Sposób wytwarzania kortykotropowych polipeptydów Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia polipeptydów o wlasciwosciach kortykotropo¬ wych i o ogólnym wzorze 1: H — SER — TYR — SER — MET — GLU — HIS 12 3 4 5 6 — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ — PRO 7 8 9 10 11 12 — WAL, — GLI — LIZ — LIZ — ARG — ARG 13 14 15 16 17 18 — PRO — WAL — LIZ — WAL — TRY — PRO 19 20 21 22 23 24 _ W — ALA — FEN — PRO — LEU — GLU 34 35 36 37 38 — FEN — OH 39 w którym W oznacza jedna z nastepujacych sek¬ wencji aminokwasów: — ASP — GIL — ALA — GLU — ASP — GLN 25 26 27 28 29 30 — LEU — ALA — GLU — lub — ASP — GLI 31 32 33 25 26 — GLU — ALA —GLU — ASP —SER — ALA 27 28 29 30 31 32 — GLN — lub — ALA — GLI — GLU — ASP 33 25 26 27 28 — ASP — GLU — ALA — SER — GLN — 29 30 31 32 33 albo fragmentów tych polipeptydów, zawierajacych co najmniej 15 pierwszych wymienionych amino¬ kwasów. 10 25 Polipeptydy wytwarzane sposobem wedlug wy¬ nalazku sa zwiazkami biologicznie czynnymi i ko¬ lejnosc ukladu zawartych w nich aminokwasów odpowiada kolejnosci wystepujacej w naturalnej kortykotropinie.W szeregu polipeptydów wyodrebnionych z przy¬ sadki mózgowej róznych zwierzat i wykazujacych dzialanie hormonu adrenokortykotropowego (ACTH), tak zwanych kortykotrapin, udalo sie po otrzyma¬ niu czystej kortykotropiny z przysadek swin, owiec oraz wolów i po wyjasnieniu jej budowy, wyod¬ rebnic hormon ludzki i ustalic jego budowe. Przy tym okazalo sie, ze wszystkie znane dotychczas kortykotropiny skladaja sie z lancuchów pepty- dowych o 39 aminokwasach, które przy tej samej budowie róznia sie miedzy soba tylko kolejnoscia w czesci nonapeptydowej, skladajacej sie z amino¬ kwasów 25 — 33 o wzorze 2, a mianowicie: H — SER — TYR — SER — MET — GLU — 1 3 4 5 HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ — 6 7 8 9 10 11 PRO — WAL — GLI — LIZ — LIZ — ARG — 12 13 14 15 16 17 ARG — PRO — WAL — LIZ — WAL — TYR — 18 19 20 21 22 23 PRO — 24 — ASP — ALA — GLI — GLU — ASP —3 — GLN — SER — ALA — GLU — (A) — ASP — — GLI — ALA — GLU — ASP — GLN — LEU — ALA — GLU — (B) — ASP — GLI — GLU — 5 ALA — GLU — ASP — SER — ALA — GLN — 25 26 27 28 29 10 GLU — ALA — SER — GLN — (D) — ALA — 30 31 32 33 34 FEJT — PftÓ* ~JLEU — GLU — FEN — OH #5 3fe ' "37 38 39 w którym (A) oznjacza czesciowa sekwencje ami- 15 nokwasów 25—33 W ludzkiej kortykotropinie, (B), (C), (D) oznaczaja czesciowe sekwencje kortykotro¬ piny swinskiej, owczej i wolowej.W podanych wzorach peptydów, jak równiez w nastepnych, uzyto skrótów trzyliterowych, zgod- 20 nie z konwencja przyjeta w chemicznej syntezie peptydów i stosowana do oznaczania aminokwasów stanowiacych elementy lancuchów peptydowych.Wynalazek umozliwia wytwarzanie polipeptydów o ogólnym wzorze 1, w którym W ma wyzej po- 25 danej znaczenie, jak równiez fragmentów tych po¬ lipeptydów zawierajacych co najmniej 15 pierw¬ szych wymienionych aminokwasów. Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze nowy, nie opisany dotychczas w literaturze tetradekapeptyd, zbudó- 30 wany z piewszych 14 aminokwasów naturalnych kortykotropin, o ogólnym wzorze 3: OY X' X X - SER - TYR - SER - MET - GLU - HIS - 35 — FEN - ARG - TRY - GLI - LIZ - PRO - WAL — GLI - R, w którym X i Y oznaczaja znane gru¬ py ochronne dajace sie usuwac, X' oznacza daja¬ ca sie usuwac grupe ochronna, odpowiednia do ochrony grupy guanidynowej, rip. trzeciorzedowa *° grupe butylohydroksykarbonylowa lub nitrowa albo atom wodoru/a R oznacza grupe wodorotle¬ nowa lub znamy podstawnik aktywizujacy grupe karboksylowa, sprzega sie metodami stosowanymi w chemii peptydów z chronionym peptydem, za- 45 wierajacym sekwencje stanowiaca reszte zadanego produktu polipeptydowego, po czym z otrzymane¬ go polipeptydu usuwa sie znanym sposobem grupy ochronne.Stosowany zgodnie z wynalazkiem zwiazek 5° o wzorze 3, w którym wszystkie symbole maja wyzej podane znaczenie, jest zwiazkiem trudno rozpuszczalnym i mozna go latwo wytwarzac w czystej postaci. Z punktu widzenia syntezy sto¬ sowanie tego zwiazku jest korzystne, poniewaz 55 zwiazek ten jako koncowy aminokwas C zawiera reszte glicyny, która nie ulega racemizacji pod¬ czas procesu sprzegania. Zwiazek ten mozna spo¬ sobem wedlug wynalazku stosowac nie tylko do wytwarzania polipeptydów o wzorze 1, ale równiez 60 aktywnych biologicznie polipeptydów, które skla¬ daja sie z krótszych, czesciowych sekwencji natu¬ ralnej kortykotropiny.Jak wiadomo, polipetydy zawierajace czesciowe sekwencje 1—13 naturalnej kortykotropiny w tej 65 4 samej postaci, a zawierajace tylko czesc komplet¬ nego lancucha aminokwasów wystepujacego w na¬ turalnej kortykotropinie, wykazuja równiez cenne dzialania terapeutyczne, prawie dorównujace hor¬ monalnemu dzialaniu naturalnej kortykotropiny.W szczególnosci odnosi sie to do peptydów skla¬ dajacych sie z pierwszych 24 lub 28 aminokwa¬ sów naturalnej kortykotropiny, mianowicie do te- trakoza — lub oktakozapeptydów. Te krótsze frag¬ menty, zawierajace poczatkowe aminokwasy 1— 13 z naturalnej kortykotropiny maja równiez inne cenne terapeutyczne wlasciwosci na przyklad dzia¬ lanie mobilizujace lipidy, które wystepuje juz we fragmentach o krótszych lancuchach, nie wykazu¬ jacych wcale, lub w bardzo malym stopniu dzia¬ lania adrenokortykotropowego.Proces wedlug wynalazku mozna prowadzic sto¬ sujac metody sprzegania znane w chemii pepty¬ dów, ale stwierdzono, ze jezeli reakcji z chronio¬ nym peptydem poddaje sie tetradekapeptyd o wzo¬ rze 3, w którym X, Y i X' maja wyzej podane znaczenie, a R oznacza grupe wodorotlenowa, to szczególnie korzystnie jest prowadzic proces w obecnosci karbódwuamidu, zwlaszcza dwucyklo- heksylokarbodwuamidu, a jezeli R we wzorze 3 oznacza grupe acyloksylowa, wówczas korzystnie jest prowadzic reakcje w obecnosci zdolnego do reakcji estru lub mieszanego bezwodnika. Proces wedlug wynalazku przebiega równiez bardzo ko¬ rzystnie w obecnosci karbódwuamidu i zwiazku hydroksylowego np. pieciochlorofenolu. Korzystnie stosuje sie zwiazki o wzorze 3, w którym X, Y i X' maja znaczenie wyzej podane, a R oznacza grupe p-nitrofenoksylowa lub pieciochlorofenoksy- lowa.Produkty reakcji otrzymuje sie z wydajnoscia wynoszaca okolo 60°/o wydajnosci teoretycznej, a jezeli skladniki reakcji stosuje sie w ilosciach równomolowych, wówczas w mieszaninie poreak¬ cyjnej nie ma produktów wyjsciowych i otrzyma¬ ne polipeptydy wyodrebnia sie latwo w czystej po¬ staci.Przez odszczepianie znanymi sposobami grup ochronnych mozna otrzymane polipeptydy przepro¬ wadzac w zwiazki o dowolnych grupach funkcyj¬ nych. Po oczyszczeniu mozna otrzymane zwiazki stosowac do celów farmakologicznych, ewentual¬ nie w postaci kompleksów z solami metali, ad- duktów z zelatyna lub z ludzka proteina surowi¬ cza, albo w postaci produktów z redukujacymi cu¬ krami.Tetradekapeptydy i peptydy stosowane jako pro¬ dukty wyjsciowe w procesie prowadzonym sposo¬ bem wedlug wynalazku mozna wytwarzac metoda¬ mi znanymi w chemii peptydów, stosujac równiez znane kombinacje grup ochronnych. Zgodnie z ogólnymi zasadami syntezy peptydów korzystne jest stosowanie takich grup ochronnych, które mozna pod koniec syntezy usunac za pomoca la¬ godnej hydrolizy kwasnej, na przyklad trzeciorze¬ dowe grupy butylohydroksykarbonylowe w celu ochrony grup aminowych i trzeciorzedowe grupy butyloestrowe w celu ochrony grup karboksylo- wych lub hydroksylowych. Przy wytwarzaniu pro¬ duktów posrednich mozna stosowac grupy karbo-5 79252 6 nylobenzoksylowe lub p-chlorokarbonylobenzoksy- lowe, a dla ochrony grupy guanidynowej argininy korzystnie jest stosowac grupy nitrowe. Synteze mozna równiez prowadzic z arginina bez specjal¬ nych grup ochronnych, zawierajaca tylko protono- 5 wana grupe guanidynowa.Jezeli w procesie prowadzonym sposobem we¬ dlug wynalazku aktywujacym skladnikiem jest kwas acyloaminowy lub acylopeptyd, zawierajacy jako zakonczenie C aminokwas proline lub glicyne, 10 mozna w celu wytworzenia wiazania peptydowe- go stosowac metody mieszanych bezwodników, aktywnych estrów lub metode karbodwuimidowa.We wszystkich innych przypadkach, gdy nalezy sie liczyc z recemizacja aktywowanych aminokwasów celowym jest stosowanie metody azydowej z wy¬ odrebnionym lub niewyodrebnionym azydkiem w srodowisku wodnym lub rozpuszczalnikach or¬ ganicznych.Przy otrzymaniu chronionego tetradekapeptydu 20 (1—14) o ogólnym wzorze 3 celowym jest przepro¬ wadzic znany z literatury, ester czteropeptydowy Z — LIZ (BOC) — PRO — WAL — GLI — OC2H5 najpierw w chroniony ester szesciopeptydo- . wy Z — TRY — GLI — LIZ (BOC) — PRO — 25 WAL — GLI — OC2H5, nastepnie przez sprzegnie¬ cie z chroniona arginina oraz usuniecie grup ochronnych przy koncowym atomie C albo N, przeprowadzic w heptapeptyd H — ARG — TRY — GLI —LIZ (BOC)—PRO —WAL—GLI—OH. 30 Otrzymany peptyd najpierw acyluje sie chronio¬ nym trójpeptydoazydem Z — GLU (OBu*) — ,GIS — FEN — N3 nastepnie otrzymany dekapeptyd, po usunieciu ochronnej grupy koncowego N, acy¬ luje sie chronionym czteropetydoazydem BOC — 35 SER — TYR — SER — MET — N8 W ten sposób otrzymuje sie tetradekapeptyd (1—14) o wzorze: BOC — SER — TYR — SER — MET — GLU (OBut) — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — 40 LIZ (BOC) — PRO — WAL — GLI — OH z gru¬ pami ochronionymi przy koncowym Niw lan¬ cuchach bocznych.Pentakozapeptyd (15—39) mozna korzystnie wy¬ twarzac w ten sposób, ze znany peptyd H — 45 GLU (OBut) — ALA — FEN — PRO — OH kon- densuje sie z Z — SER — ALA — N3 i nastepnie przez hydrolize otrzymanego produktu wytwarza sie nowy heksapeptyd H — SER — ALA — GLU (OBut) — ALA — FEN — PRO — OH, który moz- 50 na z kolei przeprowadzic równiez w nowy hepta¬ peptyd Z — GLN — SER — ALA — GLU (OBut) — ALA — FEN — PRO — OH.Przez polaczenie tego chronionego heptapeptydu ze znanym estrem trójpeptydowym H — LEU — 55 GLU (OBut) — FEN — OBut otrzymuje sie nowy dekapeptyd Z — GLN — SER — ALA — GLU (OBut) — ALA — FEN — PRO — LEU — GLU (OBut) — FEN — OBut. Ten dekapeptyd acyluje sie najpierw odpowiednio chronionym kwasem as- 60 paraginowym, a nastepnie chronionym kwasem glu¬ taminowym, w wyniku tego otrzymuje sie nowe undeka- i dodekapeptydy. Ten ostatni laczy sie z nowym trójpeptydem Z — ASP (OBut) — ALA — GLI — OH, dzieki czemu powstaje nowy penta- 65 dekapeptyd, który nastepnie acyluje sie nowym chronionym dekapeptydem, otrzymywanym przez kondensacje pentapeptydu Z — LIZ(BOC) — LIZ (BOC) — ARG(N02) — ARG(N02) — PRO — OR (przy czym R oznacza reszte p-nitrofenylowa lub pieciochlorafenylowa) z H — WAL — LIZ(BOC) — WAL — TYR(But) — PRO — OH.Przez wodórolize otrzymanego w ten s,posób, chronionego pentakozapeptydu otrzymuje sie nie znana dotychczas pochodna pentakozapeptydu o wzorze 4, przy czym X '= BOC, Y = But a X' = = H. Mozna równiez postepowac w ten sposób, ze wzmiankowany wyzej dekapeptyd laczy sie z no¬ wym oktapeptydem, otrzymanym w reakcji penta¬ peptydu Z — WAL — LIZ(BOC) — WAL — TYR (But) — PRO — OR' (R' oznacza grupe aktywuja¬ ca, na przyklad reszte imidu bursztynowego) z nowym trójpeptydem H — ASP(OBut) — ALA — GLI — OH, w wyniku czego otrzymuje sie nowy ikozapeptyd Z — WAL — LIZ(BOC) — WAL — TYR(But) — PRO — ASP(OBut) — ALA — GLI — GLU(OBut) — ASP(OBut) — GLN — SER — ALA — GLU(OBut) — ALA — FEN — PRO — LEU — GLU(OBut) — FEN — OBut.Ten ikozapeptyd, po usunieciu ochronnych grup przy koncowym N i po polaczeniu ze wzmianko¬ wanym juz pentapeptydem, przeprowadza sie we wzmiankowany, chroniony pentakozapeptyd, z któ¬ rego za pomoca wodorolizy, prowadzonej opisanym sposobem, otrzymuje sie zadany skladnik (15—39) o wzorze 4 (X = BOC, Y = But, X' = H+).Potrzebne do syntezy tetradeka — pentadeka — i heksapeptydu (1—14), (1—15) i (1—16) skladniki aminowe sa znanymi juz zwiazkami. Natomiast stosowane do wytwarzania heptadeka — albo ok- tadekapeptydu (1—17) i (1—18) skladniki aminowe (15—17) albo (15—18) mozna otrzymac przez kon¬ densacje Z — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — N8 z H— ARG(N02) — NH2 albo H — ARG(N02) — ARG(N02) — NH2. Przy wytwarzaniu stosowanych w syntezie nonadeka — do oktakozapeptydów [(1—19 do (1—28] skladników aminowych, mozna jako wspólny ma¬ terial wyjsciowy stosowac ester pentapeptydowy Z — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG(N02 — ARG (N02) — PRO — OR' (przy czym R' oznacza reszte potrzebna dla wytworzenia estru, na przyklad re¬ szte p-nitrofenylowa lub pieciochlorofenylowa).W syntezie nonadekapeptydu (1—19) zwiazek ten poddaje sie reakcji z amoniakiem, we wszystkich innych przypadkach z odpowiednia, we wlasciwy sposób chroniona pochodna aminokwasowa lub peptydowa. Skladniki aminowe stosowane do wy¬ twarzania oktakozapeptydu (1—28) mozna otrzy¬ mywac z wyzej wzmiankowanego, chronionego, ak¬ tywnego estru pieciopeptydowego w ten sposób, ze pochodna nonapeptydowa H — WAL — LIZ (BOC) — WAL — TYR(OBut) — PRO — ASP (OBut) — GLI — ALA — GLU(OBut) — OBut albo H — WAL — LIZ(BOC) — WAL — TYR(OBut) — PRO — ASP(OBut) — ALA — GLI — GLU(OBut) — OBut acyluje sie chronionym, aktywnym estrem pieciopeptydowym.Pochodna nonapeptydowa mozna otrzymac przez kondensacje Z — WAL — LIZ(BOC) — WAL — TYR(OBut) — PRO — OR' (przy czym R' oznacza7 79252 8 reszte potrzebna do wytworzenia aktywnego estru, na przyklad reszte imidu hydroksybursztynowego) z H — ASP (OBut) — GLI — ALA — GLU(OBut) — OBut albo H — ASP(OBut) — ALA — GLI — GLU(OBut) — OBut.Czesc z koncowym C, stosowana do wytwarzania dotriakontapeptydu (1—32), mozna równiez otrzy¬ mac z tego chronionego, aktywnego estru piecio- peptydowego w ten sposób, ze pochodna trójde- kapeptydowa (20—32) acyluje sie wyzej wzmian¬ kowana pochodna pieciopeptydowa. Pochodna trój- dekapeptydowa (20—23) otrzymuje sie z chronio¬ nego, aktywnego estru oktapeptydowego (20—27) i pochodnej pieciopeptydowej <(28—32).W celu oczyszczenia wielkoczasteczkowych, nie- krystalizujacych wielopeptydów poleca sie w lite¬ raturze bardzo skomplikowane metody oparte na jonowymiennej chromatografii, elektroforezie lub przeciwpradowym rozdzielaniu. W nowej syntezie, bedacej przedmiotem wynalazku, mozliwe jest po¬ miniecie tych skomplikowanych metod oszyszcza- nia produktów posrednich, mianowicie mozna róz¬ ne produkty posrednie, a nawet chronione produk¬ ty koncowe, wyodrebniac w czystej postaci za po¬ moca jednej tylko, majacej ogólne zastosowanie, operacji oczyszczania — prostego chromatograficz¬ nego rozdzielania w kolumnie z zelem krzemion¬ kowym. Skale tej operacji chromatograficznej moz¬ na dowolnie zwiekszac co pozwala na stosowanie tej metody z powodzeniem takze przy otrzymywa¬ niu wiekszych ilosci wielopeptydów.Przy rozdzielaniu chromatograficznym na zelu krzemionkowym chronionych wielopeptydów uzy¬ skuje sie produkty o dostatecznym stopniu czy¬ stosci, wobec czego otrzymane po usunieciu grup ochronnych wolne peptydy, mozna otrzymywac w chromatograficznie czystej postaci, bez dalszego oczyszczania.Sposób wytwarzania bedacy przedmiotem wyna¬ lazku uwidoczniono w podanych nizej przykladach.Poszczególne produkty posrednie i koncowe poda¬ no w tych przykladach stosujac skróty przyjete w chemii peptydów. Oprócz juz wyzej wzmianko¬ wanych zwyklych skrótów dla poszczególnych reszt aminokwasów, wprowadzono odpowiednie skróty dla nastepujacych grup ochronnych: Z = karbobenzyloksylowa C6H5CH2OCO— BOC = trzeciorzedowa butyloksykarbonylowa CH8/3COCO— But = trzeciorzedowa butylowa C(CHS)3 NB = p-nitrobenzylowa NP = p-nitrofenylowa PCP = pieciochlorofenylowa W przykladach umieszczono dane dotyczace identyfikacji, mianowicie chromatograficzne war¬ tosci Rf w odniesieniu do róznych ukladów roz¬ puszczalników; cyfry umieszczone przy symbolu „Rf" odnosza sie do nastepujacych ukladów roz¬ puszczalników: 1. Octan etylu — pirydyna — kwas octowy — woda 60 : 20 : 6 : 11; 2. Octan etylu — pirydyna — kwas octowy — woda 60 : 10 : 3 : 5,5; 3. Chloroform — metanol — woda 60 : 38: 10; 4. Chloroform — metanol 90 :10; 5. Octan etylu — pirydyna — kwas mrówkowy— woda 40 : 20 : 6 : 5,5; 6. Butanol — pirydyna — kwas octowy — wo¬ da 30 : 20 : 6 : 24; 5 7. Octan etylu — pirydyna — kwas mrówkowy — woda 60 : 20 : 6 : 5,5; 8. Chloroform — metanol — woda 40 : 10 : 1; 9. Chloroform — metanol — woda 60 : 26 : 5; 10. Chlorofom — metanol 80 : 15; 10 11. Chloroform — metanol 80 : 20; 12. Octan etylu — pirydyna — kwas octowy — woda 240 : 20 : 6 : 11.Przyklad I. Sposób wytwarzania ludzkiej 15 kortykotropiny Etap 1: Z — SER — ALA — GLU(OBut) — ALA — FEN — PRO (31—36). 