PL63201B1 - - Google Patents

Description

Pierwszenstwo: Opublikowano: 07.Y.1966 (P 114 457) 20.VHI.1971 63201 KI. 12 o, 25 MKP C 07 c, 103/19 UK©Ur^c;u Patentowego Polskiej hscr *J LurtOMj Wspóltwórcy wynalazku: Franjo Kajfez, Peter Jerman Wlasciciel patentu: KRKA tovarna zdravil, Novo mesto (Jugoslawia) Sposób wydzielania czystych antybiotyków grupy tetracykliny z roztworów Przedmiotem wynalazku jest sposób wydzielania czy¬ stych antybiotyków grupy tetracykliny z roztworów, zwlaszcza z cieczy fermentacyjnej, z której grzybnie wydzielono za pomoca zakwaszenia i lodsaczenia.Antybiotyki grupy tetracykliny naleza do grupy bio¬ logicznie czynnych substancji, które wywodza sie z per- hydronaftacenu. Wzór podstawowego szkieletu budowy antybiotyków grupy tetracykliny jest przedstawiony na rysunku. We wzonze tym podstawniki znajduja sie w pozycjach, które uwidoczniono w powyzszej tablicy, przedstawiajac poszczególne antybiotyki, które mozna wytwarzac sposobem wedlug wynalazku.Podstawnik 4-N(CH3)2,6-OH, 6-CH3, 12a-OH 4-N-(CH3)2, 5-OH, 6-OH, 6CH3, 12a-OH 4-N(CH3)2, 6-OH, 6-CH3, 7-Cl, 12a-OH 4-N(CH3)2, 6-OH, 6-CH3, 7-Br, 12a-OH 4-N(CH3)2, 6-OH, 7-Cl, 12a-OH 4-N(CH3)2,6-OH, 12a-OH 4-N(CH3)2,6-CH3,12a-OH Potoczna nazwa antybiotyku Tetracyklina (TC) 5-Oksytetracyklina (OTC) 7-Chlorotetracyklina O ) 7-Bromotetracyklina , BrTC) 6-Demetylochlorotetra- cyklina (DCTC) 6-Demetylotetracyklina 6-Dezoksytetracyklina | 10 15 20 25 30 Wedlug dotychczas znanych sposobów antybiotyki grupy tetracykliny mozna bylo otrzymac z cieczy fer¬ mentacyjnej albo z zanieczyszczonych roztworów trze¬ ma znanymi metodami, a mianowicie przez wytracanie antybiotyku odpowiednim srodkiem stracajacym i na¬ stepna ekstrakcje wytraconego osadu odpowiednim roz¬ puszczalnikiem organicznym, za pomoca ekstrakcji an¬ tybiotyku z roztworu wodnego rozpuszczalnikiem, któ¬ ry dobrze rozpuszcza antybiotyk, a z wioda nie miesza sie; za pomoca adsorpcji na wymienniku jonowym, we¬ glu aktywowanym itd.Sposób wedlug wynalazku oparty jest na metodzie pierwszej, polegajacej na wydzielaniu antybiotyków te* tracyklinowych za pomoca stracania. Do stracania anty¬ biotyku w srodowisku alkalicznym stosowano) juz mie¬ dzy innymi sole wapnia lub magnezu. Stwierdzono, ze mozna wytracac antybiotyk równiez w srodowisku kwa¬ snym, osiagajac prawie ilosciowe stracenie antybiotyku, jesli do wytracania zastosuje sie zwiazki wolframu.Sposobem wedlug wynalazku wydzielai sie antybiotyki grupy tetracykliny korzystnie z cieczy fermentacyjnej, z której grzybnie wydzielono za pomoca zakwaszenia i odsaczenia z odpowiednim srodkiem filtracyjnym. Do zakwaszenia mozna stosowac kwas solny, siarkowy, azo¬ towy, fosforowy, szczawiowy, chlorooctowy i inne. Naj¬ lepsze wyniki otrzymuje sie wtedy, gdy wartosc pH przed saczeniem wynosi mniej niz 3,0. Antybiotyk mozna równiez wydzielac z innych roztworów antybio¬ tyku.Wedlug wynalazku do roztworów zawierajacych an- 6320163201 tybiotyk grupy tetracykliny wprowadza sie kwas wol¬ framowy lub jego sole rozpuszczalne w wodzie lub we wspomnianych noztworach wodnych. Rozpuszczalnosc wolframianu nie ma podczas stracania istotnego zna¬ czenia, poniewaz ze wzgledu na tworzenie sie komplek¬ su miedzy jonem wolframianiowym a antybiotykiem wol¬ framian stale jest rozpuszczany i reaguje z obecnym w roztworze antybiotykiem, wskutek czego wolfraniian zostaje calkowicie rozpuszczony.Sposród soli kwasu Wolframowego stosuje sie naste¬ pujace zwiazki: Zwiazek Metawolframian amonowy (NH4)2W4Oi3 -8 H20 Parawolframian amonowy (NH4)6W7024-6H20 Borowolframian kadmowy Cd2B2W9032-18H20 Kwas fosforowo-wolframowy 1 P20512W03-42H20 Ortowolframian potasowy K2W04 -2 H20 Metawolframian potasowy K2W4O13 -8 H20 Parowolframian potasowy K6W7024 6 H20 Wolframian sodowy Na2W04 -2 H2O Wolframian sodowy, zwykly handlowy produkt Na2W04 -2 H20 Parawolframian sodowy Na6W7C24-16H20 Ciezar czasteczkowy 1123,65 1887,36 2737,49 3680,00 362,09 1165,77 2013,72 293,84 , 329,87 2097,22 Stosunek wagowy soli kwasu wolframowego i anty¬ biotyku powinieni wynosi 0,5 : 1 do 4:1 w przeliczeniu na Na2W04«2H20. Stwierdzono, ze najlepsze wyniki otrzymuje sie przy stosunku wagowym 1,2: 1 do 1,5 :1; powstajacy przy tym osad daje sie dobrze saczyc, prze¬ cietna wydajnosc wynosi 99,3%. Duzy nadmiar wolfra¬ mianu wywiera istotny wplyw na podwyzszenie sie roz- puszczalnosci kompleksu wolframian — antybiotyk.Mozna przypuszczac, ze powstaje rozpuszczalny kom¬ pleks antybiotyku z wolframianem.Stracanie prowadzi isie przy wartosci pH = 0,5 — 7,0, korzystnie 1 — 2,5. Przewaznie stosuje sie wolframiany 10 ciezarze czasteczkowym powyzej 500, poniewaz przy nich wartosc pH roztworu w czasie stracania nie ma istotnego wplywu. W silnie kwasnych roztworach mozna stosowac proste wolframiany typu Me2WC4.Zakwaszenie powoduje stracanie kompleksu antybio¬ tyku za .pomoca soli kwasu wolframowego, przy czym sklad kompleksu jest zalezny od wartosci pH. Wartosc pH roztworu wplywa równiez na sklad soli kwasu wol¬ framowego, gdyz w kwasnym srodowisku ciezar cza¬ steczkowy wolframu parokrotnie wzrasta, poniewaz wol¬ framian przy wartosci pH = 6,0 — 8,0 przechodzi w od¬ wracalne jony kwasu szesdowolframowego wedlug rów¬ nania 6H2WO4 ^ H12W6O24.Stwierdzono, ze kompleksy antybiotyków grupy te¬ tracykliny sa trwale nawet przy wartosci pH = 0,5 — 1.Przy wartosci pH powyzej 4,0 prawdopodobnie tworza sie kompleksy z parawolframiaaiarni typu MesHyWeC^, w bardziej kwasnych srodowiskach przy wartosci pH ponizej 4,0 powstaja jednak kompleksy z solami typu Me3H9W6024.Zostalo to potwierdzone droga analizy kompleksów, 5 które otrzymanioi przy róznych wartosciach pH.Tak wiec na przyklad kompleks tetracykliny z Na2W04 1. otrzymany przy pH = 6,0 zawiera 46,4 % substancji nieorganicznej 10 2. otrzymany przy pH = 5,0 zawiera 47,0% substancji nieorganicznej 3. otrzymany przy pH = 4,0 zawiera 48,0% substancji nieorganicznej 4. otrzymany przy pH < 3,0 zawiera 49,9% substancji 15 nieorganicznej.Te same wyniki z bledem ±2% wskazuje analiza mi- krobiologiaznja okreslajaca zawartosc antybiotyku w kompleksie.Oprócz wplywu wartosci pH roztworu na sklad kom¬ pleksu i przez to równiez na ilosc soli kwasu woframo- wego, która jest potrzebna do sitracenia antybiotyku, wartosc pH wywiera jeszcze silny wplyw na ilosc anty¬ biotyku, który zostaje wyizolowany z roztworu. Przy wartosci pH wyzszej niz 4 mozna z roztworu wyodreb¬ nic tylko 40% (antybiotyku, natomiast przy optymalnej wartosci pH = 1—2,5 po wyizolowaniu antybiotyku po¬ zostaje w roztworze tylko nieznaczna jego ilosc, co po¬ dano w ponizszej tablicy: 30 35 40 20 25 45 50 55 60 65 Lp. 1 2 3 4 5 Ilosc antybiotyk przed wyodrebnieniem antybiotyku 5039 y/ml CTC 5039 r/ml OTC 3080 Y/ml TC 1820 Y/ml BrTC 800 Y/ml DCTC u w roztworze po wyodrebnieniu antybiotyku 27 Y/ml CTC 31 Y/ml OTC 52 Y/ml TC 14 Y/ml BrTC 9 Y/ml DCTC Na podstawie przedstawionych wyników mozna stwierdzic, ze by zapewnic prawidlowe i ekonomiczne prowadzenie sposobu, nalezy poswiecic duza uwage wartosci pH roztworu antybiotyku przed straceniem kompleksu, zwlaszcza, ze wartosc pH iroztwotru antybio¬ tyku podczas stracania na skutek doprowadzanego wol¬ framianu silnie sie zmienia.Otrzymany przez stracanie kompleks miesza sie ze srodkiem filtracyjnym, na przyklad „Dicaiit" i filtruje.Osad przemywa sie woda, usuwa z filtra i ponownie zawiesza w wodzie. Przez dodanie 10%-owego roztwo¬ ru wodorotlenku sodowego nastawia sie wartosc pH na 8,5 i kompleks rozpuszcza sie. Zawiesine filtruje sie, osad zawierajacy srodek filtrujacy przemywa sie woda o wartosci pH = 9,0. Po przemyciu srodka filtrujacego przesacze laczy sie i dla lepszego oczyszczenia antybio¬ tyku ponownie straca sie taka iloscia 10 — 20%owego kwasu solnego, ze wartosc pH osiaga 1,5 — 2,0. Wydzie¬ lony kompleks po dodaniu srodka filtrujacego ponow¬ nie filtruje sie i przemywa zakwaszona destylowana woda. Osad ponownie zawiesza sie w wodzie, zawiesine zadaje sie 10%-owym roztworem wodorotlenku sodowe¬ go do wartosci pH = 8,5 —10 i ponownie filtruje.63201 Srodek filtracyjny przemywa sie wioda o wartosci pH okolo 9,0; przesacze laczy sie ze soba i dalej przerabia.Z takiego alkalicznego roztworu mozna antybiotyk ko¬ rzystnie wyizolowac wedlug nastepujacych dwóch zna¬ nych sposobów, a mianowicie przez stracenie solami wapnia lub magnezu albo mieszaninami obu tych ma¬ terialów, lub przez izolowanie za pomoca wymienników jonowych.Reasumujac sposób wedlug wynalazku wydzielania czystych antybiotyków grupy [tetracykliny z roztworów, zwlaszcza z cieczy fermentacyjnej, z której przez zakwa¬ szenie i filtracje zostala wydzielona grzybnia, polega na tym, ze do roztworu zawierajacego antybiotyk dodaje sie kwas wolframowy lub jego sole w stosunku wago¬ wym do antybiotyku od 0,5 : 1 do 4,0:1, korzystnie 1,2 : 1 do 1,5 : Iw przeliczeniu na Na^WOfZH^O, przy wartosci pH = 0,5 — 7,0, korzystnie przy wartosci pH=l,0 — 2,5, wytracony osad odsacza sie i zadaje 10 — 20%nowym roztworem wodorotlenku sodowego az do osiagniecia wartosci pH = 8,5 — 10 i z otrzymanego roztworu izoluje sie antybiotyk w znany sposób, koiizy- stnie solami wapnia i/albo magnezu, i/albo za pomoca wymienników jonowych.Jako sole wapnia lub magnezu stosuje sie przede wszystkim chlorki. Poniewaz tutaj tylko kation ma zna¬ czenie, a anion jest nieistotny, wyizolowanie antybioty¬ ku moze równiez przebiegac z innymi solami wapnia i/albo magnezu. Mozna równiez stosowac sole innych metali ziem alkalicznych.Przy pracy z chlorkiem wapnia lub magnezu do alka¬ licznego roztworu wolframowego kompleksu antybio¬ tyku o wartosci pH 8,5 —10 dodaje sie w celu osiag¬ niecia wartosci pH okolo 7,5 10 — 20%-owego kwasu solnego i nastepnie jeszcze staly chlorek amonowy w stosunku wagowym od 1 : 1 do 1:3. Przez dodanie chlorku amonowego przeszkadza sie istraoaniu sie wol- framianu wapnia lub magnezu. Po dodaniu chlorku amonowego dodaje sie 10—20% roztwór chlorku wap¬ niowego lub magnezowego i nastepnie wartosc pH roz¬ tworu nastawia sie za pomoca 10%-owego wodoiotlen- ku sodowego na 8,0 — 8,2; straca sie przy tym sól wap¬ niowa antybiotyku grupy tetracykliny. Stosunek wago¬ wy antybiotyku do chlorku wapniowego lub magnezo¬ wego wynosi 1 : 1 do 1 :4.W czasie prób mozna bylo stwierdzic, ze szybkosc dowania wodorotlenku sodowego wywiem pózniej wplyw na filtracje. Przy szybkim dodawaniu dorotlenku sodowego zauwazono tendencje do tworzenia subtelnie zdyspergowanego osadu, który pózniej trudno sie fil¬ truje. Przy powolniejiszym dodawaniu wodorotlenku so¬ dowego otrzymuje sie osad o grubszej strukturze, który latwo filtruje sie równiez bez srodka filtrujacego.Sól wapniowa antybiotyku filtruje sie ze srodkiem fil¬ trujacym lub bez niego i przemywa woda destylowana, do której dodano troche chlorku wapniowego. Przesacz laczy sie z woda z przemycia i z polaczonych przesa- czów uzyskuje sie z powrotem wolframian sodowy. Prze¬ myta sól wapniowa antybiotyku wraz ze srodkiem fil¬ trujacym zdejmuje sie z saczka i suszy w temperaturze 40 — 50°C pod obnizonym cisnieniem 30 — 40 mm Hg.Sucha sól wapniowa ekstrahuje sie metanolem, izobu- tanolem, metylobutyloketonem lub innym alkoholem lub ketonem, który uprzednio zostal nasycony woda i zakwaszony kwasem solnym do wartosci pH = 2,0.W celu usuniecia zanieczyszczen na przyklad roztwór metanolowy zadaje sie weglem aktywnym. Nastepnie' wegiel odfiilrowuje sie i zaadsorbowany antybiotyk przemywa sie zakwaszonym metanolem.W celu oddzielenia jonów metalu z antybiotyku