumaryczny wzór kanamycyny B jest C18Hg7N5010- •H20, a budowe tego zwiazku przedstawia wzór po¬ dany ma rysunku.Z brytyjskich opisów patentowych nr nr 817385 i 925790 wiadomo, ze jezeli mikroorganizm Strep¬ tomyces kanamyceticus hoduje sie w warunkach aerobowych, wówczas razem z kanamycyna A wy¬ twarza sie niekiedy i kanamycyna B oraz kanamy¬ cyna C, ale w ilosciach tak niewielkich, ze sposoby podaine w tych opisach nie nadaja sie do wytwa¬ rzania i wyosabniania kanamycyny B na skale tech¬ niczna.Z polskiego opisu patentowego nr 80342 znany jest sposób wytwarzania kanamycyny B z lepsza wydajnoscia. Sposób ten polega na tym, ze mikro¬ organizm Streptomyces kanamyceticus ATCC21252 poddaje sie hodowli w srodowisku, zawierajacym oprócz pozywki weglowodanowej i azotowej doda¬ tek zwiazków z grupy aminoglikoz lub ich zwiaz¬ ków glikozydowyioh z dezoksyrtreptamina.Wynalazek umozliwia wytwarzanie kanamycyny B z wysoka wydajnoscia na drodze aerobowej ho¬ dowli Streptomyces kanamyceticus przy uzyciu zna¬ nej pozywki weglowodanowej i azotowej, bez wspomnianych wyzej dodatków, jak równiez wy- osabnianie czystego antybiotyku na skale technicz¬ na. Cecha sposobu wedlug wynalazku jest to, ze hodowli poddaje sie nowe mutanty Streptomyces kanamyceticus ATCC 21252, mianowicie mutanty, zdeponowane pod numerami ATCC 21260, ATCC 21259, ATCC21261 i ATCC21268. Wspólna cecha tych mutantów, odrózniajaca je od macierzystego szczepu ATCC 21252 jest to, ze nie maja one wcale lub prawie wcale zdolnosci wykorzystywania ksy- lozy, podczas gdy szczep macierzysty zdolnosc te wykazuje w wiekszym stopniu.Hodowle prowadzi sie w sposób znany, stosowa¬ ny przy hodowaniu actinomycetes, przy uzyciu srodowiska, zawierajacego pozywke odpowiednia dla tych mikroorganizmów. Jako zródlo wegla sto¬ suje sie np. skrobie, sacharoze, maltoze, glikoze, gliceryne itp, a jako zródlo azotu make sojowa, roz¬ puszczalne bialko roslinne, wyciag namokowy z ku¬ kurydzy, pepton, wyciag miesny, azotany lub sole 87 27987 279 3 amonowe. Srodowisko to moze tez zawierac inne sole nieorganiczne, np. chlorek sodowy, siarczan magnezowy i inne substancje, korzystne dla rozwo¬ ju Streptomyces kanamyceticus. Mozna tez stoso¬ wac srodowiska stale, ale przy prowadzeniu pro¬ cesu na duza skale korzystniej jest prowadzic pro¬ ces w srodowisku cieklym, w warunkach aerobo- wych, metode wglebna, ewentualnie metoda wstrza¬ sania lub mieszania. Temperatura hodowli wynosi zwykle 25—35°C, korzystnie okolo 28°C, zas steze¬ nie kanamycyny B osiaga maksimum po uplywie 3—7 dini od rozpoczecia hodowli.Nagromadzona w srodowisku hodowlanym kana- mycyne B wyosabnia sie znanymi sposobami, sto¬ sujac zywiczne wymieniacze jonowe, ekstrakcje organicznymi rozpuszczalnikami lub stracanie za pomoca substancji, stosowanych przy oczyszczaniu innych, rozpuszczalnych w wodzie antybiotyków za¬ sadowych. Na skale techniczna szczególnie korzy¬ stnie postepuje sie w ten sposób, ze z brzeczki po- hodowlanej, ewentualnie po jej przesaczeniu, ad- sorbuje sie kanamycyne B razem z kanamycyna A za pomoca zywicznego wymieniacza kationowego, np. Ambertlitu IRC-50, bedacego zywicznym wy¬ mieniaczem kationowym, zawierajacym glównie kopolimer kwasu metoksylowego z dwuwinyloben- zenem, po czym wymieniacz eluuje sie wodnym roztworem amoniaku, zbiera frakcje aktywne i traktuje je zywicznym wymieniaczem anionowym, np. Dowex 1X2, bedacym silnie zasadowym wy¬ mieniaczem