PL68243B1 - - Google Patents

Description

Opublikowano: 20,VIIU973 68243 KL 12p,4/01 MKP C07d 99/14 UKD Wspóltwórcy wynalazku: TadeuszSzczesniak, Leonard Karabin, Hanna Krakowiak-Niemczyk, Krystyna Wituch Wlasciciel patentu: Tarchominskie Zaklady Farmaceutyczne "Polfa", Warszawa (Polska) Sposób wytwarzania kwasu 6-aminopenicylanowego Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwaizania kwasu 6-aminopenicylanowego z penicyliny benzylowej (penicy¬ liny G) przez rozszczepianie wodnego roztworu penicyliny benzylowej lub jej soli za pomoca enzymów zawartych w ma¬ sie komórkowej Thiobacillus trautweinii.Dotychczas do wytwarzania kwasu 6-aminopenicylano¬ wego stosowano rózne mikroorganizmy posiadajace enzym lub zespól enzymów rozszczepiajacych penicyliny.S. Murao (Journ.Agric.Chem,Soc. Japan, 29, 400-407, 1955) stosowal do wytwarzania kwasu 6-aminopenicylano¬ wego amidaze penicylinowa - enzym otrzymany z Penicillium chrysogenum Q 176 po uprzednim dzialaniu na ten grzyb sulfatiazolem. Amidaza penicylinowa odszczepiala kwas fe¬ nylooctowy od czasteczki penicyliny G. Sposób ten byl trud¬ ny do przeprowadzenia i nie zapewnial otrzymania dostate¬ cznie duzych ilosci kwasu 6-aminopenicylanowego.W belgijskim opisie patentowym nr 569728 podano spo¬ sób, polegajacy na hodowli Penicillium chrysogenum w kon¬ wencjonalnych warunkach, lecz na pozywce, nie zawierajacej prekursorów penicyliny takich, jak kwas fenylooctowy lub kwas fenoksyoctowy. Sposobem tym otrzymywano bardzo male stezenie kwasu 6-aminopenicylanowego, w konsekwen¬ cji czego izolacja kwasu byla utrudniona i sposób ten okazal sie nieprzydatny do zastosowania w skali przemyslowej.W opisach patentowych St Zjedn. Am. nr nr 3014846, 3121667, 3144395, 3150059, 3260653, 3239428, 3272715, 3297546 wykazano postep w sposobach wytwarzania kwasu 6-aminopenicylanowego stosujac inne gatunki mikroorgani¬ zmów, posiadajace enzymy rozszczepiajace penicyliny. Jed¬ nakze sposoby wytwarzania kwasu 6-aminopenicylanowego przedstawione w wyzej wymienionych opisach patentowych posiadaja wady. ^Mianowicie, albo przebieg calego procesu (proces namnazania masy komórkowej i proces rozszczepia¬ nia) jest dlugotrwaly, albo sklad stosowanych pozywekjest skomplikowany, lub sposoby te posiadaja wymienione wady lacznie.Ponadto, stosowane w tych sposobach mikroorganizmy tworza podczas hodowli zawiesine komórkowa trudna do od¬ dzielenia od plynu hodowlanego, co wymaga uzycia szybko¬ obrotowych wirówek (15000-20000 obr/min) w celu uzys¬ kania masy komórkowej. Natomiast wytracenie komórek za pomoca zwiazków powierzchniowo czynnych, jak to przed¬ stawiono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Am. nr 3278391, wplywa na zmniejszenie zdolnosci masy komór¬ kowej do rozszczepiania penicylin juz w pierwszym procesie rozszczepiania, w nastepstwie czego ponowne uzycie tej samej masy komórkowej do rozszczepiania penicyliny niejest oplacalne.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze wodny roz¬ twór penicyliny benzylowej lub jej soli w srodowisku o war¬ tosci pH * 6,0-9,5 rozszczepia sie w temperaturze 15-45°C za pomoca enzymów zawartych w masie komórkowej Thio¬ bacillus trautweinii pasazowanego uprzednio przez pozywki zawierajace przyswajalne zródlo wegla i azotu, nastepnie w znany sposób oddziela mase komórkowa od roztworu za¬ wierajacego kwas 6-aminopenicylajiowy, który ekstrahuje sie metodami konwencjonalnymi.Bakterie Thiobacillus trautweinii pasazuje sie kolejno przez pozywke pólplynna, pozywke stala i pozywke plynna. 