PL63362B1 - - Google Patents

Description

7) BOC-D-ser-tyr-ser-norleu-NH-H-NH2 11,65 g estru czteropeptydowego rozpuszcza sie w 50 ml metanolu, dodaje do roztworu 4,8 ml wo¬ dzianu hydrazyny i pozostawia mieszanine w tem¬ peraturze pokojowej na przeciag 24 godzin. Na¬ stepnie dodaje sie do mieszaniny 50 ml wody i miesza tak dlugo, az zelazopodobny produkt w pel¬ ni nie przekrystalizuje. Uzyskany produkt topnieje w temperaturze 205—207°C. 8) BOC-D-ser-tyr-ser-norleu-glu- (OtBu)-his-fen- -arg-try-gli-OH. 8,75 g BOC-D-ser-tyr-ser-norleu-NH-NH2 roz¬ puszcza sie w 75 ml dwumetyloformamidu i zadaje podczas mieszania w temperaturze —15°C, 20 ml 2 n roztworu chlorowodoru w lodowatym kwasie octowym. Nastepnie dodaje sie 1,65 g trzeciorzedo¬ wego azotynu butylu, miesza roztwór w ciagu 10 minut w temperaturze —15°C i zadaje 5,5 ml trój- etyloaminy. Tak otrzymany roztwór BOC-cztero- peptydoazydu wprowadza sie kroplami do roztwo¬ ru skladajacego sie z 10 g H-glu-(OtBu)-his-fen- -arg-try-gli-OH, 225 ml dwumetyloformamidu i 12 ml wody, oziebionego do temperatury —10°C.Mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu 20 go¬ dzin w temperaturze 0°C, a nastepnie zadaje 900 ml wody. Bezpostaciowy dekapeptyd odsacza sie na nuczy i przemywa roztworem dwumetyloforma¬ midu (woda i dwumetyloformamid w stosunku 5:1) i acetonitrylem. Po powtórnym wytraceniu z wodnego acetonitrylu i usunieciu wilgoci po¬ wietrza otrzymuje sie 12,9 g czystego ochronionego czterowodzianu dekapeptydu posiadajacego tempe¬ rature topnienia 215—218°C (rozklad); ( 20 = 18°± ±2°C/c = 0,5 w roztworze pirydyna-woda 1:1).Cienkowarstwowy chromatogram na silikazelu wy¬ kazuje jednolitosc zwiazku: Rf (52) = 0,3. 9) BOC-D-ser-tyr-ser-norleu-glu- (OtBu)-his-fen- -arg-try-gli-liz- (BOC)-pro-wal-gli-liz- (BOC)-liz- (BOC)-liz(BOC) -liz(BOC)-NH2 1 g BOC-D-ser-tyr-ser-norleu-glu(OtBu)-his-fen- -arg-try-gli-OH i 0,7 g H-liz(BOC)-pro-wal-gli-liz (BOC)-liz(BOC)-liz(BOC)-liz(BOC)-NH2 (porównaj opis patentowy nr 59570), zawiesza sie w 20 ml pi¬ rydyny i 0,83 ml 1 n roztworu kwasu solnego. Za¬ wiesine miesza sie w ciagu 15 minut w temperatu¬ rze 50°C, nastepnie dodaje sie 0,4 g dwucyklohe- ksylokarbodwuimidu i miesza przez dalsze 3 godzi¬ ny w temperaturze 50°C. W nastepnej kolejnosci dodaje sie powtórnie taka sama ilosc dwucyklohe- ksylokarbodwuimidu i miesza przez dalsze 3 go¬ dziny w temperaturze 50°C. Potem usuwa sie pod próznia glówna czesc pirydyny, pozostalosc zadaje sie 30 ml goracego dwumetyloformamidu, rozciera i odfiltrowuje nierozpuszezone czesci.Filtrat zageszcza sie w wysokiej prózni i tempe¬ raturze 40°C do objetosci okolo 5 ml i zadaje duza iloscia wody. Wydzielony surowy produkt dobrze sie rozdrabnia, odsacza na nuczy, przemywa woda i suszy. W celu dalszego oczyszczenia, produkt wy-9 traca sie powtórnie z mieszaniny dwumetyloforma- mid-octan etylu, a nastepnie poddaje sie przeciw- pradowemu rozdzialowi w ukladzie rozpuszczalnika metanol-bufor-chloroform-czterochlorek wegla (bu¬ for = 28,5 ml lodowatego kwasu octowego i 19,3 g octanu amonu w 960 ml wody). Po 120 operacjach rozdzialu, otrzymuje sie z elementów nr 38—54 czysta pochodna amidu oktadekapeptydu o ochro¬ nionych grupach (maksymalna wagowa ilosc pro¬ duktu otrzymuje sie z elementu nr 44, liczba po¬ dzialu K = 0,58). Cienkowarstwowa chromatogra¬ fia na plytkach silikazelowych wykazuje dla pro¬ duktu nastepujace wartosci Rf: Rf w ukladzie chloroform-metanol (75 : 25) = 0,22 Rf (43A) = 0,46 Stosowany jako material wyjsciowy chroniony amid oktadekapeptydu — H-liz(BOC)-pro-wal-gli- -liz(BOC)-liz(BOC)-liz(BOC)-liz(BOC)-NH2 otrzymu¬ je sie metoda azydowa poprzez kondensacje Z-liz (BOC)-OH z H-liz(BOC)-OCH3 w obecnosci dwu- cykloheksylokarbodwuimidu, przeprowadzenie chro¬ nionego estru dwupeptydowego w amid za pomoca metanolu nasyconego gazowym amoniakiem, od- szczepienie grupy karbobenzoksylowej za pomoca wody w obecnosci palladu na weglu i kondensacje tak otrzymanego H-liz(BOC)-liz(BOC)-NH2 z pep- tydem otrzymanym metoda azydkowa, o wzorze Z-liz(BOC) -pro-wal-gli-liz(BOC)-liz(BOC)-NH-NH2, omówionym w opisie patentowym NRF nr 1214242. 10) H-D-ser-tyr-ser-norleu-glu-his-fen-arg-try- -gli-liz-pro-wal-gli-liz-liz-liz-liz-NH2. 0,5 g chronionego, oczyszczonego w przeciwpra- dowym rozdziale amidu oktadekapeptydu rozpusz¬ cza sie w 10 ml lodowato zimnego 90% kwasu trój- fluorooctowego i pozostawia roztwór przez 1 godzi¬ ne w temperaturze 25°C. Nastepnie roztwór zateza sie pod próznia do niewielkiej objetosci i nastepnie poprzez dodanie duzej ilosci eteru, wolnego od nad¬ tlenków, wytraca sie kwasna, trójfluorooctanowa sól wolnego amidu oktadekapeptydu. Hygroskopij- ny produkt odsacza sie na nuczy, przemywa eterem i suszy. W celu przeksztalcenia w octan produkt rozpuszeza sie w 1% kwasie octowym, przepuszcza przez kolumne wypelniona slabo zasadowym wy¬ mieniaczem jonowym (Merck Nr II), skad odbiera sie produkt w postaci octanowej i przemywa pow¬ tórnie l°/o kwasem octowym.Do eluatu dodaje sie n-oktanol i odparowuje pod próznia w temperaturze 4Ó°C. Pozostalosc po od¬ dzieleniu oktanolu przemywa sie eterem naftowym i suszy. W dalszej kolejnosci produkt rozpuszcza sie w niewielkiej ilosci wody i liofilizuje. Otrzy¬ muje sie octan amidu oktadekapeptydu, amidu D- -seri-norleuMiz17'18^1—18-kortykotropino-liz18, w postaci suchego, prawie bialego proszku. Amid 10 oktadekapeptydu wykazuje przy elektroforezie bi¬ bulowej przy pH 6,3 dlugosc przesuwu wynoszaca 10 cm (wzgledem katody) (papier: Scheicher i Schiill 2043)b; mgl; octan pirydyfly-bufor, 1 godzi¬ na, 2000 V). W chromatogramie cienkowarstwowym na plytkach z tlenku glinu, produkt wykazuje na¬ stepujace wartosci Rf: Rf (52 A) = 0,18 Rf (101) = 0,25 Wytworzony sposobem wedlug wynalazku pep- tyd przechowuje sie w warunkach nastepujacych: Octan amidu D-ser^norleu-liz17'18-^1—18-kortyko- tropino-liz18, miesza sie w warunkach aseptycznych z polifloretynofosforanem sodowym i chlorkiem so¬ du i po wprowadzeniu do fiolek liofilizuje tak aby otrzymac sucha ampulke zawierajaca nastepujace skladniki: 0,5 mg wyzej wymienionego actanu ami¬ du, oraz 23,20 mg 86,5% polifloretynofosforanu so¬ dowego i 12,28 mg chlorku sodu.Otrzymany octan amidu mozna równiez (po u- przednim przesaczeniu w warunkach sterylnych) przechowywac w postaci ampulek o skladzie: 0,5 mg octanu amidu kortykotropiny, 280,0 mg zelaty¬ ny, 5,0 mg fenolu przy uzupelnieniu wymienionych skladników woda destylowana do objetosci 1,0 m. PL PL