anionowym, skladajacym sie glównie z kopolimeru styrenu z dwuwinylobenzenem i za¬ wierajacym czwartorzedowe grupy amoniowe. Zy¬ wice te eluuje sie chromatograficznie wodnym roz¬ tworem amoniaku, zbiera oddzielnie frakcje, zawie¬ rajace kanamycyne B i frakcje zawierajace kana¬ mycyne A, odparowuje ze stanu zamrozenia frakcje, zawierajace kanamycyne B i produkt w postaci proszku rozpuszcza w wodzie, chromatografuje roz¬ twór na kolumnie z zywicznego wymieniacza ka¬ tionowego, eluujac wodnym roztworem amoniaku.Poczatkowe frakcje zawierajace niewielkie domiesz¬ ki kanamycyny A odrzuca sie, a z pozostalych wy¬ osabnia kanamycyne B.Korzystnie jest równiez postepowac w ten spo¬ sób, ze brzeczke pohodowlana przesacza sie, prze¬ sacz alkalizuje wodotlenkiem metalu alkalicznego do wartosci pH 10, ekstrahuje n-butanolem, za¬ wierajacym aldehyd benzoesowy, wyciag miesza z woda, zakwasza kwasem siarkowym do wartosci pH 2 i miesza, po czym oddziela faze wodna i chro¬ matograf uje na kolumnie z zywicznego wymienia¬ cza anionowego. Kolumne eluuje sie wodnym roz¬ tworem amoniaku, zbiera oddzielnie frakcje, zawie¬ rajace kanamycyne B i frakcje, zawierajace kana¬ mycyne A. Frakcje, zawierajace kanamycyne B, od¬ parowuje sie ze stanu zamrozenia i otrzymany produkt w postaci proszku rozpuszcza w wodzie, chromatografuje roztwór na kolumnie z zywicznego wymieniacza kationowego, eluujac kolumne wodnym roztworem amoniaku, przy czym poczatkowe frakcje, zawierajace nikle domieszki kanamycyny A, odrzu¬ ca sie, a z pozostalych wyosabnia czysta kanamy¬ cyne B.Otrzymana kanamycyna B, to jest 2'-amino-2'- 4 -dezoksykanamycyna, stanowi bezbarwne kryszta¬ ly iglaste o temperaturze topnienia 183—186°C, o odczynie zasadowym, rozpuszczalna w wodzie, w rozcienczonym woda metanolu, etanolu, acetonie, ale nierozpuszczalna w bezwodnym metanolu, eta¬ nolu, octanie etylu, octanie butylu, eterze etylowym, chloroformie i benzenie. Daje ona dodatnia reakcje z ninhydryna, a takze z odczynnikami Elson^Mor- gana i Molischa, ale nie daje reakcji z odczynnika¬ mi Sakaguchi, Tollensa, Fahlinga, Miliona i Bene- dicta. Wodny roztwór tego antybiotyku o stezeniu 1% wykazuje skrecanie wlasciwe [a] q1C , wyno¬ szace + 118°. Pochodna N^acetylowa, otrzymana przez acetylowanie 2'-amino-2'-dezoksykanamycy- ny bezwodnikiem octowym w metanolu ma wzór sumaryczny C18H32N5Oio-5(CHgCO)-H20, topnieje w temperaturze 290—300°C z objawami rozkladu i wy¬ kazuje skrecanie wlasciwe [a]^0 , wynoszace + 118°.Bakteriobójcze wlasciwosci 2'-amino-2'-dezoksy- kanamycyny sa dosc stale w podwyzszonej tempe¬ raturze i gdy roztwór tego antybiotyku w 6n kwa¬ sie solnym ogrzewa sie w temperaturze 100°C w ciagu 40 minut, to wykazuje on nastepnie 60—80% pierwotnej aktywnosci wzgledem Bacillus subtiles.Roztwór ten nanosi sie w postaci plamy na arkusz papieru filtracyjnego firmy Toyo *nr 50 i nastepnie rozwija rozpuszczalnikiem, stanowiacym mieszani¬ ne butanolu, kwasu octowego i wody (4:2:1). To ba¬ danie chromatograficzne wykazuje, ze sa dwie pla¬ my, dajace dodatnia reakcje na ninhydryne i jed¬ na z tych plam daje równiez dodatnia reakcje na azotan srebra w amoniaku. 