wy- 5 ciag metanolowy przepuszcza sie przez kolumne z wy¬ mieniaczem jonowym, na przyklad kiationitem takim, jak Amberlite IR 110. Otrzymuje isie wówczas antybio¬ tyk o wysokim stopniu czystosci. Po przebyciu kolumny metanolowy wyciag zateza sie pod próznia do % obje- 10 tosoi i w znany sposób otrzymuje sie chlorowodorek lub zasade antybiotyku. Stopien czystosci otrzymanych kry¬ sztalów chlorowodorku antybiotyku wynosi okolo 800 — 910y/mg i wydajnosc po przekrystalizowaniu 85—90 %, w przeliczeniu nia ilosc antybiotyku w cieczy 15 fermentacyjnej.Podczas izolowania antybiotyku za pomoca wymien¬ nika jamowego, moztwór kompleksu antybiotyku przy wartosci pH = 8,5 —10,0 przepuszcza sie z szybkoscia 50 ml/minute przez kolumne z wymiennikiem kationo*- 20 wym, na przyklad Duolite C-25 (kwas polistyrenosulfo- nowy), przy czym stosuje sie stosunek przesaczu do wymiennika jonowego od, 3 : 1 do 2:1. Otrzymana z kolumny ciecz stosuje sie do regeneracji wiolframianu.Antybiotyk eluuje sie z wymiennika kationowego za 25 pomoca In — 4n roztworu wodorotlenku amonowego.Eluat zateza sie pod obnizonym cisnieniem 30 rnm Hg w temperaturze 40—45°C do Y* pierwotnej objetosci.Stezony roztwór irozaiencza sie destylowana woda w sto¬ sunku 1:1 i przepuszcza sie przez wymiennik aniono- 30 wy, na przyklad Amberlite IRC 411 (usieciowany szkie¬ let polistyrenowy z grupami kwasu sulfonowego) i w ten sposób usuwa sie ostatnie slady^ jonów wolframia- nów. Stosunek ilosci wymiennika do roztworu winien wynosic okolo 1:1, zas szybkosc przeplywu roztworu 35 przez kolumne winien wynosic 10 — 30 ml/minute.Eluat zateza sie pod obnizonym cinieniem 30 mm Hg w temperaturze 40—45°C do % pierwotnej objetosci.Z zatezonego eluatu otrzymuje sie w znany sposób czy¬ sty antybiotyk. Przez przekrystalizowanie z metanolu 40 otrzymuje sie krysztaly o stopniu czystosci 900 — 1000 ylmg. Wydajnosc wynosi 85 — 90%, w przelicze¬ niu na ilosc antybiotyku w cieczy fermentacyjnej.Azeby otrzymac zasade antybiotyku dodaje sie do wodnego koncentratu 10% nowy wodorotlenek sodowy 45 lub wodorotlenek amonowy przy wartooi pH = 3,5 — 4,0. Przez dodanie kilku ziarnek wydzielonej tetracykli¬ ny osiaga sie lepsza krystalizacje zasady antybiotyku.Po uplywie 10 — 24 godzin wydziela sie zasada anty¬ biotyku, która przemywa sie woda i butanolem i suszy 50 sie metoda liofilizacji.Z przesaczu otrzymanego po filtracji soli wapniowej lub magnezowej antybiotyku grupy tetracykliny wzgled¬ nie z roztworu odprowadzonego z pierwszego wymien¬ nika wydziela sie kwas wolframowy w znany sposób, na 55 przyklad stezonym kwasem solnym i stosuje z powro¬ tem w sposobie wedlug wynalazku. Przesacz soli wap¬ niowej antybiotyku mozna z powrotem stosowac do stracania przy nastepnych szarzach, o ile uprzednio nad¬ miar wody odparuje sie do polowy pierwotnej objetosci 60 roztworu.Stwierdzono, ze roztwór wolframianu bez regeneracji mozna stosowac pieciokrotnie bez szkody dla stopnia czystosci otrzymanego antybiotyku. Z czasem jednak gromadza sie w przesaczu wieksze ilosci chlorku sodo- 65 wego i chlorku amonowego, który tworzy sie przy neu-7 tralizacji i wówczas wolframian musi byc regenerowa¬ ny. Regeneruje sie go poprzez kwas wolframowy w na¬ stepujacy sposób: Po straceniu soli wapniowej antybiotyku przesacz za- teza sie do }A objetóci i straca sie H2WO4 za pomoca nadmiaru stezonego kwaisu solnego. Nadmiar kwasu sol¬ nego, jak równiez wysokie stezenie wolframianu w roz¬ tworze maja korzystny wplyw na powstawanie kwasu wolframowego, natomiast wplyw temperatury jest mini¬ malny. Przy nadmiarze kwasu solnego sedymentacja osadu przebiega szybciej, a filtracja staje sie latwiejsza.Wydzielony kwas wolframowy odfiltrowuje isie i miesza z 50%-owym wodorotlenkiem slodowym w stosunku ste- chiometrycznym. Przygotowany w ten sposób roztwór wolframianu mozna z powrotem stosowac doi stracania anltybiotyku.Kompleksy antybiotyku grupy tetracykliny z jonem wolframianu sa zwiazkami trwalymi i moga byc czy¬ szczone przez kilkakrotne stracanie. Kompleksy dziala¬ ja tak samo antybiotycznie, jednak sa o okolo 50% mniej skuteczne anizeli czysty antybiotyk.Otrzymane kompleksy stanowia istotnie nowe zwiaz¬ ki, a wykazaly to widma w podczerwieni, w nadfiolecie oraz widmo rentgenowskie. Tak wiec widmo absonp- cyjne w podczerwieni kompleksu chlorotetriacykliny z Na2W04-2H20 w bromku potasowym wskazuje wzgledna przepuszczalnosc promieniowania podczerwo¬ nego w zaleznloisci od dlugosci fali wzglednie czestotli¬ wosci.Antybiotyki otrzymane sposobem wedlug wynalazku nie zawieraja wolframu, co zostalo stwierdzone za po¬ moca analizy spektralnej. Próbki antybiotyków spalo¬ no w tyglu kwarcowym, przez co ograniczono rozpra¬ szanie wzorca w luku elektrycznym i jednoczenie pod¬ wyzszono dokladnosc pomiaru. Nastepnie próbki umie¬ szczono w luku elektrycznym pradu stalego o 10 A.Widma emisyjne fotografowano za pomoca spektro¬ grafu Jerrel —1 Ash na plytach Kodak Sciemtific Plateg 00 przy czasie naswietlania 70 sekund. Za po¬ moca tych widm emisyjnych udowodniono, ze antybio¬ tyki otrzymane sposobem wedlug wynalazku nlie zawie¬ raja wolframu, dla którego, charakterystyczne linie ma¬ ja dlugosci fal 2944,39 A, 2946,98 A i 2947,38 A.Dzieki zastosowaniu sposobu wedlug wynalazku uzy¬ skuje sie znaczne korzysci, a mianowicie przy stracaniu otrzymuje sie antybiotyki z duza wydajnoscia, poniewaz przy zastosowaniu korzystnego zakresu pH w cieczy fermentacyjnej, pozostaje maksymalnie tylko 1 % nie straconego antybiotyku. Srodek istracajacy antybiotyk, to znaczy wdlframiany odzyskuje sie i z powrotem sto¬ suje do stracania, gdy tymczasem znane srodki straca¬ jace odrzuca sie. Stracanie lantybiotyków solami kwasu wolframowego ma jeszcze (te korzysc, ze jony wolfra¬ mianu w kwasnym srodowisku nie tworza osadu z zad¬ nym skladnikiem cieczy fermentacyjnej albo zanieczy¬ szczonego roztworu, na skutek czego pozostaja w roz¬ tworze i nie zanieczyszczaja antybiotyku.Na skutek stracania w kwasnym srodowisku antybiotyk nie ulega rozkladowi, natomiast przy stracaniu w alka¬ licznym srodowisku wedlug znanych sposobów nastepu¬ je czesciowa jego odbudowa. Wiadomo, ze niektóre an¬ tybiotyki grupy tetracykliny sa nietrwale w srodowisku alkalicznym, natomiast w srodowisku kwasnym sa one jednak trwale.Z ekonomicznego punktu widzenia sposób wedlug 8 x wynalazku ma jeszcze jedna korzyc w porównaniu do znanych sposobów, w których odrzuca sie srodek stra¬ cajacy antybiotyk, poniewaz po wydzieleniu czystego antybiotyku nie mozna go wyodrebnic, wzglednie spo- 5 sób wydzielenia srodka stracajacego bylby nieekono^ miczny. Korzysc ita polega ma tym, ze w sposobie we¬ dlug wynalazku traci sie maksymalnie 10% srodka stracajacego antybiotyk i tylko te ilosc uzupelnia sie.Przyklad I. 20 litrów cieczy fermentacyjnej za- 10 kwasza sie 20%-owym kwasem solnym do wartosci pH = 2,6 i nastepnie zadaje sie srodkiem filtracyjnym Dicalit 4108 li filtruje. Stracanie powtarza sie i osad zawiesza sie w wodzie zakwaszonej kwalsem solnym do wartosci pH=l,5 — 2.0 i ponownie filtruje. Pierwszy 15 i drugi przesacz laczy sie i 2,5 litra poddaje dalszej ob¬ róbce. Ilosc chloroitetracykHny w cieczy fermentacyjnej wynosila 3723 ylml. Po podniesieniu w cieczy fermen¬ tacyjnej wartosci pH do 2,0 dodaje sie stezonego roz¬ tworu Na2W04»2H20 w stosunku wagowym do anty- 20 biotyku 1,2 : 1 i wartosc pH roztworu ponownie nasta¬ wia sie na 2,0. Osadowi pozwala sie Osiasc, nastepnie filtruje. Ilosc antybiotyku w przesaczu wynosi 28 ykrd.W ten sposób mozna wydzielic 99,25% ogólnej ilosci antybiotyku, wzglednie 98,6% jesli uwzglednic zwieksze- 25 nie objetosci.Otrzymany osad zdejmuje sie z saczka i zawiesza w' 400 ml destylowanej wody i potem powoli doprowadza sie 10% roztworem Wodorotlenku sodowego wartosc pH do 8,5. Przez podwyzszenie pH kompleks przechodzi do 30 roztworu. Na koniec stopniowo zadaje sie go 20%-owym kwasem Solnym do osiagniecia wartosci pH 1,5 — 2,0.Wydzielony kompleks znów filtruje sie i przemywa wo¬ da, zakwaszona kwasem solnym do wartosci pH = 2,5.Osad zawiesza sie w wodzie i zadaje 10% nowym wo- 35 doroltlenkiem sodowym do wartosci pH = 8,5 — 9,0.Otrzymany alkaliczny roztwór zadaje sie 20%-owym kwasem solnym do wartosci pH 7,5, nastepnie dodaje 30 g stalego chlorku amonowego . i jeszcze 300 ml 10%-owego roztworu chlorku wapniowego; w koncu 40 wartosc pH roztworu nastawia sie 10%-owym wodoro¬ tlenkiem sodowym na 8,0 — 8,2. Dodawanie wodoro¬ tlenku sodowego musi nastepowac bardzo powoli, azeby otrzymac dobrze filtrujacy sie osad.Otrzymany osad iodfiltrowuje sie i przemywa destylo- 45 wana woda, do której dodano nieco chlorku wapniowe¬ go. Przesacz gromadzi sie i stosuje ido ponownego stra¬ cania antybiotyku wzglednie do regeneracji wolframia¬ nu. Przemyta sól wapniowa antybiotyku usuwa sie z saczka i suszy pod obnizonym cisnieniem 30 — 40 mm 50 Hg w temperaturze 40 — 45 °C. Po wysuszeniu ekstra¬ huje sie ja metanolem zakwaszonym kwasem solnym do wartosci pH = 2,0. Wyciag metanolowy zadaje sie we¬ glem aktywnym, wegiel aktywny odfiltrowuje sie i prze¬ sacz pod próznia zateza do % pierwotnej objetosci, po 55 czym do; metanolowego koncentratu dodaje sie 30%-owy kwas solny, i ponownie zateza sie do Y$ objetosci. Po odparowaniu nadmiaru metanolu rozpoczyna sie krysta¬ lizacja chlorowodoirku chlorotetracykliny. Po rozpocze¬ ciu sie krystalizacji przerywa «de destylacje; po ostudze- 60 niu chlorowodorek chlorotettracykliny krystalizuje dalej.Wydzielone krysztaly antybiotyku odfiltrowuje sie, przemywa zimnym metanolem i suszy.Otrzymuje sie 12,1 g antybiotyku o stopniu czystosci 800 ylmg. Po przekrystalizowaniu z metanolu otrzymuje 65 sie antybiotyk o stopniu czystosci 980 ylmg.9 Przyklad II. 2,6 litrów pizefiltrowanej cieczy fer¬ mentacyjnej, która otrzymano w sposób wedlug przy¬ kladu I, poddaje sie obróbce jak w przykladzie I, tylko zamiast Na2W04»2H20 w tym przypadku stosuje sie parawolframian sodowy (NaeWyC^lGH^O) w tym sa¬ mym stosunku wagowym do antybiotyku 1,2: 1, w prze¬ liczeniu na Na2W04«2H20. Otrzymuje sie 11,3 g anty¬ biotyku o stopniu czystosci 850 ylmg.Przyklad III. 5 litrów przefiltrowanej cieczy fil¬ tracyjnej, .która otrzymano w sposób wedlug przykla¬ du I, zadaje sie parawolframianem potasowym (K6W7024«6H20) w stosunku do antybiotyku 1,3 : 1, w przeliczeniu na Na2WC4«2H20. Poniewaz ciecz fermen¬ tacyjna zawiera 18,62 g antybiotyku, przeto trzeba do¬ dac 22,0 g parawolframianu potasowego, rozpuszczone¬ go w 400 ml destylowanej wody.Po dodaniu parawolframianu potasowego wartosc pH nastawia sie na 2,0 przez dodanie 10% nowego kwasu solnego i nastepnie zawiesine miesza sie ze 100 g Di- calite'u 4108 i filtruje przez saczek Buchnera. Osad przemywa sie 100 ml destylowanej wody, do której do¬ dano 1 ml 10%-owego kwasu solnego. Przemyty osad zdejmuje sie z saczka i zawiesza w 800 ml destylowanej wody. Za pomoca 10%-owego wodorotlenku sodowego wartosc pH nastawia sie na 8,5. Zawiesine filtruje sie i osad zawierajacy Dicalite przemywa 500 molami desty¬ lowanej wody, do której dodano 200 ml 10%-owego wodorotlenku sodowego, iaby nastawic wartosc pH na 9,0—10,0.Po przemyciu Deiicate'u, przesacze laczy sie i kom¬ pleks wolframowy antybiotyku ponownie straca sie 20nprocentowym kwasem solnym; kwas solny dodaje sie stopniowo, az do osiagniecia wartosci pH = 1,5— 2,0.Wydzielony kompleks ponownie filtruje sie z 100 g Di¬ calite^ i przemywa 100 molami zakwaszonej destylowa¬ nej wody, (1 ml 10%-owego kwasu solnego na 100 ml