3,6 g (11,1 milimola) chronionego hydrozydu dwupeptydu Z — SER — ALA — N2H3 (patrz J. 20 I. Harris, J. S. Fruton: J. Biol. Chem. 191, 143 (1951) przeprowadzono w stan zawiesiny w 36 ml dwumetyloformamidu, do zawiesiny dodano 5,55 ml 6 normalnego kwasu solnego w temperaturze — 30°C, nastepnie temperature powoli podniesiono. 25 Substancja w zawiesinie rozpuscila sie w tempe¬ raturze okolo — 20°C. Nastepnie roztwór oziebiono ponizej temperatury —30°C i dodano kroplami 2,2 ml 5-molowego roztworu azotynu sodu. Mieszanine reakcyjna mieszano w ciagu 15 minut przy tem- 30 peraturze —20°C az do temperatury —30°C, na¬ stepnie dodano wodny roztwór skladnika amino¬ wego; roztwór ten otrzymano przez rozpuszczenie 4,92g wolnego czteropeptydu GLU(OBut) — ALA — FEN — PRO w 20 ml wody, zawierajacej 1,33 35 ml (9,5 milimola) trójetyloaminy patrz S. Bajusz, T. Lazar: Acta Chim. Hung. 38. 111 (1966). Po wy¬ mieszaniu obu roztworów podwyzszono powoli temperature do 0°C, i pozostawiono mieszanine na noc. Nastepnie roztwór zakwaszono kwasem cytry- 40 nowym do pH ~3, po czym oddzielono powstaly heksapeptyd: otrzymano 5,65 g (73,5% wydajnosci teoretycznej) heksapeptydu; temperatura topnienia 172—173°C.Rf2 0,23—0,33, Rf1 0,65—0,75 45 C40H54O12N6 (810,88).Etap 2: SER — ALA — GLU(OBut) — ALA — FEN — PRO (31—36). 5,8 g (7,15 milimola) chronionego heksapeptydu, otrzymanego w etapie 1, rozpuszczono w 100 ml 80% kwasu octowego i uwodorniano wobec palladu na weglu aktywnym. Postep reakcji sledzono za pomoca chromatografii. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsaczono, roztwór odparowano, do po¬ zostalosci dodano metanol i ponownie odparowano.Z metanolowego roztworu pozostalosci wydzielil sie produkt w postaci krystalicznej. Otrzymana, gesta zawiesine krysztalów rozcienczono eterem etylowym, krysztaly odsaczono, przemyto eterem i wysuszono. Otrzymano 4,3 g (89% teoretycznej) wolnego heksapeptydu: temperatura topnienia 200—202°C.Rf1 0,15—0,20.Etap 3: Z — GLN — SER — ALA — GLU(OBut) «5 — ALA — FEN — PRO (30—36).9 79252 10 4,3 g (6,35 milimola) wolnego heksapeptydu otrzymanego w etapie 2, 0,45 ml (6,35 milimola) trójetyloaminy i 2,81 g (7,0 milimola) estru karbo- benzoksy glutamino — p-nitrofenylowego rozpusz¬ czono w 13,0 ml pirydyny w temperaturze 50°C.Mieszanine pozostawiono na jeden dzien, nastep¬ nie otrzymany galaretowaty produkt reakcji roz¬ cienczono eterem etylowym, nastepnie kwasem cy¬ trynowym i przekrystalizowano^z metanolu^. Otrzy¬ mano 4,65 g (78% wydajnosci teoretycznej) chro¬ nionego heptapeptydu; temperatura topnienia 188— 190°C.Rf1 0,45—0,52.C45H62014N8 (939,01).Etap 4: Z — GLN — SER — ALA — GLU(OBut) — ALA — FEN — PRO — LEU — GLU(OBut) — FEN — OBut (30—39). 3,95 g (0,06 milimola) chronionego estru trój- peptydowego Z — LEU — GLU(OBut) — FEN — OBu* (patrz S. Bajusz, T Lazar: Acta Chim. Hung. 48, 111 (1966), rozpuszczono w 50 ml metanolu i uwodorniano wobec palladu na weglu aktyw¬ nym. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsaczo¬ no a przesacz odparowano. Otrzymany jako pozo¬ stalosc olej rozpuszczono w 4 ml dwumetylofor- amidu po czym roztwór dodano do roztworu skladnika bezwodnikowego, otrzymanego nizej opi¬ sanym sposobem. 4,55 g (4,84 milimola) chronionego peptydu, otrzymanego w etapie 3, rozpuszczono w 25 ml dwumetyloformamidu, nastepnie dodano 0,675 ml (4,82 milimola) trójetyloaminy i oziebiono do — 30°C. Do oziebionego roztworu dodano kroplami 0,49 ml (okolo 4,9 milimola) chloroweglanu ety¬ lu, mieszanine mieszano w temperaturze —20°C w ciagu 10 minut i nastepnie polaczono z roztwo¬ rem skladnika aminowego, otrzymanego w spo¬ sób podany wyzej. Mieszanine pozostawiono na noc, nastepnie dodano 0,5 ml trójetyloaminy, roz¬ cienczono okolo 100 ml wody. Wydzielony osad odsaczono, przemyto woda az do otrzymania od¬ czynu obojetnego, wysuszono, nastepnie przemyto eterem etylowym, w koncu rozpuszczono na go¬ raco w 100 ml metanolu i 70 ml wody i pozosta¬ wiono do krystalizacji. Otrzymany produkt odsa¬ czono, przemyto 60°/o metanolem i wysuszono.Otrzymano 5,9 g (84% wydajnosci teoretycznej) chronionego dekapeptydu; temperatura topnienia 213—214°C. Rf4 0,23—0,30, Rf12 0,28^0,35 C73H105O19N11 (1440,66).Etap 5: Z — ASP (OBut) — GLN — SER — ALA — GLU(OBut — ALA FEN — PRO — LEU — GLU(OBut) — FEN — OBut (29—39). 6,48 g (4,5 milimola) chronionego dekapeptydu, otrzymanego w etapie 4, rozpuszczono w 200 ml dwumetyloformamidu, dodano 4,5 ml normalnego kwasu solnego i uwodorniano wobec palladu na weglu aktywnym. Po zakonczeniu reakcji katali¬ zator odsaczono, roztwór odparowano, rozcienczo¬ no mieszanina eteru etylowego i eteru naftowego, przemyto ta sama mieszanina, nastepnie przemyto eterem etylowym i wysuszono. Otrzymano 5,62 g -<87% o wydajnosci teoretycznej) wolnego chlorowo¬ dorku dekapeptydu; Rf5 0,12—0,23. Otrzymany w powyzszy sposób wolny chlorowodorek dekapep¬ tydu (0,03 milimola) rozpuszczono w 12,5 ml dwu¬ metyloformamidu, dodano 0,565 ml (4,03 milimola) trójetyloaminy, nastepnie 2,7 g (6,05 milimola) estru p-nitrofenylowego kwasu a-karbonylobenzo- ksy — /?-III-rzed.-butylo-asparaginowego i pozo¬ stawiono na 40 godzin w temperaturze 50°C. Mie¬ szanine reakcyjna rozcienczono eterem etylowym i odsaczono. Surowy produkt otrzymany w postaci osadu, przemyto eterem etylowym, rozpuszczono w 130 ml etanolu, nastepnie do roztworu dodano wTegiel aktywny, po czym wegiel aktywny odsa¬ czono, przemyto 26 ml goracego metanolu i oczysz- 15 czony przesacz metanolowy rozcienczono 105 ml goracej wody. Wydzielony produkt po odsaczeniu i przemyciu ponownie wytracono w 130 ml meta¬ nolu i 100 ml wody. Otrzymano 4,9 g (75,5% wy¬ dajnosci teoretycznej) chronionego undekapeptydu; 20 temperatura topnienia 211—213°C.Rf12 0,4—0,45, Rf4 0,27—0,33 C81H118022N12 (1611,85)/ Etap 6: Z — GLU(OBut) — ASP(OBut) — GLN — 25 SER — ALA — GLU(OBut) — ALA — FEN — PRO — LEU — GLU(OBut) — FEN — OBut (28— 39). 4,6 g (2,85 milimola) chronionego undekapeptydu, otrzymanego w etapie 5, uwodorniano wobec pal- 30 ladu na weglu aktywnym w 250 ml 80% kwasu octowego. Po zakonczeniu reakcji katalizator od¬ saczono, roztwór odparowano, pozostalosc rozcien¬ czono eterem etylowym, odsaczono i wysuszono.Otrzymano 4,25 g (97% wydajnosci teoretycznej) 35 undekapeptydu wolnego przy koncowym N. Pro¬ dukt wymieszano z 10 ml dwumetyloformamidu oraz z 2,1 g (4,5 milimola) estru p-nitrofenylowe¬ go kwasu a-karbonylobenzoksy — /?-III-rzed.-bu- tylo-glutaminowego i pozostawiono w ciagu 20 go- 40 dzin w temperaturze 50°C. Mieszanine reakcyjna rozcienczono eterem etylowym i wysuszono. Su¬ rowy produkt, otrzymany w ten sposób, gotowano z 20 ml mieszaniny octanu etylu pirydyny, kwasu octowego i wody (60 : 10 : 3 : 5), po czym ochlo- 45 dzono lodem a wytracony galaretowaty produkt odsaczono, przemyto dwukrotnie 2 ml wyzej po¬ danej mieszaniny rozpuszczalników, nastepnie ete¬ rem etylowym i wysuszono. Otrzymano 3,48 g (70% wydajnosci teoretycznej) chronionego dode- 50 kapeptydu: temperatura topnienia 201—203°C.Rf12 0,46—0,53 Rf4 0,47—0,52 C90H133O25N13 (1797,07).Etap 7: GLU(OBut) — ASP(OBut) — GLN — SER — ALA — GLU(OBut) — ALA — FEN — PRO — 55 LEu — GLU(OBut) — FEN — OBut. HC1 (28—39).Do 2,34 g (1,3 m mola) chronionego dodekapep- tydu, otrzymanego w etapie 6, rozpuszczonego w 20 ml dwumetyloformamidu, dodano 1/3 ml nor¬ malnego kwasu solnego i uwodorniano wobec pal- 60 ladu na weglu aktywnym. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsaczono, roztwór odparowano, pozo¬ stalosc rozcienczono okolo 10 ml 15% roztworu wodnego soli kuchennej, odsaczono, przemyto ma¬ la iloscia zimnej wody i wysuszono. Otrzymano 65 2,11 g (95,5% wydajnosci teoretycznej) wolnego11 79252 12 chlorowodorku dodekapeptydu; Rf10 0,48—0,53, Rf4 0,06—0,15. C82H128023N1SC1 (1699,40).Etap 8: Z — ALA — GLI — ONB (26—27) NB = p-nitrobenzyl).Z 2,80 g (9,65 milimola) H — GLI — ONB — HBr (patrz H. Schwarz, K. Arakawa: J. Am. Chem.Soc. 81, 5691 (1959). Sporzadzono zawiesine w mie¬ szaninie 5 ml wody i 15 ml octanu etylu, która wytrzasano w temperaturze 0°C z 15 ml zimnego, nasyconego roztworu weglanu potasu. Po rozdzie¬ leniu faz warstwa wodna wytrzasano jeszcze dwu¬ krotnie z octanem etylu. Roztwory octanu etylu oczyszczono, osuszono i odparowano w tempera¬ turze pokojowej pod próznia. Otrzymano 2,0 g (100°/o wydajnosci teoretycznej) krystalicznego, wolnego estru p-nitrobenzylowego glicyny, który mozna stosowac do dalszej syntezy bez przekrysta- lizowania. 2,0 g (9,5 milimola) estru p-nitrobenzylowego gli¬ cyny i 2,13 g (9,5 milimola) karbobenzoksy alza- niny rozpuszczono w 20 ml chlorku metylenu. Roz¬ twór oziebiono do temperatury 0°C, po czym do¬ dano roztwór 1,98 g (9,5 milimola) dwucykloheksy- lokarbodwuimidu w 4 ml chlorku metylenu.Mieszanine mieszano w temperaturze 0°C w cia¬ gu jednej godziny oraz w ciagu drugiej godziny w temperaturze pokojowej, nastepnie pozostawiono na noc. Powstaly dwueykloheksylomocznik (2,0 g 93% wydajnosci teoretycznej) usunieto przez od¬ saczenie, a przesacz przemyto rozcienczonym kwa¬ sem solnym, woda, nastepnie 5% roztworem wo¬ doroweglanu sodu oraz ponownie woda, po czym wysuszono i odparowano. Pozostalosc przekrystali- zowano z mieszaniny 20 ml octanu etylu i 20 ml eteru naftowego. Otrzymany, chroniony ester dwu- peptydowy (3,50 g) ponownie przekrystalizowano z mieszaniny metanolu i wody. Otrzymano 2,0 g (76% wydajnosci teoretycznej) chronionego estru dwupeptydowego; temperatura topnienia 104— 106°C, Rf7 0,5—0,6.Analiza: C20H2iO7N3 (415,396) Obliczono: C 57,80%, H 5,10%, N 10,10% Otrzymano: C 57%, H 5,4%, N 10,1%.Etap 9: ALA — GLI — ONB — HBr (26—27). 4,0 g (9,6 milimola) chronionego estru dwupep¬ tydowego, otrzymanego w etapie 8, rozpuszczono w 5 ml octanu etylu, po czym dodano 15 ml okolo 4 n kwasu bromowodorowego. Mieszanine pozosta¬ wiono w temperaturze pokojowej (okolo jednej godziny) az do zakonczenia burzliwej reakcji. Pro¬ dukt wytracono przez dodanie absolutnego eteru etylowego, zamieszano, przesaczono, przemyto ete¬ rem i wysuszono. Otrzymany surowy produkt 3,30 g przekrystalizowano z 20 ml etanolu. Otrzy¬ mano 3,0 (86% wydajnosci teoretycznej) wolnego estru dwupeptydowego.Rf1 0,6—0,7 Analiza: C12H1505Ns-HBr (363,188) Obliczono: C89, 80%, H 4,45%, N 11,61%, Br 22,05% Otrzymano: C 40,1%, H 4,8%, N 11,6%, Br 22,25%.Etap 10: Z — ASP(OBut) — ALA — GLI — ONB (25—27). 2,40 g (7,5 milimola) kwasu karbonylobenzoksy — /?-III-rzed.-butylo-asparagowego i 2,70 g (7,5 mili¬ mola) otrzymanego bromowodorku estru dwupep¬ tydowego rozpuszczono w 8 ml dwumetyloforma- 5 midu, roztwór oziebiono do temperatury 0°C, po czym dodano 1,54 g (7,5 milimola) dwucykloheksy- lokarbodwuimidu, a po jego rozpuszczeniu dodano 1,04 ml (7,5 milimola) trójetyloaminy. Mieszanine mieszano w ciagu godzimy w temperaturze 0°C i w 10 ciagu drugiej godziny w temperaturze pokojowej.Nastepnego dnia mieszanine reakcyjna odparowano, pozostalosc rozpuszczono w octanie etylu, roztwór wytrzasano z 1 normalnym roztworem kwasu cy¬ trynowego, nastepnie z woda, z 0,2 normalnym roz- 15 tworem wodoroweglanu potasu i w koncu ponow¬ nie z woda. Roztwór organiczny wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i odparowano. Pozo¬ stalosc przekrystalizowano z mieszaniny octanu etylu i eteru naftowego. Otrzymano 2,8 g (64% wy- 20 dajnosci teoretycznej) chronionego estru dwupep¬ tydowego. Temperatura topnienia 122—124°C. Rf7 0,2—0,3.C28H34O10N4 (586,588). 25 Etap 11: ASP(OBut) — ALA — GLU (25—27). 1,0 g (1,7 milimola) chronionego estru dwupepty¬ dowego, otrzymanego w etapie 10, uwodorniono w 15 ml metanu wobec palladu na weglu aktyw¬ nym. Wolny trójpeptyd wydziela sie az do momen- 30 tu zakonczenia reakcji. Produkt ten rozpuszczono ponownie w wodzie, nastepnie usunieto katalizator przez odsaczenie, przemyto i przesacz odparowano.Krystaliczna pozostalosc przekrystalizowano z mie¬ szaniny wody i acetonu. Otrzymano 0,40 g (74% 35 wydajnosci teoretycznej) wolnego trójpeptydu.Temperatura rozkladu 194°C.Rf1 0,10—0,15.Analiza: C13H2306N3 (317,38) Obliczono: C^, 20%, H 7,30%, N 13,24% 40 Otrzymano: C 49,4%, H 7,5%, N 13,3% Etap 12: Z — ASP(OBut — ALA — GLU — (25— 27) 0,9 g (2,85 milimola) wolnego trójpeptydu, otrzy¬ manego w etapie 11, rozpuszczono w 25 ml 5% roz¬ tworu wodoroweglanu sodu w temperaturze 0°C i w stanie ochlodzonym mieszajac dodano, krop¬ lami 0,64 ml (3 milimole) okolo 80% karbonyloben- zonooksychlorku. Mieszanine reakcyjna mieszano w temperaturze pokojowej do momentu kiedy nie wykrywano juz za pomoca analizy chromatogra¬ ficznej wolnego trójpeptydu (okolo 48 godzin). Na¬ stepnie roztwór wytrzasano z eterem etylowym i zakwaszano kwasem cytrynowym do pH = 3*.Wydzielony olej ekstrahowano octanem etylu, oczyszczony ekstrakt octano-etylowy przemyto wo¬ da, wysuszono i odparowano. Pozostalosc rozcien¬ czono eterem naftowym. Otrzymano 1,15 g (90% wydajnosci teoretycznej) bezpostaciowego, chronio- 60 nego trójpeptydu. Rf1 0,7—0,8 C21H2908N3 (451,46) Etap 13: Z — ASP(OBut) — ALA — GLU — (OBut) — ASP(OBut) — GLN — SER — ALA — GLU(OBut) -- ALA — FEN — PRO — LEU — « GLU(OBut) — FEN — OBut (25—39).79252 13 342 mg (0,76 milimola) chronionego trójpeptydu, otrzymanego w etapie 12, rozpuszczono w 5 ml dwumetyloformamidu, nastepnie dodano najpierw 0,106 (0,76 milimola) trójetyloaminy, potem w tem¬ peraturze — 10°C 0,76 ml (okolo 0,76 milimola) chloroweglanu etylu. Mieszanine mieszano w cia¬ gu 15 minut, nastepnie dodano roztwór 937 mg (0,75 milimola) chlorowodorku dodekapeptydu otrzymanego w etapie 7, po czym dodano kroplami *0,077 ml (0,55 milimola) trójtyloaminy w 2,8 ml dwumetyloformamidu. Mieszanine pozostawiono na noc w temperaturze pokojowej, nastepnie rozcien¬ czono woda, wytracony osad oddzielono, przemyto woda, wysuszono i nastepnie przemyto eterem ety¬ lowym. Otrzymany surowy produkt ponownie wy¬ tracono z mieszaniny 45 ml metanolu i 10 ml wody, odsaczono i wysuszono. Otrzymano 805 mg (70% wy¬ dajnosci teoretycznej) chronionego pentadekapepty- du: Rf4 0,18—0,23; Hf* 0,65—0,70. C1wH1540joNi6 (2096,39).Etap 14: H — ARG(N02) — ARG(N02) — PRO — OH. HBr (17—19). 