PL64957B1 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: Opublikowano: 07.XI.1B68 — (P 129 941) 64957 KI. 12 o, 15 MKP C 07 c 59/38 25.Y.1972 UKD Wspóltwórcy wynalazku: Jadwiga Belzecka, Stanislaw Poradowski, Je¬ rzy Schnayder, Anna Kulpa Wlasciciel patentu: Krakowskie Zaklady Farmaceutyczne „Polfa" Przed¬ siebiorstwo Panstwowe, Kraków (Polska) Sposób wytwarzania kwasu 2-keto-l-gulonowego Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia kwasu 2-keto-l-gulonowego.Znane sa sposoby otrzymywania kwasu 2-keto- -1-gulonowego prowadzone przy uzyciu bakterii Pseudomonas, na przyklad Pseudomonas milden- bergii (opis patentowy St. Zjedn. Am. 2.421.611).Wedlug znanych sposobów proces biologicznego utleniania prowadzony jest w roztworach miesza¬ niny kwasu 1-idonowego i d-glukonowego w sto¬ sunku wagowym 1 :1 o stezeniu substratu 10— —20°/o, co w skali przemyslowej jest uciazliwe ze wzgledu na koniecznosc operowania duzymi ob- jetosciami roztworów, które wymagaja dodatko¬ wych operacji zatezania w fazie wydzielania pro¬ duktu koncowego.Istote wynalazku stanowi metoda otrzymywania kwasu 2-keto-l-gulonowego z mieszaniny o skla¬ dzie 1-idonian i d-glikonian wapnia w stosunku wagowym 1:1 przez poddanie tej mieszaniny bio¬ logicznemu utlenianiu przy pomocy szczepu Pseu¬ domonas ovalis posiadajacego zespól enzymów zdolnych do przeprowadzenia soli wapniowej kwa¬ su 1-idonowego w stezeniach 20—50*Vo, w kwas 2-keto-l-gulonowy przy równoczesnym rozkladzie soli kwasu d-glikonowego.Bakterie Pseudomonas ovalis wydzielane i ozna¬ czane w znany sposób przed poddaniem ich zabie¬ gom sposobem wedlug wynalazku maja cechy od¬ powiadajace danym taksonomicznym dla tego ga¬ tunku bakterii i nie posiadaja wlasciwosci utlenia- 15 20 25 30 nia mieszaniny kwasu 1-idonowego i d-glikonowegc w stezeniu 20—50°/a do kwasu 2-keto-l-gulonowego.Istotnym elementem sposobu wedlug wynalazku jest to, ze w procesie stosuje sie uaktywniony szczep Pseudomonas ovalis, co pozwala na utle¬ nienie produktu w wysokich stezeniach siegajacych do 50°/o.Aktywacje mozna stosowac równiez do innych gatunków bakterii na przyklad Pseudomonas mil- denbergii zdolnych do utleniania! tego samego pro¬ duktu.Aktywacje szczepu Pseudomonas ovalis prowadzi sie przez ich adaptacje do podloza zawierajacego jako substrat mieszanine o skladzie 1-idonian i d-glikonian wapnia w stosunku wagowym 1 :1 i stezeniu 10—20°/o. Bakterie posiane na podloze zawierajace oba zwiazki, wykorzystuja najpierw d-glikonian wapnia, poniewaz dla niego posiada¬ ja gotowy aparat enzymatyczny. Po uplywie kil¬ ku dni bakterie zuzywaja prawie caly zapas d-gli- konianu.W czasie prowadzenia hodowli przez 30 dni obu¬ miera czesc osobników, a w hodowli gromadza sie bakterie zdolne do wykorzystania substancji odzywczej 1-idonianu o wysokim stezeniu.Przez wielokrotne pasazowanie na podlozu o wyzej podanym skladzie, oraz przez odpowiednie prowadzenie hodowli, bakterie wytwarzaja enzy¬ my adaptacyjne, które pozwalaja na utlenienie substratu o wysokich stezeniach od 20—50°/©. Po- 64 9573 64 957 4 kwasu 2-keto-l-glikonowego, przechowuje sie na skosach z pozywka agarowa zawierajaca 20% mie¬ szaniny 1-idonianu i d-glikonianu wapnia w sto¬ sunku wagowym1:1. . .¦ 5 Ze skosu przeszczepia sie hodowle na pozywke plynna zawierajaca 10% mieszaniny 1-idonianu i d-glikonianu wapnia w stosunku wagowym 1 :1 oraz sole mineralne.Hodowle prowadzi sie w termostacie w tempe- 10 raturze 28°C, stacjonarnie przez 12 dni. Tak przy¬ gotowana hodowla zaszczepia sie pozywke w kol¬ bach 500 ml stosujac 10% inoculum i wytrzasa na wytrzasarce laboratoryjnej przez 72 godziny.Zawartoscia kolb zaszczepia sie tank fermenta- 15 cyjny 10 1 zawierajacy 5 1 pozywki produkcyjnej zawierajacej 30% mieszaniny 1-idonianu i d-gliko¬ nianu wapnia w stosunku wagowym 1 :1 stosujac 10% inoculum o gestosci 12,3 mg/ml pIL poczatkowo ustala sie na 6,5 i nie jest ono regulowane w cza- 20 sie biologicznego utleniania. Do tanku wprowadza sie sterylne powietrze w ilosci jedna objetosc po¬ wietrza/objetosc pozywki na minute i miesza z szybkoscia 240 obrotów na minute.Prowadzac w ten sposób proces utleniania przez 25 68 godzin otrzymuje sie sól wapniowa kwasu 2- -keto-1-gulonowego z wydajnoscia 99% w stosun¬ ku do zawartego w pozywce 1-idonianu wapnia.Kwas 2-keto-l-gulonowy izoluje sie z plynu po reakcji utleniania przez zadanie kwasem szczawio- 30 wym w ilosci 155,7 g. Wydzielony szczawian wap¬ nia odsacza sie, w prózni podgeszcza sie filtrat w temperaturze 33°C do momentu pojawienia sie pierwszych krysztalów. Po 24 godzinach saczy sie wydzielony kwas 2-keto-l-gulonowy. Filtrat pod- 35 geszcza sie jak wyzej i uzyskuje sie drugi rzut krysztalów. Razem otrzymuje sie 570 g kwasu 2- -keto-1-gulonowego o zawartosci 98% czystej sub¬ stancji o temperaturze topnienia 165—168°C. Wy¬ dajnosc 85% teorii. 