wody).Przemyty osad zawiesza sie w 100 ml destylowanej wody; wartosc pH nastawia sie na 8,5 — 9,5 za pomoca 10%-owego wodorotlenku sodowego, po czym ponownie filtruje. Osad przemywa sie 400 ml wody o wartosci pH = 9,0—10,0 (30 ml 10%-owego wodorotlenku so¬ dowego na 400 ml destylowanej wody). Przesacze laczy sie i dalej przerabia. Osad na saczku odrzuca sie. Prze¬ sacz zakwasza sie 20 % owym kwasem solnym do warto¬ sci pH = 7,5, nastepnie dodaje sie 60 g stalego chlorku amonowego. Na koniec dodaje sie jeszcze 200 ml 20% roztworu chlorku magnezowego i nastepnie wfcrapla 10%-owy roztwór wodorotlenku sodowego, az do osiag¬ niecia wartosci pH = 8,0 — 8,2.Wydzielona sól magnezowa chlorotetracykliny filtruje sie z pomoca Dicalite'u. Otrzymany osad przemywa sie 80 ml wody, do której dodano 1 g chlorku magnezo¬ wego. Przesacze, przechowuje sie i pózniej stosuje do regeneracji wolframianu. Przemyta sól magnezowa chlo¬ rotetracykliny usuwa sie z saczka i suszy pod obnizo¬ nym cisnieniem 30 — 40 mm Hg w temperaturze 40 — 45 °C. Sucha sól magnezowa ekstrahuje sie stop¬ niowo 3 litrami metanolu, który zawieral 30 ml stezo¬ nego kwasu solnego. Polaczone wyciagi laczy sie i fil¬ truje w celu usuniecia zawieszonego Dicalite'u.Przefiltrowany wyciag zadaje sie 4 g wegla aktywne¬ go ogrzewa ido temperatury 40°C i szybko filtruje.Otrzymany osad wegla aktywnego przemywa sie 80 ml zakwaszonego metanolu. Przesacze laczy sie i destyluje 10 tak dlugo, az oddestyluje 2,2 litra metanolu; nastepnie dodaje sie 60 mi stezonego kwasu solnego i destyluje^ dalej, az zacznie krystalizowac chlorowodorek chlonote- itracykliny. Nastepuje Ho przewaznie wtedy, gdy zostaje oddestylowane 600— 700 ml metanolu. Po ostudzeniu dalej krystalizuje chlorowodorek chlonotetracykliny.Wydzielone krysztaly lodfiltrowuje sie i przemywa 20 ml zimnego metanolu. Otrzymuje sie 20,8 g chloro¬ wodorku chlorotetracykliny o stopniu czystosci! 810 ylmg.Przyklad IV. 10 litrów cieczy fermentacyjnej za¬ kwasza sie 20%-owym kwasem solnym do wamtosci pH = 2,6, zadaje Dicalite'em 4108 i filtruje. Osad zawie¬ sza isie w wodzie, zakwaszonej kwasem solnym do war¬ tosci pH=l,5 — 2,5 i powtórnie filtruje. Pierwszy i drugi* przesacz laczy sie. Ilosc chloroteitracykliny wynosi w nim 5039 y/ml. 5 litrów przefiltrowanej cieczy fermentacyjnej zadaje sie 10%-iowym kwasem solnym az do osiagniecia war¬ tosci pH = 2,0. Teraz dodaje sie stezonego roztworu Na2W04»2H20 w stosunku do antybiotyku jak 1,3 : 1, ito znaczy, 32,8 g Na2W04«2H20; nastepnie przez do¬ danie 10%^owegot kwasu solnego wartosc pH z powro¬ tem nastawia sie na 2.0. Osadowi pozwala isie osiasc i nastepnie filtruje sie. Ilosc antybiotyku w przesaczu wy¬ nosi 27 ylml; w ten sposób lizoluje sie z cieczy fermen¬ tacyjnej 99,47% antybiotyku.Osad kompleksu chlorotetracykliny z jonami wolfra¬ mianu zdejmuje sie z saczka i zawiesza w 1 litrze de¬ stylowanej wody, nastepnie dodaje sie 10%-owy lug so¬ dowy, az do osiagniecia wartosci pH = 8,5. Roztwór filtruje sie i przesacz powoli zadaje sie 10%-owym kwa¬ sem solnym do wartosci pH=l,5— 2,0. Wydzielony kompleks powtórnie filtruje sie, osad usuwa sie.z sacz¬ ka, zawiesza w 2 litrach wody i zadaje 10%-owym roz¬ tworem wodorotlenku sodowego do osiagniecia wartcn sci pH = 7,5 — 8,0.Ten alkaliczny roztwór przepuszcza sie przez kolum¬ ne o srednicy 4 cm, wypelniona 800 graniami kationitu Duolite C-25. Szybkosc przeplywu wynosi 20 ml/minute.Roztwór odprowadzony z kolumny stosuje sie do regeneracji wolframianu. Antybiotyk eluuje sie z wy¬ miennika za pomoca 4 litrów wodorotlenku amonowego i otrzymany eluat zateza sie pod obnizonym cisnieniem 30 mm Hg w temperaturze 45° do objetosci 1,4 litra.Stezony roztwór rozciencza sie 1 litrem destylowanej wody i nastepnie z iszybkoscia 15 ml/minute przepuszcza przez kolumne o srednicy 2 cm, zawierajaca 300 g anio- nitu Amberliite IRC 411, azeby usunac sladowe ilosci jonów wolframianowych.Eluat zateza sie pod obnizonym cisnieniem 30 mm Hg w temperaturze 40^45°C do objetosci 800 ml. Do za¬ geszczonego eluatu dodaje sie stezony kwas solny do wartosci pH = 1,5 i nastepnie dalej zatezai sie, az zacz¬ na wydzielac sie krysztaly. Nastepnie roztwór nasyca sie chlorkiem sodowym i pozostawia do powolnego ochlo¬ dzenia. Wydzielone krysztaly chlorowodorku odfiltro- wuje sie i przemywa 20 ml zimnej destylowanej wody.Otrzymuje sie 27,1 g chlorowodorku chlonotetracykli¬ ny o stopniu czystosci 890 ylmg. Przez przekrystalizo- wanie otrzymuje sie produkt o stopniu czystosci 960 ylmg; wydajnosc wynosi 82%, obliczona w stosunku do calkowitej ilosci antybiotyku w cieczy fermentacyj¬ nej.Przyklad V. 5 litrów cieczy fermentacyjnej, otrzy¬ manej wedlug sposobu podanego w przykladzie IV, w11 której zawartosc chloiotetracykliny wynosi 5039 y/ml, " poddaje sie przeróbce jak w przykladzie IV, jednak z ta róznica, ze zamiast Na2W04«2H20 stosuje sie do stracania metawolframian po,tasowy (K2W40i3«8H20) w stosunku 1,2 : 1 ido ogólnej ilosci chlorotetracykliny.Po .przekrystalizowaniu otrzymuje sie czysty chloro wodorek tetracykliny o stopniu czystosci 980 y/mg. Wy¬ dajnosc ipq przekrystalizowaniu wynosi 82 %.Przyklad VI. 2 litry cieczy fermentacyjnej oksy¬ tetracykliny, z której usunieto grzybnie i która zawiera 6200 y/ml oksytetracykliny zadaje sie 47 g Na2W04« •2H2O, rozpuszczonego w 100 ml destylowanej wody; nastepnie wartosc pH nastawia sie 10%-owym kwasem solnym na 2,0. Stracony osad pozostawia sie w spokoju na okres 4 godzin i nastepnie filtruje. Osad z saczka zawiesza sie w 700 mi destylowanej wody i (rozpuszcza przez ponowne dodanie 10%-wego wodorotlenku sodo¬ wego do wartosci pH = 8,5.Po rozpuszczeniu osadu powtórnie straca sie kom¬ pleks wolframian — antybiotyk 20%-owym kwasem sol¬ nym, który dodaje sie do osiagniecia wartosci pH =1,5.Stracony kompleks pozastawia sie w spokoju w ciagu 6 godzin, nastepnie losad odfiltrowuje sie i przemywa woda zakwaszona do wartosci pH = 1,5. Przemyty osad zdejmuje sie z saczka i zawiesza w destylowanej wodzie, nastepnie dodaje sie 10%-owego wodorotlenku sodowe¬ go az osad calkowicie przejdzie do roztworu i roztwór osiagnie wartosc pH —9 ,0.Przez dodanie do otrzymanego roztworu 20%-owego kwasu solnego wartosc pH zmniejsza sie do 7,5 i na¬ stepnie dodaje sie 40 g stalego chlorku amonowego i natychmiast potem 70 ml 20%-owego roztworu chlorku wapniowego i na koniec wkrapla 10%-owy roztwór wo¬ dorotlenku sodowego az do wartosci pH = 8,0 — 8,2.Wydzielony osad pozostawia sie w spokoju w ciagu 6 godzin i nastepnie filtruje. Osad przemywa sie 60 ml destylowanej wody, która zawiera 1 g chlorku wapnio¬ wego. Przesacz przechowuje sie do swiezego stracenia antybiotyku w nastepnej szarzy luib do regeneracji wol- framianu.Przemyta sól wapniowa/ oksytetracykliny suszy sie pod obnizonym cisnieniem 30 do 40 mm Hg w tempe- raturze 40°C Sucha sól wapniowa ekstrahuje sie 2,5 li¬ trami metanolu, do którego dodano 25 ml stezonego kwasu solnego. Roztwory laczy sie, filtruje i zadaje w temperaturze 40°C 10 g wegla aktywnego. Wegiel ak¬ tywny odfiltrowuje sie i przemywa 100 ml zakwaszone¬ go metanolu, a filtrat przepuszcza sie przez kolumne wypelniona 200 g Amberlite'u IR 1100 (szkielet polisty¬ renowy z czwartorzedowymi grupami amoniowymi) i nastepnie kolumne przemywa sie 200 ml metanolu. Roz- itwór odprowadzony z kolumny zateza sie pod próznia do objetosci 1 litra, dodaje 40 ml stezonego kwasu sol¬ nego i powtórnie destyluje, iaz zaczna wydzielac sie kry¬ sztaly. Po ochlodzeniu przebiega dalsza krystalizacja, która trwa okolo 10 godzin. Wydajnosc wynosi 89%, stopien czystosci chlorowodorku loksytetracykliny wyno¬ si 900 y/mg.Przyklad VII. 2 litry cieczy fermentacyjnej, która otrzymano w sposób podany w przykladzie VI, poddaje sie obróbce w taki sam sposób, jednak z ta róznica, ze do stracania stosuje sie 14 g metawolfraimiaou amono^ wego (NH4)2W40i3»8H2O i do ekstrakcji soli wapnio¬ wej stosuje sie zamiast metanolu 2 litry ketonu izobuty- 12 lowego, nasyconego woda i 30 ml stezonego: kwasu sol¬ nego. Wydajnosc wynosi 92%, stopien czystosci 800 y/mg.Przyklad VIII. Z 10 litrów cieczy fermentacyjnej 10 zawartosci oksytetracykliny 4100 y/ml, oddziela sie 5 grzybnie w sposób opisany w przykladzie I. Do dalsze¬ go przerobu bierze sie 5 litrów i zmniejsza wartosc pH do 1 przez dodanie 10%-owego kwasu solnego, nastep¬ nie dodaje sie jeszcze 30 g stezonego roztworu Na2W04«2H20 i wartosc pH z powrotem nastawia sie 10 na 1,0 przez dodanie 10%-owego kwasu solnego.Osad pozostawia sie do odstania w ciagu 4 godzin i nastepnie filtruje. Przesacz zawiera 41 y/ml oksytetra¬ cykliny, to znaczy ze z moztworu wydzielono 99,49% logólnej ilosci antybiotyku. Osad usuwa sie z saczka, za- 15 wiesza w 800 ml destylowanej wody i zadaje 10%-owym wodorotlenkiem sodowym ido wartosci pH = 8,5. Roz¬ twór filtruje sie i przesacz powoli zadaje sie 10%-owym kwasem solnym, az do osiagniecia wartosci pH = 1,0.Wydzielony kompleks ponownie filtruje sie, osad zdej- 20 muje sie z saczka i ponownie zawiesza w 1 litrze desty¬ lowanej wody i przez dodawanie 10%-owego wodoro¬ tlenku sodowego nastawia sie na pH = 7,5 — 8,0. Alka¬ liczny roztwór przepuszcza sie z szybkoscia przeplywu 15 ml/minute przez dwie kolumny wypelnione kationi- 25 tern Duolite C-25. Ciecz odprowadzona z drugiej ko¬ lumny przechowuje sie i stosuje do regeneracji wolfra- irnianu.Antybiotyk eluuje sie z wymieniacza 3 litrami 1 n roztworu wodorotlenku amonowego, który najpierw 30 przepuszcza sie przez druga kolumne i nastepnie przez pierwsza. Otrzymany odciek zateza sie pod obnizonym cisnieniem 30 mm Hg w temperaturze 45°C do objeto¬ sci 1 litra.Stezony roztwór rozciencza sie 500 ml destylowanej 35 wody i nastepnie z szybkoscia 15 ml/minute przepusz^ cza sie przez kolumne o srednicy 2 cm wypelniona 300 g Amberlite IRC 411. Ciecz, która odprowadzono z ko¬ lumny, zateza sie pod próznia do objetosci 500 ml. Do tej zatezomej cieczy wprowadza sie kwas solny do osiag- 40 niecia wartosci pH = 1,5 i zateza znów do objetosci 100 ml. Otrzymany roztwór nasyca sie chlorkiem sodo¬ wym i powoli studzi. Wydzielone krysztaly odfiltrowuje sie, przemywa 20 ml zimnej oddestylowanej wody i su¬ szy pod próznia: Wydajnosc wynosi 84%, stopien: czy- 45 stosoi 880 y/mg.Przyklad IX. 5 litrów cieczy fermentacyjnej za¬ wierajacej 6200 y/ml tetracykliny, oddziela sie od grzyb¬ ni w sposób opisany w przykladzie I. Do odfiltrowanej cieczy fermentacyjnej o wartosci pH = 2,0 wprowadza 50 sie 42 g Na2W04«2H20, rozpuszczonego w 200 ml wo¬ dy i nastepnie dodaje sie 10%-owego kwasu solnego az do osiagniecia wartosci pH = 2,0.Osad pozostawia sie do odstania na okres 4 godzin i nastepnie filtruje. Osad usuwa sie z saczka, zawiesza w 55 500 ml destylowanej wody i;zadaje 10%^owym wodoro¬ tlenkiem sodowym do wartosci pH = 8,5. Roztwór fil¬ truje sie i do przesaczu dodaje sie powoli 10%-owego kwasu solnego, az do uzyskania wartosci pH = 1.0. Wy¬ dzielony kompleks ponownie filtruje sie, osad zawiesza 60 sie w 200 mi destylowanej wody i zadaje 10%-owym wodorotlenkiem sodowym az do osiagniecia wartosci pH = 7,5 —8.0 Alkaliczny roztwór przepuszcza sie z szybkoscia prze¬ plywu 30 ml/minute przez kolumne wjfcpelniona kationi- 65 tern Duolite C-25. Roztwór, który odprowadzono z ko-63201 13 iummy przepuszcza sie ponownie przez Jtolumne, wypel¬ niona takini samym kationitem. Odciek odprowadzony z drugiej kolumny przechowuje sie do regeneracji wolfra- mdanu.Antybiotyk eluuje sie z wymienniilca za pomoca. 