PL80132B1 - - Google Patents

Description

Sposób wytwarzania antybiotyku W847-A i Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia antybiotyku oznaczonego W847-A.Z belgijskiego opisu patentowego nr 715 638 zna¬ ny jest kompleks antybiotyku, okreslony jako W847 /kompleks, oraz sposób jego otrzymywania w dro- 5 dze hodowli nowego gatunku drobnoustróju sp.W847 z rodzaju Micromonospora. W opisie podano cenne wlasciwosci tego rodzaju kompleksu antybio¬ tyków w postaci wolnej, ewentualnie w postaci jego czynnych pochodnych. Wspomniany wyzej belgijski 10 opis patentowy wyszczególnia rózne antybiotycznie czynne frakcje, które zostaly wyizolowane z kom¬ pleksu W847 i które oznaczono jako frakcja A, frakcja B, frakcja C^ i frakcja C2. Mieszaniny frak¬ cji C2 i C2 sa opisane jako W847-C kompleks. 15 Wedlug belgijskiego opisu patentowego nr 715 638 antybiotyk W847 kompleks otrzymuje sie w drodze pódpowierzchniowej hodowli drobnoustroju gatun¬ ku Micromonospora sp. W847 w plynnej wodnej pozywce w warunkach tlenowych. Drobnoustroje 20 te naleza do rodzaju Micromonospora z rzedu Acti- nomyoetales. Hodowle dwu szczepów tego rodzaju zostaly zdeponowane w kolekcji kultur United Sta¬ tes Department of AJgriculture, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois 25 i zarejestrowane pod nr NRRL 3274 oraz NRRL 3275. Szczepy znajdujace ,sie w kolekcji sa dostepne na zadanie zainteresowanych.Specjalisci sa w stanie ocenic jak pozadane jest posiadanie pojedynczej frakcji antybiotyku w prze- 30 ciwienstwie do kompleksu, poniewaz wówczas ist¬ nieje wieksza pewnosc powtarzalnosci jego mocy, dzialania terapeutycznego, stezenia, wchlaniania i innych. Podobnie jest pozadane miec do dyspo¬ zycji antybiotyk dostepny jako pojedynczy, czysty, krystaliczny zwiazek dla uzyskania jednolitego standardu iczystosci i dawkowania.Doswiadczenia wykazaly, ze antybiotyk W847-A posiada szereg cech korzystnych w porównaniu do antybiotyku W847-Ci, mianowicie, lepsza tolerancje, niniejsza toksycznosc podostra, wieksza aktywnosc w stosunku do bakterii gram-ujemnych, oraz wyz¬ sze stezenie we krwi i nieco lepsza aktywnosc ochronna u myszy.Wedlug sposobu podanego w belgijskim opisie pa¬ tentowym nr 715 638 kiLka frakcji W847 kompleksu, w szczególnosci frakcje A, rozdziela sie i izoluje zmudna i dlugotrwala technika chromatograficzna.W kompleksie W847, otrzymanym w brzeczce fer¬ mentacyjnej, wedlug wspomnianego belgijskiego opisu patentowego, frakcja A (to jest antybiotyk W847-A) znajduje sie w stosunkowo malej ilosci, mniej niz 10 procent, natomiast glównym skladni¬ kiem jest antybiotyk W847-C. Z tego wzgledu sto¬ sujac nawet zmudna technike izolacji, otrzymuje sie tylko male ilosci antybiotyku W847-A.W zwiazku z powyzszym okazalo sie konieczne opracowanie prostszego sposobu, który pozwolilby jednoczesnie na uzyskanie lepszej wydajnosci anty-._ biotyku W847-A. 80 1323 Stwierdzono, ze kazdy z antybiotyków W847-B, W847-CT oraz W847-C2 zawiera co najmniej jedna grupe zdolna do hydrolitycznego odszczepiania, po usunieciu której otrzymuje sie antybiotyk W847-A.Antybiotyk W847-A wytwarza sie wedlug wyna¬ lazku z dobra wydajnoscia i w prosty sposób, prze¬ prowadzajac hydrolize substratu, zawierajacego co najmniej jeden z antybiotyków oznaczonych W847- B, W847-C! i/lub W847-C2, w celu przeksztalcenia ich w antybiotyk W847-A, a nastepnie izolujac an¬ tybiotyk W847-A lub frakcje wzbogacona w anty¬ biotyk W847-A w postaci: wolnej lub w postaci soli.Korzystniejsze jest stosowanie selektywnej hydro¬ lizy w warunkach niekwasowych, w szczególnosci jako kontrolowanej hydrolizy alkalicznej w srodo¬ wisku o wartosci pH = 9 — 12. Korzystne jest pro¬ wadzenie hydrolizy az do chwili, gdy nastapi za¬ sadniczo calkowite przeksztalcenie w antybiotyk W847-A. Zakonczenie hydrolizy okresla sie takimi sposobami jak, na przyklad chromatografia cienko¬ warstwowa, który opisano w dalszej czesci opisu.Szczególnie wygodne jest stosowanie sposobu we¬ dlug wynalazku do brzeczki fermentacyjnej, opisa¬ nej w belgijskim opisie patentowym nr 715 638, po¬ niewaz pomija sie izolowanie z brzeczki jakiejkol¬ wiek frakcji, a nawet kompleksu W847. Mozliwe jest równiez zastosowanie sposobu wedlug wynalaz¬ ku do wyizolowanego kompleksu W847, otrzymy¬ wanego zwykle w drodze ekstrakcji z brzeczki roz¬ puszczalnikiem nie mieszajacym sie z woda, a na¬ stepnie zageszczenia, lub do wyizolowanego nastep¬ nie kompleksu W847-C, ewentualnie do poszczegól¬ nych antybiotyków W847-B, ^847-C! oraz W847-C2, jak równiez do mieszaniny zawierajacej dwie lub wiecej frakcji kompleksu W847.Sposób wedlug wynalazku nie ogranicza sie do przeksztalcenia antybiotyków znajdujacych sie w kompleksie W847, mianowicie W847-B, W847-CJ oraz W847-C2, jezeli wytwarzane sa one jedynie przy wykorzystywaniu drobnoustrojów Micromono- spora sp. W847 var. NRRL 3274 lub NRRL 3275. Po pierwsze, mozna równiez wykorzystywac inne wa¬ rianty drobnoustroju Micromonospora sp. W847 lub ich 'mutanty otrzymywane przy zastosowaniu czyn¬ ników mutagennych, takich jak na przyklad na¬ swietlanie promieniami X i nadfioletowymi, stoso¬ wanie aktynofagów oraz iperytu azotowego. Po dru¬ gie, przy uzyciu innych drobnoustrojów otrzymuje sie jedna lub wiecej frakcji antybiotyku W847. Po trzecie frakcje antybiotyku W847 otrzymywane na drodze syntezy w sposób podobny, hydrolizuje sie do antybiotyku W847-A. A wiec, sposób wedlug wy¬ nalazku ma zastosowanie i jest skuteczny do prze¬ ksztalcania substancji antybiotycznych W847-B, W847-Ci i W847-C2 lub tez ich mieszanin do anty¬ biotyku W847-A, niezaleznie od tego, jak zostaly otrzymane substancje wyjsciowe.Wyjsciowa substancja dla sposobu wedlug wyna¬ lazku jest kazda, która zidentyfikowano jako jedna z wyzej wymienionych, ibez wzgledu na sposób jej wytwarzania. Antybiotyk W847 kompleks posiada spektrum przeciwbakteryjne podane w tabeli 1, przy czym wlasciwie nie nastepuje obnizenie jego mocy po uplywie 24 godzin i w temperaturze 37°C ) 132 od chwili dodania jednego z nastepujacych en,zv~ mów trypsyny, chymotrypsyny, pepsyny,; c^amM^ lubpenicylinazy. , . ¦ ¦i ' ; i I Antybiotyki W847-A, W847-B, W847-Ci i W847-Cr 5 sa identyfikowane na podstawie wlasnosci chemicz- oiych i fizycznych przytoczonych w tablicy 2, widnx w podczerwieni, przedstawionych na fig. 1, 2, 3 oraz: 4 odpowiednio, a podanych w belgijskim opisie pa¬ tentowym nr 