Claims (4)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowego peptydu o dzia¬ laniu ACTH, znamienny tym, ze z amidu D-sery- lo-L-tyrozylo-L-serylo -L-norleucylo -L-glutamylo- -L-histydylo-L-fenyloalanilo -L-arginilo -L-trypto- filo-glicylo -L-lizylo-L-prolilo -L-walilo-glicylo-L- -lizylo-L-lizylo-L-lizylo-L-lizyny lub odpowiednie¬ go zwiazku, zawierajacego zamiast reszty gluta- mylowej — reszte glutaminy, w których to pepty- dach, chronione sa co najmniej grupa a-aminowa i grupy aminowe obecne w lancuchach bocznych, jak tez koncowa grupa karboksylowa i ewentualnie obecne w lancuchach bocznych grupy karboksylo¬ we, odszczepia sie grupy ochronne i otrzymane zwiazki ewentualnie przeprowadza sie w ich addy¬ cyjne sole z kwasami i/lub zwiazki kompleksowe.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze grupy ochronne odszczepia sie z peptydu, w któ¬ rym grupy aminowe chronione sa przez grupe III- -rzed.-butyloksykarbonylowa, a grupa karboksylo¬ wa przez grupe Ill-rzed.-butyloestrowa.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, 2, znamienny tym, ze grupy ochronne odszczepia sie na drodze hydrolizy kwasnej.

4. Sposób wedlug zastrz. 1—3, znamienny tym, ze grupy ochronne odszczepia sie za pomoca kwa¬ su trójfluorooctowego. PL PL