PL64187B1 - - Google Patents

Description

Stwierdzono, ze anolog wazopresyny wytworzo¬ nej sposobem wedlug wynalazku posiada wysokie i przy tym specyficznie antydiuretyczne dzialanie.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze azydek 0-benzylo-merkaptopropionylo-L-tyrozylo- -L-fenyloalanylo - L-glutaminylo-L-asparaginylo- -S-benzylo-L-cysteiny kondensuje sie z amidem L^prolilo-NG-tozylo-D-arginylo-glicyny do chronio¬ nego oktapeptydu o wzorze Mep (R1) — Tyr-Phe- -Gln-Asn-Cys (R1) — Pro-D-Arg (R2) — Gly-NH2, w którym R1 oznacza grupe benzylowa, a R2 gru¬ pe p-toluenosulfonylowa, nastepnie grupy ochron¬ ne odszczepia sie przez dzialanie metalami alka¬ licznymi w cieklym amoniaku, a otrzymana zredu- 10 15 20 25 30 kowana postac polipeptydu o wzorze Mep (SH) — Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys (SH) — Pro-D-Arg-Gly-NH2 utlenia sie korzystnie zelazicyJankiem potasu w wodnym roztworze przy wartosci pH = 6,5 — 7,0 do czynnego antydiuretycznie polipeptydu o wzo¬ rze podanym na rysunku. Wymieniona pochodna oktapeptydu moze byc wytworzona równiez inny¬ mi sposobami ogólnie stosowanymi przy otrzymy¬ waniu polipeptydów. Mozna ja wytwarzac przez stopniowa dobudowe zarówno ze strony grupy aminowej jak i karboksylowej, jak równiez przez sprzeganie wczesniej wytworzonych polipeptydów, które maja kolejnosc aminokwasów odpowiadajaca polipeptydowi o wzorze podanym na rysunku.Do przejsciowej ochrony grup merkapto, amino¬ wych i grupy guanidynowej mozna stosowac grupy uzywane w syntezie polipeptydów. Grupy ochron¬ ne mozna ponownie usunac za pomoca ogólnie stosowanych sposobów w syntezie polipeptydów w jednym stopniu lub w wielu. Takze utlenianie zredukowanej postaci polipeptydu do cyklicznego polipeptydu o podanym wzorze przeprowadza sie znanymi sposobami zarówno w roztworze wodnym jak i w mieszaninach rozpuszczalników mieszaja¬ cych sie z woda. Synteze mozna np. prowadzic w ten sposób, ze chlorek kwasu 3-benzylomer- kaptopropionowego kondensuje sie z estrem me¬ tylowym tyrozyny otrzymujac nowy ester mety¬ lowy P-benzylomerkaptopropionylo-L-tyrozyny, który przeprowadza sie przez dzialanie wodzianem 6418764187 hydrazyny w nieznany dotychczas hydrazyd i azy¬ dek, który nastepnie sprzega sie z estrem metylo¬ wym L-fenyloalaniny. Otrzymana pochodna dwu- estru dwupeptydu kondensuje sie ponownie w po¬ staci azydku z estrem metylowym L-glutaminylo- -L-asparaginylo-S-benzylocysteiny otrzymujac no¬ wy ester metylowy P-benzylomerkaptopropionylo- -L-tyrozylo-L-fenyloalanylo - L-glutaminylo-L-as- paraginylo-S-benzylo-L-cysteiny, który nastepnie metoda azydowa kondensuje sie z amidem L-pro- lilo-NG-tozylo-D-arginylo-glicyny otrzymujac nowa pochodna oktapeptydu.Grupy ochronne usuwa sie przez redukcje za pomoca sodu w cieklym amoniaku, po czym zre¬ dukowany produkt przeprowadza sie przez utle¬ nienie zelazicyJankiem potasu w cykliczny biolo¬ gicznie czynny peptyd o wzorze podanym na ry¬ sunku.Polipeptyd otrzymany sposobem wedlug wyna¬ lazku odznacza sie podwyzszona i specyficzna ak¬ tywnoscia antydiuretyczna (patrz tabela), w sto¬ sunku do naturalnej argininowazopresyny, od któ¬ rej rózni sie tym, ze zawiera w pozycji 1 zamiast cysteiny kwas