715638; widim magnetycznego rezo- 10 nansu jadrowego (NMR) iprzedstawionych na fig. 5r 6, 7 oraz 8 odpowiednio, podanych równiez w bel¬ gijskim opisie patentowym nr 715 638, jak równiez na podstawie spektrum przeciwbakteryjnego poda¬ nego w tablicy 1. Widma w podczerwieni uzyskano- 15 w oleju mineralnym (nujolu), zas bardziej ¦ charak¬ terystyczne pasma absorpcji zestawiono w tablicy S stosujac nastepujaca okreslenia: S = silne, imocne, M =' umiarkowane, W = sla¬ be, VS = bardzo1 silne, M—S = umiarkowane do- 20 silnego, brd1 = szerokie, shp — ostre, shd = prze¬ giecie i s.b. = pasmo uboczne. Widmo magnetycz¬ nego rezonansu jadrowego otrzymano za poimoca spektrometru Varian A-60-A w roztworze (okolo 0,4 ml, okoloi 20 mg/ml) próbki z kazdej frakcji w deuterowanym chloroformie. Widma zapisywano w czesciach 1 na milion (ppm) z czterometylosilanu, wewnetrznego standardu. W tablicy 1 oznaczono wrazliwosc drobnoustrojów testowych na antybio¬ tyki przy pomocy próby probówkowej metoda roz- cienczen w wyciagu drozdzowoHmiesnym, doprowa¬ dzonym do wartosci pH = 8 wodorotlenkiem sodo¬ wym.Jak wynika z tablicy 1, antybiotyk W847-A wy- 35 ikazuje szeroki zakres aktywnosci przeciwbakteryj- nej zarówno wobec drobnoustrojów gram-dodat¬ nich, jak i gram-ujemnych. Grupa gram-dodatnich. drobnoustrojów chorobotwórczych obejmuje gatun¬ ki z rodzaju Streptococcus, Staphylococcus i Diplo- 40 coocus, o których wiadomo, ze powoduja szereg, objawów chorobowych. Rózne gatunki Staphyloco¬ ccus i Streptococcus sa drobnoustrojami, wywoluja¬ cymi zapalenie gruczolu sutkowego krów. Gatunki tych bakterii sa latwe do skontrolowania, a rozwój 45 ich mozna zahamowac przy uzyciu antybiotyku W847-A po stosunkowo krótkim okresie podawania.Antybiotyk W847-A jest równiez aktywny wobec: drobnoustrojów gram-ujemnych, w tym równiez, gatunków z rodzaju Escherichia, Salmonella, Pro- 50 teus i Pseudomonas. Drobnoustroje te sa odpowie¬ dzialne za powodowanie szeregu powaznych zespo¬ lów chorobowych takich, jak infekcje przewodu moczowego i biegunki. Tego rodzaju zespoly choro¬ bowe sa dosc powszechne zarówno u ludzi, jak: i u zwierzat domowych, na przyklad u bydla, koni, owiec, swin, psów, kotów i moga byc skutecznie- opanowane i leczone za pomoca antybiotyku W847- -A.Antybiotyk W847-A, zawieszony w 0,5 procento- 60 wym wodnym roztworze karboksymetylocelulozy^ a nastepnie zdyspergowany ultradzwiekami, po podskórnym podaniu myszom, jest aktywny wobecr S. aureus Gray, a jego PD50 (dawka ochronna cUa. 50 procent badanej ilosci zwierzat) wynosi 20 mgA 65 /kg, jak równiez wobec P. aeruginoss, a jego PD5tt?80 132 5 6 Tablica 1 Spektrum przeciwbakteryjne kompleksu antybiotyku W847 oraz poszczególnych frakcji A, B, Ci, C2 i kompleksu C Drobnoustrój 1 Bacillus megatherium DA I 7064 I Bacillus subtilis ATCC 6633 j Diplococcus pneumoniae DA 1 70° j Diplococcus pneumoniae AT J CC 10015 j Diplococcus pneumoniae DA 3 150 j Bnterocoocus sp. DA 800 1 Enterococcus sp. DA 801 3 Enterococcus isp. DA 802 i Sarcina lutea ATCC 9341 1 Staphylococcus aureus ATTC ] 12715 _ 1 Staphylococcus aureus ATCC 6538P i Staphylococcus aureus ATCC 11631 * Staphylococcus aureus (Gray) Staphylococcus aureus