40 PL PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe nadto zmodyfikowane szczepy odznaczaja sie zdol¬ noscia do przystosowania do tych wartosci pH srodowiska, jakie utrzymuje sie w czasie trwania reakcji. Sposób wedlug wynalazku otrzymywania kwa¬ su 2-keto-l-gulonowego polega na tym, ze uaktyw¬ nione bakterie Pseudomonas ovalis zaszczepia sie do mieszaniny o skladzie 1-idonian i d-glikonian wapnia w stosunku wagowym 1 :1, o stezeniu 20 —50% otrzymanej po wysokocisnieniowej redukcji 5-keto-glikonianu wapnia. Uaktywnione bakterie Pseudomonas ovalis utle¬ niaja substrat do soli wapniowej kwasu 2-keto-l- gulonowego przy równoczesnym rozkladzie obec¬ nego kwasu 2-keto-d-glikonowego. PH pozywki ustala siej na poziomie 6,5 i nie jest ono regulo¬ wane w czasie biologicznej reakcji utleniania. Utlenianie prowadzi sie metoda glebinowa. Ilos¬ ciowe utlenienie 1-idonianu wapnia do soli wap¬ niowej kwasu 2-keto-l-gulonowego nastepuje po 38 do 72 godzinach hodowli, a kwas 2-keto-l-gu¬ lonowy izoluje sie z plynu po utlenieniu przepro¬ wadzajac sól wapniowa w wolny kwas dzialaniem kwasu siarkowego. Stwierdzono, ze w miare wzrostu stezenia sub- stratu w pozywce przedluza sie czas trwania reak¬ cji, jednak przedluzenie tego czasu nie wzrasta proporcjonalnie ze wzrostem stezenia. Czas po¬ trzebny do utlenienia pozywek 30% nie jest nawet dwukrotnie wiekszy od czasu utlenienia substratu o stezeniu 10%. Równoczesnie wyizolowanie wolnego kwasu 2- -keto-1-gilonowego jest latwiejsze i nastepuje w znacznie skróconym czasie. Dla pozywek o ste¬ zeniu 30% czas potrzebny na wyizolowanie kwa¬ su jest trzykrotnie krótszy niz dla pozywek 10%. Przyklad I. Wyizolowane znanymi sposoba¬ mi bakterie Pseudomonas ovalis przeszczepia sie na pozywke agarowa o nastepujacym skladzie: mieszanina 1-idonian i d-glikonian wapnia w sto¬ sunku wagowym 1:1 — 10%, sole mineralne: (NH4)2S04 — 0,2%, KH2PO4 0,1%, MgS04 • 7H20 A025%. Hodowle bakterii prowadzi sie przez trzy dni w temperaturze 30°C a nastepnie w tempera¬ turze 18°C przez 27 dni. Po dwóch przesiewach w odstepach 30-dniowych na pozywke o wyzej wymienionym skladzie i pa¬ rametrach temperatury oraz czasu zwieksza sie stezenie substratu w podlozu do 12%. Po nastepnych trzech przesiewach zwieksza sie stezenie substratu w podlozu do 18% i dokonuje czterech przesiewów. W komórkach bakterii przesiewanych na podlo¬ ze zawierajace 20% substratu gromadzi sie juz dostateczna ilosc enzymów do wykorzystania sub¬ stratu o stezeniu 20—50%. Uzyskany na tej drodze szczep Pseudomonas ovalis MB 1252 o nowych wlasciwosciach, powo¬ dujacych utlenianie mieszaniny 1-idonianu i d-gli¬ konianu wapnia w stosunku 1 : 1 o stezeniu 30% substratu, do soli wapniowej kwasu 2-keto-l-gulo¬ nowego, przy równoczesnym rozkladzie obecnego 1. Sposób wytwarzania kwasu 2-keto-l-gulono¬ wego przez biologiczne utlenianie mieszaniny soli kwasu 1-idonowego i d-glikonowego, znamienny tym, ze stosuje sie bakterie Pseudomonas ovalis uaktywnione przez adaptacje do podloza zawie¬ rajacego 10—20% mieszaniny 1-idonianu i d-gliko¬ nianu wapnia w stosunku wagowym 1:1 polega¬ jaca na wielokrotnym pasazowaniu przy zwiek¬ szanych stopniowo stezeniach substratu w odste¬ pach 30 dniowych, przy czym biosynteze prowadzi sie przy stezeniach substratu 20—50% i stosunku wagowym kwasu 1-idonowego do kwasu d-gliko¬ nowego 1 : 1, a uzyskany kwas 2-keto-l-gulonowy wyodrebnia sie ze srodowiska w znany sposób.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie bakterie uaktywnione i nastepnie prze¬ chowywane na pozywkach stalych lub plynnych zawierajacych 20% mieszaniny 1-idonianu i d-gli¬ konianu wapnia w stosunku wagowym 1:1 w temperaturze 18°C przesiewajac je w odstepach 30-dniowych. 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Bltk zam. 426/72 A4 200 egz. Cena zl 10,— PL PL