2'-amino-2'-dezoiksykanamycyna wykazuje silne dzialanie bakteriobójcze w odniesieniu do bakterii Gram-dodatnich, Gram-ujemnych i odpornych na kwasy, a takze w odniesieniu do szczepów odpor¬ nych na dzialanie kanamycyny A, innych znanych antybiotyków i srodków leczniczych. Toksycznosc 2'-amino-2'-deizotosykanamycyny jest bardzo mala, gdyz LD50 w odniesieniu do myszy przy podawaniu dozylnym wynosi tylko 190 mg/kg.Wlasciwosci bakteriobójcze 2'-amino-2'-dezoksy- kanamycyny w stosunku do róznych organizmów sa podane w tablicy 1.Tablica 1 Badany mikroorganizm 1 Aerobacter aerogenes IAM 1102 Alcaligenes faecalis Bacillus agri Bacillus subtilis ATCC 6633 Bacillus subtilis PCI 219 Diplococcus pneumoniae Type 31ID Escherichia coli IAM 1253 .Minimalne stezenie w mikrogra- . mach na 1 ml | powodujace calkowite za¬ hamowanie 2 0,15 0,031 0,078 0,039 0,078 0,31 .1,25 40 45 50 655 c.d. tablicy 1 1 1 Klebsiella pneumoniae 607 Lactobacillus arabinosus ATCC8014 Lactobacillus fermenti ATCC9338 Staphylococcus albus PCI 1200A Staphylococcus aureus 209P Staphylococcous aureus Terashima Mycoibacterium phlei. No. 56 Mycobacterium phlei Sekiguchi Mycobacterium 607 Proteus vulgaris Pseudomonas aeruginosa IAM 1007 Pseudomonas aeruginosa Takasaki Pseudomonas aeruginosa Masakuro Salmonella paratyphi A Salmonella paratyphi B Salmonella paratyphi C Sarcina lutea PCI 1001 Saccharomyces cerevisiae IAM 4626 Shigella flexneri EW 10 2a Streptococcus faecalis ATCC8043 Staphylococcus aureus 209P (odporny na streptomycyne) Staphylococcus aureus 209P (odporny ma erytromycyne) Escherichia coli K-12 CS-2 Escherichia coli K-12 CS-2 | (odporny na antybiotyki) | 2 0,31 1,56 0,15 0,039 0,31 0,015 0,62 0,31 0,78 7,8 0,1 1" 0,78 0,39 0,62 0,62 1,25 0,31 500 0,039 ,6 2,5 0,31 0,31 1,56 | Na rysunku fig. 1 przedstawia wykres absorpcji roztworu wodnego 2'-amino-2'-dezoksykanamycyny o stezeniu 1 mg/ml w zaleznosci od dlugosci fali swiatla pozafioletowego, a fig. 2 — krzywa ab¬ sorpcji roztworu 2'-amino-2-dezoksyikanamycyny w nujolu w zaleznosci od dlugosci fali swiatla pod¬ czerwonego.Na fig. 1 i 2 uwidoczniano, ze 2'-amino-2'-dezo- ksykanamycyna nie wykazuje absorpcji w swietle pozafioletowym przy dlugosci fali 220—340 milimi- kronów, ale wykazuje charakterystyczne pasma ab¬ sorpcyjne przy nastepujacych dlugosciach fali w cm"1: 3600, 3000, 1650, 1600, 1570, 1140, 1110, 1095, 1090, 1060, 1035, 960, 900, 895, 880, 845, 815, 790, 780, 765 i 725.Jak wyzej wspomniano nowe mutanty ATCC 21260, ATCC 21259, ATCC21261 i ATCC 21268 Strep- tomyces kanamyceticus cechuje niewielka zdolnosc wykorzystywania ksylozy lub nawet brak tej zdol¬ nosci, podczas gdy znany szczep ATCC 21252 ma te zdolnosc w wysokim stopoiu.Cecha mutanta ATCC 21260 jest poza tym to, ze nie rozwija sie na plytce sacharozy i agaru Czape'k'a, nie zawierajacej dezoiksystreptaminy, podczas gdy szczep ATCC21252 rozwija sie w tych warunkach.Mutant ATCC21259 cechuje to, ze na plytce agaru r 279 6 Czapek'a, zawierajacej 3-aminoblikoze, tworzy zna¬ cznie wieksze kolonie niz szczep macierzysty. Mu¬ tanty ATCC 21261 i ATCC 21268 cechuje to, ze nie wykorzystuja one wcale dulcyitu lub wykorzystuja go w niewielkim tylko stopniu, podczas gdy szczep macierzysty wykorzystuje te pozywke bardzo sil¬ nie.Mutanty, stosowanie w procesie, prowadzonym sposobem wedlug wynalazku, wytwarza sie droga io mutacji i odsiewania, jak to szczególowo opisano ponizej.Mutant ATCC21260 wytwarza sie ze znanego szczepu ATCC 21252 Streptomyces kanamyceticus przez zaszczepianie go na powierzchni plytki sacha- rozo-agarowej Czaipek'a i hodowanie w temperatu¬ rze 28°C w ciagu 7 dni. Za pomoca preciku platy¬ nowego z petla przenosi sie nastepnie czesc otrzy¬ manej hodowli do 10 ml