6.5 g chronionego trójpeptydu Z — Arg(N02) — ARG(N02) — PRO — OH — (patrz K. Sturm, R.Geiger, W. Siedel, Ber. 96, 609 (1963) rozpuszczono w 25 ml lodowatego kwasu octowego, dodano 25 ml 4 normalnego roztworu kwasu bromowodo- rowego w lodowatym kwasie octowym i pozosta¬ wiono. Po zakonczeniu burzliwej reakcji wytraco¬ no bromowodorek trójpeptydu przez dodanie 200 ml eteru etylowego. Nastepnie eter zdekan- towano, osad w ten sam sposób przemyto eterem etylowym, potem izopropanolem, odsaczono, jeszcze raz przemyto na filtrze izopropanolem i wysuszo¬ no. Otrzymano 5,4'g (90°/o wydajnosci teoretycznej) brornowodorku trójpeptydu; Rf1 0,0 Rf H20 0,5— 0,6.Etap 15: Z — LIZ(OBC) — LIZ(BOC) — N2H3 (15—16). 8.6 estru dwupeptydowego Z — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — OMe (patrz: R. Schwyzer i W. Rit- tel: Helv. Chim. Acta 44, 159 (1961) rozpuszczo¬ no w 15 ml goracego metanolu, dodano 6 ml 73°/o wodzianu hydrazyny i gotowano w ciagu 4 godzin pod chlodnica zwrotna. Po zakonczeniu reakcji roz¬ twór zatezono, krystaliczna pozostalosc wymiesza¬ no z woda i wysuszono. Otrzymano 7,8 g (90°/o wydajnosci teoretycznej) krystalicznego, chronio¬ nego hydrazydu dwupeptydu. Temperatura topnie¬ nia 126—128°C. Rf4 0,50—0,60 (dla estru 1,0).Analiza: C30H50O8N6 (622,75) Obliczono: N 13,5% Otrzymano: N 13,5°/o Etap 16: Z -- LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG(NO,) — ARG(N02) — PRO — OH (15—19). 7,8 g hydrazydu dwupeptydu Z — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — N2H3, otrzymanego w etapie 15, roz¬ puszczono w 125 ml dwumetyloformamidu, po czym w temperaturze okolo —10°C dodano 50 ml 0,5 normalnego roztworu kwasu solnego, a nastep¬ nie 12,5 ml 1 normalnego roztworu azotynu sodu.Mieszanine mieszano w ciagu 15 miut w tempera- 14 turze okolo —10°C, nastepnie zobojetniono 1,0 ml trójetyloaminy i rozcienczono dodajac 250 ml ozie¬ bionego chloroformu i 250 ml wody. Po oddziele¬ niu warstwy chloroformowej, warstwe wodna po- 5 nownie przemyto chloroformem. Polaczone roztwo¬ ry chloroformowe przemyto zimna woda i wysu¬ szono nad bezwodnym siarczanem magnezu. Otrzy¬ many roztwór azydku w chloroformie dodano do roztworu powstalego przez rozpuszczanie 7,5 g wo- 10 dorobromku trójpeptydu, otrzymanego w etapie 14, w 17 ml dwumetyloformamidu z dodatkiem 4,62 ml trójetyloaminy. Chloroform oddestylowano z mie¬ szaniny pod próznia, a pozostala mieszanine reak¬ cyjna pozostawiono na 2 dni w temperaturze po- 15 kojowej. Nastepnie dwumetyloformamid oddesty¬ lowano a pozostalosc rozdzielono metoda chroma¬ tograficzna za pomoca mieszaniny octanu etylu, pirydyny, kwasu octowego i wody (60 : 10 : 3 : 5,5) w kolumnie zawierajacej 250 g zelu krzemionko- 20 wego. Frakcje zawierajace czysty, chroniony pie- ciopeptyd zebrano, odparowano i rozcienczono w temperaturze 0°C 1 normalnym kwasem solnym i woda. Ciecze stosowane do przemywania usuwa¬ no przez dekantowanie. Otrzymany jako pozosta- 25 losc gesty olej, rozpuszczono w chloroformie, roz¬ twór wysuszono nad bezwodnym siarczanem mag¬ nezu, przesaczono i odparowano. Po rozcienczeniu pozostalosci z odparowania eterem etylowym otrzymano 5,1 g (42% wydajnosci teoretycznej) 30 chronionego pieciopeptydu.Rfi 0,45—0,55; D20 = —19° (C = 1, w metanolu).Analiza: C47H77061N15 (1108,21) Obliczono: C 51,6%, H 6,95%, N 18,9% Otrzymano: C 51,5%, H 7,0%, N 19,0% 35 Etap 17: a) Z — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG (N02) — ARG(N02) — PRO — ONP 15^19), (NP = p-nitrofenyl). 0,65 g chronionego pieciopeptydu, otrzymanego w etapie 16, rozpuszczono w 3,0 ml dwumetylofor¬ mamidu, do roztworu dodano najpierw 0,082 ml trójetyloaminy, nastepnie w temperaturze — 10°C dodano 0,059 ml chloroweglanu etylu. Mieszanine chlodzono w ciagu 10 minut, nastepnie dodano 0,24 g p-nitrofenolu i pozostawiono na noc w tem¬ peraturze pokojowej. Nastepnie dwumetyloforma¬ mid oddestylowano a pozostalosc rozdzielono meto¬ da chromatograficzna za pomoca mieszaniny chlo¬ roformu i metanolu (9:1) w kolumnie zawieraja¬ cej 14 g zelu krzemiankowego. Frakcje zawierajace produkt glówny zebrano razem, odparowano a po¬ zostalosc rozcienczono eterem etylowym. Otrzyma¬ no 0,47 g (65% wydajnosci teoretycznej) chronio¬ nego estru p-nitrofenylowego pieciopeptydu. Rf4 0,3—0,4: 55 [«]D20.= -20° (C = 1, w metanolu) Analiza: C53H80O18N16 (1229,30) Obliczono: N 18,2%; Otrzymano: N 18,1%. 60 b) Z — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG(N02) — ARG(N02) — PRO — OPCP (15—19) (PCP = pie- ciochlorofenyl-). 1,62 g chronionego pieciopeptydu, otrzymanego w etapie 16, 0,45 g pieciochlorofenolu i 0,4 g dwu- 65 cykloheksylokarbodwuimidu rozpuszczono w 4,0 ml 4579252 15 dwumetyloformamidu. Mieszanine pozostawiono na noc, nastepnie wytracony dwucykloheksylomocz- nik usunieto przez odsaczenie. Z przesaczu odpa¬ rowano dwumetyloformamid, pozostalosc rozcien¬ czono eterem etylowym i rozpuszczono w 1 ml mieszaniny chloroformu, acetonu i wody (40 : 40 : 1), nastepnie rozdzielono metoda chromatograficzna za pomoca mieszaniny chloroformu, acetonu i wody w kolumnie zawierajacej 50 g zelu krzemionko¬ wego. Frakcje zawierajace aktywny ester w czy- stej^postaci zebrano razem, odparowano a pozo¬ stalosc rozcienczono eterem etylowym. Otrzymano 1,4 g (70% wydajnosci teoretycznej) chronionego estru pieciopeptydowego. Rf4 0,55—065. Rf w ukla¬ dzie chloroform—aceton—woda (40 : 40 : 10) 0,45— 0,55.Analiza: C53H76016N15Cl5 (1356,54) Obliczono: N 15,4%, Cl 13,05%; Otrzymano: N 15,35%, Cl 13,1% Etap 18: Z — TYR(But) — OSu (23) (Su oznacza reszte bursztynylowa).Z 175 g drobno sproszkowanej soli dwucyklohek- syloamonowej Z — TYR(But) — OH sporzadzono zawiesine w 1 litrze eteru etylowego i po dodaniu roztworu 17,5 ml stezonego kwasu solnego w 1250 ml wody, wytrzasano do calkowitego rozpuszcze¬ nia. Roztwór eterowy nastepnie wysuszono i od¬ parowano. Otrzymany jako pozostalosc olej roz¬ puszczono w 625 ml bezwodnego dioksanu, do roz¬ tworu dodano 33,25 g imidu N-hydroksyburszty- nowego i 65,7 g dwucykloheksylokarboimidu przy jednoczesnym oziebieniu lodem. Mieszanine pozo¬ stawiono na noc w temperaturze pokojowej. Wy¬ tracony dwucyklóheksylomocznik usunieto przez odsaczenie, dioksan oddestylowano pod próznia a otrzymany jako pozostalosc olej rozcienczono eterem naftowym. Po przekrystalizowaniu surowe¬ go produktu z 180 ml metanolu otrzymano 80 g (54% wydajnosci teoretycznej) aktywnego estru.Temperatura topnienia 118—120°C.Etap 19: H — TYR(But) — PRO — OH (23—24). 160 g aktywnego estru Z — TYR(But) — OSu.Rozpuszczono w 2 litrach bezwodnego dioksanu, roztwór ten polaczono z roztworem 50,3 g proli- ny i 36,7 g wodoroweglanu sodu w 1,5 litra wody i mieszano w ciagu 2 godzin, w temperaturze po¬ kojowej. Nastepnie mieszanine zatezono pod próz¬ nia do objetosci okolo 1 litra, pozostalosc rozcien¬ czono 600 ml. wody i wytrzasano z 1 litrem octanu etylu. Oddzielony roztwór w octanie etylu prze¬ myto najpierw 8% roztworem wodoroweglanu so¬ du potem woda. Polaczone roztwory wodne za¬ kwaszono kwasem cytrynowym do pH = 3, a wy¬ dzielony olej ekstrahowano octanem etylu. Roz¬ twór w octanie etylu wysuszono i odparowano pod próznia. Otrzymany jako pozostalosc surowy kar- bonylobenzylodwupeptyd rozpuszczono w 2,5 litrze etanolu i poddano wodorolizie wobec palladu na weglu aktywnym. Po odsaczeniu katalizatora roz¬ twór odparowano pod próznia. Otrzymano jako pozostalosc 90—95 g (79,83% wydajnosci teoretycz¬ nej) bezpostaciowego dwupeptydu, który nastepnie przekrystalizowano z wody. 16 Etap 20: H — WAL — TYR(But) — PRO — OH (22—24) 21.5 g dwupeptydu H — TYR(But) — PRO — OH, otrzymanego w etapie 19 i 9,05 ml trójety- loaminy rozpuszczono w 250 ml bezwodnego diok¬ sanu, nastepnie do roztworu dodano, 17,9 g aktyw¬ nego estru waliny Z — WAL — OSu. Mieszanine pozostawiono do nastepnego dnia w temperaturze pokojowej, nastepnie odparowano pod próznia 10 a pozostalosc rozpuszczono w mieszaninie 300 ml 8% wodnego roztworu wodoroweglanu sodu i 15fr ml eteru etylowego. Warstwe wodna oddzielono, zakwaszono kwasem cytrynowym pH = 3 a wy¬ dzielony olej ekstrahowano chloroformem. Ekstrakt 15 chloroformowy wysuszono i odparowano. Otrzyma¬ ny jako pozostalosc surowy karbonylobenzyloksy- trójpeptyd rozpuszczono w 250 ml 80% kwTasu octowego i poddano wodorolizie wobec palladu na weglu aktywnym. Po odsaczeniu katalizatora i od- 20 destylowaniu rozpuszczalnika, surowy trójpeptyd, otrzymany jako pozostalosc, przekrystalizowano z 1,1 litra bezwodnego metanolu. Otrzymano ogó¬ lem 13,7 g (62% wydajnosci teoretycznej) wolnego trójpeptydu; temperatura topnienia 134—136°C. 25 c Etap 21: Z — LIZ(BOC) — OSu (21) 67,3 g Z — LIZ(BOC) — OH rozpuszczono w 300 ml bezwodnego dioksanu po czym, do roztworu oziebionego lodem, dodano 20,4 imidu N-hydroksy- 30 bursztynowego oraz 37,0 g dwucykloheksylo kar- bodwuimidu. Mieszanine oziebiono w ciagu godzi¬ ny, nastepnie pozostawiono w ciagu 3 godzin w temperaturze pokojowej. Wytracony dwucyklohek- sylo-mocznik odsaczono i przesacz odparowane 35 Otrzymany jako pozostalosc surowy produkt prze¬ krystalizowano z mieszaniny 350 ml bezwodnego benzenu i 250 ml eteru naftowego. Otrzymano 59 g (70% wydajnosci teoretycznej) aktywnego estru.Temperatura topnienia 93—96°C. 40 Etap 22: H — LIZ(BOC) — WAL — TYR(But) — PRO — OH (21—24). 53.6 trójpeptydu WAL—TYR — (But) — PRO — OH, otrzymanego w etapie 20, oraz 17,2 g trójety- 45 loaminy rozpuszczono w 600 ml dioksanu, nastep¬ nie do roztworu dodano 59,1 g aktywnego estru li¬ zyny Z — LIZ(BOC) — OSu. Mieszanine reakcyj¬ na pozostawiono na okres 2 dni w temperaturze po¬ kojowej, nastepnie odparowano pod próznia, po- so zostalosc rozpuszczono w 800 ml octanu etylu.Roztwór wytrzasano z woda, nastepnie z 16% roz¬ tworem kwasu cytrynowego i w koncu ponownie z woda. Roztwór w octanie etylu po wysuszeniu odparowano pod próznia, pozostalosc rozpuszczo- 55 no w 1 litrze 80% kwTasu octowego i poddano wo¬ dorolizie wobec palladu na weglu aktywnym. Po odsaczeniu katalizatora i odparowaniu rozpuszczal¬ nika otrzymany surowy produkt przekrystalizo¬ wano z 4,2 litra bezwodnego metanolu. X)trzyma- 60 no ogólem 59,5 g (73% wydajnosci teoretycznej) trójpeptydu. Temperatura topnienia 192—193°C.Etap 23: Z — WAL — LIZ(BOC) — WAL — TYR (But) — PRO — OH (20—24). 65 w 410 ml bezwodnego dwumetyloformamidu roz-79252 17 puszczono przy jednoczesnym wytrzasaniu 41,0 g eteropeptydu H — LIZ(BOC) — WAL — TYR(But) — PRO — OH, otrzymanego w etapie 22, oraz 8,6 ml trójetyloaminy, nastepnie dodano 21,5 g aktywnego estru wyliny Z — WAL — OSu. Mie¬ szanine reakcyjna pozostawiono do nastepnego dnia w temperaturze pokojowej, po czym odparo¬ wano pod próznia, pozostalosc rozpuszczono w 800 ml chloroformu. Nastepnie roztwór wytrzasano z 10% roztworem kwasu cytrynowego a potem z woda, po wysuszeniu chloroform oddestylowano.Po rozcienczeniu pozostalosci eterem naftowym otrzymano 51,0 g (93% wydajnosci teoretycznej) chronionego pieciopeptydu. Temperatura topnienia 123—126°C.Etap 24: H — WAL — LIZ(BOC) — WAL — TYR(But) — PRO — OH (20—24). 1,4 g (1,565 milimola) chronionego pieciopepty¬ du, otrzymanego w etapie 23, rozpuszczono w 30 ml 80% kwasu solnego i poddano wodorolizie wo¬ bec palladu na weglu aktywnym. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsaczono i przesacz odparowa¬ no. Do pozostalosci po odparowaniu dodano 10 ml metanolu i pozostawiono do wykrystalizowania.Otrzymane krysztaly odsaczono i przemyto zim¬ nym metanolem. Otrzymano 0,785 g (66% wydaj¬ nosci teoretycznej) wolnego pieciopeptydu. Tempe¬ ratura topnienia 202—205°C.C39H6409N6 (760,95).Etap 25: Z — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG (N02) — ARG(N02) — PRO — WAL — LIZ (BOC) — WAL — TYR(But) — PRO (15—24). 481 mg (0,63 milimola) pieoiopeiptydu, otrzyma¬ nego w etapie 24, 841 mg (0,62 milimola) chronio¬ nego aktywnego estru pieciopeptydu Z — LIZ (BOC) — LIZ (BOC) — ARG(N02) — ARG(N02) —PRO — ONP, otrzymanego w etapie 17, oraz 0,088 ml (0,63 milimola) trójetyloaminy rozpusz¬ czono w 3 ml dwumetyloformaimiidu w 5i0°C. Mie¬ szanine reakcyjna pozostawiono na przeciag 8 go¬ dzin, nastepnie produkt wytracono eterem etylo¬ wym, rozcienczono roztworem kwasu cytrynowego i wysuszono. Surowy produkt oczyszczono metoda chromatograficzna za pomoca mieszaniny octanu etylu — pirydyny — kwasu octowego — wody 60: 10:3:5,5 w kolumnie z zelem krzemionkowym.Otrzymano 848 mg (74% wydajnosci teoretycznej) chronionego dekapeptydu. Temperatura topnienia 167—170)°C.Rf2 0,30—0,36; Rf10 0,10—0,18 C88H139024N21 (1851,14) Etap 26: Z — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG(N02) — ARG(N02) — PRO — WAL — LIZ (BOC) — WAL — TYR(But) — PRO — OPCP (15—24) 841 mg (0,453 milimola) chronionego dekapepty- du, otrzymanego w etapie 25, i 145 mg (0,545 milimo¬ la) pieciochlorofenolu rozpuszczono w 2,0 ml dwu- metyloformamidu, do oziebionego lodem roztworu dodano 144 mg (0,695 milimola) dwucykloheksylo- karbodwuimidu. Mieszanine reakcyjna pozostawio¬ no na okres 2 dni, nastepnie wytracony mocznik odsaczono, przemyto dwumetyloformamidem, po- 18 laczone roztwory w dwumetyloformamidzie odpa¬ rowano i nastepnie stezony roztwór acetonowy po¬ zostalosci przeniesione do kolumny z zelem krze¬ mionkowym. Kolumne eluowano acetonem, przy 5 czym nie przereagowany kwas pozostal zwiazany w kolumnie. Otrzymany acetonowy roztwór estru odparowano, pozostalosc rozcienczono eterem ety¬ lowym, przemyto i wysuszono. Otrzymano 704 mg (74% wydajnosci teoretycznej) chronionego aktyw- 10 nego estru dodekapeptydu.Rf2 0,80—0,87; Rf12 0,24—0,33; Rf10 0,79—0,86 C92H138024N21C15 (2099,48).Etap 27: LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG — ARG — 15 PRO — WAL — LIZ(BOC) — WAL — TYR(But) — PRO — ASP(OBut) — ALA — GLI — GLUi(OBut) — ASP(OBu*) — GLN — SER — ALA — GLU(OBut) — ALA/— FEN — PRO — LEU — GLU 20 (OBut) — FEN — OBut. (15—39). 600 mg (0,286 milimola) chronionego pentadeka- peptydu, otrzymanego w etapie 13, uwodorniano w 20 ml kwasu octowego wobec palladu na we¬ glu aktywnym. Po zakonczeniu reakcji kataliza- 25 tor odsaczono, przesacz odparowano, pozostalosc rozcienczono eterem etylowym, przesaczono i wy¬ suszono. Otrzymano 490 mg (85% wydajnosci te¬ oretycznej) pentadekapeptydu z wolnym konco¬ wym N. 30 Rf1 0,50—0,55; Rf10 0,25—0,30.Produkt otrzymany w powyzszy sposób (0,242 milimola) oraz 515 mg (0,242 milimola) chronione¬ go aktywnego estru dekapeptydu, otrzymanego w etapie 26, rozpuszczono razem w 3,0 ml dwumety- 35 loformamidu i pozostawiono dla przereagowania na okres 48 godzin w temperaturze 50°C. Mieszanine reakcyjna rozcienczono eterem etylowym, nastep¬ nie surowy produkt wytracono trzykrotnie z 70% wodnego roztworu metanolu i w koncu rozcien- 40 czono eterem etylowym. Otrzymano 460 mg (50% wydajnosci teoretycznej) chronionego pentakoza- peptydu.Rf2 0,42—0,47; Rf10 0,55—0,60. 366 mg (0,00065 milimola) tego chronionego pen- 45 takozapeptydu uwodorniano w 100 ml 80% kwasu octowego wobec palladu na weglu aktywnym. Po zakonczeniu reakcji (co mozna poznac w ten spo¬ sób, ze na chromatogramie widac tylko plame Rf1 0,23—0,27) katalizator odsaczono i przesacz odpa- 50 rowano. Pozostalosc po odparowaniu oziebiono lo¬ dem, nastepnie rozcienczono 10 ml 0,1 normalnego kwasu solnego, po czym dodano 10 ml 15% roz¬ tworu chlorku sodu, przesaczono, przemyto zimna woda i wysuszono. Otrzymano 225 mg (63% wy- 55 dajnosci teoretycznej) trójchlorowodorku pentako- zapeptydu.Rf1 0,23—0,27; Rf7 0,34—0,40.C173H284045Ns5Cl3 (3679,65). 