68 2433 68 243 4 Bakterie Thiobacillus trautweinii hoduje sie na pozyw¬ kach zawierajacych jako jedyne zródlo wegla i azotu sub¬ stancje bialkowe.Bakterie Thiobacillus trautweinii hoduje sie w tempera¬ turze 10-40°C na pozywkach o wartosci pH - 3,0-10,0 w ciagu 6-36 godzin.Mase komórkowa Thiobacillus trautweinii stosuje sie w ilosci 20 g na 400-2000 mg penicyliny benzylowej.Wartosc pH podczas rozszczepiania penicyliny benzylo¬ wej koryguje sie za pomoca zasad nieorganicznych, korzyst¬ nie KOH lub NaOH. Proces rozszczepiania penicyliny benzy¬ lowej prowadzi sie w ciagu 15 minut do 4 godzin.W sposobie wedlug wynalazku, zarówno proces namnaza- nia masy komórkowej, jak i proces rozszczepiania sa krótko¬ trwale, a w sklad stosowanych pozywek wchodza latwo dos¬ tepne surowce oraz odczynniki. Ponadto w sposobie wedlug wynalazku stosuje sie drobnoustrój Thiobacillus trautweinii, który w plynie hodowlanym tworzy zawiesine komórkowa, majaca tendencje do szybkiej sedymentacji i przez to oddzie¬ lanie masy komórkowej jest procesem latwym niewymagaja- cym uzycia szybkoobrotowych wirówek. Dodatkowa zaleta sposobu wedlug wynalazku jest, ze te sama mase komórko¬ wa mozna stosowac kilkakrotnie. W nastepstwie powyzszego wytwarzanie kwasu 6-aminopenicylanowego sposobem we¬ dlug wynalazku jest procesem latwym i tanim.Sposobem wedlug wynalazku otrzymuje sie stosunkowo duze stezenie kwasu 6-aminopenicylanowego wplynie po rozszczepieniu dzieki zwiekszonej zdolnosci masy komórko¬ wej do rozszczepiania penicyliny po uprzednio przeprowa¬ dzonych pasazach, polegajacych na hodowli Thiobacillus tra¬ utweinii na pozywce pólplynnej i pozywce stalej oraz w pozywce plynnej o wlasciwym skladzie i w odpowiednich warunkach, a takze dzieki wlasciwie dobranym warunkom podczas przebiegu rozszczepiania penicyliny.Zastosowanie pozywki pólplynnej w pierwszym etapie pasazowania pozwala na dlugotrwale przechowywanie Thio¬ bacillus trautweinii bez utraty jego zdolnosci zarówno do wzrostu, jak i do rozszczepiania penicyliny, dajac odpowiedni material szczepienny dla pozywki stalej.Zastosowanie pozywki stalej w drugim etapie pasazowa¬ nia zwieksza zdolnosc Thiobacillus trautweinii do rozszcze¬ piania penicyliny w nastepstwie fizjologicznej indukcji enzy¬ mów rozszczepiajacych penicyline, dajac odpowiedni ma¬ terial szczepienny dla pozywki plynnej.Zastosowanie pozywki plynnej w trzecim etapie pasazo¬ wania umozliwia namnozenie masy komórkowej Thiobacillus trautweinii o duzej zdolnosci do rozszczepiania penicyliny.Stosowane pozywki nie zawieraja weglowodanów, które wplywaja ujemnie na zdolnosc szczepu do wytwarzania en¬ zymów rozszczepiajacych penicyline, co stanowi dodatkowa zalete sposobu wedlug wynalazku.Zastosowanie masy komórkowej Thiobacillus trautweinii w ilosci 20 g masy komórkowej na 400-2000 mg penicyliny benzylowej, uzytej do rozszczepienia oraz przeprowadzenie procesu rozszczepiania we wlasciwych warunkach pH i tem¬ peratury pozwala na otrzymanie w plynie dosc duzego steze¬ nia kwasu 6-aminopenicylanowego podczas stosunkowo krótkotrwalego procesu.Wytwarzanie kwasu 6-aminopenicylanowego sposobem wedlug wynalazku przedstawiaja szczególowe przyklady, w których procenty oznaczaja procenty objetosciowe, o ile nie zaznaczono inaczej.Przyklad I. Przygotowywano pozywke pólplynna o skladzie: WyciagHottinger'a*) 40,0% Agar 0,2% (wagowych) s Wodadestylowana do 100,0% Jest to wodny wyciag z miesa wolowego trawionego enzy¬ mami trzustki, zawierajacy okolo 600 mg azotu aminowego na 100 ml wyciagu.Wartosc pH pozywki nastawiono na 7,2 za pomoca wodo¬ rotlenku sodowego. Tak przygotowana pozywke rozlewano na goraco po 10 ml do probówek i wyjalawiano w tempera- is turze 110°C wciagu 30 minut. Probówki z pozywka szcze¬ piono 24 godzinna hodowla bakterii pobrana oczkiem z ta¬ kiej samej pozywki. Inkubacje przeprowadzono w tempera¬ turze 28°C w ciagu 24 godzin. ao Przygotowywano pozywke stala o skladzie: Wyciag namokowy kukurydzy (50% suchejmasy) 8,0% Agar 2,0% (wagowych) Wodawodociagowa do 100,0% Wartosc pH pozywki nastawiono na 7,2 za pomoca wodo¬ rotlenku sodowego. Tak przygotowana pozywke rozlewano na goraco po 10 ml do probówek i wyjalawiano w tempera¬ turze 11(FC wciagu 30 minut. Probówki z pozywka szcze- 30 piono 24 godzinna hodowla bakterii pobrana oczkiem z po¬ zywki pólplynnej. Inkubacje przeprowadzono w temperatu¬ rze 28°C w ciagu 24 godzin.Przygotowywano pozywke plynna o skladzie: 35 Preparowany wyciag namokowy kukurydzy (10% suchej masy) 15,0% Pepton"BacutiT 0,25% wagowych Chlorek sodowy techniczny 0,25% wagowych Woda wodociagowa do 100,0% Wartosc pH pozywki nastawiono na 7,2 za pomoca wodo¬ rotlenku sodowego. Tak przygotowana pozywke rozlewano po 50 ml do kolb £rlenmeyer'a o pojemnosci 500 ml i wyja¬ lawiano w temperaturze 110°C wciagu 30 minut Kazda 49 kolbe z pozywka szczepiono 0,25 ml zawiesiny bakterii z pozywki stalej. Hodowle prowadzono na trzesawce obroto¬ wej o 220 obrotach/minute i mimosrodzie 25 mm w tempe¬ raturze 28°C w ciagu 18 godzin. Po zakonczeniu hodowli uzyskana zawiesine komórkowa w pozywce plynnej podda- so no wirowaniu na wirówce o 3000 obrotach/minute. Plyn znad osadu usunieto przez dekantacje.Do kolby o pojemnosci 500 ml wlewano 300 ml wody destylowanej i dodawano mase komórkowa otrzymana z po¬ zywki plynnej o objetosci 3000 ml (20 g masy komórkowej 5s w postaci ciasta) oraz dodawano 1,2 ml toluenu. Kolbe z zawartoscia umieszczono w lazni wodnej z termoregulacja o temperaturze 35°C i wprowadzono do kolby mieszadelko.Mieszano az do otrzymania jednorodnej zawiesiny komórek w plynie. Nastepnie dodawano w trakcie mieszania 400 mg 60 soli sodowej penicyliny G co odpowiadalo 2000 j/mL Rozszczepianie przeprowadzono w srodowisku o wartosci pH - 8,0.W celu utrzymania pH o wymaganej wartosci dodawano 6n NaOH lub 6n KOH. Rozszczepianie przeprowadzono 6s w ciagu 2 godzin. Obecnosc kwasu 6-aminopenicylanowego5 68243 6 wytwarzanego podczas rozszczepiania potwierdzano metoda chromatografii na talku w ukladzie butanol: aceton : eter: : woda - (72 : 22,5 : 22,5 : 8,5) wedlug Wasilewa B., Ciesla¬ ka J.: Cienkowarstwowa chromatografia kwasu 6-aminopeni- cylanowego i penicylin na talku. Antibiotiki, 10, 877, 1965.Po zakonczonej reakcji oddzielano mase komórkowa przez wirowanie a otrzymany plyn zakwaszono 6n HCL do wartos¬ ci pH ¦ 2,0 i poddawano 3-krotnej ekstrakcji octanem amy- lu. Nierozszczepiona penicylina i odszczepiony kwas fenylo¬ octowy przechodzily do fazy organicznej. Kwas 6-aminope- nicylanowy pozostaly w fazie wodnej oznaczano ilosciowo konwencjonalna metoda biologiczna po uprzednim przepro¬ wadzeniu go w penicylino benzylowa za pomoca chlorku kwasu fenylooctowego. Jako organizm testowy stosowano Bacillus subtilis 6633.Wyniki oznaczen wyrazone wjednostkach penicyliny ben¬ zylowej, przy czym jednostka penicyliny benzylowej (soli sodowej) odpowiada 0,658 jednostki kwasu 6-aminopenicy- lanowego. Stezenie penicyliny w plynie przygotowanym do procesu rozszczepiania wynosilo 2000j/mL Stezenie kwasu 6-aminopenicylanowego po zakonczeniu rozszczepiania wynosilo 355,3 j/mL Kwas 6-aminopenicylanowy, znajdujacy sie w plynach po rozszczepianiu, izolowano jedna z konwencjonalnych metod.Przyklad II. Sklad jakosciowy i ilosciowy pozywek, sposób ich przygotowania, warunki hodowli Thiobacillus trautweinii oraz sposób uzyskiwania masy komórkowej byly takie same jak w przykladzie I. Ilosc masy komórkowej uzy¬ tej do rozszczepiania penicyliny i warunki rozszczepiania byly takie same jak w przykladzie I, lecz ilosc uzytej penicy¬ liny wynosila 2000 mg w 300 ml plynu, co odpowiadalo 10000j/ml Metody oznaczania kwasu 6-aminopenicylano¬ wego byly takie same jak w przykladzie I.Stezenie penicyliny wplynie przygotowanym do roz¬ szczepiania wynosilo 10000j/mL Stezenie kwasu 6-aminope¬ nicylanowego po zakonczeniu rozszczepiania wynosilo 1645 j/ml Przyklad III. Sklad jakosciowy i ilosciowy pozywki pólplynnej i stalej oraz sposób ich przygotowywania byl taki sam jak w przykladzie I. Natomiast ze skladu pozywki plynnej wyeliminowano pepton, w nastepstwie czego sklad pozywki byl nastepujacy: Preparowany wyciag namokowy kukurydzy (10% suchej masy) 15,0% Chlorek sodowy techniczny 0,25%wagowych Wodawodociagowa do 100,0% Sposób przygotowania pozywki plynnej, warunki hodow¬ li Thiobacillus trautweinii oraz sposób uzyskania masy komórkowej byly takie same jak w przykladzie I. Ilosc masy komórkowej uzytej do rozszczepiania i warunki rozszczepia¬ nia byly takie same, jak w przykladzie I, lecz ilosc uzytej penicyliny wynosila 2000 mg, co odpowiadalo 10000 j/mL 5 Metody oznaczania kwasu 6-aminopenicylanowego byly takie same jak w przykladzie I.Stezenie penicyliny wplynie przygotowanym do roz¬ szczepiania wynosilo 10000 J/ml. Stezenie kwasu 6-aminope- nicylanowgo' po zakonczeniu rozszczepiania wynosilo io 1414,7j/mL PL PL