cieklego srodowiska, za¬ wierajacego 1% wyciagu zbozowego i 0,25% su- cnych drozdzy o pH=7,0 w probówce o pojemnosci 70 ml. Nastepnie prowadzi sie hodowle wstrzasana w (temperaturze 28°C -w ciagu 24 godzin, stosujac urzadzenie wstrzasajace o 350 ruchach/minute i o wychyleniu 2 cm. Otrzymana grzybnie oddziela sie przez odwirowanie w ciagu 10 minut pod ob¬ ciazeniem 2000 g i odrzuca odciek. Grzybnie plucze sie dwukrotnie jednakowa iloscia 0,9% roztworu fizjologicznego soli i miesza z 5 ml 0,9% roztworu fizjologicznego, do którego dodaje sie 4 ml roztworu zawierajacego 1/4 mola Na2HP04.Do otrzymanej mieszaniny dodaje sie 1 ml roz¬ tworu, zawierajacego 500 mikrogramów iperytu w 1 ml i pozostawia na okres 10 minut. Nastepnie 1 ml powstalej mieszaniny wlewa sie do 9 ml zobojetnia- jaeego roztworu 0,2% ;glikolu i 0,17% NaHCOa i pozostawia w temperaturze pokojowej na przeciag okolo 1 godziny, po czym odwirowuje sie grzybnie, przemywa i przenosi do .probówki o pojemnosci 70 ml, zawierajacej 10 ml wyciagu zbozowego. Nastep- 40 nie prowadzi sie hodowle w temperaturze 28°C w ciagu 24 godzin w sposób wyzej opisany, po czym przemywa sie hodowle dwukrotnie, rozciencza i zaszczepia na plytce sacharozo-agarowej Czapek'a, zawierajacej dodatek 100 mikrograniów dezoksy- 45 streptaminy na 1 ml. Hodowle prowadzi sie w tem¬ peraturze 28°C, w ciagu 10 dni, otrzymujac kolo¬ nie.Pewne ilosci grzybni pobiera sie z kazdej kolonii i umieszcza w probówce o pojemnosci 70 ml, zawie- 50 rajacej 10 ml wyciagu zbozowego, prowadzac na¬ stepnie hodowle wstrzasana w temperaturze 28°C w ciagu 24 godzin, jak wyzej opisano. Otrzymana hodowle przemywa sie dwukrotnie, rozciencza i za¬ szczepia na plytce sacharozo-agarowej Czapek'a 55 oraz na takiej samej plytce, zawierajacej dodatko¬ wo 100 mikrogramów dezoksystreptaminy w 1 ml.Hodowle prowadzi sie w temperaturze 28°C w cia¬ gu 7 dni, otrzymujac kolonie. Szczep, który nie rozwija sie na pierwszej z wymienionych plytek, 60 lecz rozwija sie tylko na drugiej z tych plytek, wy- osabnia sie i okresla go mianem mutanta A-4-6 Streptomyces kanamyceticus. Mutant ten, przeja¬ wiajacy zapotrzebowanie na dezoksystreptarnine, wy¬ stepuje tylko jeden na okolo 100 utworzonych ko- 65 lcmii-87 279 ¦1 / Mutant ATCC 21259 wytwarza sie w ten sposób, ze szczep Streptomyces kanamyceticus ATCC21252 zaszczepia sie na sacharozoagarze Czapek'a i hodu¬ je go w temperaturze 28°C w ciagu 7 dni, po czym precikiem platynowym z petla pobiera sie próbke hodowli i przenosi do probówki o pojemnosci 70 ml, zawierajacej 10 ml cieklego srodowiska, zawieraja¬ cego 1% wyciag zbozowy i 0,25% suchych drozdzy i majacego pH=7,0. Hodowle w probówce prowa¬ dzi sie, wstrzasajac, w temperaturze 28°C w ciagu 24 godzin, stosujac wyzej opisane urzadzenie do wstrzasania. Otrzymana kulture przemywa sie dwu¬ krotnie roztworem fizjologicznym soli i traktuje roztworem, zawierajacym 50 mikrogramów iperytu w 1 ml. Grzybnie tak potraktowanego szczepu zaszczepia sie w srodowisku Czapek'a, zawieraja¬ cym 3% 3-aniinoglikozy zamiast 3% sacharozy i prowadzi hodowle wstrzasana w temperaturze 28°C w ciagu 24 godzin, w sposób wyzej opisany.Z otrzymanej hodowli odwirowuje sie grzybnie i zaszczepia ja na wyciagu zbozowym, w celu po¬ lepszenia jej wzrostu, a nastepnie prowadzi hodow¬ le w temperaturze 28°C w ciagu 24 godzin, jak po¬ dano wyzej. Nastepnie przemywa sie kulture i otrzymana -zawiesinie homogenizuje, rozciencza