60 Etap 28: Z — TRY — GLI — LIZ(BOC) — PRO — WAL — GLI OEt (9—14). 4,95 g estru czteropeptydu Z — LIZ(BOC) — PRO — WAL — GLI — OEt (R. Schwytzer, W.Rittel: Helv. Chim. Acta 44, 159 (1961) rozpuszczo- 65 no w etanolu i poddano wodorolizie wobec palla-19 79252 20 du na weglu aktywnym w celu odszczepienia och¬ ronnych grup karbobenzoksy. Po zakonczeniu re¬ akcji katalizator odsaczono i przesacz odparowa¬ no. Otrzymany jako pozostalosc ester czteropep- tydu z wolnym koncowym N (Rf1 0,40—0,50) roz¬ puszczono w 7,5 ml dwumetyloformamidu, nastep¬ nie, dodano do roztworu mieszaniny bezwodnik, otrzymany w sposób opisany nizej. 2,95 g dwupeptydu Z — TRY — GLI — OH (K. Hofmann, M. E. Woolner, G. Spuhler i E. T.Schwarz: J. Am. Chem. Soc. 80, 1486 (1958) roz¬ puszczono w 7,5 ml dwumetyloformamidu, do roz¬ tworu dodano 1,05 ml trójetyloaminy a po oziebie¬ niu do temperatury ~10°C dodano jeszcze 0,99 ml chlóroweglanu izobutylu. Po 15 minutach miesza¬ nia,, otrzymany w ten sposób mieszany bezwodnik, dodano do wzmiankowanego wyzej roztworu estru czteropeptydu. Polaczone roztwory pozostawiono na noc, nastepnie odparowano a pozostalosc roz¬ puszczono w octanie etylu. Roztwór w octanie ety¬ lu przemyto w temperaturze 0°C rozcienczonym kwasem solnym, nastepnie woda, potem 10°/o roz¬ tworem wodoroweglanu sodu i w koncu ponow¬ nie woda. Roztwór wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i odparowano, pozostalosc roz¬ cienczono eterem etylowym, przesaczono i wysu¬ szono. Surowy, chroniony ester heksapeptydu roz¬ puszczono w bezwodnym octanie etylu przez go¬ towanie, nastepnie wytracony produkt po oziebie¬ niu roztworu odsaczono, przemyto zimnym, bez¬ wodnym octanem etylu i wysuszono [a]D20 = —50° (C = l, w etanolu. Rf12 0,13—0,22, Rf4 0,48—0,59.' Po solwolizie kwasem trójfluorooctowym: Rf1 0,44—0,50.Analiza: C^wOuNg (905,04) Obliczono: C 61,05%, H 7,13%, N 12,4% Otrzymano: C 61,05%, H 7,35%, N 12,4% Etap 29: Z — ARG — TRY— GLI —LIZ(BOC) — PRO —WAL—GLY—OEt. HC1 (8—14). 3,5 g chronionego estru heksapeptydowego, otrzymanego w etapie 28, poddano wodorolizie w roztworze etanolowym, wobec palladu na weglu Aktywnym, w celu odszczepienia ochronnych grup karbobenzoksy. Po zakonczeniu reakcji kataliza¬ tor odsaczono przesacz odparowano. Otrzymany, jako pozostalosc, olej (Rf1 = 0,54—0,64) oraz 1,33 g chlorowodorku karbobenzoksy — 1 argininy roz¬ puszczono w mieszaninie 3,9 ml pirydyny i 3,9 ml dwumetyloformamidu. Do roztworu dodano 1,2 dwucykloheksylokarbodwuimidiu i pozostawiono na okres 2 dni w temperaturze pokojowej. Po zakon¬ czeniu reakcji dwucykloheksylomocznik odsaczono, przesacz odparowano, pozostalosc rozpuszczono w chloroformie. Roztwór przemyto w temperaturze 0°C rozcienczonym kwasem solnym, nastepnie wo¬ da, wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i odparowano. Pozostalosc po odparowaniu roz¬ puszczono ponownie w chloroformie i wytracono przez dodanie eteru etylowego. Osad przesaczono, przemyto eterem etylowym i wysuszono. Otrzy¬ mano 3,0 g (84,5% wydajnosci teoretycznej) chro¬ nionego chlorowodorku estru heptapeptydu.Rfi 0,43—0,53; Rf10 0,1—0,25. MD20 = -41° C = 1, w^etanolu).Analiza: CsiH-rAaNuCl (1097,69) Obliczono: C 56,9%, H 7,1%, N 15,3%, Cl 3,25% Otrzymano: C 56,55%, H 7,1%, N 15,3%, Cl 2,9% 5 Etap 30: Z — ARG — TRY — GLI — LIZ(BOC) — PRO — WAL — GLI — OH. HC1 (8—14). 9,9 g chronionego chlorowodorku estru hepta- peptydu, otrzymanego w etapie 29, rozpuszczono w metanolu, dodano 18 ml normalnego roztworu 10 wodorotlenku sodu, pozostawiono w ciagu 1 godzi¬ ny i nastepnie zobojetniono 1,08 ml lodowatego kwasu octowego. Roztwór odparowano a pozosta¬ losc rozdzielono metoda chromatograficzna za po¬ moca mieszaniny octanu etylu, pirydyny, kwasu 15 octowego i wody (60 : 20 : 6 :11) w kolumnie za¬ wierajacej 200 g zelu krzemionkowego (3 X 70).Frakcje zawierajace czysty produkt glówny zebra¬ no razem, odparowano a pozostalosc rozpuszczono w mieszaninie chloroformu butanolu (1 : 1), na- 20 stepnie przemyto 0,5 normalnym kwasem solnym w temperaturze 0°C, potem woda i wysuszono. Po odparowaniu rozpuszczalnika pozostalosc rozcien¬ czono eterem. Otrzymano 6,15 g (64% wydajnosci teoretycznej) chronionego chlorowodorku hepta- 25 peptydu. Rf1 0,14—0,20. ' [a]D2o = -29° (C = 1, w etanolu).Analiza: C5oH78012Ni2Cl (1069,64) Obliczono: C 56,14%, H 6,88%, N 15,72% Otrzymano: C 56,2%, H 7,0%, N 15,7% 30 Etap 31: H — ARG — TRY — GLI — LIZ(BOC) — PRO — WAL — GLI — OH. HC1 (8—14). 6,0 g chronionego chlorowodorku heksapeptydu, otrzymanego w etapie 30, rozpuszczono w etanolu 35 i uwodorniano wobec palladu na weglu aktyw¬ nym. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsaczo¬ no, roztwór odparowano i pozostalosc po odparo¬ waniu rozcienczono eterem etylowym. Otrzymano 4,25 g (81,5% wydajnosci teoretycznej) chlorowo- 40 dorku heptapeptydu.Rf1 0,04—0,014; Rf7 0,50—0,58. Po solwolizie kwa¬ sem trójfluorooctowym: Rf1 0,0; RF7 0,33—0,41 [a]D2c - -30° (C = 1, w etanolu).Analiza: C42HOT01oN12Cl (935,51) « Obliczono: N 17,97%, Cl 3,8%; Otrzymano: N 18,0%, Cl 3,7% Etap 32: Z — GLU(OBut) — HIS — FEN — OMe (5—7). 50 11,8 g chronionego dwupeptydu (St. Guttmann, R. A. Boissonnas: Helv. Chim. Acta 41, 1852 (1958) rozpuszczono w metanolowym roztworze 1,04 g kwasu solnego i poddano wodorolizie wobec palla¬ du na weglu aktywnym, w celu odszczepienia 55 ochronnych grup karbonylobenzenooksy-. Po za¬ konczeniu reakcji katalizator odsaczono, roztwór od¬ parowano i krystaliczna pozostalosc przekrystali- zowano z mieszaniny metanolu i eteru etylowe¬ go. Otrzymano 6,4 g (70% wydajnosci teoretycz- 60 nej) chlorowodorku estru dwupeptydu.Otrzymany produkt oraz 6,87 g estru y-III-rzed.- butylo-a-(p-nitrofenylowego) kwasu karbonyloben¬ zenooksy glutaminowego rozpuszczono w 90 ml dwumetyloformamidu, do roztworu dodano 2,6 ml 65 trójetyloaminy i pozostawiono na okres 2 dni79252 21 22 w temperaturze pokojowej. Mieszanine reakcyjna odparowano, pozostalosc rozpuszczono w miesza¬ ninie octanu etylu i wody. Warstwe wodna oddzie¬ lono a roztwór organiczny przemyto 5°/o wodnym roztworem trójetyloaminy, nastepnie woda, wysu¬ szono i odparowano. Pozostalosc po odparowaniu przekrystalizowano z mieszaniny metanolu i wody.Otrzymano 7,5 g (78% wydajnosci teoretycznej) chronionego estru trójpeptydu. Temperatura top¬ nienia 180—182°C.Etap 33: Z — GLU(OBut) — HIS — FEN — N2H8 (5-7). 12,7g chronionego estru trójpeptydu, otrzymane¬ go w etapie 32, rozpuszczono w metanolu, do roz¬ tworu dodano 3,2 ml 94% roztworu wodzianu hy¬ drazyny w temperaturze pokojowej i pozostawio¬ no na okres 3 dni w temperaturze pokojowej. Na¬ stepnie rozpuszczalnik odparowano a pozostalosc wysuszono w prózni nad stezonym kwasem siar¬ kowym. Otrzymany produkt w postaci piany prze¬ krystalizowano z mieszaniny etanolu i wody (1:1).Otrzymano hydrazyd trójpeptydu. Temperatura topnienia 209—210°C.Etap 34: Z — GLU(OBut) — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ(BOC) — PRO — WAL — GLI — OH (5—14). 3,2 g chronionego estru trójpeptydu, otrzymanego w etapie 33 rozpuszczono w 9,0 ml dwumetylofor- mamidu, do roztworu dodano najpierw, w tempe¬ raturze —30°, najpierw roztwór 720 mg chlorowo¬ doru w 10 ml czterowodorofuranu, nastepnie 0,84 ml azotynu izoamylowego a po 5 minutach mie¬ szania 4,0 ml trójetyloaminy. Nastepnie 5,4 g hep- tapeptydu, otrzymanego w etapie 31, w 12,0 ml dwumetyloformamidu dodano do roztworu azydu otrzymanego wyzej opisanym sposobem. Miesza¬ nine reakcyjna mieszano w ciagu godziny w tem¬ peraturze miedzy -10°C i -20°C, nastepnie po¬ zostawiono na noc w temperaturze 0°C. Po od¬ parowaniu mieszaniny reakcyjnej pozostalosc roz¬ cienczono woda, wysuszono i suchy, surowy pro¬ dukt oczyszczono chromatograficznie za pomoca mieszaniny octanu etylu, pirydyny, kwasu octo¬ wego i wody (60 : 20 : 6 : 11) w kolumnie zawiera¬ jacej 140 g zelu krzemionkowego. Frakcje zawie¬ rajace czysty produkt glówny zebrano, odparowa¬ no i .pozostalosc rozcienczono eterem etylowym.Otrzymano 4,0 g chronionego dekapeptydu Rf1 0,15—0,20.Etap 35: H — GLZ(OBut) — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ(BOC) — PRO — WAL — GLI — OH. HC1 (15—14). 3,5 g chronionego dekapeptydu otrzymanego w etapie 34, uwodorniono w roztworze 80 ml metano¬ lu, 10 ml wody i 1 ml lodowatego kwasu octowe¬ go wobec palladu na weglu aktywnym. Po zakon¬ czeniu reakcji katalizator odsaczono, przesacz od¬ parowano i pozostalosc po rozpuszczeniu w 10 ml metanolu wytracono przez dodanie 100 ml eteru etylowego. Osad odsaczono i wysuszono. Otrzyma¬ no 3,0 g (100% wydajnosci teoretycznej) wolnego dekapeptydu. Rf1 0,05—0,10.Etap 36: BOC — SER — TYR — SER — MET — GLU(OBut) — HIS — HEN — ARG — TRY — GLI — LIZ(BOC) — PRO — WAL — GLI — OH. HC1 (1—14). 3,1 g hydrazydu czteropeptydu BOC — SER — TYR — SER — MET — N2H, (B. Iselin, R.Schwyzer: Helv. Chim. Acta 44, 169 (1961) rozpusz¬ czono w 15 ml dwumetyloformamidu, do roztworu oziebionego do temperatury —30°C dodano 2,35 ml 6 normalnego kwasu solnego a nastepnie stezony wodny roztwór 410 mg azotynu sodu. Otrzymany w ten sposób roztwór azydku dodano natychmiast do oziebionego do temperatury — 20°C roztworu, 3,5 g dekapeptydu, otrzymanego w etapie 35, oraz 2,1 ml trójetyloaminy w 15 ml dwumetyloforma¬ midu. Mieszanine reakcyjna mieszano w ciagu 1 godziny w temperaturze od —10° do —20°C, na¬ stepnie pozostawiono na noc w temperaturze 0°C.Po odparowaniu mieszaniny reakcyjnej pozostalosc roztarto na proszek z woda i rozdzielono metoda chromatograficzna za pomoca mieszaniny octanu etylu, pirydyny, kwasu octowego i wody (60:20: : 6:11) w kolumnie zawierajacej 150 g zelu krze¬ mionkowego. Frakcje zawierajace produkt glówny w czystym stanie zebrano i odparowano. Pozosta¬ losc po doparowaniu rozpuszczono przez dodanie 1—2 g chlorowodorku pirydyny w 20—30 ml meta¬ nolu i roztwór zatezono. Produkt wytracono przez dodanie wody, roztarto na proszek, przesaczono, przemyto woda i wysuszono.Rf1 0,10—0,15.CsiH^OaNwSCl (1971,68).Analiza aminokwasów (w nawiasach podano wartosci teoretyczne: SER 1,95 (2), TYR 0,95 (1), MET 1,0 (1), GLU 1,0 (1), HIS 1,015 (1) 1, FEN 1,01 (1), ARG 0^95 (1), GLI 2,0 (2), LIZ 1,05 (1)1, PRO 0,95 (1), WAL 1,05 (1).Etap 37: BOC — SER — TYR — SER — MET — GLU(OBut) — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ(BOC) — PRO — WAL — GLI — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG — ARG — PRO — WAL — LIZ (BOC) — WAL — TYR(But) — PRO — ASP(OBut) — ALA — GLI — GLU(OBut) — ASP — (OBut) — GLN — SER — ALA — GLU{OBut) — ALA — FEN — PRO — LEU — GLU(OBut) — FEN — OBut. 3 HCOOH (1—39). 202 mg (0,055 milimola) trójchlorowodorku pen- takozapeptydu, otrzymanego w etapie 23, 118 g (0,060 milimola) chronionego tetradekapeptydu, otrzymanego w etapie 36, 38 mg (0,144 milimola) pieciochlorofenolu i 30 mg (0,145 milimola) dwu- cyklohesylokarbodwuimidu rozpuszczono w 0,6 ml dwumetyloformamidu, który zawieral 0,077 ml (0,055 milimola) trójetyloaminy. Mieszanine reak¬ cyjna pozostawiono w temperaturze pokojowej na okres 4 dni, nastepnie rozcienczono eterem etylo¬ wym nie zawierajacym nadtlenku i wysuszono. Su¬ rowy produkt, otrzymany w ten sposób rozdzielono w kolumnie chromatograficznej z zelem krzemion¬ kowym stosujac mieszanine octanu etylu, pirydyny kwasu mrówkowego i wody. Frakcje zawierajace produkt glówny w czystym stanie zebrano razem, 10 15 20 25 30 35 40 \ 45 50 55 6023 79252 24 odparowano a pozostalosc roztarto z eterem etylo¬ wym wolnym od nadtlenków. Frakcje zawierajace produkt glówny razem z innymi substancjami rów¬ niez zebrano razem i z nich otrzymano za pomoca chromatografii dalsze ilosci pozadanego produktu. 5 W ten sposób otrzymano razem 136 mg (44% wy¬ dajnosci teoretycznej) chronionego nonatriakonta- peptydu.Rf7 0,31—0,37.C2ttH4i6073N57S (5622,54). 10 Etap 38: SER — TYR — SER — MET — GLU — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ — PRO — WAL — GLI — LIZ — LIZ — ARG — ARG — PRO — WAL — 15 LIZ — WAL — TYR — PRO — ASP — ALA — GLI — GLU — ASP — GLN — SER — ALA — GLU — ALA — FEN — PRO — LEU — GLU — FEN (anACTH). 100 mg chronionego nonatriakontapeptydu, otrzy- 2o mariego w etapie 37 rozpuszczono w 2 ml kwasu trójfluorooctowego, roztwór pozostawiono przez 15 minut i nastepnie odparowano pod próznia. Roz¬ puszczanie w wodzie i odparowanie powtórzono, po czym pozostalosc rozpuszczono w 5 ml wody 25 i roztwór przepuszczono przez kolumne jonowy¬ mienna z zywica Amberlite IRA — 400 (w cyklu octanowym) po czym kolumne przemyto 20 ml wo¬ dy. Polaczone roztwory wodne poddano liofiliza¬ cji. Jako liofilizat otrzymano 80 ml (okolo 80% 30 wydajnosci teoretycznej) wolnego nonatriakonta¬ peptydu, identycznego z ludzka kortykotropina.Rf6 0,23^0,3)0.Analiza aminokwasów: ASP 1,8 (2), SER 2,7 (3), GLU 4,5 (5), PRO 3,8 (4), GLI 2,9 (3), ALA 3,0 (3), 35 LEU 1,0 (1), WAL 2,9 (3), MET 0,95 (1), TYR 1,9 (2), FEN 3,0 (3), HIS 0 (1), LIZ 3,8 (4), ARG 2,8 (3), TYR: TRY 2,2 (2).Przyklad II. Modyfikacja sposobu wytwarza¬ nia ludzkiej kortykotropiny. 40 Etap 1: Z — WAL — LIZ(BOC) — WAL — TYR (But) — PRO — OSu (20—24). '51,5 g pieciopeptydu Z — WAL — LIZ(BOC) — WAL — TYR(But) — PRO — OH otrzymanego w ^ etapie 23 w przykladzie I, oraz 13,2 g imidu N- -hydroksybursztynowego rozpuszczono w 400 ml bezwodnego dioksanu, nastepnie do roztworu ozie¬ bionego lodem dodano 12,1 g dwucykloheksylokar- bodwuimidu. Mieszanine oziebiono w ciagu pól go¬ dziny po czym zostawiono do nastepnego dnia w temperaturze pokojowej. Po odparowaniu miesza¬ niny reakcyjnej w prózni, pozostalosc rozpuszczo¬ no w 1 litrze octanu etylu, po czym roztwór prze¬ myto trzykrotnie, za kazdym razem 300 ml 2°/o roztworu wodoroweglanu sodu. Po wysuszeniu z fazy organicznej oddestylowano octan etylu pod próznia, pozostolosc rozcienczono bezwodnym ete¬ rem etylowym, przesaczono i wysuszono w prózni nad pieciotlenkiem fosforu. Otrzymano 49,0 g (86°/o wydajnosci teoretycznej) aktywnego estru piecio¬ peptydu. Temperatura topnienia 171—173°C.Etap 2: Z — WAL — LIZ(BOC) — WAL — TYR (But) _ pro — ASP(OBut) — ALA — GLI — OH (20—27). 65 Z 130 mg drobno sproszkowanego trójpeptydu H — ASP(OBut) — ALA — GLI — OH, otrzyma¬ nego w etapie 11 w przykladzie I, sporzadzono za¬ wiesine w 3,6 ml bezwodnego dwumetyloformami- du, zawierajacego równiez 36 mg trójetyloaminy.Do zawiesiny dodano podczas mieszania, 365 mg aktywnego estru pentapeptydu Z — WAL — LIZ (BOC) — WAL — TYR(But) — PRO — OSu, otrzymanego w etapie 1 w przykladzie II, miesza¬ nine mieszano w ciagu 12 godzin w temperaturze pokojowej, przy czym trójpeptyd powoli rozpusz¬ czal sie. Mieszanine pozostawiono nastepnie na okres 36 godzin, po czym- odparowano do sucha w prózni. Pozostalosc rozpuszczono w 3 ml miesza¬ niny octanu etylu, pirydyny, kwasu octowego i wo¬ dy 120 : 20 : 6 : 11 i rozdzielono w kolumnie chro¬ matograficznej 20X250 mm, wypelnionej zelem krzemionkowym, po czym eluowano te sama mie¬ szanine rozpuszczalników. Frakcje zawierajace czy¬ sty produkt zebrano razem, odparowano pod próz¬ nia a pozostalosc roztarto z woda na proszek. Po wysuszeniu w eksykatorze nad pieciotlenkiem fos¬ foru otrzymano 304 mg (70% wydajnosci teore¬ tycznej) chronionego oktapeptydu.Rf2 0,50—0,55; Rf11 0,55—0,60.C60H91O16N9 (1194,45).Etap 3: Z — WAL — LIZ(BOC) — TYR(But) — PRO — ASP(OBut) — ALA — GLI — GLU(OBut) — ASP(OBut) — GLN — SER — ALA — GLU(OBut) — ALA — FEN — PRO — LEU — GLU(OBut) — FEN — OBut (20—39). 