DA 2001 ] Staphylococcus aureus DA 2003 | Staphylococcus aureus DA 2010 Staphylococcus aureus DA 2014 1 Staphylococcus aureus DA i 2018 Staphylococcus aureus DA 2032 j Staphylococcus aureus DA 2033** 1 Streptococcus faecalis DA 20 } Streptococcus pyogenes DA 21 i Streptococcus pyogenes DA 11 I Streptococcus pyogenes DA 12 j Mycobacterium smegmatis ATCC 10143 Escherichia coli ATCC 10536 1 Klebsiella pneumoniae ATCC 10031 Proteus vulgaris DA 121 Pseudomonas aeruginosa ATCC 8689 ] Salmonella schottmuelleri DA 10 Najmniejsze stezenie hamujace (mcg/ml) antybiotyku W847 Kompleks zasada 0,3 0,03 — — 6,0 0,3 0,3 0,3 0,0075 0,3 0,3 0,3 0,3 0,03 0,03 0,3 0,3 0,3 0:075 16 0,3 0,75 0,3 — 0,75 6,0 12,0 6,0 6,0 6,0 Kompleks HC1 0,3 0,3 — — 6,0 0,75 0,75 1,0 0,0075 0,75 0,03 0,075 0,3 0,3 0,03 0,3 0,3 0,3 0,3 16 0,3 1,0 — — 0,3 16 16 16 12,0 12,0 Frakcja A ¦ 0,6 0,005 1,2 0,5 2,7 0,6 0,6 0,2 0,005 0,08 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 2,7 0,03 5,0 0,6 0,2 5,0 6,0 6,0 12,0 6,0 6,0 Frakcja B 1,2 0,05 1,2 0,5 2,7 0,6 0,6 0,2 0,005 0,2 0,2 0,6 0,6 0,2 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 2,7 0,1 5,0 0,2 0,2 5,0 12,0 24,0 24,0 12,0 12,0 Frakcja 0,3 0,03 — — 12,0 0,3 0,3 0,3 0,0075 0,3 0,03 0,3 0,3 0,03 0,075 0,3 0,03 0,075 0,075 32,0 0,3 0,3 0,3 — 0,3 12,0 12,0 24,0 6,0 12,0 Frakcja c2 0,6 0,005 0,6 0,05 2,7 0,08 0,6 0,03 0,0005 0,005 0,005 0,6 0,6 0,03 0,6 0,2 0,6 0,1 0,08 2,7 0,005 0,6 0,03 0,03 0,05 12,0 24,0 24,0 6,0 12,0 C-kompleks 0,3 0,005 2,7 0,3 0,3 0,3 0,00075 0,03 0,03 0,3 0,5 0,03 0,3 0,25 0,03 0,1 0,08 2,7 0,075 0,3 0,3 — 0,3 12,0 12,0 24,0 6,0 12,0 Podloze: wyciag drozdzowo-miesny (pH=8,0) Kompleks = mieszanina antybiotyków A, B, Ci i C2 * Szczep penicylino-oporny ** Szczep erytramycyno-oporny7 8 Tablica 2 Wlasnosci chemiczne i fizyczne frakcji antybiotyku W847 Skrecalnosc op¬ tyczna [a£5 (1% etanol) Temperatura topnienia Stala dysocjacji (PKa) Wspólczynnik zobojetnienia Analiza elementarna: Wegiel Wodór Azot Tlen (z róznicy) Wzór sumaryczny Ciezar czasteczko- | wy Frakcja A —90° 255—259 °C (z rozkl.) 9,1 442 Znaleziono Obliczono 60,23 60,25 9,28 9,19 3,30 3,19 27,19 27,36 C44H80N2O15 877,10 Frakcja B —92 01) 125—135 °C (z rozkl.1) 8,8 490 Znaleziono1) Obliczono*) 58,90 58,95 8,94 9,03 2,88 2,99 29,18 29,03 C46H82N2016 919,14 Frakcja Ci —104° 243—246 °C (z rozkl.) 8,8 488 Znaleziono Obliczono 60,23 59,98 8.93 8,81 2.94 2,92 27,90 28,30 C48H84N2017 961,17 Frakcja C2 —102° | 146—150°C (z rozkl.) | 8,6 | 492 1 Znaleziono 1 Obliczono 1 60,54 60,35 8,60 8,89 2,87 2,87 27,99 27,89 C49H86N2Ol7 | 975,20 [ *) jednowodzian Tablica 3 Widma w podczerwieni poszczególnych frakcji antybiotyku W847 | Frakcja A Dlugosc fali (n) 2,82—2,90 3,35—3,50 5,77 5,82 5,88 6,82 7,24 7,36 7,82 8,45 8,92 9,02 9,12 9,32 9,53 9,63 9,98 10,27 11,02 11,17 Charakter piku M-S, brd Nujol S N — M-S Nujol Nujol s.b.M-S, shp VS, brd VS vs VS M-S VS VS VS S M-S M-S Frakcja B Dlugosc fali 2,87 2,97 3,35—3,50 5,72 5,83 6,82 7,25 8,05 8,45 8,59 8,94 9,30 9,62 9,91 10,02 10,29 10,84 11,08 11,20 Charakter piku M shd.Nujol S S Nujol Nujol S S, brd S S S S M-S M-S M W-M W-M W-M [ Frakcja C± Dlugosc 1 fali 2,82 2,87 3,35—3,50 5,72 