31 g ln-wodorotlenku amonowego, który .przepuszcza sie najpierw przez druga kolumne i nastepnie przez pierw¬ sza; otrzymany odciek zateza sie pod 'obnizonym cisnie¬ niem 30 mm Hg w temperaturze 40°C do objetosci 400 ml i nastepnie z szybkoscia 20 ml/minute przepu¬ szcza przez kolumne wypelniona Amberlite IRC 411.Roztwór, który wyplywa z kolumny, zateza sie pod próznia do objetosci 200 ml i nastawia 10%owym kwasem solnym wartosc pH na 3,8; wtedy roztwór na¬ syca sie krysztalami tetracykliny.Otrzymana mieszanine miesza sie w ciagu 2 godzin i pozostawia na noc w lodówce. Nastepnie mieszanine filtruje sie, osad zasady tetracykliny suszy sie na po¬ wietrzu i liofilizuje. Wydajnosc wynosi 78%, stopien czystosci — 830 ytmg.Przyklad X. 5 litrów cieczy fermentacyjnej otrzy¬ manej wedlug przykladu IX zadaje sie 36 g parawolfra- mianu sodowego (Na6W7024»16H20) i wartosc pH na¬ stawia sie 10% owym kwasem solnym na 1,5. Nastep¬ nie w czasie mieszania dodaje sie 150 g Dicalite 4180 i nastepnie filtruje.Osad zawiesza sie w 1,5 litra destylowanej wody i zadaje 10%owym wodorotlenkiem sodowym do warto¬ sci pH = 8,5. Zawiesine filtruje sie i osad przemywa 500 ml wody o wartosci pH = 10,0. Glówny przesacz i przesacz z przemywania laczy sie i nastepnie ponownie straca sie kompleks wolfram — tetracyklina przez do¬ danie 20%-owego kwasu solnego do wartosci pH = 2,0.Stracony kompleks ponownie filtruje sie ze 100 g Dica¬ lite i przemywa 100 ml destylowanej wody zakwaszonej do wartosci pH = 2,0. Przemyty osad zawiesza sie w 600 ml destylowanej wody i zawiesine zadaje 10%-owym wodorotlenkiem sodowym do wartosci pH = 9,0 i na¬ stepnie ponownie filtruje.Osad przemywa sie 400 ml destylowanej wody o war¬ tosci pH = 9,0—10,0. Przesacz laczy sie, zakwasza sie 10%owym kwasem solnym do wartosci pH = 7,5 i na¬ stepnie dodaje 60 g chlorku amonowego. Nastepnie do¬ daje sie jeszcze 160 ml 20%owego .roztworu chlorku wapniowego i 10 ml 1%-owego alkoholowego ioztwo.ru chlorku dodecylokarbamylometylo- benzylo-dwumetylo- amoniiowego i wkrapla 10%-owy roztwór wodorotlenku sodowego do wartosci pH = 8,0 — 8,2. Wydzielona sól wapniowa tetracykliny filtruje sie przy uzyciu 50 g Dicalite'u. Osad przemywa sie 80 ml destylowanej wody zawierajacej 1 g chloirku wapniowego.Przesacz stosuje sie do regeneracji volframianu. Prze¬ myta sól wapniowa tetracykliny suszy sie pod obnizo¬ nym cisnieniem 30 mm Hg w temperaturze 40—45°C.Sucha sól wapniowa ekstrahuje sie stopniowo 2 litrami metanolu, zawierajacego 25 ml stezonego kwasu solne¬ go. Wyciagi laczy sie i filtruje. Przefiltrowany wyciag zadaje sie 5 g wegla aktywnego, podgrzewa do tempe¬ ratury 40°C i szybko filtruje. Przefiltrowany wyciag za¬ daje sie 5 g wegla aktywnego, przemywa 100 ml zakwa¬ szonego metanolu. Przesacz laczy sie i metanol odde- stylowuje sie pod próznia.Destylacje prowadzi sie tak dlugo, az oddestyluje 1,5 litra metanolu. Nastepnie wprowadza sie 200 ml desty¬ lowanej wody i destyluje dalej, az do oddestylowania 15 14 600 ml metanolu. Pozostalosc podestylacyjna zadaje sie 10%owym wodorotlenkiem sodowym az do uzyskania wartosci pH = 3,8 —4,0 i zaszczepia fci^sztalaimi izo- elektrycznej tetracykliny. Otrzymana mieszanine miesza sie w ciagu 2 godzin i pozostawia do krystalizacji na okres 14 godzin w lodówce. Wydzielone krysztaly zasa¬ dy tetracykliny przemywa sie m-butanolem i woda i su¬ szy na powietrzu. Wydajnosc wynosi 92%, stopien czy¬ stosci 800 y/mg.Przyklad XI. 5 litrów cieczy fermentacyjnej pod¬ daje sie obróbce w sposób opisany w przykladzie X, z tym, ze stosunek wagowy parawioilframianu sodowego, który potrzebny jest do stracania, obliczony jako Na2W04»2H20, do tetracykliny zmienia sie z 0,5 : 1 na 4,0 : 1. Wyniki podane sa w nastepujacej tablicy. 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 NaW04 2H20 : tetra¬ cyklina 0,5 0,7 0,8 1,0 1,2 1,3 1,5 1,7 2,0 2,4 ¦ 2,8 3,0 3,5 4,0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Wydajnosc /o 38,5 59,4 75,4 80,2 91,5 92,0 89,0 78,0 76,0 72,0 77,0 70,2 65,0 63,5 Stopien czystosci Y/mg 890 1 870 820 840 860 840 870 710 730 700 650 690 700 700 Wydajnosc jest przeliczona na produkt koncowy a nie na tetracykline wydzielona z. cieczy fermentacyjnej.Przyklad XII. 2 litry cieczy femmentacyjnej we¬ dlug przykladu X obrabia sie w sposób opisany w tym przykladzie, przy czym jednak odmiennie od niego wartosc pH iroztworu przed straceniem parawolframia- nem sodowym wynosi od 0,5 do 7.0. Wyniki sa poda¬ ne w nastepujacy tablicy: PH 0,5 0,7 0,9 1,1 1,3 1,5 1,7 2,0 2,5 3,5 4,0 4,5 5,0 •6,0 .1 7,0 Wydajnosc % 95,0 94,3 x 93,5 95,0 93,0 92,0 93,0 92,0 89,0 70,0 70,8 58,0 40,0 40,0 25,0 i Stopien czystosci y/mg 880 890 870 800 850 860 850 840 820 700 750 700 700 580 38015 Przyklad XIII. 10 litrów zanieczyszczonego wod¬ nego roztworu zawierajacego 800 ylml bromotetracyilcli- ny, zakwasza sie 10% owym kwasem solnym do warto¬ sci .pH = 2,0 i zadaje di g NaWO^^I^O i silnie mier- sza w ciaga H godziny.Wydzielony osad kompleksu wolframianu z bromote- tracyklina pozostawia w spokoju na okres 2 godzin i nastepnie filtruje. Osad zawiesza sie w 300 nil wody, zawiesine zadaje sie 10%-owym wodonotlenkiem sodo¬ wym do wartosci pH = 9,0 i nastepnie szybko filtruje.Pirzesacz zadaje sie 10%-owym kwasem solnym do war¬ tosci pH = 2,0, pozostawia w spokoju na okres 4 go¬ dzin i nastepnie filtruje. Osad przemywa sie 400 ml wody zakwaszonej 10%-owym kwasem solnym.Przemyty osad rozpuszcza sie przez dodatnie 10%-owego wodorotlenku sodowego az do osiagniecia wartosci pH = 9,5; nastepnie dodaje sie 20%-owego kwasu solnego dio wartosci pH = 7,5 i 20 g chlorku amonowego i natychmiast potem 150 ml 20%-owego roztworu chlorku wapniowego.Podczas mieszania dodaje sie 10%jowego roztworu