120 mg (0,1 milimola) chronionego oktapeptydu, otrzymanego w etapie 2 w przykladzie II, roz¬ puszczono w 2 ml bezwodnego dioksanu, nastepnie dodano 23 mg (0,2 milimola) imidu N-hydroksybur- sztynowego a potem 25 mg (0,12 milimola) dwu- cykloheksylo karbodwuimidu. Mieszanine pozosta¬ wiono na okres 24 godzin w temperaturze pokojo¬ wej po czym wytracony dwucykloheksylomocznik odsaczono a przesacz odparowano. Produkt wyka¬ zal, przy badaniu metoda chromatografii cienko¬ warstwowej, nie wiecej niz 5% zawartosci nieprze- reagowanego, wyjsciowego oktapeptydu; Rf6 otrzy¬ manego, aktywnego estru oktapeptydu: 0,85—0,95.Aktywny ester oktapeptydu, otrzymany w po¬ wyzszy sposób, rozpuszczono bez dalszego oczysz¬ czania w 1 ml dwumetyloformamidu, nastepnie w roztworze tym rozpuszczono 170 mg (0,1 milimola) chlorowodorku dodekapeptydu, otrzymanego w eta¬ pie 7 w przykladzie I, po czym dodano roztwór 30 mg (0,3 milimola) trójetyloaminy w 0,5 ml dwu¬ metyloformamidu. Mieszanine pozostawiono ha okres 2 dni w temperaturze pokojowej, po czym rozpuszczalnik oddestylowano pod próznia, pozosta¬ losc rozcienczono woda, odsaczono i wysuszono w eksykatorze. Otrzymano 222 mg trudno rozpusz¬ czalnego ikozapeptydu. W produkcie nie wykryto stosowanego jako substancje wyjsciowa, aktywne¬ go estru ani odpowiedniego, wolnego kwasu, jak równiez nie wykryto zanieczyszczen reagujacych dodatnio z ndnhydryna. Metoda chromatografii cienkowarstwowej otrzymano: w 90% kwasie octo¬ wym: Rf 0,75—0,85.Ci42H2i6038N22 (2839,03).79252 25 26 Etap 4: H — WAL — LIZ(BOC) — WAL — TYR (But) — PRO — ASP(OBut) — ALA — GLU(OBut) — ASP(OBut) — GLN — SER — ALA — GLU(OBut) — ALA — FEN — PRO — LEU — GLU(OBut) — FEN — OBut (20—39). 100 mg chronionego ikozapeptydu, otrzymanego w etapie 3, rozpuszczono w 10 ml 80°/o kwasu oc¬ towego i uwodorniano wobec 70 mg, 10% palladu na weglu aktywnym w ciagu 3 godzin. Po od¬ saczeniu katalizatora przesacz odparowano pod próznia a pozostalosc wysuszono w eksykatorze nad wodorotlenkiem sodu. Otrzymano 90 mg wol¬ nego estru ikozapeptydu w postaci szklistych, amorficznych lusek. Produkt byl jednolity chroma¬ tograficznie i wykazywal slaba, dodatnia reakcje na ninhydryne; nie zawieral chronionego ikozapep¬ tydu. Rf1 0,76—0,84; Rfn 0,47—0,53.CuAioOsaNa (2704,90).Etap 5: Z — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG(N02) — ARG(N02) — PRO — WAL — LIZ (BOC) — WAL — TYR(But) — PRO — ASP(OBut) — ALA — GLI — GLU(OBut) — ASP(OBut) — GLU — SER — ALA — GLU(OBut) — ALA — FEN — PRO — LEU — GLU(OBut) — FEN — OBut (15— 39). 90 mg ikozapeptydu otrzymanego w etapie 4 rozpuszczono w 1,0 ml dwumetyloformamidu, za¬ wierajacego 6 mg trójetyloaminy. Do roztworu do¬ dano 45 mg chronionego estru pieciochlorofenylo- wego pieciopeptydu, otrzymanego w etapie 17/b w przykladzie I, i pozostawiono na okres 3 dni w temperaturze pokojowej. Nastepnie rozpuszczalnik odparowano pod próznia i otrzymany, jako pozo¬ stalosc, produkt oczyszczono od nieprzereagowane- go ikozapeptydu oraz od malej ilosci aktywnego estru pieciopeptydu w kolumnie chromatograficz¬ nej z zelem krzemionkowym stosujac nastepujacy uklad rozpuszczalników: octan etylu — pirydy¬ na — lodowaty kwas octowy — woda 120 : 20 : 6 : : 11 lub chloroform — metanol 80 : 20).Otrzymano If4 mg (40% wydajnosci teoretycz¬ nej) chronionego estru pentakozapeptydu. Rf2 0,42—0,47. Rf10 0,55—0,60. Produkt ten mozna uwol¬ nic od grup ochronnych w sposób opisany w eta¬ pie 27 w przykladzie I i stosowac w reakcji sprze¬ gania z chronionym tetradekapeptydem (1—14) wedlug etapu 37 w przykladzie I.Przyklad III. Sposób wytwarzania fragmen¬ tu kortykotropiny (1—14) H — SER — TYR — SER — MET — GLU — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ — PRO — WAL — GLI — OH. 200 mg chronionego tetradekapeptydu, otrzyma¬ nego w etapie 36 w przykladzie I, rozpuszczono w 5,0 ml kwasu trójflourooctowego, zawierajace¬ go 0,02% merkaptoetanolu. Roztwór odparowano po 20 minutach w prózni, pozostalosc rozpuszczono w 5 ml wody i przeniesiono do kolumny zawie¬ rajacej 5 ml zywicy jonowymiennej Amberlite IRA — 410* (w cyklu octanowym) i eluowano 5X X3 ml wody. Polaczone roztwory wodne poddano liofilizacji. Otrzymano 180 mg wolnego tetradeka¬ peptydu. Rf6 0,45—0,50. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Analiza aminokwasów: SER 1,95 (2), TYR 0,95 (1), MET 1,0 (1), GLU 1,0 (1), HIS 1,05 (1), FEN 1,0 (1), ARG 0,95 (1), GLI 2,0 (2), LIZ 1,05 (1), PRO 0,95 (1), WAL 1,05 (1).Przyklad IV. Sposób wytwarzania fragmen¬ tu kortykotropiny (1—14 — amid).Etap 1: BOC — SER — TYR — SER — MET — GLU(OBut) — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ(BOC) — PRO — WAL — GLI — NH2-HC1. 197 mg chronionego chlorowodorku tetradeka¬ peptydu, otrzymanego w etapie 36 w przykladzie I, rozpuszczono w 0,5 ml dwumetyloformamidu, za¬ wierajacego 5 mg amoniaku, nastepnie dodano 60 mg dwucykloheksylo karbodwuimidu i pozostawio¬ no na noc w temperaturze pokojowej. Nastepnego dnia powtórzono w ten sam sposób dodawanie amoniaku po czym do mieszaniny reakcyjnej do¬ dano dalsze 60 mg dwucykloheksylo karbodwuimi¬ du. Po 2 dniach roztwór rozcienczono eterem ety¬ lowym nie zawierajacym nadtlenków, wytracony produkt odsaczono i oczyszczono w kolumnie chro¬ matograficznej, zawierajacej zel krzemionkowy, stosujac nastepujacy uklad rozpuszczalników: octan etylu — pirydyna — kwas octowy — woda 60 : 20 : 6 : 11. Otrzymano 150 mg (75% wydajnosci teoretycznej) chronionego amidu tetradekapeptydu.Rf1 0,20—0,25.Etap 2: H — SER — TYR — SER — MET — GLU — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ — PRO — WAL — GLI — NH2 (1—14) Ze 100 mg amidu tetradekapeptydu, otrzymanego w etapie 1, usunieto grupy ochronne w sposób po¬ dany w przykladzie III. Otrzymano 60 mg (70% wydajnosci teoretycznej) wolnego amidu tetrade¬ kapeptydu. Rf6 0,55—0,60.Przyklad V. Sposób wytwarzania fragmentu1 kortykotropiny Etap 1: Z — LIZ(BOC) — NH2 (1—15 — amid.). 2,5 g aktywnego, chronionego estru lizyny Z — LIZ(BOC) — ONP rozpuszczono w 25 ml metanolu i po dodaniu 1,5 ml stezonego roztworu wodoro¬ tlenku amonu pozostawiono na noc. Nastepnie roz¬ twór odparowano, otrzymane krysztaly przemyto rozcienczonym roztworem amoniaku i przekrysta- lizowano z mieszaniny 20 ml etanolu i 30 ml wo¬ dy. Otrzymano 1,35 g (71% wydajnosci teoretycz¬ nej) chronionego amidu lizyny. Temperatura top¬ nienia 140—141°C. Rf4 0,6.Etap 2: H — LIZ(BOC) — NH2. 800 mg chronionego amidu lizyny, otrzymanego w etapie 1, uwodorniano w 40 ml metanolu wo¬ bec palladu na weglu aktywnym, nastepnie roz¬ twór, po odsaczeniu katalizatora, odparowano a po¬ zostalosc wykrystalizowano. Otrzymano 440 mg (86% wydajnosci teoretycznej) wolnego amidu li¬ zyny H — LIZ — (BOC)NH2. Rf1 0,34.Analiza: CnH^NsOa (245,33) Obliczono: Amid — N 5,7%; Otrzymano: Amid — N 5,5%.79252 27 28 Etap 3: BOC — SER — TYR — SER — MET — GLU(OBut) — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ(BOC) — PRO — WAL — GLI — LIZ(BOC) — NH2 (1—15). 40 mg amidu lizyny, otrzymanego w etapie 2, 5 oraz 197 mg chronionego chlorowodorku tetradeka- peptydu, otrzymanego w etapie 36 w przykladzie I, rozpuszczono w 0,5 ml dwumetyloformamidu.Do roztworu dodano 53 mg pieciochlorofenolu i 45 mg dwucykloheksylo karbodwuimidu i pozo- 10 stawiono na okres 2 dni w temperaturze pokojo¬ wej. Mieszanine reakcyjna rozcienczono bezwod¬ nym eterem etylowym, otrzymany osad odsaczo¬ no, przemyto eterem etylowym i rozdzielono w ko¬ lumnie chromatograficznej z zelem krzemionko- 15 wym. Frakcje zawierajace produkt glówny pola¬ czono, odparowano a pozostalosc rozcienczono ete¬ rem etylowym. Otrzymano 120 mg (60% wydajnos¬ ci teoretycznej) chronionego amidu pentadekapep- tydu. Rfl 0,2—0,25. 20 Etap 4: H — SER — TYR — SER — MET — GLU — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ — PRO — WAL — GLI — LIZ —NHt. M Z 100 mg chronionego amidu pentadekapeptydu, otrzymanego w etapie 3, usunieto grupy ochronne w sposób opisany w przykladzie III. Otrzymano wolny amid pentadekapeptydu z wydajnoscia blis¬ ka ilosciowej. Rf8 0,45—0,55. 30 Przykla-d Vi. Sposób wytwarzania fragmentu kortykotropiny (1-—16 — amid.).Etap 2: H — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — NH2 (15— 16). 1,0 g chronionego amidu dwupeptydu, otrzyma¬ nego w etapie 1, uwodorniono w roztworze me¬ tanolowym wobec palladu na weglu aktywnym.Po zakonczeniu reakcji katalizator odsaczono i roztwór odparowano. Otrzymano 0,75 g (okolo lOOtyo wydajnosci teoretycznej) wolnego amidu dwupeptydu w postaci krystalicznej pozostalosci.Rf1 0,7 (dla chronionego amidu dwupeptydu 1,0); Rf7 0,7. 35 Etap 1: Z — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — NH2 (15— 16). 2,0 g chronionego estru dwupeptydu Z — LIZ (BOC) — LIZ(BOC) — OMe [patrz R. Schwyzer, W/ Rittel: Helv. Chim. Acta 44, 159 (1961] roz¬ puszczono w 50 ml metanolu, nastepnie roztwór ^ nasycono gazowym amoniakiem. Mieszanine pozo¬ stawiono na okres 2 dni w temperaturze pokojo¬ wej, nastepnie odparowano. Krystaliczna pozosta¬ losc przekrystalizowano z malej ilosci metanolu.Otrzymano 1,6 g (83% wydajnosci teoretycznej) 45 chronionego amidu dwupeptydu. Temperatura top¬ nienia 160—162°C. Rf 0,0 (chloroform — metanol 98:2; wartosc dla estru 0,20—0,25). 50 55 60 Etap 3: BOC — SER — TYR — SER — MET — GLU(OBut) — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ(BOC) — PRO — WAL — GLI — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — NH2(1—16). 65 197 mg chronionego chlorowodorku tetradeka- peptydu, otrzymanego w etapie 36 w przykladzie I, 60 mg wolnego amidu dwupeptydu, otrzymane¬ go w etapie 2, 50 mg pieciochlorofenolu i 45 mg dwucykloheksylo karbodwuimidu rozpuszczono w 0,5 ml dwumetyloformamidu. Roztwór pozostawio¬ no na okres 2 dni w temperaturze pokojowej, na¬ stepnie rozcienczono eterem etylowym nie zawie¬ rajacym nadtlenków. Wytracony produkt odsaczo¬ no i rozdzielono w kolumnie chromatograficznej zawierajacej zel krzemionkowy stosujac nastepu¬ jaca mieszanine rozpuszczalników octan etylu — pirydyna — kwas octowy — woda 60 : 20 : 6 :11.Otrzymano 125 g (50tyo wydajnosci teoretycznej) chronionego amidu heksadekapeptydu. Rf1 0,20— 0,25.Etap 4: H — SER — TYR — SER — MET — GLU — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ — PRO — WAL — GLI — LIZ — LIZ — NH2 (1—16).Z 100 mg chronionego amidu heksadekapepty¬ du, otrzymanego w etapie 3, usunieto grupy ochronne w sposób opisany w przykladzie III.Otrzymano 70 mg (okolo 80% wydajnosci teore¬ tycznej) wolnego amidu heksadekapeptydu.Rf6 0,35—0,40.Przyklad VII. Sposób wytwarzania fragmen¬ tu kortykotropiny (1—17 — amid.).Etap 1: Z — LIZ (BOC) — LIZ(BOC) — ARG(NOa) — NH2 (15—17). a). Otrzymywanic azydu: 3,12 g chronionego hy¬ drazydu dwupeptydu Z — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — N2H3, otrzymanego w etapie 15 w przykladzie I, rozpuszczono w 50 ml dwumetyloformamidu, po czym dodano w temperaturze okolo —10°C 20 ml roztworu 0,5 normalnego kwasu solnego, nastepnie 5,0 ml 1 normalnego roztworu azotynu sodu. Mie¬ szanine mieszano w temperaturze okolo — 10°C w ciagu 15 minut, nastepnie zobojetniono 1,0 ml trój- etyloamidy i rozcienczono 50 ml oziebionego chlo¬ roformu i 50 ml wody. Po oddzieleniu warstwy chloroformowej, warstwe wodna przemyto ponownie chloroformem. Roztwory chloroformowe polaczono przemyto zimna woda, wysuszono nad siarczanem magnezu i poddano reakcji ze skladnikiem amino¬ wym w sposób opisany nizej: b). Sprzeganie: 1,5 g bromowodorku amidu — nit¬ ro argininy [H. Otsuka, K. Inouyl, M. Kanaya- ma i F. Shinozaki: Buli. Chem. Soc. Japan 38, 1563 (1965)] rozpuszczono w 10 ml dwumetyloformami¬ du, dodano 0,77 ml trójetyloaminy nastepnie prze¬ saczono do tej mieszaniny roztwór azydu otrzyma¬ ny wyzej podanym sposobem. Z mieszaniny od¬ destylowano chloroform a otrzymana jako pozosta¬ losc mieszanine reakcyjna pozostawiono na noc w temperaturze pokojowej. Nastepnie dwumetylofor- mamid oddestylowano pod próznia, pozostalosc roz¬ puszczono w 200 ml octanu etylu, roztwór prze¬ myto w temperaturze 0°C 1 normalnym roztwo¬ rem kwasu solnego, nastepnie woda, po czym wy¬ suszono i odparowano. Chroniony amid trójpepty- du otrzymano w postaci krystalicznej, sporzadzo¬ no z niego szlam z pomoca octanu etylu, wysuszo¬ no i odparowano. Otrzymano 3,1 g (77°/o wydaj-79252 29 30 nosci teoretycznej) chronionego amidu trójpepty- du. Temperatura topnienia 92—94°C.Rf2 0,80—0,88.Etap 4: H — SER — TYR — SER — MET — GLU —HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ — PRO — WAL — GLI — LIZ — LIZ — ARG — NH2 (1—17).Z 100 mg chronionego amidu heptadekapeptydu, otrzymanego w etapie 3, usunieto grupy ochronne w sposób opisany w przykladzie III. Otrzymano 70 mg (okolo 75% wydajnosci teoretycznej) amidu heptapeptydu. Rf6 0,30—0,35.Przyklad VIII. Sposób wytwarzania fragmen¬ tu kortykotropdny (1—18 — amid).Etap 1: Z — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG(NOt) — ARG(N02) — NH2 (15—18).Z 1,85 g chronionego hydrazydu dwupeptydu — Z — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — N2H8 sporzadzono roztwór azydowy w chloroformie, w sposób opisa¬ ny w etapie la w przykladzie VII, który nastep¬ nie dodano do roztworu otrzymanego w sposób nastepujacy: 1,8 g pochodnej dwupeptydowej H — ARG (BO£) — ARG(N02) — NH2-HBr (patrz H. Otsuka, K. Ino- uye, M. Kanayama, E. Shinozaki: Buli. Chem.Soc. Japan, 38, 1953 (1965) oraz 0,6 ml trójetylo- aminy rozpuszczono w 8,0 ml dwumetyloformami- du, nastepnie dodano wyzej wzmiankowany roz¬ twór azydu po czym mieszanine reakcyjna pozo¬ stawiono na okres 2 dni w temperaturze pokojo¬ wej. Po odparowaniu rozpuszczalnika pozostalosc przeniesiono do kolumny z zelem krzemionkowym i rozdzielono chromatograficznie za pomoca mie¬ szaniny octan etylu — pirydyna — kwas octowy — woda 60:10:3:5,5. Frakcje zawierajace pro¬ dukt glówny w stanie czystym zebrano, odparo¬ wano a pozostalosc rozcienczono eterem etylowym.Otrzymano 2,05 g (68°/o wydajnosci teoretycznej) chronionego amidu czteropeptydu.Rf2 0,38—0,48.Etap 2: H — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG — ARG — NH2-3HC1 (15—18). 0,4 g amidu czteropeptydu, otrzymanego w eta¬ pie 1, poddano wodórolizie w 10,0 ml kwasu octo¬ wego wobec palladu na weglu aktywnym. Po za¬ konczeniu reakcji katalizator odsaczono i roztwór odparowano. Pozostalosc po odparowaniu rozpusz¬ czono w chloroformie i dodano 0,3 g chlorowodor¬ ku pirydyny, nastepnie produkt wytracono przez dodanie eteru etylowego. Osad rozpuszczono w 0,5 ml mieszaniny chloroform — metanol 60:38 i przeniesiono do kolumny z zelem krzemionko¬ wym po czym rozdzielono chromatograficznie za pomoca mieszaniny chloroform — metanol — wo¬ da 60 : 38 : 10. Frakcje zawierajace produkt glów¬ ny w czystej postaci zebrano, odparowano a pozo¬ stalosc rozcienczono eterem etylowym. Otrzymano 0,3 g (86#/o wydajnosci teoretycznej) trójchlorowo¬ dorku amidu czteropeptydu. Rf3 0,55—0,65.Etap 3: BOC — SER — TYR — MET — GLU (OBut) — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ(BOC) — PRO — WAL — GLI — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG — ARG — NH2 (1—18). 