5,87 6,82 7,25 7,45 7,57 7,82 8,03 8,13 8,60 8,94 9,05 9,56 9,70 10,13 10,48 11,02 11,18 Charakter piku s, b W Nujol S 1 W-M Nujol Nujol M M M S VS S M-S S S S M-S M W-M W-M Frakcja C2 | Dlugosc fali 2,83 3,33-3,48 5,70 5,80 5,88 6,80 7,23 8,00 8,53 8,93 9,08 9,27 9,65 10,00 10,38 10,97 11,15 11,52 11,92 Charakter piku * W-M Nujol S N — shd.Nujol Nujol S S, brd.S shd.M-S f S 1 M-S, brd. [ M | M [ M L W [ W-M [ 1 N sygnal przyrzadu. = 161 mg/kg. LD50 dla myiszy, po podaniu podskór¬ nym wynosi 7000 mg/kig.Antybiotyk W847-A stosuje sie równiez do oczysz¬ czania i wyjalawiania szkla laboratoryjnego, instru¬ mentów chirurgicznych i tym podobnych. Amtybio- 65 tyk ten w polaczeniu z mydlem i detergentami mo¬ ze miec zastosowanie jako srodek oczyszczajacjr i odkazajacy pomieszczenia uzywane do przygoto¬ wywania pozywienia takie, jak kuchnie, jadalnie^ i tym podobne.80132 11 glukoza 1,0 g skrobia ziemniaczana 24,0 g Bacto — wyciag drozdzowy (Difco) 5,0 g weglan wapnia 2,0 g woda wodociagowa 1000,0 ml Inkubacje prowadzi sie na trzesawkach [280 ob¬ rotów na minute (=r.p.m.); 5 om skok] w ciagu 72 godzin w temperaturze 28°C.Do fermentora o pojemnosci 10 1 dodaje sie jalo¬ wa pozywke produkcyjna o ponizszym skladzie do¬ prowadzona przed sterylizacja do wartosci pH = = 7,15—7,25. tryptykoza 170,0 g chlorek sodowy 50,0 g fosforan dwupotasowy 25,0 g glukoza 25,0 g Czapek-Dox ibuljon ,350,0 g G.E.-60 srodek przeciwpienny zgodnie z po¬ trzeba (General Electric Company) woda wodociagowa do 10,0 litrów Zawartosc fermentora zaszczepia sie 500 ml 72 godzinnej hodowli posiewowej, przygotowanej jak opisano wyzej. Brzeczke fermentacyjna doprowadza sie do temperatury 31 °C i miesza przy 500 obrotach/ /minute wprowadzajac równoczesnie powietrze w ilosci 0,5 1 na minute na 1 1 pozywki. Po 24 godzi¬ nach zwieksza sie szybkosc mieszania do 600 obro¬ tów/minute, zas po 48 godzinach do 700 obrotów/ /minuteT Zakonczenie fermentacji nastepuje po uplywie 64 godzin. Pod koniec fermentacji moc wy¬ tworzonego antybiotyku osiaga wartosc szczytowa, która zasadniczo pozostaje stala. W czasie fermen¬ tacji wartosc pH mieszaniny fermentacyjnej pozo¬ staje zasadniczo w granicach 7,2—8,2. Objetosc zbi¬ tej masy komórkowej jest stala i wynosi 3,5—4,5 ml. Cala brzeczka daje srednice strefy 15-^25 mm w badaniach plytkowych wobec S. aureus lub P. aeruiginosa.Przyklad II. Izolowanie antybiotyku W847 kompleksu (metoda chromatograficzna). 60 1 (brzeczki, przygotowanej sposobem opisanym w przykladzie I, doprowadza sie do wartosci pH"'=" = 9,5 rozcienczonym wodnym wodorotlenkiem po¬ tasowym, po czym ekstrahuje octanem etylu w ilos¬ ci dwukrotnie wiekszej od objetosci ibrzeczki. Faze octanowa oddziela sie i zageszcza pod zmniejszo¬ nym cisnieniem do konsystencji oleistej (w przy¬ blizeniu 30,0 g). Tak zageszczona pozostalosc, po rozcienczeniu w stosunku 1 :20 daje strefe zahamo¬ wania srednicy okolo 20—30 mm wobec S. aureus i okolo 15—25 mm wobec P. aeruginosa. Oleista po¬ zostalosc oczyszcza sie przy pomocy chromatografii kolumnowej w sposób nastepujacy: Kolumne napel¬ nia sie 1000 g LH 20 Sephadexu (Pharmacia Fine Chemical, Inc.), zawieszonego w 95 procentowym wodnym