wodorotlenku sodowego az do wartosci pH = 8,5 i mie¬ sza jeszcze dalsze pól godziny. Osad odfiltrowuje sie, przemywa 200 ml destylowanej wody i suszy pod obni¬ zonym cisnieniem 30 mm Hg w tempeiraiturze 30—45°C.Osad ekstrahuje sie 800 ml metanolu zakwaszonego 200 mi stezonego kwasu solnego.Wyciag filtruje sie i zateza pod obnizonym cisnie¬ niem 30 mm Hg w temperaturze 30°C do objetosci 200 ml. Pozostalosc po odparowaniu rozciencza sie 100 ml destylowanej wody i w czasie silnego mieszania zadaje sie jeszcze 10%-owym wodorotlenkiem sodowym do wartosci pH = 4,5 — 5,0; nastepnie mieszanine po¬ zostawia w spokoju na okres 1 godziny. Wydzielony osad filtruje sie, przemywa destylowana woda i suszy przez liofilizacje. Wydajnosc wynosi 86%, stopien czy¬ stosci zasady bmomotetracykliny —* 750 y/mg.Przyklad XIV. 10 litrów roztworu, zawierajacego 1000 y/ml bromotetracykliny poddaje sie obróbce w ta¬ ki sposób jak opisano w przykladzie XIII, jednak z ta róznica, ze metanolowa pozostalosc po destylacji w prózni zaszczepia isie 20 g chlorku sodowego i nastepnie dodaje 15 ml stezonego kwasu solnego i na noc pozo¬ stawia w spokoju.Wydzielone krysztaly chlorowodorku bromotetracyk¬ liny przemywa sie zimna woda i suszy w prózni. Wy¬ dajnosc wynosi 80%, stopien czystosci 700 y/mg.Przyklad XV. 10 litrów cieczy fermentacyjnej, za¬ wierajacej 980 y/ml demeitylochlorotetracykliny, z której usunieto grzybnie w sposób opisany w przykladzie I, zadaje sie 12 g iparawolframianu potasowego. Po doda¬ niu parawolframianu potasowego wartosc pH nastawia sie 10%-owym kwasem 'solnym na 1,5. Mieszanine po¬ zostawia sie w spokoju na okres 4 godzin i nastepnie filtruje. Osad przemywa sie woda zakwaszona do war¬ tosci pH = 1,5, zawiesza w 300 ml destylowanej wody i powoli zadaje sie 10%-owym wodorotlenkiem sodo¬ wym do wartosci pH = 8,5 i filtruje; do przesaczu do¬ prowadza sie 10%-owy kwas solny do wartosci pH = 7,5, 30 g chlorku amonowego i 65 ml 20%-owego roztworu chlorku wapniowego. Nastepnie podczas silnego mie¬ szania dodaje sie 20%-owego kwasu solnego do warto¬ sci pH = 6,5.Wydzielona sól wapniowa demetylochlofrotetracykliny filtruje sie i przemywa 40 nil wody.,Przesacze przecho- 16 wuje sie do pózniejszej regeneracji wolframianu. Prze¬ myta sól wapniowa suszy sie w prózni, nastepnie stop¬ niowo ekstrahuje sie 1,5 litra metanolu, do którego do¬ dano 20 ml stezonego kwasu solnego. Przesacze laczy 5 sie, zadaje 8 g wegla aktywnego, podgrzewa do tempe¬ ratury 40°C i szyblko filtruje. Osad wegla akyitwmego przemywa sie 50 mi zakwaszonego metanolu. Metano¬ lowy wyciag z szybkoscia przeplywu 10 ml/minute prze¬ puszcza sie przez kolumne wypelniona Amberlite^ 10 IRC 50. Kolumne przemywa sie 100 ml zakwaszonego metanolu. Po przemyciu kolumny ciecz odprowadzona zateza sie w prózni do objetosci 400 ml; nastepnie do¬ daje sie 10 ml stezonego kwasu solnego, po czym mie¬ szanine zateza sie do objetosci 100 ml i pozostawia w 15 spokoju na okres 24 godzin. Wydzielone krysztaly chlo¬ rowodorku demetylochlorotetTacykliny przemywa sie metanolem i odfiltrowuje sie. Wydajnosc wynosi 86%, stopien czystosci 680 y/mg.Przyklad XVI. 5 litrów zanieczyszczonego wod- 2o nego roztworu, zawierajacego 1200 ylirn dezoksytetra- cykliny poddaje sie obróbce w taki sam sposób, jak opi¬ sano w przykladzie XV, z tym, ze do stracenia kom¬ pleksu wolfram — antybiotyk stosuje sie 16 g Na2W04» • 2HoO. Wydajnosc wynosi 91%, stopien czystosci 25 740 y/mg. PL PL

Claims (5)

1. Zastrzezenia patentowe 30 1. Sposób wydzielania czystych antybiotyków grupy tetracykliny z roztworów, zwlaszcza z cieczy fermenta¬ cyjnej, z której oddzielono grzybnie za pomoca zakwa¬ szenia i odsaczenia, znamienny tym, ze do roztworu za¬ wierajacego antybiotyk dodaje sie kwas wolframowy 35 albo jego sole w stosunku wagowym do antybiotyku od 0,5 : 1 do 4,0 : 1, korzystnie 1,2: 1 do 1,5 : 1 w przeli¬ czeniu na Na2W04»2H20, przy wartosci) pH = 0,5—7,0, korzystnie 1,0—2,5, po czym wytracony osad odsacza sie i zadaje 10 — 20%-owym roztworem wodorotlenku 40 sodowego az do osiagniecia wartosci pH = 8,5 —10 i z otrzymanego roztworu wydziela sie 'antybiotyk w zna¬ ny sposób, korzystnie solami wapnia i/albo magnezu, i/albo za pomoca wymieniaczy jonowych.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze z 45 otrzymanego roztworu o wartosci pH = 8,5 — 10 wy¬ dziela sie antybiotyk przez dodanie 10%—20%-owego roztworu kwasu solnego az do wartosci pH okolo 7,5 i nastepnie stalego chlorku lamonowego w stosunku wa¬ gowym od 1:1 do 1:3, i 10— 20%-owego roztworu 50 chlorku wapniowego lub chlorku magnezowego w sto¬ sunku wagowym od 1 : 1 do 1 :4, po czym z wydzielo¬ nego przez filtracje osadu ekstrahuje sie antybiotyk or¬ ganicznym rozpuszczalnikiem, takim jak metanol lub keton metyloizobutylowy. 55 3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze me¬ tanolowy wyciag antybiotyku przepuszcza sie przez ko¬ lumne wypelniona kationitem, na przyklad Amberlite

3. IR 110.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze z eo otrzymanego roztworu o wartosci pH = 8,5 —10 wy¬ dziela sie antybiotyk za pomoca kationitu, na przyklad Duolite C-25, po czym antybiotyk eluuje sie In — 4n roztworem wodorotlenku amonowego, a nastepnie od¬ ciek iprzepuszcza sie przez anionit, na przyklad Amber- « lite IRC 411.63201 17

5. Sposób wedlug zastnz. 1—4, znamienny tym, ze do roztworu zawierajacego antybiotyk dodaje sie kwas wol¬ framowy, zregenerowany w znany sposób, z przesaczu otrzymanego po odfiltrowaniu soli wapniowej lub mag- 18 nezowej antybiotyku grupy tetracykliny przez zakwa- iszenie tego przesaczu stezonym kwasem solnym lub kwas wolframowy odzyskany w postaci odcienku po od¬ dzieleniu antybiotyku na kationicie. OH O OH O WZÓR PL PL