103,5 mg chronionego chlorowodorku tetradeka- peptydu, otrzymanego w etapie 36 w przykladzie I, 65 mg wolnego trójchlorowodorku amidu czte¬ ropeptydu, otrzymanego w etapie 2, 26 mg piecio- chlorofenolu i 21 mg dwucykloheksylo-karbodwu- imidu rozpuszczono w 0,3 ml dwumetyloforma- midu, zawierajacego 7,6 mg trójetyloaminy. Mie¬ szanine reakcyjna pozostawiono na okres 2 dni w temperaturze pokojowej po czym rozcienczono ete¬ rem etylowym, nie zawierajacym nadtlenków. Wy¬ tracony, surowy produkt reakcji przeniesiono do kolumny z zelem krzemionkowym i rozdzielono chromatograficznie za pomoca mieszaniny octan 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Etap 2: H — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG — 5 NH2-2HC1 (15—17). 1,5 g chronionego amidu trójpeptydu, otrzyma¬ nego w etapie 1 uwodorniono w 75 ml kwasu octo¬ wego wobec palladu na weglu aktywnym. Po za¬ konczeniu reakcji katalizator odsaczono i roztwór 10 odparowano. Pozostalosc po odparowaniu rozpusz¬ czono w chloroformie, dodano 1,0 g chlorowodorku . pirydyny, produkt wytracono przez dodanie eteru etylowego, nastepnie rozcienczono eterem etylo¬ wym, rozpuszczono ponownie w 1 ml mieszaniny 15 chloroform-metanol 60:38 i przeniesiono do ko¬ lumny z zelem krzemionkowym. Produkt rozdzie¬ lono chromatograficznie za pomoca mieszaniny chloroform — metanol — woda 60:38: 10. Frakcje zawierajace produkt glówny polaczono, odparowa- 20 no a pozostalosc rozcienczono eterem etylowym.Otrzymano 1,0 g (77% wydajnosci teoretycznej) dwuchlorowodorku amidu trójpeptydu. Rf3 0,70— 0,80. (Powstaly podczas wodorolizy octan amonu przeprowadzono w chlorek amonu, który z mniej- * sza wartoscia Rf mikrowal i przy chromatografii pozostawal).Etap 3: BOC — SER — TYR — SER — MET — 30 GLU(OBut) — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ(BOC) — PRO — WAL — GLI — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG — NH2 (1—17). 197 mg chronionego chlorowodorku tetradeka- 35 peptydu, otrzymanego w etapie 36 w przykladzie I, 100 mg dwuchlorowodorku amidu trójpeptydu, otrzymanego w etapie 2, 53 mg pieciochlorofenolu i 46 mg dwucykloheksylo karbodwuimidu rozpusz¬ czono w 0,5 ml dwumetyloformamidu, zawieraja- cego 14 mg trójetyloaminy. Mieszanine reakcyjna pozostawiono na okres 2 dni w temperaturze po¬ kojowej, nastepnie rozcienczono eterem etylowym.Wytracony surowy produkt poddano rozdzielaniu chromatograficznemu w kolumnie z zelem krze- 45 mionkowym stosujac nastepujaca mieszanine roz¬ puszczalników octan etylu — pirydyna — kwas mrówkowy — woda 40 : 20 : 6 : 5,5. Frakcje zawie¬ rajace produkt glówny zebrano, odparowano a po¬ zostalosc rozcienczono octanem etylu. Otrzymano M 149 mg (58% wydajnosci teoretycznej). Rf5 0,38— 0,43; Rf7 0,08—0,13.31 79252 32 etylu — pirydyna — kwas mrówkowy — woda 40 : 20 : 6 : 5,5. Frakcje zawierajace produkt glów¬ ny w czystej postaci zebrano, odparowano a pozo¬ stalosc rozcienczono octanem etylu. Otrzyma¬ no 73 mg (51% wydajnosci teoretycznej) chronione¬ go amidu oktadekapeptydu.Rf5 0,17—0,23.Etap 4: H — SER — TYR — SER — MET — GLU — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ — PRO — WAL — GLI — LIZ — ARG — ARG — NH2 (1—18).Z 50 g chronionego amidu oktadekapeptydu, otrzymanego w etapie 3, usunieto grupy ochronne w sposób opisany w przykladzie III. Otrzymano wolny amid oktadekapeptydu z wydajnoscia pra¬ wie ilosciowa.Przyklad IX. Sposób wytwarzania fragmentu kortykotropiny (1—19 — amid).Etap 1: Z — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG (N02) — ARG(N02) — PRO — NH2 (15—19).Etap 2: H — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG — ARG — PRO — NH2-HC1 (15—19). 0,5 g chronionego amidu pieciopeptydu, otrzyma¬ nego w etapie 1 poddano wodorolizie w 45 ml lo¬ dowatego kwasu octowego wobec palladu na weglu 55 aktywnym. Po zakonczeniu reakcji katalizator od¬ saczono i roztwór odparowano. Pozostalosc po od¬ parowaniu rozpuszczono w chloroformie i dodano 0,3 g chlorowodorku pirydyny, nastepnie produkt wytracono przez dodanie eteru etylowego. Osad 60 rozpuszczono w mieszaninie chloroformu i metano¬ lu (60:38) i poddano chromatografii w kolumnie z zelem krzemionkowym, stosujac mieszanine chloroform — metanol — woda 60 : 38 :10. Frakcje zawierajace produkt glówny zebrano, odparowano & a pozostalosc rozcienczono eterem etylowym.Otrzymano 0,4 g (89°/o wydajnosci teoretycznej) trójchlorowodorku pieciopeptydu. Rf3 0,5—0,6.Etap 3: BOC — SER — TYR — SER — MET — GLU(OBut) — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ(BOC) — PRO — WAL — GLI — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG — ARG — PRO — NH2 (1—19). 197 mg chronionego chlorowodorku tetradeka- peptydu, otrzymanego w etapie 36 w przykladzie I, 149 mg trój chlorowodorku pieciopeptydu, otrzy¬ manego w etapie 2, 56 mg pieciochlorofenolu i 45 mg dwucykloheksylo karbodwuimidu rozpuszczo¬ no w 0,5 ml dwumetyloformamidu, zawierajacego 15 mg trójetyloaminy. Mieszanine reakcyjna pozo¬ stawiono na okres 2 dni w temperaturze pokojo¬ wej, nastepnie rozcienczono eterem etylowym nie zawierajacym nadtlenków, otrzymany osad prze¬ niesiono do kolumny z zelem krzemionkowym i poddano chromatografii za pomoca mieszaniny octanu etylu — pirydyny — kwasu mrówkowego — wody 40 : 20 : 6 : 5,5. Po zwyklym oczyszczeniu otrzymano 144 mg (50°/o wydajnosci teoretycznej) chronionego amidu nonadekapeptydu. Rf5 0,20— 0,26.Etap 4: H — SER — TYR — SER — MET — GLU — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ — PRO — WAL — GLI — LIZ — LIZ — ARG — ARG — PRO — NH2 (1—19).Z 100 mg chronionego amidu nonadekapeptydu, otrzymanego w etapie 3, usunieto grupy ochronne w sposób opisany w przykladzie III. Otrzymano 60 mg (okolo 70% wydajnosci teoretycznej) wol¬ nego amidu nonadekapeptydu. Rf6 0,30—0,40.Przyklad X. Sposób wytwarzania fragmentu kortykotropiny (1—20 — amid).Etap 1: Z — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG(N02) — ARG(N02) — PRO — WAL — NH2 (15—20). 548,8 mg chronionego estru pieciochlorofenylo- wego pieciopeptydu, otrzymanego w etapie 17 b w przykladzie I, oraz 0,15 g amidu waliny rozpusz¬ czono w 1,0 ml dwumetyloformamidu, po czym roztwór pozostawiono na okres 2 dni w tempera¬ turze pokojowej. Po odparowaniu mieszaniny re¬ akcyjnej, oleista pozostalosc oczyszczono metoda chromatograficzna w kolumnie z zelem krzemion¬ kowym, stosujac mieszanine octan etylu — piry¬ dyna — kwas octowy — woda 60 : 10 : 3 : 3,5.Otrzymano 320 mg czystego, chronionego amidu heksapeptydu. Rf2 0,4—0,5.W podobny sposób1 mozna otrzymac ten chronio¬ ny amid heksapeptydu w reakcji 500 mg chronio¬ nego estru p-nitrofenylowego pieciopeptydu, otrzy¬ manego w etapie 17 a w przykladzie I, z 80 mg chlorowodorku amidu waliny i 50 mg trójetyloa¬ miny. Po zastosowaniu zwyklej chromatografii otrzymano 430 mg (88% wydajnosci teoretycznej) chronionego amidu heksapeptydu. Rf2 0,4—0,5.Etap 2: H — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG — ARG — PRO — WAL — NH2-3HC1 (15— 20). 10 15 a) 1,0 g chronionego estru p-nitrofenylowego pieciopeptydu, otrzymanego w etapie 17 a w przy¬ kladzie I rozpuszczono w 10 ml metanolu, do roz¬ tworu dodano 3 ml stezonego roztworu amoniaku i pozostawiono na noc w temperaturze pokojowej.Mieszanine reakcyjna odparowano, pozostalosc rozpuszczono w mieszaninie chloroformu i wody. 30 Roztwór chloroformowy oddzielono, przemyto wo¬ da, wysuszono i odparowano. Pozostalosc po odpa¬ rowaniu rozdzielono chromatograficznie w kolum¬ nie z zelem krzemionkowym stosujac mieszanine chloroform — metanol — woda 40: 10 : 1. Frakcje zawierajace produkt glówny zebrano, odparowano 35 i pozostalosc rozcienczono eterem etylowym. Otrzy¬ mano 0,8 g (89% wydajnosci teoretycznej) chro¬ nionego amidu pentapeptydu.Rf2 0,25—0,35; Rf8 0,30—0,40 b) 0,41 *g chronionego estru pieciochlorofenylowe- 40 go pentapeptydu, otrzymanego w etapie 17 b w przykladzie I, rozpuszczono w 4,1 ml metanolu i przeprowadzono w amid przez dodanie 1,2 ml stezonego roztworu amoniaku. Mieszanine reakcyj^ na poddano przeróbce w sposób opisany w czesci 45 a). Otrzymano 0,24 g (74% wydajnosci teoretycz¬ nej) chronionego amidu pentapeptydu. Produkt ten jest identyczny z produktem otrzymanym w czesci a). 5533 79252 34 0,2 g amidu heksapeptydu, otrzymanego w eta¬ pie 1, poddano wodorolizie w 10 ml lodowatego kwasu octowego wobec palladu na weglu aktyw¬ nym. Po zakonczeniu reakcji katalizator odsaczo¬ no i roztwór w lodowatym kwasie octowym odpa¬ rowano; Pozostalosc rozpuszczono w chloroformie, dodano 0,12 g chlorowodorku pirydyny i produkt wytracono przez dodanie eteru etylowego. Osad rozpuszczono w 0,1 ml mieszaniny chloroform — metanol 60:38 i poddano chromatografii w ko¬ lumnie z zelem krzemionkowym stosujac mieszani¬ ne chloroform — metanol — woda 60:38: 10.Otrzymano 0,17 g trójchlorowodorku heksapepty¬ du (100% wydajnosci teoretycznej) Rf3 0,42—0,50.Etap 3: BOC — SER — TYR — SER — MET — GLU(OBut) — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ(BOC) — PRO — WAL — GLI — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG — ARG — PRO — WAL-NH2 (1— 20). 197 mg chronionego chlorowodorku tetradeka- peptydu, otrzymanego w etapie 36 w przykladzie I, 128 mg trójchlorowodorku heksapeptydu, otrzy¬ manego w etapie 2, 56 mg pieciochlorofenolu i 45 mg dwucykloheksylo karbodwuimidu rozpuszczo¬ no w 0,5 ml dwumetyloformamidu, zawierajacego 11,7 mg trójetyloaminy. Mieszanine reakcyjna po¬ zostawiono na okres 2 dni, po czym rozcienczono eterem etylowym, nie zawierajacym nadtlenków.Otrzymany osad poddano chromatografii w kolum¬ nie z zelem krzemionkowym stosujac mieszanine octan etylu — pirydyna — kwas mrówkowy — woda 40 : 20 : 6 : 5,5. Frakcje zawierajace produkt glówny w czystej postaci zebrano, odparowano a pozostalosc rozcienczono octanem etylu. Otrzy¬ mano 185 mg (61°/o wydajnosci teoretycznej) chro¬ nionego amidu ikozapeptydu. Rf5 0,27—0,31.Etap 4: H — SER — TYR — SER — MET — GLU — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ — PRO — WAL — GLI — LIZ — LIZ — ARG — ARG — PRO — WAL — NH2 (1—20).Z 100 mg chronionego amidu ikozapeptydu usu¬ nieto grupy ochronne w sposób opisany w przy¬ kladzie III. Otrzymano 75 mg (87% wydajnosci te¬ oretycznej) wolnego amidu ikozapeptydu. Rf6 0,22— 0,25.Przyklad XI. Sposób wytwarzania fragmentu kortykotropiny (1—21 — amid).Etap 1: Z — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG(N02) ARG(N02) — PRO — WAL — LIZ(BOC) — NH2 (15—21). a) 0,5 mg chronionego estru p-nitrofenylowego pieciopeptydu Z — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG(N02) — ARG(N02) — PRO — ONP, otrzy¬ manego w etapie 17a w przykladzie I, poddano reakcji z 0,17 g amidu dwupeptydu H — WAL — LIZ(BOC) — NH2 w 1,0 ml dwumetyloformamidu [patrz K. Sturm, R. Geiger, W. Siedel: Ber. 97, 1197, (1964)]. Po dwóch dniach mieszanine reakcyj¬ na rozcienczono eterem etylowym. Osad poddano chromatografii w kolumnie z zelem krzemionko¬ wym, stosujac mieszanine octan etylu — pirydy¬ na — kwas octowy — woda 60 : 10 : 3 : 5,5. Otrzy¬ mano 0,52 g (89% wydajnosci teoretycznej) amidu heptapeptydu. b) 877 mg chronionego estru pieoiochlorofenylowe- go pieciopeptydu, otrzymanego w etapie 17 b w przy¬ kladzie I, rozpuszczono w 1,5 ml dwumetyloforma¬ midu, do roztworu dodano 478 mg amidu dwupep¬ tydu H — WAL — LIZ(BOC) — NH2 i mieszani¬ ne reakcyjna pozostawiono na okres 2 dni w tem¬ peraturze pokojowej. Produkt reakcji wytracono eterem etylowym i oczyszczono na zelu krzemion¬ kowym. Otrzymano 713 mg (77% wydajnosci teo¬ retycznej) chronionego amidu heptapeptydu. Rf2 0,61—0,72; Rf1 0,35—0,40.Etap 2: H — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG — ARG — PRO — WAL — LIZ(BOC) — NH2-3HC1 (15—21). 0,4 g chronionego amidu heptapeptydu, otrzyma¬ nego w etapie 1, poddano wodorolizie w 25 ml lodowatego kwasu octowego wobec palladu na we¬ glu aktywnym. Po zakonczeniu reakcji kataliza¬ tor odsaczono, roztwór odparowano i pozostalosc rozpuszczono w chloroformie. Do roztworu chloro¬ formowego dodano 0,3 chlorowodorku pirydyny, produkt wytracono eterem etylowym, rozpuszczo¬ no w 0,5 ml mieszaniny chloroform — metanol 60 : 26 i poddano chromatografii w kolumnie z ze¬ lem krzemionkowym, stosujac mieszanine chloro¬ form — metanol — woda 60: 26 : 5. Frakcje za¬ wierajace produkt glówny w czystym stanie zebra¬ no, odparowano a pozostalosc rozcienczono eterem.Otrzymano 0,35 g (89% wydajnosci teoretycznej) trójchlorowodorku heptapeptydu. Rf1 0,07—0,10; Rf 0,45—0,50 w ukladzie chloroform — metanol — woda 60 : 26 : 5.Etap 3: BOC — SER — TYR — SER — MET — GLU(OBut) — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ(BOC) — PRO — WAL — GLI — LIZ(BOC) — LIZ(BOC)— ARG — ARG — PRO — WAL — LIZ (BOC) — NH2 (1—21). 197 mg chronionego chlorowodorku tetradeka- peptydu, otrzymanego w etapie 36 w przykladzie I, 152 g trójchlorowodorku amidu heptapeptydu, otrzymanego w etapie 2, 52 mg pieciochlorofenolu i 44 mg dwucykloheksylo karbodwuimidu rozpusz¬ czono w 0,5 ml dwumetyloformamidu, zawieraja¬ cego 11 mg trójetyloaminy, po czym pozostawio¬ no na okres 2 dni w temperaturze pokojowej. Mie¬ szanine reakcyjna rozcienczono eterem etylowym, osad poddano chromatografii w kolumnie z 10 ml zelu krzemionkowego, stosujac mieszanine rozpusz¬ czalników octan etylu — pirydyna — kwas mrów¬ kowy — woda 40 : 20 : 6 : 5,5. Po zwyklej obróbce otrzymano 200 mg (61% wydajnosci teoretycznej) chronionego amidu heneikozapeptydu. Rf5 0,35—0,40.Etap 4: H — SER — TYR — SER — MET — GLU — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ — PRO — WAL — GLI — LIZ — LIZ — ARG — ARG — PRO — WAL — LIZ — NH2 (1—21). 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6035 79252 36 Z 100 mg chronionego amidu heneikozapeptydu usunieto grupy ochronne w sposób opisany w przy¬ kladzie III. Otrzymano 75 mg (80% wydajnosci teoretycznej) wolnego amidu heneikozapeptydu.Rf6 0,20—0,25.Przyklad XII. Sposób wytwarzania frag¬ mentu (1—28) swinskiej kortykotropiny.Etap 1: Z — GLI — ALA — GLU(OBut) — OBut (26—28 B). 