P-merkaptopropionowy, a w pozycji 8 zamiast L-argininy D-arginine.Tabela Zwiazek 1-dezamino-D- Arg8-wazopresy- na' 1-dezamino- -Phe2-L-Arg8- -wazopresyna Aktywnosc antydiure¬ tyczna w IM/mg 16 000+200 800+170 Aktyw¬ nosc pre- soryczna w IM/mg 11 29±7 Dzialanie specyfi¬ czne | 1454 27,5 Aktywnosc wyrazono w jednostkach miedzynaro¬ dowych IM na mg. Specyficzne dzialanie wyra¬ zono stosunkiem aktywnosci antydiuretycznej do aktywnosci presorycznej.Polipeptyd o wzorze podanym na rysunku, któ¬ ry mozna okreslic jako l-dezamino-8-D-arginino- -wazopresyne, z uwagi na dzialanie biologiczne jest obecnie najkorzystniejszym preparatem do re¬ gulowania poliurii i lagodzenia polidypsji przy diabetes insipidus.Polipeptyd mozna stosowac zarówno w postaci wolnej zasady jak tez w postaci soli z kwasami nieorganicznymi i organicznymi, ewentualnie z do¬ datkiem srodków pomocniczych, stabilizujacych, konserwujacych, slodzacych, aromatyzujacych i zwilzajacych w celu wytworzenia postaci leku do stosowania pozajelitowego, doustnego, donosowego, podskórnego, domiesniowego i dozylnego. Jako kwasy nieorganiczne mozna stosowac, np. kwas solny, fosforowy i borowy, a jako kwasy organicz¬ ne np. kwas octowy, cytrynowy i winowy, tanine i podobne zwiazki o charakterze kwasowym. Jako zwiazki pomocnicze stosuje sie skrobie, laktoze, oleje naturalne i utwardzone, talk, gliceryne itp.Przyklad. 9,2 g kwasu P-benzylomerkapto- propionowego przeprowadzono w chlorek przez dzialanie nadmiarem chlorku tionylu, nastepnie 20 25 30 35 40 50 55 chlorek rozpuszczono w 20 ml octanu etylu. Roz¬ twór wprowadzono przy intensywnym mieszaniu i chlodzeniu do temperatury 0°C do mieszaniny 10,9 g chlorowodorku estru metylowego L-tyrozy- ny, 50 ml wody i 50 ml octanu etylu, przy czym utrzymano slabo alkaliczna wartosc pH miesza¬ niny reakcyjnej przez dodatek wodoroweglanu sodu. Warstwe octanowa oddzielono, wysuszono, odparowano pod zmniejszonym cisnieniem, a po¬ zostalosc po odparowaniu przekrystalizowano z ukladu octan etylu — eter naftowy. Z lugu ma¬ cierzystego uzyskano przez odparowanie i krysta¬ lizacje druga czesc. Otrzymano ester metylowy P-benzylomerkapto-propionylo-L-tyrozyny. Wydaj - nosc ogólna wynosi 16,5 g, to jest 73% wydajnosci teoretycznej. Temperatura topnienia 89—90°C [a]2S —3,4 ± 0,5 (c = 0,5 dwumetyloformamid). Dla C2eH23N04 S (373,5) obliczono 64,31% C, 6,21% H, 3,75% N; znaleziono 64,38% C, 6,25% H, 3,71% N. 15,3 g estru metylowego P-benzylomerkaptopro- pionylo-L-tyrozyny rozpuszczono w 60 ml etanolu, dodano 6 ml 80% wodzianu hydrazyny i miesza¬ nine ogrzewano pod chlodnica zwrotna w ciagu 2 godzin. Pastowata mieszanine reakcyjna roz¬ cienczono nadmiarem wody, wytracony produkt odsaczono, przemyto na filtrze, przekrystalizowano z wodnego alkoholu. Otrzymano hydrazyd p-ben- zylomerkaptopropionylo-L-tyrozyny. Wydajnosc 11,95 g (78%); temperatura topnienia 193—194°C; a]2B —6,0 ±0,5 (c = 0,5 dwumetyloformamid). Dla wzoru sumarycznego C19H23N303S (373,5) obliczono: 61,10% C, 6,21% H, 11,25% N; stwierdzono 61,10% C, 6,11% H, 11,15% N. 5,6 g hydrazydu (3-benzylomerkaptopropionylo-L- -tyrozyny rozpuszczono w mieszaninie 50 ml dwu- metyloformamidu i 4 ml stezonego kwasu solnego.Do roztworu dodano, mieszajac