etanolu. Oleista pozostalosc podaje sie na kolumne po czym eluuje 95 procentowym etanolem wprowadzonym w ilosci 200 mg/gódzine. Zbiera sie frakcje po 50 iiul, po czym laczy je, odpowiednio do ich aktywnosci przeciwbakteryjnej (oznaczonej irret plytce z agarem wobec S. aureus,L ATCC 6538 P)7 Frakcje posiadajace aktywnosc szczytowa za¬ geszcza sie do sucha, a nastepnie rozpuszcza' w ma¬ lej ilosci acetonu i wlewa do wiekszej objetosci eteru naftowego (temperatura wrzenia 30—6Ó^C). 12 Mieszanine przenosi sie do suchej lazni wypelnio¬ nej stalym dwutlenkiem wegla i acetonem (okolo —50°C) i pozostawia na fcrzeciajg 20 minut. Miesza¬ nine ponownie doprowadza sie do temperatury po- 5 kojowej i oddziela przez dekantacje plyn macie¬ rzysty od pozostalosci oleistej. Nastepnie plyn ma¬ cierzysty zageszcza sie do sucha, otrzymujac oczysz¬ czony antybiotyk W847 kompleks.Przyklad III. Izolowanie antybiotyku W847 io kompleksu (za pomoca kwasnej ekstrakcji). 37 1 brzeczki, otrzymanej sposobem wedlug przy¬ kladu I, doprowadza sie do wai^osci pH = 9,5, do¬ dajac 50 procentowy wodny roztwór wodorotlenku sodowego. Ekstrahuje sie octanem etylu uzytym w 15 ilosci dwukrotnie wiekszej od Objetosci (brzeczki, po czym wyciag zageszcza sie do objetosci 2150 ml.Kazda porcje wyciagu octanowego o objetosci 500 mil ekstrahuje sie dwukrotnie, uzywajac po 250 ml 0,5 procentowego 0,14 n kwasu solnego lub 0,1 n 20 kwasu siarkowego. Polaczone kwasne wyciagi al- kalizuje sie do wartosci pH = 8,5—9,0 dodatkiem 5 procentowego wodnego naziwam wodorotlenku sodowego i ponownie ekstrahuje dwiema porcjami octanu etylu po 250 ml kazda. Polaczone wyciagi 25 octanowe zageszcza sie do sucha pod zmniejszonym cisnieniem.Przyklad IV. Wytwarzanie antybiotyku W847-A sposobem (bezposredniej hydrolizy z brzecz¬ ki fermentacyjnej. 30 Do calkowitej ilosci brzeczki fermentacyjnej, opi¬ sanej w przykladzie I, dodaje sie stezonego roz¬ tworu amoniaku w takiej ilosci, aby mieszanina stanowila 1 n roztwór amoniaku i posiadala war¬ tosc pH okolo 10,8 (270 -ml stezonego amoniaku na 35 4,545 litra brzeczki). Nastepnie mieszanine pozosta¬ wia sie w temperaturze pokojowej na przeciag 3— 4 dni, dodaje sie Supercel i 'mieszanine saczy.Otrzymany przesacz ekstrahuje sie chlorkiem me¬ tylenu uzytym w ilosci odpowiadajacej V5 jego ob- 40 jetosci. Wyciag metylenowy przemywa sie woda, zageszcza do malej objetosci, dodaje acetonu i po¬ zostawia do krystalizacji. Zebrany na filtrze krysta¬ liczny antybiotyk W847-A przemywa sie oziebionym acetonem, po czym przesacze z przemycia laczy sie 45 z lugiem macierzystym pozostalym po krystalizacji i w ten sposób otrzymuje sie dodatkowa ilosc sub¬ stancji. Koncowy produkt suszy sie w ciagu nocy w piecu prózniowym w temperaturze 50°C i wów¬ czas posiada on temperature topnienia okolo 250°C 50 (z rozkladem).Przyklad V. Otrzymywanie antybiotyku W847-A metoda hydrolizy antybiotyku W$47 kom¬ pleksu. 