Claims (9)

1. Zastrzezenia patentowe ts 1. Sposób wytwarzania kwasu 6-aminopenicylanowego na drodze enzymatycznego rozszczepiania penicyliny benzylo¬ wej, znamienny tym, ze wodny roztwór penicyliny benzylo¬ wej lub jej soli w srodowisku o wartosci pH ¦ 6,0-9,5 roz¬ szczepia sie w temperaturze 15-45°C za pomoca enzymów w zawartych w masie komórkowej Thiobacillus trautweinii pa- sazowanego uprzednio przez pozywki zawierajace przyswajal¬ ne zródlo wegla i azotu, nastepnie w znany sposób oddziela mase komórkowa od roztworu zawierajacego kwas 6-amino¬ penicylanowy, który ekstrahuje sie metodami konwen-< as cjonalnymi.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze bakterie Thiobacillus trautweinii pasazuje sie kolejno przez pozywke pólplynna, pozywke stala i pozywke plynna.

3. Sposób wedlug zastrz. 1,2, znamienny tym, ze bakterie 90 Thiobacillus trautweinii hoduje sie na pozywkach zawiera¬ jacych jako jedyne zródlo wegla i azotu substancje bial¬ kowe.

4. Sposób wedlug zastrz. 1-3, znamienny tym, ze do hodowli Thiobacillus trautweinii stosuje sie pozywki o war- •5 toscipH ¦ 3,0-10,0.

5.Sposób wedlug zastrz. 1 -3, znamienny tym, ze Thioba¬ cillus trautweinii hoduje sie w temperaturze 10-40°C.

6. Sposób wedlug zastrz. 1-4, znamienny tym, ze Thio¬ bacillus trautweinii hoduje sie w ciagu 6-36 godzin. 40

7. Sposób wedlug zastrz. 1-6, znamienny tym, ze mase komórkowa Thiobacillus trautweinii stosuje sie w ilosci 20 g na 400-2000 mg penicyliny benzylowej.

8. Sposób wedlug zastrz. 1 -7, znamienny tym, ze war¬ tosc pH podczas rozszczepiania penicyliny benzylowej kory- 4* guje sie za pomoca nieorganicznych zasad, korzystnie KOH lub NaOH.

9. Sposób wedlug zastrz. 1-8, znamienny tym, ze proces rozszczepiania penicyliny benzylowej prowadzi sie wciagu od 15 minut do 4 godzin. PL PL