i zaszczepia na plytce Czapek'a z 3-aminoglikoza i agarem i hoduje w temperaturze 28°C w ciagu 14 dni w celu otrzymania kolonia. Powstaja kolonie male, sredniej wielkosci i duze. Oddziela sie grzyb¬ nie tylko z duzych kolonii, zaszczepia w wyciagu zbozowym i prowadzi hodowle wstrzasana w cia¬ gu 24 godzin w temperaturze 28°C w sposób wy¬ zej opisany. Po przemyciu homogenizuje sie za¬ wiesine, rozciencza i zaszczepia na plytce agarowej Czapek'a z 3-aminoglikoza i poddaje hodowli w temperaturze 28°C w ciagu 14 dni, w celu ponow¬ nego uzyskania kolonii. W ten sposób otrzymuje sie szczep, dajacy tylko duze kolonie.Mutanty ATCC 21261 i ATCC 21268 otrzymuje sie w ten sposób, ze kulture macierzystego szczepu Streptomyces kanamyceticus ATCC 21252 zaszcze¬ pia sie na plytce, zawierajacej skrobie i agar Czapek'a i hoduje w temperaturze 28°C w ciagu 7 dni. Z otrzymanej kultury pobiera sie pewna ilosc precikiem platynowym z petla i umieszcza w 1 ml sterylizowanej wody, uciera i przenosi na plytke ze skrobia i agarem Czapek'a, a nastepnie poddaje ho¬ dowli w temperaturze 28°C w ciagu 10 dni. Hodow- 8 le te umieszcza sie pod lampa pozafioletowa o mo¬ cy 19 W i naswietla w ciagu 10 minut z odleglosci om. Grzybnie z powierzchni agarowej zdrapuje sie i miesza z 10 ml sterylizowanej wody, homoge¬ nizuje i umieszcza na agarze. Czapek'a zawieraja¬ cym 0,1% skrobi i 3% dulcytu i hoduje w tempe¬ raturze 28°C w ciagu 7 dni. Nastepnie oddziela sie grzybnie tylko z kolonii o malych wymiarach, które nieznacznie tylko wzrastaja na agarze. Grzybnie te zaszczepia sie na agarze Czapek'a i hoduje w tem¬ peraturze 28°C w ciagu 7 dni.Wszystkie te kolonie wzrastaja dobrze. Z kazdej kolonii pobiera sie grzybnie za pomoca precika platynowego z petla i zaszczepia na pozywce, za¬ wierajacej 1% dulcytu, 0,264% siarczanu amonowego, 0,565% K2HP04, 0,238% KH2P04, 0,1% MgS04 7H20, 0,00064% CuS045H20, 0,00079% MnCl34H20, 0,00011% FeCl37H20, 0,00015% ZnS047H20 i 1;5% agaru, ma¬ jacej pH 7,0. Hodowle prowadzi sie w temperaturze 28°C w ciagu 14 dni, przy czym znaczna czesc szczepów wykazuje normalny wzrost, a tylko dwa szczepy wykazuja wzrost nieznaczny. Te dwa mu¬ tanty, które moga rozwijac sie na pozywce ze skro- bii i agaru Czapek'a, ale nie rozwijaja sie na po¬ zywce z dulcytu, substancji mineralnych i agaru, maja, jak stwierdzono, wieksza zdolnosc wytwarza¬ nia 2'-amino-2'dezoksykanamycyny z wyzsza wy¬ dajnoscia. Te wlasnie szczepy okresla sie mianem ATCC 21261 i ATCC 21268 Streptomyces kanamy¬ ceticus.Nowe mutanty Streptomyces kanamyceticus, sto¬ sowane zgodnie z wynalazkiem, maja nastepujace wlasciwosci. Sa one morfologicznie podobne do sie¬ bie o tyle, ze ich grzybnie powietrzne tworza roz¬ galezienia, ale niezbyt drobne i zazwyczaj nie tworza spirali i skretów, zarodniki powstaja przy koncach powietrznych grzybni i maja zwykle ksztalt owalny lub walcowaty, przewaznie o szero¬ kosci 1,0—1,5 mikrona, a powierzchnia zarodników jest gladka. Szczepy te jednak róznia sie warunka¬ mi wzrostu na pozywkach, wlasciwosciami fizjolo¬ gicznymi i zdolnoscia do wykorzystywania zródel wegla, jak to przedstawiono w tablicach 2, 3 i 4.W tablicy 4 podano róznice pomiedzy wlasciwoscia¬ mi znanego szczepu Streptomyces kanamyceticus ATCC 21252 i wyprowadzonymi zen mutantami.Róznice te odnosza sie do warunków wzrostu, dzia¬ lania fizjologicznego i wykorzystywania zródel wegla.Tablica 2 Warunki wzrostu mutantów