1 czesc antybiotyku W847 kompleksu otrzy¬ manego wedlug sposobu opisanego w przykladzie 55 III rozpuszcza sie w 7 czesciach metanolu po czym dodaje 3 czesci wody zawierajacej 0,67 czesci stezo¬ nego roztworu amoniaku, co w rezultacie daje 70 procentowy wodny roztwór metanolu, bedacy równoczesnie 1 n Roztworem amoniaku. Roztwór ten eo pozostawia sie w temperaturze pokojowej na prze¬ ciag i 4 dni. Po tym czasie dodaje sie 15 procent Darco (w stosunku do wagi substancji wyjsciowej), imiesza w temperaturze pokojowej w ciagu 30 mi¬ nut, saczy i zageszcza pod zmniejszonym cisnie- 65 mieni do okolo V3 objetosci/Nastepnie ekstrahuje sie80 132 13 14 dwukrotnie chlorkiem metylenu uzytym kazdora¬ zowo w ilosci odpowiadajacej V* objetosci zagesz¬ czonego wyciagu. Polaczone wyciagi metylenowe zageszcza sie do malej objetosci, dodaje acetonu, po czym pozostawia do krystalizacji. Oddziela sie krystaliczny produkt przez saczenie, przemywa oziebionym acetonem, laczy przesacze otrzymane z przemycia z lugiem macierzystym, otrzymujac w "rezuRaaIe~ dodatkuwarilusc auityibiutyku. Prodnfcfc su¬ szy sie w ciagu nocy w piecu prózniowym w tem¬ peraturze 50°C i wówczas posiada on temperature topnienia okolo 250°C (z rozkladem).Przyklad VI. Otrzymywanie antybiotyku W847-A metoda hydrolizy kompleksu antybiotyku W847-C.A. Otrzymywanie kompleksu antybiotyku W847-C. 542 g antybiotyku W847 kompleksu, otrzymanego sposobem opisanym w przykladzie III, rozpuszcza sie w 5,4 1 acetonu i do otrzymanego roztworu do¬ daje sie 81 g wegla aktywowanego i pozostawia na przeciag okolo 30 minut w temperaturze pokojowej.Wegiel odsacza sie, zas odbarwiony przesacz za¬ geszcza pod zmniejszonym cisnieniem do objetosci okolo 2 litrów. Nastepnie przygotowuje sie okolo 80 1 wody z lodem i energicznie mieszajac wlewa sie poprzednio otrzymany wyciag acetonowy. Otrzy¬ mana zawiesine miesza sie nadal, az osiagnie tem¬ perature okolo 25°C, zbiera wytracony produkt na filtrze, przemywa mala iloscia wody i suszy pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 50°C, otrzymujac 212 g antybiotyku W847-C kompleksu.Dodatkowa ilosc 85 g produktu druigiego rzutu moz¬ na uzyskac z lugu macierzystego.B. Hydroliza frakcji W847-C.Do roztworu zawierajacego 250 g frakcji W847-C w 1900 ml metanolu dodaje sie 25 g Darco, calosc miesza w temperaturze pokojowej w ciagu 30 mi¬ nut, a nastepnie saczy. Do przesaczu dodaje sie 166.5 ml stezonego wodnego roztworu amoniaku (15 n) i uzupelnia metanolem do objetosci 2500 ml.Otrzymany roztwór r który jest 1 n roztworem amo¬ niaku pozostawia sie na 14 dni w temperaturze po¬ kojowej, a po tym czasie dodaje sie 25 g Darco i postepuje jak powyzej. Przesacz zageszcza sie pod zmniejszonym cisnieniem i dodaje acetonu dla otrzymania krystalicznego produktu. Nastepnie ogrzewa sie krótko calosc na lazni parowej, aby spowodowac calkowite rozpuszczenie zanieczyszczen oraz osiajgnac maksymalny stopien krystalizacji produktu koncowego. Po oziebieniu zbiera sie kry¬ staliczny produkt. W847-A na filtrze, przemywa zimnym acetonem i suszy pod obnizonym cisnie¬ niem w temperaturze 50°C. Z zageszczonego lugu macierzystego otrzymuje sie dodatkowa ilosc pro¬ duktu drugiego rzutu.Calkowita wydajnosc antybiotyku W847-A wynosi 149.6 g (60 procent w przeliczeniu na wage) o tem¬ peraturze topnienia okolo 250° (z rozkladem). W847- A mozna ponowniekrystalizowac z acetonu, otrzy¬ mujac produkt o czystosci analitycznej i temperatu¬ rze