i chlodzac w tem¬ peraturze—10°C, 1,03 g azotynu sodu w 2 ml wody.Ustalono wartosc pH mieszaniny reakcyjnej na 6—7 za pomoca N-etylo-piperydyny i dodano 2,7 g estru metylowego L-fenyloalaniny w 3 ml dwu- metyloformamidu. Po 12-godzinnym staniu w tem¬ peraturze 0°C i 2-godzinnym przy temperaturze pokojowej odparowano mieszanine reakcyjna pod zmniejszonym cisnieniem, a do mazistej pozosta¬ losci po odparowaniu dodano nadmiar wody, wy¬ tracony produkt odsaczono i przekrystalizowano z wodnego etanolu.Otrzymano ester metylowy (3-benzylomerkapto- propionylo-L-tyrozylo-L-fenyloalaniny. Wydajnosc 7,6 g (97%); temperatura topnienia 151—152°C; M2B —17,5 ±0,5° (c = 0,5 dwumetyloformamid). W literaturze: Huguenin R. L., Boissonnas R. A.; Helv. Chim. Acta 49 (1966), 695 podano tempera¬ ture topnienia 147—148°C i [aj25 —17,5 + 1° (c- = 1,45, dwumetyloformamid) dla produktu otrzy¬ manego z 68% wydajnoscia przez sprzeganie estru trójchiorofenylowego kwasu p-benzylomerkapto- propionowego z estrem metylowym L-tyrozylo-L- -fenyloalaniny. 14,0 g estru metylowego p-benzylomerkaptopro- pionylo-L-tyrozylo-L-fenyloalaniny ogrzewano w ciagu 2 godzin pod chlodnica zwrotna z 100 ml metanolu i 6 ml 80% wodzianu hydrazyny. Wy-64187 25 tracony produkt odsaczono, przemyto w filtrze metanolem i eterem i przefcrystalizowano z mie¬ szaniny dwumetyloformamid-woda. Otrzymano hy¬ drazyd P-benzylomerkaptopropionylo-L-tyrozylo- -L-fenyloalaniny. Wydajnosc 10,1 g (72%); tempe- 5 ratura topnienia 248—250°C; [a]2B —21,9 ±0,5° (c = 0,55 dwumetyloformamid).W literaturze przytoczonej powyzej podano tem¬ perature topnienia 251—253°C. 8 g hydrazydu (3-benzylomerkaptopropionylo-L- 10 -tyrozylo-L-fenyloalaniny skondensowano z 7,2 g estru metylowego L-glutaminylo-L-asparaginylo- -S-benzylo-L-cysteiny znanym sposobem (Zaoral M.Collection Czechoslov. Chem. Commun. 30 (1965) 1853). Po przekrystalizowaniu produkt reakcji z is dwumetyloformamidu otrzymano 11,3 g (76%) estru metylowego P-benzylomerkaptopropionylo-L-tyro- zylo-L-fenyloalanylo-L-glutaminylo-L- asparaginy- lo-S-benzylo-L-cysteiny vo temperaturze topnienia 253—255°C [aj25 —29,6 ±0,5 (c = 0,5, dwumetylo- 20 formamid).Dla wzoru sumarycznego C48H57N7O10S2 • 172 H20 (965,1) obliczono 59,73% C, 6,20% H, 10,17% N; stwierdzono 59,61% C, 6,23% H, 10,23% N. 10,8 g estru metylowego (3-benzylomerkaptopro pionylo-L-tyrozylo-L-fenyloalanylo-L - glutaminy- lo-L-asparaginylo-S-benzylo-L-cysteiny w 160 ml dwumetyloformamidu dodano 12 ml 80% wodzianu hydrazyny i pozostawiono mieszanine reakcyjna przy temperaturze pokojowej w ciagu 12 godzin.Wytracony produkt odsaczono, przemyto na filtrze metanolem i eterem, nastepnie wysuszono. Otrzy- 30 mano hydrazyd P-benzylomerkaptopropionylo-L- -tyrozylo-L-fenyloalanylo-L-glutaminylo-L - aspa- raginylo-S-benzylo-L-cysteiny. Wydajnosc 6,7 g (62%). Temperatura topnienia 266—268°C bez zmia¬ ny po przekrystalizowaniu z ukladu dwumetylo- 35 formamid-woda; [aj2s —33,4 ±0,5° (c = 0,5, dwu¬ metyloformamid).Dla wzoru sumarycznego C47H57N909S2 (956,1) obliczono: 59,04% C, 6,01% H, 13,19% N, stwier¬ dzono 59,04% C, 6,16% H, 13,25% N.Wytworzono znanym sposobem (patrz wyzej po¬ dana literatura) z hydrazydu