Streptomyces kanamyceticus na róznych pozywkach w temperaturze 28°C po- uplywie 14 dni 40 Pozywka 1 Sacharoza, agar Czapek'a Obserwacje 2 Wzrost Grzybnia powietrzna Pigment roz¬ puszczalny Strona odwrotna ATCC 21260 3 Wzrost równo¬ mierny, barwa bladozólta Brak Bladozólty Zabarwiona bladoszaro- zólto ATCC 21259 4 Wzrost równo¬ mierny, barwa ciemnozólta Brak Bladozólty Zabarwiona szarozólto ATCC 21261 Wzrost równo¬ mierny, barwa ciemnozólta Brak Zólty — ATCC 21268 6 Wzrost równo¬ mierny, barwa ciemnozólta Brak Bladozólty •87 279 9 , 10 c.d. tablicy 2 1 1 Gliceryna, agar Glikoza, asparagina, agar (Krainsky) Glikoza, aspa- .ragina, agar (Uscbinski) Jablczan wapnia, agar Gliceryna, jablczan wap¬ nia agar Bulion agar 2 Wzrost Grzybnia powietrzna Pigment roz¬ puszczalny Strona od¬ wrotna Wzrost Grzybnia powietrzna Pigment roz¬ puszczalny Strona od¬ wrotna Wzrost Grzybnia powietrzna Pigment roz¬ puszczalny Strona od¬ wrotna Wzrost Grzybnia powietrzna Pigment roz¬ puszczalny Strona od¬ wrotna Wzrost Grzybnia powietrzna Pigment roz¬ puszczalny Strona od¬ wrotna Wzrost Grzybnia powietrzna Pigment roz¬ puszczalny 1 3 Wzrost bardzo slaby bezbarwny Brak Brak Zabarwienie zóltawe do gle- bokozóltego Brak Brak Zóltawoszara Zabarwienie glebokozólte Brak Brak Zólta do blado- zóltej Zabarwienie bladozólte do zóltego Brak Slabe zabarwie¬ nie zólte Zabarwienie zóltawobrazowe Brak Zólty Bladozólta Bezbarwny do szarozóltego Brak Brak 4 Wzrost równo¬ mierny zabar¬ wienie zóltawo- szare Brak Brak Zabarwienie bladoszare Zabarwienie glebokozólte do brazowego Brak Brak Jasnobrazowa Zabarwienie glebokozólte do zóltego Brak Brak Zólta do blado- zóltej Biale do blado¬ zóltego Brak Brak Brala Brazowe do zóltawobrazo- wego Brak .Zólty , Brazowa Bezbarwny do szarozóltego Brak Brak Wzrost równo¬ mierny zabar¬ wienie zóltawo- szare Brak Brak Zabarwiona lekko szarozólto Zabarwienie jasne gleboko¬ zólte Slabe zabarwie¬ nie zólte Brak Zabarwienie glebokozólte Brak Brak Biale do bardzo bladozóltego Brak Brak Biala Dobry wzrost za¬ barwienie zólte Brak Zólty Bezbarwny do szarozóltego Brak Brak 6 Wzrost równo¬ mierny zabar¬ wienie lekko brazowe Zabarwiona jasno oliwkowo- szaro Zabarwienie blade zóltawo¬ brazowe Zabarwienie zóltawobrazowe Zabarwienie zólte Brak Brak Ciemne zabar¬ wienie zólte Brak Brak Biale do bardzo bladozóltego Brak Brak Dobry wzrost za¬ barwienie zólte Brak Bladozólty Bezbarwny do szarozóltego Brak Brak87 279 11 12 c.d. tablicy 2 1 1 Glikoza pozywka ^~ agarowa Skrobia-siar- czam amonu Wycinek ziemniaka Wycinek marchwi Surowica krwi Lofflera Jajo 2 1 Wzrost Grzybnia powietrzna Pigment roz¬ puszczalny Wzrost Grzybnia powietrzna Pigment roz¬ puszczalny Strona od¬ wrotna Wzrost Grzybnia powietrzna Pigment roz¬ puszczalny Wzrost Grzybnia powietrzna Pigment roz¬ puszczalny Wzrost w temperaturze 37°C Wzrost Grzybnia powietrzna Pigment Wzrost w temperaturze 37°C Wzrost Grzybnia powietrzna Pigment roz¬ puszczalny 3 1 Silne zmarszczki bialy do blado- zóltego Brak Brak Zólty do zólta- wobrazowego Brak Brak Dobry rozwój barwa ochry Barwa biala Brak Zmarszczki, rozwój slabszy niz na ziemnia¬ ku, powierzch¬ nia ziarnista Brak Brak Brak Barwa szara do smietankowej Brak Brak Podobny do wzrostu w temp. 28°C Zmarszczki, barwa zólta Brak 4 I Silne zmarszczki bialy do blado- zóltego Brak Brak Zótly do zólta- wobrazowego Brak Brak Silne zmarszczki, powierzchnia ziarnista, barwa bladozólta do brazowej