topnienia 255—259° (z rozkladem); [a]D = —90° (w etanolu), ciezar czasteczkowy 868 (w ibenzenie); miareczkowanie: liczba zobojetnienia = 435, pKa = =9,0; wedlug analizy elementarnej: C — 60,23, H — 9,25, N — 3,30) przecietna z dwu oznaczen).Jak wyzej wspomniano antybiotyk W847-A moze byc stosowany jako taki. Przedmiotem badan jest równiez otrzymywanie pochodnych antybiotyku W847-A przez estryfikacje, tworzenie soli i innych 5 w celu uzyskania optymalnie pozadanych wlasci¬ wosci fizjologicznych i/lub farmakologicznych. Przy¬ klady odpowiednio czynnych pochodnych zestawio¬ no w belgijskim opisie patentowym nr 715 638.Nalezy- zaznaczyc, ze Micromon&fipora sp. W847 10 zostal nazwany oficjalnie Micromonospora megalo- micea, i/antybiotyk W847 nosi nazwe megalomy- cyny. PL PL PL PL

Claims (11)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania antybiotyku W847-A, zna- 15 mienny tym, ze przeprowadza sie selektywna hy¬ drolize sulbstratu, zawierajacego co najmniej jeden z antybiotyków oznaczonych W847-B, W847-C! lub W847-C2, przy wartosci pH w zakresie 9—12, po iczym izoluje sie antybiotyk W847-A lub frakcje 20 wzbogacona w antybiotyk W847-A, w postaci wol¬ nej lub w postaci soli.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze pH srodowiska doprowadza sie do wartosci 9—12 dodajac przed hydroliza zasadowe zwiazki nieorga- 25 niczne, korzystnie takie, jak amoniak, wodorotlenek sodowy, potasowy, wapniowy, weglan sodowy lub kwasny weglan sodowy.

3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze jako srodowisko hydrolizy stosuje sie 1 n roztwór 30 amoniaku.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze hydrolizie poddaje sie brzeczke fermentacyjna, za¬ wierajaca wiecej niz jedna frakcje antyibiotyku W847 kompleksu, korzystnie po przesaczeniu takiej 35 ibrzeczki.

5. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze przed saczeniem Ibrzeczki fermentacyjnej dodaje sie do niej substancje ulatwiajaca saczenie.

6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 40 przeprowadza sie hydrolize jednej substancji lub mieszaniny substancji wyizolowanych z brzeczki fermentacyjnej, która to brzeczka zawiera kom¬ pleks W847.

7. Sposób wedlug zastrz. 6, znamienny tym, ze 45 hydrolize przeprowadza sie w podwyzszonej tempe¬ raturze i w srodowisku nie zawierajacym amo¬ niaku.

8. Sposób wedlug zastrz. 6 lub 7, znamienny tym, ze hydrolizuje sie roztwór zawierajacy obojetny, so mieszajacy sie z woda polarny rozpuszczalnik orga¬ niczny, korzystnie metanol, etanol, izopropanol, ace¬ ton luib dwumetyloacetamid.

9. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze material wyjsciowy poddaje sie hydrolizie tak, az 55 bedzie ona calkowita.

10. Sposób wedlug zastrz. 9, znamienny tym, ze otrzymany po hydrolizie roztwór poddaje sie eks¬ trakcji rozpuszczalnikiem organicznym, korzystnie chlorkiem metylenu, a nastepnie wyciag zageszcza eo sie i pozostawia go do krystalizacji antybiotyku W847-A.

11. Sposób wedlug zastrz. 10, znamienny tym, ze krystalizacje ulatwia sie przez dodanie rozpuszczal¬ nika, w którym antybiotyk W847-A jest slabo roz- 65 puszczajmy, najlepiej acetonu. iCZYTELNIA 0rzedv Patentowego PL PL PL PL