P-benzylomerkapto- propionylo-L-tyrozylo-L-fenyloalanylo-L - gluta- minylo-L-asparaginylo-S-benzylo-L-cysteiny i ami¬ du L-prolilo-NG-tozylo-D-arginylo-glicyny amid p-benzylomerkaptopropionylo-L-tyrozylo-L - feny- loalanylo-L-glutaminylo-L-asparaginylo-S - ben- zylo-L-cysteinylo-L-prolilo-NG-tozylo-D - arginy- loglicyny z 68% wydajnoscia. Temperatura topnie¬ nia 223—225°C.Dla wzoru sumarycznego C67H84N14014S3 (1405,65) obliczono: 57,24% C, 6,02% H, 13,75% N; stwier¬ dzono 57,35% C, 6,01% H, 13,99% N. 0,5 g amidu P-benzylomerkaptopropionylo-L-ty- 40 50 rozylo-L-fenyloalanylo-L-glutaminylo-L. - aspara- ginylo-S-benzylo-L-cysteinylo-L-proliló-NG - tozy- lo-D-arginyloglicyny zredukowano znanym sposo¬ bem (wedlug wyzej podanej literatury) za pomoca sodu w cieklym amoniaku. Po odparowaniu amo¬ niaku otrzymana pozostalosc rozpuszczono w 800 ml 5% kwasu octowego, nierozpuszczalna czesc odsa¬ czono, wartosc pH przesaczu ustawiono na 6,5—7 za pomoca wodorotlenku sodu i roztwór znanym sposobem utleniono Kimbrough R. D. Jr., Cash.W. D., Brands L. A., Chan W. Y., du Vigneaud V.: J. Biol. Chem. 238 (1963) 1411.Wartosc pH mieszaniny reakcyjnej ustalono na 4,0—4,5 przez dodatek kwasu octowego; peptyd poddano absorpcji w kolumnie wypelnionej karbo¬ ksylowa zywica kationo-wymienna, eluowano 50% kwasem octowym i wyodrebniono przez liofilizacje.Surowy produkt oczyszczono znanym sposobem (Zaoral M. Sorm. F. Collection Czechoslov. Chem.Commun. 51 (1966) 310) przy zastosowaniu beznos- nikowej wysokonapieciowej elektroforezy. Wydaj¬ nosc liofilizatu wynosi 100—200 mg. Otrzymano l^dezamino-8-D-arginino-wazopresyne. [aT —65 + 2° (c = 0,2, M—CH3COOH). Dla wzo¬ ru sumarycznego C46H64N14012S2 • 2CH3COOH (1189,3) obliczono 50,49% C, 6,10% H, 16,48% N;, stwierdzono 50,39% C, 6,32% H, 16,45% N.Analiza skladu aminokwasów wykazala w czes¬ ciach: 1/2 Cys 0,40, Tyr 0,98, Phe 1,03, Gin 1,05, Asn 1,00, Pro 1,03, Arg 0,98, Gly 0,95. PL PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania polipeptydu o dzialaniu antydiuretycznym o wzorze podanym na rysunku, który zawiera w pozycji 1 kwas p-merkaptopro- pionowy, a w pozycji 8 D-arginine, przy czym Mep oznacza merkaptopropionyl, Tyr oznacza ty- rozyl, Phe fenyloalanyl, Gin glutaminyl, Asn aspa- raginyl, Cys cysteiny 1, Pro prolil, Arg arginyl, a Gly oznacza glicyl, znamienny tym, ze azydek P-benzylomerkaptopropionylo-L-tyrozylo-L - feny- loalanylo-L-glutaminylo-L.Hasparaginylo-S - benzy- lo-Li-cysteiny kondensuje sie z amidem L-prolilo- -NG-tozylo-D-arginyloglicyny otrzymujac chronio¬ ny oktapeptyd o wzorze Mep(R1)-Tyr-Phe-Gln- -Asn-Cys-(R1)-Pro-D-Arg(R2)-Gly-NH2, w którym R1 oznacza grupe benzylowa, R2 oznacza grupe p-toluenosulfonylowa, po czym odszczepia sie gru¬ py ochronne przez dzialanie metalami alkaliczny¬ mi w cieklym amoniaku, a nastepnie otrzymany zredukowany polipeptyd o wzorze Mep(SH)Tyr- -Phe-Gln-Asn-Cys(SH)-Pro-D-Arg-Gly-NH2 pod¬ daje sie utlenianiu.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze utlenianie prowadzi sie za pomoca zelazicyjanku potasowego w roztworze wodnym przy wartosci pH = 6,5—7,0.KI. 12 q, 6/01 64187 MKP C 07 c, 103/52 ^ep-Tyr-Phe-GIn-Ain-Cys-fto-D-AgA-NH, 123 4 567 * ' PZG w Pab. zam. 1547-71, nakl. 250 egz. PL PL