Lekkie zabar¬ wienie biale Brak Zmarszczki, rozwój slabszy niz na ziemnia¬ ku, powierzch¬ nia ziarnista Brak Brak Brak Barwa szara do smietankowej Brak Brak Jak w temp. 28°C Zmarszczki, barwa zólta Brak 1 6 A Silne zmarszczki bialy do blado- zóltego Brak Brak Bladozólty do zóltego Brak • i Brak Bladozólta Silne zmarszczki, powierzchnia ziarnista, barwa bladozólta do brazowej Lekkie zabar¬ wienie biale Brak Zmarszczki, rozwój slabszy niz na ziemnia¬ ku, powierzch¬ nia ziarnista Slabe zabar¬ wienie biale Brak i Barwa szara do smietankowej Brak Brak Jak w temp. 28°C Zmarszczki, barwa zólta Brak Brak Silne zmarszczki l bialy do blado- 1 zóltego [ Brak l Brak Bladozólty do [ zóltego [ Brak . [ Brak Bladozólta f Silne zmarszczki, powierzchnia ziarnista, barwa bladozólta do [ brazowej f Brak Brak Wzrost slaby [ Brak Brak Barwa szara do smietankowej Brak Brak Zmarszczki, barwa zólta Brak Brak87 279 13 14 Tablica 3 Dzialanie fizjologiczne mutanjów Streptomyces kanamyceticus po hodowli w ciagu 14 dni w temperatu¬ rze 28°C Dzialania fizjologiczne Redukcja azotanu 1 Hydroliza skrobi \ Wytwarzanie H2S 1 Wytwarzanie tyrozynazy 1 Uplynnianie zelatyny w temp. j 150°C w ciagu 14 dni I Rozpuszczanie surowicy krwi i Lofflera w temp. 28°C i 37°C i w ciagu 14 dni ;k Dzialanie na srodowisko I z odtluszczonego mleka ATCC 21260 tak tak nie nie uplynnia silnie Nie zaobserwo¬ wano Brak koagulacji szybka peptoni- zacja ATCC 21259 tak tak nie nie uplynnia Nie zaobserwo¬ wano Brak koagulacji szybka peptoni- zacja ATCC21261 tak tak nie nie uplynnia Nie zaobserwo¬ wano Brak koagulacji powolna pepto- nizacja ATCC 21268 tak tak nie nie uplynnia Nie zaobserwo¬ wano Brak koagulacji powolna pepto- nizacja Tablica 4 Zestawienie róznic pomiedzy znanym szczepem ATCC 21252 i mutantami Streptomyces kanamyceticus Obserwuje | Wzrost na: 1 glikozie i plytce agaru Czapek'a dezoksystreptamiinie 1 i plytce agaru Czapek'a 1 3-amdnoglikozie i plytce 1 agaru Czapek'a 1 dulcycie i plyitce ] aganu Czapek'a 1 wycinku ziemniaka J Uplynnienie zelatyny w J mleku odtluszczonym J Wykorzystanie zródel . wegla j Sacharoza Ksyloza Octan sodowy Cytrynian sodowy . Bursztyinian sodowy j Dulcyt ATCC 21252 + ++ ± -U + + + zmarszczki, powierzchnia ziarnista, barwa lekko- brazowa + Powolna -pep- tonizacja + + + + -T ++ + -r-1- + + -h"h ATCC 21260 + + — + + + dobry wzrost, barwa ochry + + Szybka pep- tonizacja + — — j_ ± •f-!- ATCC 21259 + + ± + + + + + zmarszczki, powierzchnia ziarnista, barwa blado- zóltobrazowa + Szybka pep- tonizacja + + — ± + + + + + + + ATCC 21261 + ± ± ± zmarszczki, powierzchnia ziarnista, barwa blado- zóltobrazowa + Powolna pep- tonizacja + ± + + + + + ± ATCC 21268 + ± zmarszczki, powierzchnia ziarnista, barwa blado- zóltobrazowa + Powolna pep- tonizacja + + + + + ±87 279 16 ¦Przyklad-1. 15 litrów cieklej pozywki, zawie¬ rajacej 3,0% malftozy, 2,0% skrobi, 3,0% maczki so¬ jowej, 1,0% azotanu sodowego i 0,5% chlorku so¬ dowego zaszczepia sie mutantem ATCC21260 Strep¬ tomyces kanamyceticus i poddaje hodowli w tem¬ peraturze 28°C, napowietrzajac i 'mieszajac. Naj¬ wieksze stezenie 2'-amino-2'-dezoksykananiycyny osiaga sie po uplywie 6 dni. Wówczas brzeczke przesacza sie i otrzymany przesacz o objetosci 14 litrów traktuje 4 litrami Amberlritu IRC-50 (typ amonowy), po czym. zywice eluuje sie 0,5 n roz¬ tworem wodnym amoniaku. Aktywne frakcje ste¬ za sie na syrop, który rozpuszcza sie w 500 ml wo¬ dy, odbarwia