58,1 g chronionego, aktywnego estru alaniny Z — ALA — ONSu (przy czym NSu oznacza reszte imi- du bursztynowego) rozpuszczono w 150 ml bezwod¬ nego dioksanu i dodano roztwór 54,4 g estru kwa¬ su glutaminowego GLU(OBut) — OBut w 200 ml bezwodnego dioksanu. Mieszanine reakcyjna pozo¬ stawiono na godzine w temperaturze pokojowej, nastepnie dodano 1 litr octanu etylu po czym wy¬ trzasano kolejno z woda, z 1 normalnym roztwo¬ rem kwasu solnego, z 8°/o roztworem wodorowe¬ glanu sodu i wreszcie ponownie z woda. Warstwe organiczna wysuszono i poddano wodorolizie wo¬ bec palladu na weglu aktywnym, nastepnie otrzy¬ many, wolny ester dwupeptydu ekstrahowanego 10°/o roztworem kwasu cytrynowego. Wodny roz¬ twór zalkalizowano weglanem sodu az do pH = 9, a wydzielony ester Awupeptydu w postaci oleistej, ekstrahowano eterem etylowym.Po oddestylowaniu eteru, otrzymany jako pozo¬ stalosc ester dwupeptydu ALA — GLU(OBut) — OBu*, rozpuszczono w 1 litrze octanu etylu po czym dodano 45,8 g aktywnego estru glicyny Z — GLI — ONSu. Mieszanine reakcyjna pozostawio¬ no do nastepnego dnia w temperaturze pokojo¬ wej, po czym wytrzasano kolejno z 1 normalnym roztworem kwasu solnego, z 8% roztworem wodo¬ roweglanu sodu i wreszcie z woda, nastepnie wy¬ suszono i octan etylu oddestylowano. Oleista po¬ zostalosc zakrzepla podczas stania pod warstwa eteru naftowego. Produkt przekrystalizowano z 250 ml eteru dwuizopropylowego. Otrzymano 65—66,5 g (83—85% wydajnosci teoretycznej) chro¬ nionego estru trójpeptydu. Temperatura topnienia 105—107°C [a] = -3,25 do 35,7° (C = 1, w etanolu).Etap 2: Z — ASP(OBut) — ONSu (25B).Sporzadzono zawiesine w rozdzielaczu z 58,6 g drobno sproszkowanej soli Z — ASP(OBut) — OH — dwucykloheksyloaminy w 250 ml eteru ety¬ lowego, po czym dodano mieszanine 3,3 ml ste¬ zonego kwasu siarkowego i 200 ml wody i wy¬ trzasano az do rozpuszczenia sie soli. Warstwe wodna wytrzasano nastepnie z eterem etylowym, polaczone warstwy eterowe przemyto woda, wy¬ suszono i eter oddestylowano. Otrzymany jako po¬ zostalosc olej rozpuszczono w 250 ml bezwodnego dioksanu i dodano, chlodzac lodem, 13,4 g imidu N-hydroksybursztynowego i 22,4g dwucykloheksylo- karboimidu. Mieszanine pozostawiono do nastep¬ nego dnia, nastepnie po odsaczeniu dwucyklohek- sylomocznika roztwór w diaksanie odparowano pod próznia, a otrzymany jako pozostalosc olej pozo¬ stawiono do zakrzepniecia pod warstwa eteru naf¬ towego. Po przekrystalizowaniu ze 100 ml izopro- panolu otrzymano 35-r40 g (72—83% wydajnosci teoretycznej) aktywnego estru kwasu asparagino- wego. Temperatura topnienia 148—150°C.Etap 3: Z — ASP(OBut) — GLI — ALA — GLU (OBut) — OBut (25—28 B). 46 g chronionego trójpeptydu Z — GLI — ALA GLU(OBut) — OBut, otrzymanego w etapie 1, roz¬ puszczono w 550 ml 80% kwasu octowego i podda¬ no wodorolizie wobec palladu na weglu aktyw¬ nym. Po odsaczeniu katalizatora roztwór odparo¬ wano pod próznia, po czym otrzymany jako pozo¬ stalosc olej rozpuszczono w 500 ml wody, dodano 120 g chlorku sodu i zalkalizowano weglanem so¬ du az do pH = 9. Wydzielony olej ekstrahowano octanem etylu, roztwór w kwasie octowym wysu¬ szono i odparowano. Pozostalosc rozpuszczono w mieszaninie 200 ml bezwodnego octanu etylu i 100 ml bezwodnego dioksanu po czym dodano 30,6 g aktywnego estru Z — ASP (OBut) _ ONSu. Na¬ stepnie mieszanine reakcyjna pozostawiono na 3 godziny po czym rozcienczono 200 ml octanu ety¬ lu, przemyto woda, nastepnie 1 normalnym roz¬ tworem kwasu solnego, 8% roztworem wodorowe¬ glanu sodu i w koncu ponownie woda, po czym wysuszono i odparowano pod próznia. Olej otrzy¬ many jako pozostalosc wykrystalizowal pod war¬ stwa eteru naftowego. Otrzymano 38—40 g (75— 79% wydajnosci teoretycznej) chronionego estru tetrapeptydowego. Temperatura topnienia 80—83°C, Etap 4: H — WAL — LIZ(BOC) — WAL — TYR (But) — PRO — ASP(OBut) — GLI — ALA — GLU(OBut) — OBut (20—28). 37,2 g chronionego estru czteropeptydu Z — ASP(OBut) — GLI — ALA — GLU(OBut) — OBut rozpuszczono w 400 ml 80% kwasu octowe¬ go i poddano wodorolizie wobec palladu na weglu aktywnym. Po odsaczeniu katalizatora rozpuszczal¬ nik oddestylowano pod próznia, a olej, otrzymany jako pozostalosc, rozpuszczono w 330 ml wody po czym roztwór zalkalizowano weglanem sodu az do pH = 9. Wydzielony olej ekstrahowano octanem etylu, roztwór wysuszono i rozpuszczalnik oddes¬ tylowano pod próznia. Otrzymany w ten sposób ester czteropeptydu rozpuszczono w 350 ml bez¬ wodnego dioksanu, po czym dodano 48,9 g chro¬ nionego aktywnego estru pieciopeptydu Z — WAL —LIZ(BOC) — WAL — TYR(But) — PRO — ONSu, otrzymanego w etapie 1 w przykladzie II.Mieszanine pozostawiono w ciau 20 godzin w tem¬ peraturze pokojowej, po czym odparowano pod próznia a pozostalosc rozpuszczono w 700 ml octa¬ nu etylu. Roztwór przemyto woda, nastepnie 10% roztworem kwasu cytrynowego, 8% roztworem wo¬ doroweglanu sodu i wreszcie ponownie woda; wy¬ suszono i odparowano pod próznia.Otrzymany surowy ester karbonylobenzyloksy nonapeptydu rozpuszczono w 1 litrze 80% kwasu octowego i poddano wodorolizie wobec palladu na weglu aktywnym. Po odsaczeniu katalizatora roz¬ puszczalnik oddestylowano pod próznia a pozost- losc rozpuszczono w 1 litrze octanu etylu. Roztwór przemyto dwukrotnie, za kazdym razem 150 ml 10% roztworem kwasu cytrynowego, nastepnie przemyto 5% roztworem weglanu sodu, wysuszo¬ no po czym octan etylu oddestylowano. Pozosta¬ lo. 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6037 79252 38 losc stanowila zywica, pachnaca rozpuszczalnikiem, która roztarto z eterem naftowym, odsaczono i wysuszono w prózni nad pieciotlenkiem fosforu.Otrzymany 49,5 g (77% wydajnosci teoretycznej) estru nonapeptydu. Temperatura topnienia 135— 140°C.I = 268 m^i, log £ = 2,71 (w etanolu) Analiza: CegHjogNjoOn (1301,60) Obliczono: C 59,98%, H 8,36%, N 10,76%; Otrzymano: C 59,25%, H 8,70%, N 10,66%.Etap 7: BOC — SER — TYR — SER — MET — GLU(OBut) — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ(BOC) — PRO — WAL — GLI — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG — ARG — PRO — WAL — LIZ (BOC) — WAL — TYR(But) — PRO — ASP(OBut) — GLI — ALA — GLU(OBut) — OBut (1—28). 0,986 g trójchlorowodorku tetradekapeptydu, otrzymanego w etapie 36, w przykladzie I, 1,138 g trójchlorowodorku tetradekapeptydu, otrzymane¬ go w etapie 6, 0,266 g pieciochlorofenolu i 0,206 g dwucykloheksylo karbodwuimidu rozpuszczono w 3,0 ml dwumetyloformamidu, zawierajacego 50 mg trójetyloaminy. Mieszanine reakcyjna pozostawio¬ no na okres 2 dni w temperaturze pokojowej, na¬ stepnie rozcienczono eterem etylowym nie zawie¬ rajacym nadtlenków. Otrzymany osad rozdzielo¬ no chromatograficznie w kolumnie z zelem krze¬ mionkowym stosujac mieszanine: octan — pirydy¬ na — kwas mrówkowy — woda 60 : 20 : 6 : 5,5.Frakcje zawierajace produkt glówny w stanie czy¬ stym, zebrano razem i odparowano. Dalsze frak¬ cje zawierajace równiez produkt glówny zebrano osobno, odparowano i ponownie rozdzielono chro¬ matograficznie. W ten sposób otrzymano dodatko¬ we ilosci czystego, chronionego oktakozapeptydu.Razem otrzymano 0,85 g (okolo 40% wydajnosci teoretycznej) chronionego oktakozapeptydu. Rf7 0,17—0,25.Etap 8: H — SER — TYR — SER — MET — GLU — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ — PRO — WAL — GLI — LIZ — LIZ — ARG — ARG — PRO — WAL — LIZ — WAL — TYR — PRO — ASP — GLI — ALA — GLU — OH (1— —28). 760 mg chronionego oktakozapeptydu, otrzyma¬ nego w etapie 7, rozpuszczonego w 20 ml 90% kwasu trójflurooctowego, zawierajacego 0,02% merkaptoetanolu. Roztwór pozostawiono na 15 mi¬ nut, nastepnie odparowano. Pozostalosc rozpuszczo¬ no w 3 ml wody i ponownie odparowano. Roz¬ puszczanie w wodzie i odparowywanie powtórzono jeszcze raz. Wreszcie produkt rozpuszczono w 5 ml wody i przeniesiono do kolumny zawierajacej 20 ml zywicy jonowymiennej Amerlite IRA — 400 (w cyklu octanowym). Kolumne przemyto szescio¬ krotnie, za kazdym razem 5 ml wody i otrzyma¬ ne roztwory wodne wysuszone przez liofilizacje.Otrzymano 580 mg (okolo 90% wydajnosci teore¬ tycznej) wolnego oktakozapeptydu. Rf6 0,30—0,35.Analiza aminokwasów: ASP 1,0 (1), SER 2,0 (2), GLU 2,03 (2), PRO 3,04 (3), GLI 3,1 (3), ALA 1,05 (1), WAL 3,09 (3), MET 0,97 (1), TYR 2,12 (2), FEN 1,0 (1), HIS 1,2 (1), LIZ 3,9 (4), ARG 2,91 (3).Przyklad XIII. Sposób otrzymywania fragmen¬ tu (1—28) ludzkiej kortykotropiny.Etap 1: Z — ALA — GLI — GLU(OBut) Z. 11,9 g Z —GLI — OSu rozpuszczono w 170 ml octanu etylu, do roztworu oziebionego do tempera¬ tury 0°C dodano równiez. oziebiony roztwór 12,2 g H — GLU(OBut) Z w 60 ml octanu etylu. Mie¬ szanine reakcyjna pozostawiono na noc, nastepnie Etap 5: Z — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG(N02) — ARG(N02) — PRO — WAL — LIZ (BOC) — WAL — TYR(But) — PRO — ASP(OBut) — GLI — ALA — GLU(OBut) 15 — OBut (15—28). 451 mg nonapeptydu, otrzymanego w etapie 4, i 426 mg chronionego estru p-nitrofenylowego pie- ciopeptydu, otrzymanego w etapie 17/a, w przy¬ kladzie I, rozpuszczono w 0,7 ml dwumetylofor- 20 mamidu po czym roztwór pozostawiono na okres 2 dni w temperaturze pokojowej. Nastepnie mie¬ szanine reakcyjna rozcienczono eterem etylowym a otrzymany produkt wytracono czterokrotnie z mieszaniny octanu etylu i eteru etylowego. ^ Otrzymano 735 mg (88,5% wydajnosci teoretycznej) chronionego estru tetradekapeptydu.Rf2 0,75—0,85; Rf4 0,26—0,36. [a]D2° = 65,7° (C = 1, w metanolu).Analiza: C112H183032N25 (2391,78) 30 Obliczono: C 56,2%, H 7,7%, N 14,6%; Otrzymano: C 56,05%, H 7,8%, N 14,5%.Etap 6: H — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG — ARG — PRO — WAL — LIZ(BOC) — 35 WAL — TYR(But) — PRO — ASP(OBut) — GLI — ALA — GLU(OBut) — OBut- 3HC1 (15—28). 6,1 g chronionego estru tetradekapeptydu, otrzy¬ manego w etapie 5, uwodorniono w 300 ml lodo- 40 watego kwasu octowego wobec palladu na weglu aktywnym. Po zakonczeniu reakcji katalizator od¬ saczono, roztwór odparowano a pozostalosc roz¬ puszczono w 50 ml wody i do oziebionego lodem roztworu dodano 20 ml 0,5 normalnego kwasu sol- 45 nego. Peptyd wytracono z wodnego roztworu przez dodanie 10 ml nasyconego roztworu chlorku sodu.Produkt odsaczono i wysuszono. Nastepnie wysu¬ szony produkt rozcienczono mieszanina 80 ml chlo¬ roformu i 80 ml etanolu, nierozpuszczalne sole 50 nieorganiczne usunieto przez odsaczenie. Roztwór odparowano a pozostalosc rozdzielono chromato¬ graficznie w kolumnie z zelem krzemionkowym, stosujac mieszanine chloroform — metanol — wo¬ da 60 : 26 : 5. Frakcje zawierajace produkt glówny 55 zebrano, odparowano i rozcienczono eterem etylo¬ wym. Otrzymano 4,35 g (76% wydajnosci teore¬ tycznej) trójchlorowodorku tetradekapeptydu. Rf7 0,37—0,47; Rf9 0,55—0,60 Analiza: C104H182O26N23Cl3 (2277,05) 60 Obliczono: N 14,2%, Cl 4,65%; Otrzymano: N 14,5%, Cl 4,65%.Analiza aminokwasów: ALA 0,95 (1), ARG 2,05 (2), ASP 1,0 (1), GLU 1,05 (1), GLI 1,0 (1), LIZ 2,85 (3), PRO 2,05 (2), TYR 1,0 (1), WAL 2,05 (2). « 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6039 79252 40 wytrzasano z 1 normalnym roztworem kwasu sol¬ nego, z 5°/o roztworem wodoroweglanu sodu i w koncu z woda. Roztwór w octanie etylu wysuszo¬ no i rozpuszczalnik odparowano. Otrzymano jako pozostalosc Z — GLI — GLU(OBut) Z w postaci oleistej (Analiza: obliczono C 61,4°/o, H 7,6°/o, O 24,9%, otrzymano C 10,8%, H 7,6%, O 24,5%, który bez dalszego oczyszczania ponowie rozpusz¬ czono w 200 ml octanu etylu po czym uowodor- niono wobec palladu na weglu aktywnym az do zakonczenia wydzielania sie C02. Otrzymany chro¬ matograficznie (Rf1 0,7 ninhydryna) jednolity ester dwupeptydu H — GLI — GLU(OBut)2 ekstraho¬ wano 10% roztworem kwasu cytrynowego, nastep¬ nie roztwór wodny zalkalizowano do pH = 9. Wy¬ dzielony olej ekstrahowano octanem etylu, roz¬ twór w octanie etylu wysuszono po czym dodano w temperaturze 0°C roztwór 11,1 g Z — ALA — OSu w 150 ml octanu etylu. Mieszanine pozosta¬ wiono w temperaturze pokojowej na okres 24 go¬ dzin po czym wytrzasano z 1 normalnym roztwo¬ rem kwasu solnego, z 5% roztworem wodorowe¬ glanu sodu i wreszcie z woda, nastepnie suszono i odparowano pod zmniejszanym cisnieniem.Otrzymano jako pozostalosc, stala piane, która rozcienczono eterem etylowym i eterem naftowym i przesaczano. Otrzymano 13,2 g (53,7% wydaj¬ nosci teoretycznej) surowego estru trójpeptydu. Po przekrystalizowaniu z mieszaniny octanu etylu i eteru naftowego otrzymano 11,8 g oczyszczone¬ go, krystalicznego produktu w postaci igiel. Tem¬ peratura topnienia 63—66°C.Analiza: C26H3908N3 (521,59).Obliczono: C 59,9%, H 7,5%, N 8,0%.Otrzymano: C 59,6%, H 7,7%, N 7,8%.Etap 2: Z — ASP(OBut) — ALA — GLI — GLU (OBut)2 (25—28). 4,8 g chronionego estru trójpeptydu Z — ALA — GLI — GLU(OBut)2, otrzymanego w etapie 1 roz¬ puszczono w 60 ml 80% kwasu octowego i uwodor¬ niono w zwykly sposób wobec palladu na weglu aktywnym. Po odsaczeniu katalizatora i odparowa¬ niu rozpuszczalnika otrzymany jako pozostalosc oleisty, chromatograficzne (Rf1 0,5) jednolity pro¬ dukt rozpuszczono w wodzie z chlorkiem sodu, roztwór doprowadzono do pH = 8 i wydzielony olej ekstrahowano octanem etylu. Roztwór w octanie etylu wysuszono po czym dodano w temperaturze 0°C 3,2 g Z — ASP(OBut) — OSu. Mieszanine reakcyjna pozostawiono na noc nastepnie przemy¬ to w zwykly sposób, wysuszono, rozpuszczalnik od¬ destylowano i pozostalosc pozostawiono do skrzep¬ niecia pod eterem naftowym. Otrzymano 4,75 g su¬ rowego, chronionego estru czteropeptydu (74,6% wydajnosci teoretycznej). Produkt mozna prze- krystalizowac z mieszaniny o-ctanu etylu i eteru naftowego. Temperatura topnienia 88—90°C.Analiza: C34 H52OnN4 (692,78).Obliczono: C 58,9%, H 7,5%, N 8,1%, O 25,4%.Otrzymano: C 58,2%, H 7,2%, N 8,2%, O 25,6%.Etap 3: Z — WAL — LIZ(BOC) — WAL — TYR (But) — PRO — ASP(OBut) — ALA — GLI — GLU(OBut)2 (20—28). 2,5 g (3,6 milimola) chronionego estru czteropep¬ tydu, otrzymanego w etapie 2, rozpuszczono w 28 ml 80%-owego octanu etylu i uwodorniono wobec palladu na weglu aktywnym az do zakonczenia wydzielania sie dwutlenku wegla. Katalizator od¬ saczono, przesacz odparowano pod zmniejszonym cisnieniem i pozostalosc rozpuszczono w 20 ml wo¬ dy. Roztwór wodny zalkalizowano weglanem so¬ du do pH = 9 i wydzielony ester czteropeptydu trzykrotnie wytrzasano, za kazdym razem z 20 ml eteru etylowego. Zebrane roztwory eterowe wy¬ suszono i odparowano. Otrzymano 1,8 g oleistego, surowego produktu (90% wydajnosci teoretycznej).Produkt ten oraz 2,2 g (2,2 milimola) chronione¬ go estru N-hydroksybursztynoimidowego piecio- peptydu, otrzymanego w etapie 1, w przykladzie II, rozpuszczono w 25 ml bezwodnego dioksanu, roztwór pozostawiono na okres 2 dni, nastepnie od¬ parowano pod próznia i pozostalosc rozpuszczono w 50 ml octanu etylu. Roztwór wytrzasano dwu¬ krotnie za kazdym razem z 10 ml 10% roztworu kwasu cytrynowego, nastepnie dwukrotnie z 10 ml 8% roztworu wodoroweglanu sodu, wytracony przy wytrzasaniu osad odsaczono. Roztwór wysu¬ szono nad bezwodnym siarczanem sodu, octan ety¬ lu oddestylowano i pozostalosc po dodaniu eteru naftowego przesaczono. Otrzymano 3,15 g (100% wydajnosci teoretycznej) surowego, chronionego estru nonapeptydu. Temperatura topnienia 140° (temperatura miekniecia okolo 115°C). Po wytrace¬ niu z mieszaniny octanu etylu i eteru naftowego produkt topi sie w temperaturze 132—146°C. Rf3 0,72.Analiza: (^H^NkAj, (1435,73).Obliczono: C 60,0%, H 8,0%, N 9,8%.Otrzymano: C 60,45%, H 8,24%, N 10,25%.Etap 4: H — WAL — LIZ(BOC) — WAL — TYR (But) — PRO — ASP(OBut) — ALA — GLI — GLU(OBut)2 (20—28). 3,1 g (2,35 milimola) chronionego estru nonapep¬ tydu, otrzymanego w etapie 3, rozpuszczono w 60 ml 80% kwasu octowego i uwodorniono wobec pal¬ ladu na weglu aktywnym. Po zakonczeniu wydzie¬ lania sie C02 katalizator odsaczono i przesacz od¬ parowano pod próznia. Pozostalosc rozpuszczono w 50 ml octanu etylu po czym przemyto czterokrot¬ nie, za kazdym razem 10 ml 8% roztworu wodo- weglanu sodu, nastepnie 10 ml 10% roztworu wo¬ doroweglanu sodu, wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i odparowano. Pozostalosc skrzepla podczas stania pod eterem naftowym. Po przesa¬ czeniu i wysuszeniu otrzymano 1,7 g (61% wydaj¬ nosci teoretycznej) wolnego estru nonapeptydu.Temperatura topnienia 101—112°C (temperatura miekniecia okolo 93°C). Rf3 0,15.Etap 5: Z — LIZ(BOC) — LIZ (BOC) — ARG(N02) — ARG(N02) — PRO — WAL — LIZ (BOC) — WAL — TYR (But) — PRO — ASP(OBut) — ALA — GLI — GLU(OBut)2 (15—28). 