dodajac 6g aktywowanego wegla, przesacza i chromatografuje, eluujac za pomoca 600 ml Dowex 1X2 (typ OH). Przed oddzieleniem kana- mycyiny A eluuje sie 2'-amino-2'-dezoksykanamy- cyne. Frakcje, zawierajace takie stezenie tego zwia¬ zku, steza sie i wymraza do sucha, otrzymujac 3,2 g surowego produktu w postaci proszku. Proszek ten rozpuszcza sie w 50 ml wody i traktuje zywica Amberlite CG-50 (typ amonowy) w celu zaadsor- bowania antybiotyków. Nastepnie zywice \poddaje sie ponownie eluowaniu za pomoca 0,1 n — 0,5 n roztworu wodnego amoniaku. Zawarta równiez ma¬ la ilosc kainamycyny A eluuje sie najpierw, a na¬ stepnie dopiero eluuje sie w pojedynczej frakcji 2/,-aimino-2/Hdezoksyikanamycyne. Te pojedyncza frakcje steza sie i wymraza do sucha, otrzymujac surowa 2'-amino-2'-dezokBykanamycyne w postaci proszku. Po przefcrystalizowaniu z mieszaniny i idwumetyloformamidu otrzymuje sie 1,9 g 2'-ami- no-2'-dezoksykanamycyny w postaci bezbarwnych igiel.Przyklad II. 15 litrów pozywki w skladzie, •podanym w przykladzie I, zaszczepia sie mutantem ATCC 21259 Streptomyces kanamyceticus i hoduje w temperaturze 28°C, napowietrzajac i mieszajac.Najwyzsze stezenie 2'-amino-2'-dezoksykanamycyny uzyskuje sie po uplywie 6 dni. Brzeczke przerabia sie wówczas dalej w sposób, opisany w przykladzie I, Otrzymujac 1,2 g krystalicznej 2'-amino-2'-dezo- ksykanamycyny.Przyklad III. Ciekla pozywke w ilosci 15 lit¬ rów, o skladzie, podanym w przykladzie I, zaszcze¬ pia sie mutantem ATCC 21261 Streptomyces kana¬ myceticus i poddaje 4hodowili w temperaturze 28°C, napowietrzajac i mieszajac. Najwyzsze stezenie 2'-amino-2'-dezoksykanamycyny w srodowisku uzy¬ skuje sie po uplywie 7 dni. Postepujac dalej w spo¬ sób, opisany w przykladzie I, otrzymuje sie 2,2 g krystalicznej 2'-amino-2'^dezoksykanamycyny.Przyklad IV. Postepujac w sposób analogicz¬ ny do opisanego w przykladzie I, lecz stosujac mu¬ tant ATCC 21268 Streptomyces kanamyceticus, otrzymuje sie 3,15 g krystalicznej 2'-amino-2'-dezo- ksykanamycyny.Przyklad V. Przyklad ten jest przykladem po¬ równawczym i obejmuje szereg prób, majacych na celu wykazanie nieoczekiwanego, a korzystnego wplywu, jaki zgodnie z wynalazkiem daje stoso¬ wanie nowych mutantów, majacych zdolnosc wy¬ twarzania 2'-amino-2'-dezoksykanamycyny wieksza niz macierzysty szczep Streptomyces kanamyceticus ATCC 21252. Próby te przy uzyciu wymienionych 40 45 50 55 4 mutantów szczepu macierzystego prowadzi sie w temperaturze 28°C w ciagu 150 godzin, w sposób analogiczny do opisanego w przykladzie I, stosujac takie same urzadzenia i pozywki. Po zakonczeniu procesu bada sie zawartosc 2'-amiino-2'-dezoksyka- namycyny i kanamycyny A w brzeczkach. Wyniki prób podano w tablicy 5.Tablica 5 Nu¬ mer próby 1 2 3 4 Uzyty mikroorganizm * ATCC21252 ATCC21260 ATCC21259 ATCC21261 ATCC 21268 Zawartosc 2'-amino- -2'-dezok- sykanamy- cyny w mikrogra- mach na lml 26 430 285 520 700 Zawartosc kanamycy¬ ny A w mikrogra- • mach na lml 2790 1970 1785 1900 1690 Do 15 litrów otrzymanej brzeczki poddaje sie przeróbce, opisanej w przykladzie I, uzyskujac moz¬ liwie najwieksza ilosc 2'-amino-2'Hdezoksykanamy- cyny i kanamycyny A. Wyniki te podano w tabli¬ cy 6.Tablica 6 Nu¬ mer próby 1 2 3 4 Uzyty mikroorganizm ATCC21252 ATCC21260 ATCC21259 ATCC21261 ATCC21268 Zawartosc 2'-amino- -2'-dezok- sykanamy- cyny w gramach 0,12 1,90 1,20 2,20 3,15 Wydajnosc kanamycy¬ ny A w gramach 26,8 19,0 ,8 17,6 16,1 65 PL