1,6 g (1,23 milimola) wolnego estru nonapeptydu, otrzymanego w etapie 4, oraz 1,66 g (1,23 milimola) chronionego estru pieciochlorofenylowego rozpusz- 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6041 79252 42 czono w 2 ml dwumetyloformamidu. Roztwór po¬ zostawiono na okres 1 dnia nastepnie rozcienczono eterem etylowym, po czym osad odsaczono, prze¬ myto eterem i wysuszono. Otrzymano 2,65 g (90°/o wydajnosci teoretycznej) chronionego estru tetra- dekapeptydu.Rf3 0,55.Etap 6: H — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG — ARG — PRO — WAL — LIZ(BOC) — WAL — TYR(But) — PRO — ASP(OBut) — ALA — GLI — GLU(OBut)2-3 HC1 (15— 28). 2,65 (1,21 milimola) chronionego estru tetradeka- peptydu, otrzymanego w etapie 5, rozpuszczono w 150 ml kwasu octowego i uwodorniono wobec palladu na weglu aktywnym. Postep reakcji sledzono me¬ toda chromatografii cienkowarstwowej. Po zakon¬ czeniu reakcji katalizator odsaczono, przesacz od¬ parowano, do pozostalosci dodano eteru etylowe¬ go, przesaczono i wysuszono. Otrzymany surowy produkt (2,35 g) rozpuszczono w 60 ml wody, roz¬ twór oziebiono lodem i zakwaszono do pH = 4, dodajac 7,8 ml 0,5 normalnego kwasu solnego.Trójchlorowodorek estru czteropeptydu wytraco¬ no przez dodanie 10 ml nasyconego roztworu chlorku sodu, osad odsaczono, przemyto nasyco¬ nym roztworem chlorku sodu i wysuszono. Pro¬ dukt (1,45 g) zawierajacy chlorek sodu rozpuszczo¬ no w 20 ml etanolu, po czym dodano 20 ml chlo¬ roformu a wytracony chlorek sodu odsaczono. Pu odparowaniu otrzymano 1,35 g (53°/o wydajnosci teoretycznej) wolnego estru tetradekapeptydu. Rf1 0,35.Etap 7: BOC — SER — TYR — SER — MET — GLU(OBut) — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ(BOC) — PRO — WAL — GLI — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG — ARG — PRO — WAL — LIZ (BOC) — WAL — TYR(OBut) — PRO — ASP (OBut) — ALA — GLr — GLU(OBut)2 • 3 HCOOH. (1—28). 0,60 g (0,305 milimola) chronionego tetradeka¬ peptydu, otrzymanego w etapie 36 w przykladzie I, 0,69 g (0,305 milimola) trójchlorowodorku estru tetradekapeptydu, otrzymanego w etapie 6, oraz 0,48 g (1,8 milimola) pieciochlorofenolu rozpuszczo¬ no w 2,0 ml dwumetyloformamidu, do roztworu dodano 0,124 g (0,6 milimola) dwucykloheksylo — karbodwuimidu i pozostawiono na noc w tempe¬ raturze pokojowej. Nastepnie mieszanine reakcyj¬ na zobojetniono roztworem 0,3 ml (0,215 milimola) trójetyloaminy w 1,5 ml dwuetyloformamidu, po¬ zostawiono na 1 dzien, po czym rozcienczono ete¬ rem etylowym, nie zawierajacym nadtlenków. Wy¬ tracony produkt odsaczono, przemyto eterem ety¬ lowym i wysuszono. Otrzymany surowy produkt 1,45 g rozdzielono chromatograficznie w kolumnie o srednicy 2 cm, zawierajacej 50 g zelu krzemion¬ kowego, stosujac mieszanine octan etylu — piry¬ dyna — kwas mrówkowy — woda 60 : 20 : 6 : 5,5.W ciagu kazdych 20 minut zbierano 3 ml frak¬ cji. Czysty, chroniony oktakozapeptyd uzyskano z frakcji 79 do 100 przez odparowanie. Otrzyma¬ no 0,171 g (13% wydajnosci teoretycznej) czyste¬ go produktu. Rf7 0,30.Etap 8: H — SER — TYR — SER — MET — GLU — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ — PRO — WAL — GLI — LIZ — LIZ — ARG — ARG — PRO — WAL — LIZ — TYR — PRO — ASP — ALA — GLI — GLU — OH (1—28). 171 mg chronionego oktapeptydu, otrzymanego w etapie 7, rozpuszczono w 5 ml 90% kwasu trój- fluorowego, roztwór pozostawiono na 15 minut po czym odparowano. Pozostalosc rozpuszczono wT 2 ml wody i ponownie odparowano; operacje te po¬ wtórzono, nastepnie pozostalosc rozpuszczono w 2 ml wody i przepuszczono przez kolumne zawiera¬ jaca 5 ml zywicy jonowymiennej Amberlite IRA^- 400 w cyklu octanowym. Kolumne przemyto na¬ stepnie 120 ml wody i polaczone ciecze poddano liofilizacji. Otrzymano 127,5 mg (96°/o wydajnosci teoretycznej) wolnego oktakozapeptydu.Analiza aminokwasów: LIZ 3,86 (4), ARG 2,95 (3), HIS 1,2 (1), ASP 1,01 (1), SER 2,05 (2), GLU 2,05 (2), PRO 2,9 (3), GLI 3,0 (3), ALA 0,97 (1), WAL 2,85 (3), MET 0,96 (1), TYR 1,77 (2), FEN 1,04 (1).Przyklad XIV. Sposób otrzymywania fragmen¬ tu (1—32) ludzkiej kortykotropiny.Etap 1: Z — SER — ALA — OBut (31—32) Z 7,5 g (29,5 milimola) Z — SER —N2H3 spo¬ rzadzono zawiesine w 80 ml dwumetyloformamidu, zawiesine oziebiono do temperatury — 10°C po czyim dodano najpierw 7,3 ml stezonego kwasu solnego, nastepnie wkroplono stezony, wodny roztwór 2,04 g azotanu sodu. Mieszanine reakcyjna mieszano w ciagu 5 minut, nastepnie ostroznie zalkalizowa- no 12,4 ml trójetyloaminy, po czym do roztworu azydu dodano roztwór 4,5 g (41 milimola) ALA — OBu* w 16 ml dwumetyloformamidu. Mieszanine mieszano w ciagu godziny, utrzymujac temperatu¬ re —10°C, po czym pozostawiono do nastepnego dnia w temperaturze pokojowej. Nastepnie roz¬ twór odparowano pod zmniejszonym cisnieniem i oleista pozostalosc rozpuszczono w mieszaninie 150 ml octanu etylu i 30 ml wody. Roztwór wy¬ trzasano trzykrotnie za kazdym razem z 30 ml 10°/o roztworem kwasu cytrynowego, nastepnie trzykrotnie, za kazdym razem z 30 ml, 8°/o roztwo¬ ru wodoroweglanu sodu i w koncu z 30 ml wody.Warstwe organiczna wysuszono nad bezwodnym siarczanem sodu i odparowano. Oleisty ester dwu- peptydu pozostawiono do skrzepniecia pod eterem naftowym, nastepnie odsaczono. Otrzymano 8,4 g (76°/o wydajnosci teoretycznej) chronionego estru dwupeptydu; po przekrystalizowaniu z 10% eta¬ nolu temperatura topnienia wynosila 63—65°C.Analiza: C18H26N206 + 1/3 HaO (372,42) Obliczono: C 58,10%, H 7,25°/o, N 7,53%.Otrzymano: C 58,18%, H 7,26%, N 7,80%.Etap 2: H — SER — ALA — OBut. HOOC — CH3 (31—32). 10,0 g (27,4 milimola) Z — SER — ALA — OBut rozpuszczono w 100 ml 80% kwasu octowego i uwodorniano wobec palladu na weglu aktyw- 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6043 79252 44 nym. Po zakonczeniu wydzielania sie C02 katali¬ zator odsaczono, a roztwór odparowano pod zmniejszonym cisnieniem. Oleista pozostalosc po¬ zostawiono do skrzepniecia pod eterem etylowym, po czym przesaczono. Otrzymano 6,9 g (87% wy¬ dajnosci teoretycznej) wolnego octanu estru dwu- peptydu. Temperatura topnienia 76—78°C. Rf7 0,55.Etap 3: Z — GLU(NH2) — OPCP (30). 14,0 g (50 milimoli) Z — GLU(NH2), 13,3 g (50 milimoli) pieciochlorofenolu oraz 10,5 g (50 mili¬ moli) dwucykloheksylokarbodwuimidu rozpuszczo¬ no w 150 ml dwumetyloformimidu w temperatu¬ rze 0°C. Mieszanine reakcyjna utrzymano w tem¬ peraturze 0°C w ciagu 1 godziny, nastepnie pozo¬ stawiono do ogrzania sie do temperatury pokojo¬ wej. Nastepnego dnia odsaczono dwucykloheksylo- mocznik, a roztwór odparowano pod próznia.Otrzymano krystaliczna pozostalosc, która rozcien¬ czono eterem i przesaczono. Otrzymano 17,25 g (65% wydajnosci teoretycznej) aktywnego estru.Temperatura topnienia 179—181°C.Etap 4: Z — GLU(NH2) — SER — ALA OBut (30—32). 4,2 g (14,4 milimola) soli estru dwupeptydu SER — ALA — OBut — octan oraz 7,6 g (14,4 milimo¬ la) Z — GLU(NH2) — OPCP rozpuszczono w mie¬ szaninie 5 ml bezwodnej pirydyny i 30 ml dwu- metyloformamidu. Mieszanine reakcyjna pozosta¬ wiono na okres 20 godzin, nastepnie odparowano pod zmniejszonym cisnieniem. Otrzymana oleista pozostalosc rozcienczono eterem etylowym, prze¬ myto 8% roztworem wodoroweglanu sodu, na¬ stepnie woda i wysuszono. Otrzymano 4,8 g (67,5 wydajnosci teoretycznej) chronionego estru trój- peptydu. Temperatura topnienia 183—185°C. Po przekrystalizowaniu z wody, czysty ester topi sie w temperaturze 196—197°C. Temperatura mieknie¬ cia okolo 193°C.Analiza: C23H34N408 (494,63) Obliczono: N 11,35%; Otrzymano: N 11,33%.Etap 5: Z — ASP(OBut) — GLU(NH2) — SER — ALA OBut (29—32). 4,1 g (8,3 milimola) chronionego estru trójpepty- du Z — GLU(NH2) — SER — ALA — OBut roz¬ puszczono w 400 ml metanolu podczas ogrzewania, nastepnie do roztworu, oziebionego do temperatu¬ ry pokojowej, dodano metanolowy roztwór 300 mg (8,3 milimola) chlorowodoru i uwodorniano wobec palladu na weglu aktywnym, az do zakonczenia wydzielania sie C02. Nastepnie katalizator odsaczo¬ no, a roztwór odparowano pod zmniejszonym cis¬ nieniem. Otrzymana pozostalosc w postaci stalej piany rozpuszczono w 32 ml dwumetyloformamidu, po czym dodano 3,45 g (8,2 milimola) aktywnego estru Z — ASP(OBut) — ONSu oraz 1,16 ml (8,3 milimola) trójetyloaminy. Mieszanine reakcyjna po¬ zostawiono na okres 2 dni, nastepnie odparowano, a oleista pozostalosc pozostawiono do skrzepnie¬ cia pod eterem etylowym. Odsaczony produkt przemyto eterem etylowym, 8% roztworem wodo¬ roweglanu sodu i w koncu woda, po czym wysu¬ szono. Otrzymano 4,8 g (87,5% wydajnosci teore¬ tycznej) chronionego estru czteropeptydu. Tempe¬ ratura topnienia 181—183°C.Analiza: C3iH47N504 (665,75) Obliczono: C 55,9%, H 7,10%, N 10,60% Otrzymano: C 55,9%, H 7,20%, N 10,60%.Etap 6: Z — GLU(OBut) — ASP(OBut) — GLU (NH2) — SER — ALA — OBut (28—32). 6,0 g (9,0 milimola) chronionego estru czteropep¬ tydu, otrzymanego w etapie 5, rozpuszczono w 100 ml 80% kwasu octowego i uwodorniono wobec palladu na weglu aktywnym az do zakonczenia wydzielania sie C02. Nastepnie katalizator podsa- czono, rozpuszczalnik odparowano,, a do otrzyma¬ nego jako pozostalosc oleistego estru tetrapeptydu dodano 20 ml etanolu, alkohol oddestylowano, ope¬ racje te powtórzono jeszcze raz. Nastepnie pozo¬ stalosc rozpuszczono w 20 ml dwumetyloformami¬ du i dodano 5,3 g (9,0 milimola) chronionego, ak¬ tywnego estru Z — GLU(OBut) — OPCP. Miesza¬ nine reakcyjna pozostawiono na noc w tempera¬ turze pokojowej, nastepnie odparowano pod zmniejszonym cisnieniem, pozostalosc rozcienczo¬ no eterem etylowym, odsaczono i przemyto na fil¬ trze eterem etylowym, po tym 8% roztworem wo¬ doroweglanu sodu, w koncu woda i wysuszono.Otrzymano 6,6 g (86% wydajnosci teoretycznej) chronionego estru pieciopeptydu. Temperatura top¬ nienia 170—173°C. Rf3 0,65.Analiza: C40H62N6O14 (850,97) Obliczono: C 56,4%, H 7,35%, N 9,90%; Otrzymano: C 55,8%, H 7,45%, N 9,75%.Etap 7: Z — WAL — LIZ(BOC) — WAL — TYR (But) — PRO — ASP(OBut) — ALA — GLI — GLU(OBut) — ASP(OBut) — GLU (NH2) — SER — ALA — OBut (20—32). 1,2 g (1,4 milimola) chronionego estru piecio¬ peptydu, otrzymanego w etapie 6, rozpuszczono w 50 ml etanolu i uwodorniono wobec palladu na weglu aktywnym w zwykly sposób. Po odsaczeniu katalizatora i odparowaniu roztworu pozostalosc oraz 1,6 g (1,4 milimola) estru N-hydroksybur- sztynoimidowego, który otrzymano z chronionego oktapeptydu, otrzymanego w etapie 2 w przykla¬ dzie II, rozpuszczono w 10 ml dwumetyloformami¬ du. Mieszanine reakcyjna pozostawiono na noc, nastepnie odparowano, pozostalosc rozcienczono woda, przesaczono i przemyto na filtrze 8% roz¬ tworem wodoroweglanu sodu, po czym woda.Otrzymano 2,25 g (85% wydajnosci teoretycznej) surowego chronionego estru tetradekapeptydu. Rf3 0,55; Produkt wykazywal podczas chromatografii domieszke oczyszczonego, chronionego oktapepty¬ du (Rf3 0,15).Etap 8: Z — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG(N02) — ARG(N02) — PRO — WAL — LIZ(BOC) — WAL — TYR(But) — PRO — ASP ,(OBut) — ALA — GLI — GLU(OBut) — ASP(OBut) — GLU(NH2) — SER — ALA — OBut (15—32). 2,25 g (1,19 milimola) chronionego estru trideka- peptydu, otrzymanego w etapie 7, rozpuszczono w 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6045 79252 46 50 ml etanolu i uwodorniono wobec palladu na weglu aktywnym. Katalizator odsaczono i roztwór odparowano. Otrzymany jako pozostalosc wolny ester trldekapeptydu oraz 1,44 g (1,06 milimola) estru pentachlorofenylowego pentapeptydu, otrzy- 5 manego w etapie 17b w przykladzie I, rozpuszczo¬ no w 5 ml dwumetyloformamidu. Mieszanine po¬ zostawiono na 1 dzien, nastepnie zatezono pod zmniejszonym cisnieniem, a pozostalosc pozosta¬ wiono dla skrzepniecia pod bezwodnym eterem 15 etylowym. Produkt przemyto eterem i wysuszono.Otrzymano 2,75 g (91°/o wydajnosci teoretycznej) surowego produktu, który rozpuszczono w 10 ml octanu etylu, po czym przeniesiono do kolumny o srednicy 2 cm, zawierajacej 60 g zelu krzemion- 20 kowego i eluowano mieszanina: octan etylu — pi¬ rydyna — kwas octowy — woda 120:10:3:5,5.W ciagu kazdych 20 minut zebrano frakcje o obje¬ tosci 3 ml. Po odparowaniu polaczonych frakcji 129—241 otrzymano 0,3 g chronionego oktapepty- 25 du. Rf3 0,35.Etap 9: H — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG — ARG — PRO — WAL — LIZ(BOC) — WAL — TYR — ALA — GLI — GLU(OBut) — GLU (NH2) — SER — ALA — OBut • 3 HC1 (15—32). 300 mg chronionego estru oktadekapeptydu, otrzymanego w etapie 8, rozpuszczono w 20 ml 80°/o kwasu octowego i uwodorniono wobec pal¬ ladu na weglu aktywnym. Postep reakcji kontro¬ lowano za pomoca chromatografii cienkowarstwo¬ wej. Po zakonczeniu reakcji roztwór przesaczono, odparowano pod próznia, pozostalosc rozcienczono bezwodnym eterem etylowym, przesaczono i wy¬ suszono. Otrzymany octan oktapeptydu rozpusz¬ czono w 7 ml 0,2 normalnego roztworu kwasu sol¬ nego w temperaturze 0°C, po czym produkt wytra¬ cono przez dodanie 7 ml nasyconego roztworu chlorku sodu. Po przesaczeniu i przemyciu nasy¬ conym roztworem chlorku sodu, produkt wysuszo¬ no. Otrzymano 144 mg (50°/o wydajnosci teoretycz¬ nej) trój chlorowodorku oktadektapeptydu. Rf1 0,40.Etap 10: BOC — SER — TYR — SER — MET — 50 GLU(OBut) — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ(BOC) — PRO — WAL — GLI — LIZ(BOC) — LIZ(BOC) — ARG — ARG — PRO — WAL — LIZ (BOC) — WAL — TYR (But) — PRO — 55 ASP(OBut) — ALA — GLI — GLU(OBut) — ASP(OBut) — GLU(NH2) — SER — ALA — OBut — 3 HCLOOH (1—32). 120 mg (0,060 milimola) chronionego tetradeka- peptydu, otrzymanego w etapie 36 w przykladzie 55 I, 144 mg (0,053 milimola) trójchlorowodorku estru oktadekapeptydu, otrzymanego w etapie 9, oraz* 97 mg (0,36 milimola) i 25 mg (0,12 milimola) dwu- cykloheksylo karbodwuimidu rozpuszczono w 0,4 ml dwumetyloformamidu. Mieszanine pozostawio- 60 no na dzien nastepnie dodano roztwór 0,06 ml (0,%43 milimola) trójetyloaminy w 0,4 ml dwumetylofor¬ mamidu i znów pozostawiono na 1 dzien. Nastep¬ nie wytracono z mieszaniny osad przez dodanie eteru etylowego, nie zawierajacego nadtlenków. Osad przesaczono, przemyto eterem i wysuszono.Otrzymany surowy produkt (270 mg) rozdzielono chromatograficznie w kolumnie zawierajacej 8 g zelu krzemionkowego, stosujac mieszanine: oc¬ tan — pirydyna — kwas mrówkowy — woda 60 : : 20 : 6 : 5,5. W ciagu kazdych 20 minut zbierano 0,5 ml frakcji. Produkt glówny uzyskano przez odpa¬ rowanie frakcji 109 do 135. W ten sposób otrzyma¬ no 24 mg (10°/o wydajnosci teoretycznej) chronio¬ nego dotriakontapeptydu. Rf7 0,2.Etap 11: H — SER — TYR — SER — MET — GLU — HIS — FEN — ARG — TRY — GLI — LIZ — PRO — WAL — GLI — LIZ — LIZ — ARG — ARG — PRO — WAL — LIZ — WAL — TYR — PRO — ASP — ALA — GLI — GLU — ASP — GLU(NH2) — SER — ALA — OH (1—32). 17 mg chronionego dotriakontapeptydu, otrzyma¬ nego w etapie 10 rozpuszczono w 0,5 ml 90°/o kwa¬ su trójfluorooctowego a po 15 minutach stania rozpuszczalnik oddestylowano pod zmniejszonym cisnieniem. Pozostalosc rozpuszczono w 0,5 ml wo¬ dy i odparowano, operacje te powtórzono. Wresz¬ cie pozostalosc rozpuszczono w 0,5 ml wody, po czym wprowadzono do kolumny zawierajacej 8 ml zywicy jonowymiennej Amberlite IRA—400 w cyk¬ lu octanowym. Kolumne przemyto 10 ml wody, a polaczone roztwory wodne poddano liofilizacji.Otrzymano 11 mg (80% wydajnosci teoretycznej) wolnego dotriakontapeptydu. Rf8 0,45.Analiza aminokwasów: LIZ 4,16 (4), ARG 2,98 (3), HIS 1,5 (1), ASP 2,0 (2), SER 3,4 (3), GLU 3,5 (3), PRO 3,2 (3), GLI 3,5 (3), ALA 1,6 (2), WAL 3,2 (3), MET 1,1 (1), TYR 2,1 (2), FEN 1,3 (1). PL